ES2626067T3 - Plantas transgénicas que expresan proteínas modificadas con SPIC o inteína y método relacionado - Google Patents

Plantas transgénicas que expresan proteínas modificadas con SPIC o inteína y método relacionado Download PDF

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Abstract

Una planta transgénica que se caracteriza porque porta una construcción de expresión que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína modificada que comprende una proteína diana y una secuencia de inteína condensada internamente dentro de la proteína diana en una posición por la cual la presencia de la inteína inactiva la actividad de la proteína diana, en la que la proteína diana es una proteína de degradación lignocelulósica y la inteína tiene la capacidad de cortar y empalmar la proteína modificada en la conformación cis, y la inteína se selecciona del grupo que consiste en una inteína procedente de la polimerasa de Pyrococcus spp., la inteína de Psp pol, y la secuencia codificadora de la inteína de Psp pol puede amplificarse mediante una reacción de PCR empleando los cebadores de SEQ ID NO: 5 y 6, y la actividad de la proteína diana puede recuperarse tras la inducción del corte y empalme de la inteína.

Description

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procesar químicamente la planta o partes específicas de la planta en condiciones eficaces para obtener el compuesto.
Este método puede llevarse a la práctica mediante procesamiento mecánico de la planta, o de parte de la planta, de la plántula, de tejido, de la célula, de la fracción subcelular, de la semilla, del plantón, del protoplasto, de la descendencia o descendiente, por extrusión, molienda, desmenuzado, trituración, troceado, separación, compresión, explosión y/o rasgado. Sin embargo también son adecuadas otras técnicas de procesamiento. El procesamiento químico de los componentes combinados puede realizarse mediante diversas técnicas o mediante una combinación de las mismas. Algunas de ellas son, tratamiento previo con vapor, ácido diluido concentrado, detonación con amoniaco, esterilización, inmersión en agua, mezcla con un disolvente, un cambio de pH, temperatura u osmolaridad, exposición a o a cambios de luz, catálisis enzimática y/o inorgánica, sacarificación, blanqueamiento, restregado, fermentación, destilación, cromatografía, adsorción y/o adición de un producto(s) químico. Por supuesto también se emplean otras técnicas satisfactoriamente. Se utilizan diversas etapas cuando se lleva a la práctica lo siguiente: el pretratamiento puede incluir la vaporización de los productos combinados con fines de esterilización; el procesamiento químico puede realizarse por pretratamiento con al menos uno de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico o ácido carbónico, o sumergiendo en agua a una temperatura mayor que o igual a aproximadamente 20 °C; y/o mezclando los productos combinados con al menos uno de agua, o un disolvente(s) orgánico o inorgánico. Como ya se ha explicado, puede aplicarse un estímulo(s) externo para inducir el corte y empalme de la proteína(s) modificada o segmento(s) de proteína. Son ejemplos de estímulos externos un cambio de pH, de osmolaridad o de temperatura, la exposición a sonidos, a la luz o la adición de un producto(s) químico. En algunos casos, la proteína(s) o el segmento(s) de proteína, de corte y empalme, pueden presentar una actividad(es) modificada con respecto a la proteína(s) o al segmento(s) de proteína modificado, tal como una actividad(es) catabólica o anabólica modificada con respecto a la proteína(s) diana original. Son ejemplos de proteína(s) o segmento(s) de proteína de corte y empalme aquellos que pueden degradar almidón, dextrina, pectina, lípidos, proteínas, quitina, lignina, celulosa o hemicelulosa o modificar lignina o que tienen actividad de sacarificación. Por tanto, la proteína de corte y empalme puede ser capaz de producir glucosa, fructosa, xilosa, fenol, glicerol, mañosa, ácido láctico, ácido acético, etileno, propileno, tolueno, etilbenceno, estireno, xileno, etilenglicol, butadieno, formaldehído, isopropanol, acetona, butanodiol, metanol, etanol, propanol, butanol, propanodiol, vitaminas, metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, heptano, octano, benceno y/o biopolímeros, entre otros compuestos. En una realización específica del pretratamiento, la sacarificación y fermentación pueden realizarse en una etapa, y la fermentación puede realizarse empleando un microorganismos procariota o eucariota capaz de producir ácido láctico, ácido acético, etileno, propileno, tolueno, etilbenceno, estireno, xileno, etilenglicol, butadieno, formaldehído, isopropanol, acetona, butanol, metanol, etanol, propanol, butanol, octanol, propanodiol, vitaminas, metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, heptano, octano, benceno, proteína diana, proteínas terapéuticas, enzimas y/o biopolímeros, entre otros compuestos.
La invención también incluye la producción de materias primas de animales que comprenden una cantidad nutritiva de la planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente recombinante de la invención. Cuando la materia prima proporcionada por el inventor la ingiere un animal, la proteína(s) o segmento(s) de proteína, modificados se cortan y empalman mediante un estímulo(s) interno del animal. Son ejemplos de estímulos internos, entre otros, la saliva, la bilis, la quimotripsina, la tripsina, el bicarbonato, el ácido clorhídrico, o el pH del estómago o la temperatura del animal. La materia prima de la invención puede comprender una proteína(s) de corte y empalme tales como fitasas, endocelulosas, exocelulasas, amilasas, glucanasas, hemicelulasas, pectinasas, proteasas, xilanasas o lipasas, o una hormona del crecimiento. Sin embargo, según se desee, también pueden emplearse otras proteínas.
Otro aspecto de esta invención proporciona el uso de la materia prima descrita anteriormente para la fabricación de una composición potenciadora de la respuesta inmunológica, en el que dicha una proteína(s), o un segmento(s) de proteína, cortada comprende al menos un inmunógeno(s) recombinante. El inmunógeno puede incluir uno o más inmunógenos víricos o bacterianos, y puede formularse en diversas formas adecuadas. Se prefiere una formulación oral, una formulación transmucósica, una formulación absorbida en el tracto gastrointestinal (GI). Sin embargo, esta composición de materia puede formularse en cualquier forma sistémica o tópica adecuada para la administración a un animal, que incluye su adición a un alimento para animales.
Las materias primas de animales de la invención pueden producirse realizando en primer lugar las etapas indicadas anteriormente para obtener una planta, o parte de la planta, plántula, tejido, célula, fracción subcelular, semilla, plantón, protoplasto, descendencia o descendiente genéticamente recombinante y después procesar las plantas o una parte del producto resultante, genéticamente modificado, en condiciones eficaces para obtener una materia prima digerible para el animal.
El producto de esta invención también puede emplearse para promover el crecimiento del animal, por ejemplo produciendo materia prima que comprenda un producto que promueva el crecimiento y permitiendo que un animal acceda a la materia prima modificada. El producto de esta invención también puede emplearse para potenciar la respuesta inmunológica de un animal. Esto puede realizarse administrando a un animal que lo necesite una cantidad de potenciación inmunológica de la composición de la invención.
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Un aspecto adicional de esta invención implica un método para la producción de una proteína(s) o de un segmento(s) de proteína diana, comprendiendo el método
producir una primera proteína(s) o segmento(s) de proteína, modificados, en el que el extremo amino de una secuencia(s) de SPIC o de inteína o un segmento(s) de la misma se fusiona con el extremo(s) carboxilo de una proteína(s) diana o un segmento(s) de proteína mediante el método descrito anteriormente;
producir una segunda proteína(s) modificada que comprende un segmento(s) de la secuencia(s) de SPIC o de inteína; y
poner en contacto la primera y segunda proteínas modificadas en condiciones eficaces para la escisión en trans de la secuencia(s) de SPIC o de inteína o segmento(s) de la misma con la segunda proteína(s) modificada.
Otra variación más del método anterior para la producción de una proteína(s) diana, comprende
producir una primera proteína(s) modificada, en las que el extremo carboxilo de una secuencia(s) de SPIC o de inteína o segmento(s) de proteína de la misma se fusiona con el extremo(s) amino de la proteína(s) diana o segmento(s) de proteína mediante el método ya descrito;
de manera similar producir una segunda proteína(s) modificada, o segmento(s) de proteína que comprende un segmento de la secuencia(s) de SPIC o de inteína; y
poner en contacto la primera y segunda proteínas modificadas en condiciones eficaces para la escisión en trans de la secuencia(s) de SPIC o de inteína, o segmento(s) de la misma con la primera proteína(s) modificada o segmento(s) de proteína. En este procedimiento la escisión puede inducirse por un cambio de temperatura, de luz o de pH, por la adición/eliminación de productos químicos que facilitan/inhiben el corte y empalme o bloquean la escisión, por la desfosforilación o la desglucosilación de aminoácidos y/o por la puesta en contacto con/eliminación de péptidos o peptidomiméticos que activan/bloquean la escisión/corte y empalme, entre otros.
Por tanto, la invención se refiere a plantas transgénicas, cuyo término pretende, en esta patente, ser sinónimo de plantas genéticamente recombinantes, sus semillas y plantas descendientes o cualquier parte de la planta, tejido o célula, que contenga un gen(es) para una proteína(s) modificada con SPIC o inteína. La invención también se refiere a métodos para la producción de las plantas transgénicas que producen proteínas modificadas con SPIC o inteína, a métodos para la producción en plantas de proteínas modificadas con SPIC o inteína y a usos de las plantas como sustratos para combustibles, productos químicos, pienso para animales o aditivos alimenticios, papel y producción de productos farmacéuticos. La invención permite la producción de plantas transgénicas que pueden usarse como una fuente de componentes estructurales o catalíticos, o que pueden tener sus proteínas modificadas con inteína purificadas y usarse por separado como proteínas estructurales o catalíticas. Las plantas transgénicas son plantas multicelulares que expresan genes exógenos sencillos o múltiples y sus actividades asociadas a proteínas (o ácido ribonucleico). Dentro del contexto de esta invención, puede hacerse referencia específicamente a clases de genes o enzimas, sin embargo, esto no es un aspecto limitante de la invención. Cuando se exponen clases específicas, se entiende que esto identifica cualquier gen o enzima dentro de la clasificación específica. Las SPIC o inteínas son secuencias de proteínas internas o adyacentes a una secuencia de proteína parental, que pueden escindirse a sí mismas espontáneamente en cualquiera, o en ambos extremos carboxilo o amino terminal y que pueden ligar selectivamente los fragmentos de proteína exteína resultantes cuando sea apropiado, en condiciones específicas. Véase, por ejemplo Perler, et al., Nucl. Acids Res., 22: 1125-1127 (1994); Wallace, C. J., Protein Sci., 2: 697-705 (1993); Xu, et al., Cell, 75: 1371- 1377 (1993); Pietrokovski, S., Protein Sci., 2: 697-705 (1994). Por tanto, puede decirse que las SPIC son péptidos de autoescisión en fase que generalmente se producen como parte de una molécula de proteína precursora más grande. Las SPIC o inteínas se diferencian de otras proteasas o zimógenos de diversos aspectos fundamentales. Al igual que las proteasas que se escinden a sí mismas o a otras proteínas en polipéptidos múltiples, no ligados, las inteínas tienen la capacidad tanto de escindir como de ligar en conformación cis o en trans. Por tanto, a diferencia de la escisión terminal que resultaría de la reacción de una proteasa sobre una proteína, la inteína tiene la capacidad de escindir en sitios múltiples, y ligar los fragmentos de proteína resultantes. Esta escisión se induce en condiciones específicas y puede realizarse implementando técnicas conocidas en biología molecular. Las inteínas de diversas fuentes, sus secuencias, características y funciones se han descrito ampliamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Kane et al., Science 250: 651 (1990); Hirata et al., J. Bio. Chem.
265: 6726 (1990) (Saccharomyces cerevisiae)] Davis et al., J. Bact. 173: 5653 (1991), Davis et al., Cell 71: 1 (1992) (Mycobacterium tuberculosis); Perler, et al., PNAS 89: 5577 (1992) (Thermococcus litoralis). Como se muestra en la Figura 1, la combinación de una SPIC con una proteína de actividad o función estructural propuesta produce una proteína modificada con inteína, cuya actividad o función estructural propuesta puede modificarse sustancialmente. Las plantas transgénicas que expresan proteínas modificadas con SPIC (a partir de sus genes modificados con inteína asociados) son una mejora sobre las plantas transgénicas anteriores, debido a que la proteína modificada con inteína parental puede tener dos estados sustancialmente diferentes que actúan de mediadores de manera controlable mediante la escisión de la inteína. Esta escisión puede estar o no asociada con la recombinación de la secuencia de proteína propuesta. La invención puede realizarse con cualquier especie de planta, o combinarse con
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