CN102031272A - 表达civps或内含肽修饰蛋白的转基因植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物、以它们为成分的组合物、用转基因植物造出的具各种用途的产品、构建含有表达CIVPS或内含肽修饰基因的转基因植物的方法、在植物表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的方法以及使用转基因植物的方法。

Description

表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物及其制备方法

相关申请

本申请是2004年7月7日提交的美国申请10/886,393的继续申请，美国申请10/886,393是2003年1月7日提交的国际申请PCT/US03/00432的继续申请，该国际申请要求2002年1月8日提交的美国临时申请60/346,541的优先权，上述申请的全部内容都并入本申请。

本申请的“序列表”是2010年1月15日完成的，其全部内容都并入本申请。

本申请是国际申请日为2003年1月7日、国际专利申请号为PCT/US2003/000432、中国专利申请号03804121.9、名称为“表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物及其制备方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物，生产该转基因植物的方法，在植物中表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的方法，和包含表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物的各种产品及其用途。

背景技术

矿物燃料是一种不可再生的资源，因此必须保证在将来有足够的能量和有机饲料供应。转化可持续资源需要新的技术，以构建改良饲料，设计将饲料转化为有用产品的有效方法，和/或设计能有效利用其他替代物质的产品。这种转化有利于，例如减少源于能量生产和使用的污染、减少源于化学制备方法的污染、通过利用可再生自然资源和有机废物而增加可持续性、减少对国外原材料的依赖性和促进与新物质生产有关的当地经济和市场。

植物原料是一种可持续资源，能帮助满足将来对饲料的需求。应用植物作为能源和有机饲料物质有利于现有的大规模农业生产，通过光合作用使用阳光中的能量而将二氧化碳吸收到植物中，并产生更少的环境有害副产品。通过应用光合作用，植物从空气中排除二氧化碳，有利于能量、化学和农产品生产。寻找使这些碳以容易且经济的可利用形式重新有效分布的方法仍然是一种挑战。

用植物生产化学饲料和燃料还处于初级阶段。例如，基于淀粉的原材料可用于生产日用化学品。引起生物转化过程受阻的可用物质和菌株的匮乏，以及对已存在的和预想中的安全性的控制问题，和经济上的不可能导致这些领域发展尤其慢。诸如玉米淀粉之类的非纤维型生物材料与矿物资源相比，在材质上更有优势，但是价格昂贵。相反，纤维素物质，如速生白杨、松树、柳枝、玉米杆、甘蔗渣、废纸浆和城市固体废物在质量和能量上都具有价格优势。但是，由于其复杂结构，纤维质难以加工处理。目前，纤维质需要预处理，包括用强酸、强碱和/或其他用作燃料的物质，如乙醇，或者用作化学产品的物质，如纸产品处理。这些预处理能有效暴露纤维质中的单体亚单位、主要是已糖、戊糖和酚类成分，然后将其剪切并作为物质应用，但价格昂贵。另一个可选择使用的物质是酶，尽管其价格便宜，但更不安全。

重组DNA技术已用于改变微生物以实现物质的低成本生物转化，因此扩大了微生物的应用并增加产品的生产数量。例如已经构建了表达木质纤维素降解酶的植物细胞，虽然由于其结构成分分解，该植物细胞很难分化和生长为完整植物。但是在木质素和纤维素物质和酶的滴度都很低时，它们能分化为完整植物，该植物需要做进一步的处理。将生物物质的预处理和发酵相结合的尝试也碰到了困难，部分原因是由于质量转化限制和发酵有机物干扰。

CIVPS或者内含肽是位于框架内，自我剪切的多肽，其一般是较大前体蛋白分子的一部分。在很多基本方面，CIVPS或者内含肽不同于其他蛋白酶或酶原。与将自身或其他蛋白裂解为数量众多的不连接多肽的其它蛋白酶不同，CIVPS或者内含肽具有在顺式或反式构象中进行裂解和连接的能力。因此，与蛋白酶对蛋白质反应产生的末端裂解相反，CIVPS或者内含肽具有在多个位点裂解和连接生成的蛋白片段的能力。所述裂解需在特定条件下诱导，能应用分子生物学技术工程化。根据文献描述，在啤酒酵母(Sacchromyces cervisiae)(Kane等，Science 250：651；Hirata等，J.Bio.Chem.265：6726(1990))、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Davis等，J.Bact.173：5653(1991)；Davis等，Cell 71：1(1992))、Thermococcus litoralis(Perler等，PNAS 89：5577(1992))和其它有机体中存在CIVPS或者内含子。

因此，有必要提供一种新的方法以从更容易再生的原料中生产能量，例如通过某种方式修饰植物，使得该植物可以作为能量和化学饲料。

发明概述

本发明提供了基因重组植物或植物部分、胚、种子、幼苗及其后代(总称为“植物”)，所述植物包括单个或多个其中插入或融合了单个或多个CIVPS或内含肽序列的外源基因序列，或包含可控插入蛋白序列(Controllable Inter Vening Protein Sequence，CIVPS)或内含肽序列和任选的适于植物基因表达和转化的调节序列的组合。该修饰基因可以在整个植物、特定组织或包含单个和多个CIVPS或者内含肽修饰基因的其任何组合中组成型地或短暂地表达。在本发明的不同具体实施方案中，任何修饰基因序列或修饰基因序列系列可以在任何或所有组织内组成型地表达或在特定时间表达。

本发明还涉及产生包含CIVPS或者内含肽修饰基因的转基因植物的方法，例如，首先构建包含亲本CIVPS或者内含肽修饰基因的DNA片段，然后用该构建体转化植物。

本发明还涉及在转基因植物中产生CIVPS或者内含肽修饰蛋白的方法。例如，用单个或多个CIVPS或者内含肽修饰基因序列转化植物或植物细胞，表达CIVPS或者内含肽修饰蛋白。在一个优选具体实施方案中，该基因序列可以在任何时间表达。在另一个具体实施方案中，，蛋白剪接前最好具有完全不同的活性和/或结构特性。经剪接的蛋白的活性是显露的，除非被与非CIVPS或者内含肽修饰蛋白亲本序列相似的外加或内生分子抑制。CIVPS或者内含肽修饰基因产品可以大量表达，并从植物材料中回收。在可供选择的情况下，所述植物和植物材料本身可作为一种CIVPS或者内含肽修饰基因产品来源。

本发明还提供了在植物中表达的CIVPS或者内含肽修饰基因产品用途，表达CIVPS或者内含肽修饰基因的转基因植物在动物饲料中的用途，或所述转基因植物在分批、半批或连续工业制备燃料、化学产品、动物食品或食品添加剂、药物、造纸、纸产品的生产和疫苗释放和废材料的补救中的用途。

通过以下附图说明和论述，本发明的其他目的、优势和特征对于本领域技术人员来说是明显的。

附图简要说明

图1显示了通过构建CIVPS或者内含肽修饰蛋白编码DNA序列而形成的CIVPS或者内含肽修饰蛋白编码DNA序列构建体，所述的CIVPS或者内含肽修饰蛋白编码DNA序列是通过将其融合到具有目标活性的蛋白的编码序列的3`端、5`端或中间序列中而构建的。将任意三个图1所示的生成的CIVPS或者内含肽修饰蛋白编码序列进行组合可以构建其它变体。

图2显示生成的CIVPS或者内含肽修饰蛋白或其片断的一种构象。该图证明了单一CIVPS或者内含肽修饰蛋白的事实。然而多个天然蛋白序列可以与单一或多个CIVPS或者内含肽组合。

图3显示了CIVPS或者内含肽修饰蛋白或及片段的裂解，当予以合适裂解刺激剂时，该裂解可在胞内或胞外发生。此处图表性的举例显示了单一CIVPS或者内含肽修饰蛋白裂解的过程。其他变体可以通过组合如图所示CIVPS或者内含肽修饰蛋白构建而成。

优选实施例详述

根据本发明人的设想，本发明提供了一种从可再生资源，如植物材料或生物材料，中产生能源的新的方法并以低耗费的方式达到上述目的。发明者断定使用与目标蛋白连接的CIVPS或者内含肽修饰蛋白来修饰植物生物材料是达到上述目的的有效方式。在本专利的上下文中，术语CIVPS或者内含肽也指相似产品，使用时可以互换。根据内含肽修饰蛋白在细胞中高效价表达，而活性大幅度降低的认识，发明者得出结论，如果将该蛋白克隆至植物中，其活性降低将使形成的转基因植物细胞、植物片段或植物组织发育为产生内含肽修饰蛋白的完整植物。另外，他认为所述转基因植物有不同的实施方法，例如，所产生的重组植物以如下方式表达所述修饰蛋白：1)组成型或短暂型表达，2)通过植物生长周期中的化学或生物诱导，3)在整个植物或特定的植物组织，和/或4)具有或不具有亚细胞定位等等。如发明者所设想，在本发明的一个具体实施方案中，表达的内含肽修饰蛋白包括一个亲本蛋白序列，其活性已知或通过从序列或者结构同源序列推知，和/或通过诱变或从头合成而产生；每个亲本序列插入或融合了一个内含肽序列。一旦插入，该修饰蛋白的内含肽部分在体内就失去亲本蛋白的活性或结构效用。然而，如果通过内含肽剪接诱导，亲本蛋白的原有活性可以完全恢复。例如，在一申请中，在植物收割后的物质预处理期间，可以诱导每个CIVPS自我剪接亲本蛋白序列，于是亲本蛋白就恢复原有活性。使用或不使用重组蛋白来剪接内含肽以产生功能活性的方法对于本领域技术人员来说是已知的，此处不需重复。这些方法包括改变光照、温度、pH值和/或添加化学剂。

更为具体地说，本发明涉及含有表达构建体的重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔，所述构建体编码至少一种含有靶蛋白或蛋白片断的修饰蛋白，所述靶蛋白或蛋白片断融合到可控插入蛋白序列或内含肽序列及其片段中间，或融合到上述序列或其片断的氨基末端或羧基末端。在一个具体实施方式中，每个该植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔的表达构建体包括可操纵性相互连接的编码靶蛋白的第一核酸片段，编码CIVPS或内含肽序列的第二核酸片段，任选的选择性标记或报导基因和/或启动子。需说明的是，在更具体的实施方案中这些序列可以直接融合或通过连接体融合，更优选在阅读框内融合。修饰蛋白可以在植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔中组成型或诱导型表达。在后一种情况下，至少一种修饰蛋白的表达和/或剪接可以通过刺激激发或诱导。合适的刺激的例子包括pH改变、温度或渗透压改变、肥料添加、杀虫剂、或化学物、或光照和/或声音变化。植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔可以在植物生命周期中的预定点，或在一个或多个特定组织或其部分，和/或在至少一个特定的亚细胞器中表达修饰蛋白。在可被选择的情况下，或者在与后者相关联的条件下，修饰蛋白可以表达并分泌到细胞外。植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔的特定组织可以是种子、根、果实、茎、块茎和/或叶，特定亚细胞器可以是细胞胞液、线粒体、质体、内质网、包含体、液泡和/或细胞核。然而本发明的限定范围也包括其他的可变形式。

植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔还可以包括使其具备化学药品抗性的选择性标记。所述化学药品的例子包括溴草腈、2，2-二氯丙酸、G418、甘磷酸、合氯氟(haloxyfop)、潮霉素、咪唑啉、卡那霉素、氨甲蝶呤、新霉素、膦丝菌素、稀禾定、2，2-二氯丙酸、甘磷酸、潮霉素、trichothecne、磺酰脲、s-三嗪和/或三唑嘧啶。然而也可以应用其他化学物质。在CIVPS或内含肽修饰蛋白多核苷酸序列之前可以包含启动子。在许多情况下，植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔对常规剧毒量的所选化学物具有耐受性或抗性。在另一些情况下中，植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔是能繁殖的，含有至少一种可遗传的修饰蛋白编码多核苷酸序列。然而它也可以是不能繁殖的。而且，如上所示，本发明的部分内容关于同系繁殖和杂交的基因重组植物，或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔，其或者可以通过本发明所述方法产生，或者不能。其中特别令人感兴趣的是植物部分，植物种子、植物幼苗和植物原生质体，它们具有相当重要的商业意义，其次，植物、植物组织、植物细胞和亚细胞部分也引起商业的和其他的兴趣。剪接蛋白能改变一种或多种植物成分的含量或活性。在一个实施例中，植物组分如葡萄糖、果糖、甘油、甘氨酸三甲内盐、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、氨基酸、脂、维生素和淀粉等的含量可以发生改变，例如减少。在另一实施例中，植物组分如纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、胶质和/或脂等的活性发生改变，如下降。一方面，CIVPS或内含肽序列和靶蛋白及其片段形成至少一个与靶蛋白的剪接连接。在理想的具体实施方案中，该剪接连接的羧基端氨基酸残基带有羟基或巯基侧链。在另一个特别有用的具体实施方案中，该剪接连接位于CIVPS或内含肽序列及其片段的下游，可以含有氨基酸残基，例如，在靶蛋白及其片段的氨基端的缺乏羟基或巯基侧链的残基。在其他重要的变异体中，剪接连接位于CIVPS或内含肽序列或其片段的上游，可以含有在CIVPS或内含肽序列或其片断的氨基端的带有羟基或巯基侧链的氨基酸残基。另一种重要可能性是剪接连接位于CIVPS或内含肽序列及其片段的上游，包含半胱氨酸。再一种重要的变异体是剪接连接位于CIVPS或内含肽序列及其片段的下游，在CIVPS或内含肽序列及其片段的羧基端具有His-Asn残基，和/或在靶蛋白连接区的氨基端带有羟基或巯基侧链。在另一种令人感兴趣的变异体中，该剪接连接位于CIVPS或内含肽序列及其片段的下游，在CIVPS或内含肽序列及其片段的羧基端具有Asp残基，和/或在靶蛋白及其片段连接区的氨基端带有羟基或巯基侧链。进一步的修饰是羧基端的Asp被无羧基或氨基侧链的氨基酸取代，并且CIVPS或内含肽序列及其片段含有外部可控的CIVPS或内含肽序列及其片段，所述可控的CIVPS或内含肽序列及其片段可以来自于其他物种，即酵母属(Saccharomyces)真菌，或更具体地是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)真菌。在本发明的产品中适合插入的其他构建体是这样的一些构建体，在这些构建体中CIVPS或内含肽序列及其片段插入到靶蛋白及其片段的Ser、Thr或Cys残基前并与后者紧邻，其中该CIVPS或内含肽的氨基或羧基端含有Ser、Thr或Cys等残基。正如以下更详细的描述所述，蛋白可以在如细菌等微生物中表达，这是本领域公知的。可以应用的微生物的例子是苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)或岛生商陆(phytolacca insularis)。一种优选的靶蛋白是苏云金芽孢杆菌内毒素，它以苏云金芽孢杆菌内毒素的修饰形式表达。另一个具体实施方案包括通过病毒表达修饰蛋白。尽管所有病毒都能应用，但举例而言可以是马铃薯病毒Y(potato virusY)、双生病毒、不孕病毒2b(aspermy virus 2b)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)等。

植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔生产方法，包括：

提供表达构建体，所述构建体编码至少一种含有靶蛋白或其片段的修饰蛋白，该靶蛋白在融合到CIVPS或内含肽序列或其片段中间，或上述序列或片断的氨基或羧基末端；

用该表达构建体转化植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔；

从至少编码至少一种修饰蛋白的转化植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔中再生基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔。

所述转化方法特别优选一种稳定的转化方法。但是也可以用一些具有暂时稳定性的转化方法。再生步骤可以是：培育重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔，或将基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔与非基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔杂交，和/或将两种基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔回交。在这种方法中使用的表达构建体可以包括一个或多个启动子、选择性标记、抗性标记、可遗传性标记、聚腺苷酸序列、抑制子、增强子、定位序列、和/或信号序列。在本申请中，可用的重组技术是已知的，在下文的实施例或其它地方有举例。该方法的一个重要方面是用上述表达构建体通过病毒转化、DNA包裹微粒轰击、脂质体基因转化、细菌基因转移、电穿孔、或基因化学转化，或其组合来转化植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔。如上所述，植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔可以通过细菌如根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(尽管其他细菌亦可)转化。在本方法中，转化通过基因化学转化法完成，可以有如磷酸钙，和/或聚乙二醇或其他在现有技术中记载的适合于本发明目的的化合物的协助。筛选通过选择性标记、抗性标记或表达至少一种编码CIVPS或内含肽修饰蛋白的核酸来完成。在本发明方法中，从转化胚组织、植物原生质体、未成熟胚衍生细胞或转化种子等中再生基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔。

本专利还提供另一种方法，所述方法适合从表达蛋白或其片段的重组转化植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔中生产修饰蛋白或其片段。该方法包括实施如上所述的方法，然后从转化植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔中收集修饰蛋白或其片段。该方法还可以包括纯化修饰蛋白步骤，该步骤可以用已知的技术完成。如本文所述，该方法能产生含有CIVPS或内含肽修饰蛋白或其片段的修饰蛋白或其片段。

本发明还提供了生产含有靶蛋白或其片段的修饰蛋白的方法，该靶蛋白融合到CIVPS或内含肽序列或其片段中间，或融合到上述序列或其片断的氨基末端或羧基末端，所述方法包括：

获得编码靶蛋白的表达构建体，该靶蛋白在框架内，或其氨基或羧基端，有融合的CIVPS或内含肽序列或其片段；

用表达构建体转化宿主植物细胞；和

在适合修饰蛋白表达的条件下培养转化的植物宿主细胞。

一个优选的情况是，在表达构建体中，至少有一个编码CIVPS或内含肽序列或其片段的第一核苷酸融合到编码靶蛋白或其片段的第二核苷酸序列的5`端。其他可选择的情况是，在表达构建体中，编码CIVPS或内含肽序列或其片段的第一核苷酸可以融合到编码靶蛋白或其片段的第二核苷酸序列的3`端。尤其适合实施本发明方法的是酵母菌CIVPS或内含肽序列或其片段，因已知其能对剪切、裂解、连接、剪切-连接、裂解-连接、和/或环化的步骤产生顺式或反式的作用。当应用CIVPS或内含肽或其片段诱导蛋白剪接时，可以通过以下方式诱导：光照、温度、pH变化，添加/去除有利/抑制剪接或裂解的化学剂，氨基酸去磷酸化或去糖基化，或接触或去除能够对剪接或裂解过程产生激活或阻断作用的肽或模拟肽。诱导蛋白剪接的其他方法是在体内或体外接触或去除能够对剪接或裂解过程产生激活或阻断作用的肽或模拟肽试剂。一些令人感兴趣的能产生优良效果的改变是：CIVPS或内含肽及其片段的氨基或羧基端包含Ser、Thr或Cys残基，或CIVPS或内含肽及其片段的羧基端在靶蛋白的Ser，Thr或Cys前含有Asp。然而，利用现有技术中已知的改变也是可以的，例如，将美国专利US5,834,247公开的原核生物和真核生物领域的一些方法学理论用于本发明以产生包含有用特性的杂种植物。在本方法中，表达构建体还可以含有启动子、选择性标记、抗性标记、可遗传标记、聚腺苷酸序列、抑制子、增强子、定位序列和/或信号序列中的至少一种。另外，本发明的方法还包括含有表达构建体的植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔的转化体，该转化体通过病毒转化、DNA包裹微粒轰击、脂质体基因转化、细菌基因转移、电穿孔、或基因化学转化，或其他已知或发展的技术转化。如上所述，用于转化表达构建体的细菌可以是根瘤土壤杆菌；用于转化的化合物可以是磷酸钙或聚乙二醇；转化植物细胞、植物部分、植物等可以通过表达选择标记、抗性标记来筛选；转化的植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔可通过表达修饰蛋白基因序列来筛选；再生基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔可以从胚组织、未成熟胚衍生细胞或转化种子等中获得。

本发明还公开了生产表达修饰蛋白的种子的方法，所述方法包括：

获得基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔；

培养或培育基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔；和

获得表达修饰蛋白的植物种子。

本发明的另一方法是使用表达修饰蛋白的植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔来生产化合物，该方法包括：

根据本发明的教导，收集本发明的重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔；

机械加工所述植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔；

以大于或等于零的重组：非重组比例将机械加工的植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔与非基因重组植物组合；和

在能有效获得化合物的条件下化学加工上述植物或特定植物部分。

这个方法通过对所述植物，或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔进行下述的机械加工处理来实施，即挤出、碾磨、切碎、覆盖、碎裂、切块、压缩、爆散、和/或撕破。然而其他加工方法也适用。该组合成分的化学加工可以用不同技术或其组合来实现，其中包括蒸处理，稀酸/浓酸处理，氨爆炸，灭菌，水浸泡，溶剂混合，pH、温度或渗透压改变，暴露于或改变光照，无机物和/或酶催化，糖化，脱色，摩擦，发酵，蒸馏，层析，吸收和/或添加化合物。当然，其他方法也可以使用。各种有用的操作步骤如下：预处理可以包括对组合产物进行以杀菌为目的的蒸处理；化学加工包括用至少一种硫酸、盐酸、磷酸或羧酸预处理，或在大于或等于20℃的温度中浸泡、和/或将组合物与至少一种水或有机或无机溶剂混合。正如已经解释的那样，外部刺激物能用于诱导修饰蛋白及其片段的剪接。外部刺激的例子包括pH、渗透压或温度变化，暴露于声音、光照中、或添加化合物。在有些情况下，剪接的蛋白及其片段的活性可变，例如相对于原始靶蛋白，其分解代谢或合成代谢活性改变。剪接蛋白及其片段的例子包括能降解淀粉、糊精、胶质、脂、甲壳素、木质素、纤维素、或半纤维素、或修饰木质素，或具有糖化活性的蛋白。因此，剪接蛋白能够产生葡萄糖、果糖、木糖、酚、甘油、甘露糖、乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、异丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、维生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、和/或生物高聚体等等。在一个预处理的特定具体实施方案中，糖化和发酵可以在一个步骤中进行，利用能产生乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、异丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、维生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、和/或生物高聚体等等的原核或真核微生物进行发酵。

本发明还包括生产动物饲料，该饲料含有营养有效量的本发明的植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔。本发明的饲料经动物消化后，修饰蛋白及其片段经动物体内的刺激诱导剪接。内部刺激的例子是，动物的唾液、胆汁、糜蛋白酶、胰岛素、重碳酸盐、盐酸、胃部pH和温度等等。本发明的饲料包括的剪接蛋白可以是肌醇六磷酸酶、内纤维素酶、外纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、胶质酶、脂酶或生长激素。然而其他蛋白也可以。

另一方面，本发明还提供上述饲料在制造免疫反应促进组合物中的用途，其中剪接蛋白及其片段至少含有一个重组免疫原，该免疫原可以包括一个或多个病毒或细菌免疫原，可以有多种合适剂型。优选剂型是口服、跨粘膜、胃肠(G.I.)道吸收剂型。然而该组合物的剂型可以包括任何适合动物全身或局部给药的剂型，包括添加到动物饲料中。

本发明的动物饲料生产，首先是实施上述的步骤以获得基因重组植物或植物部分，胚，组织，细胞，亚细胞片段，种子，幼苗，原生质体，后代或后裔，然后在能有效获得动物可消化饲料的条件下，加工上述生成的遗传修饰植物或植物部分。

本发明产品还可以用于促进动物生长，例如通过生产包含生长促进产品的饲料，让动物进食所述修饰饲料。本发明产品还可以用于提高动物免疫反应，动物服用治疗量的本发明的提高免疫反应的组合物。

本发明还包括生产靶蛋白及其片段的方法，所述方法包括：

制备第一修饰蛋白及其片段，其中通过如上所述方法将CIVPS或内含肽序列及其片段的氨基端融合到靶蛋白及其片段的羧基端；

制备包含CIVPS或内含肽序列片段的第二修饰蛋白；和

在有利于第二修饰蛋白反式裂解CIVPS或内含肽序列及其片段的条件下将第一和第二修饰蛋白接触。

生产上述靶蛋白的其他方法包括：

制备第一修饰蛋白及其片段，其中通过上述方法将CIVPS或内含肽序列及其片段的羧基端融合到靶蛋白及其片段的氨基端；

类似地产生包含CIVPS或内含肽序列片段的第二修饰蛋白及其片段；和

在有利于反式裂解第一修饰蛋白的CIVPS或内含肽序列及其片段的条件下，将第一和第二修饰蛋白接触。所述剪接的诱导条件可以是光照、温度、pH变化，添加/去除有利/抑制剪接或裂解的化学剂，氨基酸去磷酸化或去糖基化，或接触/去除对剪接/裂解过程有激活/阻断作用的肽或模拟肽等。

因此，本发明涉及转基因植物，在本发明中，该术语与包含CIVPS修饰蛋白基因的基因重组植物、种子子代植物、或任何植物部分、组织、细胞等含义相同。本发明进一步涉及产生CIVPS修饰蛋白的转基因植物的生产方法，在植物中产生内含肽修饰蛋白的方法，上述植物在燃料、化学、动物食品或食品添加剂、造纸和药物产品中的用途。本发明还考虑到转基因植物生产可以作为结构或催化组分的来源、或纯化内含肽修饰蛋白后分别作为结构或催化蛋白。转基因植物是多细胞植物，他们表达单个或多个外源基因及其相关蛋白(或核酸)活性。然而，在本发明中，具体引用的基因或酶类并不是对本发明的限定。可以理解，当提及特定的种类时，仅仅是为了确定具体分类中的任一基因或酶。CIVPS或内含肽的序列存在于亲本蛋白序列内部或与其比邻，可以在羧基和/或氨基端自发的自我剪接，合适时能选择性地连接生成的外显肽片断。例如参见Perler等，Nucl.AcidsRes.，22：1125-1127(1994)；Wallace，C.J.，Protein Sci.，2：697-705(1993)；Xu，等，Cell，75：1371-1377(1993)；Pietrokovski，S.，Protein Sci.，2：697-705(1994)。因此认为CIVPS是阅读框内的自我剪接多肽，其一般是作为前体蛋白分子的一部分。CIVPS或内含肽在一些基本的方面上不同于其他蛋白酶或酶原。与其他蛋白酶将自身或其它蛋白裂解多个不连接的多肽不同，内含肽具有在顺式或反式构象中进行裂解和连接的能力。因此，与蛋白酶对蛋白质反应产生的末端裂解相反，CIVPS或者内含肽具有在多个位点裂解和连接生成的蛋白片段的能力。所述裂解需在特定条件下诱导，可以应用分子生物学的已知技术进行。不同来源的内含肽，它们的序列、特征和功能在文献中都有描述，参考：Kane等，Science，250：651(1990)；Hirata等，J.Bact，173：5653(1991)，Davis等，Cell 71：1(1992)(结核杆菌)；Perler等，PNAS 89：5577(1992)(Thermococcus litoralis)。如图1所示，CIVPS与某种活性或结构作用的蛋白结合产生内含肽修饰蛋白，蛋白活性或结构功能可以完全改变。表达CIVPS修饰蛋白(从相关内含肽修饰基因)的转基因植物是对以前转基因植物的一种改进，因为亲本内含肽修饰蛋白能有两个完全不同的状态，可控地由内含肽裂解介导。该裂解可能与或不与目标蛋白序列的重组有关。本发明可以通过任何单一或多重蛋白与CIVPS的组合后再和任何一种植物组合而形成。植物种类可以包括，但不仅限于：白杨、桦树、香柏、松树、落叶树、针叶树、大豆、柳树、玉米、烟草、苜蓿、甘蔗、花椰菜、香蕉、苹果、樱桃、黄瓜、莴苣、葡萄、柠檬、甜瓜、坚果、橘子、大米、橙、桃、梨、蓝莓、草莓、西红柿、胡萝卜、大白菜、土豆、菊苣、韭、菠菜、杂草、葛、甜菜根、胡萝卜、甜瓜、芜菁、薯蓣、填土豆、小麦、大麦、大豆、豆子、油菜籽、粟、向日葵、燕麦、豌豆、块茎、竹、海藻、藻类和其他物种。蛋白可以包括任何已知的、纯化的、修饰的和从头合成的蛋白。虽然天然蛋白的选择并不严格，但优选地包括木质纤维素降解蛋白(纤维素酶、木质素酶、淀粉酶)，淀粉降解酶(淀粉酶、葡聚糖酶)，在燃料和化合物生产、细菌或病毒抗原生物合成途径中所需要的酶，在维生素和其他食品添加剂生物合成途径中所需要的酶(肌醇六磷酸酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、胶质酶、脂酶或生长激素)，具害虫或昆虫抗性的蛋白，与疾病发病机理有关的治疗性蛋白。用于修饰在目标植物中表达的融合体的蛋白的CIVPS或内含肽的选择也没有限定。相对于所需的目标蛋白，任何单一或多重CIVPS或内含肽在任何构型下都可应用。CIVPS或内含肽应具备在某些刺激下被单端或双端剪接的能力，并允许(或不允许)已融合了单一或多重的CIVPS或内含肽的目标蛋白的连接。

生产表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物，和在转基因植物中生产CIVPS或内含肽修饰蛋白可以通过组合本领域已知方法(Ausbel等)来实现。一般地，这些方法包括，DNA构建，该DNA含有CIVPS或内含肽修饰的目标蛋白和其表达、扩增必须的调节元件；筛选构建的DNA；转化目标植物种；再生并筛选合适的转化植物种。假如需要，纯化天然或裂解形式的CIVPS或内含肽修饰蛋白。无论是生产表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物，还是在转基因植物中生产CIVPS或内含肽修饰蛋白都构成本发明的一部分。对于生产转基因植物或在转基因植物中生产CIVPS或内含肽修饰蛋白而言，必须构建CIVPS或内含肽修饰蛋白序列。这也很容易完成：克隆具有目标活性和目标内含肽序列的基因序列到大肠杆菌(E.coli)或其他任何合适宿主(例如，有时候酵母也可以，或在哺乳动物或植物细胞中表达，用或不用病毒或非病毒载体)中。一旦克隆了基因和内含肽编码序列，他们必须被连成所需的构型。选择的内含肽序列应该能够实现期望的功能，如在外加刺激(如光照、pH变化，温度、压力、内含肽修饰蛋白周围的局部化合成分发生变化)下的剪接功能，假如需要，使融合蛋白连接。用已知方法很容易将CIVPS或内含肽DNA序列和蛋白的DNA序列连接，产生CIVPS或内含肽修饰蛋白的DNA编码序列或其组合，如图1所示。如上文所述，CIVPS或内含肽修饰蛋白是将CIVPS或内含肽融合到天然蛋白及其片段的羧基端、氨基端或中间的蛋白。尽管存在很多可选择的方法，但是使CIVPS或内含肽与目标蛋白编码序列融合的方法之一是纯化编码目标蛋白序列DNA，用限制酶在内含肽的目标插入点切割蛋白编码序列，然后将内含肽编码序列连接到限制性位点。可以将多核苷酸或其片段直接克隆到合适的调控和/或筛选序列中，或通过载体克隆。调控片段的例子有调控CIVPS或内含肽修饰蛋白瞬时表达的启动子、复制起始序列，和/或调控CIVPS或内含肽修饰蛋白在特定植物组织和/或特定亚细胞器中的体内空间分布的信号序列。筛选元件的例子有除草剂或抗菌基因、荧光标记、染料标记、和其他合适的选择标记。生成的多核苷酸和载体含有CIVPS或内含肽修饰蛋白编码多核苷酸和任选的任何目标调控和筛选元件，将其扩增获得大量产品，该产品可用于随后的目标植物种的转化。任何修饰和上述所有步骤都有可能促进特异性定位和任何目标CIVPS或内含肽蛋白与蛋白之间的融合，利用本领域已知的方法可以完成。编码序列和/或CIVPS或内含肽蛋白编码序列的改变，及这些序列的连接用本领域已知的技术也很容易完成，例如定点突变、随机突变、PCR、易错PCR和/或其他本领域技术人员能想到的合适常规方法。这些技术有利于大量连接序列的替换，可以使用任何期望的和合适的组合。同样，任何调控和筛选元件的组合和定位都可用于本发明。基因调节元件如启动子(Guilley等，Higgins，T.J.Y.，Coruzzi等，Tingey等，Ryan等，Rocha-gosa等，Wenzler等，Eird等)、增强子(Brederode等)、RNA剪接位点、核糖体连接位点、糖基化位点、蛋白剪接位点、亚细胞信号序列(Smeekens等，van den Eroeck等，Schreier等，Tague等)、分泌信号序列(Yon Heijne，G.，Sijmons等)等都有利于调节CIVPS或内含肽修饰蛋白浓度的时间和空间上的分布、和在转化植物体内的活性。使用这些元件意欲促进内含肽修饰蛋白在转基因植物中的生产和加工。内含肽修饰蛋白的表达可以是组成型或诱导型的方式，为了实现任一模式，任何一种在本发明中叙述的、或已被公知的、或以后可能实施的方法都可应用。外界刺激物可以协助诱导蛋白表达，例如暴露于杀虫剂、光照、温度变化、和/或声音。然而其他刺激物也可以。另外，重组植物可以表达任何一个或多个选择标记基因或上述提到的报导基因。

如果构建了CIVPS或内含肽修饰蛋白DNA序列，并与目标调控和筛选DNA序列连接，成功克隆和筛选的话，那么接着就需要转化目标植物种并再生为完全植物。转化目标植物种并再生完全植物的方法可以通过已知方法来完成(Draper等，Potrykus等)。转化技术包括但不限于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转化、毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的基因转化、直接将基因转化到植物原生质、Ti质粒介导的基因转化(有或无质粒辅助)、生物弹或颗粒轰击的植物转化、微注射和纤维介导的转化、组织电穿孔(Shimamoto等)。基因转化可以发生在整个植物、植物外植体(如但不限于根外植体)、植物部分(如但不限于植物叶片部分、种子、或种子部分)、植物原生质或质外体、单个或多个植物细胞中。各种不同方法在现有技术中已有详细描述。筛选适合转化植物的方法也是公知的。在包含CIVPS或内含肽修饰蛋白的转化DNA中包含选择性标记能促进筛选，例如抗性基因、编码有颜色的化合物产品的基因、编码荧光化合物产品的基因或其他任何合适方法。另外，可以分离转化植物的DNA并对其进行测序以确认目标CIVPS或内含肽修饰蛋白编码序列存在。其他合适方法也可用于筛选步骤的确认，如PCR、限制性消化分析、或southern分析。任何可以确认目标转基因植物的筛选方法都可以应用。如果植物被CIVPS或内含肽修饰蛋白和目标调控和筛选元件转化，则整个植物就能用本领域的公知方法再生(Horsch等)。大部分方法都包括在合适培养基和合适的光照、温度条件下培养转化的植物细胞、外植体、组织、部分和整个植物。再生植株的方法并不对本发明产生限制，任何有效方法都可以使用。生成的转基因植物应该产生完全如前文所述的CIVPS或内含肽修饰蛋白，或图2所示物质的组合。一旦筛选出整个转基因植物，就能监控CIVPS或内含肽修饰蛋白的表达。在培育表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物时，这并不要求；但要慎重确认已经得到表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的目标转基因植物，且其表达受所用的目标调控元件正确调控。监控CIVPS或内含肽修饰蛋白的表达对于纯化剪接或未剪接CIVPS或内含肽修饰蛋白是必需的，如图3所示，整个内含肽修饰蛋白或其成分包括图3所示元件的组合。通过western分析、二维凝胶电泳(并着色)、质谱测定植物提取液或纯化转基因蛋白片段可以监控内含肽修饰蛋白表达。另外，一些纯化蛋白或转基因植物本身应该暴露在内含肽裂解刺激剂中，暴露后，CIVPS或内含肽修饰蛋白和CIVPS或内含肽裂解生成的蛋白可通过western分析和其他方法确认合适蛋白的存在，以及CIVPS或内含肽修饰蛋白和生成的蛋白活性的差别。必须做活性分析以便于监控目标蛋白的活性，且分析对与该活性应该是特异的，不易于受竞争干扰。可使用一种标准对照来比较蛋白的天然活性与内含肽修饰蛋白、生成的剪接蛋白的活性。使用表达CIVPS或内含肽修饰蛋白的转基因植物的方法和加工包括将植物作为燃料生产物质(包括但不限于可燃生物材料、乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、丙烷、甲烷或辛烷生产)，消费化学产品(包括但不限于乳酸、乙醇、葡萄糖、和其他己糖、戊糖、丙二醇、乙烯、乙醇、乙烯、酚类化合物、氨基酸、纸浆、杀害虫剂、杀昆虫剂、其他醇类、醚类、酯类)，食品和食品添加剂(包括但不限于：氨基酸、糖、维生素、纤维和家畜饲料)，将植物用于疫苗释放、造纸和废材料补救。任何成批、半成批或连续地加工表达内含肽修饰蛋白的转基因植物以生产上述任一用途物质均属本专利保护的范围。这些加工方法包括但不限于，收集表达内含肽修饰蛋白的转基因植物，运用内含肽剪接刺激剂，将转基因植物与其他物质按≥0的配比混合，然后以化学、酶学或生物学方法转化为上述产品。

以下实施例阐述了本发明的加工方法、表达CIVPS或内含肽修饰纤维素酶的转基因植物的制备，及其生成的植物。在这些植物中，纤维素酶通过调节元件调控CIVPS或内含肽修饰基因而表达。体内纤维素酶活性在融合蛋白插入天然纤维素酶后大幅度下降。这使得植物在没有或几乎没有受纤维素酶活性所抑制下生长。收集植物，运用内含肽剪接刺激剂，如暴露在一定的光波、与硫磺或改变pH的化合物混合、与盐和其他化合物混合、使温度变化。在这种情况下，CIVPS或内含肽被裂解，纤维素酶活性恢复并随后催化裂解纤维素和/或木质素。此时裂解蛋白植物糊状物以任意比例，优选以大于等于零的比例与其他植物物质、化学物质、城市垃圾、生产副产品、酶和/或原核或真核细胞等混合，以帮助上述物质转化为目标产品，如燃料、消费化合物、人类和动物消费食品、食品添加剂、纸浆、疫苗抗原等等。值得注意的是，本发明并不仅限于生产加工或机械加工，本发明应用的非限制性的例子有释放疫苗、激素、治疗性蛋白，在这种情况下内含肽修饰蛋白可以含有治疗活性蛋白和/或蛋白抗原、潜在保护性蛋白序列与转基因植物如香蕉植株表达的CIVPS或内含肽的组合。释放可以实现，例如，通过人类或非人类动物消化植物产品。然后该植物在口腔中被嚼碎、暴露在体内胃部的刺激剂中，于是依次启动或诱导CIVPS或内含肽剪接。对于人，如果需要，刺激可以是胃部pH下降，其诱导抗原或治疗性蛋白的CIVPS或内含肽剪接并提供合适的连接。然后治疗性蛋白和抗原流入十二指肠或小肠，此时pH呈中性化，蛋白产品就被吸收到血液中。

下述实施例信息背景

本领域技术人员都明知，下述实施例1技术方案的很多不同变化也适合于实施本发明。一般地，构建编码CIVPS或内含肽修饰蛋白的DNA序列，并将其组装到合适的载体中，用该载体转化植物材料(不管其是否在悬浮液中单细胞生长)、原生质体、植物片段或部分、整个植物或本发明所描述其它的合适形式，然后再生出完整植物、种子或本发明描述的其它合适形式。实施例1显示本发明方法的一个具体实施方案，可用于生产转基因树，如表达内含肽修饰纤维素酶的白杨的改变方案也可以实施，然而要根据转基因植物物种的可能应用来选择目标蛋白。可以用天然蛋白、从头合成蛋白或演化蛋白，例如通过基因重组、易错PCR或其他类似方法制备的蛋白。纤维素酶催化裂解植物的一种化学成分，即纤维素，在构建其他表达纤维素酶的植物时，该酶通常瞬时表达或隐蔽在细胞部分中，因而不会破坏植物组织分化和发育。例如，参考Ziegler等(2000)；Dai等(a).(2000)；Dai等(b).(2000)；Montalvo-Rodriguez等(2000)。因此，假如纤维素酶活性没有由局部的或短暂的表达所控制，那么整个植物通常很难再生，或纤维素酶活性通常太低以至于没有作用。通过使用内含肽修饰纤维素酶，整个植物能再生，因为整个植物产生较低活性，但效价很高的内含肽修饰纤维素酶。参考Aspergen等，Molecular breedingl：91-99(1995)。该酶随后可以被活化，通过内含肽的自我剪接能力产生比内含肽修饰纤维素酶更高活性的纤维素酶。值得注意的是，任何天然蛋白都符合本发明的要求，蛋白选择依赖于植物的目标用途。本发明中，能诱导自身纤维素解聚的白杨品种将在以生物材料为原料的乙醇生产中或作为其他化合物发酵制备的底物时显示有用性。

CIVPS或内含肽修饰蛋白的构建

各种重组DNA技术都可组合用于构建编码修饰蛋白DNA的载体，最容易和直接的方法是利用PCR将编码内含肽修饰蛋白核酸序列组装到有利于目标载体连接的合适互补端。此处利用PCR方法。为了达到同一的目的，其他方法也可以使用，有些方法依赖于目标蛋白和内含肽编码序列的特异性限制和连接，但仍然包括PCR步骤。进行该反应的PCR试剂盒很容易得到(Epicentre，madison WI)。对引物的唯一要求是：一种与待扩增的正义链5`端相匹配，另一种与反义链5`端相匹配；相关序列具有唯一性是有利的。

从凝胶中回收和纯化

通过电洗脱、酚提取、琼脂酶消化、玻璃珠提取和商业可得到的试剂盒，从凝胶中纯化DNA。QIA快速凝胶提取试剂盒(QiagenValencia，CA)和相关方法就是一实施例。

根据目标用途选择内含肽

该步骤具有两个重要特征：CIVPS或内含肽具备诱导有利于转基因植物用于目标用途的最佳化剪接，和将内含肽置于编码靶蛋白的核苷酸序列中的性能。任何自我剪接蛋白，如内含肽编码序列都可用于本发明。Perler，F.B.(2002).InBase，the Intein Database.Nucleic Acids Res.30，383-384中给出了一些已知内含肽，还在继续发现其他内含肽，通过序列分析、DNA扩增重组还会创造出新的内含肽。对于目标转基因白杨品种，实施例1的内含肽是有益处的，因为内含肽剪接后产生处于优势连接态的天然蛋白(75％)；并且内含肽对温度敏感：其剪接在＜30℃时被抑制，直到50℃才基本恢复，且在此温度下非裂解蛋白的半衰期小于2小时。

内含肽修饰蛋白的构建

为了确保正确的内含肽剪接，实施例1中，内含肽插入到天然靶蛋白的序列框内，紧邻丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。这使得天然靶蛋白的丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸位于内含肽的组氨酸和天冬氨酸(即末端536和537氨基酸位点)保守残基的羧基侧。根据内含肽剪接所需要的目标刺激物和机制，也可应用其他末端残基。如果需要，外显肽-内含肽连接区的密码子可以改变以有利于这些需求。建议在改变功能连接区密码子时要小心，以使内含肽修饰蛋白可以如期望的那样裂解，让生成的产品具有合适的活性。位于天然靶蛋白中的该内含肽位点可以完全地改变得到的内含肽修饰蛋白的活性，大部分情况下，任何在活性位点内或附近的插入都能达到上述目的。如果丝氨酸残基临近天然蛋白编码序列的唯一限制位点，则很容易将扩增的内含肽序列和扩增的天然蛋白序列结合。相反，通过几个PCR很容易将内含肽编码序列插入到天然蛋白的任意期望的位置。优选的PCR方法如下：优选应用50个核苷的寡核苷酸引物。也可以应用较短的引物，但相同长度的引物更好，尽管这并不是必须的。C-外显肽的正义引物可以与C-外显肽和内含肽序列在连接区杂交，以促进扩增序列在随后的PCR中融合。对于内含肽扩增，所有引物优选与各自期望临近的外显肽序列交迭，以促进内含肽和外显肽在随后的PCR扩增中融合。PCR优选使用上述标准技术方案进行，但也可以优化。典型的优化参数是混合物中加入的模板和引物DNA的量(通常加入的引物DNA的量大大超过模板DNA)，反应循环的温度和时间、循环次数、MgCl₂浓度。使用的引物长度和组成可以变化以生产有效的内含肽修饰蛋白，只要空间限制允许。商业可得到的试剂盒含有所有必需试剂：Taq DNA聚合酶、MgCl₂、25mMdNTP混合物(包括等摩尔数的dATP、dCTP、/dGTP、dTTP)，反应缓冲液和水。

这时，开始下一个PCR循环以融合外显肽和内含肽序列。本例中，内含肽片段优选和等摩尔C-外显肽混合，这些片段的连接有赖于所需的模板和引物(交迭区)。需要加入反应缓冲液、25mMdNTP、MgCl₂和TaqDNA聚合酶，改变温度循环。该反应扩增优选分别添加下列正义和反义引物，和E.coli DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，然而该添加也并非必需，依赖于实际反应条件，并不一定导致产量增加。

SEQ ID NO：1

5`-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAG AATGGGTTC-3`

SEQID NO：2

5`-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTGT CGTGA-3`

一旦完成，PCR产物最好再次进行琼脂糖凝胶电泳，从胶中纯化2665核苷酸长的合适条带，根据上述方法进行分析。少量纯化反应产品优选在UV光谱仪上260和280nm波长处进行吸收定量测定。为了完成装配，将刚构建的等摩尔融合的C-外显肽和内含肽与在先纯化的N-外显肽片段连接，对内含肽修饰纤维素酶编码序列进行PCR反应。加入反应缓冲液、25mM dNTP、MgCl₂和TaqDNA聚合酶，优选使用与原来相同的温度循环。该反应扩增优选分别添加下列正义和反义引物，和E.coli DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，然而该添加也并非必需，依赖于实际反应条件，并不一定导致产量增加。

5`-AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAATAG TTTTC-3`(SEQID NO：3)

5`-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTGTG GTGA-3`(SEQID NO：4)

载体构建

实施例1中，其他元件也可以包括在表达盒中，例如：细胞外分泌信号蛋白、细胞内定位信号序列、其他可诱导启动子等等。由于载体包含在到重组根瘤土壤杆菌中，因此将上述基因转化到白杨种中就依赖于细菌的特定输送系统。其他基因转化方法也可以使用。挑选合适的转化方法依赖于植物材料的来源，例如，原生质和单个植物细胞可以直接通过电穿孔、CaCl₂、生物粒子轰击(Bio-Rad，Hercules，CA)用重组pTiBo542质粒转化。相反，植物结节、植物片段或整个植株在适当的时候可以作为起始材料，当孵育时间和培养基细胞浓度达到最佳时，能产生有效的基因转化。

实施例1的转基因白杨的优势和应用

生成的转基因白杨虽然产生高效价地内含肽修饰蛋白纤维素酶，但是能无限制地生长和传代。随后通过收集植物、机械碎裂或碾碎以增加暴露面积、然后在较高温度(优选30-50℃)或较低pH值(小于等于6.5)条件下，在桶或罐中孵育生成的糊状物使得纤维素酶活性活化。暴露在较高温度或较低PH值条件下，将能诱导内含肽剪接，并产生活性完全增加的天然纤维素酶。该条件下，纤维素酶催化纤维素裂解从而经济地产生可以随后发酵为乙醇或其他化合体的物质。另外，该植物能作为内含肽修饰的纤维素酶或剪接后复性的天然纤维素酶的来源。两种情况下，蛋白最好使用已知方法从上述植物中纯化，其方法包括沉淀、膜过滤、层析(包括亲和层析)、提取等。

产生内含肽修饰蛋白的转基因植物的用途相对于以前报导的转基因植物有两个好处。由于内含肽修饰蛋白比天然蛋白活性低很多，所以它可以高效价表达，并定位在植物的任意部位。以前的关于表达纤维素酶的转基因植物的报道已经揭示了去除分泌信号能使该纤维素酶保留在细胞溶质中。这对于内含肽修饰蛋白并不需要。内含肽修饰蛋白能够与其底物近距离接触而不发生催化反应(直至需要时才催化)，这是一种很大的改进。另外这些植物有着更高的环境安全度，因为转化基因编码的蛋白在生理条件下活性较低，物种间基因水平转移而产生任何被选择优势的可能性较低。因此，不可能出现转基因植物比野生天然植物优越的情况或因基因转移产生倾向于转化种群的被选择优势。

实施例2显示本发明的广泛用途。实施例2叙述一种由实施例1变更得到的方法，该方法用来产生表达内含肽修饰木质素过氧化物酶的转基因花旗松种。何种特定靶蛋白被选择取决于该转基因植物的目标用途。在本实施例中，被选择的是一个能易化木材的一种化学成分——木质素的催化降解的木质素过氧化物酶基因。应用被内含肽修饰的木质素过氧化物酶时整株植物虽然在各个局部均以所需高效价产生非活化内含肽修饰木质素过氧化物酶，它仍能够再生。该酶随后可以通过内含肽的自我剪接能力被活化，产生比内含肽修饰木质素过氧化物酶更高活性的木质素过氧化物酶。这能够增强对不需要的木质素过氧化物酶的活性的调控。在生产纸浆、动物饲料、其它加工底物，改进机械制浆，生物漂白纸浆、改良通过降纸浆处理的废物、和产生具有用单一属性的生物聚合体方面，这些转基因植物物种是有价值的。

基因和内含肽修饰蛋白的构建

如上所示，任何天然蛋白都适合作为靶蛋白，靶蛋白选择依赖于植物的目标用途。例如，花旗松木质素修饰后，将其作为不同纸浆加工的底物是有益的。有益的编码蛋白的核酸可从phanerochaetechrysosporium中分离(GenBank Accession#M37701)[SEQ ID NO：25]。一个引物优选与扩增的正义链的5`末端相匹配，另一个与互补DNA链的5`末端相匹配，相关序列具有唯一性是有利的。

从凝胶中纯化PCR片段

通过电洗脱、酚提取、琼脂酶消化、玻璃珠提取或商业可得到的试剂盒，从凝胶中纯化核酸。优选使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen Valencia，CA)。

内含肽的选择

内含肽的选择完全取决于植物的目标用途和内含肽修饰蛋白。可使用存在的多种不同内含肽。在本实施例中，与实施例1具有相同性能的内含肽对实现花旗松物种的目标用途有益。因此，优选使用来自Pyrrococcus spp的Psp pol内含肽突变体(GenBank Accession#PSU00707)[SEQ ID NO：26]。该内含肽的优势在于它通过剪接产生处于优势连接态的天然蛋白(＞75％)，并且它的剪接对温度敏感，即在＜30℃时可被抑制、50℃才恢复，此温度下非裂解蛋白的半衰期小于2小时。在体外，pH变化诱导剪接，因而增加了后续加工转基因植物的灵活性。

载体的转化

使用包含在重组根瘤土壤杆菌中的载体，依赖细菌的特定输送系统基因转化花旗松。其他基因转化方法也可以，根据植物材料的来源和其应用的容易程度选择合适的转化方法，转化参数的某些改进和优化通常是必需的。

重组树的应用

实施例2的树可用作材料来源来纯化木质素过氧化物酶或内含肽修饰木质素过氧化物酶。另外，它本身还可以在许多应用中用于生产木浆，例如纸产品、动物饲料、复合材料等等。实施例1和2都表明了树的用途，当然根据本发明的目标用途，其它植物也是可用的选择。在许多地区，这种树生长得并不很好，而草、蔓藤、海草或其他植物生产得很好，可以同样使用。另外，很多水果和蔬菜也可以从内含肽修饰蛋白技术中获利，如诱导成熟、害虫抗性或其他用途。因此，宿主植物的选择使没有限制的。通过使用本发明的CIVPS或内含肽修饰蛋白技术将促进植物作为重组蛋白来源的应用。所得的植物能表达任意数量的融合蛋白，其中融合部分包含一种不能促进融合蛋白外显肽的重组反而使目标蛋白与亲和层析纯化用蛋白结合的内含肽。在这种情况下，目标蛋白在体内可以或不具备完全活性。如果融合蛋白在植物中表达，就将其洗脱到亲和柱上，使融合蛋白的结合部分结合到柱上。然后处理柱，诱导内含肽剪接，冲洗目标蛋白，然后回收。本发明有医学用途的另一种变体是融合蛋白，其含有通过内含肽与保护性蛋白基团融合的治疗性蛋白或疫苗。这些治疗性蛋白在植物中表达并被人或动物食用(如在动物免疫时或激素治疗时)。于是，依赖于胃部的pH变化或由第三化合物的吸收诱导的硫醇梯度，在患者或动物体内发生内含肽剪接。剪接去除保护性蛋白基团，产生天然的治疗性蛋白或疫苗，然后在肠道中吸收。

实施例1或2的表达内含肽修饰蛋白的转基因植物能有效地用于大规模工业加工，如实施例3所示。通过对花旗松种进行与实施例2相似的修饰可以提高其自身的制浆过程。

树加工

使木质纤维素物质降解的一般预处理方法包括浓酸(通常是硫酸)预处理，稀酸预处理、氨气爆炸预处理和热水预处理。其他预处理方法也可以。如果需要，优化表达内含肽修饰蛋白的转基因树的设计以充分利用预处理方法。内含肽剪接可以在容器中通过任何已知的方法，其示例包括但不限于：改变pH值、改变温度、光照暴露、声音刺激或添加任何外源化合物。

目标用途和加工方法变化

实施例3加工方法的优选变更包括将预处理、剪接、消化和发酵步骤合并。这种优选的加工方法合并可以发生在任一步骤之间，然而优选在单个单元操作中同时合并所有步骤。这种优选组合方式通过减少资金支出和损耗、降低物质成本和减少加工过程中投入的能量和化合物成本而节约成本。另外，由于与制造相同产品的竞争性化学加工方法相反，通过减少排放和有毒废物再生对环境有利。在实施例3中，产品的选择依赖实现目标生物转化的发酵所使用的微生物。能降解纤维素的微生物都可以有效的产生目标产品。因此，可制备的终产品范围将非常广泛。本发明的内含肽修饰蛋白承载植物使物质具有易于处理属性，从该物质获利的应用包括但不仅限于：燃料生产、化合物生产、纺织品生产、二聚体生产、食品生产和糖化作用。尽管实施例3主要是被降解的转基因植物的发酵过程，但内含肽修饰植物也可用传统化学方法加工。例如，实施例2的植物优选用于纸浆。在该加工方法中，好处源于减少了用于漂白木材的粗化合物。这将可能使化合物投入的费用减少、产生危险材料和污染减少和在处理过程中的一些潜在合并。另一种用途是用于棉花洗涤的果胶酶或用于纺织产品加工的纤维素酶的用途。在这种情况下，能通过更多的传统化学加工方法获得终产品，但是与通常使用的正常粗化学处理情景不同，利用内含肽修饰蛋白植物物质将更有利。

动物饲料通常添加以各种酶，以增加饲料的营养价值并减轻因动物肥料在周边场所大量堆积而经受的环境负担。通过纯化酶作用于植物聚合物使营养价值增加，帮助动物消化饲料，于是更多的有益饲料成分得到利用。通过限制添加的矿物量，如无机磷的量，使环境负担减轻；因为在活性酶存在时能从植物本身获得无机磷酸盐。与非修饰蛋白不同，使用内含肽修饰蛋白的好处是引起多蛋白高水平表达，这不会干扰植物再生，但会使酶在胃部产生目标剪接活性。与其外源性生产和加入到食物不同，输送酶到食物自身中能减少饲料成本。另外，在体内使用接近失活的蛋白的编码基因的其它好处在于它提供的技术平台不可能涉及一些与基因水平转移至天然植物物种相关的环境风险。这种有利的环境效果，不管它已经实现或者尚在设想中，适用于所有的内含肽修饰蛋白植物产品。实施例4阐述了在油菜籽中构建内含肽修饰肌醇六磷酸酶，以作为动物饲料。

用途和变更

肌醇六磷酸酶是一种将动物食品内的肌醇磷酸转化为无机磷酸的酶。减少动物饲料生产所需要的磷酸辅料，以及降低动物肥料中带来当地水质污染的磷酸含量将带来经济方面的效果。尽管下述实施例4阐述了在油菜籽中构建内含肽修饰肌醇六磷酸酶和作为动物饲料的用途，但也同样可以用一些其他有价值的天然蛋白，例如，可以用纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、胶质酶、脂酶或生长激素或免疫抗原等替代肌醇六磷酸酶，或添加到后者之上。每种酶在用于动物饲料辅料方面都具有潜在价值。

实施例5阐述了本发明的一个优选具体实施方案。构建转基因玉米，作为乙醇加工物质。本例中，再次应用实施例1中的内含肽修饰基因序列仅仅是为了证明的目的。然而，在一个优选的具体实施方案中，几个内含肽修饰蛋白可同时表达，以优化目标植物用于发酵加工过程的降解加工特性。靶酶可以选自一般的公知酶，如纤维素酶(E.C.3.2.1.4)、外纤维素生物水解酶(E.C.3.2.1.19)、葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)，这些酶可以与酶分类中3.2.1.x项下的任何酶，或所需的其它种类的酶一起表达。除了多个内含肽修饰蛋白同时表达外，本具体实施方案优选能够再生和具有稳定基因遗传性的可育植物。

转化信息

大粒子被用来加速微粒子，后者进入植物细胞。

现在已经对本发明进行了一般性描述，参考具体的实施例将会更好地理解本发明，这些实施例仅是说明的目的，而不对本发明或其任何具体实施方案产生限制，除非另有特别声明。

实施例

实施例1：表达内含肽修饰纤维素酶的转基因白杨的生产

本实施例应用纤维素酶。首先组装载体，所述载体包含内含肽修饰蛋白DNA编码序列。为了构建该载体，首先制备一个内含肽修饰蛋白DNA序列，然后将其包装到目标载体中。该植物的目标蛋白是从芽孢杆菌NBL420中分离的纤维素酶(Genbank Accession#AY039744)[SEQ ID NO：27]。从芽孢杆菌NBL420中分离出DNA模板，PCR扩增该蛋白的对应基因。将模板DNA、两种与扩增模板DNA 3`端互补的引物、TaqDNA、聚合酶反应缓冲液(10X缓冲液包括500mM KCl，100mMTris-Cl pH 9.0，0.1％Triton X-100)和MgCl₂在250L的薄壁PCR管中混合，进行PCR反应。一旦混合，每个反应管置于热循环中，该热循环设定为35个循环，包括三个步骤，94℃、30秒，60℃、60秒，72℃、120秒。扩增后，生成的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上与分子量标准(Iivitrogen，Carlsbad，CA)在1X TAE(或TBE)缓冲液中电泳，溴化乙啶(0.5g/mL)印迹。应该小心操作以确保得到大约3200个核苷的合适大小的条带。然后用解剖刀从凝胶中切出该条带，用市售凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化(从凝胶物质中分离)。一旦片段从凝胶中纯化出来，用限制性消化或测序进行分析(参考Ausbel等；Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，NewYork(1998))。基因扩增后，插入内含肽序列片段修饰基因。本例中，使用来自Pyrrococcus spp的Psp pol内含肽突变体(GenBankAccession#PSU00707)[SEQ ID NO：26]。该突变体已在文献中描述，包含一个酪氨酸⁵³⁴残基变为蛋氨酸的突变(参见Xu，M，Perler，F，(1996)The mechanism of protein splicing and its modulation bymutation，The EMBO Journal 15：5146-5153)。该内含肽在体外由于pH变化而裂解。然后用PCR扩增内含肽编码序列，模板为Pyrrococcus spp的染色体组DNA。使用标准方法和下列引物进行PCR扩增(例如，30个循环，包括94℃、30秒，60℃、60秒，72℃、120秒)。

5’-A TT A TGTGCA T AGAGGAA TCCAAAG-3’[SEQ ID NO：5]

5’-AGCA TTTTACCGGAAGAA TGGGTTC-3’[SEQ ID NO：6]

扩增一旦完成，将PCR产物转移到1％琼脂糖凝胶上，在1X TAE或TBE缓冲液中电泳。生成条带按上述对天然纤维素酶编码序列的方法进行纯化和分析。这时的这两个PCR产物片段显示在附图1中，一个编码纤维素酶蛋白，另一个编码内含肽多肽序列，将两者连接。其中，内含肽插入到了天然蛋白的框架内，于是天然蛋白的丝氨酸残基在内含肽和该天然蛋白的C-外显肽之间的连接点处成为末端C-外显肽氨基酸。生产内含肽修饰蛋白片段时首先用PCR扩增纤维素酶基因的C-外显肽序列。扩增C-外显肽序列所用的引物是交叉引物，即它不仅针对C-外显肽，也针对内含肽的与C-外显肽序列毗邻的包含组氨酸和天冬氨酸密码子的末端：：

5’-TTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCCGGAAACGGCGGTGTCT CCTCG-3’[SEQID NO：7]

5’-GTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGAACGAATTTTG TGA-3’[SEQID NO：2]

生成序列的长度为604个核苷。然后用正义引物和反义引物扩增内含肽，所述正义引物含有包含末端色氨酸密码子的内含肽末端和纤维素酶基因的N-外显肽末端，反义引物含有内含肽和C-外显肽的特定核酸。本例PCR反应中，应用下列引物以得到一1661核苷长的序列：

5’-CAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGA TGGGTTC-3’[SEQID NO：1]

5’-GAGGTAGACACCGCCGTTTCCGGAATTATGTGCATAGAGGA TCCAAAG-3’[SEQID NO：8]

然后使用PCR扩增N-外显肽，一个引物包含正义N-外显肽链的特定核酸，另一个引物包含N-外显肽链和邻近内含肽序列的特定核酸。纤维素酶的N-外显肽部分得到扩增，使用下列引物，生成一1541核苷长的序列：

5’-GCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATA ATTTTC-3’[SEQ ID NO：9]

5’-AACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTAGCATCGCTCGCTCGTTCC CATTCTGTG-3’[SEQ ID NO：10]

一旦这三个反应完成，清洗每个PCR片段以去除残留引物，然后，通过另外两个PCR反应将C-外显肽、内含肽和N-外显肽PCR产物片断连接在一起。在两个单一反应中分别扩增内含肽或一个纤维素酶外显肽区域，即C-外显肽或N-外显肽，将生成的两个PCR片产物段等摩尔混合，如上所述进行PCR反应。该反应不需要多余的外加引物，产生第一内含肽-外显肽融合体。清洗该反应混合物，将等摩尔经清洗的融合产物与另一个的外显肽部分混合，不添加额外的引物，再次PCR。在最后两个PCR反应中，不需要外源引物，在内含肽-外显肽连接处发生退火。经Taq聚合酶，退火区延伸并产生最终融合产物。通过该反应得到一种内含肽被插入到所需的准确位置的内含肽修饰蛋白的编码序列。再次清洗终反应产品，进行最后一次PCR扩增，所用引物序列特异于纤维素酶外显肽末端，且具特异末端方便于连接到克隆载体。该反应一结束，将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，纯化3806个核苷长的合适条带，然后根据上述方法分析。得到的内含肽修饰蛋白编码序列(核苷酸片段)包含核糖体连接位点、起始于N-外显肽的起始密码子、带有以合适方向插入到阅读框内的内含肽的内含肽修饰纤维素酶的完整序列和位于C-外显肽末端的终止密码子。使用文献[Ausbel等，Current Protocols in Molecular Biology(1998)]和[Parsons TJ，Sinkar，VP，Stettler，RF，Nester，EW，Gordon，MP，″Transformation of Poplar by Agrobacteriumtumefaciens，″Biotechnolog 4：533-536，1986]中描述的方法，将该内含肽修饰纤维素酶编码序列克隆到pTiBo542中，在T DNA中替换tms和tmr基因，此时表达盒中包括“MAC”启动子、甘露碱合成酶终止子和卡那霉素抗性标记。通过本领域公知的合适方法(如电穿孔或CaCl₂方法)，将该载体转化到根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)A281中。各种转化方法在上述文献[Ausbel等，1998]中也有描述。

使用改进的叶盘(leaf disk)法以使重组根瘤土壤杆菌转化到目标Populas trichocarpa×美洲黑杨(deltoides)，H11植物种中。将该重组根瘤土壤杆菌在选择性培养基中30℃下摇床培育，该培养基包括50％MG培养基(10g/L甘露醇，2.32g/L谷氨酸钠盐，0.5g/L KH₂PO₄，0.2g/L NaCI，0.2g/L MgSO₄-7H₂O，0.002g/L生物素，pH 7.0)，50％luria肉汤(20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物和10g/L NaCl)和合适的抗生素。为了进行转化，用20％漂白剂、0.1％Tween 20和30mg/L的Benomyl系统杀真菌液(Chas.H.Lilly Co.，Portland，OR)将大约7mm长和2-3mm直径的小绿色木材茎部分杀菌。蒸馏水冲洗后，将茎部分无菌转移到根瘤土壤杆菌培养基中，细胞浓度为大约5×10⁸细胞/Ml，培养16小时。植物茎暴露于重组根瘤土壤杆菌培养物后，将其转移到在垂直位置补加了玉米素核糖甙和卡那霉素的固体Murashige-Skoog培养基中[参考文献：Murashige T，SkoogF，″A revised medium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures，″Physiol.Plant，15：473-497，1962]。一旦根开始生长，芽就能发育。每2-3周，将再生植物转移到新鲜培养皿中，在植物生长期间，保持正常光照周期并增加培养箱中的湿度。一旦根形成，将外植体转移到没有玉米素核糖甙但含有卡那霉素的固体培养基中，2-3周后，将植物转移到装有土壤的盒子中生长4-5天，然后再植到土壤中，在温室或可控土块中完成生长。用几种方法监测初始植物以确保内含肽修饰纤维素酶DNA序列已经转移到基因组中，并且表达蛋白具有活性。通过用内含肽修饰纤维素酶编码序列作为探针，对转基因植物分离的基因组DNA进行southern分析来进行基因监测，如上述文献[Ausbel等，1998)]所描述。如上所述，用内含肽修饰纤维素酶编码序列作为探针，以转基因植物基因组DNA为模板进行PCR。溴化乙啶着色的胶中出现大小接近的条带证明存在内含肽修饰纤维素酶编码序列。也可以对植物基因组DNA进行直接测序。通过用内含肽修饰纤维素酶和天然纤维素酶的特异性抗体进行western分析来监测蛋白产物。另外纤维素酶活性检测方法是本领域公知的，可以对非剪接内含肽修饰纤维素酶和剪接内含肽修饰纤维素酶活性进行定量分析。

实施例2：转基因花旗松的生产

表达内含肽修饰的木质素过氧化物酶

本实施例应用与实施例1相同的方法构建包含内含肽修饰木质素过氧化物酶编码序列的构建体。主要的差异是使用的根瘤土壤杆菌质粒、经修饰的天然蛋白序列和选择用来扩增新的内含肽修饰木质素过氧化物酶编码序列的引物。

木质素过氧化物酶基因(Genbank Accession #M37701)[SEQ ID NO： 25]以黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。如实施例1的描述进行PCR反应，所用引物为：

5’-TGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAG-3’[SEQ ID NO：11]

5’-TTAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTG-3’[SEQ ID NO：12]

扩增后，生成的PCR产物如实施例1所述与分子量标准用琼脂糖凝胶电泳分析，溴化乙啶染色后，得到大约1567个核苷大小的条带，用解剖刀将其从凝胶中切下，用如上所述方法纯化。片段从凝胶中纯化后，用限制性消化或测序进行分析(参考Ausbel等，1998)。

基因扩增后，将内含肽序列插入到该基因序列而使其修饰。例如，使用与实施例1相同的内含肽，用与实施例1所述的相同方法扩增内含肽，通过如前所述方法进行内含肽扩增和凝胶电泳纯化和分析。

将两个PCR产物片段，一个编码木质素过氧化物酶，另一个编码内含肽多肽序列，相互连接。为确保正确的内含肽剪接，将该内含肽插入到木质素过氧化物酶的序列框内，紧邻丝氨酸残基，同时丝氨酸位于内含肽的组氨酸与天冬氨酸保守残基(即末端536和537氨基酸位点)的羧基侧。内含肽插入到天然蛋白中，使天然蛋白的丝氨酸残基成为介于天然内含肽和该天然蛋白的C端外显肽之间的连接点的属于C端外显肽的氨基酸。内含肽位于天然蛋白内，他的存在大幅度降低了内含肽修饰后蛋白的活性。在大多情况下，在该分子活性位点内或附近的任何丝氨酸残基都能达到上述目的，然而作一些优化也是必需的。

使用实施例1相同的PCR，生产内含肽修饰蛋白序列，唯一不同是引物选择。使用上述PCR反应产物清洗后的基因产物对木质素过氧化物酶的C-外显肽部分进行扩增，得到一个长445个核苷的序列，引物如下：

5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCTCGCCCGCGACTCCCG CACCGCT-3’[SEQ ID NO：13]

5’-TAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTGGAAGAGGAATATGTCA GCTGGGGGC-3’[SEQ ID NO：14]

使用相同模板，对木质素过氧化物酶的N-外显肽部分进行扩增，所用的PCR引物如下：

5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAGCGATTTCCCTCGCACTC TCGCTCAC-3’[SEQ ID NO：15]

5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGTGTGGTCGGTCTGGA TGCGGATCT-3’[SEQ ID NO：16]

生成的序列长为1196个核苷。内含肽编码序列置于木质素过氧化物酶基因内，如实施例1所述对其进行PCR扩增。在该反应中，使用Pyrrococcus spp基因组DNA为模板，引物如下：

5’-AGATCCGCATCCAGACCGACCACACAGCATTTTACCGGAAGA ATGGGTTC-3’[SEQ ID NO：17]

5’-GCGGTGCGGGAGTCGCGGGCGAGAATTATGTGCATAGAGG AATCCAAAG-3’[SEQ ID NO：18]

生成的序列长为1660个核苷。这些反应一旦结束，将反应产物按上述方法在琼脂糖凝胶中电泳、纯化和分析。如实施例1所述方法将外显肽和内含肽部分连接。在本例中，将内含肽片段和等摩尔木质素过氧化物酶C-外显肽部分混合。组合这些片段通过以所需的模板和引物进行PCR反应而得到。在与实施例1相同的条件进行PCR，一旦完成，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，条带长大约2106个核苷，然后从凝胶中纯化。用如实施例1所述的方法分析纯化的条带。少量纯化反应产品在UV光谱仪上260和280nm波长处进行吸收定量测定。

通过另一些PCR反应得到内含肽修饰蛋白的DNA编码序列。将刚构建的C端外显肽与内含肽片断融合体与等摩尔量的预纯化N-外显肽片段连接。PCR反应条件与前相同。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，条带大约3302个核苷，然后根据实施例1的方法从凝胶中纯化、分析。最终的内含肽修饰蛋白编码序列在木质素过氧化物酶编码序列内含有以合适方向插入到阅读框内的完整内含肽序列。

将内含肽修饰木质素过氧化物酶编码序列克隆到植物表达盒中。本例中使用具有卡那霉素抗性、缺乏octupine合成酶基因但包含octupine转录调控序列的pTiA6质粒。将内含肽修饰的木质素过氧化物酶的编码下列连接到限制性PTiA6中，处于octupine转录调控序列(启动子和3`聚腺苷酸位点)的调控下。用生成的连接载体转化根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)K12X562，可以使用任何合适方法(例如电穿孔或CaCl2方法)。在Ausbel等的文章(1998)中描述了转化方法。

利用重组根瘤土壤杆菌转化花旗松及其结节部分或种子样品。幼芽根据前述方法(Gupta PK，Durzan，DJ，″Shoot multiplicationfrom mature trees of Douglas-fir，and sugar pine，″PlantCell Reports，9：177.179，1985)在含有DCR基本培养基的培养皿中增殖和生长。重组根瘤土壤杆菌培养物根据实施例1方法培养生长。为了进行植物转化，用20％漂白剂和0.1％Tween 20对培养物中大约50mm长的再生幼芽、种子表面进行杀菌。杀菌后，用无菌的双蒸去离子水在无菌条件下冲洗幼芽或种子。首先用无菌针扎伤表皮组织或用无菌刀切割表面以转化种子或幼芽。将受伤的种子或幼芽浸泡在重组根瘤土壤杆菌培养物中，其中的细胞浓度大约为5×10⁸细胞/mL。暴露于重组根瘤土壤杆菌培养物中大约12小时后，将种子或幼芽培养在DCR基本培养基(2.2％蔗糖，0.8％Bacto(Difco)琼脂)中。培养条件包括：25℃下16小时的光照期，然后在20℃的温室或生长室中8小时的黑暗期。每2-3周将再生植物转移到新鲜培养皿中；根一旦形成，就将外植体转移到装有土壤的盒子中，4-5天后再植入温室或可控土块的土壤中并完成整个生长。第一年在温室中生长，温度条件可控，不超过30℃。

用与实施例1相似的方法对上述植株进行监测，除了在western分析时使用特异性木质素过氧化物酶蛋白或内含肽修饰的木质素过氧化物酶蛋白。

生成的转基因花旗松种无限地生长，且产生高效价内含肽修饰木质素过氧化物酶。因为用于修饰的内含肽相同，所以随后木质素过氧化物酶以与实施例1相同的方法被激活。

实施例3：发酵物质的制备加工方法

使用植物表达内含肽修饰蛋白

在实施例1中，转基因白杨可作为底物通过发酵来生产乙醇。该加工方法中，转基因树以链锯或斧头等合适的工具收集。接着用机械制浆机将该树制成浆，然后将该浆液倒入罐中。经任何必须的预处理后，提高罐内温度或降低pH值到4来诱导内含肽剪接。依赖于使用的预处理方式，内含肽剪接也可以被预处理诱导，平行发生于加工操作中。一旦剪接后，天然酶活性开始消化浆液中的纤维素，增加单糖浓度。

剪接诱导后，将糖化容器的内容物以任意比例与天然白杨浆液或其他物质混合，以促进这些物质的纤维素降解。混合的比例依赖于转基因白杨纤维素酶活性，即在植物中表达的具有功能的内含肽修饰蛋白的数量以及剪接效率、重组效率和混合的天然纤维素酶对物质的活性。每个参数都有广泛选择范围的可能值，可以优化以促进更经济地加工。

用0.22m或更小孔径的过滤器过滤，或成批热蒸馏，或通过热交换器连续蒸馏经降解的纤维素中的无菌生成的葡萄糖。将无菌葡萄糖加入到发酵工艺中用作底物，用文献中所描述的方法来生产乙醇。参见H.K.Sreenath和T.W.Jeffries，″Production of ethanol fromwood hydrolysate by yeasts，″Bioresource Technology，72(3)：253-260，2000；Lisbeth Olsson和Barbel Hahn-Hagerdal，″Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanolproduction，″Enzyme and Microbial Technology，18(5)：312-331，1996；Kutluo O.Ulgen等，″Bioconversion of starch intoethanol by a recombinant Saccharomyces cerevisiae strainYPG-AB″，Process Biochemistry，37(10)：1157-1168，2002；M.Mete Altintas等，″Improvement of ethanol production fromstarch by recombinant yeast through manipulation ofenvironmental factors，″Enzyme and Microbial Technology，31(5)：640-647，2002；Farooq Latif等，″Production of ethanoland xylitol from corn cobs by yeasts，″BioresourceTechnology，77(1)：57-63，2001。

发酵加工以分批、补料分批和连续方式进行。

实施例4：作为动物饲料应用的表达内含肽修饰蛋白的植物

转基因油菜籽用基本上与实施例1和2相同的方法构建，进行如下改进：在构建CIVPS或内含肽修饰基因序列时，可以使用相同的内含肽编码序列，但在本例中内含肽融合到Aspergillus ficuum表达的肌醇六磷酸酶中。在本实施例中，内含肽修饰蛋白的选择依据是它是否能够在该动物的胃酸水平下被诱导产生蛋白剪接。由于其在低PH值环境中具有高水平活性(van Ooijen等.(2000)，美国专利6,022,846)，所以选择该肌醇六磷酸酶。在如上所述的相同条件下用下列引物扩增肌醇六磷酸酶C端外显肽：

5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTTCCTTCGACACCATCTC CAC CAGCA-3’[SEQ ID NO：19]

5’-CTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCACCGCCAGATCTGGCAAA GCTCAACC-3’[SEQID NO：20]

生成的序列长为627个核苷。内含肽序列用下列引物扩增，反应条件如上：

5’-AGTGACCTACCTCATGGACATGTGCAGCATTTTACCGGAAG AATGGGTTC-3’[SEQID NO：21]

5’-GCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAATTATGTGCATAGAGG AATCCAAAG-3’[SEQID NO：22]

最后，N-外显肽用如下引物扩增，得到928个核苷的PCR片段：

5’-ATGGGTGTCTCTGCCGTTCTACTTCCTTTGTACCTCCTGTCC GGAGTATG-3’[SEQ ID NO：23]

5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGCACATGTCCATGAGGT AGGTCACT-3’[SEQ ID NO：24]

用PCR法及如实施例1和2所述的方法清洗、分析并连接生成的DNA片段。该步骤产生内含肽修饰肌醇六磷酸酶的编码序列。然后将该连接的内含肽修饰肌醇六磷酸酶的编码序列扩增、清洗、分析，方法如实施例1和2所述。与实施例2相同，将该内含肽修饰肌醇六磷酸酶的DNA编码序列克隆到表达盒，然后转化根瘤土壤杆菌。生成的重组根瘤土壤杆菌用于转化油菜籽茎部分。转化完全按照实施例1和2所述的方法进行，有下列改进：用20％漂白剂溶液室温下对5-6周的植物的油菜籽茎部分灭菌25分钟。灭菌后，用无菌的双蒸去离子水在无菌条件下冲洗茎部分。通过在加有1mg/L BAP的Murashige-Skoog培养基中培养以对该部分进行预处理，24小时后将茎部分与含有内含肽修饰肌醇六磷酸酶的新转化的根瘤土壤杆菌一起培养48小时。紧接该培养步骤后，再生转基因植物，用卡那霉素抗性标记进行选择，后续步骤完全如实施例1和2所述。内含肽修饰肌醇六磷酸酶的插入也可用如实施例1和2所述的方法进行证实。

生成的转基因油菜籽被培育在地方法律许可的区域。该油菜籽成熟后收割，作为动物饲料添加物。另外，油菜籽也可以生长在动物放牧区，因为内含肽剪接可在动物胃部中自发发生，而使肌醇六磷酸酶活性激活。

实施例5：表达内含肽修饰纤维素酶的转基因玉米的生产和其在乙醇生产中的用途

本实施例显示一种实施本发明的方法。在本实施例中，构建了转基因玉米并将其用作生产乙醇的底物或其他发酵底物。在本实施例中，再次利用实施例1的内含肽修饰基因序列证明本发明效果。玉米易碎的胚源II型愈伤组织培养物的生长起始于温室生长的A188(University of Minnesota，Crop Improvement Association)xB73(Iowa State University)的大约1.6-1.8mm长的未成熟胚。收割后，用50％漂白剂室温下对片断表面灭菌25分钟，然后用无菌的双蒸去离子水冲洗。将收集的片段开始进行无菌培养，培养条件为：不超过10Em^-2S^-1的光照、24℃、改良的N6培养基(Chu，et al.，(1975)，″Establishment ofan Efficient Medium for AntherCulture of Rice through Comparative Experiments on NitrogenSources，″Sci.Sin.，18：659-668)中、pH 5.8、同时含2mg/L甘氨酸、2.9g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、100mg/L酪蛋白水解产物、20g/L蔗糖，以2g/L Gelgro(ICNBiochemicals)凝固化。

大约培养2周后，根据合适的形态学评估培养物。这种仔细的肉眼观察能发现性质良好的肉质胚。将能够增殖的合适形态转移到新鲜改良N6培养基中(如上所述)。每2-3周将具有合适形态的组织按常规方法进行次级培养，直到进行基因枪轰击。该目标内含肽修饰基因序列和表达载体按实施例1方法构建，在本实施例中，优选的表达载体有以下改进：用本领域公知的方法(例如，自合适模板PCR扩增潮霉素抗性标记物、以DNA核酸内切酶剪切载体、随后纯化和连接潮霉素抗性标记)将卡那霉素抗性标记取代为潮霉素抗性标记(Ausbel等，1998)。一旦构建后，载体以1∶1的摩尔比例沉淀在钨(平均直径1.2m，GTE Sylvania)或金颗粒中。如同该方法的其他步骤，沉淀参数可以作些微小优化，将1.25mg钨颗粒与溶于含有1.1M CaCl2和8.7mM亚精胺，总体积为575L的溶液中的25g载体DNA混合以完成沉淀。将沉淀在0℃涡旋10分钟。涡旋后，在500×g，离心混合物5分钟。离心后，去除大约550L的上清液，剩余的25L沉淀物等分分配到1L微粒中(Biolistics，Inc，Ithaca，NY)，除了上述提及的不同以外，按照Klein等的描述(1987)进行轰击。所有操作都是在无菌和冰上进行。

一旦生物微粒准备完毕，目标植物组织即准备进入轰击步骤。每个愈伤组织块重50mg(湿重)，将大量的愈伤组织块在60×15mm无菌陪替式培养皿(petri dish)(Falcon 1007)的中央排列成X图案。每次轰击需要准备几个培养皿，将这些培养皿顺序放置，位于微注射仪器的终止平板下5cm。培养皿位于该装置下方的中央，去盖，用3×3mm网筛覆盖在平板上，该网筛帮助限制位于培养皿中的被轰击组织。根据制造商的描述用微注射仪器进行组织轰击，商业上可用的微注射仪器可从Bio-Rad(Hercules，CA)得到。轰击后，将愈伤组织转移到新鲜的改良N6培养基中，按上述相同条件培养。

培养2天后，开始挑选转化细胞以进行随后的再生。将经过轰击程序的愈伤组织平板在无菌的状态下转移到新鲜、无菌的改良N6培养基中，其中潮霉素B(Calbiochem)的终浓度为10mg/L。暴露2周后，将所有的愈伤组织从选择平板无菌地转移到新鲜、无菌的改良N6培养基中，其中潮霉素B的终浓度为50mg/L。进行该转移从而使单一平板中只容纳5个30mg的愈伤组织块，因此平板数增加。在50mg/L潮霉素B的平板中培养3周后，将所有愈伤组织无菌转移到新鲜、无菌的改良N6培养基中，其中潮霉素B的终浓度为60mg/L。培养2周后，观察愈伤组织增殖块。挑选增殖块，并将其转移到改良的Murashige-Skoog培养基中，该培养基中加有0.5mg/L维生素B1、HCl、0.75mg/L、2，4-D50g/L蔗糖、150mg/L天冬氨酸和2.0g/L Gelgro。

此时务必确保被选择植物的成功转化。使用实施例1和实施例2的方法证明内含肽修饰纤维素酶的存在。在本例中，用本领域公知的方法，内含肽修饰纤维素酶编码序列和/或潮霉素抗性标记都可作为转化有效性标记，如同Ausbel等的描述(1998)。在改良的Murashige-Skoog培养基中培养2周后，将平板暴露在明(14hrs)暗(10hrs)交替的周期中于24℃下培养。将形成的幼小植物无菌地转移到装有100mL改良的Murashige-Skoog培养基的1L广口锥形瓶中，转移生成的植物到蛭石(VERMICULITE)中，1-2周后植入土壤中，生长发育至成熟。成熟植物基本按照实施例1的方法分析以确保内含肽修饰蛋白序列稳定转化，最好同时确保内含肽修饰纤维素酶成功表达。

生成的成熟植物可以通过标准技术异花授粉，该授粉可发生在两个转化植物之间或转化植物与非转化植物之间。检测培育得到的后代是否含有内含肽修饰纤维素酶和潮霉素抗性标记。注意，此时在挑选中使用的潮霉素抗性标记对于构建的转基因玉米的应用和用途不再是必需元件，只要含有内含肽修饰纤维素酶序列，保留的潮霉素抗性标记就不再是转基因玉米的必需成分。可以从能育的转基因植物中收集种子用于植物扩增，生成的转基因植物可生长用于与实施例3相似的加工。利用表达多个内含肽修饰蛋白的转基因玉米进行加工对于利用玉米植物的纤维素和淀粉部分，合并预处理、糖化、和发酵步骤和降低能源和原材料投入成本具有经济利益。转基因植物中含有内含肽修饰蛋白，这使有效使用该方法生产乙醇成为可能。

以上实施例并不对本专利范围产生任何限制，其仅仅是用来帮助阐述本专利所公开发明的实施方式。本领域技术人员都知道可以进行其他改进，这些改进也包含在本发明的范围内。

参考文献

Dale，Biotechnol.Prog.15：775-776(1999).

Committee on Biobased  Industrial Products，BiobasedIndustrial

Products：Priorities  for  Research  and  Commercialization，National Academy Press，Washington D C(1999).

Cameron，et al.，Biotechnol.Prog.14：116.125(1998).

Park，et al.，Biotechnol.Prog.14：699-704(1998).

Taylor，et al.，Biotechnol.Prog.16：541.547(2000).

Poirier，Nature Biotechnology 17：960-961(1999).

Lynd，Biotechnol.Prog.15：777-793(1999).

Ingram，Biotechnol.Prog.15：855-866(1999).

Aspergren，et al.，Molecular Breeding 1：91-99(1995).

Mansfield，et al.，Biotechnol.Prog.15：804-816(1999).

Evans，et al.，Protein Science 7：2256-2264(1998).

Perler，et al.，Nucl.Acids Res.22：1125-1127(1994).

Xu，et al.，EMBO 15：5146-5153(1996).

Wood，et al.，Biotechnol.Prog.16：1055.1063(2000).

Clarke，P.N.A.S.(USA)91：11084.11088(1994).

Derbyshire，et al.，P.N.A.S.(UBA)95：1356-1357(1998).

Perler，et al.，Nucleic Acids Res.22：1125-1127(1994).

Wallace，C.J.，Protein Sci.2：697-705，(1993).

Xu，et al.，Cell 75：1371-1377(1993).

Pietrokovski，S.，Protein Sci.3735：2340-2350(1994).

Ausbel，et al.，″Current Protocols in Molecular Biology，″Wiley，NewYork(1998).

Draper，et al.，″Plant Genetic Transformation and GeneExpression：

A Laboratory Manual，″Blackwell Scientific Publications，Boston(1998).

Potrykus，et al.，″Gene Transfer  to Plants，″Springer，NewYork

Guilley，et al.，Cell，30：763(1982).

Higgins，T.J.V.，Annu.Rev.Plant Physiol.35：191(1984).

Coruzzi，et al.，EMEO J.3：1671(1984).

Tingey，et al.，EMBO J.6：3565(1987).

Ryan，et al.，Nuc.Acids Res.17：3584(1989).

Rocha-gosa，et al.，EMBO J.8：23(1989).

Wenzler，et al.，Plant Mol.BioI.12：41(1989).

Bird et al.，Plant Mol.BioI.11：651(1988).

Brederode，et al.，Nucl.Acids Res.8：2213(1980).

Smeekens，et al.，T.I.E.S.15：73(1990).

van den Broeck et al.，Nature 313：358(1985).

Schreier，et al.，EMBO J.4：25(1985).

Tague，et al.，Plant Phys.86：506(1988).

Yon Heijne，G.，J.Mol.BioI.189：239(1986).

Sijmons，et al.，Bio/Technol.8：217(1990).

Gordon-Kamm，et al.，The Plant Cell 2：603(1990).

Shimamoto，et al.，Nature 338：274(1989).

Horsch，et al.，Science 2：1229(1985).

Ziegler，et al.，Molecular Breeding 6：37.46(2000).

Dai，et al.，(a)，Molecular Ereeding 6：277-285(2000).

Dai，et  al.，(h)，Molecular  Breeding  9：43-54(2000).

Montvalvo.Rodriguez，et al.，Biotech.and Bioeng.2：151-159(2000).

U.S.Patent No.6,022,846.

Chu，et al.，Sci.Sin.18：659.668(1975).

Klein，et al.，Nature 327：70-73(1987).

至此，已经对本发明进行了完整的说明，显然，本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明作一些改变和改进。

Claims (38)

1.一种在转基因植物中表达修饰蛋白的重组DNA表达构建体，该表达构建体包括编码修饰蛋白的序列，该修饰蛋白具有靶蛋白和融合在该靶蛋白内的内含肽，其中所述的内含肽序列可诱导引起该修饰蛋白的顺式剪接。

2.根据权利要求1所述的方法，该表达构建体进一步包括一或多个核苷酸序列，该核苷酸编码至少一个可选择的标记、报道基因和启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中：

至少一个可选择标记具有对溴苯腈、2，2-二氯丙酸、G418、草甘膦、吡氟氯禾灵、潮霉素、咪唑啉、卡那霉素、甲氨蝶呤、新霉素、草胺膦、稀禾定、单端孢霉烯、磺脲、s-三嗪、甘露醇和/或三氮嘧啶中一种或多种化学物质的抗性；以及

启动子先于编码修饰蛋白的序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其中转基因植物对一种或多种化学物质的常规剧毒性有耐受性或抗性。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的内含肽选自酵母属真菌、Psp pol内含肽、源于结核杆菌的内含肽和源于Thermococcus litoralis的内含肽。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的内含肽选自源于适温生物的内含肽。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的内含肽选自Tersnf2、Ter RIR1-4、Rma dnaB、Tfus recA-1、Tfus recA-2、AaeRIR2、Tth RIR1-1、Tth RIR1-2、Tth DnaE-1、Mex Helic、ChyRIR1、Gob DnaE、BspM1918RIR1、Tvo VMA、Mka CDC48、MkartcB、Mka VatB、Mka RFC、Tfu pol-2、Tag pol-1、Psp pol-1、Pfu topA、Pfu IF2、Pfu CDC21、Pfu lon、Pho pol、PhortcB(PH1602)、Pho CDC21-1、Pho r-gyr、Pho lon、Pho VMA、Pab polC、Pab rtcB(PAB0383)、Pab IF2Pab RIR1-1、PabRIR1-2、Pab RIR1-3、Pab CDC21-1、Pab CDC21-2、Pab RFC-1、Pab lon、Pab VMA、Pab klbA、Pab moaA、Mja pol-1、Mja pol-2、Mja hyp1(MJ0043)、Mja rtcB(MJ0682)、Mja helicase(MJ1124)、Mja GF6P、Mja RNR-1、Mja RFC-1、Mja RFC-2、MjaRpolA’、Mja RpolA″、Mja TFIIB、Mja r-gyr和AApe hyp3(APE0745)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的内含肽是热诱导的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白选自木质纤维素降解蛋白、源自微生物的木质纤维素降解蛋白、E.C.3.2.1.4等级的纤维素酶、E.C.3.2.1.91等级的外切纤维二糖水解酶、E.C.3.2.1.21等级的葡糖苷酶、内切纤维素酶、外切纤维素酶、木聚糖酶、半纤维素酶、木质酶、木质素过氧化物酶和纤维素酶。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白为改变至少一种物质水平的蛋白，该物质选自葡萄糖、果糖、甘油、甘氨酸三甲内盐、果胶、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、一种或多种氨甲酸、一种或多种脂、一种或多种维生素和/或淀粉。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白为改变至少一种物质活性的蛋白，该物质选自蛋白质、RNA和脂质。

12.根据权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其中所述的靶蛋白选自苏云金芽孢杆菌内毒素、Phytolacca insularis蛋白、病毒Y蛋白、双粒病毒组蛋白、黄瓜花叶病毒2b蛋白和黄瓜花叶病毒蛋白。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白能降解一种物质，该物质选自淀粉、糊精、胶质、脂、蛋白质、甲壳素、木质素、纤维素和半纤维素。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白选自能产生葡萄糖、果糖、木糖、酚、甘油、甘露糖、乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、异丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、维生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷和苯的蛋白质。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白选自淀粉降解酶、淀粉酶和葡聚糖酶。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的靶蛋白选自重组免疫原、具有糖化活性的蛋白、燃料或化学品生产合成路径中所需的酶、细菌或病毒抗原、维生素或其它食品添加剂生产合成路径中所需的酶、植酸酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、传递害虫或昆虫抗药性的蛋白、传递除草剂抗药性的蛋白、治疗性蛋白、胰岛素、红细胞生成素、生长激素、瘦蛋白、组织胞浆素原活化体、组织坏死因子受体、Her2受体和包含在疾病机理中的蛋白。

17.根据权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其中所述的修饰蛋白在转基因植物生命周期的预设点表达；

所述的修饰蛋白在至少一个特定组织或其部分；和/或

所述的修饰蛋白在至少一个特定的亚细胞区室；和/或

所述的修饰蛋白在细胞外表达和分泌。

18.根据权利要求1-8中任一权利要求所述的方法，其中所述的特定组织为种子、根茎、果实、茎、块茎和/或种子根茎、果实、茎、块茎和/或叶组织；以及

特定的亚细胞区室为胞液、线粒体、质体、内质网、内含体、液泡和/或细胞核。

19.一种生产转基因植物的方法，该方法包括：

提供权利要求1-18任一权利要求所述的表达构建体；

用该表达构建体转化植物、植物部分、幼苗、组织、细胞、种子、芽苗或原生质体；以及

从转化的植物、植物部分、幼苗、组织、细胞、种子、芽苗或原生质体中再生转基因植物。

20.一种加工植物的方法，该方法包括：

获得权利要求19所述方法生产的转基因植物；以及

在转基因植物或其部分的至少一部分存在下，诱导剪接该修饰蛋白。

21.一种生产修饰蛋白的方法，该方法包括：

执行权利要求19所述的方法；以及

收获该修饰蛋白。

22.根据权利要求21所述的方法，进一步包括提纯该修饰蛋白。

23.一种生产修饰蛋白的方法，该方法包括：

执行权利要求19所述的方法；以及

在有效表达修饰蛋白的条件下培养转基因植物或培育其亚细胞组分。

24.一种生产表达修饰蛋白种子的方法，该方法包括：

获得权利要求19所述方法生产的转基因植物；

培养或培育转基因植物；以及

获得相应的种子。

25.一种使用权利要求1-9，13-15或17-18中任一权利要求所述的表达构建体制备生物燃料的方法，该方法包括：

收获根据权利要求19所述方法制备的转基因植物；

机械加工该转基因植物，以生产机械加工过的转基因植物材料；以及

在有效的条件下，化学处理该机械加工过的转基因植物材料，获得用于生物燃料或制备生物燃料的化合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的机械加工包括至少一种挤压、研磨、撕裂、覆盖、破碎、切割、压缩、炸开或裂开。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，在化学处理之前，进一步包括将机械加工过的转基因植物材料和第二植物以大于零的合适比例组合，形成组合材料；其中的化学处理步骤包括用化学处理组合材料，从而替代用化学处理机械加工过的植物材料。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的化学处理包括至少用蒸汽、稀释或浓缩的酸中的一种预处理，以及包括氨爆破、杀菌、在水中浸泡、和溶剂混合、改变pH、改变温度、改变渗透压、改变曝光、无机和/或酶催化、糖化、漂白、净化、发酵、蒸馏、层析、吸附或加入化学品。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的预处理包括用蒸汽对组合材料进行灭菌。

30.根据权利要求25所述的方法，其中所述的化学处理包括其中的一种：

用至少一种硫酸、盐酸、磷酸或碳酸预处理；

在大于或等于20℃的温度下于水中浸泡；

将组合材料和至少一种水、有机或无机溶剂混合。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的预处理包括同时用蒸汽处理、糖化水解和发酵。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述的发酵用原核或真核微生物进行。

33.根据权利要求25所述的方法，其中所述的化学处理包括至少用蒸汽、稀释或浓缩的酸中的一种预处理，以及包括氨爆破、杀菌、在水中浸泡、和溶剂混合、改变pH、改变温度、改变渗透压、改变曝光、无机和/或酶催化、糖化、漂白、净化、发酵、蒸馏、层析、吸附或加入化学品。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述的化学处理包括其中的一种：

用至少一种硫酸、盐酸、磷酸或碳酸预处理；

在大于或等于20℃的温度下于水中浸泡；

将组合材料和至少一种水、有机或无机溶剂混合。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述的预处理包括同时用蒸汽处理、糖化水解和发酵。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述的发酵用原核或真核微生物进行。

37.一种动物饲料，包含权利要求19所述方法生产的转基因植物的营养成分。

38.一种生产靶蛋白的方法，该方法包括：

获得权利要求19所述方法生产的转基因植物或其亚细胞组分；以及

诱导修饰蛋白的剪接。

Images