JP2010042034A - Civpsまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物と、その関連の手法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CIVPSあるいはインテイン組換タンパク質を発現するトランスジェニック植物の組成は次の事項を含む、トランスジェニック植物からつくられた多様な応用成果物、CIVPSあるいはインテイン組換遺伝子を含むトランスジェニック植物を構成する手法、植物におけるCIVPSあるいはインテイン組換タンパク質を発現する手法、そしてトランスジェニック植物の利用法。
【選択図】図1
Description
ら再生されるであろう。
5’−ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC−3’ [SEQ ID NO:1]
5’−CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA−3’ [SEQ ID NO:2]
5’−AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC−3’ [SEQ ID NO:3]
5’−CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA−3’ [SEQ ID NO:4]
5’−CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCCGGAAACGGCGGTGTCTACCTCG−3’ [SEQ ID NO:7]
5’−CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA−3’ [SEQ ID NO:8]
5’−ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC−3’ [SEQ ID NO:9]
5’−CGAGGTAGACACCGCCGTTTCCGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG−3’ [SEQ ID NO:10]
5’−AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC−3’ [SEQ ID NO:11]
5’−GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTAGCATCGCTCGTTCCCCATTCTGTG−3’ [SEQ ID NO:12]
5’−ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAG−3’ [SEQ ID NO:13]
5’−TTAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTG−3’ [SEQ ID NO:14]
例1にて述べられているようにPCR反応に使われる。拡大についで、結果として生じるPCR成果物は、例1に記述したように分子量標準を伴って、アガローゼゲル上のゲル電気泳動を使って分析される。エンチジウム臭をともなったゲル臭化物の付着した後、1567basepair(bp)バンドはメスによってゲルから切り離される、上記に記述したようにそしてゲルから精浄化さる。ゲルからの破片を清浄した後、破片はAusubel, et al., 1998に述べられているように、直接の確認のために制限消化、または配列をすることによって分析される。
5’−CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCTCGCCCGCGACTCCCGCACCGCT−3’ [SEQ ID NO:15]
5’−TAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTGGAAGAGGAATATGTCAGCTGGGGGC−3’ [SEQ ID NO:16]
5’−ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAGCGATTTCCCTCGCACTCTCGCTCAC−3’ [SEQ ID NO:17]
5’−GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGTGTGGTCGGTCTGGATGCGGATCT−3’ [SEQ ID NO:18]
5’−AGATCCGCATCCAGACCGACCACACAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC−3’ [SEQ ID NO:19]
5’−GCGGTGCGGGAGTCGCGGGCGAGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG−3’ [SEQ ID NO:20]
5’−CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCA−3’ [SEQ ID NO:21]
5’−CTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCACCGCCAGATCTGGCAAAGCTCAACC−3’ [SEQ ID NO:22]
5’−AGTGACCTACCTCATGGACATGTGCAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC−3’ [SEQ ID NO:23]
5’−GCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG−3’ [SEQ ID NO:24]
5’−ATGGGTGTCTCTGCCGTTCTACTTCCTTTGTACCTCCTGTCCGGAGTATG−3’ [SEQ ID NO:25]
5’−GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGCACATGTCCATGAGGTAGGTCACT−3’ [SEQ ID NO:26]
皿は10mg/Lヒグロミシン(hygromycin)Bで最終濃縮に調合された新鮮で、滅菌された組換N6ミディアム皿に無菌でトランスファーされたボンバードの処置を受ける(Calbiochem)。2週間の露出後、すべてのカルスは50mg/Lヒグロミシン(hygromycin)Bで最終濃縮に調合された新鮮で、滅菌された組換N6ミディアム皿に無菌でトランスファーされる。このトランスファーはたくさんの皿が使用された結果、一つの皿に5つのみの30mgカルスの小片が含まれる皿でおこなわれる。50mg/Lヒグロミシン(hygromycin)B皿の三週間についで、すべてのカルスは60mg/Lヒグロミシン(hygromycin)Bで最終濃縮に調合された新鮮で、滅菌された組換N6ミディアム皿に無菌でトランスファーされる。培養の二週間後、カルスは増殖する塊のため検査される。選ばれた増殖する塊は組換Murashige−Skoog midium supplemented with 0.5mg/L thiamine−HCl,0.75mg/L 2,4−D, 50g/L sucrose, 150mg/L asparagines, and 2.0g/L Gelgroにトランスファーされる。
Claims (35)
- 標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、制御可能な介在タンパク質配列(CIVPS)、又はインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記CIVPS又は前記インテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が外部から刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のcis−スプライシングを誘発するものである、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 前記組換タンパク質を発現し、刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすこと、および、
前記スプライシングされたタンパク質は、グルコース、フルクトース、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、グリセロール、グリシンベタイン、ペクチン、スクロース、ラクトース、マルトース、ガラクトース、アミノ酸、脂質、ビタミン、および/または、でんぷんを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
請求項1の組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 前記組換タンパク質の発現が誘導的なプロモーターにより制御される、請求項2の組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第1核酸セグメントと、CIVPS又はインテイン配列をコード化する第2核酸セグメントとを含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第1核酸セグメントと、CIVPS又はインテイン配列をコード化する第2核酸セグメントと、選択マーカーまたはリポーター遺伝子および/またはプロモーターとを含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記組換タンパク質は、構成的に発現される請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記刺激は、pH、浸透圧、温度、肥料、農薬、化学物質、光、及び/又は音の変化を含むことを特徴とする請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 少なくとも一つの組換タンパク質は、
少なくとも一つの特異的な組織又はその一部内に、および/または、
少なくとも一つの特異的な細胞内小器官内に、
植物のライフサイクルの所定の点で発現され、および/または、
発現又は細胞外に分泌されることを特徴とする請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)progeny)、または、発生物(descendent)。 - 少なくとも一つの選択マーカーは、
ブロモキシニル、2,2−ジクロロプロピオン酸、G418、グリホセート(Glyphosate)、ピリジン(haloxyfop)、ハイグロマイシン(ヒグロミシン(hygromycin))、イミダゾリン、カネマイシン、メトトレキサート、ネオマイシン、ホスフィノスリシン、セトキシジム、トリクロチエン(trichothecne)、スルホニル尿素、s−トリアジン(s−triazine)、および/または、トリアゾロピリミジンを含む化学物質に対して耐性を起こし、および/または、
前記プロモーターは、CIVPS又はインテイン組換タンパク質ポリヌクレオチドの少なくとも一つに先行する請求項5の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 少なくとも一つの化学物質の通常毒性レベルに対して耐性又は抵抗性を有する請求項9の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 繁殖力を有し、CIVPSまたはインテイン組換タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一つを有する請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記植物は、繁殖力を有さないことを特徴とする請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 請求項1の近交遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 請求項1〜3いずれかのハイブリッド遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPS、またはインテイン配列および標的タンパク質、またはタンパク質セグメントは、少なくとも一つのスプライス部位を形成することを特徴とする請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記スプライス部位の前記カルボキシル末端における前記アミノ酸残基は、ヒドロキシル基またはスフヒドリル基側鎖を持つアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項15の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの前記アミノ末端において、ヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を欠くアミノ残基を含むことを特徴とする請求項15の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列の前記スプライス部位の上流は、前記CIVPSまたはインテイン配列またはタンパク質セグメントのアミノ末端において、ヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項15の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記CIVPSまたはインテイン配列のカルボキシル末端においてHis−Asnと、前記標的タンパク質の隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基(hydroxyl)又はスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項15の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記スプライス部位の下流は、前記CIVPSまたはインテイン配列のカルボキシル末端において、Aspと、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項15の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記カルボキシル末端Aspにおける前記Aspは、カルボキシルまたはアミノ側鎖を欠いたアミノ酸により置換される請求項20の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列は、外部制御可能なサッカロミケス(Saccharomyces)CIVPSまたはインテイン配列を含む請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントのSer,Thr、Cysの直前に挿入される請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテインアミノまたはカルボキシ末端は、Ser、Thr、またはCysを含む請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記標的タンパク質又は前記タンパク質セグメントは、微生物に由来するものであることを特徴とする請求項1〜3いずれかの植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、制御可能な介在タンパク質配列(CIVPS)、又はインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記CIVPS又は前記インテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が外部から刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のcis−スプライシングを誘発するものである、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を生成するための方法であって、
前記標的タンパク質又は前記タンパク質セグメントを含み、前記CIVPS又は前記インテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、組換タンパク質を少なくとも一つコード化する発現構造を提供する工程と、
前記発現構造によって、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)へ形質転換する工程と、
少なくとも一つの組換タンパク質配列をコード化する前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)から、遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)、を再生する工程と、を備える方法。 - 前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が、
前記組換タンパク質を発現し、刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、グルコース、フルクトース、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、グリセロール、グリシンベタイン、ペクチン、スクロース、ラクトース、マルトース、ガラクトース、アミノ酸、脂質、ビタミン、および/または、でんぷんを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、請求項26の方法。 - 前記組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が、
組換タンパク質の発現が誘導的なプロモーターにより制御されるものである、請求項27の方法。 - 前記形質転換は、安定的な形質転換を含む請求項26〜28いずれかの方法。
- 前記再生工程は、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を増殖する工程と、
組換植物と非遺伝的組換植物、子孫(progeny)と非遺伝的組換植物、組換植物と子孫(progeny)、子孫(progeny)と子孫(progeny)、またはプロトプラストとプロトプラストとを交雑(crossing)する工程と、または、
2つの遺伝的組換植物、2つの子孫(progeny)、または2つのプロトプラストを戻し交雑(back-crossing)する工程と、の少なくとも一つによって実施されることを特徴とする請求項26〜28いずれかの方法。 - 前記発現構造は、プロモーター、選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、遺伝性マーカー、ポリアデニル化配列、リプレッサー、エンハンサー、局在配列、または、シグナリング配列、の少なくとも一つを含む請求項26〜28いずれかの方法。
- 前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、ウイルス性の形質転換、DNAコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃(bombardment)、リポソーム遺伝子形質転換(liposomal gene transformation)、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション、化学遺伝子形質転換、の少なくとも一つによる前記発現構造を用いて形質転換されることを特徴とする請求項26〜28いずれかの方法。
- 前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、選択可能なマーカーまたは抵抗性マーカーの少なくとも一つを用いて選択される請求項26〜28いずれかの方法。
- 前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、
形質転換された胚形成組織の一つと、
植物プロトプラストと、
未成熟胚から分離した細胞と、または、
形質転換種子と、から再生されることを特徴とする請求項26〜28いずれかの方法。 - 組換タンパク質を発現する種子を生成する方法であって、
請求項26〜28いずれかの方法により前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を取得する工程と、
前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を培養または栽培する工程と、
CIVPSまたはインテイン組換タンパク質を発現する種子をそこから取得する工程と、を備える方法。
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