JP2006512042A - Civpsまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物と、その関連の手法 - Google Patents
Civpsまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物と、その関連の手法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
cerevisiae(Kane et. al., Science 250:651; Hirata et al., J. Bio. Chem. 265:6726
(1990)), Mycobacterium tuberculosis (Davis et al., J. Bact. 173:5653
(1991), Davis et al., Cell 71:1 (1992)), Thermococcus litまたはalis (Perler,
et al., PNAS 89:5577 (1992))
thuringgiensis endotoxin)である。他の実施例は、ウィルスによる標的タンパク質の発現を含んでいる。如何なるウィルスでも用いられるであろうが、例としては、ポテトウィルス Y(potato virus Y)、ジェミニウィルス(geminivirus)、アスパミーウィルス 2b(aspermy virus 2b)、あるいはキュウリモザイクウィルス(cucumber mosaic virus)などがあげられる。
tumefaciens)のようなバクテリアを用いた方法によって転換される。ただし、他の有機微生物も用いられるだろう。現在の手法において、形質変換は化学遺伝子変換により行われるだろう。そして次にあげるものを助成物として用いて行われるであろう。例として、専門的には知られている、リン酸カルシウム、そして/あるいはポリエチレングリコール、またはこの目的のために適しているとされている他の化学物質がある。前記選択は選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、または、CIVPSあるいはインテイン組換タンパク質をコード化する少なくとも一つの核酸の発現に助けられて達成するであろう。前期発明の手法においては、前記遺伝子的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下区画、種、苗木、プロトプラスト、子孫(progeny)、発生物(descendent)は転換された胚発生組織、植物プロトプラスト、細胞発達した胚子から引き出された細胞、転換した種などから再生されるであろう。
ブタンジオール、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロパンジオール、ビタミン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ベンゼン、そして/あるいは生物ポリマー、などの化合物を生産できる原核(原核)あるいは真核(真核)微生物を用いて達成されるであろう。
absorbed formulation)などである。しかし、この構成物質は動物、または動物飼料に適用するために適したあらゆる組織系、または主題の形にて定型化されるであろう。
組換タンパク質を持つことができる、トランスジェニック植物の産出を認める。トランスジェニック植物は単数または複数の外因性遺伝子そして、それらの関連づけられたタンパク質(または、リボ核酸)活動を発現する多細胞植物である。この発明の記述のなかで、遺伝子または、酵素の分類が特定のものを示しているであろうが、発明の様相を制限することはない。特定の分類が述べられるとき、特定の分類の中でどのような遺伝子または、酵素も認めることを解釈される。親タンパク質配列の内部または、隣接したタンパク質配列である。この自然発生的カルボキシルまたは、アミノ末端のいずれか、あるいはその両方において自切断する、そしてCIVPSあるいはインテインは結果として生じるエクステインタンパク質の破片が特定の条件にのもとで適時に選択的なライゲートをすることができる。以下参照(例)Perler,
et al., Nucl. Acids Res., 22:1125-1127 (1994); Wallace, C. J., Protein Sci.,
2:697-705 (1993); Xu, et al., Cell, 75: 1371-1377 (1993); Pietrokovski,
S.,Protein Sci.,2:697-705 (1994)。従って、CIVPSより大きな先駆タンパク質分子の部分として遺伝子的に起きるインフレーム、自切断ペプチドと言われるだろう。CIVPSあるいはインテインはいくつかの基本的な方法において、他のプロテアーゼまたはチモーゲンとは異なる。自己切断、または他のタンパク質を複数のライゲートされていないポリペプチドにライーゲート(ligate)するプロテアーゼと異なり、インテインは、cisまたは、transの配列において、切断やライゲートのどちらも出来る。従って、タンパク質上のプロテアーゼの反応の結果生じる、末端の切断に対抗するものとして、インテインは複数の位置で切断することや、結果として生じるエクステインタンパク質の破片をライゲートすることが出来る。この切断は特定の条件の下で誘発される、そして分子生物学において知られている技術の実行を遂げるだろう。種々のもとによるインテインは、それらの配列、特徴と機能は細かく文献に記述さている。参照、(例)Kane et. al., Science 250:651
(1990); Hirata et al., J. Bio. Chem. 265:6726 (1990) (Sacchromyces cerevisiae);
Davis et al., J. Bact. 173:5653 (1991), Davis et al., Cell 71:1 (1992)(Mycobacterium
tuberculosis); Perler, et al., PNAS 89:5577 (1992) (Thermococcus litoralis)。図1に示されるように、CIVPSと予期される活動あるいは構造的な役割のタンパク質との組み合わせはインテイン組換タンパク質をもたらすであろう。この予期される活動あるいは構造的な役割は実質上変換される。CIVPS組換タンパク質を発現する(それらのインテイン組換遺伝子の関連による)トランスジェニック植物は、先のトランスジェニック植物の改良による。それは、親インテイン組換タンパク質は二つの実質上異なった状態を持つことができるからである。その状態とは、インテインの切断により抑制可能な媒介がされる。この切断は予期されるタンパク質配列の組み合わせと関連されることもあるだろう。発明は単数または、複数のタンパク質とCIVPSどんな組み合わせのあらゆる植物種から形成されるであろう。植物種には次にあげるものが含まれるが、それ以外も適用される。これらは、ポプラ、シラカバ、ヒマラヤスギ、マツ、堅材、軟木、大豆、スウィッチグラス、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、さとうきび、カリフラワー、アーティチョーク、バナナ、りんご、チェリー、クランベリー、きゅうり、レタス、ブドウ、レモン、メロン、ナット、蜜柑、米、オレンジ、モモ、ナシ、ブルーベリー、いちご、トマト、にんじん、キャベツ、ポテト、エンダイブ、ニラネギ、ほうれんそう、雑草、クスウコン、ビート、にんじん、カッサバ、カブ、ヤムイモ、ダディッシュ、サツマイモ、ムギ、オオムギ、大豆、豆、菜種、キビ、ヒマワリ、オートムギ、エンドウ豆、塊茎、タケ、海藻、藻、またはその他の植物種。タンパク質はあらゆる周知の、推定の、組換の、あるいは斬新に作られたものを含むだろう。自生タンパク質の選択は限定されていないが、好ましいタンパク質は以下にあげるものが含まれる。それらは、リグノセルローシック解体タンパク質(セルラーゼ、リグナーゼ、アミラーゼ)、でんぷん解体酵素(アミラーゼ、グルカナーゼ)、燃料、または化学製品、細菌性のあるいはウィルス性の抗原体に必要な生合成経路においての酵素、生合成経路のためのビタミンまたは、その他の食品添加物のための酵素(フィターセ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ヘミ−セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロチアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、成長ホルモン)、有害生物の伝染や、インセクトレジスタンスのタンパク質、そして、疾病病因に含まれる、治療効果のあるタンパク質である。タンパク質を組み換えるために用いるCIVPSあるいはインテインの選択は好ましい植物において発現されるものの融合も制限されない。あらゆる単数または、複数のCIVPSあるいはインテインは望ましいタンパク質または、タンパク質に関して、あらゆる配置において使用される。CIVPSあるいはインテインは一個所または両端において、スプライスされることが出来る。ある刺激の反応において、そして単数または、複数のCIVPSあるいはインテインが融合されるタンパク質にライゲートすることもあるだろう。
coliまたは、あらゆる他の適した宿主(例、イーストがある場合には有益であろう、または哺乳類または、ウィルス性または、非ウィルス性のべクトルを使用、あるいは使用しない植物の細胞における発現)の中で繁殖することよって達成される。いったん遺伝子とインテインコーディング配列が繁殖されたら、それらは望ましい配置で結合されなければならない。選ばれたインテイン配列は刺激による(例えば、光、pHの変化、温度、圧力、あるいはインテイン組換タンパク質を取り巻いているローカルな化学的構成における変化)反応でスプライシングするなどの望ましい機能を行うことができるべきである。図1に示されるように、CIVPSあるいはインテインDNAコーディング配列または、それらの組み合わせの発生結果においてCIVPSあるいはインテインのDNA配列とタンパク質のDNA配列を繋ぐことは、専門では知られている手法によって容易に成される。すでに示されたように、CIVPSあるいはインテインはカルボキシル末端、アミノ末端、または、自生タンパク質または、タンパク質内部の一部のいずれかにCIVPSまたはインテインが融合されたものである。いくつかの手法があるが、CIVPSあるいはインテインと望ましいタンパク質コーディング配列の間で融合を作る一つの手法は、精製するDNAがコード化する望ましいタンパク質配列、そしてタンパク質コーディング配列をインテイン挿入の望ましい位置において切断する制限酵素の利用、そしてまた、制限された位置にインテインコーディング配列をライゲートする。ポリヌクレオチド、または核酸部分のいずれかは、適した調整、そして/あるいは選択配列、またはそれらのベクトルを介したものに直接クローンされるであろう。調整部分の例は以下にあげるものである。CIVPSあるいはインテインの一時的な発現をコントロールするプロモーター、そしてオリジナルの複製、そして/あるいは生体内、特定の植物組織あるいは特定の副細胞質の区画において、CIVPSあるいはインテインの場所の分配をコントロールするシグナルリング配列である。選択エレメントの例としては、次にあげるものがある。除草性または、アンチ細菌性の遺伝子、蛍光性マーカー、色素性マーカー、そしてその他の適する選択されたマーカーがある。結果として生じているポリヌクレオチドまたは、CIVPSあるいはインテインを構成するベクトルのコード化するポリヌクレオチドと、そして随意的にあらゆる望ましい調整、そして選択エレメント、これらはいっそうたくさんの成果物を得るために拡大されるだろう、それらは望ましい植物種の次の変換に使われるだろう。改良のすべてのステップは、あらゆる望ましいCIVPSあるいはインテインとタンパク質の間で特定の方向づけと融合を容易にすることが可能である、そして、この手法は知られている。コーディング配列、そして/あるいはCIVPSあるいはインテインのコーディング配列のいずれかの変質と、そしてこれら配列のいずれまたは両方のライゲートは、専門では知られている技術よって容易に達成される。その手法はサイトディレクト突然変異生成、ランダム突然変異生成、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、エラープローンPCR、そして/あるいは、専門では決まった手法と考えられる、あらゆる他の適した手法などである。これらの技術は多数の配列の結合の配置を促進します、そしてどんな望ましい、そして適当な組み合わせでも使われるだろう。同じく、調整と選択エレメントのどんな組み合わせ、あるいは方向づけもこの発明のとおりに実行されるだろう。遺伝子調整エレメント、例えば、プロモーター(Guilley et al.,Higgins,
T.J.V., Coruzzi et al., Tingey et al., Ryan et al., Rocha-Sosa et al., Wenzler
et al., Bird et al.)、エンハンサー(Brederode, et al.)、RNAスプライシングサイト、リボソーム結合サイト、糖化(glycosylation)サイト、タンパク質スプライシングサイト、副細胞質シグナルリング配列(Smeekens
et al., van den Broeck et al., Schreier et al., Tague et al.), 分泌性シグナル配列s(Von
Heijne, G., Sijmons, et al.)、または他、変換植物にてCIVPSあるいはインテインの生体内で濃縮そして活動のいずれをもコントロールすることにおいて、有利であるだろう。トランスジェニック植物にてのインテイン組換タンパク質の産出と処理を促進するのにこれらのエレメントの使用は望ましいだろう。組換タンパク質の発現は構造性のまたは、誘発される方法のいずれかにおいて行われるだろう。これらのいずれかの手法を達成するためには、この特許で記述されるか、専門では知られている手法のいずれも、または、後に生まれる手法にて実行されるだろう。外性の刺激の援助によりタンパク質発現の誘発はおこなわれるだろう。これらの例は農薬、光、温度の変化、そして/あるいは音にさらすことである。その他の外性の刺激も用いられるだろう。加えて、上記に示したとおり、組換植物もまた、一つ以上の選択可能なマーカー遺伝子または、リポーター遺伝子を発現するであろう。
rhizo)遺伝子、媒介遺伝子トランスファー、植物プロトプラストに向かう遺伝子トランスファー、Tiプラスミド媒介遺伝子トランスファー、(プラスミドの補助がある/なしで)、生物学的な、または、分子ボンバード植物の転換(Gordon-Kamm et al.)、ミクロ投射の媒介転換、そして組織エレクトロポレーション(Shimamoto
et al.)。遺伝子のトランスファーは植物の全体、植物の外植体(あるいは根茎の外植体)、あらゆる植物部位(あるいは植物の葉部分、種または種部分)、植物プロトプラストまたはアポプラストあるいは単数または、複数の植物細胞である。それぞれの異なった手法はすでにこの専門によって詳しく記述されている。正式な変換植物の選択の手法は専門では知られている。選択の手法はCIVPSあるいはインテイン組換タンパク質を含んだ変換DNAにて、選択可能なマーカーを含むことにより促進されるだろう。(それらは、レジスタンス遺伝子、染色合成物の産出物をコーディングした遺伝子、蛍光合成物の産出物をコーディングした遺伝子、または他の適した手法)。さらに、変換植物からのDNAは実在の望ましいCIVPSあるいはインテイン組換タンパク質コーディング配列を立証するために、分離され、配置されるであろう。その他の技術は選択過程のための確認に適している。それらはポリメラーゼ反応連鎖、制限消化分析(restriction digest analysis)そしてサザン分析(southern
analysis)である。望ましいトランスジェニック植物の認定のためにあらゆる選択の手法も用いられるだろう。いったん、植物がCIVPSあるいはインテインと望ましい調整や選択配列をともない変換されると、植物の全体が、専門では知られている手法によって再生される(Horsch et al.)。植物の再生に用いられる手法は制限されるものではなく、あらゆる効果的な手法が用いられるであろう。結果として生じるトランスジェニック植物は、概略的に図2で記述されるようにCIVPSあるいはインテインを生産する。時に、トランスジェニック植物が選択された、CIVPSあるいはインテインの発現のためにモニターされる。CIVPSあるいはインテインを発現するトランスジェニック植物の産出物として必要ではないが、次の点において慎重に確証されている。それは、望ましいCIVPSあるいはインテインを発現する、望ましいトランスジェニック植物の獲得、そして発現は望ましい制御エレメントの使用により、適度に制御されることである。CIVPSあるいはインテインの発現のモニタリングは概略的に図3で記述されるように、インテイン組換タンパク質の全体または、インテイン組換タンパク質の構成物のいずれかのために、切断または、非切断の状態においてのCIVPSあるいはインテインの精製が必要である。それらエレメントの組み合わせの構成は図3に表されている。インテイン組換タンパク質の発現したタンパク質はトランスジェニック植物からの植物の抽出物、またはタンパク質破片の精製を行うウェスタン分析(western analysis)、2次元ゲル電気泳動(2-dimensional gel 電気泳動)、または分光法(mass spectrometry)によりモニターされる。さらに、精製されたタンパク質または、トランスジェニック植物のいずれかはインテイン切断の刺激にさらされる。露出の後に、CIVPSまたはインテインの切断の結果として現れた、CIVPSあるいはインテインと結果として生じるタンパク質の両方は、最適なタンパク質とインテイン組換タンパク質と結果として生じる切断タンパク質の間の活動における相違を立証するためにウェスタン分析と他の検査の両方よって分析される。活動の検査は望ましいタンパク質の活動をモニターすると同じく活動を特定し、競われる干渉に強いように構成されなければいけない。制御は原生の活動と、インテイン組換活動とインテイン切断に次ぐ活動の両方を比べるために基準として使われなければいけない。CIVPSあるいはインテインを発現するトランスジェニック植物の手法と処置は次にあげるとおりである。燃料産出のための基質としての植物の使用(これに限定されないが、つぎのとおりである:可燃性のバイオマス、エタノール、メタノール、プロパノール、プロパン、メタン、またはオクタン製品)。日用化学製品のため基質としての植物の使用(これに限定されないが、つぎのとおりである:乳酸、エタノール、グルコースまたは、他のヘキソース、ペントース、プロパンジオール、エチン、エタン、エチレン、石炭酸の構成物、アミノ酸、紙パルプ、農薬、殺虫薬、他のアルコール、エテール、エステール)。食品そして/あるいは食品添加物のための基質としての植物の使(これに限定されないが、つぎのとおりである:アミノ酸、砂糖、ビタミン、ファイバー、または家畜の飼)、ワクチンである。紙製品と廃棄物再生のための基質としての植物の使用。インテイン組換の発現するトランスジェニック植物における、あらゆるバッチやセミバッチ、または処置の継続は上記に記述された目的のひとつとして特許の申請をされる。これらの処置はこれに限定されないが、次にあげるものを含む。インテイン組換タンパク質を発現するトランスジェニック植物における処置は採収、インテイン切断の刺激の実行、ゼロに等しいかそれ以上の比率の基質にトランスジェニック植物におけるほかの基質の混合、または、上記に詳しく述べた成果物のひとつに化学的、酵素的、または生物的のいずれかでの転化。
連鎖反応(PCR)をコード化するインテイン組換タンパク質核酸配列と最適な相補性の端をもちいて集めることである、それは望ましいベクトルの中にライゲートを促進させる。PCR手法はここに説明されている。他の手法もこの同じ目的を達成するために使われる、そして、いくつかは特定の制限、望ましいタンパク質のライゲートそして配列をコード化するインテインに依存するが、PCRステップも含まれる。反応を行うためのPCR Kitsは容易に利用可能である(Epicentre,
Madison, WI)。プライマーにおいて唯一の必要事項は感覚節の5’endを拡大させるために一致させなければならない、そして他は反感覚節の5’end一致させなければいけない。関連配列の独自性は有益である。
(http://blocks.fhcrc.org/~pietro/inteins/)。他のインテインは発見されるため残存し、そして新しいインテインは配列analysisと組換DNAの手法、そして周知の知られている突然変異を通して作られるだろう。例1のこのインテインは意図的なトランスジェニックポプラ種のために有利である。それはスプライシングにおいて、優勢的にライゲートされ、原生タンパク質(>75%)をもたらす、そして温度に敏感であるためインテインスプライシングは30℃以下の温度において抑制される、また50℃までは実在しない、この温度においては2時間以内に非切断タンパク質は半滅する。
England Biolabs, Beverly, MA)を伴って、しかしこの付加は必ずしも必要ではない、そして用いられる正確な反応条件に依存することは産出を増やすことにつながるであろう。
5’-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’ [SEQ ID NO: 1]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID NO: 2]
England Biolabs, Beverly, MA)によって増大される、しかしこの付加は必ずしも必要ではない、そして用いられる正確な反応条件に依存することは産出を増やすことにつながるであろう。
5’- AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC-3’
[SEQ ID NO: 3]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID NO:
4]
酵素とともに最適に発現されるマルチプルインテイン組換タンパク質の同時発現に加えて、望ましい事項実施例の構成は再生産と安定した遺伝子の遺伝の能力がある肥沃な植物である。
KCl, 100 mM Tris-Cl pH 9.0, 0.1% Triton X-100)、そして薄く覆われた250μL PCR管の中のMgCl2を混ぜることによりおこなわれる。一度混合されると、それぞれの反応管はサーモサイクラーに位置される、そしてこのサーモサイクラーは3つの部分が形成される35サイクルのためセットされる。この部分は30秒には94℃、60秒には60℃、120秒には72℃である。拡大に次いで、結果として生じるPCRの成果物は以下にあげるものによって分析される。1%のアガローゼゲル上の電気泳動、分子量標準(Invitrogen,Carlsbad,CA)をともない、1X
TAE (or TBE)流動する緩和物の援助をともない、そしてエンチジウム臭化物 (0.5 μg/mL)による濾過。適した長さバンドが得られるように注意が必要とされる、その長さはおおよそ3200 base pairs(bp)である。このバンドはメスによってゲルから切り離され、そして(ゲル物質から離されて)商業的に利用可能なジェル清浄化キット(Qiagen)清浄化される。いったんこの破片がゲルから清浄化されたら、このバンドは制限消化または、Ausubel
et. al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1998)によって述べられた配列を使って分析される。遺伝拡大の後、遺伝子はインテイン配列部分の挿入によって組み換えられる。この場合、Pyrrococcus sppからの変体Psp
pol インテイン (GenBank Accession # PSU00707)が使用される。この変体は、文献で述べられているが、チロシンがメチオニンに転換されるチロシン534残基においての突然変異が含まれる。参照、Xu,M,
Perler, F, (1996), The mechanism of protein splicing and its modulation by
mutation, The EMBO Journal 15:5146-5153。このインテインはpHの変化によってインヴィトロで切断されるだろう。このインテインコーディング配列はPyrrococcus
sppゲノミックDNAを使うPCRによりテンプレートとして拡大された。PCR反応は標準プロトコルの使用により行なわれる。(例、30サイクルは30秒のための94℃で、60秒には50℃、120秒には72℃を含む)、そしてプライマーが続く。
NO: 5]
NO: 6]
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCCGGAAACGGCGGTGTCTACCTCG-3’ [SEQ ID NO:
7]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID
NO: 8]
5’-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 9]
5’-CGAGGTAGACACCGCCGTTTCCGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 10]
5’-AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC-3’
[SEQ ID NO: 11]
5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTAGCATCGCTCGTTCCCCATTCTGTG-3’
[SEQ ID NO: 12]
et. al., Current Protocols in Molecular Biology (1998)に述べられている手法をつかってインテイン組換セルラーゼコーディング配列はpTiBo542にクローンされ、T
DNAの中のtmsとtmr遺伝子が再配置される。参照、Parsons TJ, Sinkar, VP, Stettler, RF, Nester, EW,Gordon,MP,“Transformation
of Poplar by Agrobacterium tumefaciens,” Biotechnology 4:533-536, 1986. Here
the includes a “MAC” プロモーター、マノピン シンセターゼ ターミネーター、そしてカナマイシン レジスタンス マーカーは発現カセットである。このベクトルは周知のあらゆる専門技術を用いアグロバクテリウム(A.tumefaciens)A281に変換される。種々の転換手法もまた上記のAusubel,et. al.(1998)により述べられている。
g/ L mannitol, 2.32 g/ L sodium glutamate, 0.5 g/ L KH2PO4,
0.2 g/ L NaCl, 0.2 g/ L MgSO4-7H2O,0.002 g/ L biotin,pH7.0)、50%
luria broth (20 g/ L tryptone, 10 g/ L yeast extract, and 10 g/ L NaCl)、そして最適な抗生物質。植物の転換のためには、長さにおいておよそ7ミリと直径2〜3ミリの小さい緑木の茎のセクションは、20%の漂白剤、0.1% Tween
20, そして30 mg/L Benomylの溶液で消毒さる。滅菌された水で洗った後は、茎のセクションは無菌でおおよそ5x108細胞per mLの細胞濃縮においてのアグロバクテリウム(A.tumefaciens)の培養にトランスファーされる。そしてセクションは16時間の培養が行われる。組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)培養に露出された後、植物茎はトランスファーされたゼアチンリボシドと水平の位置にあるカナミシン(kanamycin)をもった固体のMurashige-Skoog medium supplementedにトランスファーされる。参照
Murashige T, Skoog F, “A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures,” Physiol.plant, 15:473-497, 1962.いったん根の成長が始められると、若枝も成長するだろう。再生植物は二週間から三週間ごとに新しい植物にトランスファーされる、そして通常の光のサイクルは植物の成長の間、そしてインキュベーターの中で湿度が上昇された状態で維持される。いったん根が形成すると、外植体は均質の媒体の不足したゼアチンリボシドにトランスファーされる。しかし、その他の二週間から三週間の間カナミシン(kanamycin)を含み、この期間の後で植物は土に移される四日から五日ほど前に、土の入った箱の中に移され、温室または制御された土のプロットで十分成長される。最初の植物は、インテイン組換セルラーゼDNA配列がゲノムとタンパク質の発現が活性であるようにトランスファーされるのを確実にするため、いくつかの手法によって検査される。遺伝学的な検査は、上記のAusubel, et. al. (1998)に述べられているように、プローブとしてインテイン組換セルラーゼコーディング配列を使ったトランスジェニック植物からゲノミックDNAを孤立させた状態のサザン分析(southern analysis)により行われる。上記に述べたように、PCRはテンプレートとして、インテイン組換セルラーゼコーディング配列とトランスジェニック植物ゲノミックDNAにプローブの特質を使っておこなわれる。エチジウム臭化物が付着したゲル上で、最適なサイズにされたバンドの様相はインテイン組換セルラーゼコーディングFの実在を確証する。植物ゲノミックDNAの直接配列することが行われるだろう。タンパク質の産出は特定のインテイン組換セルラーゼと原生セルラーゼの両方に免疫抗体が使われるウェスタン分析(western analysis)によってモニターされるだろう。加えて、セルラーゼ活動のための酵素分析は専門技術では周知である、そしてスプライシングしないインテイン組換セルラーゼとスプライシングされたセルラーゼの活動量を計るために使用されるだろう。
5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAG-3’ [SEQ ID
NO: 13]
5’-TTAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTG-3’ [SEQ ID NO: 14]
例1にて述べられているようにPCR反応に使われる。拡大についで、結果として生じるPCR成果物は、例1に記述したように分子量標準を伴って、アガローゼゲル上のゲル電気泳動を使って分析される。エンチジウム臭をともなったゲル臭化物の付着した後、1567
base pair (bp) バンドはメスによってゲルから切り離される、上記に記述したようにそしてゲルから精浄化さる。ゲルからの破片を清浄した後、破片はAusubel,et
al., 1998に述べられているように、直接の確認のために制限消化、または配列をすることによって分析される。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCTCGCCCGCGACTCCCGCACCGCT-3’
[SEQ ID NO: 15]
5’-TAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTGGAAGAGGAATATGTCAGCTGGGGGC-3’
[SEQ ID NO: 16]
5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAGCGATTTCCCTCGCACTCTCGCTCAC-3’
[SEQ ID NO: 17]
5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGTGTGGTCGGTCTGGATGCGGATCT-3’
[SEQ ID NO: 18]
sppゲノミックDNAテンプレートとプライマーにつぐものが使われる:
5’-AGATCCGCATCCAGACCGACCACACAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 19]
5’-GCGGTGCGGGAGTCGCGGGCGAGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 20]
al. (1998)により記述されている。
multiplicaion from mature trees of Douglas-fir, and sugar pine,”Plant
cell Reports, 9:177-179, 1985)。組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)の培養は例1に記述された手法にしたがって成長される。植物の転換のためには、培養から再生されたおおよそ50mmの長さの若枝、または表面が10%漂白と0.1%Tween 20の処置によって滅菌された種がある。いったん滅菌されると、種または、若枝は中性、蒸留とイオン除去した水で無菌状態にリンスされる。傷ついた若枝や種は、108細胞per mLの細胞濃縮においての組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)培養に浸けられる。組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)培養に露光した12時間後に、若枝と種は2.2%のスクロースと0.8% Bacto(Difco)agarと一緒にDCR基底のミディアムで培養される。培養の条件は温室または成長器で20℃においての8時間暗サイクルについで、25℃において16時間の光サイクルを含む。再生植物は新植物に毎2週間から3週間ごとに転化する。いったん、根が形成すると、外植体は、土に移される四日から五日ほど前に、土の入った箱の中に移され、温室または制御された土のプロットで十分成長される。最初の年の成長は30℃以下に保たれた温室で行われる。
and T. W. Jeffries, “Production of ethanol from wood hydrolysate by yeasts,”
Bioresource Technology, 72(3): 253-260, 2000; Lisbeth Olsson and Barbel HahN−Hagerdal,
“Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,” Enzyme
and Microbial Technology, 18(5):312-331, 1996; Kutluo O. Ulgen, et. al.,
“Bioconversion of starch into ethanol by a recombinant Saccharomyces cerevisiae
strain YPG-AB”, Process Biochemistry, 37(10):1157-1168, 2002; M. Mete Altintas,et
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manipulation of environmental factors,” Enzyme and Microbial Technology,
31(5):640-647, 2002; Farooq Latif, et al., “Production of ethanol and xylitol
from corn cobs by yeasts,” Bioresource Technology, 77(1):57-63, 2001.
States Patent Publication No. 6,022,846)。フィターセのC−エクステイン部分は前述されたのと同じ条件のもとで次のプライマーを使い拡大される。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCA-3’
[SEQ ID NO: 21]
5’-
CTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCACCGCCAGATCTGGCAAAGCTCAACC-3’ [SEQ ID NO: 22]
5’-
AGTGACCTACCTCATGGACATGTGCAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 23]
5’-GCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 24
5’-ATGGGTGTCTCTGCCGTTCTACTTCCTTTGTACCTCCTGTCCGGAGTATG-3’
[SEQ ID NO: 25]
5’- GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGCACATGTCCATGAGGTAGGTCACT-3’
[SEQ ID NO: 26]
of BAPにおいて24時間の培養によって前処理される。24時間の蒸散されると、茎部分はアグロバクテリウム(A.tumefaciens)を含むインテイン組換フィターセの新しく転換された濾過をともなって48時間の間培養される。この培養ステップについで、実質に例1と2で記述された同じ処置についで、カナミシン(kanamycin)レジスタンスマーカーを使って植物を再生し、選択する。インテイン組換フィターセの混合の確認は例1と2で記述されたよう行われる。
(University of Minnesota, Crop Improvement Association) x B73 (Iowa State
University)植物である。採収後、破片は25分間室内温度で50%の漂白を使って表面を滅菌される。そして中性、蒸留とイオン除去した水で洗われる。新培養は無菌的に採収された破片から始められ、そして10μEm-2s-1光以下で、24℃にて組換N6medium上で維持される。(Chu,et al.,(1975),“Establishment
of an Efficient ミディアム for Anther Culture of Rice through Comparative
Experiments on Nitrogen Sources,” Sci. Sin., 18:659-668) at pH 5.8, with 2mg/L
glycine, 2.9g/L L-proline, 1mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 100mg/L
casein hydrolysate, 2g/L sucrose, and solidified with 2g/L Gelgro (ICN
Biochemicals).
1.2μm、GTE Sylvania)または金、の素粒子に沈殿される。この過程の他のステップで、沈殿パラメーターはいくつかのマイナーな最適化を必要とする。沈殿は1.25mgのタングステン素粒子、そしての1.1M CaCl2そして8.7mM spermidineをともなった25μgの溶液中のベクトルDNA
の575μLの合計量の混合によって行われる。沈殿は0℃にて10分間かき混ぜられる。いったんかき混ぜられると、10分間500xgにおいて遠心分離機にかけられる。遠心分離後、上清はおおよそ550μL取り除かれ、残りの25μLの沈殿物は、Klein et al.(1987)に記述されているボンバードのためマクロ投射に1μL約数分配される(Biolistics,
Inc, Ithaca, NY)、ただし上記した変更は含まず。すべての操作は無菌的に氷上で行われる。
CA)を通して利用可能である。ボンバードについで、カルスは新鮮な組換N6ミディアム皿そして上記した同じ条件で培養されるのにトランスファーされる。
midium supplemented with 0.5 mg/ L thiamine-HCl, 0.75 mg/ L 2,4-D, 50 g/ L
sucrose, 150 mg/ L asparagines, and 2.0 g/ L Gelgroにトランスファーされる。
al., 1998に記述される。組換Murashige-Skoogミディアムでの二週間後、皿は24℃において10時間の暗についで、14時間の光で組織された、光サイクル培養摂取にさらされる。小植物は100mLの組換Murashige-Skoogミディアムを含む、1L、大口のErlenmeyerフラスコに無菌でトランスファーされて形成する。結果として生じる植物は、土に植える前の一週間から二週間の間バーキュライトにトランスファーされ、成熟に育てられる。成熟植物は実質的に例
1に記述されたように、インテイン組換タンパク質配列の、そして優先的にインテイン組換セルラーゼの発現の安定転換を確認するために分析される。
Biobased Industrial Products: Priorities for Research and Commercialization, National Academy Press, Washington D
C (1999).
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1:91-99 (1995).
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22:1125-1127 (1994).
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and Gene Expression: A Laboratory Manual,” Blackwell Scientific Publications, Boston (1998).
Plants,” Springer, New York
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35:191(1984).
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6:277-285 (2000).
Bioeng. 2:151-159 (2000).
6,022,846.
Claims (95)
- 制御可能な介在タンパク質配列(CIVPS)、インテイン配列、あるいはそれらのセグメントに対して、または、それらのアミノ末端、あるいはカルボキシル末端に対して内部又は末端に融合される標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含む少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備える組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第1核酸セグメントと、CIVPS又はインテイン配列をコード化する第2核酸セグメントと、任意に選択マーカーまたはリポーター遺伝子および/またはプロモーターとを含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記組換タンパク質は、構成的に発現される請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 少なくとも一つの組換タンパク質を誘導的に発現し、任意に、刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすことを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記刺激は、pH、浸透圧、温度、肥料、農薬、化学物質、光、及び/又は音の変化を含むことを特徴とする請求項4の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 少なくとも一つの組換タンパク質は、
少なくとも一つの特異的な組織又はその一部内に、および/または、
少なくとも一つの特異的な細胞下区画内に、
植物のライフサイクルの所定の点で発現され、および/または、
発現又は細胞外に分泌されることを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 種、根茎、果物、茎、塊茎、そして/あるいは葉といった少なくとも一つの特定の組織で構成され、そして、
シトソル、ミトコンドリア、プラスチド(plastid)、小胞体(endoplasmic reticulum)、体内封入(inclusion body)、空胞(vacuole)、そして/あるいは核といった少なくとも一つの特定の細胞下分画で構成されている請求項6の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 少なくとも一つの選択マーカーは、
ブロモキシニル、2,2−ジクロロプロピオン酸、G418、有機リン酸(Glyphosphate)、ピリジン(haloxyfop)、ハイグロマイシン(ヒグロミシン(hygromycin))、イミダゾリン、カネマイシン、メトトレキサート、ネオマイシン、ホスフィノスリシン、セトキシジム、2,2−ジクロロプロピオン酸、有機リン酸(Glyphosphate)、ハイグロマイシン(ヒグロミシン(hygromycin))、トリクロチエン(trichothecne)、スルホニル尿素、s−トリアジン(s-triazine)、および/または、トリアゾロピリミジンを含む化学物質に対して耐性を起こし、および/または、
前記プロモーターは、CIVPS又はインテイン組換タンパク質ポリヌクレオチドの少なくとも一つに先行する請求項2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 少なくとも一つの化学物質の通常毒性レベルに対して耐性又は抵抗性を有する請求項8の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 繁殖力を有し、組換タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一つを有する請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記植物は、繁殖力を有さないことを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 請求項1の近交遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 請求項1のハイブリッド遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記スプライシングされたタンパク質は、所定の植物構成要素の中身または活性の少なくとも一つを変化することを特徴とする請求項4の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- その中身が減少する前記植物構成要素は、グルコース、フルクトース、グリセロール、グリシンベタイン、スクロース、ラクトース、マルトース、ガラクトース、アミノ酸、脂質、ビタミン、および/または、でんぷんを含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- その活性が減少する前記植物構成要素は、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、ペクチン、および/または、脂質を含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPS、またはインテイン配列および標的タンパク質、またはタンパク質セグメントは、少なくとも一つのスプライス部位を形成することを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記スプライス部位の前記カルボキシル末端における前記アミノ酸残基は、ヒドロキシル基またはスフヒドリル基側鎖を持つアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記スプライス部位の下流は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの前記アミノ末端において、ヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を欠くアミノ残基を含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記スプライス部位の上流は、前記CIVPSまたはインテイン配列またはタンパク質セグメントのアミノ残基において、ヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記スプライス部位の上流は、システイン(cysteine)を含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記スプライス部位の下流は、前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントのカルボキシル末端においてHis−Asnと、前記標的タンパク質の隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基(hydroxyl)又はスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記スプライス部位の下流は、前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントのカルボキシル末端において、Aspと、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項17の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記カルボキシル末端Aspにおける前記Aspは、カルボキシルまたはアミノ側鎖を欠いたアミノ酸により置換される請求項23の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントは、CIVPSあるいはインテインを含むことを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントは、外部制御可能なサッカロミケス(Saccharomyces)CIVPSまたはインテイン配列を含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列は、対外的に制御可能な出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)CIVPSあるいはインテイン配列を含むことを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントのSer,Thr、Cysの直前に挿入される請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記CIVPSまたはインテインアミノまたはカルボキシ末端は、Ser、Thr、またはCysを含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記タンパク質は、微生物によって発現されることを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記微生物は、バチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringgiensis)あるいはフィトラッカインスラーリス(Phytolacca insularis)によって選択されることを特徴とする請求項30の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記発現タンパク質は、組換バチルスチューリンゲンシス内毒素(Bacillus
thuringgiensis endotoxin)を含むことを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 前記タンパク質は、ウィルスよって発現されることを特徴とする請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記ウィルスは、ポテトウィルス Y(potato virus Y)、ジェミニウィルス(geminivirus)、アスパミーウィルス 2b(aspermy virus
2b)、あるいはキュウリモザイクウィルス(cucumber mosaic virus)から選択されること特徴とする請求項33の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 請求項1の組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を生成するための方法であって、
CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントに対して、または、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端に対して、内部又は末端に融合される標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含む組換タンパク質を少なくとも一つコード化する発現構造を提供する工程と、
前記発現構造によって、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)へ形質転換する工程と、
少なくとも一つの組換タンパク質配列をコード化する前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)から、遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)、を再生する工程と、を備える方法。 - 前記形質転換は、安定的な形質転換を含む請求項35の方法。
- 前記再生工程は、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を増殖する工程と、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)と、非遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)とを交雑(crossing)する工程と、または、
2つの遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を戻し交雑(back-crossing)する工程と、の少なくとも一つによって実施されることを特徴とする請求項35の方法。 - 前記発現構造は、プロモーター、選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、遺伝性マーカー、ポリアデニル化配列、リプレッサー、エンハンサー、局在配列、または、シグナリング配列、の少なくとも一つを含む請求項35の方法。
- 前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、ウイルス性の形質転換、DNAコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃(bombardment)、リポソーム遺伝子形質転換(liposomal
gene transformation)、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション、化学遺伝子形質転換、の少なくとも一つによる前記発現構造を用いて形質転換されることを特徴とする請求項35の方法。 - 前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)を含むバクテリアとして形質転換されることを特徴とする請求項35の方法。
- 前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、リン酸カルシウム、あるいはポリエチレングリコール(polyethylene
glycol)の少なくとも一つの助けを借りて化学遺伝子転換されることを特徴とする請求項35の方法。 - 前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、選択可能なマーカーまたは抵抗性マーカーの少なくとも一つを用いて選択される請求項35の方法。
- 前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、CIVPSあるいはインテイン組換タンパク質をコード化する少なくとも一つの核酸の発現の助けを借りて選択される請求項35の方法。
- 前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、
形質転換された胚形成組織の一つと、
植物プロトプラストと、
未成熟胚から分離した細胞と、または、
形質転換種子と、から再生されることを特徴とする請求項35の方法。 - 前記タンパク質またはタンパク質セグメントを発現する組換形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)から、組換タンパク質またはタンパク質セグメントを生産する方法であって、
請求項35の方法を実施する工程と、
前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)から、前記組換タンパク質またはタンパク質セグメントを栽培する工程と、を含む方法。 - 前記組換タンパク質を浄化することも含む請求項45の方法。
- 前記組換タンパク質あるいはタンパク質セグメントは、CIVPSあるいはインテイン組換タンパク質あるいはタンパク質セグメントである請求項45の方法。
- CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントに対して、または、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端に対して、内部または末端に融合される標的タンパク質またはタンパク質セグメントを含む組換タンパク質を生産する方法であって、
インフレーム(in-frame)によって融合されたCIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメント、または、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端を有する標的タンパク質をコード化する発現構造を取得する工程と、
前記発現構造によって宿主植物細胞を形質転換する工程と、
前記組換タンパク質の発現に効果的な条件の下で、前記形質転換植物宿主細胞を培養する工程と、を備える方法。 - 前記発現構造内において、前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントをコード化する少なくとも一つの第1核酸セグメントは、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントをコード化する少なくとも一つの第2核酸セグメントの5’−端と融合される請求項48の方法。
- 前記発現構造内において、CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントをコーディングする少なくとも一つの第1核酸セグメントは、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントをコード化する少なくとも一つの第2核酸セグメントの3’−端と融合される請求項48の方法。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列あるいはそれらのセグメントは、サッカロミケスタンパク質(Saccharomyces protein)あるいはそのセグメントを含む請求項48の手法。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントは、in-cisまたはin-transのいずれかで、切断、クリベージ、ライゲーション、切断−ライゲーション、クリベージ−ライゲーション、または、環化の少なくとも一つを特徴とする請求項48の方法。
- タンパク質のスプライシングは、温度または光またはpHの変化、スプライシングまたはクリベージの促進剤/抑制剤である化学試薬の追加/除去、アミノ酸の脱リン酸化または脱グリコシル化、または、スプライシングまたはクリベージの活性/阻害のペプチドまたは擬似ペプチドとの接触/除去、の少なくとも一つによって引き起こされる請求項48の方法。
- タンパク質スプライシングは、スプライシングまたはクリベージの活性/阻害のペプチドまたは擬似ペプチドとのin-vitroあるいはin-vivoにおける接触/除去の少なくとも一つによって引き起こされる請求項53の方法。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記アミノまたはカルボキシ末端は、Ser、Thr、またはCysを含む請求項48の方法。
- 前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記カルボキシ末端は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントのSer、Thr、またはCysに先行するAspを含む請求項48の方法。
- 前記発現構造は、さらに、プロモーター、選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、遺伝性マーカー、ポリアデニル化配列、リプレッサー、エンハンサー、局在配列、または、シグナリング配列の少なくとも一つを含むことを特徴とし、そして、さらに、
任意に、ウィルス性の形質転換、DNAコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃(bombardment)、リポソーム遺伝子形質転換(liposomal gene transformation)、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション、化学遺伝子形質転換の少なくとも一つによる前記発現構造を用いて、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を形質転換する工程と、を備える請求項48の方法。 - 前記発現構造を転移するのに使われるバクテリアはアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)である請求項57の方法。
- 転換に使われる前期化学物質はリン酸化カルシウム(calcium phosphate)、あるいはポリエチレングリコール(polyethylene glycol)で、そして、前記形質転換植物細胞、植物の部分、あるいは植物は、選択可能なマーカー、あるいは抵抗性マーカーの発現によって選択される請求項57の方法。
- 前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、前記組換タンパク質遺伝子配列の発現を通じて選択されることと、そして、
前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、組換胚形成組織から再生されることと、を特徴とする請求項48の方法。 - 前記遺伝的組換植物は、未成熟胚から誘導された細胞から再生されることを特徴とする請求項48の方法。
- 前記遺伝的組換植物は、形質転換種子から再生されることを特徴とする請求項48の方法。
- 組換タンパク質を発現する種子を生成する方法であって、
請求項1の方法を含む前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を取得する工程と、
前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を培養または栽培する工程と、
組換タンパク質を発現する種子をそこから取得する工程と、を備える方法。 - 化合物を生産するための、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を発現する組換タンパク質を使用する方法であって、
請求項1の遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を収穫する工程と、
前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を機械的に処理する工程と、
ゼロ以上の組換:非組換の比率において非遺伝的組換植物と機械的に処理された植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を結合させる工程と、そして、
前期化合物を得るために有効な条件の下、前記植物あるいは植物の特定の部分を化学的に処理する工程と、を備える方法。 - 前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)の前記機械的処理は、排出(extrusion)、粉砕(grinding)、切れ切れに裂いたり(shredding)、根囲いをしたり(mulching)、割いたり(chipping)、 さいの目に切ったり(dicing)、圧縮したり(compressing)、破裂させたり(exploding)、 そして/あるいは、裂いたり(tearing)することの少なくとも一つを含む請求項64の方法。
- 前記結合の前記化学的処理は、蒸気、希釈酸あるいは濃縮酸、アンモニア破裂、滅菌、水浸、溶剤との混合、pHの変化、温度および/あるいは浸透圧、光の変化、無機および/あるいは酵素触媒、糖化、漂白、スカーリング、発酵、蒸留、クロマトグラフィー、吸収、または化学物質の付加、の少なくとも一つの前処理を含む請求項64の方法。
- 前記前処理は、殺菌目的で前記結合物を蒸すことを含む請求項66の方法。
- 前記化学的処理は、
硫黄酸、塩化水素酸、リン酸、あるいは炭酸の少なくとも一つによる前処理、
水中におよそ20℃かそれ以上の熱において浸すこと、そして/あるいは、
前記結合物を水、有機または無機の溶剤のどれか一つと混ぜること、の一つを含む請求項66の方法。 - 外的刺激は、前記組換タンパク質またはタンパク質セグメントのスプライシングを誘発するよう適用される請求項67の方法。
- 前期外的刺激は、pH、浸透圧、または温度の変化、音、光、または化学物質の付加の少なくとも一つを含む請求項69の方法。
- 前記スプライシングされたタンパク質またはタンパク質セグメントは、前記組換タンパク質またはタンパク質セグメントに関して異なった活動を持つ請求項69の方法。
- 前記スプライシングされたタンパク質またはタンパク質セグメントは、異化作用活動あるいは同化作用活動の少なくとも一つを有する請求項71の方法。
- 前記スプライシングされたタンパク質またはタンパク質セグメントは、でんぷん、デキストリン、ペクチン、脂質、タンパク質、キチン質、リグニン、セルロース、あるいはヘミセルロース、または組換リグニンを解体することができ、または糖化活動(saccharification)ができる請求項72の方法。
- グルコース、フルクトース、キシロース、フェノール、グリセロール、マンノース、乳酸、酢酸、エチレン、プロピレン、トルエン、エチルベンゼン、スチレン、キシレン、エチレングリコール、ブタジエン、ホルムアルデヒト、イソプロパノール、アセトン、
ブタンジオール、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロパンジオール、ビタミン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ベンゼン、あるいは
生物ポリマー(biopolymers)の少なくとも一つを生成できる請求項72の方法。 - 前記前処理、糖化(saccharification)、そして発酵は一回で行なわれる請求項67の方法。
- 前記糖化と発酵は一回で行なわれる請求項67の方法。
- 前記発酵は原核(原核)あるいは真核(真核)微生物によって行なわれる請求項67の方法。
- 乳酸、酢酸、エチレン、プロピレン、トルエン、エチルベンゼン、スチレン、キシレン、エチレングリコール、ブタジエン、ホルムアルデヒト、イソプロパノール、アセトン、
ブタンジオール、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、オクタノール、プロパンジオール、ビタミン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ベンゼン、あるいは
生物ポリマー(biopolymers)の少なくとも一つを生成する前記微生物を有する請求項74の方法。 - 請求項1の遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)の栄養分量を含む動物の供給原料。
- 植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、細胞下分画、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が摂取されると、動物の内部刺激によって前記組換タンパク質またはタンパク質セグメントがスプライシングされる請求項79の供給原料。
- 前記動物の内部刺激は、だ液、胆汁、
キモトリプシン、トリプシン、重炭酸塩、塩酸、あるいは胃内pHまたは温度の少なくとも一つを含む請求項79の供給原料。 - 前記スプライシングされたタンパク質は、フィターセ, エンドセルラーゼ、エクソセルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ヘミ-セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、またはリパーゼ酵素、または成長ホルモンの少なくとも一つを含む請求項79の供給原料。
- 前記スプライシングされたタンパク質またはタンパク質セグメントは、少なくとも一つの組換免疫原を形成する特徴を持つ請求項79の供給原料を構成している免疫反応強化組成。
- 前記組換免疫原は、ウィルス性または細菌性の免疫原を含む請求項83の組成。
- 経口吸収型(oral formulation)の形を取る請求項83の組成。
- 粘膜吸収型(trans-mucosal
absorbed formulation)の形を取る請求項83の組成。 - 胃腸管吸収型(gastrointestinal
(G.I.) tract absorbed formulation)の形を取る請求項83の組成。 - 前記スプライシングされたタンパク質またはタンパク質セグメントは、原核(原核)タンパク質またはタンパク質セグメントである請求項83の組成。
- 前記スプライシングされたタンパク質またはタンパク質セグメントは、真核(真核)タンパク質またはタンパク質セグメントである請求項83の組成。
- 動物の供給原料の生成方法であって、
請求項35の方法を実施する工程と、そして、
前記遺伝子組換植物、または動物が消化可能な供給原料を得るために効果的な条件の下、結果として生じた遺伝子的組換植物の一部を処理する工程と、を含む方法。 - 請求項79の供給原料へのアクセスを動物に与える、動物の成長を促進させる方法。
- 免疫を強化する分量の請求項83の組成を、免疫強化を必要とする動物に授与する方法を含む動物の免疫反応を強める方法。
- 標的タンパク質またはタンパク質セグメントを生産する方法であって、
CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記アミノ末端は、請求項45の方法によって、標的タンパク質またはタンパク質セグメントの前記カルボキシル末端に融合されることを特徴とする第1組換タンパク質またはタンパク質セグメントを生産する工程と、
前記CIVPSまたはインテイン配列のセグメントを含む第2組換タンパク質を生産する工程と、
第1組換タンパク質および第2組換タンパク質を、前記第2組換タンパク質によって、前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントのトランスクリベージ(trans cleavage)に効果的な条件の下で接触させる工程と、を備える方法。 - 標的タンパク質を生産する方法であって、
CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントの前記カルボキシル末端は、請求項45の方法によって、標的タンパク質またはタンパク質セグメントの前記アミノ末端に融合されることを特徴とする第1組換タンパクを生産する工程と、
前記CIVPSまたはインテイン配列のセグメントを含む第2組換タンパク質またはタンパク質セグメントを同様に生産する工程と、そして、
第1組換タンパク質および第2組換タンパク質を、前記第1組換タンパク質またはタンパク質セグメントからの前記CIVPSまたはインテイン配列またはそれらのセグメントのトランスクリベージに効果的な条件の下で、接触させる工程と、を備える方法。 - 前記クリベージは、温度、光、またはpH、スプライシングまたはクリベージの阻止を促進/抑制する化学試薬の追加/除去、アミノ酸の脱リン酸化または脱グリコシル化、または、スプライシングまたはクリベージを活性/阻害するペプチドまたは擬似ペプチドとの接触/除去、の少なくとも一つの変化によって誘導される請求項92の方法。
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