JP4554932B2

JP4554932B2 - Ｃｉｖｐｓまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物と、その関連の手法

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Publication number: JP4554932B2
Application number: JP2003557280A
Authority: JP
Inventors: アール．ラーブマイケル
Original assignee: アール．ラーブマイケル
Priority date: 2002-01-08
Filing date: 2003-01-07
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2023-01-07
Also published as: CN101993907B; EP2395083B1; CN101993890A; AU2003235745B2; JP2010042034A; JP5890130B2; US20140314909A1; US20110138502A1; BRPI0307155A8; US9888707B2; US7906704B2; US20130318655A1; JP2012044992A; CN101993907A; US20100159510A1; US7709697B2; CN1633501A; US20120291160A1; US8664476B2; JP5529507B2

Description

現在の発明は以下に記述することに関連している。最初にＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物、次にトランスジェニック植物を生産するための手法、植物においてＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質を発現する手法、そして多種の利用法とＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物を含む成果物である。

化石燃料が再生可能でない資源であるため、エネルギーと有機供給原料の適切な供給が将来のために確保される必要がある。持続可能な資源への移行には供給原料の改良開発のための新しい技術と、供給原料を貴重な成果物に換える効率的なプロセスのデザイン、そして／あるいは改良された基質スペクトルを効率的に利用する成果物のデザインが必要となる。この転換は次にあげるような利益をもたらすであろう。それは、エネルギー生産と使用から生じる汚染物質や、化学的な製造プロセスから生じる汚染物質を減少させ、基質として再生可能な天然資源と有機廃棄物の使用を通して持続の可能性を増やし、外国の原材料への依存を減少させ、国内の経済と新しい基質の生産に関係する市場の拡大をもたらすことである。

植物バイオマスは未来の供給原料の必要条件を満たすために貢献する一つの再生可能な資源である。エネルギー、化学、製薬の基質としての植物の用途、そして有機的な供給原料が既存の大規模な農業の生産を利用したり、太陽からのエネルギーを使い光合成によって植物に二酸化炭素を取り入れたりする機能を利用するため、環境上危険な副産物は少ない。光合成を利用して、植物はエネルギー、化学物質と農産物の生産のために利用可能にするよう二酸化炭素を空気中から取り除く。しかし容易に、そして経済的に採用できる、効果的なこの炭素を再分配する手法を見いだすことは難しい。

植物バイオマスからの化学物質供給原料と燃料の生産はまだその初期段階にある。例えば、でんぷんベースの原材料が日用品あるいは専門化学物質成果物の生産に用いられるであろう。劣等の基質、そして抑制と関係がある実質的、あるいは認知的な安全問題と、経済的な問題、生物変換の障害となりうる負担がこのエリアでの進歩を特に遅くした。コーンスターチのような、セルロースに起因しないバイオマスは、量的に化石資源と比べて優るとも劣らないが、あまりにも高価である。それと対照的にセルロースでできた物質、たとえばショートローテーションのポプラ、松、スイッチグラス、コーン・ストーバー、バガス、紙くずのスラッジと自治体の固形廃棄物などは、量とエネルギー両方に関してコストが低い。しかしながらセルロースでできたバイオマスは、その複雑な構造物のために、処理することが難しい。現在、セルロースでできたバイオマスは強い酸、塩、そして／あるいは他の化学物質、燃料のための基質として利用する、例えばエタノールなどの化学物質や、例えば紙製品などの化学製品に使われるものを用いて前処理をする必要がある。この前処理は効率的に重合体のサブユニット、初期のヘキソース、ペントースとフェノールの化合物を引き出す、そしてこれらは基質として切断されて使用される。しかしながらこの前処理はたいへん費用がかかる。他の手法ではそれほど費用が安くないものとして、いっそう危険な化学物質の酵素の使用がある。

組換ＤＮＡ技術は微生物の変換に応用され、経済的な基質バイオコンバージョンの役割を果しており、微生物の利用を拡大しその生産物を増大させている。例えば、構造的な成分の分解によって完全な植物にほとんど分化したり再生したりはしないが、リグノセルロースでできた物質を酵素が分解するものを発現する植物細胞が作られている。例えば、リグニンとセルロース基質を用いて分化する場合など、完全な植物に分化するケースでは、酵素活性は低く、植物はそれ以上の処理を必要とする。基質バイオマスの前処理を発酵と組み合わせる試みも、大量移換の限界と有機体の発酵が一部の原因として難航している。

ＣＩＶＰＳあるいはインテインはインフレームで自己切断をするペプチドである。それは、一般により大きい先駆物質であるタンパク質分子の一部として起きる。ＣＩＶＰＳあるいはインテインがいくつかの基本的な手法で他のプロテアーゼまたは酵素原とは基本的な部分で異なる。自己切断、または他のタンパク質を多非結合ポリペプチドに変化させるようなプロテアーゼと異なり、ＣＩＶＰＳあるいはインテインはcis型あるいはtrans型構造に切断したり、結合させる能力を有する。よって、あるタンパク質に対するプロテアーゼの反応で起きる末端切断と異なり、ＣＩＶＰＳ或いはインテインは複数箇所を切断し、幾つかのタンパク質の断片を結合させる能力を持つ。この切断は特別な状態のもとで誘発され、分子生物学技術を使って実行できる。ＣＩＶＰＳあるいはインテインは以下にあげる文献にとりあげられている。Sacchromyces
cerevisiae(Kane et. al., Science 250:651; Hirata et al., J. Bio. Chem. 265:6726
(1990)), Mycobacterium tuberculosis (Davis et al., J. Bact. 173:5653
(1991), Davis et al., Cell 71:1 (1992)), Thermococcus litまたはalis (Perler,
et al., PNAS 89:5577 (1992))

以上のように、エネルギーや化学供給原料として使われるであろう組換植物といった容易に再生可能な資源からエネルギー、及びその他の製薬又は工業の製品を作り出すための斬新な手法が求められているのである。

現発明は、標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）が外部から５０℃以上への温度の上昇の刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のｃｉｓ−スプライシングを誘発するものであり、
前記組換タンパク質を発現し、前記刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、および／または、リグニンを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を提供することにより、エネルギーや化学供給原料として使われるであろう組換え植物を提供する。

発明はＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換遺伝子によって構成されているトランスジェニック植物を生産するための手法にも関連している。（例）最初に親ＣＩＶＰＳ或いはインテイン組換遺伝子で形成されたＤＮＡの断片を構成し、それによって植物を変換する方法。

発明はまたトランスジェニック植物におけるＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質を生産するための手法に関連もしている。（例）植物やその細胞の変換によること、単数または複数の組換遺伝子配列をともなうこと、そしてＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質の発現。１つの望ましい実施例で遺伝子配列はいつでも発現されるであろう。そのほかの実施例においては、タンパク質がスプライシングされる前に、実質上異なった活動、そして／あるいは構造的な特性をもたらす。スプライシングされたタンパク質の成果物の活動は、ＣＩＶＰＳ以外の、またはインテイン組換タンパク質親配列に相似した、外生的に加えられたり内生的に発生した分子によって抑制されなければ明確になる。ＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質成果物は大量に発現され、そして植物材料から再生されるであろう。その他に植物、あるいは植物材料がＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質の成果物の資源として使用されるであろう。

発明は次にあげる利用をも対象とする。それらは、植物においてＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質の成果物の利用、ＣＩＶＰＳやインテイン組換遺伝子が発現されたトランスジェニック植物の動物飼料利用、一群のＣＩＶＰＳやインテイン組換タンパク質が発現されたトランスジェニック植物の利用、燃料、化学製品、動物の飼料、食品添加物、薬、紙、製紙商品の生産に関る継続的な産業プロセスへの利用、そして、ワクチンデリバリーと廃棄物の再資源化である。

現発明の他の目的、利点と特徴がつぎに述べる図と論議による概略からその特殊技術が図示において明白になるであろう。

この発明は、植物材料やバイオマスなど再生可能な資源から貴重な成果物を生み出す斬新な手法を創造する発明者の願望から生まれた。効果的にこの目的を達成させる手法の一つは、ＣＩＶＰＳあるいはインテインが付着している望ましいタンパク質、ＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質の使用を通して生じる組換植物バイオマスによってである。本特許申請書類ではＣＩＶＰＳとインテインは同義語として解釈され、それらは置き換えることができる。発明者は、インテインにより組換られたタンパク質が、高い滴定量の細胞において、実質上低活動で、発現されるという知識から、もしクローンとして植物に発生させるなら、この低活動は、形成されたトランスジェニック植物細胞、植物の部分、または植物の組織が、インテイン組換タンパク質を生成する完全な植物に成長することを可能にするであろうと結論付けた。さらに、発明者はこのトランスジェニック植物はいくつかの異なった実施例をもたらすと考える。その実施例には、組換タンパク質を発現するためにつくられた組換植物である。それらは次のいずれかの条件を持つ。（１）継続的、または過渡的、（２）植物の成長周期による化学的誘発または生物学的誘発、（３）植物全体を通して、または特別に性質の異なる植物組織において、そして／あるいは（４）細胞下の局在化をともなって／ともなわず、などがある。発明者によって構想されるように、この発明の一つ実施例において発現されたインテイン組換タンパク質は、その活動が既知である親タンパク質配列によって構成されている。その親タンパク質配列は、配列またはホモロジーの体系、そして／あるいは突然変異生成よって、または新たな合成によって生産されることなどを通して推論される。即ち、それぞれの親配列は、インテイン配列またはインテイン配列の部分により切断されたり、融合されたりする。いったん挿入されると、組換タンパク質のインテイン部分は、生体内で、その活動や親タンパク質の構造的有用性を非活性化する。しかしながら、親タンパク質の元々の活動は、必要に応じてインテインのスプライシングの誘発により実質上回復されるであろう。例えば、応用例の一つとして、植物収穫期や基質の前処理の間に次いで、それぞれのＣＩＶＰＳが、その元々の活動を取り戻した親タンパク質の配列から自身をスプライシングするよう誘発することが挙げられる。タンパク質を機能性活動に組換て、或いはその組換無しで、インテインをスプライスする手法は、この技術の専門家に知られているのでここでは記述をはぶく。これらの手法は光、温度、ｐＨの変化の使用、そして／あるいは化学試薬の付加を含む。

さらに具体的に述べると、この発明は組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）、発現構造を形成するものを対象としている。これら対象物は内部、または末端のどちらかにおいて、ＣＩＶＰＳやインテイン配列、またはその部分、またはアミノ末端またはカルボキシル末端に融合される標的タンパク質またはタンパク質セグメントを含む、少なくとも一つの組換タンパク質を符号化する。一つの実施例において、植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）、構成物質の発現構造は、効力的に相互に連接している、標的タンパク質を符号化した最初の核酸部分、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列を符号化した二番目の核酸部分、そして随意的に選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子、そして／あるいはプロモーターによって構成される。より特定の実施例においては、配列は直接的、あるはリンカーを介して、そしていっそう望ましい、リーディングフレームにおいて、融合されるであろうことは理解されている。組み換えタンパク質は継続的にまたは誘発的に植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）によって発現されるだろう。後者のケースでは、発現、そして／あるいは、少なくとも一つの組換タンパク質のスプライシングは、ある刺激によって引き金を引かれ、または誘発されるであろう。適当な刺激の例として、ｐＨの変化、オスモル濃度の変化、あるいは温度、肥料、殺虫剤、あるいは化学物質、の付加あるいは光の変化、そして／あるいは音の変化で構成される。植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は、植物ライフサイクルの事前に決められた時点において、一つ以上の特定の組織、あるいはその組織の部分で、そして／あるいは少なくとも一つの特定の細胞内小器官で、組換タンパク質を発現するであろう。代わりに、あるいは後者の組換タンパク質をともなった結合において、発現されたり、細胞外で分泌されるであろう。植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）の特定の組織は種、根茎、果物、茎、塊茎、そして／あるいは葉であろう。そして、特定の細胞内小器官は細胞のアポプラスト、シトソル、ミトコンドリア、プラシド、小胞体、体内封入、空胞、そして／あるいは核であろう。他の異なったものは、この発明の範囲内に含まれている。

植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は化学物質に対する抵抗をおこす、選択可能なマーカーを伴うであろう。これらの例は、ブロモキシニル、２，２−ジクロロプロピオン酸、Ｇ４１８、有機リン酸（Ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ピリジン（ｈａｌｏｘｙｆｏｐ）、ハイグロマイシン（ヒグロミシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ））、イミダゾリン、カネマイシン、メトトレキサート、ネオマイシン、ホスフィノスリシン、セトキシジム、２，２−ジクロロプロピオン酸、有機リン酸（Ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ハイグロマイシン（ヒグロミシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ））、トリクロチエン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｎｅ）、スルホニル尿素、ｓ−トリアジン（ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ）、および／または、トリアゾロピリミジンである。また、以上の他も用いられるだろう。プロモーターはＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質ポリヌクレオチドを先行するために含まれるだろう。場合によっては、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、あるいは発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は、選択された化学物質の通常極めて有毒なレベルに対して耐性的であるか、あるいは抵抗的であるだろう。別の実施例においては、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、あるいは発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は繁殖力があり、少なくとも一つの遺伝性の組換タンパク質エンコーディングポリヌクレオチド配列を持っている。しかし、それはまた繁殖力に乏しいものであるかもしれない。さらに、先に述べたように、同じくこの発明の一部は、この発明の手法により生産される、あるいはそうでない、インブリッドでハイブリッドである遺伝的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、あるいは発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）に関する。とりわけ重要なものは、実質的に商業的重要性のある、植物の部分、植物の種、植物の苗木そして、プロトプラストであろう。同じく商業的に、そして他に重要なものは、植物、植物組織、と植物細胞である。スプライシングされたタンパク質は、一つ以上の植物構成物の内容や活動を変える能力を持っているだろう。一つの例においては、構成物の内容、例えば、グルコース、フルクトース、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、グリセロール、グリシンベタイン、ペクチン、スクロース、ラクトース、マルトース、ガラクトース、アミノ酸、脂質、ビタミンやでんぷんなどの含有量を減らすなど、内容を変えられるであろう。他の例としては、植物構成物の活性が変えられる。例えば、一つ以上のセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、および／あるいは脂質などの活性が減らされるだろう。一つの面では、前記ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列と前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントは、前記標的タンパク質を用いてスプライシングする接合点を少なくとも一つ形成する。ある望ましい実施例においては、スプライス接合点のカルボキシル末端におけるアミノ酸残基はヒドロキシル基またはスルフヒドリル基の側鎖を提供される。もう一つの特に有用な実施例では、前記スプライス接合点は前記ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分の下流に配置される、そして例えば、標的タンパク質、あるいはタンパク質セグメントのアミノ末端において、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基の側鎖が不足しているアミノ酸残基を構成するであろう。その他の重要な変異として、前記スプライス接合点は前記ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分の上流に配置される、そして例えば、標的タンパク質、あるいはタンパク質セグメントのアミノ末端において、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基の側鎖が伴っているアミノ酸残基を構成するであろう。もう一つの重要な可能性として、前記スプライス接合点はＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分の上流に配置され、そして、そのスプライス接合点はシステインを構成しているであろう。またもう一つの重要な変異として、前記スプライス接合点はＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分の下流に配置されるところにて、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分のカルボキシル末端において、Ｈｉｓ−Ａｓｎが供給され、そして／あるいは標的タンパク質の隣接領域のアミノ末端において、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基の側鎖を有するアミノ酸残基も供給されるだろう。もう一つの興味深い点は、前記スプライス接合点はＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分の下流に配置され、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分のカルボキシル末端において、Ａｓｐが供給され、そして／あるいは標的タンパク質またはタンパク質セグメントの隣接領域のアミノ末端において、ヒドロキシル基またはスルフヒドリル基の側鎖を有するアミノ酸残基も供給されるだろう。更なる一時的変異は、カルボキシル末端における前記Ａｓｐがカルボキシルまたはアミノ側基が不足しているアミノ酸によって置換され、そして、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはその部分がサッカロミケス真菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｆｕｎｇｉ）、さらに特定すると出芽酵母真菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｕｎｇｉ）から、またはその他の種族の中から外的に制御可能なＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分を形成することがあげられる。この発明の成果物の挿入物として適したその他の構造は、次にあげるものである。ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはその部分が、標的タンパク質またはタンパク質セグメントのＳｅｒ、ＴｈｒあるいはＣｙｓの直前に挿入されたもの、そして、Ｓｅｒ、ＴｈｒあるいはＣｙｓなどを構成しているＣＩＶＰＳ、インテインアミノ、またはカルボキシル末端である。これからさらに詳しく記述するように、専門的には知られているように、標的タンパク質は、バクテリアなどの有機微生物によって発現されるであろう。有機微生物の例としてはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｇｉｅｎｓｉｓ）、あるいはフィトラッカインスラーリス（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｉｎｓｕｌａｒｉｓ）が用いられている。一つの望ましい標的タンパク質は、発現される組換バチルスチューリンゲンシス内毒素（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｇｉｅｎｓｉｓｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）として結果生じる、バチルスチューリンゲンシス内毒素（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｇｉｅｎｓｉｓｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）である。他の実施例は、ウィルスからの標的タンパク質の発現を含んでいる。如何なるウィルスでも用いられるであろうが、例としては、ポテトウィルスＹ（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ）、ジェミニウィルス（ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ）、アスパミーウィルス２ｂ（ａｓｐｅｒｍｙｖｉｒｕｓ２ｂ）、あるいはキュウリモザイクウィルス（ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）などがあげられる。もう一つの実施例としては、ヒトの標的タンパク質の発現を含む。どのようなヒトのタンパク質も用いられるであろうが、好ましいタンパク質の例としては、成長ホルモンそして治療の上で有益なその他のタンパク質を含む。

前記組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を生産する手法は以下にあげるものがある。

ＣＩＶＰＳまたはインテイン配列に対して、または、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端に対して、内部又は末端に融合される標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含む組換えタンパク質を少なくとも一つコード化する発現構造を提供する工程。

前記発現構造によって、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）へ形質転換する工程。

少なくとも一つの組換タンパク質配列をコード化する前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）から、遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を再生する工程。

前期形質転換が安定した転換であることは大いに望ましい。しかし、それが一時的な安定でもよい。前記再生工程は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を増殖する工程と、組換植物と非遺伝的組換植物、子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)と非遺伝的組換植物、組換植物と子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)、子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)と子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)、またはプロトプラストとプロトプラストとを交雑（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）する工程と、および／または、２つの遺伝的組換植物、２つの子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または２つのプロトプラストを戻し交雑（ｂａｃｋ−ｃｒｏｓｓｉｎｇ）する工程があるであろう。発現構造は以下にあげるものを含んだこの手法が用いられる、手法に含まれているであろうものは、一つ以上のプロモーター、選択可能なマーカー、レジスタンスマーカー、遺伝性のマーカー、ポリアデニル化配列、リプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）、エンハンサー、局在配列、そして／あるいはシグナルリング配列がある。これらは専門的には知られており、これらは組換テクノロジーの応用目的のためであり、以下にあげる例の中に幾度か記述されている。この手法の重要な点においては、植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）がウィルス性の形質転換、ＤＮＡコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム遺伝子転換、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、または化学遺伝子形質転換、またはそれ以外のものによって形質変換された発現構造を用いる。上記で述べたように、転換した植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアを用いた方法によって転換される。ただし、他の有機微生物も用いられるだろう。現在の手法において、形質変換は化学遺伝子変換により行われるだろう。そして次にあげるものを助成物として用いて行われるであろう。例として、専門的には知られている、リン酸カルシウム、そして／あるいはポリエチレングリコール、またはこの目的のために適しているとされている他の化学物質がある。前記選択は選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、または、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質をコード化する少なくとも一つの核酸の発現に助けられて達成するであろう。前期発明の手法においては、前記遺伝子的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は転換された胚発生組織、植物プロトプラスト、未熟胚から誘導された細胞、転換した種などから再生されるであろう。

その他の手法もまたこの特許にて述べられる。それは、タンパク質またはタンパク質セグメントを発現する組換転換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）から、組換タンパク質、またはタンパク質セグメントを産出するのに適している、これは先に述べた手法を使って構成している。そしてさらに、転換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）から組換タンパク質、またはタンパク質セグメントを採集する。

またさらに、ＣＩＶＰＳまたはインテイン配列に対して、または、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端に対して、内部または末端に融合される標的タンパク質またはタンパク質セグメントを含む組換タンパク質を生産する方法は以下に述べるものである。

インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）によって融合されたＣＩＶＰＳまたはインテイン配列、または、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端を有する標的タンパク質をコード化する発現構造を取得する工程。

発現構造を用いて、宿主植物細胞を形質変換する。そして、

前記組換タンパク質の発現に効果的な条件の下で、前記形質転換植物宿主細胞を培養する工程。

一つの好ましい状況では、発現構造にて、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分をコード化する、少なくとも最初の核酸部分が標的タンパク質またはタンパク質セグメントにコード化した２番目の核酸部分５’−端に融合される。そしてまた他には、発現構造にて、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分または標的タンパク質または、タンパク質セグメントをコード化する最初の核酸部分は２番目の核酸部分３’−端に融合される。現行の手法を使うのはサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分を用いるのにとりわけ適している。このサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分はｃｉｓ、またはｔｒａｎｓのどちらかで次にあげることに効果的だと知られている。それらは、切断、クリベージ、ライゲーション、切断−ライゲーション、クリベージ−ライゲーション、そして／あるいは環化である。ＣＩＶＰＳあるいはインテインまたは、その部分がタンパク質スプライシングを誘発するのに用いられる時、この事象は次のことにより誘発または引き金となるだろう。それらは、スプライシングまたは、切断、あるいはアミノ酸の脱リン酸化または脱グリコシル化、あるいは、ペプチドまたは擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）の活動、あるいはスプライシングや切断の妨害を用いての接触または除去による。これらは温度の変化、光、ｐＨ、化学反応の付加／除去によって促進または抑制される。他のタンパク質スプライシングを誘発する手法は生体外または生体内において、スプライシングまたは、切断を活性または切断するペプチド、または擬似ペプチド物質（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃａｇｅｎｔ）で接触、除去する。優れた結果をもたらす興味深い他のバリエーションは、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓを形成するＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分のアミノまたはカルボキシル末端、あるいは、標的タンパク質またはタンパク質セグメントのＳｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓを先行するＡｓｐを構成するＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分のカルボキシル末端である。しかし、専門家には知られている、他の変化も可能である。（参照例、米国特許Ｎｏ．５，８３４，２４７）原核（原核）と真核（真核）の領域をあらわす、ある系統的分類法はこの発明において、ハイブリッド植物の有用な特徴の成果物に組み込まれた。発現構造はプロモーター、選択可能なマーカー、レジスタンスマーカー、遺伝性のマーカー、ポリアデニル化配列、抑圧体、エンハンサー、ローカリゼーション、配列、そして／あるいはシグナルリング配列をさらに構成するであろう。さらに、ここに示す手法は、ウィルス性の形質転換、ＤＮＡコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム遺伝子形質転換（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション、化学遺伝子形質転換、またはそれ以外のもの、または専門では知られている他の手法、あるいは二次的に発生されるものによって行われた発現構造を用いて植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）の形質変換が構成されるだろう。上記に示されたように、ここで述べている手法において、発現構造に変換するバクテリアはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）。形質の変換のために使用される化学物質はリン酸化カルシウム、またはポリエチレングリコール。変換された植物細胞、植物の部分、植物などは選択可能なマーカー、レジスタンスマーカーのそれらの発現を通して選択されるだろう。変換された植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）の選択は組換タンパク質配列の発現を通して行われるだろう。そして、遺伝的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）の再生は、組換胚発生組織、未成熟胚から誘導された細胞、形質転換種子などを通して行われる。

そしてまた、この特許は組換タンパク質の発現の種を作り出すための手法も記述する。この手法は以下にあげるものである。

発明の遺伝的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を得る手法。

遺伝的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）培養、または栽培する手法、そして

組換タンパク質を発現する栽培された植物の種から得る手法である。

この特許による、またもうひとつの手法は化合物を生産するために組換タンパク質を発現する植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を使用するためにもたらされた手法である。この手法は以下にあげるものである。

この特許で説明されるとおりの組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を採集する手法。

機械的に植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を処理する手法。

ゼロ組換：非組換に対してそれ以上か同等の割合で非遺伝的組換植物と機械的に処理された植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を結合する手法。そして

化合物を得るため、有効な条件の下で植物あるいは植物の特定の部分を化学的に処理する手法。

この手法は植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を押し出したり、粉砕したり、ずたずたにしたり、根おおいを施したり、割いたり、さいの目に切ったり、圧縮したり、破裂させたり、そして／あるいは裂いたりする、これらの機械的処理によって行われるだろう。他の処理技術も適用される。結合された化学物質の化学的な処理は種々の技術あるいはその組み合わせによって行われるだろう。いくつかの前処理は次にあげるものによっておこなわれる。それらは、蒸気、希釈酸あるいは濃縮酸、アンモニア破裂、滅菌、水に浸す、溶剤、ｐＨの変化、温度あるいはオスモル濃度、光の変化、無生物そして／あるいは化学物質の付加。その他も起用に成功している。次のように行われるとき、種々のステップが役に立つ：前処理は殺菌目的で結合された成果物を蒸発することを含む；化学的な処理は硫黄酸、塩化水素酸、リン酸、あるいは炭酸、水中におよそ２０℃かそれ以上の熱において浸すことによって、そして／あるいは水、有機あるいは無機の溶剤のどれか一つにて混ぜた結合した成果物これらの少なくとも一つを用いる。すでに説明したように、外部からの刺激が組換タンパク質あるいはタンパク質セグメントのスプライシングを誘発するために応用されるだろう。外部からの刺激の例はｐＨ、オスモル濃度、あるいは温度の変化、音、光あるいは化学物質の付加にさらされることがあげられる。ある場合において、スプライシングされたタンパク質あるいはタンパク質セグメントは組換タンパク質あるいはタンパク質セグメントに関して異なる活動を示すであろう。その活動とは、オリジナルの標的タンパク質に関しての異なる結合、異化作用あるいは同化作用の活動である。スプライシングされたタンパク質あるいはタンパク質セグメントの例として、でんぷん、デキストリン、ペクチン、脂質、タンパク質、キチン質、リグニン、セルロース、あるいは半セルロース、または、組換リグニン、または糖化活動を解体ことができる。そのため組換タンパク質は次にあげるものを生産することができるであろう。それらは、グルコース、フラクトース、キシロース、フェノール、グリセリン、マンノース、乳酸、酢酸、エチレン、プロピレン、トルエン、エチルベンゼン、スチレン、キシレン、エチレングリコール、ブタジエン、ホルムアルデヒト、イソプロマノール、アセトン、ブタンジオール、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロパンジオール、ビタミン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ベンゼン、そして／あるいは生物ポリマー（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、などの化合物がある。前処理の特定な実施例の一つにおいて、糖化活動と発酵は一回で行なわれるであろう。そして発酵は、乳酸、酢酸、エチレン、プロピレン、トルエン、エチルベンゼン、スチレン、キシレン、エチレングリコール、ブタジエン、ホルムアルデヒト、イソプロマノール、アセトン、ブタンジオール、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロパンジオール、ビタミン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ベンゼン、そして／あるいは生物ポリマー、などの化合物を生産できる原核（原核）あるいは真核（真核）微生物を用いて達成されるであろう。

この発明は組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）の食物を構成する動物の供給原料の生産も含む。発明者によって生産された供給原料が動物によって摂取されるとき、動物からの内部の刺激によって組換タンパク質またはタンパク質セグメントはスプライシングされる。内部の刺激の例として、動物のだ液、胆汁、キモトリプシン、トリプシン、重炭酸塩、塩化水素の酸、あるいはｐＨまたは温度による。発明による供給原料はスプライシングされたタンパク質を含む、それらは、フィターセ、エンドセルラーゼ、エクソセルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ヘミ−セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、またはリパーゼ、または、成長ホルモンといったものである。その他のタンパク質も必要とあれば用いられるだろう。

また、その他のこの発明の様相は上で記述された、免疫反応を強める構成物の製造における供給原料の使用のためにもたらす。この構成物の中はスプライスされたタンパク質または、タンパク質セグメントは少なくとも一つの組換免疫原を構成する。免疫原は一つ以上のウィルス性または、細菌性の免疫原を含んでいるだろう、そして種々の適当な形で定式化されるだろう。好ましいのは経口吸収型（oral formulation）、粘膜吸収型（trans-mucosal absorbed formulation）、胃腸管吸収型（gastrointestinal (G.I.) tract
absorbed formulation）などである。しかし、この構成物質は動物、または動物飼料に適用するために適したあらゆる組織系、または主題の形にて定型化されるであろう。

発明による動物の供給原料は最初に上記に示されたステップを用いて、生産されるであろう。その手段とは遺伝子的組換植物、または植物の部分、小植物、組織、細胞、種、苗木、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を得る、そして遺伝子的組換植物、または動物の消化可能な供給原料を得るために効果的な条件の下で結果として生じた成果物の一部を処理する手段である。

この発明の成果物は動物の成長促進のためにも用いられる。例としては成長促進成果物を含む供給原料の生産によること、または動物が組換供給原料を得ることができることによる。また、この発明の成果物は動物の免疫反応を強めることにも用いられる。さらなるこの発明の様相は治療が必要な動物に発明による免疫力を強める構成物を投与することにも用いられる。

この発明のさらなる様相には標的タンパク質または、タンパク質セグメントを生産するための手法がある。この手法は以下にあげるものである。

上記に記述された手法によって、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分のアミノ末端がカルボキシル末端に融合されるところにおいての最初の組換タンパク質または、タンパク質セグメントを生産する手法。

ＣＩＶＰＳあるいはインテインの部分を構成する２番目組換タンパク質を生産する方法。そして、

２番目の組換タンパク質によってＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれら部分のトランス切断のために効果的な条件下で、１番目と２番目の組換タンパク質が接触する手法。

標的タンパク質を生産するための、ほかの種々の上記の手法。それらは以下の手法を含む。

ＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分のカルボキシル末端が、上記ですでに述べた手法により標的タンパク質または、タンパク質セグメントのアミノ末端に融合するところにおける、最初の組換タンパク質を生産する手法。

同様にＣＩＶＰＳあるいはインテインシーケンスのセグメントを構成する２番目の組換えタンパク質を生産する手法。そして、

最初の組換タンパク質または、タンパク質セグメントからＣＩＶＰＳあるいはインテイン配列、またはそれらの部分をトランス切断するための効果的な条件下で、最初と２番目の組換タンパク質を接触する手法。切断は次にあげるものによる処置において誘発されるだろう。それらは、温度、光、またはｐＨの変化、アミノ酸の脱リン酸化または脱グリコシル化のスプライシング、または切断の阻止を促進／抑制する化学物質の付加／除去、そして／あるいはスプライシング／切断を活性／阻止するペプチド、または擬似ペプチド（peptidomimetic）を接触／除去するなど。

従って、発明はトランスジェニック植物に対して向けられている。この特許では、トランスジェニック植物の用語は遺伝子的組換植物、それらの種と子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）植物、またはどんな植物部位、組織、または細胞、ＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質のための遺伝子を含んでいるものは類語として解釈される。発明はさらに次にあげることに向けられている。ＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質を生産するトランスジェニック植物の産出のための手法、植物におけるＣＩＶＰＳまたはインテインの組換タンパク質の産出のための手法、そして、燃料、化学物質、動物飼料または、食品添加物、紙、そして、製薬製品のための基質としての植物の利用。発明は結合、生体構造または、触媒作用の構成物の資源とし使用ができることや、あるいは結合、生体構造または、触媒作用タンパク質として別々に精製、または使用されるインテイン組換タンパク質を持つことができる、トランスジェニック植物の産出を認める。トランスジェニック植物は単数または複数の外因性遺伝子そして、それらの関連づけられたタンパク質（または、リボ核酸）活動を発現する多細胞植物である。この発明の記述のなかで、遺伝子または、酵素の分類が特定のものを示しているであろうが、発明の様相を制限することはない。特定の分類が述べられるとき、特定の分類の中でどのような遺伝子または、酵素も認めることを解釈される。親タンパク質配列の内部または、隣接したタンパク質配列である。この自然発生的カルボキシルまたは、アミノ末端のいずれか、あるいはその両方において自切断する、そしてＣＩＶＰＳあるいはインテインは結果として生じるエクステインタンパク質の破片が特定の条件にのもとで適時に選択的なライゲートをすることができる。以下参照（例）Ｐｅｒｌｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２：１１２５−１１２７（１９９４）；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｃ．Ｊ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，２：６９７−７０５（１９９３）；Ｘｕ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５：１３７１−１３７７（１９９３）；Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，２：６９７−７０５（１９９４）。従って、ＣＩＶＰＳより大きな先駆タンパク質分子の部分として遺伝子的に起きるインフレーム、自切断ペプチドと言われるだろう。ＣＩＶＰＳあるいはインテインはいくつかの基本的な方法において、他のプロテアーゼまたはチモーゲンとは異なる。自己切断、または他のタンパク質を複数のライゲートされていないポリペプチドにライーゲート（ｌｉｇａｔｅ）するプロテアーゼと異なり、インテインは、ｃｉｓまたは、ｔｒａｎｓの配列において、切断やライゲートのどちらも出来る。従って、タンパク質上のプロテアーゼの反応の結果生じる、末端の切断に対抗するものとして、インテインは複数の位置で切断することや、結果として生じるエクステインタンパク質の破片をライゲートすることが出来る。この切断は特定の条件の下で誘発される、そして分子生物学において知られている技術の実行を遂げるだろう。種々のもとによるインテインは、それらの配列、特徴と機能は細かく文献に記述さている。参照、（例）Ｋａｎｅｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：６５１（１９９０）；Ｈｉｒａｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６５：６７２６（１９９０）（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：５６５３（１９９１），Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７１：１（１９９２）（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；Ｐｅｒｌｅｒ，ｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８９：５５７７（１９９２）（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）。図１に示されるように、ＣＩＶＰＳと予期される活動あるいは構造的な役割のタンパク質との組み合わせはインテイン組換タンパク質をもたらすであろう。この予期される活動あるいは構造的な役割は実質上変換される。ＣＩＶＰＳ組換タンパク質を発現する（それらのインテイン組換遺伝子の関連による）トランスジェニック植物は、先のトランスジェニック植物の改良による。それは、親インテイン組換タンパク質は二つの実質上異なった状態を持つことができるからである。その状態とは、インテインの切断により抑制可能な媒介がされる。この切断は予期されるタンパク質配列の組み合わせと関連されることもあるだろう。発明は単数または、複数のタンパク質とＣＩＶＰＳどんな組み合わせのあらゆる植物種から形成されるであろう。植物種には次にあげるものが含まれるが、それ以外も適用される。これらは、ポプラ、シラカバ、ヒマラヤスギ、マツ、堅材、軟木、大豆、スウィッチグラス、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、さとうきび、カリフラワー、アーティチョーク、バナナ、りんご、チェリー、クランベリー、きゅうり、レタス、ブドウ、レモン、メロン、ナット、蜜柑、米、オレンジ、モモ、ナシ、ブルーベリー、いちご、トマト、にんじん、キャベツ、ポテト、エンダイブ、ニラネギ、ほうれんそう、雑草、クスウコン、ビート、にんじん、カッサバ、カブ、ヤムイモ、ダディッシュ、サツマイモ、ムギ、オオムギ、大豆、豆、菜種、キビ、ヒマワリ、オートムギ、エンドウ豆、塊茎、タケ、海藻、藻、またはその他の植物種。タンパク質はあらゆる周知の、推定の、組換の、あるいは斬新に作られたものを含むだろう。自生タンパク質の選択は限定されていないが、好ましいタンパク質は以下にあげるものが含まれる。それらは、リグノセルローシック解体タンパク質（セルラーゼ、リグナーゼ）、でんぷん解体酵素（アミラーゼ、グルカナーゼ）、燃料、または化学製品、細菌性のあるいはウィルス性の抗原体に必要な生合成経路においての酵素、生合成経路のためのビタミンまたは、その他の食品添加物のための酵素（フィターセ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ヘミ−セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロチアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、成長ホルモン）、有害生物の伝染や、インセクトレジスタンスのタンパク質、そして、疾病病因に含まれる、治療効果のあるタンパク質である。タンパク質を組み換えるために用いるＣＩＶＰＳあるいはインテインの選択は好ましい植物において発現されるものの融合も制限されない。あらゆる単数または、複数のＣＩＶＰＳあるいはインテインは望ましいタンパク質または、タンパク質に関して、あらゆる配置において使用される。ＣＩＶＰＳあるいはインテインは一個所または両端において、スプライスされることが出来る。ある刺激の反応において、そして単数または、複数のＣＩＶＰＳあるいはインテインが融合されるタンパク質にライゲートすることもあるだろう。

ＣＩＶＰＳあるいはインテインを発現するトランスジェニック植物、そしてトランスジェニック植物によるＣＩＶＰＳあるいはインテインの産出は専門では知られている手法の組み合わせによって成される（Ausubel, et al.）。一般にこれらの手法は次にあげるものを含む。ＣＩＶＰＳあるいはインテインを含んだＤＮＡ構成の重要性とその発現のための調節エレメントの必要、拡大と構成されたＤＮＡの選択物、望ましい植物種の変換、再生、適切に変換したの選択植物種、そして必要であれば、自生の形または、切断された形でのＣＩＶＰＳあるいはインテインの精製。ＣＩＶＰＳあるいはインテインを発現するトランスジェニック植物、そしてその両方はこの発明の一部を構成する。トランスジェニック植物にてのＣＩＶＰＳあるいはインテインの産出のためには、ＣＩＶＰＳあるいはインテインＤＮＡ配列が構成されなければならない。これは容易に、望ましい活動の遺伝子配列とインテイン配列がE. coliまたは、あらゆる他の適した宿主（例、イーストがある場合には有益であろう、または哺乳類または、ウィルス性または、非ウィルス性のべクトルを使用、あるいは使用しない植物の細胞における発現）の中で繁殖することよって達成される。いったん遺伝子とインテインコーディング配列が繁殖されたら、それらは望ましい配置で結合されなければならない。選ばれたインテイン配列は刺激による（例えば、光、ｐＨの変化、温度、圧力、あるいはインテイン組換タンパク質を取り巻いているローカルな化学的構成における変化）反応でスプライシングするなどの望ましい機能を行うことができるべきである。図１に示されるように、ＣＩＶＰＳあるいはインテインＤＮＡコーディング配列または、それらの組み合わせの発生結果においてＣＩＶＰＳあるいはインテインのＤＮＡ配列とタンパク質のＤＮＡ配列を繋ぐことは、専門では知られている手法によって容易に成される。すでに示されたように、ＣＩＶＰＳあるいはインテインはカルボキシル末端、アミノ末端、または、自生タンパク質または、タンパク質内部の一部のいずれかにＣＩＶＰＳまたはインテインが融合されたものである。いくつかの手法があるが、ＣＩＶＰＳあるいはインテインと望ましいタンパク質コーディング配列の間で融合を作る一つの手法は、精製するＤＮＡがコード化する望ましいタンパク質配列、そしてタンパク質コーディング配列をインテイン挿入の望ましい位置において切断する制限酵素の利用、そしてまた、制限された位置にインテインコーディング配列をライゲートする。ポリヌクレオチド、または核酸部分のいずれかは、適した調整、そして／あるいは選択配列、またはそれらのベクトルを介したものに直接クローンされるであろう。調整部分の例は以下にあげるものである。ＣＩＶＰＳあるいはインテインの一時的な発現をコントロールするプロモーター、そしてオリジナルの複製、そして／あるいは生体内、特定の植物組織あるいは特定の細胞内小器官において、ＣＩＶＰＳあるいはインテインの場所の分配をコントロールするシグナルリング配列である。選択エレメントの例としては、次にあげるものがある。除草性または、アンチ細菌性の遺伝子、蛍光性マーカー、色素性マーカー、そしてその他の適する選択されたマーカーがある。結果として生じているポリヌクレオチドまたは、ＣＩＶＰＳあるいはインテインを構成するベクトルのコード化するポリヌクレオチドと、そして随意的にあらゆる望ましい調整、そして選択エレメント、これらはいっそうたくさんの成果物を得るために拡大されるだろう、それらは望ましい植物種の次の変換に使われるだろう。改良のすべてのステップは、あらゆる望ましいＣＩＶＰＳあるいはインテインとタンパク質のポリヌクレオチドの間で特定の方向づけと融合を容易にすることが可能である、そして、この手法は知られている。コーディング配列、そして／あるいはＣＩＶＰＳあるいはインテインのコーディング配列のいずれかの変質と、そしてこれら配列のいずれまたは両方のライゲートは、専門では知られている技術よって容易に達成される。その手法はサイトディレクト突然変異生成、ランダム突然変異生成、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、エラープローンPCR、そして／あるいは、専門では決まった手法と考えられる、あらゆる他の適した手法などである。これらの技術は多数の配列の結合の配置を促進します、そしてどんな望ましい、そして適当な組み合わせでも使われるだろう。同じく、調整と選択エレメントのどんな組み合わせ、あるいは方向づけもこの発明のとおりに実行されるだろう。遺伝子調整エレメント、例えば、プロモーター（Guilley et al.，Higgins, T.J.V., Coruzzi et al., Tingey et al., Ryan et al., Rocha-Sosa et al., Wenzler et al., Bird et al.）、エンハンサー（Brederode, et al.）、RNAスプライシングサイト、リボソーム結合サイト、糖化（glycosylation）サイト、タンパク質スプライシングサイト、副細胞質シグナルリング配列（Smeekens et al., van den Broeck et al., Schreier et al., Tague et al.）、分泌性シグナル配列s（Von Heijne, G., Sijmons, et al.）、または他、変換植物にてＣＩＶＰＳあるいはインテインの生体内で濃縮そして活動のいずれをもコントロールすることにおいて、有利であるだろう。トランスジェニック植物にてのインテイン組換タンパク質の産出と処理を促進するのにこれらのエレメントの使用は望ましいだろう。組換タンパク質の発現は構造性のまたは、誘発される方法のいずれかにおいて行われるだろう。これらのいずれかの手法を達成するためには、この特許で記述されるか、専門では知られている手法のいずれも、または、後に生まれる手法にて実行されるだろう。外性の刺激の援助によりタンパク質発現の誘発はおこなわれるだろう。これらの例は農薬、光、温度の変化、そして／あるいは音にさらすことである。その他の外性の刺激も用いられるだろう。加えて、上記に示したとおり、組換植物もまた、一つ以上の選択可能なマーカー遺伝子または、リポーター遺伝子を発現するであろう。

いったん、ＣＩＶＰＳあるいはインテインＤＮＡ配列が構成されていると、望ましい調整と選択ＤＮＡ配列が組合され、うまくクローンや選択され、そして望ましい植物種と植物全体の発生の変換が必要とされる。望ましい植物種と植物全体の発生の変換の手法は専門では知られている技術によって成される（Ｄｒａｐｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，ｅｔａｌ．）。変換技術は次にあげるものが含まれている。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝子トランスファー、根様アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏ）遺伝子、媒介遺伝子トランスファー、植物プロトプラストに向かう遺伝子トランスファー、Ｔｉプラスミド媒介遺伝子トランスファー、（プラスミドの補助がある／なしで）、生物学的な、または、分子ボンバード植物の転換（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍｅｔａｌ．）、ミクロ投射の媒介転換、そして組織エレクトロポレーション（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．）。遺伝子のトランスファーは植物の全体、植物の外植体（あるいは根茎の外植体）、あらゆる植物部位（あるいは植物の葉部分、種または種部分）、植物プロトプラストまたはアポプラストあるいは単数または、複数の植物細胞である。それぞれの異なった手法はすでにこの専門によって詳しく記述されている。正式な変換植物の選択の手法は専門では知られている。選択の手法はＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質を含んだ変換ＤＮＡにて、選択可能なマーカーを含むことにより促進されるだろう。（それらは、レジスタンス遺伝子、染色合成物の産出物をコーディングした遺伝子、蛍光合成物の産出物をコーディングした遺伝子、または他の適した手法）。さらに、変換植物からのＤＮＡは実在の望ましいＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質コーディング配列を立証するために、分離され、配置されるであろう。その他の技術は選択過程のための確認に適している。それらはポリメラーゼ反応連鎖、制限消化分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔａｎａｌｙｓｉｓ）そしてサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎａｎａｌｙｓｉｓ）である。望ましいトランスジェニック植物の認定のためにあらゆる選択の手法も用いられるだろう。いったん、植物がＣＩＶＰＳあるいはインテインと望ましい調整や選択配列をともない変換されると、植物の全体が、専門では知られている手法によって再生される（Ｈｏｒｓｃｈｅｔａｌ．）。植物の再生に用いられる手法は制限されるものではなく、あらゆる効果的な手法が用いられるであろう。結果として生じるトランスジェニック植物は、概略的に図２で記述されるようにＣＩＶＰＳあるいはインテインを生産する。時に、トランスジェニック植物が選択された、ＣＩＶＰＳあるいはインテインの発現のためにモニターされる。ＣＩＶＰＳあるいはインテインを発現するトランスジェニック植物の産出物として必要ではないが、次の点において慎重に確証されている。それは、望ましいＣＩＶＰＳあるいはインテインを発現する、望ましいトランスジェニック植物の獲得、そして発現は望ましい制御エレメントの使用により、適度に制御されることである。ＣＩＶＰＳあるいはインテインの発現のモニタリングは概略的に図３で記述されるように、インテイン組換タンパク質の全体または、インテイン組換タンパク質の構成物のいずれかのために、切断または、非切断の状態においてのＣＩＶＰＳあるいはインテインの精製が必要である。それらエレメントの組み合わせの構成は図３に表されている。インテイン組換タンパク質の発現したタンパク質はトランスジェニック植物からの植物の抽出物、またはタンパク質破片の精製を行うウェスタン分析（ｗｅｓｔｅｒｎａｎａｌｙｓｉｓ）、２次元ゲル電気泳動（２−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌ電気泳動）、または分光法（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によりモニターされる。さらに、精製されたタンパク質または、トランスジェニック植物のいずれかはインテイン切断の刺激にさらされる。露出の後に、ＣＩＶＰＳまたはインテインの切断の結果として現れた、ＣＩＶＰＳあるいはインテインと結果として生じるタンパク質の両方は、最適なタンパク質とインテイン組換タンパク質と結果として生じる切断タンパク質の間の活動における相違を立証するためにウェスタン分析と他の検査の両方よって分析される。活動の検査は望ましいタンパク質の活動をモニターすると同じく活動を特定し、競われる干渉に強いように構成されなければいけない。制御は原生の活動と、インテイン組換活動とインテイン切断に次ぐ活動の両方を比べるために基準として使われなければいけない。ＣＩＶＰＳあるいはインテインを発現するトランスジェニック植物の手法と処置は次にあげるとおりである。燃料産出のための基質としての植物の使用（これに限定されないが、つぎのとおりである：可燃性のバイオマス、エタノール、メタノール、プロパノール、プロパン、メタン、またはオクタン製品）。日用化学製品のため基質としての植物の使用（これに限定されないが、つぎのとおりである：乳酸、エタノール、グルコースまたは、他のヘキソース、ペントース、プロパンジオール、エチン、エタン、エチレン、石炭酸の構成物、アミノ酸、紙パルプ、農薬、殺虫薬、他のアルコール、エテール、エステール）。食品そして／あるいは食品添加物のための基質としての植物の使（これに限定されないが、つぎのとおりである：アミノ酸、砂糖、ビタミン、ファイバー、または家畜の飼）、ワクチンである。治療効果のあるタンパク質の生産のための植物の利用。紙製品と廃棄物再生のための基質としての植物の使用。インテイン組換の発現するトランスジェニック植物における、あらゆるバッチやセミバッチ、または処置の継続は上記に記述された目的のひとつとして特許の申請をされる。これらの処置はこれに限定されないが、次にあげるものを含む。インテイン組換タンパク質を発現するトランスジェニック植物における処置は採収、インテイン切断の刺激の実行、ゼロに等しいかそれ以上の比率の基質にトランスジェニック植物におけるほかの基質の混合、または、上記に詳しく述べた成果物のひとつに化学的、酵素的、または生物的のいずれかでの転化。

下記に示された例は、発明の処置が、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換セルラーゼ酵素を発現するトランスジェニック植物と、それらによって生じる植物の製造と同様に述べられている。これらのセルラーゼ酵素の植物はＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換遺伝子を制御する調整エレメントにより命令されたものとして発現される。セルラーゼ活動は融合されたインテインによる原生セルラーゼ酵素の妨害により体内で実質上減らされる。これは、セルラーゼ活動により抑制をまったくか、少しする事で植物の成長を促す。植物は採収され、そして、インテイン切断の刺激に用いられる、それらは、光のある波長への露出、硫黄または、化学的変化をするｐＨの混合、塩の混合、その他の化学物質の混合、または温度変化の適用。この場合、ＣＩＶＰＳまたは、インテインは、切断され、セルラーゼ活動が回復される、そしてそれらはセルロースそして／あるいはリグニンの切断の触媒作用をおこす。この点において、切断されたタンパク質植物の塊は望ましい製品に植物基質を転化する助けをするため、次にあげる部分に混合される。ゼロに等しいかそれ以上の比率で他の植物基質、化学基質、自治体の廃棄物、副産物による製造品、酵素、そして／あるいは原核または、真核細胞など。（例）燃料、日用化学製品、食品または動物の飼料、食品添加物、紙パルプ、または、ワクチン抗原など。現発明の利用は、製造過程、機械的処置に制限をきたさない。この発明のその他の応用として、ワクチン、ホルモン、または治療効果のあるタンパク質の生産があり、その場合インテイン組換タンパク質はタンパク質そして／あるいはタンパク質抗原、保護する可能性のあるタンパク質配列そして、トランスジェニック植物によって発現されるであろうＣＩＶＰＳまたはインテインの組み合わせを構成するであろう。例としてバナナがあげられる。例えば、人間や動物による植物製品の摂取により生産過程はおこなわれる。植物は口での咀嚼と、胃部の体内での刺激にさらされる、それらは、ＣＩＶＰＳあるいはインテインによる切断の引き金または、誘発となる。人間の胃部の減少されたｐＨの刺激は、必要であれば、抗原または、治療効果のあるタンパク質からのＣＩＶＰＳあるいはインテインの切断を誘発し、最適なライゲートをもたらすであろう。治療効果のあるタンパク質または、抗原はｐＨが中和され、そしてタンパク質が生産される十二指腸または小腸の中に入り血流に吸収される準備ができる。

例証的なインフォメーションのための背景を次に述べる。

下記の例１のプロトコルに述べられる、多くの異なったバリエーションは、専門では知られている、現発明を実施するにおいて適している。一般的に、ＣＩＶＰＳあるいはインテインをコード化するＤＮＡ配列は以下にあげるものの中に構成され、まとめられる。それらは、最適なベクトル、植物物質、サスペンションの中で育てられた単細胞であろうが、プロトプラスト、植物部分または部位、植物全体または他のフォーム、ベクトルをもちいて変換されることをここでは詳しく述べ、そして完全植物、種、または他の植物フォームは再生されることをここでは述べている。発明の手法の一つの実施例として、例1に示したように、トランスジェニック木を生産するのに使われるバリエーションもありえる。（例）インテイン組換セルラーゼで発現するポプラ種。トランスジェニック植物種に向ける望ましいタンパク質の選択は応用による。原生タンパク質に関して、新な合性タンパク質、または進化したタンパク質、（例）遺伝子シャフリング、エラープローンPCR、または他のいかなる類似した手法によって使われるだろう。セルラーゼは植物の化学物質であるセルロースの分解における切断反応の触媒作用をおこす。他の植物は発現するセルラーゼを構成されている一方で、酵素は典型的に一時的に表現されるか、細胞の部分で隔離されるか、同じく、植物組織を分化と成長において分裂させない。参照、例、Ziegler et al. (2000); Dai et al. (a), (2000); Dai et al. (b) (2000); Montalvo-Rodriguez et al. (2000)。したがって、セルラーゼ活動がローカリゼーションまたは過渡の発現により制御されないところにおいては、植物全体が再生するのはたいへん難しい、あるいはほとんど使用可能ではない。インテイン組換セルラーゼをもちいて、低活性インテイン組換セルラーゼは植物を通して、そして高い滴定量において生産される間、植物の全体は再生される。参照、Aspergen et al.,，Molecular Breeding 1:91-99(1995)。酵素は、組換セルラーゼに適切な増進した活動のセルラーゼを生じるインテインを自己スプライシングの能力によって実質的に活性される。あらゆる原生タンパク質はこの発明の必要条件を満たし、そしてタンパク質の選択は植物の使用目的によることは注目すべきことである。この場合、ポプラ種はそれら自身のセルロースを非重合化するために誘発されるであろう、そしてそれらはバイオマスからのエタノール産出や、他の化学物質の発酵のための基質として有益であろう。

ＣＩＶＰＳあるいはインテインの構成

種々の組換ＤＮＡ技術はコード化するＤＮＡを持つベクトルの構成物と、組換タンパク質の組み合わせにより利用される。最も容易で、そして最も直接の使用することは、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)をコード化するインテイン組換タンパク質核酸配列と最適な相補性の端をもちいて集めることである、それは望ましいベクトルの中にライゲートを促進させる。PCR手法はここに説明されている。他の手法もこの同じ目的を達成するために使われる、そして、いくつかは特定の制限、望ましいタンパク質のライゲートそして配列をコード化するインテインに依存するが、PCRステップも含まれる。反応を行うためのPCR Kitsは容易に利用可能である(Epicentre,
Madison, WI)。プライマーにおいて唯一の必要事項は感覚節の5’endを拡大させるために一致させなければならない、そして他は反感覚節の5’end一致させなければいけない。関連配列の独自性は有益である。

ゲルからの清掃と清浄化

ゲルからのＤＮＡの清浄化はエレクトロルーション（electroelution）、フェノール抽出、アガラーゼ（agarase）消化、ガラスビーズ抽出、あるいは多くの商業的に利用可能なキットを使って行われるだろう。商業的に利用可能なQIAquickゲル抽出キット（Qiagen、Valencia、ＣＡ、）そして、関連した手法は１つの例である。

意図された使用によるインテインの選択

このステップで重要なスプライシングを誘発する過程のCIVPCまたはインテインの特性は図的な目的のためにトランスジェニック植物の最適化を促進する、そして標的タンパク質をコード化する核酸配列の中でインテインを配置する。あらゆるコーディング配列タンパク質の自己スプライシングのため、例えば、インテインなどがこの発明で使用されるだろう。次のウェブサイトであるいくつかの周知のインテインの編集が紹介されている
（http://blocks.fhcrc.org/~pietro/inteins/）。他のインテインは発見されるため残存し、そして新しいインテインは配列analysisと組換ＤＮＡの手法、そして周知の知られている突然変異を通して作られるだろう。例１のこのインテインは意図的なトランスジェニックポプラ種のために有利である。それはスプライシングにおいて、優勢的にライゲートされ、原生タンパク質（＞７５％）をもたらす、そして温度に敏感であるためインテインスプライシングは３０℃以下の温度において抑制される、また５０℃までは実在しない、この温度においては２時間以内に非切断タンパク質は半滅する。

インテイン組換タンパク質の構造

適したインテインスプライシングを確証するためには、原生標的タンパク質の例１におけるセリン、システイン、またはトレオニン残基の次のフレームに挿入される。これはインテインのヒスチジン−アスパラギンのカルボキシル基の酸側上で以下にあげるものを残す。原生標的タンパク質のセリン、システイン、またはトレオニン、アミノ酸の位置の末端536と537にて保存された残基、など。インテインスプライシングのための望ましい刺激と仕組みにより、ほかの末端残基は利用される。必要である場合は、エクステイン−インテインの接合部分においてコンドンはこれらの必要条件を促進するために転換されるだろう。コンドン接合点転換の場合、ケアーが必要である、それによりインテイン組換タンパク質は必要どおりに切断し、結果として生じる成果物を適度な活動を行うようにすることができる。原生標的タンパク質のなかのインテイン位置は結果として生じるインテイン組換タンパク質の活動を実質上変える。ほとんどの環境において、中または近隣にての分子の活動側の実質上あらゆる妨害はこの基準をみたす。もしセリン残基が原生タンパク質コーディング配列の独自の制限側の近くにある場合、拡大されたインテイン配列と拡大された原生タンパク質配列の組み合わせは次の条件のもとで容易に行われる。逆に、インテインコーディング配列は、いくつかのポリメラーゼ連鎖反応を使うことによって原生タンパク質配列におけるあらゆる望ましい位置に取り入れられる。好ましいPCR手法をここで述べる。50オリゴヌクレオチドのプライマーの利用が望ましい。短いプライマーが使われるであろうが、同じ長さのプライマーを使う必要はないがそれも有益である。C-エクステインのプライマーのセンスは結果として起きるPCR拡大の中で、拡大された配列の融合を促進する接合点にて、C-エクステインとインテイン配列の両方に交雑するであろう。ポリメラーゼ連鎖反応は概説された標準的なプロトコルを使用して実行されるのが望ましい、しかし若干の最適化を持っているだろう。典型的な最適化のパラメーターは以下にあげるものがある。それはテンプレートの量と混合物に加えられたプライマーＤＮＡ（一般に、プライマーＤＮＡはテンプレートＤＮＡにたいして最超過した中に加えられる）、反応サイクルのための温度と時間、サイクルの数そして、MgCl₂s濃縮がある。配置の上の制約が観察される限り、プライマーの長さと構成の使用は効果的なインテイン組換タンパク質を生じるために変えられるだろう。すべての必要な試薬を含むキットが商業的に利用可能である。TaqＤＮＡポリメラーゼ，MgCl₂，25mM dNTP混合（equamolarを含んでいるdATP，dCTP，dGTPとdTTPの量）反応緩和物と水。

この時点でPCRの次のラウンドはエクステインとインテイン配列を融合するために始められる。この場合インテインの破片はC-エクステインセルラーゼ破片の等しいモル濃度の部分と混ぜられる。これらの破片の組み合わせはテンプレートとプライマー(重なり合っている部分)の両方を表す。反応緩和物の付加、25mM dNTPs，MgCl₂、そしてTaqＤＮＡポリメラーゼはまだ必要とされ、温度サイクルの変化となる。この反応はむしろ感覚と反感覚プライマーに次いだ付加によって増大される。それぞれE.coliＤＮＡligase(New
England Biolabs, Beverly, MA)を伴って、しかしこの付加は必ずしも必要ではない、そして用いられる正確な反応条件に依存することは産出を増やすことにつながるであろう。
5’-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’ [SEQ ID NO: 1]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID NO: 2]

いったん完了されると、PCR成果物はすなわち再び以下のように進行する。アガロースゲル、そして最適なバンド、2665ヌクレオチドlong、ゲルからの精製と、上に記述された手法にそっての分析。少量の浄化反応反応成果物はすなわちUV分光光度計上２６０ナノメートルと２８０ナノメートルの波長においての吸光度の測定による計量の測定のために使用される。インテイン組換セルラーゼコーディング配列のPCR反応の集合を完結するには、融合されたC-エクステインとインテイン破片の構成物だけの等しいモル濃度の量と前もって浄化されたN−エクステイン破片を組み合わせて成し遂げられる。PCR反応はすなわち、反応緩和物、25mM dNTPs，MgCl₂，およびTaqＤＮＡポリメラーゼを加えた後の先の反応と同じ温度のサイクルでの使用が行われる。この反応はすなわち感覚と反感覚プライマーとE.coliＤＮＡligaseに次ぐ付加(New
England Biolabs, Beverly, MA)によって増大される、しかしこの付加は必ずしも必要ではない、そして用いられる正確な反応条件に依存することは産出を増やすことにつながるであろう。
5’- AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC-3’
[SEQ ID NO: 3]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID NO:
4]

ベクトルの構成

その他のエレメントは準備された発現カセットに含まれているであろう。（例）１細胞外の分泌シグナルリング配列、細胞内のローカリゼーションシグナルリング配列、そして他の誘発可能はプロモーターなど。ベクトルは今組換の種族内アグロバクテリウムで含まれているように、遺伝子はバクテリアの特殊伝達システムにたよるポプラ植物にトランスファーする。他の遺伝子トランスファーの手法も用いられ、そして適した転換手法の選択は植物物質の資源による。例えば、プロトプラストまたは個々の植物細胞は、ゲル電気泳動、塩化カルシウム、あるいは生物学的な粒子照射(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて、組換pTiBo542プラスミドによって直接転換される。逆に、植物カルス、植物部分、またはある場合では、適しているときにおいて植物の全体がスターティング物質として使用されるだろう。効率的な遺伝子トランスファーが起こるために、培養の時間と採収の細胞密度はなるべく最適化されるだろう。

利点と例１のトランスジェニックポプラの使用法

結果として生じるトランスジェニックポプラ種は高い滴定量においてインテイン組換セルラーゼが生産される間、成長し通過するかは不確定だろう。セルラーゼは結果として次にあげることによって活性化される。採収する植物、露出した表面増やすための機械的なチップ、またはグラインドをすること、そして上昇した温度（３０℃から５０℃が好ましい)そして／あるいは低いｐＨ（6.5 or below）においてバットやタンクの中で結果として生じる塊を培養する。上昇温度や低ｐＨに露出することは、もし必要であれば、結果として増大された活動において、インテインスプライシングや原生セルラーゼを誘発するであろう。これらの条件において、セルラーゼは経済的に基質を生産するようにセルロースの切断反応に触媒作用をおこすであろう。それは、結果としてエタノールまたはほかの化学物質に発酵されるであろう。加えて、この植物インテイン組換セルラーゼまたは再生原生セルラーゼ、ポストスプライシングのいずれかの資源として使われるだろう。いずれかの場合、タンパク質は前に述べた従来の技術で周知の、沈殿、薄膜ろ過、クロマトグラフィー、親和力のクロマトグラフィー、抽出などの手法を使って植物から浄化されるのが好ましい。

インテイン組換タンパク質を生産するトランスジェニック植物の使用は前に報告されたトランスジェニック植物対する二つの利点を持っている。インテイン組換タンパク質は原生タンパク質に比べると、実質上少ない活動を持っているため、植物種のより高い滴定量とローカリゼーションのどこにおいて発現される。セルラーゼ酵素を発現するトランスジェニック植物の先の報告は、分泌の除去は細胞のシトソルのセルラーゼ酵を含むため合図をすると述べている。インテイン組換タンパク質の使用をもちいることは必要ではないそして、必要までは触媒作用をおこす反応はないが、それは組換タンパク質が基質をもちいて近接に位置されることとしての重要な改良である。さらに、これらの植物はより高度の環境の安全性を持っている。生理学の条件の下で、実質上少ない活動の遺伝子トランスファーエンコードタンパク質のため、種族間の水平方向遺伝子トランスファーはあらゆる選択された利点をもたらしにくい。この理由により、トランスジェニック植物が自然界のなかでより優れている原生植物であるとも、または遺伝子トランスファーが変換された植物に有利な選択的な利点をもたらすとも、そのどちらでもない。

例２はこの発明の広範囲の応用を述べる。例２は例１の手法のインテイン組換リグニンペルオキシダーゼを発現するダグラスーモミ種族を発生するためのバリエーションを表す。特定の標的タンパク質の選択はトランスジェニック植物種の応用目的による。この例から、木の化学物資が選ばれたリグニンペルオキシダーゼ遺伝子はリグニンの分解の触媒作用を促進する。インテイン組換リグニンペルオキシダーゼを使うことにより、非活性化されたインテイン組換リグニンペルオキシダーゼが必要であれば、高滴定量において植物をとおして生産される間、植物の全体が再生されるだろう。酵素はインテイン組換リグニンペルオキシダーゼより増大された活動にて原生リグニンペルオキシダーゼを生産するためのインテインの自己スプライシング能力により結果として活性化されるだろう。これは現在可能でないリグニンペルオキシダーゼ活動の制御を改良するであろう。トランスジェニック植物種は次にあげる点において重要である、パルプの産出、動物の飼料、そのほかの処理のための基質、機械的パルプの改良、パルプのバイオ漂白、減少されたパルプの廃棄物処理の改良、そして、独自の特性を持ったバイオポリマーの製造。

遺伝子とインテイン組換タンパク質の構成

上に示されるように、あらゆる原生タンパク質は標的タンパク質として適している、そして、その選択は植物の利用目的による。例として、リグニン自身を組換るダグラスーモミ種族が異なったパルプ処理のための基質として有益である。核酸をコード化するタンパク質の重要性はPhanerochaete chrysosporium(GenBank Accession # M37701)とは別のものである。一つのプライマーは拡大されるためセンスストレインの5’endと、そして遺伝子の末端の他の完全になったＤＮＡのストランドの5’endに一致するのが好ましい。相対的配列の特性をもつのは有益である。

ゲルからのPCR破片

ゲルからの核酸の清浄化はエレクトロルーション（ectroelution）、フェノール抽出、アガラーゼ消化、ガラスビーズ抽出、あるいは多くの商業的に利用可能なキットを使って達成される。Qiagen(Valencia，CA)のQIAquick Gel Extraction Kitなキットの使用が好ましい。

インテイン選択

インテインの選択は植物の利用目的とインテイン組換タンパク質の両方に多く依存する。多くの異なったインテインが存在して、そして使われるだろう。この例によって、インテインは例１において示したとおり同じ特性をもって、トランスジェニックダグラスーモミ種族の利用目的のために大変有益である。従って、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列であるＰｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐからＰｓｐｐｏｌインテイン（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＰＳＵ００７０７）の変異体が使われるのが望ましい。このインテインの利点はスプライシングにおいて、優先的にライゲートされたもの、原生タンパク質を生産し、そして温度に敏感であるためインテインスプライシングは３０℃以下の温度において抑制される、また５０℃までは実在しない、この温度においては２時間以内に非切断タンパク質は半滅する。このインテインは体内におけるｐＨの変化によりスプライシングを誘発する、それゆえに、トランスジェニック植物の処理による発生結果のため柔軟性の増加を加える。

ベクトル転換

アグロバクテリウム（アグロバクテリウム（A.tumefaciens））組換種族の中でベクトルを含有をもちいて、遺伝子はバクテリアの伝染システムの特性によって、ダグラスーモミにトランスファーする。他の遺伝子の手法も用いられる、そして植物物質の資源と、手法の容易さによる転換手法に適した選択も応用される。転換パラメーターのいくつかの改良と最適化も必要とされる。

組換木の使用

例２の木はリグニンペルオキシダーゼまたは、インテイン組換リグニンペルオキシダーゼの清浄化のための資源物質として使用されるであろう。その他、多くの応用にて木材パルプの生産のため基質として使用されるであろう。例として、紙製品、動物の飼料、合成物質など。例１と例２の両方は木の使用を述べ、他の植物も発明の目的により役立てられるであろう。多くのエリアのこれらのタイプの木は成長が悪く、そして草、つる、海草、あるいは他の植物種は成長が良く、使用に適する。加えて、多くの果物、野菜はインテイン組換タンパク質テクノロジーから利益を得る。例えば熟成、農薬レジスタンスを誘発する、そしてまた他の応用にも多く適用されるであろう。したがって、宿主植物の選択は制限されない。組換タンパク質のための資源としての植物の利用はこの発明のＣＩＶＰＳあるいはインテイン技術の利用によって促進される。植物は融合タンパク質のあらゆる数を発現するのに作られる、その融合ポイントはインテインを構成する。それはエクステインの再組み合わせを促進しないが、代わりに、望ましいタンパク質が結合タンパク質に親和力クロマトグラフィーを介して清浄化するために結合する。この場合、望ましいタンパク質は生体内でフル活動するかもしれない、またはしないかもしれない。一度植物で発現されると、融合タンパク質は融合タンパク質の結合部分がコラムに繋がった部分の親和力コラムに抽出される。コラムはインテインスプライシングを誘発されるよう扱われる。そして、望ましいタンパク質は洗い落とされ、再生する。その他の発明バリエーションは医療関連にある。それらは、融合タンパク質を構成する治療効果のあるタンパク質または、タンパク質グループを保護するインテイン働きによってワクチンを融合すること、植物内にあるときにその本来の活性を示さないようにするためにインテインを付加することなどがある。これらの治療効果のあるタンパク質は植物において発現され、精製され、そして人間や動物に食べられたりする。（例）動物ワクチン接種、ホルモンの治療の場合。インテインスプライシングは次にあげるものにより起こる。それは、加工タンク内において生体外で、または患者や動物の体内において、いずれにおいてでもよいが、胃部内でのｐＨの変化によるもの、第三化学物質によるチオールグラディエントの誘発。スプライシングは保護タンパク質グループ取り除き、原生治療効果のあるタンパク質またはワクチンを産出し、それらは消化管に吸収される。

例１と２のいずれにより、インテイン組換タンパク質を発現するトランスジェニック木は例３に示すよう、産業的なスケールプロセスで効果的に使われるだろう。パルプにすること自体、ダグラス−モミ種族のために例２で使われるものに類似している改良によって強められるだろう。

木の処理

リグノセルローシック基質の滅成のための、典型的な前処理の処置は濃縮酸の前処理(通常、硫黄酸)、希釈酸の前処理、アンモニア破裂の前処理、そして熱湯の前処理を含む。他の前処理の処置も用いられるだろう、そしてインテイン組換タンパク質を発現するトランスジェニック木の構成は必要であれば、前処理の処置を十分利用するために最適化されるべきである。インテインスプライシングは容器の中で周知の手法を介して起きるだろう。それらは、これらに制限するものではないが、ｐＨの変化、温度の変化、光りの露出、音波の刺激、またはあらゆる外因性の化学添加。

使用法と処置のバリエーション

好ましい例３の処置のバリエーションは前処理、スプライシング、消化、発酵のステップの組み合わせが含まれる。この好ましい処理の合同はあらゆるステップの間でも起きるが、ひとつの単位の操作にて全てのステップが同時に現れるのが好ましい。この好ましい組み合わせは資本支出と価値低落における減少、基質の価格の減少において、そして処置にエネルギーと化学をつぎ込むことをとおして、コスト削減をもたらすだろう。加えて、同じ成果物を作る競合の化学処置で発生する排出物、危険廃棄物の減少をとおして環境的利益をもたらす。例３において、成果物の選択は望ましいバイオコンフバージョンのための発酵で使われる有機物質による。あらゆる有機物は効果的に望ましい成果物を生産するであろう基質として減成されたセルロースを十分に利用する。この理由から成果物のもたらすスペクトルは大変大きい。この発明のインテイン組換タンパク質を持つ植物によって、促進された特性の好ましい処理をもちいた基質の応用は次のような利益をもたらすだろう。これらのみに制限はされないが、燃料製品、化学製品、織物製品、バイオポリマー製品、食品、そして糖化。例３はおもに減成されたトランスジェニック植物の発酵に重点をおいているが、インテイン組換植物伝統的な化学プロセスのために基質として使用されるであろう。例えば、例２の植物は優先的に紙パルプにて使われるであろう。この過程において、木の漂白に使用する有害化学物質を減少する成果をなすであろう。これは、化学物資の投入、危険物資の発生、汚染、そして処理において発生するであろうものにかかるコストを減少する結果をもたらす。他の利用として、綿の洗浄のためのペクチナーゼ、またはほかの織物製品の処理のためのセルラーゼがある。これらの例は、インテイン組換タンパク質の植物基質の使用をとおして利益が得られるにもかかわらず、環境に通常危険な化学的処置が一般にもちいられることによる伝統的な化学処理を行うことで成果物の結果がえられる。

動物飼料は一般に飼料の栄養化をあげるために使われる、あらゆる種の酵素とともに補われる。またそれと同様、動物の肥料の集積によって発生する悪臭による環境汚染を減少する。栄養価値は植物ポリマー上の推定の酵素活動をとおして上げられる。それらは、動物の飼料の消化を助け、そして有益な飼料物質のいっそうの利用による。活動酵素の現れによって植物自身から得られる、無機のホスファターゼのような鉱物の量を制限することによって環境的負担は軽減されるだろう。非組換タンパク質に反して、インテイン組換タンパク質の利用に関する利益は、マルチタンパク質の発現における結果の高いレベルにおいて、植物再生をもちいて干渉しないで動物の腹部の中で、スプライシング上の、望ましい酵素活動をつたえる。外因的にそして食物に加えられ動物に生産されているものと違い、これは食物のなかに酵素を入れることにより飼料のコスト減少となる。加えて、植物の生体内でわずかに非活性のタンパク質のためにコード化する遺伝子の使用の付加的な利益は技術のプラットホームをもたらす。それは、環境的なリスクを及ぼさない、原生植物種に水平方向に遺伝子トランスファーすることに関連している。この環境に影響をあたえる利益は実際的または予測的である、すべてのインテイン組換タンパク質植物成果物を持つ。例４では動物飼料としての使用のための、菜種での、インテイン組換フィターセの構成を例証する。

使用とバリエーション

フィターセは生得的に動物飼料に含まれたミオイノシトールホスファターゼからの無機燐の進化において援助をする酵素である。経済的な影響として、動物飼料の生産のために必要とされるホスファターゼの補足の量における減少と地方の水の汚染に影響する動物肥料に含まれるホスファターゼの減少をもたらす。下記の例４で動物飼料のための菜種におけるインテイン組換の発現されたフィターセの構成と使用方を例証するが、他の多くの貴重な原生タンパク質も同様使用されるであろう。例えば、フィターセはつぎにあげる多くの物質の付加として使用されたり、あるいは代用となるだろう。それらは、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ヘミ−セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、成長ホルモンまたは、免疫性抗体原などである。それぞれのほかのタンパク質は動物飼料の補足としての利用において経済的な価値が見込まれる。

例５が発明の望ましい実施例の１つを例証する。トランスジェニックコーンはエタノール処理のため基質として構成され、利用される。この場合、例１のインテイン組換遺伝子配列は実例による説明のためのみに使用される。好ましい実施例にて、しかしながら、いくつかのインテイン組換タンパク質は発酵処理において利用されるため、望ましい植物の滅成処理特性を最適化するのに同時に発現されるだろう。標的酵素は通常知られているセルラーゼ(E.C. 3.2.1.4)、exocellobiohydrolases (E.C. 3.2.1.91)、グルコシダー（glucosidases）(E.C. 3.2.1.21)、の酵素から選択されるだろう。そして酵素分類標題3.2.1.x、または必要とあらば、あらゆる他の分類グループから選ばれた他の
酵素とともに最適に発現されるマルチプルインテイン組換タンパク質の同時発現に加えて、望ましい事項実施例の構成は再生産と安定した遺伝子の遺伝の能力がある肥沃な植物である。

変換のインフォメーション

ミクロ投射は植物セルに入力するミクロ投射を速めるために使われる。

今一般にこの発明を記述して、同じことがもっと良くある特定の個々の事例に対する参考文献によって理解されるであろう、それは例証の目的のためのみでここに含まれて、そして、それがとりわけ特定されない場合は、発明あるいはその実施例は制限されることはない。

例１：インテイン組換えセルラーゼを発現するトランスジェニックポプラの産出

この例のため、セルラーゼ酵素は使用される。ベクトルはインテイン組換タンパク質のためＤＮＡコーディング配列を含み最初に組み立てられる。このようなベクトルを構成するため、インテイン組換タンパク質ＤＮＡ配列は最初に準備され、そして、望ましいベクトルにまとめられる。この植物のための望ましいタンパク質はセルラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＹ０３９７４４）であり、それはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＮＢＬ４２０から分離されている。このタンパク質に一致する遺伝子はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＢＬ４２０から分離されたゲノミックＤＮＡテンプレートからのＰＣＲを使い拡大される。ＰＣＲ反応はテンプレートＤＮＡ、補足的にテンプレートＤＮＡの３’ｅｎｄｓに拡大されるための二つのプライマー、ＴａｑＤＮＡポリマーゼ（ｐｏｌｙｅｒｍａｓｅ）、反応緩和物（５００ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ９．０，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、そして薄く覆われた２５０μＬＰＣＲ管の中のＭｇＣｌ_２を混ぜることによりおこなわれる。一度混合されると、それぞれの反応管はサーモサイクラーに位置される、そしてこのサーモサイクラーは３つの部分が形成される３５サイクルのためセットされる。この部分は３０秒には９４℃、６０秒には６０℃、１２０秒には７２℃である。拡大に次いで、結果として生じるＰＣＲの成果物は以下にあげるものによって分析される。１％のアガローゼゲル上の電気泳動、分子量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をともない、１ＸＴＡＥ（ｏｒＴＢＥ）流動する緩和物の援助をともない、そしてエンチジウム臭化物（０．５μｇ／ｍＬ）による濾過。適した長さバンドが得られるように注意が必要とされる、その長さはおおよそ３２００ｂａｓｅｐａｉｒｓ（ｂｐ）である。このバンドはメスによってゲルから切り離され、そして（ゲル物質から離されて）商業的に利用可能なジェル清浄化キット（Ｑｉａｇｅｎ）清浄化される。いったんこの破片がゲルから清浄化されたら、このバンドは制限消化または、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ．ａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９８）によって述べられた配列を使って分析される。遺伝拡大の後、遺伝子はインテイン配列部分の挿入によって組み換えられる。この場合、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列であるＰｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐからの変体Ｐｓｐｐｏｌインテイン（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＰＳＵ００７０７）が使用される。この変体は、文献で述べられているが、チロシンがメチオニンに転換されるチロシン５３４残基においての突然変異が含まれる。参照、Ｘｕ，Ｍ，Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ，（１９９６），Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｐｌｉｃｉｎｇａｎｄｉｔｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙｍｕｔａｔｉｏｎ，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１５：５１４６−５１５３。このインテインはｐＨの変化によってインヴィトロで切断されるだろう。このインテインコーディング配列はＰｙｒｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐゲノミックＤＮＡを使うＰＣＲによりテンプレートとして拡大された。ＰＣＲ反応は標準プロトコルの使用により行なわれる。（例、３０サイクルは３０秒のための９４℃で、６０秒には５０℃、１２０秒には７２℃を含む）、そしてプライマーが続く。

5’-ATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’ [SEQ ID
NO: 5]

5’-AGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’ [SEQ ID
NO: 6]

いったん拡大が完了すると、PCR成果物はX TAEの１％アガローゼゲル上のelecrophoresedまたはTBE緩和物にトランスファーされる。結果として生じるバンドは原生セルラーゼコーディング配列のために上に記述されるように、清浄化と分析をされる。この点において、図１に示された二つのPCR破片は一つのコード化するセルラーゼタンパク質と、一つのコード化するインテインポリペプチド配列が結合される。従って、インテインフレームにおいての原生タンパク質の中に挿入される、それは、原生タンパク質のセリン残基は原生インテインと原生タンパク質のC−エクステインとの間の接合点において末端C−エクステインアミノ酸となる。このインテイン組換タンパク質セグメントは、セルラーゼ遺伝子の最初に拡大したC−エクステインコーディング配列によって使用するPCRを生産する。C−エクステインと、ヒスチジンとC−エクステインのすぐに近接したアスパラジンコンドンを含んだインテインエンドの両方に覆われたプライマーはC−エクステイン配列を拡大するのに使用される。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCCGGAAACGGCGGTGTCTACCTCG-3’ [SEQ ID NO:
7]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID
NO: 8]

結果として生じる配列は604ヌクレオチドロングである。インテインは末端セリンコンドンを含んだインテインエンドとセルラーゼ遺伝子のN−エクステインエンドの両方を含むセンスプライマー使用により拡大され、インテインとC−エクステインの特定のヌクレオチドを含んだアンチセンスプライマーを伴う。プライマーに続くこのPCR反応は配列1661ヌクレオチドロングを得るために使用される。
5’-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 9]
5’-CGAGGTAGACACCGCCGTTTCCGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 10]

N−エクステインPCRと、センスN−エクステインストランドの特定のヌクレオチドを含む一つのプライマー、そしてN−エクステインと隣接したインテイン配列の特定のクレオチドを含む、をその他のプライマーを使用して拡大される。セルラーゼ遺伝子のN−エクステイン部分は配列1541ヌクレオチドロングの中で結果として生じるプライマーに続くのをともない拡大される。
5’-AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC-3’
[SEQ ID NO: 11]
5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTAGCATCGCTCGTTCCCCATTCTGTG-3’
[SEQ ID NO: 12]

いったんこれらの反応が完了すると、それぞれのPCRの破片は残りのプライマーを取り除くために清浄される。C−エクステイン、インテイン、そしてN−エクステインPCRの破片はふたつのポリメラーゼ連鎖反応が行なわれることによって結合される。インテインとセルラーゼエクステイン部分のひとつ、C−エクステインまたはN−エクステインの一方は上で発生された二つのPCRの破片と、以前に記述されたPCRの実行の混交した等しいモル濃度の量による単数の反応にて拡大された。この反応は余分な外性のプライマーと最初のインテイン−エクステイン融合の結果を必要としない。この反応混合は清浄され、そしてきれいにされた融合成果物の等しいモル濃度部分は残ったエクステインと混ぜられる、そしてPCRは付加のプライマーを加えずにもう一度行なわれる。最後の二つのPCR反応のいずれかにおける外因性プライマーは必要とされない、そしてインテイン−エクステインの最後の接合部において、アニールが起きる。アニールされた部分は結果として生じるTaqポリメラーゼによって伸ばされる。この反応の配列は、望ましい正確な位置において挿入されたインテインを伴ったインテイン組換タンパク質のコーディング配列結果となる。最後の反応の成果物は再び清浄され、そしてPCRを使い、最後の一度プライマー特定を持ってセルラーゼエクステイン末端に向け、クローニングベクトルの中にライゲートするのを促進するための特定のエンドと共に拡大さる。いったんこの反応が完了すると、PCR成果物はアグローゼゲルにより動かされ、そして、最適なバンドとしての3806ヌクレオチドロングはゲルから清浄化されそして上記に述べられた手法によって分析される。結果として生じるインテイン組換タンパク質コーディング配列（核酸部分）は以下にあげるものを含む。リボソーム結合面、N−エクステインの始まるコンドン出発点、適した方向にてフレームに挿入されたインテインを持ったインテイン組換セルラーゼの完全な配列、そしてC−エクステインコーディングの最後における配列コンドンの終点。Ausubel,
et. al., Current Protocols in Molecular Biology (1998)に述べられている手法をつかってインテイン組換セルラーゼコーディング配列はpTiBo542にクローンされ、T
ＤＮＡの中のtmsとtmr遺伝子が再配置される。参照、Parsons TJ, Sinkar, VP, Stettler, RF, Nester, EW，Gordon，MP，“Transformation
of Poplar by Agrobacterium tumefaciens,” Biotechnology 4:533-536, 1986. Here
the includes a “MAC” プロモーター、マノピンシンセターゼターミネーター、そしてカナマイシンレジスタンスマーカーは発現カセットである。このベクトルは周知のあらゆる専門技術を用いアグロバクテリウム（A.tumefaciens）A281に変換される。種々の転換手法もまた上記のAusubel，et. al.(1998)により述べられている。

Ｈ１１植物種の望ましいｏｐｕｌａｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａｘｄｅｌｔｏｉｄｅｓを組換アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を持って変換することは種々の葉ディスク手法が用いられる。組換アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は３０℃のインキュベーター−シェカーにて次において採収される。選ばれたミディアｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５０％ＭＧミディアム（１０ｇ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌ，２．３２ｇ／Ｌｓｏｄｉｕｍｇｌｕｔａｍａｔｅ，０．５ｇ／ＬＫＨ₂ＰＯ₄，０．２ｇ／ＬＮａＣｌ，０．２ｇ／ＬＭｇＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ，０．００２ｇ／Ｌｂｉｏｔｉｎ，ｐＨ７．０）、５０％ｌｕｒｉａｂｒｏｔｈ（２０ｇ／Ｌｔｒｙｐｔｏｎｅ，１０ｇ／Ｌｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，ａｎｄ１０ｇ／ＬＮａＣｌ）、そして最適な抗生物質。植物の転換のためには、長さにおいておよそ７ミリと直径２〜３ミリの小さい緑木の茎のセクションは、２０％の漂白剤、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，そして３０ｍｇ／ＬＢｅｎｏｍｙｌの溶液で消毒さる。滅菌された水で洗った後は、茎のセクションは無菌でおおよそ５ｘ１０⁸細胞ｐｅｒｍＬの細胞濃縮においてのアグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の培養にトランスファーされる。そしてセクションは１６時間の培養が行われる。組換アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）培養に露出された後、植物茎はトランスファーされたゼアチンリボシドと水平の位置にあるカナミシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）をもった固体のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄにトランスファーされる。参照ＭｕｒａｓｈｉｇｅＴ，ＳｋｏｏｇＦ， “Ａｒｅｖｉｓｅｄｍｅｄｉｕｍｆｏｒｒａｐｉｄｇｒｏｗｔｈａｎｄｂｉｏａｓｓａｙｓｗｉｔｈｔｏｂａｃｃｏｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓ，” Ｐｈｙｓｉｏｌ．ｐｌａｎｔ，１５：４７３−４９７，１９６２．いったん根の成長が始められると、若枝も成長するだろう。再生植物は二週間から三週間ごとに新しい植物にトランスファーされる、そして通常の光のサイクルは植物の成長の間、そしてインキュベーターの中で湿度が上昇された状態で維持される。いったん根が形成すると、外植体は均質の媒体の不足したゼアチンリボシドにトランスファーされる。しかし、その他の二週間から三週間の間カナミシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含み、この期間の後で植物は土に移される四日から五日ほど前に、土の入った箱の中に移され、温室または制御された土のプロットで十分成長される。最初の植物は、インテイン組換セルラーゼＤＮＡ配列がゲノムとタンパク質の発現が活性であるようにトランスファーされるのを確実にするため、いくつかの手法によって検査される。遺伝学的な検査は、上記のＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．（１９９８）に述べられているように、プローブとしてインテイン組換セルラーゼコーディング配列を使ったトランスジェニック植物からゲノミックＤＮＡを孤立させた状態のサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎａｎａｌｙｓｉｓ）により行われる。上記に述べたように、ＰＣＲはテンプレートとして、インテイン組換セルラーゼコーディング配列とトランスジェニック植物ゲノミックＤＮＡにプローブの特質を使っておこなわれる。エチジウム臭化物が付着したゲル上で、最適なサイズにされたバンドの様相はインテイン組換セルラーゼコーディングＦの実在を確証する。植物ゲノミックＤＮＡの直接配列することが行われるだろう。タンパク質の産出は特定のインテイン組換セルラーゼと原生セルラーゼの両方に免疫抗体が使われるウェスタン分析（ｗｅｓｔｅｒｎａｎａｌｙｓｉｓ）によってモニターされるだろう。加えて、セルラーゼ活動のための酵素分析は専門技術では周知である、そしてスプライシングしないインテイン組換セルラーゼとスプライシングされたセルラーゼの活動量を計るために使用されるだろう。

例２：トランスジェニックダグラス−モミの産出

発現するインテイン−組換えリグニンペルオキシダーゼ

この例はインテイン組換を含むリグニンペルオキシダーゼコーディング配列を構成するベクトルため、例１にて使用されたよう、同じ手法が使われる。主な相違はアグロバクテリウム（A.tumefaciens）プラスミドを用いるにおいて、原生タンパク質配列が組換られること、そして新しいインテイン組換リグニンペルオキシダーゼコーディング配列を拡大するため選ばれたプライマーである。

リグニンペルオキシダーゼ遺伝子(GenBank Accession # M37701)はテンプレートとしてのP. chrysosporiumからのゲノミックＤＮＡを使用するPCRによって拡大された。プライマーは
5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAG-3’ [SEQ ID
NO: 13]
5’-TTAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTG-3’ [SEQ ID NO: 14]
例１にて述べられているようにPCR反応に使われる。拡大についで、結果として生じるPCR成果物は、例１に記述したように分子量標準を伴って、アガローゼゲル上のゲル電気泳動を使って分析される。エンチジウム臭をともなったゲル臭化物の付着した後、1567
base pair (bp) バンドはメスによってゲルから切り離される、上記に記述したようにそしてゲルから精浄化さる。ゲルからの破片を清浄した後、破片はAusubel，et
al., 1998に述べられているように、直接の確認のために制限消化、または配列をすることによって分析される。

遺伝子が拡大された後、それは遺伝子配列の中にインテイン配列の挿入により組換される。この例により、同じインテインが例１にて使われる。このインテインコーディング配列は例１に記述されたように、同じ方法で拡大される。結果として生じるインテインＤＮＡ配列はゲル前に記述されたように電気泳動により清浄化され、そして分析される。

二つのPCR破片は、一つがコード化するリグニンペルオキシダーゼで、そしてもう一つがコード化するインテインポリペプチド配列であり、これらは結合される。適切なインテインスプライシングを保証するため、インテインはリグニンペルオキシダーゼのセリン残基の次のフレームの中に挿入される。このセリンはカルボキシル基を持つ酸側の上にある、ゆえにこのインテインのヒスチジン−アスパラギンはインテインアミノ酸の位置の末端536そして537において残基に変換される。インテインは原生タンパク質の中に挿入されるので、原生タンパク質のセリン残基は原生タンパク質の原生インテインとC−エクステインの間の接合点において末端C−エクステインアミノ酸になる。インテインは原生タンパク質の中で配置される、よってそれの現われは結果として生じるインテイン組換タンパク質の活動を実質的に減少する。ほとんどの状況で、実質上分子の活動面の中あるいは近くのあらゆるセリン残基はこの基準を満たすだろう、しかしいくつかは最適化が必要であろう。

インテイン組換タンパク質配列は、プライマーの選択の違いはあるが例１に記述したのと同じようにPCRを使って産出される。リグニンペルオキシダーゼ遺伝子のC−エクステイン部分は、上記のPCR反応から洗浄された遺伝子成果物を使って拡大された、そして445ヌクレオチド配列の中でプライマーの発生結果につながる。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCTCGCCCGCGACTCCCGCACCGCT-3’
[SEQ ID NO: 15]
5’-TAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTGGAAGAGGAATATGTCAGCTGGGGGC-3’
[SEQ ID NO: 16]

リグニンペルオキシダーゼ遺伝子のN−エクステイン部分は次のプライマーを使ったPCRにより、同じテンプレートを使い拡大された。
5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAGCGATTTCCCTCGCACTCTCGCTCAC-3’
[SEQ ID NO: 17]
5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGTGTGGTCGGTCTGGATGCGGATCT-3’
[SEQ ID NO: 18]

結果として生じる配列は1196ヌクレオチドロングである。リグニンペルオキシダーゼ遺伝子に配置されるインテインコーディング配列は例１に記述されるようにPCRを使って拡大される。この反応にて、Pyrrococcus
sppゲノミックＤＮＡテンプレートとプライマーにつぐものが使われる：
5’-AGATCCGCATCCAGACCGACCACACAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 19]
5’-GCGGTGCGGGAGTCGCGGGCGAGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 20]

結果として生じる配列は1661ヌクレオチドロングである。いったんこれらの反応が完了すると、反応成果物はアガローゼゲル上で電気泳動され、ゲルから清浄化され、そして上述されるように分析される。エクステインとインテインの部分は例１に記述されたように結合する。この場合、インテイン破片C−エクステインリグニンペルオキシダーゼ破片の等モル濃度の量と混合される。これらの破片の組み合わせはPCR反応のためにテンプレートとプライマーが必要されたものを現す。PCRは例１のように、同じ反応条件を使って行われる。いったん完了すると、PCRは１％アガローゼゲル上で電気泳動される、そして最適なバンドの2106ヌクレオチドロングはゲルから清浄化される。清浄化されたバンドは、例１に記述されたように分析される。清浄化された反応成果物の少量はUV分光光度計上で260nmと280nm吸収度の測定によって計測される。

インテイン組換タンパク質ＤＮＡコーディング配列はもう一度PCR反応で完了される。等モル濃度量の融合されたC−エクステインとちょうど構成されたインテイン破片は前もって清浄化されたN−エクステイン破片と組み合わされる。PCR反応は前の反応と同じ条件を使っておこなわれる。PCRは１％アガローゼゲル上で電気泳動される、そして最適なバンドの3302ヌクレオチドロングはゲルから清浄化される。清浄化されたバンドは、例１に記述されたように分析される。最終のインテイン組換タンパク質コーディング配列は、フレームの中で、適した方向にむけて、リグニンペルオキシダーゼコーディング配列の中で完了される。

インテイン組換リグニンペルオキシダーゼコーディング配列は植物の発現カセットの中へクローンされる。この場合、pTiA6プラスミドはカナミシン（kanamycin）レジスタンスと不足したオクツパインシンセターゼ（octupine synthetase）遺伝子を伴って使われ、オクツパイン転写制御（octupine transcription control）配列を含む。インテイン組換リグニンペルオキシダーゼはオクツパイン転写制御（octupine transcription control）配列(プロモーターそして3’polyadenylation site)の制限においてpTiA6はライゲートされる。アグロバクテリウム（A.tumefaciens）K12X562は結果として生じるライゲートされたベクトルと、専門技術では周知のあらゆる適した手法（例、エレクトロポレーションまたはカルシウム塩化物の手法）を使って変換される。転換の手法はAusubel，et.
al. (1998)により記述されている。

ダグラスーモミは、組換アグロバクテリウム（A.tumefaciens）とnodal部分またはこれらの木の見本となった種を用いて変換される。若枝の繁殖と伸長はDCR基底のミディアムの皿上の培養のなかで前述した手法で行われる(Gupta PK，Durz“Shoot
multiplicaion from mature trees of Douglas-fir, and sugar pine,”Plant
cell Reports, 9:177-179, 1985)。組換アグロバクテリウム（A.tumefaciens）の培養は例１に記述された手法にしたがって成長される。植物の転換のためには、培養から再生されたおおよそ50mmの長さの若枝、または表面が１０％漂白と０．１％Tween 20の処置によって滅菌された種がある。いったん滅菌されると、種または、若枝は中性、蒸留とイオン除去した水で無菌状態にリンスされる。傷ついた若枝や種は、10⁸細胞per mLの細胞濃縮においての組換アグロバクテリウム（A.tumefaciens）培養に浸けられる。組換アグロバクテリウム（A.tumefaciens）培養に露光した１２時間後に、若枝と種は2.2％のスクロースと0.8％ Bacto(Difco)agarと一緒にDCR基底のミディアムで培養される。培養の条件は温室または成長器で２０℃においての８時間暗サイクルについで、２５℃において１６時間の光サイクルを含む。再生植物は新植物に毎２週間から３週間ごとに転化する。いったん、根が形成すると、外植体は、土に移される四日から五日ほど前に、土の入った箱の中に移され、温室または制御された土のプロットで十分成長される。最初の年の成長は３０℃以下に保たれた温室で行われる。

植物は例１の同手法をもちいて検査される、ただし、ウエスタン分析の場合の特定のリグニンペルオキシダーゼタンパク質または、インテイン組換リグニンペルオキシダーゼタンパク質を除く。

トランスジェニックの結果として生じるダグラスーモミ種族は、インテイン組換リグニンペルオキシダーゼ生産の間、高滴定量の中で不確定の成長をする。リグニンペルオキシダーゼは、この例で改良のため同じインテインを用いたために、例１に記述される同じ手法を使って後に活性化される。

例３：発酵基質の準備プロセス

インテイン組換タンパク質を発現する植物の使用

例１の場合、トランスジェニックポプラ種族は発酵を介して基質として使用される。この過程のため、トランスジェニック木はチェーンソーや斧のような適した道具にて伐採される。木はパルプ製造機を使って後パルプされる。そしてパルプはタンクに入れられる。あらゆる必要な前処理が行われた後、インテインスプライシングは４バリューに下げられたｐＨとタンクの温度が上昇することでインテインのスプライシングが誘発される。前処理で使われるものにより、インテインスプライシングは前処理と処置の操作にともない同時に起きることにより刺激されるだろう。いったんスプライスされると、原生酵素活動はパルプのセルロースの消化が始まる、それは単糖類の濃縮が増すことである。

スプライシングの誘発につぎ、それらの基質のセルロース滅成を促進するのに、単糖質脈間の成分は原生ポプラパルプまたは、他の基質をともなった、あらゆる割合で混合される。混合の割合は、トランスジェニックポプラのセルラーゼ活動による。その活動は基質上の原生セルラーゼの、植物にて発現されたインテイン組換セルラーゼの作用量、スプライシングの有効性、組み合わせの有効性、そして再構成の有効性そして、再構成された活動による。それらのパラメーターのそれぞれは、広い範囲にわたる可能性のある価値を持ち、そしてプロセス経済学を促進することを最適化できるだろう。

結果として生じるグルコースは０．２２（またはそれ以下)μmフィルターを通して、減成されたセルロースからフィルター滅菌、またはバッチにて、あるいは熱交換器をとおして持続モードで熱滅菌される。滅菌グルコースが発酵過程に与えられる、そこでは文献に記述されるように、エタノール製品のため基質として使われる。参照、H.K.Sreenath
and T. W. Jeffries, “Production of ethanol from wood hydrolysate by yeasts,”
Bioresource Technology, 72(3): 253-260, 2000； Lisbeth Olsson and Barbel HahＮ−Hagerdal,
“Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,” Enzyme
and Microbial Technology, 18(5):312-331, 1996； Kutluo O. Ulgen, et. al.,
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strain YPG-AB”, Process Biochemistry, 37(10):1157-1168, 2002； M. Mete Altintas,et
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manipulation of environmental factors,” Enzyme and Microbial Technology,
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from corn cobs by yeasts,” Bioresource Technology, 77(1):57-63, 2001.

発酵プロセスはバッチ、フェド−バッチ、あるいは継続するモードで行なわれる。

例４：インテイン組換タンパク質を発現する植物の動物飼料ための使用法

トランスジェニック菜種は例１と２において記述されているのと実質同じ手法を用いて次にしめす変異をともない構成される。ＣＩＶＰＳあるいはインテインの構成にて、同じインテインコーディング配列が使われるが、この場合Aspergillus ficuumによるフィターセの中で融合される。この例においては、選択されたインテイン組換タンパク質はタンパク質動物の胃部においてスプライシングを誘発する酸性による。選ばれたフィターセは低ｐＨにおける高いレベルの活動により選択された（van Ooijen et al.(2000)，United
States Patent Publication No. 6,022,846）。フィターセのC−エクステイン部分は前述されたのと同じ条件のもとで次のプライマーを使い拡大される。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCA-3’
[SEQ ID NO: 21]
5’-
CTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCACCGCCAGATCTGGCAAAGCTCAACC-3’ [SEQ ID NO: 22]

結果として生じる配列は627ヌクレオチドロングである。インテイン配列は前述と同条件下のプライマーを使用し拡大される。
5’-
AGTGACCTACCTCATGGACATGTGCAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 23]
5’-GCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 24

最後に、N−エクステインはPCR破片928ヌクレオチドロングにて、結果として生じるプライマーを使い拡大された。
5’-ATGGGTGTCTCTGCCGTTCTACTTCCTTTGTACCTCCTGTCCGGAGTATG-3’
[SEQ ID NO: 25]
5’- GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGCACATGTCCATGAGGTAGGTCACT-3’
[SEQ ID NO: 26]

結果として生じるＤＮＡ破片は洗浄されそして、分析される。そしてPCRの使用と、例１と２に述べた方法を合わせて組み合わされる。この過程はインテイン組換フィターセコーディング配列で結果として現れる。最後のインテイン組換フィターセ配列の合成は、例２に述べたように、拡大され、洗浄されそして分析される。インテイン組換フィターセＤＮＡコーディング配列は、例１と２に述べたように、同じ発現のカセットの中にクローンされ、そしてアグロバクテリウム（A.tumefaciens）に変換される。菜種茎の部分は５週間から６週間成長した植物の表面を室温にて２５分間２０％の漂白液を使って滅菌される。部分はMurashige-Skoogミディアムsupplemented with 1mg／L
of BAPにおいて２４時間の培養によって前処理される。２４時間の蒸散されると、茎部分はアグロバクテリウム（A.tumefaciens）を含むインテイン組換フィターセの新しく転換された濾過をともなって４８時間の間培養される。この培養ステップについで、実質に例１と２で記述された同じ処置についで、カナミシン（kanamycin）レジスタンスマーカーを使って植物を再生し、選択する。インテイン組換フィターセの混合の確認は例１と２で記述されたよう行われる。

結果として生じるトランスジェニック菜種はその地の法律にしたがって認められたエリアで成長される。菜種は成熟し動物飼料の補足として利用されるときに採収される。逆に、菜種は動物のために牧草地で栽培される。それは、インテインスプライシングは動物の胃部でフィターセ活動の活性化ができるため、自然発生的に起こることによる。

例５：インテイン組換で発現するトランスジェニックとうもろこしの産出

セルラーゼそしてエタノールの産出における利用法

この例は発明が実際に使われであろう一つの方法として例証される。ここに、トランスジェニックとうもろこしは構成され、そしてエタノール処理のための基質として、またはほかの発酵での基質として使われる。この例における例１のインテイン組換遺伝子配列は再び論証のために使われる。Zea mays friableの成長、胚genic type II callusの培養は幼胚から始められる。その幼胚は、おおよそ1.6mmから1.8mmの長さで、温室の成長からA188
(University of Minnesota, Crop Improvement Association) x B73 (Iowa State
University)植物である。採収後、破片は２５分間室内温度で５０％の漂白を使って表面を滅菌される。そして中性、蒸留とイオン除去した水で洗われる。新培養は無菌的に採収された破片から始められ、そして10μEm^-2s^-1光以下で、２４℃にて組換Ｎ６medium上で維持される。(Chu，et al.，(1975)，“Establishment
of an Efficient ミディアム for Anther Culture of Rice through Comparative
Experiments on Nitrogen Sources,” Sci. Sin., 18:659-668) at ｐH 5.8, with 2mg／L
glycine, 2.9g／L L-proline, 1mg／L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 100mg／L
casein hydrolysate, 2g／L sucrose, and solidified with 2g／L Gelgro (ICN
Biochemicals).

おおよそ２週間の培養後、栽培は適切な形態学のため手作業で評価される。これは胚子の特徴において一貫性が少ないため視覚的な観察が必要とされる。増殖を論証する適切な形態学は組換N6 ディアムにトランスファーされる。(上述される)。適切な形態学をともなって組織の結果物はミクロ投射ボンバードが用意されるまで、規則的に毎二週間から三週間ごとに二次培養される。望ましいインテイン組換遺伝子配列と発現ベクトルは例１に記述されるように構成される。この例において、好ましい発現ベクトルはまた次にあげる改変を持つ。ヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカーをともない専門技術で知られている手法を使い、カナミシン（kanamycin）レジスタンスマーカーの再配置を行う。（例えば、適したテンプレートからのヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカーのPCR、ベクトルのＤＮＡエンドヌクレアーゼ制限、ヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカーの精製とライゲートにより従う）Ausubel，et. al.，1998に記述される。いったん構成されると、ベクトルは１：１モルの割合でタングステン(平均直径
1.2μｍ、GTE Sylvania)または金、の素粒子に沈殿される。この過程の他のステップで、沈殿パラメーターはいくつかのマイナーな最適化を必要とする。沈殿は１．２５ｍｇのタングステン素粒子、そしての1.1M CaCl₂そして8.7mM spermidineをともなった２５μｇの溶液中のベクトルＤＮＡ
の５７５μＬの合計量の混合によって行われる。沈殿は０℃にて１０分間かき混ぜられる。いったんかき混ぜられると、１０分間500xgにおいて遠心分離機にかけられる。遠心分離後、上清はおおよそ５５０μＬ取り除かれ、残りの２５μＬの沈殿物は、Klein et al.(1987)に記述されているボンバードのためマクロ投射に１μＬ約数分配される(Biolistics,
Inc, Ithaca, NY)、ただし上記した変更は含まず。すべての操作は無菌的に氷上で行われる。

いったんバイオリスティク投射が準備されると、望ましい植物組織ボンバードの処置のために用意される。多くのカルスの塊は、各重さ５０ｍｇ（濡れた重量）、滅菌した６０×１５ｍｍペトリディッシュの中心の近くのＸパターンにて無菌として用意される。(Falcon 1007)いくつかのディッシュは各ボンバードの処置のために準備されるべきである。これらのディッシュはミクロ投射機の止められた皿の５ｃｍ下に各順番に調整される。ディッシュは端が取り除かれて装置の下の中心に置かれ、そして３×３ｍｍのメッシュスクリーンで皿の上を覆う。メッシュスクリーンは処置中、ディッシュの中の含まれたボンバードされた組織を助ける。組織ボンバードは、製造インストラクションによって記述されるとおりにミクロ投射機でおこなわれる。商業的ミクロ投射機はBio-Rad(Hercules,
CA)を通して利用可能である。ボンバードについで、カルスは新鮮な組換N6ミディアム皿そして上記した同じ条件で培養されるのにトランスファーされる。

結果として起きた再生のための変換細胞の選択は２週間の培養の後で始まる。カルスの皿は１０ｍｇ／Ｌヒグロミシン（hygromycin）Ｂで最終濃縮に調合された新鮮で、滅菌された組換 N6 ミディアム皿に無菌でトランスファーされたボンバードの処置を受ける(Calbiochem)。２週間の露出後、すべてのカルスは５０ｍｇ／Ｌヒグロミシン（hygromycin）Ｂで最終濃縮に調合された新鮮で、滅菌された組換Ｎ６ミディアム皿に無菌でトランスファーされる。このトランスファーはたくさんの皿が使用された結果、一つの皿に５つのみの３０ｍｇカルスの小片が含まれる皿でおこなわれる。５０ｍｇ／Ｌヒグロミシン（hygromycin）Ｂ皿の三週間についで、すべてのカルスは６０ｍｇ／L ヒグロミシン（hygromycin）Ｂで最終濃縮に調合された新鮮で、滅菌された組換Ｎ６ミディアム皿に無菌でトランスファーされる。培養の二週間後、カルスは増殖する塊のため検査される。選ばれた増殖する塊は組換Murashige-Skoog
midium supplemented with 0.5 mg／ L thiamine-HCl, 0.75 mg／ L 2,4-D, 50 g／ L
sucrose, 150 mg／ L asparagines, and 2.0 g／ L Gelgroにトランスファーされる。

このポイントにおいては、選ばれた植物の転換を確認するのは慎重である。インテイン組換セルラーゼの現れは例１と２に記述される手法を使い確証される。この場合において、インテイン組換セルラーゼコーディング配列と、ヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカーのいずれ、または両方は転換確認の対象として、専門技術では知られている手法により使われる。Ausubel，et
al., 1998に記述される。組換Murashige-Skoogミディアムでの二週間後、皿は２４℃において１０時間の暗についで、１４時間の光で組織された、光サイクル培養摂取にさらされる。小植物は100mLの組換Murashige-Skoogミディアムを含む、１Ｌ、大口のErlenmeyerフラスコに無菌でトランスファーされて形成する。結果として生じる植物は、土に植える前の一週間から二週間の間バーキュライトにトランスファーされ、成熟に育てられる。成熟植物は実質的に例
1に記述されたように、インテイン組換タンパク質配列の、そして優先的にインテイン組換セルラーゼの発現の安定転換を確認するために分析される。

結果として生じる成熟植物は標準の技術を使い異種交配される。これは変換植物間、または,単数変換植物と非変換植物間のいずれかでおこなわれる。繁殖の結果として生じる子孫（progeny）はヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカー同様、インテイン組換セルラーゼの包含を検査される。（記）このポイントで、選択においてヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカーの使用は、構成されたトランスジェニックコーン植物の使用と応用のためのもはや本質的なエレメントでない。インテイン組換セルラーゼ配列が含まれているかぎり、ヒグロミシン（hygromycin）レジスタンスマーカーの維持はトランスジェニックコーンの本質的な物質ではない。種は肥沃なトランスジェニック植物から収穫されて、そして植物拡大のために使われることができる。結果として生じるトランスジェニック植物は例３で記述されたそれらに類似しているプロセスで使用のために栽培されることができる。トランスジェニックコーン種族を発現する複数のインテイン組換タンパク質を使う過程は、コーン植物のでんぷんとそしてセルローシック部分の両方の利用、前処理の合同、糖化、と発酵ステップ、そしてエネルギーと原材料インプット経費を減少させる、経済的な利点があるだろう。エタノールの産出ためのこの過程の効果的な利用は、トランスジェニック植物におけるインテイン組換の包含によって可能となる。

ここに記述した例は、発表された特許の応用を例証するために用いられており、この特許の範囲を限定しない。専門家において既知であり、そしてこの特許の論証に含まれるその他のバリエーションも可能である。

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ここに全て記述された発明は、その基本部分と領域を越さない限り、多くの変更や改良が可能であり、それにより専門における通常の技術が明白にされるであろう。

図１はＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質コーディングＤＮＡ配列の構成法を例証する。これはＣＩＶＰＳあるいはインテインコーディング配列がタンパク質遺伝子の中の遺伝子の3’−端、5’−端または内部において、意図的活動のタンパク質のコーディング配列に融合されることにより構成されたＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質ＤＮＡコーディング配列が構成されることにより構成されるものである。図１にて示された、３つのＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質コーディング配列の発生結果のどんな組み合わせによる他の変化も可能である。図２はＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質あるいはそれらの成分の発生結果の一つの配置を例証する。この図は単数のＣＩＶＰＳまたはインテイン組換タンパク質の例を示すものである。複数の原生たんぱく質配列はおそらく、単数または複数のＣＩＶＰＳまたはインテインと同様に組み合わせられるだろう。図３はＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質あるいはそれらの成分が、適度なクリベージ（cleavage）の刺激を受けた時、生体内または生体外で切断が達成されることを例証する。ここに概要の例証とされるのは、単数のＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質のための切断過程の例である。他の変化はこの図にて示した、ＣＩＶＰＳあるいはインテイン組換タンパク質の組み合わせとして構成されるであろう。

Claims

標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）が外部から５０℃以上への温度の上昇の刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のｃｉｓ−スプライシングを誘発するものであり、
前記組換タンパク質を発現し、前記刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、および／または、リグニンを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記組換タンパク質の発現が誘導的なプロモーターにより制御される、請求項１の組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第１核酸セグメントと、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列をコード化し、第１核酸セグメントの内部に融合される第２核酸セグメントとを含む請求項１の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第１核酸セグメントと、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列をコード化し、第１核酸セグメントの内部に融合される第２核酸セグメントと、選択マーカーまたはリポーター遺伝子および／またはプロモーターとを含む請求項１の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記組換タンパク質は、構成的に発現される請求項１の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
少なくとも一つの組換タンパク質は、
少なくとも一つの特異的な組織又はその一部内に、および／または、
少なくとも一つの特異的な細胞内小器官内に、
植物のライフサイクルの所定の点で発現され、および／または、
発現又は細胞外に分泌されることを特徴とする請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）progeny）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
少なくとも一つの選択マーカーは、
ブロモキシニル、２，２−ジクロロプロピオン酸、Ｇ４１８、グリホセート（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、ピリジン（ｈａｌｏｘｙｆｏｐ）、ハイグロマイシン（ヒグロミシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ））、イミダゾリン、カネマイシン、メトトレキサート、ネオマイシン、ホスフィノスリシン、セトキシジム、トリクロチエン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｎｅ）、スルホニル尿素、ｓ−トリアジン（ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ）、および／または、トリアゾロピリミジンを含む化学物質に対して耐性を起こし、および／または、
前記プロモーターは、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列組換タンパク質ポリヌクレオチドの少なくとも一つに先行する請求項４の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
少なくとも一つの化学物質の通常毒性レベルに対して耐性又は抵抗性を有する請求項７の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
繁殖力を有し、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列組換タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一つを有する請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記植物は、繁殖力を有さないことを特徴とする請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
請求項１の近交遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
請求項１または２のハイブリッド遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列および標的タンパク質、またはタンパク質セグメントは、少なくとも一つのスプライス部位を形成することを特徴とする請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記スプライス部位の前記カルボキシル末端における前記アミノ酸残基は、ヒドロキシル基またはスフヒドリル基側鎖を持つアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１３の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの前記アミノ末端において、ヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）またはスフヒドリル基側鎖（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を欠くアミノ残基を含むことを特徴とする請求項１３の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の上流は、前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列またはタンパク質セグメントのアミノ末端において、ヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）またはスフヒドリル基側鎖（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を有するアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１３の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列のカルボキシル末端においてＨｉｓ−Ａｓｎと、前記標的タンパク質の隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）又はスフヒドリル基側鎖（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項１３の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列のカルボキシル末端において、Ａｓｐと、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）またはスフヒドリル基側鎖（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項１３の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記カルボキシル末端Ａｓｐにおける前記Ａｓｐは、カルボキシルまたはアミノ側鎖を欠いたアミノ酸により置換される請求項１８の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントのＳｅｒ，Ｔｈｒ、Ｃｙｓの直前に挿入される請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列アミノまたはカルボキシ末端は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＣｙｓを含む請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
前記標的タンパク質又は前記タンパク質セグメントは、微生物に由来するものであることを特徴とする請求項１または２の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）。
標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）が外部から５０℃以上への温度の上昇の刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のｃｉｓ−スプライシングを誘発するものであり、
前記組換タンパク質を発現し、前記刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、および／または、リグニンを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を生成するための方法であって、
前記標的タンパク質又は前記タンパク質セグメントを含み、前記配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、組換タンパク質を少なくとも一つコード化する発現構造を提供する工程と、
前記発現構造によって、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）へ形質転換する工程と、
少なくとも一つの組換タンパク質配列をコード化する前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）から、遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）、を再生する工程と、を備える方法。
前記組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）が、
組換タンパク質の発現が誘導的なプロモーターにより制御されるものである、請求項２３の方法。
前記形質転換は、安定的な形質転換を含む請求項２３または２４の方法。
前記再生工程は、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を増殖する工程と、
組換植物と非遺伝的組換植物、子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)と非遺伝的組換植物、組換植物と子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)、子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)と子孫(ｐｒｏｇｅｎｙ)、またはプロトプラストとプロトプラストとを交雑（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）する工程と、または、
２つの遺伝的組換植物、２つの子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または２つのプロトプラストを戻し交雑（ｂａｃｋ-ｃｒｏｓｓｉｎｇ）する工程と、の少なくとも一つによって実施されることを特徴とする請求項２３または２４の方法。
前記発現構造は、プロモーター、選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、遺伝性マーカー、ポリアデニル化配列、リプレッサー、エンハンサー、局在配列、または、シグナリング配列、の少なくとも一つを含む請求項２３または２４の方法。
前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は、ウイルス性の形質転換、ＤＮＡコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム遺伝子形質転換（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション、化学遺伝子形質転換、の少なくとも一つによる前記発現構造を用いて形質転換されることを特徴とする請求項２３または２４の方法。
前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は、選択可能なマーカーまたは抵抗性マーカーの少なくとも一つを用いて選択される請求項２３または２４の方法。
前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）は、
形質転換された胚形成組織の一つと、
植物プロトプラストと、
未成熟胚から分離した細胞と、または、
形質転換種子と、から再生されることを特徴とする請求項２３または２４の方法。
組換タンパク質を発現する種子を生成する方法であって、
請求項２３または２４の方法により前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を取得する工程と、
前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、または、発生物（ｄｅｓｃｅｎｄｅｎｔ）を培養または栽培する工程と、
配列番号２７のＤＮＡの第１８３９〜３４４９塩基にコードされるインテイン配列組換タンパク質を発現する種子をそこから取得する工程と、を備える方法。