JP4554932B2 - Civpsまたはインテイン組換タンパク質により発現したトランスジェニック植物と、その関連の手法 - Google Patents
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Description
cerevisiae(Kane et. al., Science 250:651; Hirata et al., J. Bio. Chem. 265:6726
(1990)), Mycobacterium tuberculosis (Davis et al., J. Bact. 173:5653
(1991), Davis et al., Cell 71:1 (1992)), Thermococcus litまたはalis (Perler,
et al., PNAS 89:5577 (1992))
前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が外部から50℃以上への温度の上昇の刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のcis−スプライシングを誘発するものであり、
前記組換タンパク質を発現し、前記刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、および/または、リグニンを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を提供することにより、エネルギーや化学供給原料として使われるであろう組換え植物を提供する。
absorbed formulation)などである。しかし、この構成物質は動物、または動物飼料に適用するために適したあらゆる組織系、または主題の形にて定型化されるであろう。
連鎖反応(PCR)をコード化するインテイン組換タンパク質核酸配列と最適な相補性の端をもちいて集めることである、それは望ましいベクトルの中にライゲートを促進させる。PCR手法はここに説明されている。他の手法もこの同じ目的を達成するために使われる、そして、いくつかは特定の制限、望ましいタンパク質のライゲートそして配列をコード化するインテインに依存するが、PCRステップも含まれる。反応を行うためのPCR Kitsは容易に利用可能である(Epicentre,
Madison, WI)。プライマーにおいて唯一の必要事項は感覚節の5’endを拡大させるために一致させなければならない、そして他は反感覚節の5’end一致させなければいけない。関連配列の独自性は有益である。
(http://blocks.fhcrc.org/~pietro/inteins/)。他のインテインは発見されるため残存し、そして新しいインテインは配列analysisと組換DNAの手法、そして周知の知られている突然変異を通して作られるだろう。例1のこのインテインは意図的なトランスジェニックポプラ種のために有利である。それはスプライシングにおいて、優勢的にライゲートされ、原生タンパク質(>75%)をもたらす、そして温度に敏感であるためインテインスプライシングは30℃以下の温度において抑制される、また50℃までは実在しない、この温度においては2時間以内に非切断タンパク質は半滅する。
England Biolabs, Beverly, MA)を伴って、しかしこの付加は必ずしも必要ではない、そして用いられる正確な反応条件に依存することは産出を増やすことにつながるであろう。
5’-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’ [SEQ ID NO: 1]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID NO: 2]
England Biolabs, Beverly, MA)によって増大される、しかしこの付加は必ずしも必要ではない、そして用いられる正確な反応条件に依存することは産出を増やすことにつながるであろう。
5’- AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC-3’
[SEQ ID NO: 3]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID NO:
4]
酵素とともに最適に発現されるマルチプルインテイン組換タンパク質の同時発現に加えて、望ましい事項実施例の構成は再生産と安定した遺伝子の遺伝の能力がある肥沃な植物である。
NO: 5]
NO: 6]
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCCGGAAACGGCGGTGTCTACCTCG-3’ [SEQ ID NO:
7]
5’-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTTGTGCGTGA-3’ [SEQ ID
NO: 8]
5’-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 9]
5’-CGAGGTAGACACCGCCGTTTCCGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 10]
5’-AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAGATTTTC-3’
[SEQ ID NO: 11]
5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTAGCATCGCTCGTTCCCCATTCTGTG-3’
[SEQ ID NO: 12]
et. al., Current Protocols in Molecular Biology (1998)に述べられている手法をつかってインテイン組換セルラーゼコーディング配列はpTiBo542にクローンされ、T
DNAの中のtmsとtmr遺伝子が再配置される。参照、Parsons TJ, Sinkar, VP, Stettler, RF, Nester, EW,Gordon,MP,“Transformation
of Poplar by Agrobacterium tumefaciens,” Biotechnology 4:533-536, 1986. Here
the includes a “MAC” プロモーター、マノピン シンセターゼ ターミネーター、そしてカナマイシン レジスタンス マーカーは発現カセットである。このベクトルは周知のあらゆる専門技術を用いアグロバクテリウム(A.tumefaciens)A281に変換される。種々の転換手法もまた上記のAusubel,et. al.(1998)により述べられている。
5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAG-3’ [SEQ ID
NO: 13]
5’-TTAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTG-3’ [SEQ ID NO: 14]
例1にて述べられているようにPCR反応に使われる。拡大についで、結果として生じるPCR成果物は、例1に記述したように分子量標準を伴って、アガローゼゲル上のゲル電気泳動を使って分析される。エンチジウム臭をともなったゲル臭化物の付着した後、1567
base pair (bp) バンドはメスによってゲルから切り離される、上記に記述したようにそしてゲルから精浄化さる。ゲルからの破片を清浄した後、破片はAusubel,et
al., 1998に述べられているように、直接の確認のために制限消化、または配列をすることによって分析される。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCTCGCCCGCGACTCCCGCACCGCT-3’
[SEQ ID NO: 15]
5’-TAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTGGAAGAGGAATATGTCAGCTGGGGGC-3’
[SEQ ID NO: 16]
5’-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAGCGATTTCCCTCGCACTCTCGCTCAC-3’
[SEQ ID NO: 17]
5’-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGTGTGGTCGGTCTGGATGCGGATCT-3’
[SEQ ID NO: 18]
sppゲノミックDNAテンプレートとプライマーにつぐものが使われる:
5’-AGATCCGCATCCAGACCGACCACACAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 19]
5’-GCGGTGCGGGAGTCGCGGGCGAGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 20]
al. (1998)により記述されている。
multiplicaion from mature trees of Douglas-fir, and sugar pine,”Plant
cell Reports, 9:177-179, 1985)。組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)の培養は例1に記述された手法にしたがって成長される。植物の転換のためには、培養から再生されたおおよそ50mmの長さの若枝、または表面が10%漂白と0.1%Tween 20の処置によって滅菌された種がある。いったん滅菌されると、種または、若枝は中性、蒸留とイオン除去した水で無菌状態にリンスされる。傷ついた若枝や種は、108細胞per mLの細胞濃縮においての組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)培養に浸けられる。組換アグロバクテリウム(A.tumefaciens)培養に露光した12時間後に、若枝と種は2.2%のスクロースと0.8% Bacto(Difco)agarと一緒にDCR基底のミディアムで培養される。培養の条件は温室または成長器で20℃においての8時間暗サイクルについで、25℃において16時間の光サイクルを含む。再生植物は新植物に毎2週間から3週間ごとに転化する。いったん、根が形成すると、外植体は、土に移される四日から五日ほど前に、土の入った箱の中に移され、温室または制御された土のプロットで十分成長される。最初の年の成長は30℃以下に保たれた温室で行われる。
and T. W. Jeffries, “Production of ethanol from wood hydrolysate by yeasts,”
Bioresource Technology, 72(3): 253-260, 2000; Lisbeth Olsson and Barbel HahN−Hagerdal,
“Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,” Enzyme
and Microbial Technology, 18(5):312-331, 1996; Kutluo O. Ulgen, et. al.,
“Bioconversion of starch into ethanol by a recombinant Saccharomyces cerevisiae
strain YPG-AB”, Process Biochemistry, 37(10):1157-1168, 2002; M. Mete Altintas,et
al, “Improvement of ethanol production from starch by recombinant yeast through
manipulation of environmental factors,” Enzyme and Microbial Technology,
31(5):640-647, 2002; Farooq Latif, et al., “Production of ethanol and xylitol
from corn cobs by yeasts,” Bioresource Technology, 77(1):57-63, 2001.
States Patent Publication No. 6,022,846)。フィターセのC−エクステイン部分は前述されたのと同じ条件のもとで次のプライマーを使い拡大される。
5’-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCA-3’
[SEQ ID NO: 21]
5’-
CTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCACCGCCAGATCTGGCAAAGCTCAACC-3’ [SEQ ID NO: 22]
5’-
AGTGACCTACCTCATGGACATGTGCAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3’
[SEQ ID NO: 23]
5’-GCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3’
[SEQ ID NO: 24
5’-ATGGGTGTCTCTGCCGTTCTACTTCCTTTGTACCTCCTGTCCGGAGTATG-3’
[SEQ ID NO: 25]
5’- GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGCACATGTCCATGAGGTAGGTCACT-3’
[SEQ ID NO: 26]
of BAPにおいて24時間の培養によって前処理される。24時間の蒸散されると、茎部分はアグロバクテリウム(A.tumefaciens)を含むインテイン組換フィターセの新しく転換された濾過をともなって48時間の間培養される。この培養ステップについで、実質に例1と2で記述された同じ処置についで、カナミシン(kanamycin)レジスタンスマーカーを使って植物を再生し、選択する。インテイン組換フィターセの混合の確認は例1と2で記述されたよう行われる。
(University of Minnesota, Crop Improvement Association) x B73 (Iowa State
University)植物である。採収後、破片は25分間室内温度で50%の漂白を使って表面を滅菌される。そして中性、蒸留とイオン除去した水で洗われる。新培養は無菌的に採収された破片から始められ、そして10μEm-2s-1光以下で、24℃にて組換N6medium上で維持される。(Chu,et al.,(1975),“Establishment
of an Efficient ミディアム for Anther Culture of Rice through Comparative
Experiments on Nitrogen Sources,” Sci. Sin., 18:659-668) at pH 5.8, with 2mg/L
glycine, 2.9g/L L-proline, 1mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 100mg/L
casein hydrolysate, 2g/L sucrose, and solidified with 2g/L Gelgro (ICN
Biochemicals).
1.2μm、GTE Sylvania)または金、の素粒子に沈殿される。この過程の他のステップで、沈殿パラメーターはいくつかのマイナーな最適化を必要とする。沈殿は1.25mgのタングステン素粒子、そしての1.1M CaCl2そして8.7mM spermidineをともなった25μgの溶液中のベクトルDNA
の575μLの合計量の混合によって行われる。沈殿は0℃にて10分間かき混ぜられる。いったんかき混ぜられると、10分間500xgにおいて遠心分離機にかけられる。遠心分離後、上清はおおよそ550μL取り除かれ、残りの25μLの沈殿物は、Klein et al.(1987)に記述されているボンバードのためマクロ投射に1μL約数分配される(Biolistics,
Inc, Ithaca, NY)、ただし上記した変更は含まず。すべての操作は無菌的に氷上で行われる。
CA)を通して利用可能である。ボンバードについで、カルスは新鮮な組換N6ミディアム皿そして上記した同じ条件で培養されるのにトランスファーされる。
midium supplemented with 0.5 mg/ L thiamine-HCl, 0.75 mg/ L 2,4-D, 50 g/ L
sucrose, 150 mg/ L asparagines, and 2.0 g/ L Gelgroにトランスファーされる。
al., 1998に記述される。組換Murashige-Skoogミディアムでの二週間後、皿は24℃において10時間の暗についで、14時間の光で組織された、光サイクル培養摂取にさらされる。小植物は100mLの組換Murashige-Skoogミディアムを含む、1L、大口のErlenmeyerフラスコに無菌でトランスファーされて形成する。結果として生じる植物は、土に植える前の一週間から二週間の間バーキュライトにトランスファーされ、成熟に育てられる。成熟植物は実質的に例
1に記述されたように、インテイン組換タンパク質配列の、そして優先的にインテイン組換セルラーゼの発現の安定転換を確認するために分析される。
Biobased Industrial Products: Priorities for Research and Commercialization, National Academy Press, Washington D
C (1999).
al., Biotechnol. Prog. 14:116-125 (1998).
(1998).
Biotechnol. Prog. 16:541-547 (2000).
(1999).
(1999).
1:91-99 (1995).
Biotechnol. Prog. 15:804-816 (1999).
(1998).
22:1125-1127 (1994).
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and Gene Expression: A Laboratory Manual,” Blackwell Scientific Publications, Boston (1998).
Plants,” Springer, New York
(1995).
35:191(1984).
(1989).
(1988).
(1980).
(1990).
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6:277-285 (2000).
Bioeng. 2:151-159 (2000).
6,022,846.
Claims (31)
- 標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が外部から50℃以上への温度の上昇の刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のcis−スプライシングを誘発するものであり、
前記組換タンパク質を発現し、前記刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、および/または、リグニンを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 前記組換タンパク質の発現が誘導的なプロモーターにより制御される、請求項1の組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第1核酸セグメントと、配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列をコード化し、第1核酸セグメントの内部に融合される第2核酸セグメントとを含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 各発現構造は、動作可能なように相互に結合される標的タンパク質をコード化する第1核酸セグメントと、配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列をコード化し、第1核酸セグメントの内部に融合される第2核酸セグメントと、選択マーカーまたはリポーター遺伝子および/またはプロモーターとを含む請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記組換タンパク質は、構成的に発現される請求項1の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 少なくとも一つの組換タンパク質は、
少なくとも一つの特異的な組織又はその一部内に、および/または、
少なくとも一つの特異的な細胞内小器官内に、
植物のライフサイクルの所定の点で発現され、および/または、
発現又は細胞外に分泌されることを特徴とする請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)progeny)、または、発生物(descendent)。 - 少なくとも一つの選択マーカーは、
ブロモキシニル、2,2−ジクロロプロピオン酸、G418、グリホセート(Glyphosate)、ピリジン(haloxyfop)、ハイグロマイシン(ヒグロミシン(hygromycin))、イミダゾリン、カネマイシン、メトトレキサート、ネオマイシン、ホスフィノスリシン、セトキシジム、トリクロチエン(trichothecne)、スルホニル尿素、s−トリアジン(s−triazine)、および/または、トリアゾロピリミジンを含む化学物質に対して耐性を起こし、および/または、
前記プロモーターは、配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列組換タンパク質ポリヌクレオチドの少なくとも一つに先行する請求項4の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。 - 少なくとも一つの化学物質の通常毒性レベルに対して耐性又は抵抗性を有する請求項7の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 繁殖力を有し、配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列組換タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列の少なくとも一つを有する請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記植物は、繁殖力を有さないことを特徴とする請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 請求項1の近交遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 請求項1または2のハイブリッド遺伝子組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列および標的タンパク質、またはタンパク質セグメントは、少なくとも一つのスプライス部位を形成することを特徴とする請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記スプライス部位の前記カルボキシル末端における前記アミノ酸残基は、ヒドロキシル基またはスフヒドリル基側鎖を持つアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項13の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの前記アミノ末端において、ヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を欠くアミノ残基を含むことを特徴とする請求項13の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の上流は、前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列またはタンパク質セグメントのアミノ末端において、ヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項13の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列のカルボキシル末端においてHis−Asnと、前記標的タンパク質の隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基(hydroxyl)又はスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項13の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列の前記スプライス部位の下流は、前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列のカルボキシル末端において、Aspと、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントの隣接領域のアミノ末端においてヒドロキシル基(hydroxyl)またはスフヒドリル基側鎖(sulfhydryl)を有するアミノ酸残基と、を含むことを特徴とする請求項13の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記カルボキシル末端Aspにおける前記Aspは、カルボキシルまたはアミノ側鎖を欠いたアミノ酸により置換される請求項18の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列は、前記標的タンパク質またはタンパク質セグメントのSer,Thr、Cysの直前に挿入される請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列アミノまたはカルボキシ末端は、Ser、Thr、またはCysを含む請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 前記標的タンパク質又は前記タンパク質セグメントは、微生物に由来するものであることを特徴とする請求項1または2の植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)。
- 標的タンパク質又はタンパク質セグメントを含み、配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、少なくとも一つの組換タンパク質をコード化する発現構造を備え、
前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列は、組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が外部から50℃以上への温度の上昇の刺激を受けた際に、前記組換タンパク質のcis−スプライシングを誘発するものであり、
前記組換タンパク質を発現し、前記刺激が前記組換タンパク質のスプライシングを引き起こすものであり、
前記スプライシングされたタンパク質は、セルロース、ヘミセルロース、および/または、リグニンを含む所定の植物構成要素の中身を変化させるものである、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を生成するための方法であって、
前記標的タンパク質又は前記タンパク質セグメントを含み、前記配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列が前記タンパク質又は前記タンパク質セグメントの内部に融合される、組換タンパク質を少なくとも一つコード化する発現構造を提供する工程と、
前記発現構造によって、植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)へ形質転換する工程と、
少なくとも一つの組換タンパク質配列をコード化する前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)から、遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)、を再生する工程と、を備える方法。 - 前記組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)が、
組換タンパク質の発現が誘導的なプロモーターにより制御されるものである、請求項23の方法。 - 前記形質転換は、安定的な形質転換を含む請求項23または24の方法。
- 前記再生工程は、
組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を増殖する工程と、
組換植物と非遺伝的組換植物、子孫(progeny)と非遺伝的組換植物、組換植物と子孫(progeny)、子孫(progeny)と子孫(progeny)、またはプロトプラストとプロトプラストとを交雑(crossing)する工程と、または、
2つの遺伝的組換植物、2つの子孫(progeny)、または2つのプロトプラストを戻し交雑(back-crossing)する工程と、の少なくとも一つによって実施されることを特徴とする請求項23または24の方法。 - 前記発現構造は、プロモーター、選択可能なマーカー、抵抗性マーカー、遺伝性マーカー、ポリアデニル化配列、リプレッサー、エンハンサー、局在配列、または、シグナリング配列、の少なくとも一つを含む請求項23または24の方法。
- 前記植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、ウイルス性の形質転換、DNAコートマイクロプロジェクションによる遺伝子銃(bombardment)、リポソーム遺伝子形質転換(liposomal gene transformation)、細菌性遺伝子転写、エレクトロポレーション、化学遺伝子形質転換、の少なくとも一つによる前記発現構造を用いて形質転換されることを特徴とする請求項23または24の方法。
- 前記形質転換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、選択可能なマーカーまたは抵抗性マーカーの少なくとも一つを用いて選択される請求項23または24の方法。
- 前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)は、
形質転換された胚形成組織の一つと、
植物プロトプラストと、
未成熟胚から分離した細胞と、または、
形質転換種子と、から再生されることを特徴とする請求項23または24の方法。 - 組換タンパク質を発現する種子を生成する方法であって、
請求項23または24の方法により前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を取得する工程と、
前記遺伝的組換植物、植物の部分、小植物、組織、細胞、種子、実生、プロトプラスト、子孫(progeny)、または、発生物(descendent)を培養または栽培する工程と、
配列番号27のDNAの第1839〜3449塩基にコードされるインテイン配列組換タンパク質を発現する種子をそこから取得する工程と、を備える方法。
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