JP2020501530A - 近接増強反応性による分割タンパク質の鋳型アセンブリ方法 - Google Patents

近接増強反応性による分割タンパク質の鋳型アセンブリ方法 Download PDF

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Abstract

標的核酸分子と目的タンパク質フラグメントに付加された相補的核酸分子との間の特異的な核酸ハイブリダイゼーションによって強制される、誘導近接法を介して、より大きなタンパク質フラグメントの補助的折り畳みの方法に用いる化合物、組成物及びキットが提供される。【選択図】なし

Description

本開示は、一部には、目的タンパク質フラグメントに付加された標的核酸分子と相補的核酸分子との間の特異的な核酸ハイブリダイゼーションによって強制される誘導近接法を介して、大型タンパク質のタンパク質フラグメントを補助的に折り畳むための方法において用いられる化合物、組成物、及びキットに関する。
創薬の目標は、ウイルス感染細胞、新生物細胞、自己免疫応答を生起する細胞、及び他の調節不全または機能不全細胞などの、病原性細胞への強力な生物学的療法の介入を提供することにある。病原性細胞を駆除し得る強力な生物学的療法の介入の例としては、毒素、アポトーシス促進剤、及び免疫細胞を病原性細胞の排除に再指向させる免疫療法アプローチが挙げられる。しかしながら、隣接する正常細胞に対し毒物が曝される危険性が高いことから、すなわち患者の全身的な健康上の理由から、こうした創薬は極めて困難となっている。
正常細胞への毒性を軽減しつつ病原性細胞への強力な介入を可能にすることを目的とした方法が、台頭してきた。この方法は、病原性細胞に特異的な分子マーカーに対し治療薬を指し向けることによって治療薬を標的化するというものである。標的治療薬は、限られた症例において臨床結果が並外れたものであることが明らかにされてきたが、標的治療用のアクセス可能マーカーが欠如しているという理由から、現時点では標的治療薬の適用性に限界がある。多くの病原性細胞型に対するタンパク質マーカーを発見することは極めて困難であり、不可能なこともしばしばである。
病原性細胞に特異的な核酸標的を標的化する治療法が開発されてきたのは、つい最近のことである。ｓｉＲＮＡなどの既存の核酸標的療法は、危険な可能性のある遺伝子の発現の下方調節を可能としているが、強力な細胞傷害性または細胞増殖抑制性の介入を生じないため、危険な細胞自体を排除する効率に劣っている。
そのため、既存の生物学的療法の介入の有効性が低く及び／または副作用が深刻となっており、それらに対処する必要性が存在している。本明細書に記載の方法は、予備折り畳みサブユニットどうしが相互作用する他の形態のタンパク質相補性（例えば、βガラクトシダーゼのα相補性）とは異なり、強制的な空間的近接を介した成熟折り畳み経路を促進することを特徴とする、分割タンパク質アプローチを含む。結果として、分割タンパク質フラグメントは単独では、それらの対応する親タンパク質の機能的プロファイルを再現できないことから、フラグメントバックグラウンド機能レベルは極度に低い。
本明細書において一般的に記載されている方法は、それによって分割タンパク質の再折り畳みは、複数の異なるアーキテクチャの核酸鋳型を介して指向され得る。特に、細胞性ＲＮＡ、または標的細胞内の任意のアクセス可能な核酸鋳型配列は、目的タンパク質の特異的ポリペプチドフラグメントを機能的な折り畳み形態にアセンブルする目的に使用され得る。例えば、このようにして強力なリボトキシンのアセンブリを用いることによって、腫瘍細胞または異常免疫細胞をはじめとする特異的マーカーを発現する細胞を標的殺害することが可能である。
本開示には、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｂ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、且つ抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、第２の５’ステム部分と、を含むポリヌクレオチドを具備する、ボトルハプロマーも提供されている。
また、本開示には、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｂ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmより大きい、第２の５’ステム部分と、を具備するポリヌクレオチドを含む、ボトルハプロマーにおいて、
ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されるか、またはＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結され、ポリヌクレオチドにライニング（ｌｉｎｅｄ）されたタンパク質フラグメントの末端がシステインまたはセレノシステインを含む、ボトルハプロマーも提供されている。
また、本開示は、ａ）ポリヌクレオチドと、ｂ）ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端もしくはＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたＮ末端タンパク質フラグメントまたはＣ末端タンパク質フラグメントとを含み、ｉ）Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧ（配列ＩＤ番号：１）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２）を含み、ｉｉ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧ（配列ＩＤ番号：３）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４）を含み、ｉｉｉ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫ（配列ＩＤ番号：５）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：６）を含み、ｉｖ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤ（配列ＩＤ番号：７）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：８）を含み、ｖ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧ（配列ＩＤ番号：９）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、ｖｉ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤ（配列ＩＤ番号：１１）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１２）を含み、ｖｉｉ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱ（配列ＩＤ番号：１３）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１４）を含み、ｖｉｉｉ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧ（配列ＩＤ番号：１５）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１６）を含み、ｉｘ）Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮ（配列ＩＤ番号：１７）を含み、Ｃ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１８）を含み、あるいはＮ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴ（配列ＩＤ番号：４０）を含み、Ｃ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４１）を含むハプロマーを提供する。
また、本開示には、ａ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｂ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、且つ
ペプチドが細胞表面分子に対するリガンドである、表面標的化合物も、提供されている。
また、本開示には、ａ）Ｎ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と精製ドメインとを含む融合タンパク質であって、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端が融合パートナータンパク質のＮ末端にカップリングされ、且つ融合パートナータンパク質のＣ末端が精製ドメインのＮ末端にカップリングされるか、またはｂ）Ｎ末端タンパク質フラグメント、融合パートナータンパク質及び開裂部位にカップリングされ、融合パートナータンパク質のＣ末端が開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニンとＣ末端システインとを含む、あるいはｃ）Ｃ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と開裂部位を含み、融合パートナータンパク質のＣ末端が開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む融合タンパク質も、提供されている。
また、本開示には、次式：
Figure 2020501530
 （式中、ｎは約３〜約６である）を有する化合物も、提供されている。
また、本開示には、ａ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第１のハプロマーと、ｂ）Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチを含む第２のハプロマーであって、第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し相補的であり、あるいはｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、あるいはｉｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいはｉｖ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの３’部分に対し実質的に相補的である、第２のハプロマーと、
を具備する、組成物またはキットも提供されている。
また、本開示には、ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが第１のステム部分：第２のステム部分のＴmより大きい、第２の５’ステム部分とを具備する、ボトルハプロマーと、ｂ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がシステイン−ＳＨ残基を含む、Ｎ末端タンパク質フラグメントと、ｃ）ビスマレイミド試薬と、を具備する、組成物またはキットも提供されている。
また、本開示には、ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端が、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む第２の５’ステム部分と、を具備するボトルハプロマーと、ｂ）ポリヌクレオチド及びＣ末端タンパク質フラグメントを含む第２のハプロマーであって、ポリヌクレオチドの３’末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結され、Ｎ末端がシステインを含み、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、第２のハプロマーとを具備し、
Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導される、前記組成物またはキットも提供されている。
また、本開示には、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントの両方がレポータータンパク質、転写因子、シグナル伝達経路因子、遺伝子編集タンパク質、単鎖免疫グロブリン可変領域（ｓｃＦｖ）タンパク質、毒性タンパク質または酵素から誘導される、上記及び本明細書に記載されているハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質及びキットまたは組成物も、提供されている。
また、本開示には、ａ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、ｂ）細胞を、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、あるいはｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、あるいはｉｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいはｉｖ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの３’部分に対し実質的に相補的であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、細胞内のタンパク質の指向性アセンブリ方法も、提供されている。
また、本開示には、ａ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、ボトルハプロマーが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む第２の５’ステム部分と、を具備する、接触させることと、ｃ）ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、タンパク質の指向性アセンブリ方法も提供されている。
また、本開示には、ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、表面標的化合物が、ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、細胞表面分子に対するリガンドである、ペプチドとを具備する、接触させることと、ｂ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、ｃ）細胞を、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることと、を含む。
また、本開示には、ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、表面標的化合物が、ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、細胞表面分子に対するリガンドである、ペプチドとを具備する、接触させることと、ｂ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、ボトルハプロマーが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む第２の５’ステム部分と、を具備する、接触させることと、ｃ）ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、タンパク質の指向性アセンブリ方法も提供されている。
また、本開示には、ａ）融合タンパク質を、２−メルカプトエタンスルフォン酸に接触させることと、ｂ）融合タンパク質をメチルテトラジン基を有するシステインに接触させることと、を含み、それにより、融合タンパク質からＮ末端タンパク質フラグメントを剥離させる、融合タンパク質内のインテイン融合パートナーからＮ末端タンパク質フラグメントを開裂させる方法も提供されている。
タンパク質フラグメントのためのタンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）／分割タンパク質テクノロジーの概略図を示す。 タンパク質フラグメント融合物の発現及び共折り畳みのためのタンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）／分割タンパク質テクノロジーの概略図を示す。 ポリペプチド−核酸共役体の第１の配向（パネルＡ）及び第２の配向（パネルＢ）に関する、近接増強反応性による分裂タンパク質鋳型アセンブリ（ＳＰ−ＴＡＰＥＲ）の代表的な概略図を示す。 添付の核酸タグが自己相補的であるＳＰ−ＴＡＰＥＲの代表的な第１のアーキテクチャを示す。 添付の核酸タグが自己相補的でないが、但し、線状標的核酸鋳型上に並置してハイブリダイズする、ＳＰ−ＴＡＰＥＲの代表的な第２のアーキテクチャを示す。 鋳型媒介ポリペプチドフラグメントの並置が、ステムループ構造によって指向されるものである、ＳＰ−ＴＡＰＥＲの代表的な第３のアーキテクチャを示す。 鋳型媒介ポリペプチドフラグメントの並置が、ループ構造内のハイブリダイゼーション部位の「エキソ」配位によって指向されるものである、ＳＰ−ＴＡＰＥＲの代表的な第４のアーキテクチャを示す。 ＳＰ−ＴＡＰＥＲのためのロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの代表的な構造を示す。 ロックドＴＡＰＥＲアプローチと調和するＳＰ−ＴＡＰＥＲの代表的な概略図を示す。 ヒルステリンＡの構造及びアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５０）、ならびに代表的な候補フラグメント配列（例えば、配列ＩＤ番号：５１及び配列ＩＤ番号：４１、ならびに配列ＩＤ番号：５２及び配列ＩＤ番号：２）を示すと共に、分割タンパク質アッセイ用の２つの代表的開裂部位（例えば、ジトレオニンＳＰ部位及びジグリシンＳＰ部位）を示す。 図１０−１の続き。 代表的なスーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）とＲｅｎｉｌｌａのＮ末端フラグメントとを比較対照して示す。 ＳＰ−ＴＡＰＥＲ−インテイン融合開裂のための代表的なｓｆＧＦＰ Ｎ末端フラグメント（約１７ｋＤ）を示す。 図１２−１の続き。 マルトース結合タンパク質系における代表的なｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａ Ｃ末端フラグメント、エンテロキナーゼ開裂部位（配列ＩＤ番号：４４）、ならびにエンテロキナーゼフラグメントの開裂を示す。 マルトース結合タンパク質系における代表的なｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａ Ｎ末端フラグメント、ならびにエンテロキナーゼ開裂部位（配列ＩＤ番号：４４）を示す。 マルトース結合タンパク質系におけるｓｆＧＦＰのＮ末端フラグメントの代表的なエンテロキナーゼ開裂を示す。 トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理し、続いて１，８−ビス（マレイミド）ジエチレングリコール（ＢＭＰ２）と反応させた後の、５’−ジスルフィド基を有する代表的なオリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：４５）の分析を示す。 代表的な鋳型配列（配列ＩＤ番号：２０）と共に、ＭＣ１Ｒを発現する標的細胞内に表面鋳型を生成するためのαメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）誘導体（配列ＩＤ番号：２１）の代表的な使用例を示す。 ８９〜９０ジグリシンでフラグメント化され、ＭＢＰ系において融合タンパク質として発現する、ヒルステリンＡセグメント（配列ＩＤ番号：２５及び配列ＩＤ番号：２６）、ならびにエンテロキナーゼ開裂部位（配列ＩＤ番号：４４）の代表的な構造を示す。 オリゴヌクレオチドをヘキサヒスチジン分割タンパク質フラグメント融合体に結合できるように核酸の５’末端もしくは３’末端をキレート剤で共有結合的に修飾することによる、ＳＰ−ＴＡＰＥＲのためのオリゴヌクレオチドの代表的なカップリングを示す。 固相ストレプトアビジン調製物によるテトラヒスチジン配列を有するビオチン化オリゴヌクレオチド（ビオチン−ＧＳＧＳＧＨＨＨＨ；配列ＩＤ番号：１９）を用いたヘキサヒスチジンとの複合体を形成する反応による、過剰なＮＴＡ：：Ｎｉオリゴヌクレオチドの除去を示した代表的な概略図を示す。 （パネルＡ及びＢ）は、トリス−タンデムＮＴＡ修飾オリゴヌクレオチドの調製のための代表的なプロセス、及びロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチド上での生成物形成のデモンストレーションを示す。 Ｈｉｓ結合トリスタンデムＮＴＡロックドＴＡＰＥＲオリゴを精製するための代表的な機能的ストラテジーを示す。 ヘキサヒスチジン融合としてのｓｆＧＦＰフラグメント（配列ＩＤ番号：５３及び配列ＩＤ番号：５４）の発現を示す。 ｓｆＧＦＰ−ヘキサヒスチジンロックドＴＡＰＥＲオリゴ−ＮＴＡ−Ｎｉ共役体を有するＳＰ−ＴＡＰＥＲを示す。 ｓｆＧＦＰフラグメントを有するＳＰ−ＴＡＰＥＲを示す。
ここで、本明細書に開示されている組成物及び方法の構造、機能、製造、ならびに使用の原理を全般的に理解できるように、或る特定の例示的な実施形態について説明する。これらの実施形態の１つ以上の実施例が、添付の図面に例証されている。当業者であれば、本明細書中に具体的に説明され添付の図面に例証されている組成物及び方法が、非限定的な例示的実施形態であり、本開示の範囲がもっぱら特許請求の範囲によって定義されることを、理解するであろう。或る例示的実施形態に関連して例証または説明されている特徴を、他の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。そのような修正形態及び変形形態は、本開示の範囲内に包含されることを意図したものである。
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が本明細書中に用いられている場合、その内容が特に明記されていない限り、複数の指示物が包含される。本開示中に用いられている用語は、当業者に一般に認められている標準的な定義に準拠している。いくつかの用語については、更に詳しい説明が必要とされる場合、以下に更に解説してある。
「抗標的ループ部分」という語句が本明細書中に用いられている場合、標的核酸分子に対する配列特異的な結合を促進するボトルハプロマーの一部分を指す。
本明細書において、「塩基」という用語は、ワトソン−クリックまたはフーグスティン結合相互作用を介して別の対応する塩基と結合対を形成する、プリンもしくはピリミジン基、または人工類似体を含む分子を指す。塩基は、オリゴマーなどのポリマー中で複数の塩基を一体的に共有結合させるのを促進する基を、更に含有する。例としては、限定されないが、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸残基、またはモルホリノ残基が挙げられる。
本明細書において、「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」、「結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ）」及び「結合された（ｂｏｕｎｄ）」という用語は、互いに近接した２つの分子間の安定した相互作用を指す。この用語には、（直接結合または中間構造を介した）化学結合などの物理的相互作用のほか、非物理的相互作用、ならびに静電引力、水素結合、及びファンデルワールス／分散力などの引力が包含される。
本明細書において、「生体共役化学」という語句は、穏やかな条件下で共通の官能基を一体的にライゲートし、多残基化合物のモジュール構造を促進する化学合成ストラテジー及び試薬を指す。
本明細書において、「化学連結基」または「連結基」いう語句は、或るハプロマーを別のハプロマーに結合する分子、または或る残基を異なる化合物上の別の残基に結合する分子を指す。連結基は、分枝状または非分枝状の共有結合分子鎖から構成され得る。
本明細書において、「投薬量単位形態」という語句は、治療の対象となる被験者用の単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す。
本明細書において、「ハプロマー」という用語は、配列特異的に標的核酸分子鋳型に結合し、核酸鋳型化アセンブリ中にタンパク質形成に関与する、タンパク質フラグメントに連結された核酸分子を指す。また、本明細書には、化学修飾に供されていて、同じ生物学的活性もしくは生物学的活性欠如、及び／またはハプロマーとして作用する能力を維持しているか、あるいはハプロマーと一貫性のある様式にて機能する「誘導体」または「類似体」、例えば、それらの塩、水和物、溶媒和物もしくは他の分子も含まれる。
本明細書において、「非無痕跡型の生体直交型化学」という語句は、選択的反応性残基の構造の一部または全部が産物構造中に保持されている選択的反応性残基を含む反応を指す。
本明細書において、「核酸鋳型化アセンブリ」という語句は、ハプロマーを介してタンパク質の形成を促進できるように、標的核酸分子上のタンパク質を生成することによって、タンパク質が標的核酸分子に結合されたときに近接してアセンブルすることを指す。
本明細書中に用いられている「オリゴマー」及び「オリゴ」という用語は、複数の単位から構成される分子において、その単位の一部または全部が、ワトソン−クリックもしくはフーグスティン塩基対相互作用を形成する機能を有する塩基であり、それにより二本鎖または多重構造における核酸分子への配列特異的結合を可能にしている、分子を指す。例としては、限定されないが、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸オリゴマー及びモルホリノオリゴマーが挙げられる。
本明細書において、「病原性細胞」という語句は、ウイルスに感染した細胞、腫瘍細胞及び微生物に感染した細胞などの罹患状態もしくは異常状態を引き起こし得るまたは促進し得る細胞を指す場合もあれば、あるいはアレルギー、アナフィラキシー、炎症及び自己免疫を含むがこれらに限定されない疾患を誘発または媒介する分子を産生する細胞を指す場合もある。
本明細書において、「医薬的に許容される」という語句は、生物学的に許容されない物質もしくはそれ以外の様式で許容されない物質において、許容されない生物学的影響を引き起こしたりまたは許容されない様式で組成物の他の成分と相互作用したりすることなしに、組成物中に組み込むことも患者に投与することも可能な、物質を指す。
本明細書において、「医薬的に許容される塩」という語句は、哺乳動物などの患者に投与する目的に許容される塩基または酸から調製される塩（例えば、所与の投薬レジームで、許容される哺乳動物に対し安全性が確保される塩）を意味する。
本明細書において、「塩」という用語には、医薬的に許容される無機酸及び塩基から誘導される塩が包含される場合もあれば、医薬的に許容される有機酸及び塩基、ならびにそれらの誘導体及び変種から誘導される塩が包含される場合もある。
本明細書において、「試料」という用語は、ハプロマーの投与先となり得る系であって、核酸鋳型化アセンブリが起こり得る、任意の系を指す。試料の例としては、限定されないが、固定もしくは保存された細胞、生物全体、組織、腫瘍、溶解物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系が挙げられる。
本明細書において、「対応する反応物のセット」または「対応するハプロマー」という語句は、単一の標的核酸分子上に会合して鋳型されたアセンブリ反応に関与するハプロマーを指す。
本明細書において、「標的区画」という語句は、細胞、ウイルス、組織、腫瘍、溶解物、他の生物学的構造、空間領域もしくは試料であって、標的核酸分子（複数可）を含むもの、または非標的区画とは異なる量の標的核酸分子を含むものを指す。
本明細書において、「標的核酸配列」及び「標的核酸分子」という語句は、同義に用いられており、核酸鋳型化アセンブリ用の鋳型として機能することが意図される、一連の単位または核酸を指す。
本明細書において、「鋳型化アセンブリ産物」という語句は、ハプロマーに関連する特定のタンパク質の２つのフラグメントによって形成されるタンパク質を指す。
本明細書において、「無痕跡型の生体直交型化学」という語句は、アミドのような天然起源の結合が、こうして生成された構造から生体直交型残基の一部または全部を除去することによって形成されるハプロマーを含む反応を指す。
指定された目的の細胞に特異的な核酸分子は（それらが病理学的腫瘍細胞、異常な免疫細胞、または他の任意の細胞型によって表されるかどうかには無関係に）、分子間相互作用の近接誘導性増強を利用して新規構造（例えばエフェクター構造）を生成するための鋳型として、使用可能である（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／１９７５４７号を参照）。そのような鋳型化産物は、様々な方法で細胞死を誘発するように、または細胞活性を調節するように設計することが可能である。細胞型特異的核酸は、特異的転写ｍＲＮＡから、または核酸アプタマーを介して供給することが可能であり、非核酸標的を定義済の鋳型配列を提供する目的に合うように適応させるのに役立ち得る。
上記の診断または治療を目的とする鋳型化アセンブリの元のプロセスにおいて、反応性基は、所定の配列のオリゴヌクレオチドとの連結によって空間的に近接し、標的核酸分子鋳型上で反応性基どうしがそれら自体で近接して共ハイブリダイズする。相互に反応性である基を保持する鋳型指向性の修飾オリゴヌクレオチドは、「ハプロマー」と呼称される。そのような反応性基どうしを強制的に近接させ、産物形成を多大に増強することで、細胞型特異的な転写産物により、目的の細胞内で所望される分子を産生させ得る。本明細書に記載されているように、特異的リガンドを、直接相互作用性官能基に付加する代わりに各ハプロマーオリゴヌクレオチドに付加することによって、ＴＡＰＥＲの一般原理を２段階プロセスに変更することが可能である。ゆえに、（本明細書中で「従来のＴＡＰＥＲ」と呼称される）ＴＡＰＥＲの元の構成において、鋳型を機能的に特異的な触媒と見なしても差し支えない場合、本プロセスを単一反応シーケンス内で起こるものとして表すことができる。
Figure 2020501530
 式中、Ｈ１及びＨ２はそれぞれ、反応基Ａ及び反応基Ｂを有するハプロマーを表す。特異的な鋳型へのハイブリダイゼーションの際、ＡとＢとの間の近接駆動反応中間体［Ａ：Ｂ］が形成され、急速に産物［Ｐ］が形成される。
いくつかの実施形態において、「ロックドＴＡＰＥＲ」と呼ばれるＴＡＰＥＲの変形形態は、ＳＰ−ＴＡＰＥＲに容易に適用可能である。ロックドＳＰ−ＴＡＰＥＲに関しては、第１のボトルハプロマー及び第２のハプロマーが、本明細書に記載されているように相互作用する。ロックドＴＡＰＥＲプロセスの性質上、第１のボトルハプロマーの抗標的ループ部分に対しハイブリダイゼーションが生じた状況において、第２のハプロマータンパク質フラグメント共役体のハイブリダイゼーション部位は、特異的標的の存在下にある場合を除いて、アクセス不可能となる。引き続いて、第２のハプロマータンパク質フラグメント共役体のハイブリダイゼーション部位をアクセス可能にし、次いで、近接促進アセンブリを行う。
ＳＰ−ＴＡＰＥＲプロセス及びその成分は、下記の汎用表現によって概説することができる。
多数のタンパク質を、単独では無秩序であるが空間的に近接して適正な配向にて一体的に保持されているときに高精度な共折り畳みを可能にする２つの別々のポリペプチドフラグメントに分割できる。そのような空間的に強制された折り畳みによって、その元の機能的特性の再構成を伴う、成熟タンパク質が形成することが可能である。そのようなタンパク質フラグメント間の空間的近接性を誘発するには、ロイシンジッパーのような、独立に折り畳まれて相互作用する小タンパク質ドメインに対し、それぞれのタンパク質フラグメントを付加するのが、１つの手段である。このプロセスは、タンパク質補完アッセイ（ＰＣＡ）または分割タンパク質テクノロジーと通称されるものであり、図１及び図２に概略的に描かれている。タンパク質三次元構造が利用可能であるときには、目的タンパク質分割のための一次アミノ酸配列内の特定部位の選択を、合理的に誘導し得る。したがって、一般的なタンパク質の折り畳みもしくは機能を損なうことなしに修正できるループまたは他の構造的特徴は、タンパク質分割法に有利である。目的タンパク質のＮ末端及びＣ末端の空間的配向もまた、重要であり得る。例えば、Ｎ末端及びＣ末端が成熟折り畳みタンパク質内で空間的に近接して詰め込まれている場合（図１を参照）、分割タンパク質相補性におけるこれらの末端の平行配向は、逆平行配向よりも必要な折り畳み経路との適合性が良好であり得る。にもかかわらず、各フラグメントが空間的位置決めを可能にするうえで十分な長さの柔軟な連結基配列を具備していれば、そのような潜在的な制約を低減または排除できる。分割タンパク質分析用に選択されたフラグメンテーションポイントの有用性に関する情報がそれ以外には存在しない場合、自己折り畳み及び相互作用性タンパク質ドメインとの適切な融合物としてフラグメントを別々に発現させるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフラグメントを混合した際に機能的活性の再構成を試験するか、または 融合産物を細胞内で共発現させることによって、系を経験的に試験できる。そのようなアレンジメントの一例として、２つのフラグメントＡ及びＢとしてレンダリングされたタンパク質は、Ａ−（Ｃ−末端）−Ｊｕｎ及びＦｏｓ−（Ｎ−末端）−Ｂとして別々に発現するようにエンジニアリングされ、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓは、相互作用性ロイシンジッパーから誘導され、長いセリン−グリシン連結基を介して、所望されるポリペプチドからＪｕｎ／Ｆｏｓセグメントが分離される。
本明細書中に記載されているように、機能的再構成用の分割タンパク質フラグメント間に空間的近接性を生じさせる目的で、核酸ハイブリダイゼーションを相互作用性タンパク質ドメインの代用とし得ることが、明らかにされてきた。タンパク質フラグメントは、診断、画像化、及び治療を目的に、好適な配向にて相互に相補的なオリゴヌクレオチドと共役している。
分子的近接性及び付随する二分子反応を実施するための核酸鋳型の使用は、治療的または診断的関連においてペプチドまたは他の小分子のアセンブリに適用される（関与する修飾核酸は、ハプロマー（商標）という呼称のＴＡＰＥＲプロセスと呼ばれる）。ＰＣＴ公報ＷＯ１４／１９７５４７を参照。これまで、本プロセスについて、小分子のアセンブリに焦点を当てて説明してきたが、アセンブルされた分子種の性質に対し固有なサイズ制限は課されていない。本実施形態では、分割タンパク質アプローチによるポリペプチドの指向性アセンブリを目的に、ＴＡＰＥＲ及びハプロマーテクノロジーを利用する。そのため、そのような利用は、ＴＡＰＥＲプロセスのサブセットとして分類されるものであり、分割タンパク質ＴＡＰＥＲまたはＳＰ−ＴＡＰＥＲと総称されている。前述のようなＴＡＰＥＲの使用は、本明細書中では「従来のＴＡＰＥＲ」と呼称されている。本明細書において、ＳＰ−ＴＡＰＥＲのためのタンパク質フラグメントと共役されたオリゴヌクレオチドは、従来のＴＡＰＥＲからの延長線上にあるという観点から「ＳＰ−ハプロマー」と呼称されている。
従来のＴＡＰＥＲをＳＰ−ＴＡＰＥＲに適合させるため、タンパク質フラグメントを核酸ハプロマーにカップリングさせる。それにより、そのハプロマーを介して、２つのタンパク質フラグメント間のハイブリダイゼーション媒介分子近接が可能になる。これらのハプロマーは、選択されたタンパク質の発現によって生成される新しいＮ末端またはＣ末端に、２つの別々のフラグメントとして付加される（これらの新しい末端は、本明細書中ではそれぞれＮ*−及びＣ*−と呼ばれる）。オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端は、様々な化学的手法（パネルＡ対パネルＢ）によって、分割タンパク質フラグメントのＮ*末端及びＣ*末端のいずれかに付加することができる（図３を参照）。
核酸共役に先立って、目的タンパク質フラグメントを細菌系で発現させて精製する。いくつかの実施形態において、発現系は、限定されないが、マルトース結合タンパク質とのアフィニティ融合体またはヘキサヒスチジンタグを含む。いくつかの実施形態において、インテイン融合は、適切な条件下で、所望のタンパク質フラグメントがｉｎ ｖｉｔｒｏで開裂されるように発現する。
いくつかの実施形態において、ハプロマーとタンパク質フラグメントとの間のカップリングは、架橋末端−ＳＨ基によって媒介される。オリゴヌクレオチドの場合、５’または３’−ＳＨ基は、合成によって容易に生成される。スルフヒドリル基の場合、典型的に、使用直前に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤で処理することにより、末端前駆体ジスルフィドから生成される。ポリペプチドでは、Ｎ末端またはＣ末端−ＳＨ基は、末端システイン残基を適切な部位に配置することにより、最も容易に生成される。−ＳＨ標識オリゴヌクレオチドの結合は、１，８−ビス（マレイミド）ジエチレングリコール及び１，１１−ビス（マレイミド）トリエチレングリコールを含むがこれらに限定されない二機能性マレイミド試薬を用いることにより、達成できる。目的ポリペプチドフラグメント内に内部システインが存在する場合、本アプローチにおいて障害となる可能性があるが、実際に見出されてきたように、末端システインの方が、より長い配列内に埋め込まれたシステインに比べてはるかに効率的に修飾される。
いくつかの実施形態において、ハプロマーとタンパク質フラグメントとの間のカップリングは、代替化学によって媒介される。ハプロマーとＮ末端ポリペプチドの共役に関して、限定されないが、ケテン化学、チオアゾリジン、またはイソシアナトキレートが、これらのアプローチに包含される。ハプロマーとＣ末端ポリペプチドの共役に関しては、限定されないが、エンジニアリングされたＣ末端セレノシステインのヨード化、及び標識化がインテイン開裂とカップリングする方法が、これらのアプローチに包含される。後者の状況において、アジド基を有するヒドラジノ化合物を介して、融合インテイン配列から目的のＮ末端タンパク質フラグメントを開裂させることを達成できる（Ｋａｌｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ＢｉｏＣｈｅｍ．，２００６，７，１３７５−１３８３）。これに続いて、銅を含まないクリックケミストリーを介して、５’または３’シクロオクチン基を担持するオリゴヌクレオチドを、アジド残基に容易に結合できる。代替的に、メチルテトラジン基（（Ｒ）−２−アミノ−３−メルカプト−Ｎ−（３−（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３））−イル）フェノキシ）プロピル）プロパンアミド）を有する新規な修飾システインと共反応させながら、２−メルカプトエタンスルホン酸で従来通り処理し、融合インテイン配列から目的のＮ末端タンパク質フラグメントを開裂させることもできる。
Figure 2020501530
これにより、所望のＮ末端タンパク質フラグメントの剥離とシステイン−メチルテトラジンの共役とが同時に行われる。次いで、５’または３’トランス−シクロオクテン基を担持するオリゴヌクレオチドが、付加的なメチルテトラジン残基と迅速且つ特異的に反応する。
いくつかの実施形態において、ハプロマーとタンパク質フラグメントとの間のカップリングは、拡張遺伝コードによって媒介される。これを実行するために、（ＤＮＡレベルでの）ＴＡＧ終止コドンをＮ末端またはＣ末端位置でエンジニアリングし、発現目的に使用される細菌株を、特定の配列修飾を有する古細菌起源に由来する生体直交型アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ／ｔＲＮＡ対をコードするプラスミドと共トランスフェクトする。そのような状況において、アミノアシルｔＲＮＡシンターゼは、その同族のｔＲＮＡに、ｔＲＮＡアンチコドントリプレットを介してＵＡＧコドンを認識して、部位特異的にタンパク質に組み込まれる所望の非天然アミノ酸を生体直交的に充填するように、エンジニアリングされ、選択されている。
拡張遺伝暗号アプローチのいくつかのインスタンス化において、非天然アミノは、トランス−シクロオクテンを含むがこれらに限定されないクリック基を有する。特定のクリック基を有する側鎖を含む非天然アミノ酸残基が、選択されたポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に、またはその付近に組み込まれている場合、反応相補的クリック基を有するオリゴヌクレオチドを、特定のクリック反応自体を介してポリペプチドに化学的にライゲートできる。組み込まれた非天然アミノ酸がトランス−シクロオクテンを有する実施形態では、５’または３’メチルテトラジン基が、生体直交型反応性オリゴヌクレオチドに付加される。
ハプロマーのポリヌクレオチドと共役されたタンパク質フラグメントは、存在する他のタンパク質、及び共役されていない過剰な核酸から精製できる。精製方法としては、限定されないが、透析（目的の共役体と他の成分との間に実質的な分子量差が存在する場合）、ゲル濾過、非変性ゲル電気泳動及び特異的バンド切除及びＨＰＬＣが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドに付加されたハプロマーは、ＤＮＡから構成されており、共役体をビオチン化相補的ＲＮＡ鎖とハイブリダイズし、引き続き固相ストレプトアビジンに固定化することによって精製できる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドハプロマーを欠く初期混合物の成分は、固相ストレプトアビジンに結合していないので、洗浄工程により除去される。次いで、結合共役体を、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を特異的に消化するＲＮａｓｅＨで処理して、剥離させる。
ハイブリダイゼーション媒介ポリペプチド並置（折り畳み及び機能的活性の再構成を可能にする）が多数の異なる分子アーキテクチャによって生ずる場合に、ＳＰ−ＴＡＰＥＲを開始できる。最も単純なアレンジメントでは、各分割タンパク質フラグメント上のハプロマーどうしが相互に対し実質的に相補的になる。そのようなハプロマー間の直接ハイブリダイゼーションは、付加されたタンパク質フラグメントの空間的近接性を促進し、次いで、天然の折り畳み経路を介して相互作用を促進する（図４を参照）。本明細書において、この配位は「アーキテクチャ１」と呼称されている。
従来のＴＡＰＥＲと密接に平行するために、一対のＳＰ−ハプロマーはまた、互いに相補的であるよりも寧ろ、空間的に近接して第三者の線状標的鋳型に共ハイブリダイズできる。そうすることによって、付加されたポリペプチド配列は、所望の方向に空間並置にて配置され、結果として、成熟折り畳みタンパク質産物を形成できる（図５を参照）。本明細書において、この配位は「アーキテクチャ２」と呼称されている。このアーキテクチャ内で、相補的鋳型（すなわち、標的核酸分子）上の２つのハイブリダイズするＳＰ−ハプロマー間のギャップは、ゼロ（すなわち、ＳＰ−ハプロマーが正確に並置されている場合）またはＮ＞０（式中、Ｎは、ＳＰ−ハプロマー対の５’末端と３’末端との間の鋳型ヌクレオチドの数）であり得る（実際に、Ｎの増加につれて、ハプロマーポリペプチド間の相互作用効率が低下する傾向がある）。
ＳＰハプロマーのハイブリダイゼーション部位が、標的鋳型の一次配列に対し不連続な場合、ＳＰ−ＴＡＰＥＲに対し付加的なアーキテクチャを考え得る。一対のＳＰ−ハプロマーに対して不連続な認識部位は、ステムループ構造（本明細書中で「アーキテクチャ３」と呼称される）によって空間的に近接させられ、付加されたポリペプチド配列は成熟タンパク質構造に共折り畳みできる（図６を参照）。
鋳型ベースのアーキテクチャ２及び３では、ＳＰハプロマーの５’及び３’は、鋳型鎖の座標に向かって相互に指向されている。これは以前「エンド」配位と呼称されていた。鋳型鎖がかなりの大きさのループ構造を形成し得る場合、反対側のハプロマーアレンジメント（５'及び３'のＳＰ−ハプロマーは鋳型鎖の座標に対して互いに離れる向きに指向する「エキソ」配位（図７を参照））はまた、機能的共折り畳みと共に、付加されたポリペプチドセグメントどうしが空間的に近接し得る。本明細書において、この配位は「アーキテクチャ４」と呼称されている。
いくつかの実施形態において、以前は「ロックドＴＡＰＥＲ」と呼称されていたＴＡＰＥＲの変形形態（すなわち、ボトルハプロマーを使用するＴＡＰＥＲプロセス）は、ＳＰ−ＴＡＰＥＲに容易に適用可能である。ロックドＴＡＰＥＲを使用すると、鋳型の滴定効果を回避するのに有用である。ロックドＳＰ−ＴＡＰＥＲについては、第１のハプロマーボトル及び第２のハプロマーは、上記の実施形態における他のＳＰ−ＴＡＰＥＲアーキテクチャと類似の様式で、目的タンパク質の所定の独立に発現したポリペプチドフラグメントと共役される。目的ポリペプチドフラグメントと、第１のハプロマーボトル及び第２のハプロマーとの間の共役プロセスは、二機能性マレイミドカップリング試薬によるチオール共役を含むがこれらに限定されない上記実施形態に対応する様々な方法で達成できる（図８を参照）。ロックドＴＡＰＥＲプロセスの性質上、第１のハプロマーボトルの抗標的ループ部分に対しハイブリダイゼーションが生じた状況において、第２のハプロマー・ポリペプチド共役体のハイブリダイゼーション部位は、特異的な標的核酸分子の存在下にある場合を除いて、アクセス不可能となる。引き続いて、第２のハプロマー・ポリペプチド共役体のハイブリダイゼーション部位をアクセス可能にし、次いで、２つのポリペプチド鎖の近接促進共折り畳みが起こり得る（図９を参照）。
ロックドＴＡＰＥＲ系内で、ポリペプチド共役体を担持する２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション媒介により空間的に近接しているときは（図９及び図４を参照）、標的鋳型に対し相補的なアーキテクチャ２〜４とは異なって、２つの誘導体化オリゴヌクレオチドが互いに相補的となることから、アセンブリ片の構造がアーキテクチャ１に対応する（図９を参照）。にもかかわらず、ロックドＴＡＰＥＲ第１のハプロマーボトルのループセクションが、標的核酸分子配列にハイブリダイズするので、第２のハプロマーの認識部位を露出させるために、ループ−標的結合自体が異なるアーキテクチャを介して起こり得る。ゆえに、図９のロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイゼーションはアーキテクチャ２に対応するが（図５を参照）、アーキテクチャ３及び４による標的ハイブリダイゼーション（それぞれ図６及び図７を参照）も同様に可能である。したがって、ロックドＴＡＰＥＲは、ＴＡＰＥＲアセンブリが常にアーキテクチャ１に対し一定であるという独特の特徴を有するが、標的ハイブリダイゼーションは可変アーキテクチャを想定し得る。言い換えれば、標的ハイブリダイゼーション及びアセンブリ指向性ハイブリダイゼーションは、従来のＴＡＰＥＲでは合致するものであるのに対し、ロックドＴＡＰＥＲでは区別され且つ分離される場合がある。
ＳＰ−ＴＡＰＥＲによって指向された鋳型再構築に対する分割ポリペプチドとして適用可能なタンパク質は、レポーターシグナルを送達できる全てのものを含む。レポータータンパク質の非限定例のセットには、蛍光タンパク質（ＧＦＰ及びその誘導体、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ＶＥＮＵＳ、及びＣＦＰなど）、及びルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）が含まれる。ＳＰ−ＴＡＰＥＲ用途に包含される他の種類のタンパク質としては、限定されないが、転写因子、シグナル伝達経路因子、及び遺伝子編集タンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＳＰ−ＴＡＰＥＲは一本鎖免疫グロブリン可変領域（ｓｃＦｖ）タンパク質の鋳型アセンブリを標的とする。これらは典型的に、可変領域の重鎖及び軽鎖セグメントの会合を可能にする伸長セリン−グリシン連結基配列を含む。この連結基配列は、分割タンパク質の生成にとって便宜的な部位であり、２つの免疫グロブリン可変領域セグメントは、所望のアーキテクチャ（図５〜図８を参照）に従って核酸タグを付加され、その後、それらのアセンブリ及び結果として生ずる抗原結合特性は、特異的な鋳型の存在により媒介される。これは、細胞特異的な核酸配列によって定義されるように、目的の細胞標的における所望される抗原結合特異性のｉｎ ｓｉｔｕ生成を可能にする。ｓｃＦｖ標的化ＳＰ−ＴＡＰＥＲの用途としては、限定されないが、蛍光活性化タンパク質（ＦＡＰ、標的リガンドにおいて蛍光を発生させるｓｃＦｖ分子）の使用が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＳＰ−ＴＡＰＥＲは、真核生物のリボソームを酵素的に無効にすることにより機能する、小型の高毒性タンパク質またはリボトキシンの鋳型化アセンブリに適用される。そのようなタンパク質としては、限定されないが、リシンＡ鎖、Ａｓｐｆ１、α−サルシン、ミトギリン、及びヒルステリンＡが挙げられる。これらのタンパク質は、それらの小型サイズ及び高毒性により、ＳＰ−ＴＡＰＥＲに対し魅力的である。例として限定されないが、ヒルステリンＡは、ジグリシンターンをはじめとするいくつかの潜在的な分割タンパク質フラグメンテーション部位を有する（図１０を参照）。極端な毒性は、直接の免疫共役体としてのリボトキシンの展開に対する重大な制限となり得るが（許容できないバイスタンダー効果による）、これはＳＰ−ＴＡＰＥＲによって効果的に回避される。リボトキシン分割タンパク質フラグメントが、それらの親タンパク質の毒性活性を欠く場合、それらの循環フラグメントは無害である。ＳＰ−ＴＡＰＥＲでは、そのようなフラグメントは病的細胞標的と関連する特異的鋳型の存在下で、完全に活性なタンパク質に簡単にアセンブルされる。
リボトキシンに関して記載したのと同じ原理により、ＳＰ−ＴＡＰＥＲは、ジフテリア毒素及びコレラ毒素を含むがこれらに限定されない、他の小型で高毒性のタンパク質の鋳型指向性アセンブリにも適用可能である。以下、更に例を提供する。
ＳＰ−ＴＡＰＥＲ用の鋳型として有用な標的核酸分子は、選択の標的を識別する任意の核酸配列を含む。配列は、任意の記載の細胞性ＲＮＡ分子に対応するか、またはアプタマー媒介適応プロセス（ＵＳＳＮ６２／３３９，９８１を参照）、あるいは、任意の他のプロセスに由来する。それにより、好適な鋳型配列が所望の細胞位置に固定される。
ＳＰハプロマーの鋳型促進アセンブリも同様に表面効果である状況では、ＳＰ−ＴＡＰＥＲの鋳型として有用な標的核酸分子は細胞表面上に産生可能である。いくつかの実施形態において、特異的な所望の鋳型（及び所望の分割タンパク質アセンブリ部位）は、異常な免疫経路を通じて生じるか、または他の任意の種類の病理学的プロセスによって生ずる腫瘍起源とは関係なく、内部で標的細胞型内に位置する。そのような事例において、ＳＰハプロマーは、体操的アプローチ、及び多種多様なナノ粒子を含むがこれらに限定されない様々な送達テクノロジーにより細胞内環境に送出される。後者のカテゴリーとしては、限定されないが、単層及び多層リポソーム、デンドリマー、細胞外小胞、ＤＮＡもしくは他の核酸折り畳みケージ、人工細菌ビヒクル、人工ミトコンドリア、ウイルス由来構造、リボ核タンパク質ボールト、ならびにタンパク質またはＰＥＧ化タンパク質自己アセンブリ区画が挙げられる。従来のＴＡＰＥＲと同様に、送達の標的精度は有用であるが、病理学的に定義された標的配列が存在しない場合には、分割タンパク質アセンブリが起こらないので、必須ではない。言い換えれば、通常の「標的外」の細胞への送達は、ＳＰ−ＴＡＰＥＲの実装に対して有害な副作用はない。
いくつかの実施形態において、ＳＰ−ＴＡＰＥＲにおける分割ポリペプチドフラグメントの折り畳み経路は、タンパク質ヒペロン（多様な熱ショックタンパク質ファミリーのメンバーを含むがこれらに限定されない）、または低分子量化学シャペロンの提供によって補助され得る。非特異的シャペロン化機能を有する後者のカテゴリーの小分子シャペロンとしては、限定されないが、４−フェニルブチレート、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはタウロルソ−デオキシコール酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＰ−ＴＡＰＥＲは、目的の特異的な標的ポリペプチドフラグメントに対して有益な折り畳みが増強された小分子を利用し得る。そのような低分子量化合物は、薬理学的シャペロン、またはファーマコペロンとして定義される。
ＳＰ−ＴＡＰＥＲプロセス及びその成分は、より具体的な下記の実施形態によって概説できる。
本開示には、ａ）標的核酸分子に対し実質的に相補的であるポリヌクレオチドと、ｂ）ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端もしくはＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結された、Ｎ末端タンパク質フラグメントまたはＣ末端タンパク質フラグメントと、を含むハプロマーも提供されている。いくつかの実施形態において、ハプロマーのポリヌクレオチドは、約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、ハプロマーのポリヌクレオチドは、約８〜約１５ヌクレオチド塩基を含む。
いくつかの実施形態において、一対のハプロマーは縦列方向に動作する。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーのタンパク質フラグメントは、第１のハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマーのタンパク質フラグメントは、第２のハプロマーのポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーのポリヌクレオチドは、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドは、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的である。
本明細書に記載のいずれかの実施形態において、ハプロマーは、（標的核酸分子に結合したときに）空間的に近接していることから、タンパク質フラグメントが適切に相互作用して目的タンパク質フラグメントの各々の相互作用を誘発できるようになっている。ゆえに、任意のハプロマー対に対して、標的核酸分子に結合する第１のハプロマーと第２のハプロマーとの間のギャップＮが０である（すなわち、ハプロマーが直ちに並置され）、ギャップ（Ｎ＞０）の漸増によって活性が徐々に低減する。ゆえに、いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー及び第２のハプロマーとの間には、０個のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー及び第２のハプロマーとの間には、６個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー及び第２のハプロマーとの間には、５個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー及び第２のハプロマーとの間には、４個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー及び第２のハプロマーとの間には、３個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー及び第２のハプロマーとの間には、２個未満のヌクレオチドが存在する。
いくつかの実施形態において、第１のハプロマーのタンパク質フラグメント及びポリヌクレオチドの双方は生体直交型残基を含み、及び／または第２のハプロマーのタンパク質フラグメント及びポリヌクレオチドの双方は生体直交型残基を含み、第１のハプロマーの生体直交型残基が、第２のハプロマーの生体直交型残基と反応可能である。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧ（配列ＩＤ番号：１）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧ（配列ＩＤ番号：３）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫ（配列ＩＤ番号：５）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：６）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤ（配列ＩＤ番号：７）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：８）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧ（配列ＩＤ番号：９）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１０）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤ（配列ＩＤ番号：１１）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１２）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱ（配列ＩＤ番号：１３）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１４）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧ（配列ＩＤ番号：１５）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１６）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮ（配列ＩＤ番号：１７）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１８）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴ；（配列ＩＤ番号：４０）を含み、Ｃ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４１）を含む。
また、本開示には、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｂ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ｉ）ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、且つｉｉ）抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、第２の５’ステム部分とを具備するポリヌクレオチドを含む、ボトルハプロマーも提供されている。
また、本開示には、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｂ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ｉ）抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端が、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されるか、またはＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結され、ポリヌクレオチドにライニング（ｌｉｎｅｄ）されたタンパク質フラグメントの末端がシステインまたはセレノシステインを含む、第２の５’ステム部分とを具備するポリヌクレオチドを含む、ボトルハプロマーも提供されている。
いくつかの実施形態において、第１のステム部分は、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、抗標的ループ部分は、約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、第２のステム部分は、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む。抗標的ループ部分の第１の端部には、第１のステム部分が連結されている。抗標的ループ部分は、標的核酸分子に対し実質的に相補的である。第２のステム部分は、抗標的ループ部分の第２の端部に連結されている。第１のステム部分は、第２のステム部分に対し実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、抗標的ループ部分は、内部ヒンジ領域を更に含む場合があり、このヒンジ領域は、標的核酸分子に対し相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、約１ヌクレオチド〜約６ヌクレオチド、約１ヌクレオチド〜約５ヌクレオチド、約１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチド、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチド、または１ヌクレオチドもしくは２ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載のボトルハプロマーのポリヌクレオチドに関しては、特定のポリヌクレオチドまたはその一部の長さは、そのポリヌクレオチドまたはその一部と、別の核酸分子またはその一部との相互作用を介して形成される二重鎖のＴmよりも重大度が低い。例えば、抗標的ループ部分と標的核酸分子（例えば、抗標的ループ部分：標的核酸分子）との相互作用によって形成される二本鎖のＴmは、第２のステム部分を有する第１のステム部分（例えば、第１のステム部分：第２のステム部分）の相互作用によって形成される二本鎖のＴmよりも大きい。いくつかの実施形態では、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃である。いくつかの実施形態において、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子Ｔmから減算した残余が、約１０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態において、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約４０℃〜約５０℃である。いくつかの実施形態において、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約６０℃〜約８０℃である。
加えて、上記のＴm情報を本明細書に記載の特定の長さの核酸分子に翻訳する際にはまた、各核酸分子のＧＣ含有量に依存する場合もある。例えば、好適なＨＰＶモデル標的核酸分子は、長さが３０塩基（Ｔmが７０℃）である一方、ＥＢＶモデル標的核酸分子の場合、その％ＧＣが高いことから、長さが２１塩基のみ（Ｔmが６９℃）に限られる。
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマーは、第２のハプロマーに対し縦列方向に動作する。いくつかの実施形態において、ボトルハプロマーは本明細書に記載のボトルハプロマーのいずれかであり、且つ本明細書に記載の第２のハプロマーはハプロマーのいずれかである。いくつかの実施形態において、第２のハプロマーは、ａ）ボトルハプロマーのタンパク質フラグメントに連結されているボトルハプロマーのステム部分に対し実質的に相補的である約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、ヌクレオチド部分と、ｂ）ボトルハプロマーのタンパク質フラグメントに連結された第２のハプロマー：第１もしくは第２のステム部分のＴmが、ボトルハプロマーの第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である、第２のハプロマーのヌクレオチド部分の５’末端もしくは３’末端に連結されたタンパク質フラグメントと、を含む。
いくつかの実施形態において、第２のハプロマーを、第１のステム部分または第２のステム部分のいずれかタンパク質フラグメントに連結されている方のステム部分（例えば、タンパク質フラグメントに連結されている第２のハプロマー：第１または第２のステム部分）と相互作用させて形成された二重鎖のＴmは、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である。いくつかの実施形態において、第２のハプロマーと、タンパク質フラグメントに連結されている第１または第２のステム部分とによって形成された二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余は、約０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態において、タンパク質フラグメントに連結されている第２のハプロマーと、第１または第２のステム部分とによって形成された二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余は、約５℃〜約１０℃である。いくつかの実施形態において、第２のハプロマーと、タンパク質フラグメントに連結されている第１または第２のステム部分とによって形成された二重鎖Ｔmは、約３０℃〜約４０℃である。
この構造的アレンジメントは、標的核酸分子鋳型の非存在下で、ロックド第１のハプロマーボトルがその相補的な第２のハプロマーに有意にハイブリダイズしないように設計されているので、そのような条件下では鋳型指向性産物のアセンブリが促進されない。他方、特異的な標的核酸分子鋳型が存在する場合、ボトルハプロマーの抗標的ループ部分と標的核酸分子自体との間に安定性に優れるハイブリッドが形成されて、ボトルハプロマーが「アンロック」される。いったんこのアンロックが起こると、タンパク質フラグメントに連結されているボトルハプロマーの第１のステム部分が、利用可能な第２のハプロマーに自在にハイブリダイズし、結果として、両端のタンパク質フラグメントどうしが近接する。
また、本開示には、ａ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｂ）ｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチドと、を含み、ｉｉ）ペプチドが細胞表面分子に対するリガンドである、表面標的化合物も提供されている。
いくつかの実施形態において、リガンドは、ペプチドホルモンまたは神経ペプチドである。ペプチドホルモンの例としては、限定されないが、α−ＭＳＨ、アミリン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、アトリオペプチド、ヒト成長ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、インヒビン、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレシン、血管作用性腸管ペプチド、ガストリン、セクレチン、胃抑制性ポリペプチド、モチリン、ヘプシジン、レニン、リラキシン、グレリン、レプチン、リポトロピン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、ブラジキニン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、グルカゴン様ペプチドＩ、膵臓ポリペプチド、ベータトロフィン、コレシストキニン、エンドセリン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤ラクトゲン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、及び下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドが挙げられる。
神経ペプチドの例としては、限定されないが、神経ペプチドＹ、エンドルフィン、エンセファリン、脳性ナトリウム利尿ペプチド、タキキニン、コルチスタチン、ガラニン、オレキシン、及びオキシトシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列ＡＡＧＣＣ
ＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣ（配列ＩＤ番号：２０）を含み、ペプチドは、アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２１）、ＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２２）、ＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２３）、またはＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２４）を含み、Ｘはノルロイシンであり、且つＦ残基はＤ−フェニルアラニンである。
また、本開示には、Ｎ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と精製ドメインとを含む融合タンパク質も、提供されている。Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端が融合パートナータンパク質のＮ末端にカップリングされ、且つ融合パートナータンパク質のＣ末端が精製ドメインのＮ末端にカップリングされるか、またはＮ末端タンパク質フラグメント、融合パートナータンパク質及び開裂部位にカップリングされ、融合パートナータンパク質のＣ末端が開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニンとＣ末端システインとを含むか、またはＣ末端タンパク質フラグメント、融合パートナータンパク質及び開裂部位とを含み、融合パートナータンパク質のＣ末端が開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がインテインのＮ末端にカップリングされ、且つインテインのＣ末端がキチン結合ドメインのＮ末端にカップリングされ、融合タンパク質が、Ｎ末端タンパク質フラグメントとインテインとキチン結合ドメインとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端タンパク質フラグメント、マルトース結合タンパク質、及びエンテロキナーゼ開裂部位を含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つエンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニン及びＣ末端システインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が、Ｃ末端タンパク質フラグメント、マルトース結合タンパク質、及びエンテロキナーゼ開裂部位を含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つエンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端が、エンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端が、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、且つＮ末端タンパク質フラグメントが、アミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＣ（配列ＩＤ番号：２５）を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、且つＣ末端タンパク質フラグメントがアミノ酸配列ＣＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２６）を含む。
いくつかの実施形態において、融合パートナータンパク質は、インテイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはＯｍｐＦである。
いくつかの実施形態において、開裂部位は、エンテロキナーゼ開裂部位または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位である。いくつかの実施形態において、第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位は、ＩＥＧＲ（配列ＩＤ番号：２７）である。
いくつかの実施形態において、精製ドメインは、キチン結合ドメインまたはヘキサヒスチジンタグである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドをヘキサヒスチジン分割タンパク質フラグメント融合体に結合できるように核酸の５’末端もしくは３’末端をキレート剤で共有結合的に修飾することによって、ＳＰ−ＴＡＰＥＲのためのオリゴヌクレオチドのカップリングを達成する。最初に５’または３’ジスルフィド修飾を有するオリゴヌクレオチドをモル過剰なＴＣＥＰで還元し、次いで脱塩カラムに通過させてＴＣＥＰ及び低分子量生成物から得られるチオール末端オリゴヌクレオチドを精製する。この後、遊離チオールオリゴヌクレオチドをマレイミド−Ｃ３−ニトリロ三酢酸（ＭＮＴＡ；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と反応させると、ＭＮＴＡのマレイミド残基と利用可能なチオールとの反応によって、共役体が形成される。この生成物を、脱塩によって低分子種から再度精製し、次いでモル過剰なＮｉＣｌ2と共にインキュベートすることによりニッケルイオンを充填してから、再脱塩によって過剰なニッケルを除去する。続いて、結果として得られたキレート化共役体を使用して、適切なコード配列の発現によって産生される、Ｃ末端もしくはＮ末端ヘキサヒスチジンタグのいずれかを有する分割タンパク質フラグメントと複合体を形成できる。その共役プロセスは、図１９に描かれている。
いくつかの実施形態では、テトラヒスチジン配列（ビオチン−ＧＳＧＳＧＨＨＨＨ；配列ＩＤ番号：１９）を有するビオチン化オリゴヌクレオチドを介して、ヘキサヒスチジンと複合体を形成する反応から、過剰なＮＴＡ：：Ｎｉオリゴヌクレオチドを除去できる。ニッケルキレートは依然としてテトラヒスチジンと結合することができるが、ヘキサヒスチジンと比較して親和性が低いことから（Ｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２２：２７０−２７９，２００９）、過剰なテトラヒスチジンペプチドは、タンパク質フラグメントのヒスチジンタグからオリゴヌクレオチドを競合的に剥離させることなしに、非共役ＮＴＡ::Ｎｉオリゴヌクレオチドを枯渇させ得る。次いで、固相ストレプトアビジン調製物上で、ビオチン化ペプチド／オリゴヌクレオチド過剰を除去する（図２０を参照）。必要であれば、ビオチン化テトラヒスチジンペプチドを用いた枯渇ステップを繰り返して、残りの未共役ＮＴＡ：：Ｎｉオリゴヌクレオチドキレートを除去することができる。
ＮＴＡ：：Ｎｉキレートとヘキサヒスチジンタグとの間の複合体形成によって形成された複合体は、アーキテクチャ１〜４、及びロックドＴＡＰＥＲ構成のいずれかを使用して、他の化学的複合経路と同様にＳＰ−ＴＡＰＥＲにおいて使用できる（図４〜図９を参照）。
また、本開示には、次式
Figure 2020501530
 （式中、ｎは約３〜約６である）を有する化合物も提供されている。いくつかの実施形態において、ｎは約４〜約６または５〜６である。いくつかの実施形態において、ｎは３である。いくつかの実施形態において、ｎは４である。いくつかの実施形態において、ｎは５である。いくつかの実施形態において、ｎは６である。いくつかの実施形態では、１つ以上の水素を、例えば、−ＯＨ、−Ｃ1−Ｃ6アルキル、−Ｃ1−Ｃ6アルケニル、及びハロゲンなどをはじめとする様々な置換基で置換することによって、化合物を修飾する。
本明細書に記載の任意のハプロマーポリヌクレオチド、またはその任意の部分において、ヌクレオチド塩基が、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ類）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせもしくは混合物からなる群から選択される。
本明細書に記載の任意のハプロマーポリヌクレオチドのいずれについても、別の核酸分子との相補性は１００％であり得る。いくつかの実施形態において、或る特定の核酸分子は、別の核酸分子に対し実質的に相補的であり得る。本明細書中に「実質的に相補的」という語句が用いられている場合、１〜１０個のミスマッチ塩基位置、１〜９個のミスマッチ塩基位置、１〜８個のミスマッチ塩基位置、１〜７個のミスマッチ塩基位置、１〜６個のミスマッチ塩基位置、１〜５個のミスマッチ塩基位置、１〜４個のミスマッチ塩基位置、１〜３個のミスマッチ塩基位置、及び１または２個のミスマッチ塩基位置を意味する。いくつかの実施形態では、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、ミスマッチ塩基位置を介して１０％を超えて低下するのを回避することが所望される。ボトルハプロマーステムは、第２のハプロマーに関して設計されており、その構造は、第２のハプロマー二本鎖の形成よりも幾分かは安定性が高まるように意図的に整列されている。
いくつかの実施形態において、タンパク質フラグメントに連結されていないボトルハプロマーの部分は、オーバーハングしてステム構造の一部を形成しない付加的なヌクレオチド塩基を有し得る。いくつかの実施形態において、第２のハプロマーの端部は、タンパク質フラグメントに連結されていない場合、オーバーハングしてボトルハプロマーのステム部分に対し構造の相補的部分を形成しない付加的なヌクレオチド塩基を有し得る。加えて、いくつかの実施形態では、タンパク質フラグメントに連結されているステムの部分はまた、第１のステム部分と塩基対合していないヌクレオチド塩基を有し得る。ハイブリダイズしていない「アーム」を介して、そのようにステムが伸長すると、２つのタンパク質フラグメントがより大きな空間距離に配置するため、それらの相互反応性が低下する傾向がある。したがって、少数のヌクレオチド塩基（１０未満または５未満）では、反応性の強化が依然として生起される可能性が高いが、非塩基対合セグメントの長さが増加するにつれてこの反応性は低減する傾向がある。
いくつかの実施形態において、付加されたヌクレオチド塩基が無限の長さになり得るのは、
１）ロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの他の領域のいずれに対しても有意な相同性を有さず、それゆえ交差ハイブリダイズして干渉する傾向がない場合、または２）系の他の任意の機能に対し非特異的に干渉しない場合である。例えば、長い付加配列は治療との関連において使用されるロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの形質転換効率を低下させる可能性がある。また、付加配列は、他の細胞転写物との擬似ハイブリダイゼーションが回避されるように設計されている必要がある。付加された非相同配列は、２０〜３０ヌクレオチド塩基のものが、好適とされる。付加された核酸配列は、当該技術分野において遍く用いられるプライマー配列を含有し得る。そのような例としては、限定されないが、Ｍ１３、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、ＶＦ２、ＶＲ、それらの修飾バージョン、それらの相補配列、及びそれらの逆配列を挙げることができ、それ以外に、カスタムプライマー配列もまた含まれる。そのようなプライマー配列も使用可能であり、考え得る用途としては、例えば、ロックドＴＡＰＥＲに対し化学的にライゲートされたオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）ストラテジーが挙げられる（その全体が本明細書において参照により援用されているＰＣＴ公報ＷＯ２０１６／８９９５８号を参照）。
本明細書に記載のハプロマー及びボトルハプロマーのいずれか、またはその任意の部分は、第１のステム部分と抗標的ループ部分との間、抗標的ループ部分と第２のステム部分との間、第２のステム部分とリガンドとの間、第１のステム部分とタンパク質フラグメントとの間、または第２のハプロマーとそのタンパク質フラグメントとの間、のうちのいずれか１つ以上の間に連結基を更に含む場合がある。いくつかの実施形態において、連結基は、アルキル基、アルケニル基、アミド、エステル、チオエステル、ケトン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン、ウレタン、アゾール、イミン、ハロアルキル、ニトリロ三酢酸、ニッケル、コバルト、銅、及びカルバメート、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマーは、
ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：２８）または５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：２９）を含む。
いくつかの実施形態では、第２のハプロマーは、
ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：３０）、または５’−ＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：３１）を含む。
いくつかの実施形態では、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３'（配列ＩＤ番号：３２）を含み、第２のハプロマーのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴ−３'（配列ＩＤ番号：３０）を含み、あるいはボトルハプロマーのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３'（配列ＩＤ番号：２９）を含み、第２のハプロマーのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３'（配列ＩＤ番号：３１）を含む。
本明細書に記載の実施形態において鋳型として機能する標的核酸分子は、ハプロマーのポリヌクレオチドまたはボトルハプロマーの抗標的ループ部分とハイブリダイズ可能な任意の所望の核酸配列から構成され得る。アクセス可能な配列を有する任意の一本鎖核酸分子は、潜在的に標的化可能である。これらには、限定されないが、細胞性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムもしくはオルガネラＤＮＡ、エピソームもしくはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、短い及び長い非コードＲＮＡ、ならびに鋳型化の目的に使用される任意の人工核酸配列、または他の任意の生物学的もしくは人工の核酸配列が包含される。人工配列の例としては、限定されないが、アプタマー及び高分子−核酸共役体が挙げられる。アプタマー鋳型も挙げられる。これらはロックドＴＡＰＥＲをはじめとする任意の形態のＴＡＰＥＲに関する非核酸細胞産物を標的化可能な配列に変換するように設計されている。いくつかの実施形態において、標的核酸分子ハイブリダイゼーション部位が可能な限り短く維持されるのは、１）複雑なトランスクリプトームまたは他の複雑な標的内で特異性を維持する場合、
及び２）本明細書に記載されているロックドＴＡＰＥＲ設計ガイドラインを維持する場合である。
核酸分子を含有する試料の任意の細胞、ウイルス、組織、空間領域、溶解物、または他の副成分によって、標的核酸分子が提供される場合もある。標的核酸分子を含む標的区画の例としては、限定されないが、病原性細胞、がん細胞、ウイルスを挙げることができるほか、ウイルスまたは他の病原体に感染した宿主細胞、あるいは自己免疫に寄与する免疫系の細胞（例えば、適応免疫系もしくは先天的免疫系の細胞、移植拒絶反応、またはアレルギー反応の細胞）も挙げることができる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ウイルス中、またはウイルスに感染した細胞中に存在し得る反面、健常細胞中には存在し得ない。ウイルスの例としては、限定されないが、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、腫瘍細胞中またはがん性細胞中に存在し得る反面、健常細胞中には存在し得ない。がんの例としては、限定されないが、ヒトパピローマウイルス、エプスタインバーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのがんウイルスによって引き起こされるがんが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、感染性病原体中もしくは微生物中、または感染性病原体もしくは微生物に感染した細胞中に存在し得る反面、健常細胞中には存在しない。感染性病原体または微生物の例としては、限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、プリオン、または真核生物の寄生虫が挙げられる。
標的核酸分子は、遺伝子のフラグメント、部分または一部、例えば、がん遺伝子、突然変異体遺伝子、がんウイルス遺伝子、ウイルス核酸配列、微生物核酸配列、差次的に発現した遺伝子、及びそれらの核酸遺伝子産物であり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、細胞性核酸分子、腫瘍特異的核酸分子、異常な免疫経路核酸分子、または表面標的化合物のポリヌクレオチドである。
がん特異的な標的核酸の例としては、限定されないが、変異型がん遺伝子、例えば変異型ｒａｓ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＢＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４もしくはＳＲＣ遺伝子、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＭＤＭ１、ＭＤＭ２、ＡＴＭ、ＲＢ１、ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＷＴ１、ＩＲＦ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＴＲＩＭ３、ＢＲＣＡ１、またはＢＲＣＡ２遺伝子などの突然変異体腫瘍抑制遺伝子、及び変異または遺伝的に改変し得ないが、投与時に試料の健常細胞では発現されないがん細胞において発現する、がん胎児性抗原などの遺伝子が挙げられる。
いくつかの実施形態において、標的核酸分子が、非標的区画と比較して、標的区画において差次的な量または濃度で存在し得る。例としては、限定されないが、健常細胞とは異なるレベルでがん細胞中に発現する遺伝子、例えばｍｙｃ、テロメラーゼ、ＨＥＲ２、またはサイクリン依存性キナーゼが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、標的区画と非標的区画との間に、少なくとも１．５Ｘ倍に差次的に発現する遺伝子であり得る。それらのいくつかの例としては、限定されないが、標的ＲＮＡ分子が免疫グロブリンイプシロン重鎖配列を含む、Ｉ型アレルギー反応の媒介に関連する遺伝子；Ｔ細胞サブセットで発現する遺伝子、例えば、プロインスリン由来ペプチドのような特異的主要組織適合性（ＭＨＣ）タンパク質及び糖尿病誘発性ＣＤ８＋から誘導されたαまたはβ可変領域配列を含むクローン特異的ｍＲＮＡとの関連において自己抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、ＩＦＮ−γ、ＯＳＭ及びＬＩＦが挙げられるがこれらに限定されない、炎症反応の悪化によってその産生が有害な転帰を生ずる恐れのあるサイトカインが挙げられる。
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、標的区画及び非標的区画の許容可能なサブグループ中に存在するが、非標的区画の異種または別個のサブグループ中には存在しない。例としては、限定されないが、がん細胞内で発現する遺伝子（但し、がん精巣抗原、サバイビン、前立腺特異抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン及び他のがん胎児性タンパク質などの健常細胞のクラスのみ）が挙げられる。また、組織及び臓器の多くは、他の点では深刻な病気に直面しても健全な生活に不可欠でない。例えば、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００のようなメラニン形成細胞抗原は、多くの悪性黒色腫ならびに正常なメラニン形成細胞上に発現する。これらの抗原を標的とする治療法は、腫瘍と正常なメラニン細胞の両方を破壊し、白斑を生ずるだけでなく、腫瘍を大幅に減少させる。同様に、これらの組織の腫瘍が発生し、これらの臓器内の正常組織の破壊が治療の結果として許容範囲内となり得る場合、精巣、卵巣及び子宮などの生殖器官を外科的に除去し得ると共に、乳房及び前立腺などの関連する器官を標的化し得る。更にそのうえ、チロキシン及びインスリンなどのホルモンを産生する細胞によっては、関連タンパク質で置換可能なものもあり、これらの起源の腫瘍の存在下で、存在し得る正常細胞を潜在的に標的化することが可能となる。
いくつかの実施形態において、特定のハプロマーに対する標的核酸分子は、対応するハプロマーのポリヌクレオチドであり、結果として、アーキテクチャ１が生成されるようになっている。
また、標的核酸分子は、以前に同定されなかった新規な配列も含み得る。いくつかの実施形態では、次世代配列決定、全トランスクリプトーム（ＲＮＡ配列）または全ゲノム配列決定、マイクロアレイプロファイリング、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）などの配列分析によって１つもしくは複数の試料を評価し、試料の遺伝子構成を特定できる。標的核酸分子は、標的区画中に存在するものとして同定できるが、非標的区画中には存在しないか、または非標的区画と比較して差次的な量もしくは濃度で標的区画中に存在する。これらの方法で同定された配列は、標的核酸分子としての役目を果たし得る。
いくつかの実施形態において、ハプロマーのポリヌクレオチド、及びタンパク質フラグメントは、それらの連結を補助するための生体直交型反応性残基を更に含み得る。生体直交型残基は、アジドとアルキンとの間の「クリック」反応、アジドとホスフィンとの間の無痕跡型もしくは非無痕跡型シュタウディンガー反応、及びチオエステルとチオールとの間の天然化学ライゲーション反応を経る可能性のある基を含む。追加的に、生体直交型残基は、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、及びそれらの誘導体のいずれかであり得る。１セットの対応するハプロマーのメンバーの生体直交型残基は、それらが互いに反応するように選択される。
本明細書中に開示されている方法及び組成物と共に複数の生体直交型残基を使用できる。いくつかの例としては、限定されないが、
アジド−アルキン「クリックケミストリー」が挙げられる。
クリックケミストリーは高度な選択性を呈する。この理由は、典型的な条件下ではアジドもアルキンも一般的な生体分子と反応しないからである。Ｒ−Ｎ3型のアジド及びＲ−Ｃ≡ＣＨ型の末端アルキンまたはＲ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ型の内部アルキンは、互いに容易に反応して１，２，３−トリアゾールの形のフイスゲン環状付加産物を生成する。
Figure 2020501530
アジド系ハプロマーが有する部分構造は、以下の通り：
Ｒ−Ｎ3（式中、Ｒは化学連結基、核酸認識残基（例えば核酸分子の別の部分に対し相補的なオリゴヌクレオチドの部分）、またはリガンド）である。アジド及びアジド誘導体は、市販の試薬から容易に調製できる。
また、タンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドの合成中に、アジドをタンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドに導入することも可能である。いくつかの実施形態では、標準的なペプチド合成法を用いたタンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドの合成中に、市販のアジド誘導体化標準アミノ酸またはアミノ酸類似体を組み込むことによって、タンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドにアジド基を導入する。アミノ酸は、α−アミノ基を置換するアジドで誘導体化され、以下の形態の構造を与え得る。
Figure 2020501530
 式中、Ｒは標準アミノ酸または非標準アミノ酸類似体の側鎖である。
市販の製品は、アミノ酸側鎖としてアジド機能性を導入でき、その結果、次の形態の構造を生ずる。
Figure 2020501530
 式中、Ａは、標準アミノ酸または非標準アミノ酸類似体の側鎖中の任意の原子及びその置換基である。
また、ジアゾトランスファー法により、タンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチド上のアミン基をアジドに変換することにより合成した後に、アジドをタンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドに導入することも可能である。また、生体共役化学を使用して、市販の誘導体化アジドを化学連結基、核酸認識残基、または好適な反応基を含むタンパク質フラグメントもしくはポリヌクレオチドに結合することも可能である。
アジドの組み込みと同様の方法で、標準アルキンをハプロマーに組み込むことができる。アルキン官能化ヌクレオチド類似体は市販されており、これにより、核酸認識残基の合成時に、アルキン基を直接的に組み込むことが可能になる。同様に、アルキン誘導体化アミノ酸類似体を、標準的なペプチド合成方法でタンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドに組み込むこともできる。追加的に、生体共役化学的アプローチに適合する多様な官能化アルキンを使用して、好適な官能基または側鎖を介して他の残基へのアルキンの組み込みを促進できる。
アジド活性化アルキン「クリックケミストリー」
標準的なアジド−アルキン化学反応では、典型的には銅（Ｉ）のような触媒が必要とされる。触媒濃度の銅（Ｉ）は多くの生物学的系に有毒であることから、標準的なアジド−アルキン化学反応は、生細胞における用途が限られている。活性化アルキンに基づく銅を含まないクリックケミストリー系は、有毒な触媒を回避する。
活性化アルキンは、シクロオクチン類の形態を取り、シクロオクチル基に組み込まれて環歪みを生ずることもしばしばである。
Figure 2020501530
ヘテロ原子または置換基は、シクロオクチル環の様々な位置に導入することができ、これによって、アルキンの反応性が改変することも、あるいは化合物中に他の代替の化学的性質が付与することも可能となる。また、環上の様々な位置は、シクロオクチンを核酸鋳型化アセンブリ残基または連結基に連結するための結合点としての役目を果たし得る。環上のこれらの位置またはその置換基は、任意選択的に、補助基で更に誘導体化できる。
標準的な生体共役化学プロトコールと併用するのに適したいくつかの誘導体化バージョンを含む、複数のシクロオクチンが市販されている。市販のシクロオクチン誘導体化ヌクレオチドは、合成中にタンパク質フラグメントまたはポリヌクレオチドが好都合に取り込まれるのを促進する一助となり得る。
Figure 2020501530
アジド−ホスフィンスタイディンガー化学
また、アジドとホスフィンまたは亜リン酸エステルとの急速な反応に基づくＮ2の損失を伴う、シュタウディンガー還元も、生体直交型反応を表す。シュタウディンガー反応において反応物どうしの間に共有結合を形成するシュタウディンガーライゲーションは、核酸鋳型化アセンブリでの使用に適する。これらの反応で形成される産物の化学構造における多様な選択肢が、非無痕跡型形態及び無痕跡型形態のシュタウディンガーライゲーションの両方によって実現されている。
非無痕跡型シュタウディンガーライゲーション
標準シュタウディンガーライゲーションは、アジドとトリフェニルホスフィンのようなフェニル置換ホスフィンとの間の非無痕跡型反応である。メチルエステルなどのホスフィン上の求電子性トラップ置換基は、反応のアザ−イリド中間体と再配列して、ホスフィンオキシドを介して連結されたライゲーション産物を生成する。
また、求電子トラップを担持するフェニル置換ホスフィンも、容易に合成できる。誘導体化バージョンは、市販されており、ハプロマーへの組み込みに適している。
Figure 2020501530
無痕跡型シュタウディンガーライゲーション
いくつかの実施形態において、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションが可能なホスフィンは、ポリヌクレオチド及びタンパク質フラグメント用の生体直交型残基として利用され得る。無痕跡型反応において、ホスフィンは、アザ−イリド中間体の転位中に脱離基として機能し、典型的には天然アミド結合の形態でライゲーションを生ずる。無痕跡型シュタウディンガーライゲーションが可能な化合物は、チオエステル誘導体化ホスフィンまたはエステル誘導体化ホスフィンの形態を取るのが、一般的である。
無痕跡型シュタウディンガーライゲーション用の例示的なエステル誘導体化ホスフィンは以下の通り：
Figure 2020501530
 を有する化合物。
無痕跡型シュタウディンガーライゲーション用の例示的なチオエステル誘導体化ホスフィンは以下の通り：
Figure 2020501530
 を有する化合物。
上記構造中のＲ基への置換基として、化学連結基または補助基を任意に付加することが可能であり、それにより、ポリヌクレオチド、及びタンパク質フラグメントまたは反応物に対し追加的な機能性を導入するための結合点が提供される。
無痕跡型ホスフィノフェノールシュタウディンガーライゲーション
無痕跡型ホスフィノフェノール上の求電子性トラップエステルの配向は、非無痕跡型タウディンガーフェニルホスフィン化合物とは対照的に、フェニル基に対して逆さまになっている。これにより、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションがアジドとの反応で起こり、ホスフィンオキシドを含まずに産物中に天然アミド結合を生成することが可能になる。
Figure 2020501530
第三級アミンのような好適な親水性基がフェニルホスフィンに付加されている場合には、有機共溶媒を含まない水性媒体中で、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションを行うことができる。Ｗｅｉｓｂｒｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｘには、水溶性ホスフィノフェノールの調製に関する記載がある。この水溶性ホスフィノフェノールには、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などのエステル活性化剤を用い、穏やかなステグリッヒエステル化を介して、カルボン酸含有の所望のリガンド（ペプチドのＣ末端など）を充填できる。このアプローチによって促進されるハプロマーの合成形態は以下の通り：
Figure 2020501530
 （Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０１０，５，７８７−７８９）。
水溶性ホスフィノフェノール系の無痕跡型ハプロマー構造
無痕跡型ホスフィノメタンチオールシュタウディンガーライゲーション
ホスフィノメタンチオールは、無痕跡型シュタウディンガーライゲーション反応を媒介するためのホスフィノフェノールに対する代替物の代表例である。無痕跡型シュタウディンガー反応の媒介におけるホスフィノフェノール類と比べ、ホスフィノメタンチオールは、概ね有利な反応速度論を有する。米国特許出願公開第２０１０／００４８８６６号及びＴａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９，１１４２１−３０には、以下の形態の水溶性ホスフィノメタンチオールの調製について記載されている。
Figure 2020501530
これらの化合物に、活性化エステル形態にてペプチドまたは他のペイロードを充填することによって、無痕跡型の生体直交型反応基としての使用に適したチオエステルを形成することが可能である。
天然化学ライゲーション
天然化学ライゲーションは、チオエステルと、チオール及びアミンを有する化合物との間の反応に基づく生体直交型アプローチである。下記から分かるように、古典的な天然化学ライゲーションは、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドと、Ｎ末端システインを有する別のペプチドと、の間におけるものである。
Figure 2020501530
非標準アミノ酸が利用される場合、天然化学ライゲーションを利用して、無痕跡型反応を仲介して、内部システイン残基、または他のチオール残基含有のペプチドもしくはペプチド模倣物が製造される場合がある。
標準的なアミノ酸合成法により、Ｎ末端システインを取り込むことが可能である。末端チオエステルの生成を可能にする方法としては、当該技術分野において公知のいくつかの方法、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような薬剤を用いた活性化エステルとチオールとの縮合、または「セーフティ−キャッチ」支持樹脂を用いたペプチド合成中の導入が挙げられる。
他の選択的反応性残基
任意の好適な生体直交型反応化学は、複雑な生物学的環境において高度に選択的な方法で反応を効率的に媒介するものである限り、ハプロマータンパク質フラグメントの合成に利用できる。好適とされ得る代替の生体直交型化学で、最近開発されたものの例としては、限定されないが、テトラジン類と、ノルボルネン及びトランス−シクロオクテンのような種々のアルケン類との間の反応であり、この反応によって水性媒体中での生体直交型反応が効率的に媒介される。
上記構造中のＲ基への置換基として、化学連結基または補助基を任意に付加することが可能であり、それにより、ポリヌクレオチドもしくはタンパク質フラグメントに対し、または反応物に対し追加的な機能性を導入するための結合点が提供される。
実施例及び図に描かれているタンパク質フラグメントを含む配位は、逆さまにもできる。換言すれば、第２のハプロマーの５’末端にタンパク質フラグメントが連結されている限り、ボトルハプロマーの３’末端にタンパク質フラグメントを連結させることができる。５’に連結されたタンパク質フラグメントを有するボトルハプロマー、及び３’に連結されたタンパク質フラグメントを有する第２のハプロマーは、下掲の例に示す通りである。同様に、この系では、生体直交型残基を入れ替えることができる。例えば、５’−ヘキシニルを有するボトルハプロマー、及び３’−アジドを有する第２のハプロマーを用いる代わりに、アジド、及び第２のハプロマーであるヘキシニル基を、ボトルハプロマーに具備させてもよい。
いくつかの実施形態において、生体直交型残基は、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーの生体直交型残基はヘキシニルであり、且つ第２のハプロマーの生体直交型残基はアジドである。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーの生体直交型残基はアジドであり、且つ第２のハプロマーの生体直交型残基はヘキシニルである。
いくつかの実施形態において、鋳型化アセンブリを介して生成された目的タンパク質が応答を誘発し得るのは、標的区画内（例えば細胞内）、標的区画の表面（例えば細胞表面）、標的区画の近傍（例えば、エフェクター構造が細胞から活発に輸送された場合、細胞から漏出された場合、細胞死の際に剥離もしくは拡散された場合、または試料の離れた領域に運搬された場合である。いくつかの実施形態では、鋳型化アセンブリ産物に標的化基を組み込むことによって、目的タンパク質をその活性部位に標的化できる。標的化基の例としては、限定されないが、小胞体輸送シグナル、ゴルジ体輸送シグナル、核輸送シグナル、ミトコンドリア輸送シグナル、ユビキチン化モチーフ、他のプロテオソーム標的化モチーフ、及びグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーモチーフが挙げられる。標的化基は、合成中にハプロマー残基、化学連結基、または補助基に組み込むことによって導入することも可能であるし、あるいはライゲーション反応中に生成することも可能である。
いくつかの実施形態では、目的タンパク質を、標的区画の表面上に提示できる。いくつかの実施形態では、目的タンパク質を、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合したリガンドとしての細胞の表面上に提示できる。
いくつかの実施形態では、目的タンパク質を、内因性ペプチド、及びそれらの類似体、あるいは抗体などの薬剤の標的となる完全に合成の構造であり得る。標的核酸分子の利用可能性が、目的の活性タンパク質の産生を制限してしまう可能性があることから、低レベルで存在するときに活性を発揮する目的タンパク質を有することが所望される場合がある。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントは、レポータータンパク質、転写因子、シグナル伝達経路因子、遺伝子編集タンパク質、単鎖免疫グロブリン可変領域（ｓｃＦｖ）タンパク質、毒性タンパク質または酵素から誘導される。
いくつかの実施形態において、酵素は、β−ラクタマーゼ、コラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、制限酵素、ＤＮａｓｅ、またはＲＮａｓｅである。
いくつかの実施形態において、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、チョラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはβ−グルクロニダーゼである。
いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ＶＥＮＵＳ、ＣＦＰもしくは青色蛍光タンパク質、またはそれらの任意の類似体である。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、スーパーフォルダーＧＦＰである。いくつかの実施形態において、スーパーフォルダーＧＦＰのＮ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＭＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＲＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（配列ＩＤ番号：３３）を含む。いくつかの実施形態では、スーパーフォルダーＧＦＰのＣ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列ＩＤ番号：３４）を含む。いくつかの実施形態において、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）のフラグメントは、ＭＲＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（配列ＩＤ番号：３５）またはＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列ＩＤ番号：３４）を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと相互作用するようになっている。
いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはＫｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのＮ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＭＡＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＣＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＹ（配列ＩＤ番号：３６）を含む。いくつかの実施形態において、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのＣ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＺ（配列ＩＤ番号：３７）を含む。いくつかの実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのフラグメントは、ＭＡＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＣＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧ（配列ＩＤ番号：３８）またはＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列ＩＤ番号：３９）を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと相互作用するようになっている。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼのＮ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＭＫＰＴＥＮＮＥＤＦＮＩＶＡＶＡＳＮＦＡＴＴＤＬＤＡＤＲＧＫＬＰＧＫＫＬＰＬＥＶＬＫＥＭＥＡＮＡＲＫＡＧＣＴＲＧＣＬＩＣＬＳＨＩＫＣＴＰＫＭＫＫＦＩＰＧＲＣＨＴＹＥＧＤＫＥＳＡＱＧＧＩＧ（配列ＩＤ番号：４２）を含む。いくつかの実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼのＣ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＭＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤ（配列ＩＤ番号：４３）を含む。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性、殺微生物性、または殺ウイルス性のエフェクター構造との直接的な相互作用によって、標的細胞の殺傷または増殖阻害が誘発される場合がある。当該技術分野において、公知の多数の有毒分子を生成できる。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は有毒ペプチドまたは有毒タンパク質である。有毒ペプチドの例としては、限定されないが、蜂メリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、ＮＫ−リシンが挙げられる。毒性タンパク質の例としては、限定されないが、リシンＡ鎖、Ａｓｐｆ１、α−サルシン、ミトギリン、ヒルステリンＡ、ジフテリア毒素、ボツリヌスＡ毒素、及びコレラ毒素が挙げられる。いくつかの実施形態において、毒性タンパク質は、大型２８ＳリボソームＲＮＡを開裂させるリボトキシンである。
いくつかの実施形態では、目的プロアポトーシスタンパク質によって、標的細胞の殺傷または増殖阻害が誘発される場合がある。例えば、目的タンパク質としては、限定されないが、プロアポトーシスペプチド、例えば、プリオンタンパク質フラグメント１０６〜１２６（ＰｒＰ １０６〜１２６）、カスパーゼカスケードに関連するＢａｘから誘導された最小ポロペプチド（Ｂａｘ１０６〜１３４など）及びプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ）2が挙げられる。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、凝固カスケードタンパク質の様々な成分の活性化、タンパク質の活性化、血小板の活性化及び／または凝集、あるいは内皮損傷を誘発するという点で血栓形成性であり得る。このために、病原性細胞を含む領域を選択的に血栓化して腫瘍もしくは他の病原性細胞への血液供給を制限してしまう恐れのある、生物学的に活性なプロセスに至る可能性がある。また、それらの種類の目的タンパク質は、凝固を誘発することも、凝固を防止することも、あるいは標的病原細胞内及び周囲の血小板が活性化されて凝集するのを防止することもできる。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、免疫系に関連する分子、経路、または細胞の活性化によって、標的細胞もしくはウイルスの殺傷または増殖阻害を媒介し得る。目的タンパク質は、先天性免疫系、適応免疫系、及び／またはその両方に関与し得る。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、自然免疫系の刺激によって、細胞もしくはウイルスの殺傷または増殖阻害を媒介し得る。いくつかの実施形態では、目的タンパク質に、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、及びそれらの合成類似体が包含される。
いくつかの実施形態では、生来の免疫系には、補体系を活性化させる目的タンパク質が関与し得る。補体活性化エフェクター構造の非限定的な例は、補体タンパク質Ｃ３のＣ３ａフラグメントであり得る。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の天然または合成リガンドであり得る。そのような目的タンパク質の例としては、ＴＬＲアゴニストであることが公知である熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）のペプチドフラグメントが挙げられる。
いくつかの実施形態において、無痕跡型の生体直交型化学を用い、ＮＯＤ２受容体のムラミルジペプチドアゴニストを製造し、炎症反応を活性化することが可能になる。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、適応免疫系の分子または細胞の活性化によって、細胞もしくはウイルスの殺傷または増殖阻害を媒介し得る。適応免疫系に特有な、分子または細胞は、極めて多様な構造を認識するようにエンジニアリングを施すことが可能であり、それにより、目的タンパク質が本質的に活性であるかまたは内因性タンパク質に結合しなければならないという制約が取り除かれる。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、抗体または抗体フラグメント（限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖを含む）に対するリガンドであり得る。無痕跡型の生体直交型アプローチを使用すれば、既存の抗体を介して結合されるペプチドまたは他のエピトープを産生することも可能であるし、あるいは作製された目的タンパク質を認識するための抗体を開発することも可能である。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、細胞傷害性タンパク質、殺菌性タンパク質、殺ウイルス性タンパク質、プロアポトーシスタンパク質、血栓形成性タンパク質、補体活性化タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質またはその抗体もしくはその抗体フラグメントであり、第１のフラグメントと第２のフラグメントとの相互作用によって機能性タンパク質が生成される。
いくつかの実施形態において、細胞傷害性タンパク質は、ハチメリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、またはＮＫ−リシンである。いくつかの実施形態において、プロアポトーシスタンパク質は、プリオンタンパク質、カスパーゼカスケードと会合したＢａｘ由来最小ポロペプチド、またはプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ）2（配列ＩＤ番号：４０）である。いくつかの実施形態において、先天性免疫系刺激タンパク質は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）である。いくつかの実施形態において、補体活性化タンパク質は、補体タンパク質Ｃ３のＣ３ａフラグメントである。いくつかの実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）タンパク質は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）である。いくつかの実施形態において、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質はムラミルジペプチドアゴニストである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチン、βラクタマーゼまたは単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼのフラグメントであり、目的タンパク質の或るフラグメントがその目的タンパク質の他のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
いくつかの実施形態では、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のフラグメントは、そのアミノ酸１〜１０５または１０６〜１８６を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと相互作用するようになっている。
いくつかの実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンのフラグメントがそのアミノ酸１〜３４（ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥ；配列ＩＤ番号：５５）または３５〜７６（ＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ；配列ＩＤ番号：５６）を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと相互作用するようになっている。
いくつかの実施形態では、β−ラクタマーゼのフラグメントがそのアミノ酸２５〜１９７または１９８〜２８６を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと相互作用するようになっている。
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼのフラグメントがそのアミノ酸１〜２６５または２６６〜３７６を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと相互作用するようになっている。
いくつかの実施形態では、一般的なタンパク質分解分析（例えばＳＰ−ＴＡＰＥＲ）用の、目的タンパク質がどこで分断されるかに関する既存の情報が存在しない可能性がある。そのような事例において、タンパク質の三次元結晶構造の検査によって、タンパク質の機能に直接関係する領域から離れた表面ループ内及びターン内に、いくつかの候補標的が提供される場合がある。予測された標的部位における開裂によって生じたフラグメントは、例えば、好適な相互作用性ロイシンジッパーを有する融合タンパク質として別個に発現することでスクリーニング可能となり、この場合、分割タンパク質が正常に標的化されれば、融合タンパク質が混合された際にタンパク質の活性が回復する。経験的に好適な開裂部位にフラグ付けするためのより迅速なアッセイ溶解度アッセイ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１８，３９９−４０９を参照）、または好ましい円順列アッセイ（Ｍａｓｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，１６，９２１−９２６を参照）が利用可能である 。それらのアッセイは、構造的情報がなくても適用可能であるが、利用可能な場合には構造的知識によりガイドし、効率化できる。円順列アッセイ用に、最初に、２つのコピーの間に位置するセリン−グリシン連結基（［ＳＧＧＧＧ］3；配列ＩＤ番号：５７など）を用いて、目的のコード配列の縦列インフレーム連続二量体を生成する。次いで、好適なプライマーを用いた増幅によって、発現用に、二量体から円順列コード配列ブロックを作製する。
また、本開示には、本明細書に記載のハプロマー、ボトルハプロマー及び表面標的化合物のいずれか１つ以上を具備する本組成物またはキットも提供されている。
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、ａ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第１のハプロマーと、ｂ）Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第２のハプロマーとを具備し、ｉ）第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つｉｉ）Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し相補的であり、あるいはｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、あるいはｉｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいはｉｖ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの３’部分に対し実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含み、第１の３’ステム部分に対し実質的に対し実質的に相補的である第２の５’ステム部分であって、ｉ）ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、且つｉｉ）抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、第２の５’ステム部分と、ｂ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がシステイン−ＳＨ残基を含むＮ末端タンパク質フラグメントと、ｃ）ビスマレイミド試薬と、を含む。
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む、第２の５’ステム部分と、を具備するボトルハプロマーと、ｂ）ポリヌクレオチドとＣ末端タンパク質フラグメントとを含む第２のハプロマーであって、ポリヌクレオチドの３’末端が、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されており、Ｎ末端がシステインを含む、第２のハプロマーと、を具備し、ｉ）第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ｉｉ）抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つｉｉｉ）Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されるようになっている。
いくつかの実施形態では、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃である。いくつかの実施形態では、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態では、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmが、約４０℃〜約５０℃である。いくつかの実施形態では、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、約６０℃〜約８０℃である。いくつかの実施形態では、第２のハプロマーと第１もしくはボトルハプロマーの第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が、約０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態では、第２のハプロマーと第１もしくはボトルハプロマーの第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が、約５℃〜約１０℃である。いくつかの実施形態では、第２のハプロマーと第１もしくはボトルハプロマーの第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が、約３０℃〜約４０℃である。
いくつかの実施形態において、第１のステム部分は、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、抗標的ループ部分は、約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、第２のステム部分は、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む。
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、タンパク質シャペロン、小分子シャペロン、またはファーマコペロンを更に含む。いくつかの実施形態において、タンパク質シャペロンは熱ショックタンパク質である。いくつかの実施形態において、小分子シャペロンは、４−フェニルブチレート、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロルソ−デオキシコール酸、リゾホスファチジン酸、トレハロース、マンニトール、トリメチルアミンオキシド、ベタイン、またはジメチルスルホキシドである。
また、本開示には、融合タンパク質を２−メルカプトエタンスルフォン酸に接触させることと、ｂ）融合タンパク質をメチルテトラジン基を有するシステインに接触させることとを含み、それにより、融合タンパク質からＮ末端タンパク質フラグメントを剥離させる、融合タンパク質内のインテイン融合パートナーからＮ末端タンパク質フラグメントを開裂させる方法も提供されている。いくつかの実施形態において、メチルテトラジン基を有するシステインは、
Figure 2020501530
 である。
いくつかの実施形態において、本方法は更に、Ｎ末端タンパク質フラグメントと、５’または３’トランス−シクロオクテン基を有するポリヌクレオチドとを反応させることを含む。
また、本開示には、タンパク質の指向性アセンブリ用に、本明細書に記載のハプロマーのいずれかを使用する方法も、提供されている。
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、ｂ）細胞を、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、ｉ）第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、ｉｉ）Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つｉｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの３’部分に対し実質的に相補的であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることと、を含む。
いくつかの実施形態では、第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーのポリヌクレオチドは、第２のハプロマーがポリヌクレオチドの標的核酸分子に結合する部分に空間的に近接して、標的核酸分子に結合する。
いくつかの実施形態では、第１のハプロマーのタンパク質フラグメントが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接する核酸標的５’の一部に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのタンパク質フラグメントは、第２のハプロマーのポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドは、ステムループ構造に隣接した核酸標的３’の部分に実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、第１のハプロマーのタンパク質フラグメントは第１のハプロマーのポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第１のハプロマーのポリヌクレオチドは、標的核酸分子のステムループ構造のループ構造の５’部分に対し実質的に相補的であり、このループ構造の５’部分がステムループ構造のステム領域に隣接していて、且つ第２のハプロマーのタンパク質フラグメントは、第２のハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、核酸標的のステムループ構造のループ構造の３’部分に対し実質的に相補的であり、ループ構造の３’部分はステムループ構造のステム領域に隣接している。
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、ボトルハプロマーが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む、第２の５’ステム部分と、を具備する接触させることと、ｂ）ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ｉ）Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、ｉｉ）抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つｉｉｉ）第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、表面標的化合物が、ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチドであって、細胞表面分子に対するリガンドであるペプチドと、を具備する、接触させることと、ｂ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、ｃ）細胞を、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、ｉ）第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、ｉｉ）Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つｉｉｉ）第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、表面標的化合物が、ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチドであって、細胞表面分子に対するリガンドであるペプチドと、を具備する、接触させることと、ｂ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、ボトルハプロマーが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む、第２の５’ステム部分と、を具備する接触させることと、ｃ）ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ｉ）Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、ｉｉ）抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つｉｉｉ）第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む。
また、本開示には、本明細書に記載のハプロマーのいずれかを使用して、細胞または細胞標的分子を調節する方法も提供されている。哺乳動物またはヒトに対し対応するハプロマーのセットの投与は、治療が試みられる疾患、障害または症状の性質に応じて異なる場合がある。いくつかの実施形態では、ハプロマー及びボトルハプロマーを、好適な容器またはチャンバ内の試料に分取する場合もある。いくつかの実施形態では、既にハプロマーまたはボトルハプロマーを含有する容器に、試料を分取する場合もある。いくつかの実施形態では、ハプロマー及びボトルハプロマーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用される場合もあればまたはｉｎ ｓｉｔｕで使用される場合もある。いくつかの実施形態においてヒトに必要とされるのは、そのような治療である。
いくつかの実施形態では、鋳型化アセンブリ用にハプロマー及びボトルハプロマーがｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合がある。そのような治療を促進する目的で、調製されたハプロマー及びボトルハプロマーを、任意選択的に好適な送達剤を組み込み、ｅｘ ｖｉｖｏ法では哺乳動物もしくはヒトまたはその試料と接触させて、任意の好適な緩衝液または製剤中で投与してもよい。ハプロマー及びボトルハプロマーの濃縮形態は、その対応物であるハプロマー及びボトルハプロマーとは別個に取り扱うことができる。高濃度での産物生成反応は、標的核酸分子鋳型の非存在下で起こり得るからである。表１に、様々なハプロマー及びボトルハプロマーから構成される体操性（送達剤なし）ハプロマー及びボトルハプロマーの最大許容濃度に関するガイドラインを示す。ハプロマー及びボトルハプロマーをその閾値を超える濃度で接触させた場合、非鋳型化バックグラウンド反応が起こり得る。
Figure 2020501530
他のハプロマー及びボトルハプロマーの閾値濃度は、開示されている鋳型化アセンブリ診断評価アッセイを利用して経験的に算定できる。
いくつかの実施形態では、最初に１つのハプロマーを投与し、次いで時間遅延が観察された後、対応するハプロマーを投与して、１セットの対応するハプロマー及びボトルハプロマーを投与することによって、非鋳型反応の可能性を低減し得る。この時間遅延は、系内のハプロマーの持続性に応じて、１分〜数日の範囲に及ぶ場合がある。
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン、デキストラン系トランスフェクタントなどのトランスフェクション試薬、または当該技術分野において公知の他のものなどの特定の送達剤は、ハプロマーの縮合を引き起こし得る。これらの状況下で、ハプロマーを、対応する反応性ハプロマーとは別に調製して、別々に試料に投与してもよいし、また、任意の付加的な送達剤を加えることなしに、ハプロマーを適切な緩衝液中に溶解して、体操的に投与しても差し支えない。
また、ハプロマー及びボトルハプロマーを、好適な送達剤を用いて製剤化した後に投与することもできる。好適な送達剤は、ハプロマー及びボトルハプロマーの安定性、生物学的利用能、生体内分布、細胞透過性もしくは他の望ましい薬理学的特性、またはこれらの特性の組み合わせを増強できる。当該技術分野において公知の送達剤の例としては、限定されないが、ポリカチオントランスフェクション試薬、ポリエチレンイミン及びその誘導体、ＤＥＡＥ−デキストラン、他のトランスフェクション試薬、塩、イオン、緩衝剤、可溶化剤、各種ウイルスベクター、リポソーム、標的リポソーム、ナノ粒子、キャリアポリマー、エンドソーム破壊剤、透過処理剤、脂質、ステロイド、界面活性剤、分散剤、安定化剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
また、ハプロマー及びボトルハプロマーに補助基を共有結合することによって、標的コンパートメントに対するハプロマー及びボトルハプロマーの送達を増強できる。送達を増強し得る補助基としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化合物の安定性及び生体内分布を増強することが公知である化合物類、ハプロマーの細胞透過性を高める化合物類、例えば、当該分野において公知のコレステロール誘導体類、当該分野において公知のエンドソーム破壊剤類、ポリカチオン（例えば、ポリアルギニン、ポリリジン）などの細胞透過性ペプチド類、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質であるトランスポーターから誘導されたペプチド類、アンテナペディアタンパク質（ペネトラチン）から誘導されるペプチド類を挙げることができるが、これらに限定されない。
また、エフェクタータンパク質産物誘発剤、例えば、抗体もしくは他のエフェクタータンパク質産物検出分子またはエフェクタータンパク質産物検出細胞を投与することを、含めてもよい。この投与を、鋳型化アセンブリ手順の一環としてもよい。本剤は、ハプロマー及びボトルハプロマーの投与前、投与中、または投与後に、薬剤に適した任意の方法で、投与することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質産物誘発剤の投与後にハプロマー及びボトルハプロマーを投与することによって、エフェクタータンパク質が形成されて薬剤結合に利用可能になると直ちに、それらのエフェクタータンパク質によって活性の誘発が促進される。
いくつかの実施形態では、複数セットの対応するハプロマー及びボトルハプロマーを並行して投与する場合がある。これらのセットの反応物は、単一の標的核酸分子上の複数のハイブリダイゼーション部位に結合するか、または異なる標的核酸分子に結合するか、またはそれらの組み合わせであり得る。種々のセットのハプロマー及びボトルハプロマーは同じタンパク質構造を生成し、それにより、その生成を促進することでそのタンパク質構造で生成される活性のレベルを上昇させ、あるいは種々のセットのハプロマー及びボトルハプロマーによって異なるタンパク質構造を生成し、それにより、試料中に多価活性、またはそれらの組み合わせを生じ得る。
本明細書に記載の方法によるエフェクタータンパク質の産生は、免疫応答の誘発、プログラム細胞死、アポトーシス、壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、がん遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の修飾、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害、ならびにこれらの生物学的活性の組み合わせなどの活性をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、投与される組成物は、２セット以上の対応するハプロマー及びボトルハプマーのうち、２つ以上の標的核酸分子を標的化するものを含み得る。２つ以上の標的核酸分子が、同じ遺伝子転写物内に見出される場合もあれば、あるいは代替的に異なる別々の転写物上に見出される場合もある。同じ細胞転写物内の別個の核酸標的分子を認識する２セット以上の対応するハプロマー及びボトルハプロマーは独立に、同じまたは異なるタンパク質を産生し得る。
また、標的核酸分子が多量の場合は、鋳型化アセンブリによって産生される活性タンパク質の量が制限されてしまう可能性がある。いくつかの実施形態では、標的区画当たり少なくとも平均５コピーの標的核酸分子が存在する。投与される組成物の投薬量及び濃度に関して、標的核酸分子の利用可能性が考慮される場合がある。
いくつかの実施形態では、ハプロマー及びボトルハプロマー、またはそれらのうちの１セット以上を含む組成物を病原性細胞に送達する方法が、開示されている。本方法には、治療上有効量の１セットまたは複数セットの対応するハプロマー及びボトルハプロマー組成物を病原性細胞に投与することを、含める場合もある。また、いくつかの実施形態では、標的核酸分子の存在または非存在を検出した後、ハプロマー及びボトルハプロマー組成物を投与することを本方法に含める場合もある。
医薬組成物は、以下の経路：経口、局所、全身（例えば、経皮、鼻腔内、または坐剤）、または非経口（例えば、筋肉内、皮下、または静脈内注射）のうちの１つを介して投与できる。本組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアロゾル剤、または任意の他の適切な組成物の形態を取る場合もあれば、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて少なくとも１つの化合物を含む場合もある。好適な賦形剤は当業者に周知であり、且つ本組成物の処方方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａなどの標準的な参考文献に見出すことができる。特に注射用溶液に好適な液体担体には、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、及びグリコールが含まれる。
注射用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液、及び滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含み得る。あらゆる場合において、本組成物は無菌である必要があると共に、容易な注射可能性が存在する程度に流動的である必要がある。本組成物は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならないと共に、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。好適な流動性を維持する手段としては、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用が挙げられる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって達成できる。多くの事例では、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール類、及び塩化ナトリウムを含める場合がある。組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって、注射用組成物の持続的吸収を実現できる。
滅菌注射用溶液は、ハプロマー及びボトルハプロマーを含有する組成物を、上記諸成分のうちの１成分または成分の組み合わせと共に好適な量で、適切な溶媒中に組み込むことによって調製できる。概して、分散液は、基本分散媒と、上記諸成分中の他の所要成分とを含有する滅菌ビヒクル中に、組成物を組み込むことによって調製される。
上記のように、ハプロマー及びボトルハプロマーを含有する組成物が好適に保護されている場合、本組成物を経口投与用に、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に処方できる。また、本組成物及び他の成分を、硬殻中もしくは軟殻ゼラチンカプセル中に封入することも、錠剤のかたちに圧縮することも、あるいは被験者の食事に直接組み込むこともできる。経口治療投与用に、本組成物を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用してもよい。本組成物及び調製物の割合は、当然のことながら、変動する場合もある。そのような治療上有用な組成物中のハプロマー及びボトルハプロマーの量は、好適な投薬量が得られるように適合されている。
投薬の容易さ及び投与量の均一性を期して、組成物を投薬単位形態で処方することが有利な場合もある。各投薬単位形態は、所定量のハプロマーとボトルハプロマーとを含み、これらは、医薬担体に関連する活性エフェクター産物の量が求められるように計算されている。新規な投薬単位形態の仕様は、標的化の対象となる鋳型化アセンブリ組成物の独特の特徴、及び達成すべき特定の療法効果に依存する。投薬量は、通常の用量、及び成分の投与様式を参照することによって決定される。
ハプロマー及びボトルハプロマーは、本組成物中に担体を組み込み、許容されない生物学的効果を引き起こすことなしに、または組成物の他の成分と許容されない方法で相互作用することなしに、担体を患者に投与できるような、医薬的に許容される担体を含み得る。そのような医薬的に許容される担体は典型的に、毒物学的試験及び製造試験の必要基準を満たし、米国食品医薬品局によって好適な不活性成分として同定された材料を具備する。
また、ハプロマー及びボトルハプロマーを、医薬的に許容される塩として調製することも可能である。そのような塩は、例えば、哺乳動物などの患者に投与する目的に許容される塩基または酸から調製される塩（例えば、所与の投薬レジームで、許容される哺乳動物に対し安全性が確保される塩）であり得る。但し、了解されるように、本明細書中で扱われている塩は、必ずしも医薬的に許容される塩（例えば、患者への投与にはふさわしくないハプロマーの塩）でなくてもよい。医薬的に許容される塩は、医薬的に許容される無機塩基または有機塩基から、及び医薬的に許容される無機酸または有機酸から誘導できる。加えて、アミンのような塩基性残基と、カルボン酸のような酸性残基と、の両方がハプロマーに含有される場合、双性イオンが形成される可能性があり、この双性イオンは、本明細書中に用いられている「塩」という用語に組み込まれる。医薬的に許容される無機塩基から誘導される塩には、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛の塩などが包含される場合がある。医薬的に許容される有機塩基から誘導される塩としては、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペラジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのような、置換アミン、環式アミン、天然起源のアミンならびにそれらに類するものをはじめとする、一級、二級及び三級アミンの塩を挙げることができる。医薬的に許容される無機酸から誘導される塩としては、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸またはヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸及び硫酸の塩を挙げることができる。医薬的に許容される有機酸から誘導される塩としては、脂肪族ヒドロキシル酸の塩（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸及び酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸及びトリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチシン酸、馬尿酸及びトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸及び３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸及びコハク酸）、グルコロン酸、マンデル酸、粘液酸、ニコチン酸、オロト酸、パモ酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、エジシル酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸などが挙げられる。
本明細書に記載のプロセスによって、生成されるエフェクタータンパク質は、所望される作用を駆動するトリガーである。所望されるタンパク質活性のいくつかの例としては、限定されないが、免疫応答の誘発、プログラム細胞死、アポトーシス、非特異的壊死またはプログラム壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、がん遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の修飾、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害、ならびにこれらの生物学的活性の組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質は、病原性細胞の部位で免疫応答を誘発するための抗体に対するリガンドとして、または治療有効量を担持する抗体などの抗体指向性治療を病原性細胞の部位に局在化させるための抗体に対するリガンドとして機能し得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質は、標的遺伝子の発現を調節し得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質は、酵素活性、遺伝子／タンパク質発現、分子シグナル伝達、及び分子間相互作用を制御し得る。
以下のような代表的な実施形態が提示されている。
実施形態１
ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｂ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、且つ
抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、第２の５’ステム部分とを具備する、ボトルハプロマー。
実施形態２
ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｂ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｃ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
ポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端、またはＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結され、ポリヌクレオチドにライニング（ｌｉｎｅｄ）されたタンパク質フラグメントの末端がシステインまたはセレノシステインを含む、第２の５’ステム部分とを具備する、ボトルハプロマー。
実施形態３
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃である、実施形態１または実施形態２に記載のボトルハプロマー。
実施形態４
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmが、約４０℃〜約５０℃である、実施形態１〜３のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態５
抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが約６０℃〜約８０℃である、実施形態１〜４のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態６
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約２０℃である、実施形態１〜５に記載のボトルハプロマー。
実施形態７
第１のステム部分が約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、実施形態１〜６のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態８
抗標的ループ部分が約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含む、実施形態１〜７のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態９
第２のステム部分が約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、実施形態１〜８のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態１０
第１のステム部分、抗標的ループ部分、及び第２のステム部分のうちのいずれか１つ以上のヌクレオチド塩基が、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ類）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１〜９のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態１１
第１のステム部分と抗標的ループ部分との間、または抗標的ループ部分と第２のステム部分との間、のうちのいずれか１つ以上の間の連結基を更に含む、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
実施形態１２
連結基がアルキル基、アルケニル基、アミド、エステル、チオエステル、ケトン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン、ウレタン、アゾール、イミン、ハロアルキル及びカルバメート、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１１に記載のボトルハプロマー。
実施形態１３
ａ）ポリヌクレオチドと、ｂ）ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端もしくはＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結された、Ｎ末端タンパク質フラグメントまたはＣ末端タンパク質フラグメントと、を含むハプロマーであって、
Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧ（配列ＩＤ番号：１）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧ（配列ＩＤ番号：３）を含み、Ｃ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列ＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫ（配列ＩＤ番号：５）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：６）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤ（配列ＩＤ番号：７）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：８）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧ（配列ＩＤ番号：９）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤ（配列ＩＤ番号：１１）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１２）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱ（配列ＩＤ番号：１３）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１４）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧ（配列ＩＤ番号：１５）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１６）を含み、Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮ（配列ＩＤ番号：１７）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１８）を含み、あるいはＮ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴ；（配列ＩＤ番号：４０）を含み、Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４１）を含む、ハプロマー。
実施形態１４
ａ）鋳型ポリヌクレオチドと、
ｂ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチドとこのペプチドが細胞表面分子に対するリガンドである、表面標的化合物。
実施形態１５
リガンドがペプチドホルモンまたは神経ペプチドである、実施形態１４に記載の表面標的化合物。
実施形態１６
ペプチドホルモンが、α−ＭＳＨ、アミリン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、アトリオペプチド、ヒト成長ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、インヒビン、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレシン、血管作用性腸管ペプチド、ガストリン、セクレチン、胃抑制性ポリペプチド、モチリン、ヘプシジン、レニン、リラキシン、グレリン、レプチン、リポトロピン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、ブラジキニン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、グルカゴン様ペプチドＩ、膵臓ポリペプチド、ベータトロフィン、コレシストキニン、エンドセリン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤ラクトゲン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、及び下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドからなる群から選択される、実施形態１５に記載の表面標的化合物。
実施形態１７
神経ペプチドが、神経ペプチドＹ、エンドルフィン、エンセファリン、脳性ナトリウム利尿ペプチド、タキキニン、コルチスタチン、ガラニン、オレキシン、及びオキシトシンからなる群から選択される、実施形態１５に記載の表面標的化合物。
実施形態１８
ヌクレオチド配列ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣ（配列ＩＤ番号：２０）を含み、ペプチドがアミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２１）、ＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２２）、ＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２３）、またはＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２４）を含み、Ｘがノルロイシンであり、Ｆ残基がＤ−フェニルアラニンである、実施形態１４に記載の表面標的化合物。
実施形態１９
Ｎ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と精製ドメインとを含む融合タンパク質であって、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端が融合パートナータンパク質のＮ末端にカップリングされ、且つ融合パートナータンパク質のＣ末端が精製ドメインのＮ末端にカップリングされるか、またはＮ末端タンパク質フラグメント、融合パートナータンパク質及び開裂部位にカップリングされ、融合パートナータンパク質のＣ末端が開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニンとＣ末端システインとを含むか、またはＣ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と開裂部位とを含み、融合パートナータンパク質のＣ末端が開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む、融合タンパク質。
実施形態２０
Ｎ末端タンパク質フラグメントとインテインとキチン結合ドメインとを含み、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がインテインのＮ末端にカップリングされ、且つインテインのＣ末端がキチン結合ドメインのＮ末端にカップリングされるか、またはＮ末端タンパク質フラグメント、マルトース結合タンパク質及びエンテロキナーゼ開裂部位にカップリングされ、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つエンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニンとＣ末端システインを含むか、またはＣ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つエンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む、実施形態１９に記載の融合タンパク質。
実施形態２１
Ｎ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つエンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、Ｎ末端タンパク質フラグメントがアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＣ（配列ＩＤ番号：２５）を含む、実施形態２０に記載の融合タンパク質。
実施形態２２
Ｃ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、且つＣ末端タンパク質フラグメントがアミノ酸配列ＣＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２６）を含む、実施形態１９に記載の融合タンパク質。
実施形態２３
次式：
Figure 2020501530
 （式中、ｎは約３〜約６である）を有する化合物。
実施形態２４
ａ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第１のハプロマーと、ｂ）Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第２のハプロマーと、を含み、
第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの３’部分に対し実質的に相補的である、キットまたは組成物。
実施形態２５
ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、且つ
抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、第２の５’ステム部分と、ｂ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がシステイン−ＳＨ残基を含むＮ末端タンパク質フラグメントと、ｃ）ビスマレイミド試薬と、を含む組成物またはキット。
実施形態２６
ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、このポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む、第２の５’ステム部分と、を具備するボトルハプロマーと、ｂ）ポリヌクレオチドとＣ末端タンパク質フラグメントとを含む第２のハプロマーであって、ポリヌクレオチドの３’末端が、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されており、Ｎ末端がシステインを含む、第２のハプロマーと、を具備し、
第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導される、
キットまたは組成物。
実施形態２７
ハプロマーのヌクレオチド塩基、またはボトルハプロマーの第１のステム部分、アンチターゲットループ部分、及び第２のステム部分のいずれか１つ以上が、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、
２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ類）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２４〜２６のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態２８
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃である、実施形態２５または実施形態２６に記載のキットまたは組成物。
実施形態２９
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmが、約４０℃〜約５０℃である、実施形態２５〜２８のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態３０
抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが約６０℃〜約８０℃である、実施形態２５〜２９のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態３１
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約２０℃である、実施形態２５〜３０のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態３２
第１のステム部分が約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、実施形態２５〜３１のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態３３
抗標的ループ部分が約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含む、実施形態２５〜３２のいずれか一項に記載のキットまたは組成物
実施形態３４
第２のステム部分が約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、実施形態２５〜３３のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態３５
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃である、実施形態２６に記載の組成物またはキット。
実施形態３６
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmが約３０℃〜約４０℃である、実施形態２６に記載の組成物またはキット。
実施形態３７
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約５℃〜約１０℃である、実施形態２６に記載の組成物またはキット。
実施形態３８
ポリヌクレオチド及びタンパク質フラグメントがそれぞれ生体直交型反応性分子を含む、実施形態２４〜３７のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態３９
生体直交型反応性分子が、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体である、実施形態３８に記載の組成物またはキット。
実施形態４０
第１のステム部分と抗標的ループ部分との間、または抗標的ループ部分と第２のステム部分との間、のうちのいずれか１つ以上の間の連結基を更に含む、実施形態２５〜３９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
実施形態４１
連結基が、アルキル基、アルケニル基、アミド、エステル、チオエステル、ケトン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン、ウレタン、アゾール、イミン、ハロアルキル、ニトリロ三酢酸、ニッケル、コバルト、銅、及びカルバメート、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態４０に記載のキットまたは組成物。
実施形態４２
抗標的ループ部分が、内部ヒンジ領域を更に含み、このヒンジ領域が、標的核酸分子に対し相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含む、実施形態２５〜４１のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
実施形態４３
ヒンジ領域が約１ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む、実施形態４２に記載のキットまたは組成物。
実施形態４４
Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが、レポータータンパク質、転写因子、シグナル伝達経路因子、遺伝子編集タンパク質、単鎖免疫グロブリン可変領域（ｓｃＦｖ）タンパク質、毒性タンパク質または酵素から誘導される、実施形態１〜１４、１９〜２２、または２４〜４３のいずれか一項に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態４５
酵素が、β−ラクタマーゼ、コラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、制限酵素、ＤＮａｓｅ、またはＲＮａｓｅである、実施形態４４に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態４６
レポータータンパク質が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、チョラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはβ−グルクロニダーゼである、実施形態４４に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態４７
蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｓＲｅｄ、ＶＥＮＵＳ、ＣＦＰもしくは青色蛍光タンパク質、またはそれらの任意の類似体である、実施形態４６に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態４８
蛍光タンパク質がスーパーフォルダーＧＦＰである、実施形態４６に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態４９
スーパーフォルダーＧＦＰのＮ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＭＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧ
ＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＲＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（配列ＩＤ番号：３３）を含む、実施形態４８に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５０
スーパーフォルダーＧＦＰのＣ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列ＩＤ番号：３４）である、実施形態４８に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５１
ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはＧａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼである、実施形態４６に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５２
ルシフェラーゼが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである、実施形態５１に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５３
ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのＮ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＭＡＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＣＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＹ（配列ＩＤ番号：３６）を含む、実施形態５２に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５４
ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのＣ末端フラグメントが、そのアミノ酸配列ＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＺ（配列ＩＤ番号：３７）を含む、実施形態５２に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５５
毒性タンパク質が、リシンＡ鎖、Ａｓｐｆ１、α−サルシン、ミトギリン、ヒルステリンＡ、ジフテリア毒素、ボツリヌスＡ毒素、またはコレラ毒素である、実施形態４４に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５６
毒性タンパク質は、大型２８ＳリボソームＲＮＡを開裂させるリボトキシンである、実施形態４４に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５７
標的核酸分子が、細胞性核酸分子、腫瘍特異的核酸分子、異常免疫経路核酸分子、または表面標的化合物のポリヌクレオチドである、実施形態１〜１４、１９〜２２、または２４〜４３のいずれか一項に記載のハプロマー、ボトルハプロマー、融合タンパク質、またはキットもしくは組成物。
実施形態５８
タンパク質シャペロン、小分子シャペロンまたはファーマコペロンを更に含む、実施形態２４〜４３のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
実施形態５９
タンパク質シャペロンが熱ショックタンパク質である、実施形態５８に記載の組成物またはキット。
実施形態６０
小分子シャペロンは、４−フェニルブチレート、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロルソ−デオキシコール酸、リゾホスファチジン酸、トレハロース、マンニトール、トリメチルアミンオキシド、ベタイン、またはジメチルスルホキシドである、実施形態５８に記載の組成物またはキット。
実施形態６１
融合パートナータンパク質が、インテイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはＯｍｐＦである、実施形態１９〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
実施形態６２
開裂部位が、エンテロキナーゼ開裂部位、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位である、実施形態１９〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
実施形態６３
第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位が、ＩＥＧＲ（配列ＩＤ番号：２７）である、実施形態６２に記載の融合タンパク質。
実施形態６４
精製ドメインが、キチン結合ドメインまたはヘキサヒスチジンタグである、実施形態１９〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
実施形態６５
細胞内のタンパク質の指向性アセンブリ方法であって、ａ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、ｂ）細胞を、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、
第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいは第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの３’部分に対し実質的に相補的であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、方法。
実施形態６６
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、ａ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、ボトルハプロマーが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む、第２の５’ステム部分と、を具備する接触させることと、ｂ）ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、方法。
実施形態６７
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、表面標的化合物が、ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチド、
またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチドであって、
細胞表面分子に対するリガンドであるペプチドとを具備する、接触させることと、ｂ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、ｃ）細胞をＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、
第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、且つ第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にてタンパク質フラグメントに連結され、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、方法。
実施形態６８
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、表面標的化合物が、ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、ｉｉ）ポリヌクレオチドの５’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、またはポリヌクレオチドの３’末端がペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされたペプチドであって、細胞表面分子に対するリガンドであるペプチドとを具備する、接触させることと、ｂ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、ボトルハプロマーが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、ｉｉ）第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である、抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、第１の３’ステム部分が第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、Ｃ末端がシステインを含む、第２の５’ステム部分と、を具備する接触させることと、ｃ）ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
第２のハプロマーと、ボトルハプロマーの第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、それにより、結果として、Ｎ末端タンパク質フラグメント及びＣ末端タンパク質フラグメントからタンパク質のアセンブリを生ずる、接触させることとを含む、方法。
実施形態６９
融合タンパク質内のインテイン融合パートナーからＮ末端タンパク質フラグメントを開裂させる方法であって、
ａ）融合タンパク質を２−メルカプトエタンスルフォン酸に接触させることと、
ｂ）融合タンパク質をメチルテトラジン基を有するシステインに接触させることとを含み、それにより、融合タンパク質からＮ末端タンパク質フラグメントを剥離させる、方法。
実施形態７０
メチルテトラジン基を有するシステインが、
Figure 2020501530
 である、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１
Ｎ末端タンパク質フラグメントと、５’または３’トランス−シクロオクテン基を有するポリヌクレオチドとを反応させることを更に含む、実施形態６９に記載の方法。
本明細書中に開示されている主題をより効率的に理解できるように、以下に実施例を提供する。これらの実施例は、もっぱら例証のみを目的としたものであり、いかなる方法によっても、請求対象となる主題を限定するものと解釈すべきではないことを理解する必要がある。別段の定めがない限り、これらの実施例全体を通して、市販の試薬を用い、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法に従って分子クローニング反応及び他の標準的な組み換えＤＮＡテクニックを遂行した。
実施例１：
インテインベースの系におけるタンパク質溶解度 − Ｎ末端ｓｆＧＦＰフラグメントの発現
ＳＰ−ＴＡＰＥＲを実装することによって、核酸タグとの共役に先立って、目的タンパク質全体の所定ポリペプチドフラグメントの発現が実現される。この目的に合わせて、好適な細菌発現系の、所要分割タンパク質フラグメントを評価する。原核生物系における発現の成功の一態様は、タンパク質の溶解度の維持である。不溶性封入体は多くの場合、再可溶化できるが、可能な限り、多大な時間を要するステップを回避することが好ましい。
初期のＳＰ−ＴＡＰＥＲ：ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ用に、２つの別々のレポータータンパク質を考慮に入れた。ｓｆＧＦＰタンパク質を、ループ領域の部位にて、１５７及び８１アミノ酸残基のＮ末端フラグメントならびにＣ末端フラグメントそれぞれに分けた。従来のタンパク質相補性アッセイと適合する開裂部位を対象とした以前のスクリーニングに基づいて、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを、２２９及び８１残基のＮ末端フラグメントならびにＣ末端フラグメントにそれぞれ分けた（Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０３，７５，１５８４−１５８９）。
ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方のモデル系において、選択されたＮ末端フラグメントは、それらの対応するＣ末端フラグメントより有意に長かった。原核生物の発現系におけるタンパク質フラグメントの不溶性は複数の要因による影響を受けるが、発現したフラグメントが長いほど、疎水性領域（通常は正しく折り畳まれた全長タンパク質が詰め込まれている）が含まれる可能性が高くなる。したがって、インテインベースの発現系では、最初により長いｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａ Ｎ末端フラグメントを調べた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化された各フラグメントのコード配列を、インテインベースの発現ベクターｐＴＸＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＮｄｅ Ｉ／Ｓａｐ Ｉクローニング部位に挿入し、それにより、正しい接合配列及びリーディングフレームを生成して、所望のコード配列を、開裂性インテインドメイン配列との５’インフレーム融合物としてクローニングしてから、親和性選択可能なキチン結合ドメインのコード配列と融合させた（候補クローンの配列決定により確証した）。
検証されたプラスミドクローンをＥ．ｃｏｌｉ株Ｔ７−ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランセクトし、液体培養物（５０ｍｌ）中で短期間の増殖条件下、３７℃で１．５時間増殖させてから、更に２時間４００μＭのＩＰＴＧで誘導させた。試料（２００μｌの「直接溶解物」）を入手し、１．５ｍｌのチューブに１０００ｇでペレット化して、２００μｌの１×ＰＢＳで１回洗浄してから、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。残りの５０ｍｌの増殖物を（Ｓｏｒｖａｌｌベンチトップ遠心分離機で１０分／３０００ｒｐｍ）ペレット化し、２．０ｍｌのエッペンドルフチューブで、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ３８４０）を含む氷冷ＴＸＢカラム緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）１．５ｍｌ中に再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を超音波処理した（各超音波処理ラウンドの間に冷却しながら、６×５秒パルス、５設定、Ｂｒａｎｓｏｎ ４５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した（ベンチトップ微量溶液）、上清を新しいチューブに移した。
上記の上清試料及び直接溶解物試料（５０μｌ）を等容量の標準２×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ溶解緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合し、試料を１００℃で５分間加熱した。次いで、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（５μｌ／レーン；「ａｎｙ−ｋＤ」ＴＧＸゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に充填し、固定して、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ（Ｔｈｅｒｍｏ）で一晩染色した。脱色後、ゲルをＵＶトランスイルミネーターで可視化した。Ｒｅｎｅｌｌａバンド強度はｓｆＧＦＰの場合よりもかなり小さかったが、ＩＰＴＧ誘導培養物の全細胞溶解物試料において、ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼＮ末端融合フラグメントの両方は、予期された分子量で観察された（図１１を参照）。超音波処理後、清澄な上清中でｓｆＧＦＰバンドは容易に観察されたのに対し、Ｒｅｎｉｌｌａバンドはまったく観察されなかった。これらの結果から、このインテインベースの系は、使用された条件下では、Ｒｅｎｉｌｌａフラグメントの発現との適合性が劣ることが明らかにされた。他方、ｓｆＧＦＰ Ｎ末端フラグメントは可溶性であり、良好な収率で発現し、特異的共役体の調製に向けての更なるプロセシングと適合した。
実施例２：
Ｎ末端ｓｆＧＦＰ−インテイン融合、及び固相からのインテイン媒介開裂のアフィニティ精製
インテインベースの系において融合タンパク質として発現したときのＮ末端ｓｆＧＦＰフラグメントの溶解度（実施例１に記載）から示唆されたように、遊離Ｎ末端フラグメント自体の調製について更に検討することが適切であった。融合タンパク質のキチン結合ドメインセグメント（図１１を参照）を用い、Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株中のＮ末端ｓｆＧＦＰ−インテイン−キチン結合ドメイン融合体をコードするプラスミドの複製５０ｍｌを増殖させるという方法で、全細胞超音波処理上清中の可溶性Ｎ末端ｓｆＧＦＰ融合フラグメントをキチン磁気ビーズ（ＣＭＢ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に結合させてから、１００μＭのＩＰＴＧで誘導させて全細胞溶解物試料を得た。超音波処理された清澄化上清を続いて調製し、これらの初期ステップは、実施例１と同様の方法で実施した。好適な量のＣＭＢ（それぞれ１００μｌのビーズスラリー含有のチューブ２本）を０．５ｍｌの氷冷ＴＸＢ緩衝液で２回洗浄し（ビーズの磁気分離を使用）（実施例１を参照）、続いて、元の容量（１００μｌ）のＴＸＢ緩衝液中に再懸濁させた。Ｎ末端ｓｆＧＦＰ融合タンパク質の誘導超音波処理上清１．２５ｍｌを各チューブに加え、頻繁にチューブを混合用に反転させながら、４℃で１時間インキュベートした。この後、ビーズを磁気的に分離させ、上清を除去してから、ビーズをＴＸＢ緩衝液で３回洗浄した後、最終的に同じ緩衝液に溶かした最終総容量２００μｌの懸濁液中にプールさせた。
次いで、融合タンパク質のキチン結合ドメインを介してキチン磁気ビーズ上に残存した材料を一連の処理に供し、単離されたＮ末端ｓｆＧＦＰフラグメントを調製するための最適な手段を調べた。この系では、適切なチオール試薬を用いインサートポリペプチド接合部におけるインテインを活性化することによって、所望のポリペプチドフラグメントが開裂して剥離し得る一方、インテイン−キチン結合ドメインセグメントはキチンビーズに結合されたままの状態に維持される。この目的に対応するように、多くの場合、試薬２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）が使用される。インテイン開裂産物の溶解度及び他の性質は、塩化ナトリウム濃度を変えることによって調節できる。したがって、Ｎ末端ｓｆＧＦＰ融合体を有するキチンビーズを、２５℃で１６時間のインキュベーションを伴ういくつかのＭＥＳＮＡ／塩条件で試験した。各実験条件について、洗浄した２０μｌキチン磁気ビーズ／融合タンパク質スラリーを、総容量４０μｌで使用した。インキュベーション時間の終了時に、上清を磁気的に取り除いた。ビーズペレットを保持し、ＴＸＢ緩衝液０．５ｍｌで２回洗浄した後、同じ緩衝液３０μｌ中で再構成した。全ての事例において、試料２５μｌまたは３０μｌを等量の２ＸＬａｅｍｍｌｉＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と混合し、１００℃で５分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に試料５μｌをロードする。
この代表的な実施例では、全細胞溶解物中でのｓｆＧＦＰ融合の誘導、及び可溶性融合を含む上清の誘導が達成された（図１２のレーン１及びレーン２を参照）。Ｎ末端ｓｆＧＦＰ融合を有するキチンビーズをＴＣＢ緩衝液中で一晩インキュベートした後、タンパク質の非特異的溶出は観察されなかった。但し、低レベルの自発的に開裂されたインテイン−キチン結合ドメイン（約２８ｋＤ）及びＮ末端ｓｆＧＦＰ（約１７ｋＤ）はビーズと結合したままの状態に維持された（図１２のレーンａＳ／ａＰを参照）。一般的に使用されている１０ｍＭ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）よりも高濃度のＭＥＳＮＡの方が、可溶性上清中に開裂Ｎ末端ｓｆＧＦＰフラグメントを産生する効果に優れていた（レーンセットｂ（１０ｍＭ ＭＥＳＮＡ）対レーンセットｃ（７５ｍＭ ＭＥＳＮＡ）を参照）。これらのＭＥＳＮＡをインキュベーションしている間、かなりの量のインテイン−キチン結合ドメインがビーズから溶出し、予期された剥離済Ｎ末端ｓｆＧＦＰフラグメントも溶出した。しかしながら、この所望されない効果は、塩化ナトリウムの濃度を上昇させることによって、抑制できた（レーンセットｆ（７５ｍＭ ＭＥＳＮＡ／１．４Ｍ ＮａＣｌ）対レーンセットｇ（７５ｍＭ ＭＥＳＮＡ／２．３Ｍ ＮａＣｌ）を参照）。
これらの結果から示唆されるように、Ｎ末端ｓｆＧＦＰフラグメントがインテインベースの系によってうまく調製できる。しかも、上記のように、メチルテトラジン基を有する修飾システインによって、オリゴヌクレオチドとのＣ末端共役ストラテジーを提供する。
実施例３：
マルトース結合タンパク質融合体としてのＣ末端ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａフラグメントの発現及び精製、ならびにエンテロキナーゼによるフラグメントの開裂
ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方のＣ末端フラグメントの発現、ならびにそのような産物のＮ末端（Ｎ*）の標識化に関しては、マルトース結合タンパク質を用いた代替の発現系の方が、実施例１及び実施例２のインテイン系よりも技術的な利便性に優れていた。マルトース結合タンパク質は、実施例１及び実施例２のインテイン系よりも技術的な利便性に優れていた。加えて、モデルタンパク質ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの場合には、どちらも選択されたＣ末端セグメント内にシステイン残基を有さないため、Ｎ末端システインの挿入によるオリゴヌクレオチドの共役は、容易な選択肢となる。
各Ｃ末端セグメント（実施例１に記載されているような境界）ごとのコード配列は、所望されるＮ末端位置にシステインコドンを具備し、更に、エンテロキナーゼ認識シグナル（ＤＤＤＤＫのコドン；配列ＩＤ番号：４４）を供給されることにより、発現後にＣ末端フラグメントがマルトース結合担体タンパク質から開裂可能である。アセンブルされた配列をｐＭＡＬｃ５ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＸｍｎ Ｉ部位とＳｂｆ Ｉ部位との間にクローニングし、候補クローンの構造を配列決定により確証した。検証されたクローンを株ＮＥＢ−ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換し、液体培養物（５０ｍｌ）中で短期間の増殖条件下、３７℃で１．５時間増殖させてから、更に２時間３００μＭのＩＰＴＧで誘導させた。試料（「直接溶解物」２００μｌ）を採取し、１．５ｍｌのチューブで１０００ｇにてペレット化し、２００μｌの１×ＰＢＳで１回洗浄してから、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。残りの５０ｍｌの増殖物を（Ｓｏｒｖａｌｌベンチトップ遠心分離機で１０分／３０００ｒｐｍ）ペレット化し、氷冷マルトース結合タンパク質系カラム緩衝液（ＭＣ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴ）１．５ｍｌ中に２．０ｍｌエッペンドルフチューブに再懸濁させ、次いで、実施例１で使用したのと同じ条件で、超音波処理し、清澄化して、可溶性上清を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、そのような上清は、予期された分子量の強力なバンドを呈した（ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａ調製物についてはそれぞれ図１３のレーンＧ及びレーンＲを参照）。これらのモデルレポータータンパク質のＣ末端フラグメントは、分子量が類似している（ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａではそれぞれ９．１及び９．４ｋＤ）。それゆえ、両方のフラグメントに対して観察されたＭＢＰ融合タンパク質バンドは、予期されたサイズ約５１ｋＤで遊送する（図１３を参照）。
マルトース結合タンパク質との融合物として発現したポリペプチドを、アミロース磁気ビーズ（Ａ−ＭＢ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）上でアフィニティ精製した。Ａ−ＭＢの好適な試料（通常、上清１ｍｌ当たり２５０μｌの元のスラリーと等量）を、１ｍｌの冷ＭＣ緩衝液で２回洗浄し（磁気分離を用いてＡ−ＭＢを牽引させ）、元のボリューム中に再懸濁させた。誘導されたプラスミド培養物から超音波処理済の上清を、４℃でＡ−ＭＢと１時間混合させ、チューブを頻回にわたって反転させ、ビーズを再懸濁させる。この後、上清を磁気的に除去し、ビーズを０．５ｍｌの冷ＭＣ緩衝液で４回洗浄して、同じ緩衝液１５０μｌ／元のビーズ２５０μｌ中に再懸濁させた。結合タンパク質を、２５℃にて最終濃度１０ｍＭのマルトースで１時間溶出させた。
次いで、ＭＢＰと単離タンパク質融合では、目的の遊離ポリペプチドフラグメントをエンテロキナーゼで処理して、ＭＢＰ担体から剥離させる必要がある。両方の融合体は開裂性であり、予期されたフラグメントが生成された（図１３を参照）。本実施例の条件下では、一定量のエンテロキナーゼを用いた開裂は１時間までにピークに達し、インキュベーション時間を延ばしても、それ以上は増強しなかった（図１３を参照）。
実施例４：
マルトース結合タンパク質融合体としてのＮ末端ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａフラグメントの発現及び精製、ならびにエンテロキナーゼによるフラグメントの開裂
ＲｅｎｉｌｌａシフェラーゼのＮ末端フラグメントは、インテイン−キチン結合ドメイン融合体との可溶性融合に対して抵抗性であるので（実施例１を参照）、Ｃ末端ＭＢＰ融合物としてのＳＰ−ＴＡＰＥＲ用のＮ末端フラグメントを使用した。
プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ系（Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、インテインベースの系（実施例１を参照）に用いられるようなＲｅｎｉｌｌａのＮ末端コード配列を、適切な改変を有するプライマーを用いコード配列の増幅を介してＭＢＰ融合体としてインフレームＣ末端発現用に適合させた。同時に、比較の目的で、対応するｓｆＧＦＰ配列に対して類似の操作を実行した。増幅セグメントを、（プライマー内には存在するがコード配列内には存在しない）Ｘｍｎ Ｉ及びＳｂｆ Ｉで消化し、実施例３と同様の方法でｐＭＡＬｃ５ｘ内に挿入した。但し、この事例では、システイン残基がＣ*末端に発現するように、これらのコード配列の３’末端にシステインコドンを配置した。Ｃ末端フラグメントの発現（実施例３を参照）におけるのと同様に、エンテロキナーゼの開裂部位もまた、ＭＢＰコード配列の末端と、Ｎ末端ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａフラグメントのコード配列の先頭との間に挿入した（図１４に概略的に描かれている）。配列決定によって、候補クローンの構造を確証した。検証されたクローンを株ＮＥＢ−ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換し、直接溶解物試料、最初の上清生成のための超音波処理、ならびにアミロース磁気ビーズからの結合及び溶出の場合と同様、ＩＰＴＧ誘導のために増殖させた（Ａ−ＭＢ）。
ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａ Ｎ末端フラグメントの両方がＭＢＰとの可溶性融合タンパク質として発現し得ることが、見出された。ＩＰＴＧ誘導後にのみ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の直接溶解物試料中に、両方とも観察された（図１４のレーン１対レーン２；及びレーン３対レーン４を参照）。更になお、誘導された融合バンドの両方が、超音波処理済の上清中に存在した（ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａ Ｎ末端フラグメントについてはそれぞれ図１４のレーン５及びレーン８を参照）。次いで、これら融合バンドを両方とも、マルトースを用いてＡ−ＭＢから溶出させて結合できた（ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａＮ末端フラグメントについてはそれぞれ図１４のレーン６及びレーン９を参照）。
使用された条件下にて、ｆＧＦＰフラグメントでは、溶出効率が高めであった。ＭＢＰを介して結合された融合タンパク質を有するＡ−ＭＢの試料を均質なスラリーとして採取した（実施例３と同様にＭＣ緩衝液で４回洗浄した後）。比較の目的に、溶出後の上清試料も採取した。初期スラリー及びマルトース溶出可溶性材料の体積は同じとした。これらのペアを１００℃のＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で（実施例１と同様に）通常通りに変性させ、試料５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。Ａ−ＭＢスラリー試料は、存在する全結合タンパク質に相当することから、そのバンド強度と、容量が一致した溶出試料のバンド強度とを比較することによって、溶出効率の推定値が算定される。ゆえに、ｓｆＧＦＰ Ｎ末端融合体については、溶出が効率的で完了間近であるのが認められたが、一方、Ｎ末端Ｒｅｎｉｉｌａ融合体では可溶性収率が低かった（それぞれ図１４のレーン６対ランド７、及びレーン９対レーン１０を参照）。にもかかわらず、ＭＢＰ系では精製された可溶性Ｎ末端Ｒｅｎｉｌｌａ融合タンパク質の産生が可能であった。これとは大きく異なり、実施例１のインテインベースの系において同等の可溶性タンパク質を観察できなかった。
遊離Ｎ末端フラグメントを遊離させる目的で、ＭＢＰとＮ末端ｓｆＧＦＰとの融合体をエンテロキナーゼで処理して更に調べた。２５℃で２．５時間にわたってエンテロキナーゼの量を変えながら一定量のｓｆＧＦＰ融合体と併用した場合に、用量反応が観察され、最大量のプロテアーゼで完全な開裂が見られた（図１５を参照）。同時に、剥離されたフラグメント（約１７ｋＤ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出できた（図１５を参照）。
実施例５：
５’または３’スルフヒドリル基を有する核酸タグ、及びＮ末端またはＣ末端システインを有するポリペプチドの化学的連結
ビス−マレイミド連結基を用いた共役プロセスは、２段階で行われる。まず、５’または３’末端ジスルフィド修飾を有するオリゴヌクレオチド（図１６を参照；
−ＳＳ−ＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣ；配列ＩＤ番号：４５）を、２５℃にて１００倍モル過剰なＴＣＥＰで少なくとも４時間処理した後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に脱塩し、ＴＣＥＰ及び低分子量の生成物を除去する。次いで、結果として得られた−ＳＨオリゴヌクレオチドを、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）中、モル過剰（５００倍）のＢＭＰ２（Ｓｉｇｍａ）で２５℃にて４時間処理する。次いで、調製物をもう一度脱塩し、過剰なＢＭＰ２を除去する。修飾オリゴヌクレオチドの試料を、８Ｍ尿素ゲル上で泳動させ、元の−ＳＳ−オリゴヌクレオチド及び対応する誘導−ＳＨオリゴヌクレオチドと比較してプロセスの成功を調べる。
第２の段階では、ＢＭＰ２誘導体化オリゴヌクレオチドを用い、末端システイン残基を有する目的ポリペプチドフラグメントに架橋させる。好適なフラグメントを、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有のリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）、及び大モル過剰なＢＭＰ２誘導体化オリゴヌクレオチド中で、２５℃にて４時間インキュベートする。次いで、過剰なオリゴヌクレオチド（未反応マレイミド基を有する）をスルフヒドリル磁気ビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ）で処理して除去する。次いで、ポリペプチド共役体をＰＢＳＭに対して透析し、５０％グリセロール中に−２０℃で保存する。
実施例６：
ＳＰ−ＴＡＰＥＲを介した細胞表面上のレポーターフラグメントのアセンブリ及び機能
鋳型化ＳＰ−ＴＡＰＥＲを介した細胞表面アセンブリ及びレポーターフラグメントアッセイのプロセスは、
いくつかの段階に分類できる。それらの段階には、
１）鋳型化の目的でヌクレオチド配列を特定の方法で細胞表面に配置することと、
２）ＳＰ−ＴＡＰＥＲのレポーター開裂点を選択することと、
３）レポーター開裂点ポリペプチドを調製し、それらのＳＰ−ＴＡＰＥＲに対する核酸タグと共役させることと、
４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において特異的に鋳型化されたＳＰ−ＴＡＰＥＲを介したレポーター開裂フラグメントの再アセンブリを決定することと、
５）ＳＰ−ＴＡＰＥＲレポーター系に対する細胞表面鋳型の有効性をデモンストレーションすることと、
が含まれる。
本実施例では、このプロセスの各段階について説明する。第５段階は、直前の第１段階〜第４段階のデモンストレーションが正常に完了してはじめて開始される。
１）表面鋳型：
ＳＰ−ＴＡＰＥＲでは、細胞表面上で標的化アセンブリ用タンパク質フラグメントをアセンブルするための鋳型として、標的核酸分子配列を用いる。初期の態様は、特定の方法で標的細胞上で鋳型配列を局在化するための手段とされる。この目的に、アプタマーが使用される場合もある。そのような状況において、アプタマーは、（細胞表面標的に結合するための）認識セグメントと鋳型配列との両方からなる二機能性実体と見なし得る。それらは、一重項アプタマーでは５’末端もしくは３’末端、またはバイナリーアプタマーでは５’−３’接合部のいずれかに位置する。黒色腫における表面マーカーに対するアプタマー（メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）、α−メラニン細胞刺激ホルモンからのＧタンパク質共役受容体伝達シグナル）の例もまた、記載されている。
表面標的に対するリガンドが公知である場合、表面鋳型を生成するための代替アプローチが存在する。本実施例では、リガンドはα−メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）であり、セリン−グリシン連結基及びＣ末端システイン残基からなるＣ末端延長部を有する（図１７；ＡｃＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ−ＳＨ；配列ＩＤ番号：２１を参照）。この末端システインは、ビス−マレイミド架橋試薬を介して、オリゴヌクレオチドが５’（または３’）−ＳＨ基を有するオリゴヌクレオチド共役体の形成を可能にしている（図１７を参照）。本実施例において、表示された鋳型配列は、ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ６／Ｅ７配列のセグメントに対応している（図１７；ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣ；配列ＩＤ番号：２０を参照）。
本実施例の変形において、結合特性は、ＭＳＨリガンドの置換によって増強する。一例において、ＮＤＰ−ＭＳＨは、鋳型用のＮＤＰ−ＭＳＨの拡張バージョンがＡｃＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２２）のアミノ酸配列を有する場合に生成される。野生型Ｍｅｔ−４及びＰｈｅ−７残基（両方とも太字）は、それぞれノルロイシン（Ｎｌｅ）及びＤ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）で置換されている。ＭＳＨリガンドの他の変異体としては、ＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２３）、及びＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２４）が挙げられ、Ｘはノルロイシンであり、且つＦ残基はＤ−フェニルアラニンである。
ビス−マレイミド連結基を用いた共役プロセスは、実施例５の２段階プロトコールに従い、合成ペプチドに対し１００：１のモル比のＢＭＰ２修飾鋳型オリゴヌクレオチド（図１７を参照）を使用して実行され、それにより、ペプチドの誘導体化が完了に向かって駆動される。この後、過剰な未反応ＢＭＰ２−オリゴヌクレオチドを、スルフヒドリル修飾長腕磁気ビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ）と反応させることにより除去して、任意の残留マレイミドオリゴヌクレオチドを固相に移す。引き続き、可溶性相を、磁気分離を介してビーズに対しパーティション化する。
調製した表面鋳型を表示するために、細胞（２．１０5）を氷上でペプチドリガンド−鋳型共役体１ｎｍｏｌで１時間処理し、且つ１ｍＭ ＭｇＣｌ2（ＰＢＳＭ）の１×ＰＢＳ混液で２回洗浄した。陽性対照細胞は表面ＭＣ１Ｒを発現することが公知であり、陰性対照はＭＣ１Ｒ−である。両方のタイプの細胞はまた、ペプチドリガンド−鋳型共役体を除いて、同じ方法で処理される。受容体リガンドの結合及びアクセス可能表面鋳型の存在の両方を、添付の鋳型タグ：５’−６Ｆａｍ−ＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＴ−６Ｆａｍ（配列ＩＤ番号：４６）に対し相補的である蛍光二重標識プローブで同時にアッセイする。
二重標識プローブ（５００ｐｍｏｌ）を、ペプチドリガンド−鋳型を有する細胞（０．５ｍｌ；２．１０5）に添加し、上記のように適合させた対照細胞を加える。２５℃で３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳＭで１回再洗浄し、次いでフルオレセインの場合と同様に、チャンネル設定を用いてフロー分析に供する。リガンド結合の正常終了及び鋳型アクセス性は、ＭＣ１Ｒ−細胞には存在しないがＭＣ１Ｒ＋細胞に対する有意な蛍光ピークによって規定される。これらの細胞は両方とも、ペプチドリガンド−鋳型共役体で前処理されたものであり、同様にペプチドリガンド−鋳型共役体が省略されたいずれの細胞にも不在であった。
２）ＳＰ−ＴＡＰＥＲのレポーター開裂点の選択：
レポーターｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの開裂点の配置は、実施例１に記載の通りである。
３）レポーター開裂点ポリペプチドの調製、及びそれらのＳＰ−ＴＡＰＥＲに対する核酸タグとの共役
実施例１〜４では、レポーターｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの開裂点ポリペプチドを調製する方法について説明する。インテインベースの系またはＭＢＰ系のいずれかが、Ｎ末端ｓｆＧＦＰフラグメントに適用可能であり、一方ＭＢＰ系は、両方のレポーター用ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメント対し奏功する。
スルフヒドリル基及びビス−マレイミド化学連結基を介したポリペプチド−核酸タグ共役体の調製方法は、実施例５に記載の通りである。
所定の鋳型配列に対し相補的なループ領域を有するロックドＴＡＰＥＲ第１ボトルハプロマーオリゴヌクレオチド（５’−ＳＨ基を有する）を、Ｎ末端ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼフラグメントのＣ末端システインと別々に共役する（実施例１に定義した通り）。対応する第２ハプロマー（３’−ＳＨ基を有する）を、（実施例１においても定義されているように）Ｃ末端ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼフラグメントのＮ末端システインと別々に共役させる。両タイプの共役体は、図９に概略的に描かれている。
４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において特異的に鋳型化されたＳＰ−ＴＡＰＥＲを介したレポーター開裂フラグメントの再アセンブリ試験
正しく再アセンブルされたレポーターポリペプチドフラグメントは、その名の通り、その固有の「レポータブル」機能に堪能である。本実施例では、線状ＤＮＡ鋳型（図１７の鋳型の遊離オリゴヌクレオチドバージョンに対応する）を、上記のロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドレポーター共役体と併用する。ロックドＴＡＰＥＲ系を使用すれば、鋳型滴定効果が回避されるので、第１ハプロマーボトル及び第２ハプロマーの共役量を変動させながら、過剰量の鋳型と併用しても差し支えない。
上述されているようにして、下掲の共役体を調製する。
Figure 2020501530
ｓｆＧＦＰシグナルは、フルオレセインの場合と同じ最大発光での蛍光であり、蛍光読み取り機能付き分光光度計（Ｔｅｃａｎ）でモニターされる。精製Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）をセレンテラジン基質及び陽性対照として用い、この酵素用の市販キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの酵素活性を評価する。標準照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で発光を定量化する。
用量反応実験デザインにおいて、等モル量の（ｓｆＧ−Ｎ−Ｈ１＋ｓｆＧ−Ｃ−Ｈ２）及び（Ｒ−Ｎ−Ｈ１＋Ｒ−Ｃ−Ｈ２）を、２倍希釈ステップで、またはＳＰ−ハプロマーの許容範囲内の利用可能量で、それぞれ１０．０〜０．１ｐｍｏｌの範囲の希釈系列で混合し、その後、使用された最高量の共役体に対して２倍過剰にて一定量のＤＮＡ標的鋳型と混合する。２５℃で１６時間インキュベートした後、ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方に対し、適宜にレポーターシグナルのアッセイを行う。
一定量のポリペプチド共役体（［ｓｆＧ−Ｎ−Ｈ１＋ｓｆＧ−Ｃ−Ｈ２］及び［ＲＮ−Ｈ１＋ＲＣ−Ｈ２］）を、２倍過剰量の鋳型と混合する、同等な経時的実験を実施し、１５分、３０分、４５分、６０分ならびに１時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び１６時間の一連の時点でアッセイ可能な試料を採取することができる。
（図９に描かれているような）使用されたオリゴヌクレオチドポリペプチド共役体と同じ配列に対応するが付加されたポリペプチドタグを含まないブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して、鋳型媒介ポリペプチドアセンブリの特異性をデモンストレーションできる。アセンブリ反応は、これらのオリゴヌクレオチドのいずれかをモル過剰に用いることによって効果的に阻害されるのに対し、アセンブリプロセスは、スクランブルド配列を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドを過剰に用いても影響されない。
５）ＳＰ−ＴＡＰＥＲレポーター系に対する細胞表面鋳型の有効性のデモンストレーション
本実施例では、表面鋳型は、上記の様式で、ＭＣ１Ｒを発現する標的細胞上に生成される（図１７を参照）。用いられた細胞には、黒色腫系統４５３Ａ及びリンパ腫系統Ｋ５６２が含まれ、両方とも一次抗体及びＦＩＴＣ標識二次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に検出される表面ＭＣ１Ｒを有することが公知である。（上記のように、二重標識蛍光プローブを用いて）鋳型が表示され且つアクセス可能であることを確認した後、鋳型表示細胞を過剰なポリペプチド−共役体の対（［ｓｆＧ−Ｎ−Ｈ１＋ｓｆＧ−Ｃ−Ｈ２］及び［ＲＮ−Ｈ１＋ＲＣ−Ｈ２］）で処理して、２５℃で２時間インキュベートした。ｓｆＧＦＰに対するポリペプチドフラグメントの表面鋳型共折り畳みによるレポーターシグナルの生成を、抗ＭＣ１Ｒ一次抗体及び蛍光二次抗体のみで処理された細胞と比較して、フロー分析により達成する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ細胞表面の測定用に、全細胞試料を、無傷のＲｅｎｉｌｌａ酵素を陽性アッセイ対照として用い、上記のように直接発光のアッセイを行う。
実施例７：
ＳＰ−ＴＡＰＥＲを介した細胞表面上の毒素フラグメントのアセンブリ及び機能
小型の有毒メディエータの細胞表面アセンブリの過程、ならびにそれに続く取り込み及び細胞死滅における機能的活性は、いくつかの段階に分けられ、
１）鋳型化の目的でヌクレオチド配列を特定の方法で細胞表面に配置することと、
２）ＳＰ−ＴＡＰＥＲのレポーター開裂点を選択することと、
３）毒素開裂点ポリペプチドを調製し、それらのＳＰ−ＴＡＰＥＲに対する核酸タグと共役させることと、
４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ系内の特異的鋳型化ＳＰ−ＴＡＰＥＲを介した毒素開裂フラグメントの再構築を検査することと、
５）ＳＰ−ＴＡＰＥＲレポーター系に対する細胞表面鋳型の有効性をデモンストレーションすることと、
６）表面にアセンブルされた毒素の取り込みによる細胞死をデモンストレーションすることと、
が含まれる。
本実施例では、このプロセスの各段階について説明する。第５段階及び第６段階は、直前の第１段階〜第４段階のデモンストレーションが正常に完了してはじめて開始される。
１）表面鋳型：
ＳＰ−ＴＡＰＥＲの鋳型として作用する目的で細胞表面核酸を誘導する方法は、実施例６に記載の通りである。
２）ポリペプチド毒性及び開裂点：
小型リボトキシンのなかには、ＳＰ−ＴＡＰＥＲに対して考え得る用途の観点から魅力的なものが数多くあるが、ヒルステリンＡ（ＨｓｔＡ）は、今日まで知られているリボトキシンの中で最小で、且つ潜在的な開裂点を同定可能なものとしての主要な候補とされる（上記の図１０を参照）。選択された最初の開裂点は、成熟ポリペプチドの８９位及び９０位のジグリシンである（図１０を参照）。
ＨｓｔＡを用いたＳＰ−ＴＡＰＥＲ研究に含めるのに有用な対照とされるのは、Ｃ末端フラグメント内に触媒的に重要な残基を欠く突然変異体（すなわち、点変異変化によって正常なコドンをグリシン残基（Ｈ１１３Ｇ）をコードするコドンに変換する、ヒスチジン−１１３（図１０を参照））である。
３）毒素フラグメントポリペプチドの調製及び核酸共役
ジグリシン部位におけるＮ末端（ＡＰＩＶＴＣＲＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＣ；配列ＩＤ番号：４７）フラグメント及びＣ末端ＨｓｔＡ（ＣＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ；配列ＩＤ番号：２６）フラグメントの両方が、合成コード配列を介して、挿入されたＣ末端システイン残基とＮ末端システイン残基とをそれぞれ有するＭＢＰ系における融合体として発現する（図１８を参照）。融合タンパク質を発現させ、アミロース磁気ビーズに結合して、実施例３及び４に記載されているようにマルトースで溶出させる。ポリペプチドＨｓｔＡフラグメントをエンテロキナーゼで遊離させ（実施例３及び４）、続いて市販のアフィニティ製品（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）でエンテロキナーゼを除去する。
ロックドＴＡＰＥＲボトルオリゴヌクレオチド（図８の第１のハプロマーボトルを参照）を、５’スルフヒドリル基及び目的の標的核酸分子鋳型配列に対し相補的な抗標的ループ部分を用いて調製する。本実施例において、図１６に示すように、鋳型は、ＭＣ１Ｒ＋細胞上に表面表示されている。ＴＣＥＰで処理した後で脱塩することによって、ジスルフィド前駆体から５’スルフヒドリルを生成する。このロックドＴＡＰＥＲボトルオリゴヌクレオチドを、実施例５と同じ方法で、二機能性マレイミド試薬を用い、Ｃ末端システインを担持するＮ末端ＨｓｔＡフラグメント（図１７を参照）と共役させる。
ロックドＴＡＰＥＲ用の対応する第２ハプロマーオリゴヌクレオチド（図８を参照）も同様に遊離３’−スルフヒドリル基を用いて調製し、その後、実施例５の場合と同様に二機能性マレイミド試薬を用いて、Ｎ末端システインを有するＮ末端ＨｓｔＡフラグメントと共役させる（図１７を参照）。
各共役体を天然アクリルアミドゲルから切除し、続いて電気溶出により精製する。両方のＨｓｔＡフラグメントは内部システインを含有するが、これらの残基を含む共役体で所望されないものは、適切なゲル系内で単一のＮ末端またはＣ末端共役体から分解させ得る。単一の末端共役体は、ポリペプチド鎖から付加核酸ホスホジエステル配列にまたがる線状主鎖構造に近接しているが、１つまたは複数の内部共役体は分岐構造を有し、結果として、その電気泳動移動度が改変される。
４）特異的に鋳型化されたＳＰ−ＴＡＰＥＲを介した毒性開裂フラグメントの再アセンブリ試験
２つのＨｓｔＡロックドＴＡＰＥＲ共役体（上記のようにして調製された各５０ｐｍｏｌ）を、１×ＰＢＳＭ中で、２倍過剰な遊離鋳型配列（非共役であること以外は図１７と同様）あり及びなしで、２５℃で６時間インキュベートする。正しくアセンブルされたＨｓｔＡの効果に関するアッセイを行うには、哺乳動物のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系が適切である。ラビット網状赤血球溶解物調製物（Ｐｒｏｍｅｇａ ＴＮＴ（登録商標）ＱｕｉｃｋＣｏｕｐｌｅｄＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）ベースのカップルドｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を便宜的に用いることにより、高感度リードアウトがルシフェラーゼ形態で生成される。このルシフェラーゼのプラスミド（及び試験試薬）は、市販のキットに付属している。ＨｓｔＡを含むリボトキシンは、リボソームタンパク質の合成を妨害し、アッセイ可能なタンパク質産生がリボトキシン活性レベルの基準として有用であることを可能にする。
メーカーの指示に従い、対照ルシフェラーゼ生産の系が確立し、試験的にアセンブルされたＨｓｔＡ調製物を増量しながら播種して、その後３７℃で９０分間インキュベートする。（レポーターアセンブリ系に関して上述したように）対照は、鋳型なしのＨｓｔＡポリペプチド共役体、及び共役体と同じ配列を有する非標識ブロッングオリゴヌクレキオチドを付加することを含む。陽性対照は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現した別のリボトキシン（リシンＡ鎖，Ｓｉｇｍａ）の市販の試料、及びＨｓｔＡ自体で表される。後者は、本出願において他の発現したポリペプチドと類似の様式でｐＭＡＬｃ５ｘベクターに挿入された全長合成コード配列から産生され、全長ＨｓｔＡポリペプチドはエンテロキナーゼを介して、ＭＢＰ担体から開裂される。アミロース−磁気ビーズ上のＭＢＰ−ＨｓｔＡ融合体の精製、マルトースによる溶出、及びエンテロキナーゼの開裂後、プロテアーゼを市販のアフィニティ樹脂（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で除去し、この調製物は、ルシフェラーゼによる転写／翻訳系での試験に直接使用した。
この系内でのリードアウトの正常終了は、リボトキシン陽性対照と並行して、アセンブルされたＨｓｔＡフラグメントを介してルシフェラーゼ発光シグナルを用量依存的に減少させることによって達成される。アセンブリプロセスは、鋳型依存的であり、非標識の競合オリゴヌクレオチドで特異的に遮断可能であることが、デモンストレーションされている。
また、ルシフェラーゼレポーター活性の抑制と並行して、サルチン−リシンループでのリボソーム２８ＳＲＮＡ開裂を評価することによって、ＨｓｔＡアセンブリを同じｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ成分で直接対処できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳プロセスの後は、アセンブルされたＨｓｔＡ調製物の有無とは関係なしに、全反応混合物の試料をＲＮａｓｅフリー条件下でＴＥ緩衝液中でフェノール抽出し、沈殿させて再構成する。試料を２％アガロース上に流し、臭化エチジウムで明視化する（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２００１，３４１，３２４−３３５）。特徴的な４００塩基リボトキシンαフラグメントが生成された場合、ＨｓｔＡアセンブリが正常終了したと診断されたことになる。加えて、２８Ｓ ＲＮＡ内のサルシン−リシンループに対応する合成３５量体（ＧＧＵＡＡＵＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧＧＵＵ；配列ＩＤ番号：４８；Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２６３，７９１７−７９２０）を使用して、特異的リボトキシンのｉｎ ｖｉｔｒｏ開裂に関するアッセイを直接的に行うことができる。このアッセイを、オリゴリボヌクレオチドを漸増量の試験的にアセンブルされたＨｓｔＡ（及び全ＨｓｔＡ対照調製物）と共にインキュベートすることにより行った後、３７℃で９０分間インキュベートする。生成物及び開裂の正常終了を、１５％の８Ｍ尿素変性アクリルアミドゲル上で評価する。
野生型ＨｓｔＡ共役体を用いたＳＰ−ＴＡＰＥＲ分析と並行して、Ｈ１１３Ｇ突然変異を有する共役体（Ｃ末端ＳＰ−ハプロマー）を用い、真核生物リボソームタンパク質合成の抑制に対する効果の特異性をデモンストレーションする。
５）ＳＰ−ＴＡＰＥＲレポーター系を介した細胞表面鋳型の有効性のデモンストレーション
実施例６に記載されているように、ＳＰ−ＴＡＰＥＲを介したレポーターアセンブリによって、毒素アセンブリの目的に細胞表面鋳型のアクセス性を最初に確証する。
６）表面にアセンブルされた毒素の取り込みによる細胞死のデモンストレーション
（実施例６に記載されているように）確立済の細胞表面鋳型系を使用する。ＨｓｔＡポリペプチド共役体及び対照ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａレポーター共役体を、表面鋳型が表示されるように以前に操作された細胞と共に、希釈系列でインキュベートする。ＨｓｔＡアセンブリ用のｉｎ ｖｉｔｒｏ鋳型を使用した並行実験は、アセンブリプロセス自体の陽性対照として機能する。更に、細胞表面レポーターシグナルの並行生成は、鋳型系が計画された通りに機能していることを示唆する。
表面アセンブルされた機能的ＨｓｔＡの所望される活性は、表面部位から標的細胞へのその取り込みに依存する。これは成熟ＨｓｔＡタンパク質の固有の細胞透過機能を通して能動的に起こるか、またはいずれにせよ受動的にエンドサイトーシスを介して起こる。生体染色を用いた直接顕微鏡検査で、及びアポトーシス細胞用の市販アネキシンＶ系を用いたフロー分析で、細胞傷害性効果をモニターし定量する。
実施例８：
ｓｆＧＦＰ分割タンパク質系を用いた機能性ＳＰ−ＴＡＰＥＲ
ＳＰ−ＴＡＰＥＲの有効性をデモンストレーションする目的に用いられた成分を以下の通り：
Ａ．タンパク質フラグメント：
特異的バージョンのｓｆＧＦＰの以下のタンパク質フラグメント（Ｏｖｅｒｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１３，７９，６４８１−６４９０）が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）：
Figure 2020501530
 において発現した。
付加されたヘキサヒスチジンタグは、ボールド体で示されている。ヘキサヒスチジンセグメントとｓｆＧＦＰ配列との間の短いセリン−グリシン連結基は下線付きである。固定化金属アフィニティクロマトグラフィ磁気ビーズ（ＩＭＡＣ，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃｏｒｐ）上で、超音波処理された細胞抽出物から精製を行い、タンパク質を３００ｍＭイミダゾールで溶出した。
Ｂ．タンパク質−核酸共役体を作製するためのオリゴヌクレオチド：
このＳＰ−ＴＡＰＥＲの実例に適用されるロックドＴＡＰＥＲを実装する目的に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
（ｉ）トリスＡｍ−ＨＰＶ−Ｂ１（ロックドＴＡＰＥＲハプロマーループ’ボトル’オリゴ）
［トリス−タンデムアミノ］−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ（配列ＩＤ番号：２８）、及び
（ｉｉ）ＨＰＶ−Ｂ２−トリスＡｍ（第２のロックドＴＡＰＥＲハプロマーオリゴ）
ＴＴＴＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−［トリス−タンデムアミノ］（配列ＩＤ番号：５８）。
これらのオリゴヌクレオチドＴＮ−ＨＰＶ−Ｂ１及びＨＰＶ−Ｂ２−Ｔを、それぞれ５’または３’末端にトリスタンデムアミノ基を用いて合成し、マレイミド−Ｃ３−ニトリロ三酢酸（ＭＮＴＡ；同仁化学分子技術）を用いてそれらのタンデム誘導体化を可能にすることによって、ヘキサヒスチジンタグに対するＮｉ+2の存在下で結合親和性が増大する（Ｇｏｏｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００９，１０，１５５１−１５５７を参照）。このＭＮＴＡ共役は、末端アミノ基からトリプルセットへの反復を除き、上記のように進行する（図１９を参照）。共役プロセスでは、初期ステップを用い、二機能性試薬Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用してトリス末端アミンを最初にジチオールに変換し、続いてＴＣＥＰで還元して、最後にＭＮＴＡのマレイミド部分を介して共役させる（図２１のパネルＡを参照）。図２１のパネルＢに図示されているように、実際には、共役反応自体は容易に進行するが、オリゴヌクレオチドの完全なトリス置換誘導体化を達成することは不可能である。一置換、二置換及び三置換ＮＴＡ形態を有するロックドＴＡＰＥＲ系の小成分の非限定的な例では、変性アクリルアミドゲル上で明らかである。ゆえに、三置換ＮＴＡ形態の富化が望ましい。これは、単一ＭＮＴＡ共役体の精製に関して記載されているようなビオチン化テトラヒスチジンストラテジーにより達成された（図２０を参照）。この時点で、混合タンデムＭＮＴＡ生成物の反応生成物にＮｉ+2イオンを加えてキレート化させ、固相ビオチン化テトラヒスチジンとインキュベートして、イミダゾールで溶出する。このプロセスがトリスタンデムＮＴＡ形態のロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの選択的富化を可能にしたのは、テトラヒスチジンに対する親和性が高いという理由からであった（図２２を参照）。
分割タンパク質フラグメントは、共通の鋳型上で相互に近接してハイブリダイズするように設計された特定のオリゴヌクレオチドと共役している場合に、ＳＰ−ハプロマーと呼称され、ロックドＴＡＰＥＲストラテジーと併用された場合、それに応じて（略称で）Ｌｋ−ＳＰ−ハプロマーと呼ばれる。
ヘキサヒスチジンタグを有する（上記のような）ｓｆＧＦＰのフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ株ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）中で発現させ、標準プロトコールに従って精製して、イミダゾールを介して最終的な溶出液を得た（図２３を参照）。次いで、これらの調製物を、タンパク質がモル過剰である、トリスタンデムＮＴＡロックＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドで誘導体化した（図２２を参照）。
この非限定的な例において、より大型のｓｆＧＦＰフラグメント（図２３を参照）３００ｐｍｏｌを、上記のように誘導体化且つ富化された小型のロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドＨＰＶ−Ｂ２（上記の通り）１６０ｐｍｏｌで処理して、ＨＰＶ−Ｂ２−３’−トリス−ＮＴＡを形成した。この非限定的な例において、より小型のｓｆＧＦＰフラグメント（図２３を参照）３００ｐｍｏｌを、上記のように且つ富化されたより大型のループボトルロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドＨＰＶ−Ｂ１（上記の通り）１６０ｐｍｏｌで処理して、５’−トリス−ＮＴＡ−ＨＰＶ−Ｂ１を形成した。過剰のタンパク質を使用することにより、オリゴヌクレオチドの複合体化を完了に向かって駆動し、それにより、以後の型鋳化ＳＰ−ＴＡＰＥＲを妨害し得る遊離オリゴヌクレオチドの量を最小限に抑えた。
ＳＰ−ＴＡＰＥＲのデモンストレーション用に、上記Ｌｋ−ＳＰ−ハプロマー（各２０ｐｍｏｌ）を、５０ｍＭ容量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中５０μｌ容量で別々にまたは一緒にインキュベートした。その際、９６ウェル黒色平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に直接入れた１０倍過剰（２００ｐｍｏｌ）の鋳型オリゴヌクレオチド：ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣ（配列ＩＤ番号：５９）、または１０倍過剰の（２００ｐｍｏｌ）の対応するスクランブルドオリゴヌクレオチド：ＴＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＣ（配列ＩＤ番号：４９）を用いた。
ロックドＴＡＰＥＲを使用することによって、従来のハプロマーで観察された鋳型滴定効果が回避されるので、鋳型濃度をＬｋ−ＳＰハプロマーよりも大過剰に使用可能である。
好適な時点で、Ｔｅｃａｎ分光蛍光光度計で、プレートの蛍光（フルオレセインに関する設定）を読み取った。結果を図２５に示す。ｓｆＧＦＰ活性を示す蛍光応答は、特異的な過剰スクランブル鋳型の存在下で、大幅に加速された。鋳型に関係なしに、Ｌｋ−ＳＰハプロマー単独では、有意な応答は観察されなかった。
本明細書中に記載されている主題以外の、記載されている主題に対する様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。また、そのような修正形態も、添付の特許請求の範囲内に包含されることを意図したものである。本出願中に引用されている各参考文献（限定されるものではないが、ジャーナル記事、米国及び米国以外の特許、特許出願公開、国際特許出願公開、遺伝子バンク受託番号などを含む）は、その全体が本明細書において参照により援用されている。

Claims (23)

  1. ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、前記ポリヌクレオチドが、
    ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、
    ｂ）前記第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
    ｃ）前記抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、前記第１の３’ステム部分が前記第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、前記第２の５’ステム部分とを具備する、前記ボトルハプロマー。
  2. ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、前記ポリヌクレオチドが、
    ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、
    ｂ）前記第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
    ｃ）前記抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、前記第１の３’ステム部分が前記第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
    前記ポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端もしくはＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結され、
    前記ポリヌクレオチドにライニング（ｌｉｎｅｄ）された前記タンパク質フラグメントの末端がシステインまたはセレノシステインを含む、前記第２の５’ステム部分とを具備する、前記ボトルハプロマー。
  3. 前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃であり、
    前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmが、約４０℃〜約５０℃であり、
    前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが約６０℃〜約８０℃であり、及び／または
    前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約２０°Ｃである、請求項１または請求項２に記載のボトルハプロマー。
  4. 前記第１のステム部分が、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含み、
    前記抗標的ループ部分が、約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含み；及び／または
    前記第２のステム部分が、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
  5. 前記第１のステム部分と前記抗標的ループ部分との間、または前記抗標的ループ部分と前記第２のステム部分との間、のうちのいずれか１つ以上の間の連結基を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のボトルハプロマー。
  6. ａ）ポリヌクレオチドと、
    ｂ）前記ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端もしくはＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結された、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントまたは前記Ｃ末端タンパク質フラグメントと、
    を含むハプロマーであって、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧ（配列ＩＤ番号：１）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧ（配列ＩＤ番号：３）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫ（配列ＩＤ番号：５）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：６）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤ（配列ＩＤ番号：７）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：８）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧ（配列ＩＤ番号：９）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤ（配列ＩＤ番号：１１）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１２）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱ（配列ＩＤ番号：１３）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１４）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧ（配列ＩＤ番号：１５）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１６）を含み、
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮ（配列ＩＤ番号：１７）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：１８）を含み、あるいは
    前記Ｎ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫ
    ＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴ；（配列ＩＤ番号：４０）を含み、且つ前記Ｃ末端フラグメントがそのアミノ酸配列ＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：４１）を含む、前記ハプロマー。
  7. ａ）鋳型ポリヌクレオチドと、
    ｂ）ペプチド、
    を含み、
    前記ポリヌクレオチドの５’末端が前記ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、または前記ポリヌクレオチドの３’末端が前記ペプチドの前記Ｎ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、且つ
    前記ペプチドが細胞表面分子に対するリガンドである、表面標的化合物。
  8. 前記リガンドがペプチドホルモンまたは神経ペプチドである、請求項７に記載の表面標的化合物。
  9. 前記ポリヌクレオチドが、前記ヌクレオチド配列ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣ（配列ＩＤ番号：２０）を含み、且つ前記ペプチドが、前記アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２１）、ＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶＧＧＧＳＳＧＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２２）、ＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２３）、またはＣＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＹＳＸＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ2（配列ＩＤ番号：２４）を含み、Ｘがノルロイシンであり、且つＦ残基がＤ−フェニルアラニンである、請求項７に記載の表面標的化合物。
  10. Ｎ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と精製ドメインとを含む融合タンパク質であって、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端が前記融合パートナータンパク質のＮ末端にカップリングされ、且つ前記融合パートナータンパク質のＣ末端が前記精製ドメインのＮ末端にカップリングされるか、または
    Ｎ末端タンパク質フラグメント、融合パートナータンパク質及び開裂部位にカップリングされ、前記融合パートナータンパク質のＣ末端が前記開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ前記開裂部位のＣ末端が前記融合パートナータンパク質のＮ末端にカップリングされ、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニンとＣ末端システインとを含むか、またはＣ末端タンパク質フラグメントと融合パートナータンパク質と開裂部位とを含み、前記融合パートナータンパク質のＣ末端が前記開裂部位のＮ末端にカップリングされ、且つ前記開裂部位のＣ末端が前記Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングされ、前記Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む、前記融合タンパク質。
  11. Ｎ末端タンパク質フラグメントとインテインとキチン結合ドメインとを含む融合タンパク質であって、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がインテインのＮ末端にカップリングされ、インテインのＣ末端が前記キチン結合ドメインのＮ末端にカップリングされるか、またはＮ末端タンパク質フラグメント、マルトース結合タンパク質及びエンテロキナーゼ開裂部位にカップリングされ、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントがＮ末端メチオニンとＣ末端システインとを含むか、またはＣ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、マルトース結合タンパク質のＣ末端がエンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端がＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、前記Ｃ末端タンパク質フラグメントがＮ末端システインを含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  12. Ｎ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、前記マルトース結合タンパク質のＣ末端が前記エンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、前記エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端が前記Ｎ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントがアミノ酸配列ＡＰＩＶＴＣＲＰＫＬＤＧＲＥＫＰＦＫＶＤＶＡＴＡＱＡＱＡＲＫＡＧＬＴＴＧＫＳＧＤＰＨＲＹＦＡＧＤＨＩ
    ＲＷＧＶＮＮＣＤＫＡＤＡＩＬＷＥＹＰＩＹＷＶＧＫＮＡＥＷＡＫＤＶＫＴＳＱＱＫＧＣ（配列ＩＤ番号：２５）を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. Ｃ末端タンパク質フラグメントとマルトース結合タンパク質とエンテロキナーゼ開裂部位とを含み、前記マルトース結合タンパク質のＣ末端が前記エンテロキナーゼ開裂部位のＮ末端にカップリングし、前記エンテロキナーゼ開裂部位のＣ末端が前記Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端にカップリングし、且つ前記Ｃ末端タンパク質フラグメントがアミノ酸配列ＣＧＰＴＰＩＲＶＶＹＡＮＳＲＧＡＶＱＹＣＧＶＭＴＨＳＫＶＤＫＮＮＱＧＫＥＦＦＥＫＣＤ（配列ＩＤ番号：２６）を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
  14. 次式：
    Figure 2020501530
     （式中、ｎは約３〜約６である）を有する化合物。
  15. ａ）Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第１のハプロマーと、
    ｂ）Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む、第２のハプロマーと、
    を具備する組成物またはキットにおいて、
    前記第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にて前記タンパク質フラグメントに連結され、且つ前記第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にて前記タンパク質フラグメントに連結され、
    前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
    前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し相補的であるか、あるいは 前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し相補的であり、且つ前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であるか、あるいは 前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記ステムループ構造に隣接した標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいは 前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記標的核酸分子の前記ステムループ構造の前記ループの３’部分に対し実質的に相補的である、前記組成物またはキット。
  16. ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、
    ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、
    ｉｉ）前記第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
    ｉｉｉ）前記抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、前記第１の３’ステム部分が前記第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記ポリヌクレオチドの５’末端が−ＳＨ残基を含み、且つ
    前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、前記第２の５’ステム部分と、
    を具備する前記ボトルハプロマーと、
    ｂ）Ｎ末端タンパク質フラグメントであって、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端がシステイン−ＳＨ残基を含む、前記Ｎ末端タンパク質フラグメントと、
    ｃ）ビスマレイミド試薬と、
    を具備する、組成物またはキット。
  17. ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、
    ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、
    ｉｉ）前記第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
    ｉｉｉ）前記抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含み、前記第１の３’ステム部分に対し実質的に相補的である第２の５’ステム部分であって、
    前記ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、前記Ｃ末端がシステインを含む前記第２の５’ステム部分と、を具備する、前記ボトルハプロマーと、
    ｂ）ポリヌクレオチドとＣ末端タンパク質フラグメントとを含む第２のハプロマーであって、前記ポリヌクレオチドの３’末端が前記Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されており、前記Ｎ末端がシステインを含む、前記第２のハプロマーと、
    を具備する組成物またはキットにおいて、
    前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
    前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導される、
    前記組成物またはキット。
  18. 前記ポリヌクレオチド及びタンパク質フラグメントがそれぞれ生体直交型反応性分子を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のキットまたは組成物。
  19. 細胞におけるタンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
    ａ）細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、
    ｂ）前記細胞を、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、
    前記第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にて前記タンパク質フラグメントに連結され、且つ前記第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にて前記タンパク質フラグメントに連結され、
    前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
    前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であるか、あるいは前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であるか、あるいは
    前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接した標的核酸分子５’部分に対し実質的に相補的であり、且つ前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記ステムループ構造に隣接した前記標的核酸分子３’部分に対し実質的に相補的であり、あるいは
    前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、標的核酸分子のステムループ構造のループの５’部分に対し実質的に相補的であり、前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記標的核酸分子の前記ステムループ構造の前記ループの３’部分に対し実質的に相補的であり、
    それにより、結果として、前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントから前記タンパク質のアセンブリを生ずる、前記接触させることと、を含む、前記方法。
  20. タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
    ａ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、前記ボトルハプロマーが、
    ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、
    ｉｉ）前記第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
    ｉｉｉ）前記抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、前記第１の３’ステム部分が前記第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントＣ末端に連結され、
    前記Ｃ末端がシステインを含む前記第２の５’ステム部分と、を具備する、前記接触させることと、
    ｂ）前記ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、
    前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
    前記第２のハプロマーと、前記ボトルハプロマーの前記第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、
    それにより、結果として、前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントから前記タンパク質のアセンブリを生ずる、前記接触させることと、を含む、前記方法。
  21. タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
    ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、前記表面標的化合物が、
    ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、
    ｉｉ）ペプチド、
    を含み、前記ポリヌクレオチドの５’末端が前記ペプチドの前記Ｎ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、または前記ポリヌクレオチドの３’末端が前記ペプチドの前記Ｎ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、
    前記ペプチドが細胞表面分子に対するリガンドである、前記接触させることと、
    ｂ）前記細胞を、Ｎ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第１のハプロマーに接触させることと、
    ｃ）前記細胞をＣ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、
    前記第１もしくは第２のハプロマーのうちの一方のポリヌクレオチドが、その５’末端にて前記タンパク質フラグメントに連結され、且つ前記第１及び第２のハプロマーのうちの他方が、その３’末端にて前記タンパク質フラグメントに連結され、
    前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、且つ
    前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、且つ前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記第１のハプロマーのポリヌクレオチドに対し空間的に近接した部位にて前記表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的であり、
    それにより、結果として、前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントから前記タンパク質のアセンブリが生ずる、前記接触させることとを含む、前記方法。
  22. タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
    ａ）細胞を表面標的化合物に接触させることにおいて、前記表面標的化合物が、
    ｉ）鋳型ポリヌクレオチドと、
    ｉｉ）ペプチド、
    を含み、前記ポリヌクレオチドの５’末端が前記ペプチドの前記Ｎ末端もしくはＣ末端にカップリングされるか、または前記ポリヌクレオチドの３’末端が前記ペプチドの前記Ｎ末端もしくはＣ末端にカップリングされ、
    前記ペプチドが細胞表面分子に対するリガンドである、前記接触させることと、
    ｂ）標的核酸分子をボトルハプロマーに接触させることにおいて、前記ボトルハプロマーが、
    ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１の３’ステム部分と、
    ｉｉ）前記第１の３’ステム部分に連結された約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む抗標的ループ部分であって、前記抗標的ループ部分が、前記表面標的化合物の鋳型ポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
    ｉｉｉ）前記抗標的ループ部分に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第２の５’ステム部分であって、前記第１の３’ステム部分が前記第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記ポリヌクレオチドの５’末端がＮ末端タンパク質フラグメントのＣ末端に連結され、
    前記Ｃ末端がシステインを含む前記第２の５’ステム部分と、を具備する、前記接触させることと、
    ｃ）前記ボトルハプロマーを、Ｃ末端タンパク質フラグメントのＮ末端に連結されたポリヌクレオチドを含む第２のハプロマーに接触させることにおいて、前記第２のハプロマーのポリヌクレオチドが、前記ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの第２の５’ステム部分に対し実質的に相補的であり、
    前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントが単一タンパク質から誘導されたものであり、
    前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きく、且つ
    前記第２のハプロマーと、前記ボトルハプロマーの前記第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、前記第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃であり、
    それにより、結果として、前記Ｎ末端タンパク質フラグメント及び前記Ｃ末端タンパク質フラグメントから前記タンパク質のアセンブリが生ずる、前記接触させることと、を含む、前記方法。
  23. 融合タンパク質内のインテイン融合パートナーからＮ末端タンパク質フラグメントを開裂させる方法であって、
    ａ）前記融合タンパク質を２−メルカプトエタンスルフォン酸に接触させることと、
    ｂ）前記融合タンパク質をメチルテトラジン基を有するシステインに接触させることと、を含み、
    それにより、前記融合タンパク質から前記Ｎ末端タンパク質フラグメントを剥離させる、前記方法。
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