CN109563537B - 使用核酸适体用于导向的模板化组装的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了核酸适体、与单倍体杂交的核酸适体、使用核酸适体以呈现模板序列的方法，其中所述适体结合至特定的细胞靶所特有的靶分子，用于具有所需功能的分子的核酸模板化组装。

Description

使用核酸适体用于导向的模板化组装的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年5月23日提交的美国临时申请序列号62/339,981的优先权，其以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本公开部分涉及使用核酸适体以呈现模板序列的方法，其中所述适体结合至特定的细胞靶所特有的靶分子，用于具有所需功能的分子的核酸模板化组装。

背景技术

药物开发的一个目标是将有效的生物治疗性干预递送给病原性细胞，如病毒感染细胞、赘生性细胞、产生自身免疫应答的细胞、及其它失调或功能障碍细胞。能够对抗病原性细胞的有效生物治疗性干预的实例包括毒素、促凋亡剂、以及再导向免疫细胞以消除病原性细胞的免疫治疗方法。令人遗憾地，这些试剂的开发极其困难，因为会对相邻的正常细胞或患者整体健康有高风险的毒性。

出现了一种容许递送有效干预至病原性细胞同时减轻对正常细胞的毒性的方法，该方法通过将治疗剂导向对病原性细胞有特异性的分子标记来实现治疗剂的靶向作用。靶向治疗剂已在有限的病例中显示出卓越的临床结果，但目前由于缺乏用于靶向疗法的可接近的标记而在其适用性上受到限制。发现许多病原性细胞类型的蛋白质标记是极其困难的且常常是不可能的。

近年来，已经开发了靶向对病原性细胞有特异性的核酸靶的疗法。现有的核酸靶向疗法如siRNA能够下调潜在危险基因的表达，但不递送有效的细胞毒性或细胞抑制性干预且因此在消除危险细胞本身方面不是特别有效。因此，需要对抗现有生物治疗性干预的不良功效和/或严重副作用。

找出蛋白质或其它大分子中的近端结合位点不能根据简单的杂交规则进行。配体结合可被视为模拟过程，而不是容易应用的数字码，其中配体与其受体袋享有基于形状的互补性。这种配体介导的模板化的合理设计因此需要详细的三维结构信息。即使蛋白质的晶体结构(被认为是可能的靶模板)是可用的，相互作用的配体的设计在困难中又前进了一步，特别是在这种配体必须在相互之间的严格限制的空间边界内结合时。此外，这种设计还必须考虑结合相关构象变化的可能性(类似于变构效应)，这可无意中破坏空间接近性。

尽管这些警告并不排除出于模板化目的而测试特定的蛋白质选择物，但其突出了在实际的时间框架中在靶异常细胞中发现非核酸模板的困难。

虽然近年来已在关于特定癌症的疗法方面取得了很大进展，但是仍存在大量的治疗剂缺口。这种对更佳治疗的未满足的的需要高度适用于许多肿瘤类型。此外，希望将能够靶向特定的病理或不良细胞的一般疗法扩展到更广泛的治疗领域，包括过敏和自身免疫。

发明内容

一般说来，本公开提供了用于产生针对多种类别的靶分子的适体的方法，其中所述适体提供模板序列以修改用于效应物部分/单倍体(haplomer)的靶分子，以用于供诊断或治疗应用的肽或其它结构的组装。

具体说来，本公开提供了单态核酸适体，其包含折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分和包含3’或5’末端区的第二部分，其中第二部分与第一单倍体杂交和第二单倍体。第一单倍体包含与单态核酸适体的第二部分杂交的杂交区域、和反应性效应物部分。第二单倍体包含与单态核酸适体的第二部分杂交的杂交区域、和反应性效应物部分。第一单倍体的反应性效应物部分在空间上邻近第二单倍体的反应性效应物部分。

本公开还提供了双重近端核酸适体对，其包含第一核酸适体和第二核酸适体。第一核酸适体包含折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分和包含3’末端区的第二部分，其中第二部分与第一单倍体杂交。第一单倍体包含与第一核酸适体的第二部分杂交的杂交区域、和反应性效应物部分。第二核酸适体包含折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分和包含5’末端区的第二部分，其中第二部分与第二单倍体杂交。第二单倍体包含与第二核酸适体的第二部分杂交的杂交区域、和反应性效应物部分。第一单倍体的反应性效应物部分能够与第二单倍体的反应性效应物部分相互作用。

本公开还提供了二元核酸适体，其包含折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分、折叠成能结合至靶分子的三级结构的第二部分和位于第一部分与第二部分之间的第三部分，其中第三部分与第一单倍体和第二单倍体杂交。第一单倍体包含与二元核酸适体的第三部分杂交的杂交区域、和反应性效应物部分。第二单倍体包含与二元核酸适体的第三部分杂交的杂交区域、和反应性效应物部分。第一单倍体的反应性效应物部分在空间上邻近第二单倍体的反应性效应物部分。

本公开还提供了包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所列的核苷酸序列的适体。

本公开还提供了从文库中选择适体的方法，所述方法包括：使文库的成员结合至所需固相靶；洗涤所述固相靶；洗脱所述文库的结合成员；沉淀所述文库的结合成员；重构所述文库的结合成员；对于最佳可扩增浓度测试所述文库的结合成员；进行制备性不对称PCR；在凝胶上测试PCR产物；使所述PCR产物结合至链霉抗生物素磁性珠粒；洗涤所述链霉抗生物素磁性珠粒；洗脱上链；在凝胶上测试洗脱的链；以及进行所述循环九至十次直到结合适体群体的多样性充分降低以便可进行特定的主要适体克隆的结合性质的分析。

本公开还提供了选择具有用于与单倍体杂交的可接近的3’或5’末端的适体的方法，所述方法包括：使适体与相应的靶分子接触；使所述适体与具有与所述适体的3’或5’末端互补的区域的寡核苷酸探针接触，其中所述寡核苷酸探针缀合至生物素；洗涤所述适体-寡核苷酸探针复合体以除去未结合的寡核苷酸探针；使所述适体-寡核苷酸探针复合体与链霉抗生物素磁性珠粒接触；洗涤链霉抗生物素磁性珠粒并洗脱适体，其中所述适体具有用于与单倍体杂交的可接近的3’或5’末端。

本公开还提供了制备二元适体的方法，所述方法包括：使靶分子或靶细胞与多个适体接触；洗脱结合的适体，包括至少一个左适体和至少一个右适体；使所述靶分子或靶细胞与结合的左适体和右适体群体接触；使结合的适体与连接酶和RNA夹板接触；用RNA酶H除去所述夹板；由此产生共价连接的二元适体。

本公开还提供了向病原性细胞递送至少一个适体的方法，所述方法包括：向所述病原性细胞施用治疗有效量的任何一个或多个如权利要求1至18中任一项所述的适体，其中在所述病原性细胞中产生至少一个活性效应结构。

附图简述

图1示出了用于蛋白质或其它大分子靶的代表性方法。

图2示出了用于大分子模板化的适体的代表性布置，借此适体序列的区域被用于带有生物正交的反应性基团的效应物部分部分的基于杂交的模板化。

图3示出了代表性双重适体文库配置(N＝随机区域，其中N>或＝40；P＝5’磷酸基；对于左适体，Pr-a、Pr-b分别＝引物a和b序列；对于右适体，Pr-c、Pr-d分别＝引物c和d序列；TL、TR分别＝左和右模板区域。

图4示出了用于每个单文库(“单态”适体)的代表性适体选择过程。

图5示出了差异链生物素化用于制备大量单链适体选定的亚群的代表性用途。

图6示出了在适体选择循环期间用于生成单链的代表性不对称PCR过程。

图7(图A和B)示出了单个适体在3’端(图A)或5’端(图B)处的代表性模板化效应物部分反应性。

图8示出了将特定的靶与可接近的末端序列结合以便与生物素化探针寡核苷酸杂交的单态适体的代表性选择。

图9(图A和B)示出了双重近端适体(图A)或连接的二元对(图B)的代表性模板化效应物部分反应性。

图10示出了涉及在靶分子上的共结合的代表性二元适体选择。

图11示出了代表性一般二元适体结构(L、R分别＝左适体和右适体序列。

图12示出了由向近端靠近复杂分子上的靶位点共结合的一对适体进行的二元适体的代表性形成。

图13示出了二元适体的代表性加速选择过程。

图14示出了二元适体的代表性加速选择过程。

图15示出了将非天然L-DNA标签附加到单态适体的5’端上的代表性示意图。

图16示出了将非天然L-DNA标签附加到单态适体的3’端上的代表性示意图。

图17示出了将非天然L-DNA标签附加到双重适体的3’和5’端上的代表性示意图，以用于通过生物正交杂交导向效应物部分部分的空间邻近性。

图18(图A和B)示出了用于以桥连非天然L-DNA序列装备二元适体(图A＝左适体；图B＝右适体)的代表性示意图，以用于通过生物正交杂交导向效应物部分部分的空间邻近性。

图19示出了用于以桥连非天然L-DNA序列装备二元适体的另一代表性示意图，以用于通过生物正交杂交导向效应物部分的空间邻近性。

图20示出了适体变构效应的代表性选择过程，其中靶结合诱导模板序列的暴露/可接近性。

图21示出了针对连接的二元适体的原位生成的适体变构效应的代表性应用。

图22示出了结合来自肿瘤细胞来源的靶的适体与结合匹配的同源正常细胞的适体之间的代表性扣除。

图23示出了结合来自肿瘤细胞来源的靶的适体与结合匹配的同源正常细胞的适体之间的另一代表性扣除。

图24(图A和B)分别示出了人MC1R蛋白的代表性N末端胞外结构域以及用结合五肽的L-和R-适体亚群的两个组合的共结合实验。

图25示出了适体的代表性循环分析。

图26示出了在Fab选择的4个循环之后成功的共结合的代表性示例以及共结合实验二元适体产物的序列分析。

图27示出了结合生物素化Fab的适体的代表性循环分析。

图28示出了L-和R-适体与生物素化Fab的第10个循环的代表性共结合测试。

图29示出了由第10循环共结合实验获得的代表性二元克隆10CB-01。

图30示出了特定的第10循环适体与“无生物素化Fab”(bFab)的代表性导向结合。

图31示出了通过二元形式的已知Fab结合单态适体生物素化Fab靶的代表性结合。

图32示出了在第10循环Fab选定适体的IgG1靶上的共结合的代表性示例。

图33示出了二元适体接合和测试适体模板导向的连接寡核苷酸的代表性序列。

图34示出了用于氨基末端寡核苷酸衍生化的反式环辛烯(TCO)酯和甲基四嗪(MTZ)酯试剂的代表性结构。

图35示出了点击标记的寡核苷酸与靶分子模板的代表性退火，造成双链体末端与相容的限制位点突出端的空间邻近性。

图36示出了在适体中基于固相寡核苷酸的模板化的代表性示意图。

图37示出了固相链霉抗生物素磁性珠粒上的末端连接的寡核苷酸原位PCR产物形成的代表性示例。

图38示出了通过原位结合至bFab靶上的适体模板进行的模型反电子需求Diels-Alder(IEDDA)点击反应的模板化的代表性示例。

图39示出了原位结合至bFab的适体的结合和二元形成的代表性PCR测试。

图40(图A、B和C)示出了原位处于bFab靶上的二元适体的代表性形成和测试。

图41示出了来自近端二元适体对的模板借助于短的茎环桥的替代原位形成的代表性示意图。

图42示出了用于测试互补端茎环桥二元模板化方法的适体和相应序列的代表性结构。

图43示出了适体延伸对于结合bFab-BRD7的能力的影响的代表性测试。

图44(图A和B)示出了互补端二元茎-环适体方法的代表性测试。

图45示出了适体#228与生物素化的Fab-BRD7的代表性结合曲线。

图46示出了在形成细胞表面复合物中的代表性第一步，演示了经由模板化组装的适体介导的肽组装。

图47示出了在形成细胞表面复合物中的代表性剩余步骤，演示了经由模板化组装的适体介导的肽组装；以及借助于特定的T细胞受体识别的功能性读出的代表性过程。

具体实施方式

细胞特异性转录物可潜在地用作能够直接或间接杀伤宿主细胞的新型结构的导向组装的模板。具体说来，肿瘤特异性转录物可潜在地用作能够直接或间接杀伤肿瘤宿主的新型结构的导向组装的模板。如果非RNA分子可以细胞类型特异性方式用于模板组装反应，特别是如果可能以此方式利用表面靶分子的话，那么此项技术将得到极大拓展。后面这种能力将通过减少物流配送问题来提供较大益处。原则上，这两个期望的特点可通过使用核酸适体得到满足，其中适体发挥双重作用，即作为针对目标靶的两种识别剂，并且提供模板化组装可在其上进行的可接近的核酸序列。

原则上，共价地载有反应性效应物部分(即，所需效应产物的可组合部分)的一对配体(即，如先前在例如PCT国际公布WO 14/197547中描述的部分效应物部分；在本文中现在称为“单倍体”)可在任何模板化结构上完成效应产物组装，前提条件是模板-配体(即，适体-单倍体)结合产生两个反应性效应物部分之间出现相互反应性所必需的空间邻近性(参见图1)。因此，除核酸以外的其它分子可在原则上充当特定的模板组装过程的向导。这类非核酸模板可单独或以组合形式包括蛋白质和复合碳水化合物。并且，蛋白质或复合碳水化合物原则上可充当与核酸一致的模板，其中各自存在于特定的核糖核蛋白内有或没有糖基修饰。

其中作出关于类似物模板化位点的性质的一些假设的方法使用核酸适体。此处适体被选择作为蛋白质组/糖组/核酸靶的配体本身，并且结合至空间上邻近的靶的那些适体潜在地适用作模板化组装的单倍体的载体。适体对可用作这类载体配体，或替代地，单个选定的适体可与也携带了单倍体的已知配体同时使用。

因为适体可被选择结合至在细胞表面上表达的非核酸靶分子，所以它们特别适用于识别和适应模板化见于特定细胞(如肿瘤细胞)上的新型表面结构。然而，由于大多数适体不是大核酸分子(即，许多具有小于100个碱基)且经常可呈现折叠和致密的结构，所以它们比许多基于蛋白质的试剂更容易转染到靶细胞中。因此，还需要用于适体的胞内靶。这种胞内靶也可包括RNA分子，特别是当RNA以充分折叠的稳定状态存在时。后者的构型常常难以进行常规的杂交介导的模板化组装，但易于通过适体进行识别和二级适应模板化。

适体是已就结合至特定的目标靶分子的能力进行选择单链折叠的核酸。在一些实施方案中，选择过程涉及通过能够实现随机群体的扩增的特定引物序列或其具有特定序列的任何成员合成在3’或5’末端侧接有延伸的随机序列段的核酸分子。在大型随机群体内，生成由随机区域的自折叠产生的结构基序文库，且原则上，广泛多种靶分子可被此文库的特定成员结合。这些特定的结合核酸分子可通过适当的选择工序富集，然后扩增。在结合所需靶分子的核酸分子最初极少子集的这种扩增之后，重复进行选择轮次，由此促进所需核酸分子的进一步富集。另外，此循环是发展的，因为在增强结合的扩增过程期间出现的突变是有利的，并且在足够的重复之后，以高亲和力结合至所需目标靶分子的特定核酸分子可被分离和鉴别。以高亲和力结合至所需目标靶分子的这种特定核酸分子充当核酸适体，其又可充当用于可修饰细胞的功能性产物的模板化组装的模板。

一般说来，由于适体是由核酸构成，所以它们可潜在地提供用于模板化目的的短线性序列，作为其一级序列的连续区段。这种“内建(built-in)”模板化序列原则上可位于一级适体序列内的任何地方，前提条件是单倍体在适体上的杂交不破坏适体与目标靶分子的结合。然而，实际上，适体序列的5’或3’末端区的靶向可能具有较低的破坏适体功能的概率。这种末端位点更容易根据需要来修饰或生成作为二级附加区段。

在本文所述的任何适体(包括有或没有其杂交的单倍体的那些)中，核酸可包括DNA核苷酸、RNA核苷酸、硫代磷酸酯修饰的核苷酸、2-O-烷基化RNA核苷酸、卤化核苷酸、锁核酸核苷酸(LNA)、肽核酸(PNA)、XNA、吗啉代核酸类似物(吗啉代)、假尿苷核苷酸、黄嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、2-脱氧肌苷核苷酸、或能够形成碱基配对的其它核酸类似物、或其任何组合。在一些实施方案中，核酸是作为LNA的一个部分或包含作为LNA的一个部分。在一些实施方案中，在本文所述的任何核酸适体中，单倍体的杂交区域和适体与单倍体的杂交区域杂交的部分都包含L-DNA。另外，适体可以是非常柔性的。例如，适体可被修饰以便借助于修饰的主链(包括但不限于硫代磷酸酯)或2’修饰(包括但不限于2’-O-甲基衍生物)赋予核酸酶抗性。或者，适用时，可使用结合所需靶的L-DNA类似物(镜像异构体)，并且其具有高核酸酶抗性。

本公开提供了核酸适体。在一些实施方案中，适体是单态核酸适体。单态核酸适体包含折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分。折叠成三级结构的单态适体的此第一部分可包含适体的3’或5’末端区。单态核酸适体还包含第二部分，其包含适体的3’或5’末端区(即，不是第一部分的一部分的任何一个末端区)。因此，在一些实施方案中，折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分包含适体的5’部分，而第二部分包含适体的3’末端区。或者，折叠成能结合至靶分子的三级结构的第一部分可包含适体的3’部分，而第二部分包含适体的5’末端区。

单态适体的第一部分和第二部分都包含充当用于扩增目的的引物结合位点的序列区域。在一些实施方案中，适体的5’末端区含有充当用于扩增目的的第一引物结合位点的第一序列区。在一些实施方案中，适体的3’末端区含有充当用于扩增目的的第二引物结合位点的第二序列区。使用扩增引物结合位点连同适当的引物一起允许扩增，如通过单态适体的PCR所进行。在一些实施方案中，单态适体的第二部分中的各自引物结合区也可形成一旦模板组装便产生功能性产物的模板区的一部分。

在一些实施方案中，单态核酸适体的第二部分与第一单倍体和第二单倍体杂交。当适体与第一单倍体和/或第二单倍体杂交时，由此形成的复合体在本文中被称为“适体-单倍体”复合体。在一些实施方案中，单态核酸适体的第二部分不与第一单倍体和/或第二单倍体杂交。在任一种情况下，单态核酸适体的第二部分包含与第一单倍体的至少一部分互补的区域并且包含与第二单倍体的至少一部分互补的区域。因此，在一些实施方案中，适体缺乏与其杂交的第一单倍体和/或第二单倍体。因此，在其它实施方案中，适体包括与其杂交的第一单倍体和/或第二单倍体。

第一单倍体包含能与单态核酸适体的第二部分杂交(即，单倍体的杂交区域充分互补)的杂交区域。第一单倍体还包含反应性效应物部分。第二单倍体还包含能与单态核酸适体的第二部分杂交(即，单倍体的杂交区域充分互补)的杂交区域。第二单倍体还包含反应性效应物部分。

第一单倍体的反应性效应物部分在空间上邻近第二单倍体的反应性效应物部分。当在相应的模板反应性效应物部分之间可发生化学反应(如下文所述的任一个化学反应)以使得两个反应性效应物部分相连形成单一功能产物时，第一单倍体的反应性效应物部分与第二单倍体的反应性效应物部分在空间上是邻近的。

在一些实施方案中，适体是双重近端核酸适体对。双重近端核酸适体对的第一核酸适体包含折叠成能结合至所需靶分子的三级结构的第一5’部分。双重近端核酸适体对的第一核酸适体还包含含有3’末端区的第二部分。在一些实施方案中，双重近端适体对的第一适体被称为“左”适体。

在一些实施方案中，双重近端核酸适体对的第一核酸适体的第二部分与第一单倍体杂交。当第一适体与第一单倍体杂交时，由此形成的复合体在本文中被称为“适体-单倍体”复合体。在一些实施方案中，双重近端核酸适体对的第一核酸适体的第二部分不与第一单倍体杂交。在任一种情况下，双重近端核酸适体对的第一核酸适体的第二部分包含与第一单倍体的至少一部分互补的区域。因此，在一些实施方案中，双重近端核酸适体对的第一核酸适体缺乏与其杂交的第一单倍体，且在其它实施方案中，双重近端核酸适体对的第一核酸适体包括与其杂交的第一单倍体。

第一单倍体包含能与双重近端核酸适体对的第一核酸适体的第二部分杂交(即，单倍体的杂交区域充分互补)的杂交区域。第一单倍体还包含反应性效应物部分。此第一单倍体类似于如上所述用于单态适体的第一单倍体。

双重近端核酸适体对的第二核酸适体包含折叠成能结合至所需靶分子的三级结构的第一3’部分。双重近端核酸适体对的第二核酸适体还包含含有5’末端区的第二部分。在一些实施方案中，双重近端适体对的第二适体被称为“右”适体。

在一些实施方案中，双重近端核酸适体对的第二核酸适体的第二部分与第二单倍体杂交。当第二适体与第二单倍体杂交时，由此形成的复合体在本文中被称为“适体-单倍体”复合体。在一些实施方案中，双重近端核酸适体对的第二核酸适体的第二部分不与第二单倍体杂交。在任一种情况下，双重近端核酸适体对的第二核酸适体的第二部分包含与第二单倍体的至少一部分互补的区域。因此，在一些实施方案中，双重近端核酸适体对的第二核酸适体缺乏与其杂交的第二单倍体，且在其它实施方案中，双重近端核酸适体对的第二核酸适体包括与其杂交的第二单倍体。

类似于第一单倍体，第二单倍体包含能与双重近端核酸适体对的第二核酸适体的第二部分杂交(即，单倍体的杂交区域充分互补)的杂交区域。第二单倍体还包含反应性效应物部分。此第二单倍体类似于如上所述用于单态适体的第二单倍体。

当在相应的单倍体之间可发生化学反应(如下文所述的任何化学反应)以使得两个模板反应性效应物部分相连形成单一功能产物时，第一单倍体的反应性效应物部分与第二单倍体的反应性效应物部分在空间上是邻近的。

图3示出了代表性双重适体文库配置。“文库1‘左’”是指本文所述的双重近端核酸适体对的第一核酸适体且“文库2‘右’”是指本文所述的双重近端核酸适体对的第二核酸适体。这两个单倍体一般各自对应于本文所述的单态适体，例外的是对于单态适体，第一和第二单倍体结合至相同单态适体，而对于双重近端适体对，第一单倍体结合至第一(即左)适体且第二单倍体结合至第二(即右)适体。还参看图3，“P”表示5’磷酸基。

再次参看图3，标记为“Pr-a”、“Pr-b”、“Pr-c”和“Pr-d”的适体的部分，是用于特定适体的扩增的引物结合位点。这些位点对应于如上所述的单态适体的序列区域，这些序列区域充当用于扩增目的的引物结合位点。

再次参看图3，标记为“TL”和“TR”的适体的部分是与单倍体杂交的适体的区域。在一些实施方案中，“TL”和“TR”中的一者或两者可包括相邻的“N”区域和相邻引物区中的任一者或两者的一部分。双重近端适体的“TL”和“TR”区域对应于包含单态适体的3’或5’末端区(即，不是单态适体的第一部分的一部分的任一个末端)的第二部分。

继续参看图3，“N”代表初始随机核苷酸区域。在一些实施方案中，“N”为约20个核苷酸至约60个核苷酸。在一些实施方案中，N大于或等于40个核苷酸。本文所述的适体各自包含“N”区域。也就是说，图3中所绘的“N”区域对应于折叠成能结合至所需靶分子的三级结构的单态适体的第一部分。

“N”区域被随机化以使得初始适体群体包含许许多多具有通过此区域的变体序列但具有固定引物位点的分子。具有出现在大型随机群体内的特定序列的一些适体可以使其可结合所需靶分子的方式折叠。这些适体逐渐被选择并经由适体分离过程(常称为SELEX过程)扩增。因此，来自随机区域群体的特定“N”序列是经由其三级折叠(如上所述)实现靶结合的主要贡献者。然而，靠近“N”区域(而不是图3中所示的“Pr-b”和“Pr-c”区域)的引物位点在一些情况下也可促进靶结合或靶-适体稳定，这取决于选择过程的细节。

图9A示出了结合至复合靶(如在例如细胞表面蛋白中)的代表性双重近端适体。弯曲箭头表示介于不同效应单倍体(即“效应物部分”)之间的邻近诱导的化学反应。

在一些实施方案中，适体是二元核酸适体。二元核酸适体包含折叠成能结合至所需靶分子的三级结构的第一部分(即左侧部分)。第一部分还包含在5’末端上用于扩增目的的引物结合区。二元核酸适体还包含也折叠成能结合至所需靶分子的三级结构的第二部分(即右侧部分)。第二部分还包含在3’末端上用于扩增目的的引物结合区。二元核酸适体还包含位于第一部分与第二部分之间的第三部分。在一些实施方案中，第一适体(即，双重近端适体对的左适体)的3’末端与第二适体(即，双重近端适体对的右适体)的5’末端可连接在一起形成二元适体。例如，关于双重近端核酸适体对，适体对的5’与3’末端可连接在一起。在一些实施方案中，二元适体的第一部分被称为“左”适体且二元适体的第二部分被称为“右”适体。

在一些实施方案中，折叠成能结合至靶分子的三级结构的二元核酸适体的第一部分和也折叠成能结合至靶分子的三级结构的第二部分各自独立地具有以下的T_m：约45℃至约85℃、约45℃至约80℃、约45℃至约75℃、约50℃至约70℃、约50℃至约65℃、约55℃至约70℃、或约55℃至约65℃。

二元适体的第三部分包含与单倍体所杂交的区域，如下文进一步描述。二元适体的第三部分还包含供第一部分应用的3’引物结合区(以及第一部分的5’引物结合区)和供第二部分扩增的5’引物结合区(以及第二部分的3’引物结合区)。在一些实施方案中，二元适体选择过程需要第三部分是可接近的以杂交夹板(splint)分子，从而针对需要存在这些区域以用于它们结合至靶的适体进行选择。因此，仅以游离的(可接近的)第三部分结合至靶的适体理论上可通过二元选择过程来选择。换句话说，由于单态至二元选择过程的原因，可用于模板化过程的第三部分不可能显著地促进靶结合。

在一些实施方案中，二元核酸适体的第三部分与第一单倍体和第二单倍体杂交。在一些实施方案中，二元核酸适体对的第三部分不与第一单倍体和/或第二单倍体杂交。在任一种情况下，二元核酸适体的第三部分包含与第一单倍体和/或第二单倍体的至少一部分互补的区域。因此，在一些实施方案中，二元核酸适体缺乏第一单倍体和/或第二单倍体，且在其它实施方案中，二元核酸适体包含与它杂交的第一单倍体和/或第二单倍体。

第一单倍体(即左单倍体)包含能与二元核酸适体的第三部分杂交(即，单倍体的杂交区域充分互补)的杂交区域。第一单倍体还包含反应性效应物部分。第二单倍体(即右单倍体)也包含能与二元核酸适体的第三部分杂交(即，单倍体的杂交区域充分互补)的杂交区域。第二单倍体还包含反应性效应物部分。

当在相应的单倍体之间可发生化学反应(如下文所述的任何化学反应)以使得两个模板反应性效应物部分相连形成单一功能产物时，第一单倍体的反应性效应物部分与第二单倍体的反应性效应物部分在空间上是邻近的。

在一些实施方案中，位于第一部分与第二部分之间的二元核酸适体的第三部分(在本文中有时称为“夹板区域”)包含约20个核苷酸至约80个核苷酸的长度、约30个核苷酸至约70个核苷酸的长度、约35个核苷酸至约65个核苷酸的长度、或约40个核苷酸至约60个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，位于第一部分与第二部分之间的二元核酸适体的第三部分包含约10个核苷酸至约90个核苷酸的长度、约15个核苷酸至约85个核苷酸的长度、约20个核苷酸至约80个核苷酸的长度、或约25个核苷酸至约75个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第三部分可为完全随机的(即，通过合成率得到25:25:25:25dA:dC:dG:dT)，或具有任何形式的特定模式，其中所定义的碱基散布在随机区域中。作为一个非限制性实例，被设计来加强G四链体的选择的61个碱基的随机区域可采用(N₉-G₄)₄-N₉的形式。

图9的图B示出了结合至复合靶(如在例如细胞表面蛋白中)的代表性二元适体。另外，如在本文中进一步描述，二元适体可由在本文中称为“共结合”的过程中在合适的空间邻近性下结合靶分子然后连接的双重近端适体对形成(参见，例如图10)。取决于适体间距的特定参数，提供用于单倍体的连续模板的二元适体可比双重近端适体更有效。参看图9，弯曲箭头表示不同效应物部分部分之间的邻近诱导的反应。

一个或多个核酸适体结合至的靶分子可为任何蛋白或翻译后修饰的蛋白、蛋白复合物、碳水化合物、脂质、磷脂、糖脂、核酸、或与细胞有关的核糖核蛋白。具体的靶分子包括但不限于表面表达分子、一般和胞内蛋白、碳水化合物、脂质相关分子、及核酸分子。表面表达分子包括但不限于：1)整联蛋白(例如像整联蛋白-β1)；2)黑素皮质素-1受体(MC1R)；3)其它G-蛋白偶联受体(GPCR)；4)免疫细胞标记(例如像IgM、IgA、IgG、IgE(所有同种型)、MHCI类和II类分子、CD19、CD20、CD27、CD28、CTLA-4和PD-1)；5)磷脂酰丝氨酸；6)磷脂酰乙醇胺；及7)生长因子受体(例如像HER-2/neu和EGFR)。一般和胞内蛋白包括但不限于：1)激酶；2)酶；3)转录因子；4)翻译后修饰的蛋白；5)突变蛋白；及6)蛋白复合物。碳水化合物包括但不限于附加到蛋白质(糖蛋白)或其它分子如载体上的复合碳水化合物。脂质相关分子包括但不限于磷脂和糖脂。核酸分子包括但不限于核糖核蛋白和mRNA结构基序。

在一些实施方案中，当使用多于一个适体时，适体可结合至相同的靶分子以便适体在物理上相邻近。例如，关于双重近端核酸适体对，适体对可结合至相同的靶分子以便适体对在物理上相邻近。或者，适体对可结合至相同细胞上的不同靶分子以便适体在物理上相邻近。另外，适体对可结合至不同细胞上的不同靶分子以便适体在物理上相邻近。在一些实施方案中，靶分子可以是胞内的。或者，靶分子可在细胞表面上。

在一些实施方案中，关于本文所述的任何核酸适体，第一单倍体和/或第二单倍体的杂交区域独立地包含约6至约24个核苷酸的长度、约8至约20个核苷酸的长度、或约10至约18个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，在空间上邻近第二单倍体(包含反应性效应物部分)的末端的第一单倍体(包含反应性效应物部分)的末端被共价连接。在一些实施方案中，第一单倍体与第二单倍体通过其相应的反应性效应物部分之间发生的化学反应共价地连接到其在空间上邻近的相应末端。许多反应性效应物部分公开于例如PCT国际公布WO14/197547中，其以引用的方式整体并入本文。

两个反应性效应物部分的组合容许形成功能性产物。两个反应性效应物部分之间的相互作用可包括物理相互作用，如化学键(直接连接或通过中间结构)；以及非物理相互作用和引力，如静电引力、氢键、及范德华力/分散力。

反应性效应物部分可为生物惰性的。具体说来，与第一单倍体有关的反应性效应物部分可与同第二单倍体有关的相应的反应性效应物部分相互作用，但不容易与天然的生物分子相互作用。这是为了确保只有当相应的效应物部分部分在结合至靶分子的适体上装配时才形成模板化组装产物。这也保护了反应性效应物部分以免与其中发生组装的环境中存在的其它分子上的官能团反应，由此防止形成不想要的产物。反应性效应物部分的一个实例包括生物正交部分。生物正交部分与相应的生物正交部分起化学反应并且不容易与其它生物分子起化学反应。

反应性效应物部分提供在复合靶隔室中发生模板化反应的机构，如细胞、病毒、组织、肿瘤、裂解物、其它生物结构、或在含有靶分子或含有与非靶隔室不同量的靶分子的样品内的空间区域。反应性效应物部分可与相应的反应性效应物部分反应，但在典型条件下不与常见的生化分子反应。与其它反应性实体不同，反应性效应物部分的选择性防止在产物或反应物组装之前反应性基团的消除。

反应性效应物部分的一个实例可包括生物正交部分。生物正交部分可包括经历例如叠氮化物与炔烃之间的“点击”反应、叠氮化物与膦之间的无痕或非无痕施陶丁格反应、以及硫酯与硫醇之间的天然化学连接反应的那些基团。另外，生物正交部分可为以下任一个：叠氮化物、环辛炔、硝酮、降冰片烯、氧杂降冰片二烯、膦、二烷基膦、三烷基膦、膦基硫醇、膦基苯酚、环辛烯、腈氧化物、硫酯、四嗪、异腈、四唑、四环庚烷、及其衍生物。

可在本文所公开的方法和组合物中使用多个反应性效应物部分。一些非限制性实例包括以下。

点击化学品有高度选择性，因为叠氮化物或炔烃在典型条件下都不与常见的生物分子反应。R-N₃形式的叠氮化物和R-C≡CH形式的末端炔烃或R-C≡C-R形式的内部炔烃容易彼此反应以产生呈1,2,3-三唑形式的Huisgen环加成产物。叠氮化物和叠氮化物衍生物可容易由可商购获得的试剂来制备。叠氮化物也可在反应性效应物部分的合成期间引入反应性效应物部分中。在一些实施方案中，通过在使用标准肽合成法合成反应性效应物部分肽的期间掺入可商购获得的叠氮化物衍生化的标准氨基酸或氨基酸类似物将叠氮基引入由肽构成的反应性效应物部分中。氨基酸可用叠氮化物代替α-氨基来衍生化。可商购获得的产物可引入叠氮化物官能团作为氨基酸侧链，产生以下形式的结构：

其中A为在标准氨基酸或非标准氨基酸类似物的侧链中的任何原子及其取代基。

也可在合成之后通过将肽上的胺基经由偶氮转移方法转化为叠氮化物将叠氮化物引入反应性效应物部分肽中。生物缀合化学品也可用于将可商购获得的衍生化的叠氮化物连接至化学接头或含有合适的反应性基团的反应性效应物部分。

标准炔烃也可通过类似于叠氮化物掺入的方法掺入到反应性效应物部分中。炔烃官能化的核苷酸类似物可商购获得，由此容许在反应性效应物部分合成之时直接掺入炔烃基团。类似地，炔烃衍生化的氨基酸类似物可通过标准肽合成法掺入到反应性效应物部分中。另外，与生物缀合化学方法相容的不同官能化的炔烃可用于促进炔烃通过合适的官能团或侧基掺入到其它部分中。

标准叠氮化物-炔烃化学反应通常需要催化剂，如铜(I)。因为在催化浓度下的铜(I)对许多生物系统有毒性，所以标准叠氮化物-炔烃化学反应在活细胞中具有有限的用途。基于活化炔烃的无铜点击化学系统规避了毒性催化剂。活化炔烃经常采取环辛炔的形式，其中向环辛基中的掺入将环张力引入炔烃。

杂原子或取代基可被引入环辛基环中的不同位置处，这可改变炔烃的反应性或在化合物中提供其它替代化学性质。环上的各种位置也可充当用于将环辛炔连接至反应性效应物部分或接头的连接点。环或其取代基上的这些位置可任选地用辅助基团进一步衍生化。可商购获得多个环辛炔，包括适用于标准生物缀合化学方案的几种衍生化形式。可商购获得的环辛炔衍生化的核苷酸可有助于促进在核酸合成期间反应性效应物部分的便利掺入。

基于在N₂的损失下叠氮化物与膦或亚磷酸盐之间的快速反应的施陶丁格还原也代表生物正交反应。施陶丁格连接适于在模板化组装中使用，其中在施陶丁格反应中在反应物之间形成共价连接。施陶丁格连接的非无痕和无痕形式都允许在这些反应中形成的产物的化学结构中的多种选择。

标准施陶丁格连接是叠氮化物与苯基取代的膦如三苯基膦之间的非无痕反应，其中膦上的亲电子捕获取代基如甲酯与反应的氮杂内盐中间物重排以产生由氧化膦连接的连接产物。也可容易合成携带亲电子捕获物的苯基取代的膦。衍生化形式是可商购获得的并且适于掺入到模板化组装反应物中。

在一些实施方案中，能够实现无痕施陶丁格连接的膦可用作反应性效应物部分。在无痕反应中，膦充当氮杂内盐中间物重排期间的离去基团，产生通常呈天然酰胺键形式的连接。能够实现无痕施陶丁格连接的化合物一般采用硫酯衍生的膦或酯衍生化的膦的形式。酯衍生化的膦也可用于无痕施陶丁格连接。硫酯衍生化的膦也可用于无痕施陶丁格连接。

化学接头或辅助基团可任选地作为取代基被附加，所述取代基提供用于反应性效应物部分的连接点或用于将另外的官能团引入反应物中。

与非无痕施陶丁格苯膦化合物相比，亲电子捕获酯在无痕膦基苯酚上的取向相对于苯基是反向的。这使得无痕施陶丁格连接能够在与叠氮化物的反应中发生，在不包含氧化膦的产物中生成天然的酰胺键。如果合适的亲水性基团如叔胺被附加到苯膦上的话，那么无痕施陶丁格连接可在不含有机共溶剂的含水介质中进行。已经报道了水溶性膦基苯酚的制备，其可使用碳化二亚胺如二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)和酯活化剂如1-羟基苯并三唑(HOBT)，经由温和的Steglich酯化，负载含羧酸(如肽的C末端)的所需反应性效应物部分(Weisbrod等人,Synlett,2010,5,787-789)。

膦基甲硫醇代表用于介导无痕施陶丁格连接反应的膦基苯酚的替代物。一般说来，与膦基苯酚相比，膦基甲硫醇在介导无痕施陶丁格反应时具有有利的反应动力学。美国专利公布2010/0048866和Tam等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,11421-30描述了水溶性膦基甲硫醇的制备。这些化合物可负载肽或呈活化酯形式的其它有效负载来，以形成适用作无痕生物正交反应性基团的硫酯。

天然化学连接是基于硫酯与带有硫醇和胺的化合物之间的反应的生物正交方法。经典的天然化学连接是在带有C末端硫酯的肽与带有N末端半胱氨酸的另一肽之间。可利用天然化学连接以介导产生含有内部半胱氨酸残基或其它含硫醇的残基(如果使用非标准氨基酸的话)的肽或肽模拟物的无痕反应。

可通过标准氨基酸合成法掺入N末端半胱氨酸。可通过本领域中已知的若干方法生成末端硫酯，包括使用剂如二环己基碳二亚胺(DCC)进行的活化酯与硫醇的缩合，或在肽合成期间经由使用“保险栓(Safety-Catch)”辅助树脂的引入。

可利用任何合适的生物正交反应化学品来合成反应性效应物部分，只要其在复杂的生物环境中以高度选择性方式有效地介导反应。最近开发的合适的替代生物正交化学反应的非限制性实例是介于四嗪与各种烯烃如降冰片烯和反式环辛烯之间的反应，其在含水介质中有效地介导生物正交反应。

化学接头或辅助基团可任选地作为取代基被附加到上述反应物中，所述取代基提供核酸部分的连接点或用于将另外的官能团引入反应物中。

本公开还提供了新型适体。在下文所示的适体序列中，第一行提供引物序列(除了加下划线的序列之外，其表示茎-环的延伸)；第二行提供来自原始随机区域的40-碱基序列；且第三行提供其它引物序列(除了加下划线的序列之外，其表示茎-环的延伸)。

1)适体229(10AptL3)；85-聚体(参见图29)(SEQ ID NO:1)：

CATCTCCACCTCCATAACCCACGGACGGGCGTCTAGAGAAGTAGGCTGA

AATATCGTGGCGAGAACGAGCTGTGTCCTGAAGAAA

2)适体228(10AptR1)；85-聚体(参见图27)(SEQ ID NO:2)：

GCAAAGACATCTGGACACGCCACTAAGTGGAGGTGATCTGTACTTCATT

TATGAGATCGCGGCGAGGAGAAGGAGACTTAGAGGC

3)适体229-3’-Ext1；95-聚体(参见图42)(SEQ ID NO:3)：

CATCTCCACCTCCATAACCCACGGACGGGCGTCTAGAGAAGTAGGCTGA

AATATCGTGGCGAGAACGAGCTGTGTCCTGAAGAAACCGGCTGCGC

4)适体228-5’-Ext1；95-聚体(参见图42)(SEQ ID NO:4)：

CGACGCGGGCGCAAAGACATCTGGACACGCCACTAAGTGGAGGTGATCT

GTACTTCATTTATGAGATCGCGGCGAGGAGAAGGAGACTTAGAGGC

参看图27，已观察到引物位点Trz.R有助于适体228/10AptR1与靶的结合，且同样地，引物位点Trz.F有助于适体229/10AptL3与靶的结合。

图25示出了适体的第4循环分析，其中在4个结合循环(EL4)之后获得从靶Fab蛋白洗脱的克隆适体的任意实例。L1-01和R1-01分别是左适体和右适体克隆的任意实例。粗体序列表示从原始适体文库中的随机化序列衍生的40-聚体序列段。加框序列表示引物位点(无填充，引物Trz.F；浅灰色填充，引物AptInt.R(在此取向中呈反义)；加点填充，引物AptInt.F；无填充、暗线，引物Trz.R(在此取向中呈反义))。

本公开还提供了核酸适体的群体，其包含两个或更多个本文所述的核酸适体。在一些实施方案中，选择适体的5’或3’端用于可接近第一和第二单倍体对。

本公开还提供了从文库中选择适体的方法，所述方法包括例如：使所述文库的成员结合至所需固相靶；洗涤所述固相靶；洗脱所述文库的结合成员；沉淀所述文库的结合成员；重构所述文库的结合成员；对于合适的可扩增浓度分析所述文库的结合成员；进行制备性不对称PCR；在凝胶上测试PCR产物；使所述PCR产物结合至链霉抗生物素磁性珠粒；洗涤所述链霉抗生物素磁性珠粒；洗脱上链；在凝胶上测试洗脱的链；以及进行所述循环多次，如高达九次或更多次，直到结合适体群体的多样性充分降低以便可进行特定的主要适体克隆的结合性质的分析。

本文描述了一般结合和洗脱工序。在一些实施方案中，将适体最初在含有1mM氯化镁的标准磷酸盐缓冲盐水(PBSM)中制备，并在80℃下加热约3分钟，然后在0℃下(冰浴)至少5分钟，以便允许自身退火以及适体间相互作用的最小化。在一些实施方案中，将适体群体(或特定的适体)与靶一起孵育并且转变为固相。

在一些实施方案中，可将适体群体(或特定的适体)与靶一起在室温下孵育至少1小时，然后在室温下添加到过量的固相捕获基质中持续超过约1小时。对于主要的适体群体，与靶一起在溶液中的初始孵育时间为约16小时。对于连续多轮选定的适体群体，孵育时间为约2至4小时。对于特定的适体，孵育时间为约1小时。当靶被生物素化时，捕获基质可为过量的链霉抗生物素磁性珠粒(SAMB)或任何其它链霉抗生物素树脂。珠粒量可由生物素化的靶的已知摩尔输入和如由制造商所提供的最大珠粒结合力数据来计算。SAMB最初可通过以下操作来制备：基于实验需要在储存缓冲液中采用预定体积，将它们磁性分离，并用例如1.0ml的PBSM洗涤两次，每次使用磁性分离。最终，可将珠粒再悬浮于原始体积的PBSM中。

在其它实施方案中，可将适体群体(或特定的适体)与先前已在合适的基质中转变为固相的靶一起孵育。这些基质包括但不限于链霉抗生物素磁性珠粒、链霉抗生物素琼脂糖或任何其它链霉抗生物素树脂，其中所述靶带有一个或多个生物素部分。所述靶也可通过各种化学作用(包括但不限于胺/N-羟基-丁二酰亚胺或硫醇/顺丁烯二酰亚胺)共价地结合至固相基质。这种化学作用可将靶共价地结合至磁性珠粒或各种其它材料，包括但不限于琼脂糖或聚合树脂。

在一些实施方案中，可洗涤在固相靶基质上捕获的适体。可用例如0.5ml PBSM(其中最终重悬浮液在相同体积的PBSM中)洗涤带有靶的固相基质和结合的适体1次、2次、3次或4次。当SAMB提供固相基质时，可借助于磁性分离进行每个洗涤周期中基质与上清液的分离。当使用其它固相材料时，可通过其它方式(包括但不限于离心或过滤)进行分离。

在一些实施方案中，洗脱结合的适体。如在上述洗涤步骤中，可将适体/固相靶基质从最终洗涤上清液中分离，并且在室温下再悬浮于例如约100μl的0.1M氢氧化钠/5mMEDTA中持续约20秒。可将上清液移到新管中，并且将固相材料再一次在室温下再悬浮于例如约100μl的0.1M氢氧化钠/5mM EDTA中持续约20秒。可将两次的上清液汇集，并且在约-20℃下用例如约20μg糖原/20μl的3M乙酸钠/600μl乙醇沉淀30分钟。可将制剂离心(例如，在最大微量离心速度下10分钟)，并且用例如1ml的70％乙醇洗涤沉淀。

在一些实施方案中，可重构洗脱的适体。例如，在来自上述步骤的70％洗涤之后，可将制剂短暂离心(例如，在最大微量离心速度下持续1-2分钟)并除去上清液。可将所生成的沉淀干燥并且再溶于适当体积(例如，通常25μl)的TE(10/1.0)中。当分离工序使用磁性珠粒时，可使重新溶解的适体制剂经历另一次磁性分离(例如1分钟)以除去残余的遗留珠粒。可将适体制剂在260nm下用分光光度法定量，其中1.0的吸光度＝33μg/ml单链DNA。也可在例如10％变性尿素丙烯酰胺凝胶上分析样品。这些制剂在本文中被称为针对循环N的初级洗脱的单链适体，其中N是循环工序已经重复的次数。图4示出了对于每个单文库(例如“单态”适体)的代表性适体选择过程。

在一些实施方案中，可在约9至10个循环之后分析适体。例如，随着结合和洗脱循环的持续进行，显著地结合至靶的适体群体的比例提高且同样地，群体的多样性(对应于例如单态适体的第一部分的N区中的变化，在初始群体中在最大(即随机)多样性下开始)减小。在约9至10次循环之后，适体群体的克隆分析通常显示具有相同或相关序列的重复出现的独立克隆，其对应于具有显著结合性质的群体成员。

在一些实施方案中，可如本文所述进行克隆分析工序。一般说来，可在循环步骤期间的任何时点通过克隆和测序来分析适体，但通常在获得具有高水平的序列相似性的多个重复出现克隆之前，约9至10个循环是合适的。在所需的循环次数之后，初级洗脱的左适体或右适体可用适当的L/R引物(参见图3和11)扩增以提供用于克隆的双链体来源。所得的PCR产物可被纯化以除去过量引物(NucleoSpin试剂盒，Machery-Nagel/Clontech)，然后连接至适用于由Taq DNA聚合酶产生的片段的直接克隆的载体(包括但不限于载体如pGEM-Teasy,Promega)。在适当的连接孵育之后，可用产物转化感受态大肠杆菌细胞。然后可用跨越适体插入物的引物来为所得克隆的微量制剂测序，并且分析具有相似的40-聚体序列段的克隆。

例如，特定的单态适体在所限定的靶分子上的选择示于图4中。简单地说，靶分子可在结合至适体群体之后转变为固相。在一些实施方案中，可通过缀合至N-羟基琥珀酰亚胺活化的磁性珠粒将靶分子转变为固相。在一些实施方案中，靶分子带有一个或多个生物素部分，并且可通过结合至固相链霉抗生物素基质(如链霉抗生物素琼脂糖或链霉抗生物素磁性珠粒)转变为固相。可通过洗涤除去非结合适体物质。可将结合的适体用0.05或0.1M氢氧化钠洗脱，沉淀，洗涤，然后用于再扩增以获得富集的单链DNA，供后续轮次的选择之用。

来自所扩增适体的正确有义链的单链DNA的制备可允许后一轮选择的再重复。初步试验扩增可用于测量洗脱适体的最佳浓度以便使用大量PCR制剂来获得相当大的量的单链适体。在典型的试验扩增(即“范围测试”)中，可在例如1:100、1:500和1:2000下稀释来自每个循环的初级洗脱适体，并且在用Amplitaq Gold(Thermo)的PCR扩增中使用各自1.0μl，其中循环的是：在95℃下7分钟，20x(60℃持续约20秒、72℃持续约1分钟且94℃持续约40秒)，60℃持续约20秒，且72℃持续约2分钟。可在例如10％非变性丙烯酰胺凝胶上分析产物以确定提供最佳和最纯产率的浓度，而不含当初始靶浓度过高时出现的较高分子量形式。根据此信息，单链可通过若干不同选择来制备，包括但不限于电泳、用生物素化下链的变性、及不对称PCR。

在一些实施方案中，如图5中示意性地所示，差异链生物素化可用于制备大量单链适体选定的亚群。从固相靶上洗脱的单链适体制剂可被扩增，其中下链(对应于适体补体)带有5’-生物素。在结合至固相链霉抗生物素之后，可用碱(例如像0.05M或0.1M NaOH，还用5mM EDTA)洗脱单链适体(上链)。

在一些实施方案中，如图6中示意性地示出，不对称PCR过程可用于从扩增的双链体适体群体生成单链。可使用较大摩尔过量的上链引物，产生过量的对应于所需适体亚群的单链。可通过例如结合至固相链霉抗生物素除去任何生物素化链，其中未结合的上清液含有适当的单链制剂。

制备性不对称PCR示于图6中，并且涉及其中下链被生物素化的选定适体群体的初始扩增，接着是不对称PCR以用于上链的差异扩增。剩余的下链可通过结合至SAMB(例如，如上所述)被除去。

图7示出了结合特定靶分子的代表性单态适体，在此之后3’或5’末端暴露并且是可接近的以便通过两个效应物部分分子结合(分别参见图7A和图7B)，从而造成后者的生物正交反应性部分之间的反应。弯曲箭头表示不同单倍体之间的邻近诱导的反应。

在用于结合的选择(参见例如图4)之后，结合至靶的单态适体不一定能提供用于杂交的可接近的末端序列，因为它们可能已经并入到结合状态下的特定适体的折叠结构中。具有可接近的末端的单态可用另外的步骤选择，其中单态适体结合至非生物素化靶，且随后与同所需可接近的3’或5’末端互补的生物素化探针杂交。由于杂交需要可接近性，所以可随后在固相链霉抗生物素基质如但不限于链霉抗生物素-磁性珠粒上选择适当的结合物(参见，例如图8)。一旦洗脱，便可扩增单态适体并且必要时重复所述过程。

在一些实施方案中，制备性不对称PCR包括：扩增选择的适体群体，其中对应于所述适体互补序列的下链是生物素化的；以及进行不对称PCR以用于上链的差异扩增，由此使用大量摩尔过量的上链引物，导致产生过量的对应于所需适体亚群的单链。

在一些实施方案中，生物素化链通过结合至固相链霉抗生物素被除去，其中未结合的上清液含有适当的单链制剂。

本公开还提供了选择具有用于与单倍体杂交的可接近的3’或5’末端的适体的方法，所述方法包括：使适体与相应的靶分子接触；使所述适体与具有与适体的3’或5’末端互补的区域的生物素化探针接触；洗涤适体-探针复合体以除去未结合的探针；使适体-探针复合体与链霉抗生物素磁性珠粒接触；以及洗涤链霉抗生物素磁性珠粒并洗脱适体，其中所述适体具有用于与单倍体杂交的可接近的3’或5’末端。此方法显示为一种选择在靶结合之后呈现可接近的序列的单态适体的方式，以使得它们可用于后续的效应物部分组装。

本公开还提供了制备二元适体的方法，所述方法包括：使靶分子或靶细胞与多个适体接触；洗脱结合的适体；使靶分子或靶细胞与结合的适体群体接触；使结合的适体与连接酶和RNA夹板接触；以及用RNA酶H除去夹板，由此产生共价连接的二元适体。

本文描述了一般二元适体选择过程。例如，可将最初在特定的靶上分别选择的左和右主要适体群体(参见图4)与所述靶以等摩尔量共孵育。在典型的工序中，可使用各自8pmol的L-和R-适体与特定的靶。在室温下孵育约2至4小时之后，所述靶可如上所述(即，一般结合和洗脱工序)结合至固相基质，并且经受4x 0.5ml的例如PBSM洗涤。固相制剂可与过量的分别跨越L-和R-适体的3’和5’端的夹板寡核苷酸退火(参见图11)。退火可例如与在约37℃下孵育约5分钟和在约25℃下孵育约30分钟一起进行。制剂可用例如含有1mM ATP的x1连接酶缓冲液(New England Biolabs)洗涤两次，并且再悬浮于约50μl相同的连接酶缓冲液中。可添加连接酶，并且在室温下孵育制剂约1.5至约4小时。可使用对照，其中省略夹板和连接酶或这两者。

在一些实施方案中，连接酶是T4DNA连接酶、T3DNA连接酶或小球藻DNA连接酶(

连接酶；New England Biolabs，具有相应的缓冲液)。

在一些实施方案中，连接酶是T4DNA连接酶或小球藻DNA连接酶。

在一些实施方案中，可选择适体以结合至癌细胞，且其中可扣除结合至正常细胞的适体。

在空间上邻近的常见靶分子上共结合的单态适体的连接造成左适体和右适体之间的连续融合，称为二元适体(参见例如图11)。可用跨越相连序列的单对引物，从任何特定的二元适体或二元适体群体扩增整个二元序列。如果需要的话，也可从任何特定的二元适体或二元适体群体扩增组分左适体和右适体(参见图11)。

二元适体提供的优势是提高的特异性和亲和力，并且提供在介于L-与R-适体区段之间的界面中的模板化序列。此序列具有双重作用，既用于模板化所需组装反应，也作为用于L-适体反向引物和R-适体正向引物的引物位点(参见图11)。

举例来说，图11示出了一般二元适体结构(L、R分别＝左适体和右适体序列(来源于原始的相应文库；参见图1)；a、d、c、d＝引物位点/引物)。还用反向L-适体(“b”，在此图中呈反义)和正向R-适体(“c”，在此图中呈有义)的特定引物序列示出了用于模板化的适体间序列。在此序列中的垂线表示L-与R-适体之间的连接接合。

一般，二元适体符合以下通式：(L-正向引物)-(L-随机区域)-(L-反向引物/半夹板区域)-(R-正向引物/半夹板区域)-(R-随机区域)-(R-反向引物)。相连的(L-反向引物/半夹板)-(R-正向引物/半夹板)区段构成借此夹板分子能够实现L-和R-连接的位点，并且还充当用于模板反应的单链可接近的模板。

每个左适体和右适体相连成为二元形式可借助于例如与左适体的3’端和右适体的5’端互补的RNA夹板寡核苷酸实现(参见图12)。适体末端在此夹板上的连接可通过T4DNA连接酶实现，或通过小球藻DNA连接酶(New England Biolabs)更有效地实现，所述小球藻DNA连接酶在通过RNA夹板的DNA末端的连接中高度有效。特定的二元对可通过将近端二元单元扩增为单个连续序列而被鉴别和表征(参见图11，引物a+d)。在完成连接之后，RNA夹板可通过用RNA酶H(其仅对RNA:DNA杂交体有活性)处理被除去，以暴露来自左适体和右适体的相连模板区域用于与单倍体的后续杂交。

二元适体通过靶共结合和夹板连接的选择也同时确保模板区域出于杂交目的是可接近的。其3’和5’末端难接近(由于其特异性靶结合的结果)的在空间上邻近的适体对未能与夹板杂交并且容许后续连接并扩增为二元实体(参见图12)。

本文还公开了替代的适体选择过程。例如，最初可在所需靶分子上分别选择左适体和右适体文库，并且洗脱结合亚群(参见图13)。接着可使其经受共结合选择以用于近端二元适体的富集，并且可从洗脱的二元群体扩增组分左适体和右适体群体(参见图13)。这两个选定的群体都可经受重组DNA改组(Stemmer,Nature,1994,370,389-391)以提高分子多样性。

DNA改组步骤(参见molecular breeding,Stemmer 1994)被设计来促进不同适体链之间的穿越引发，并且通过以下步骤实现：每个选定的左适体和右适体亚群的有限DNA酶I消化，继之以重组装循环，然后用原始引物再扩增(参见图14)。可在高严格性下在固相靶上再次选择适体DNA改组的产物，接下来依次是共结合连接(参见图13)、洗脱和扩增。此过程的产物可通过测序及针对结合亲和力的测试来表征。

用于模板化组装目的的单态和二元适体的操作在上文中描述。二元适体应用可被分成两个类别。在第一类中，在它们从近端结合单态中鉴别之后，可将二元物在溶液中(在靶分子不存在下)连接在一起，然后出于功能性目的进行配置。在第二类中，将二元物直接在靶分子上组装，不管是出于便利性考虑还是必要性考虑。

出于适应模板化目的生成的所有适体可具有其所测量的结合亲和力(如由其K_d值所指示)。这种亲和力测量可通过包括但不限于以下的各种方法进行：BiaCore仪器、平衡透析、凝胶移位分析、滤器结合分析、以及与结合和未结合的材料的分离过程组合的定量PCR(参见Jing等人,Anal.Chim.Acta,2011,686,9-18)。

在单倍体模板化组装的任何应用期间，单倍体与所需模板的杂交可为特异性的。可通过选择目标细胞类型所特有的靶分子使非特异性杂交最小化。在仅点突变区分靶分子的情况下，脱靶分子杂交的风险是显著的。提供单倍体的模板的适体的使用提供完全消除非靶分子杂交的独特机会。

具有L-核糖(L-DNA)而不是D-核糖的DNA类似物需要纯手性互补核酸链以供双链体的形成。因此，由L-DNA构成的模板不能与全都具有D-核糖的任何天然核酸杂交。L-DNA模板标签可被附加到适体上，以便模板化杂交部分也是由L-DNA构成的效应物部分部分。L-DNA单倍体也是有利的，因为其杂交部分对所有核酸酶有高度抗性。L-DNA的单链不应与左手DNA双链体(Z-DNA)相混淆。

在用于适体展示的生物正交杂交的方法的一些实施方案中，将预定义的单态适体的可接近的5’端经由互相反应性点击化学反应用L-DNA序列标签来衍生化。将5’点击基团经由用合适的修饰上链引物扩增引入到适体中(参见图15)，其中下链引物带有5’生物素以促进上部(适体)单链的生成(参见图5或图6)。在与过量的带有3’点击基团(与由适体携带的5’点击基团互相反应)的所需L-DNA进行化学连接之后，适体携带对应于所需L-DNA序列的5’标签。一旦靶结合，L-DNA标签便可充当单倍体的模板，但只有当这些单倍体同样携带互补L-DNA杂交部分时才可以。

在用于适体展示的生物正交杂交的方法的一些实施方案中，将单态适体的可接近的3’端经由互相反应性点击化学反应，用L-DNA序列标签来衍生化。在此情况下，将预定义的适体的3’端经由RNA连接酶I与带有5’磷酸和3’点击基团的短寡核苷酸序列(dT_6-8)酶促连接。在此情况下，适体5’端带有5’羟基。在此之后，可用过量的带有5’点击基团(与由适体携带的3’点击基团互相反应)的所需L-DNA进行化学连接。所得的适体产物携带对应于所需L-DNA序列的3’标签。一旦靶结合，L-DNA标签便可充当单倍体的模板，但只有当这些单倍体同样携带互补L-DNA杂交部分时才可以。

在用于适体展示的生物正交杂交的方法的一些实施方案中，在空间上邻近地结合至指定靶的双重适体被用于展示L-DNA模板。此方法使用分别带有5’和3’L-DNA标签的适当的左适体和右适体(被预定义为通过共结合连接向近端结合至所需靶分子；参见图12)，如分别在图15和图16中所详示。在此情况下，使用具有L-DNA杂交部分的单倍体，但单倍体不只单独针对单个适体的5’端(如在图15中)或单个适体的3’端(如在图16中)。相反，单倍体针对双重适体对的每个适体的末端，以便生物正交反应性经由结合于常见靶分子上的双重适体的空间邻近性来促进(参见图17)。

具体参看附图，图12示出了由向近端靠近复杂分子上的靶位点共结合的一对适体进行的二元适体的形成。适体末端在此夹板上的连接可通过T4DNA连接酶实现，或通过小球藻DNA连接酶更有效地完成，所述小球藻DNA连接酶在通过RNA夹板的DNA末端的连接中高度有效(New England Biolabs)。连接之后，夹板可用RNA酶H除去。虚线椭圆表示在RNA夹板除去之后由二元适体提供的可接近的模板。

具体说来，图15示出了附加到单态适体的5’端上的非天然L-DNA标签。使预定义的适体再扩增，其中上链引物带有5’点击基团，且下链引物带有5’生物素。扩增之后，可制备对应于原始适体序列的单链(与图5或图6一样)。所得的适体随后可与过量的带有3’-点击基团的所定义序列的L-DNA标签反应，所述3’-点击基团与适体点击基团正交反应。在结合其靶分子之后，适体将附加的L-DNA序列展现为5’模板，带有互补L-DNA杂交部分的单倍体可识别它。弯曲箭头表示不同单倍体之间的邻近诱导的反应。

具体说来，图16示出了附加到单态适体的3’端上的非天然L-DNA标签。将具有可接近的3’端的预定义的适体与带有5’磷酸和3’点击基团的短单链寡核苷酸(如dT₈)借助于RNA连接酶I连接。所得的适体随后可与过量的带有5’-点击基团的所定义序列的L-DNA标签反应，所述5’-点击基团与适体点击基团正交反应。在结合其靶分子之后，适体将附加的L-DNA序列展现为3’模板，带有互补L-DNA杂交部分的单倍体可识别它。弯曲箭头表示不同单倍体之间的邻近诱导的反应。

具体说来，图17示出了附加到双重适体的3’和5’端上的非天然L-DNA标签，用于导向单倍体通过生物正交杂交的空间邻近性。在近端结合相同靶分子的适体的3’和5’末端处的L-DNA标签可通过图15和图16的方法分别被附加。

在用于适体展示的生物正交杂交的方法的一些实施方案中，二元适体被用于展示L-DNA模板。为了实现这点，使用双重衍生化过程。最初，包含通过共结合针对邻近性预选择(参见图12)的二元物的左和右区段的单态适体是以分别与图16和图15相同的方式用L-DNA标签衍生化。在此情况下，L-DNA标签还具有分别附加到其3’和5’末端上的氨基(参见图18；图A和B)。在每个L-DNA标签序列的初始化学连接之后，氨基可用适当的点击基团，经由N-羟基琥珀酰亚胺化学反应来衍生化。可进行这些反应，因为一旦先前的点击基团已经反应，产物便对二次衍生化呈惰性。完全衍生化的L-DNA标签标记的适体又可通过共结合至目标靶分子而在化学上连接在一起。在此情况下，每个L-DNA标签之间的相互作用通过短的(即4-6个碱基)彼此互补的末端序列得到促进(参见图19)。这形成了短茎环，其又通过提高空间邻近性促进杂交L-DNA单倍体的后续反应(参见图19)，如先前用带有点击反应性基团的寡核苷酸示出。

具体说来，图18示出了用桥连非天然L-DNA序列装备二元适体，以便通过生物正交杂交导向单倍体的空间邻近性。图A示出了用衍生化的L-DNA标签制备左适体。L-DNA标签的初始键联是与于图16一样的，例外的是L-DNA带有3’-氨基以用于点击基团的二级衍生化。图B示出了用衍生化的L-DNA标签制备右适体。L-DNA标签的初始键联是与图15一样的，例外的是L-DNA带有5’-氨基以用于点击基团的二级衍生化。在这两种情况下，可进行二级衍生化，因为一旦先前的点击基团已经反应，产物便对二次衍生化呈惰性。

具体说来，图19示出了用桥连非天然L-DNA序列装备二元适体，以便通过生物正交杂交导向单倍体的空间邻近性。示出了带有L-DNA序列的左和右衍生化的适体的靶分子上的化学连接以及与单倍体的后续杂交。每个左和右L-DNA区段被设计以具有短的(即，4-6个碱基)彼此互补序列，从而促进局部相互作用与后续的单倍体空间邻近性。

在一些实施方案中，点击反应性基团可为但不限于叠氮化物和带状(strained)环辛炔基团、或四嗪衍生物及反式环辛烯基团。对于5’模板修饰，上链引物最初可用5’氨基合成，其随后可通过与点击基团-N-羟基琥珀酰亚胺部分的反应转化为适当的点击基团。

配体诱导的变构结构变化的许多情况已在RNA和DNA适体下记录。这种效应已有利地用于生成特定的适体官能团，如适体信标(aptabeacon)和适体感应物(aptasensor)。在此情况下，可进行针对变构效应的选择以便仅暴露适体来源的模板，用于结合至靶分子之后的效应物部分部分杂交。这些类型的变构适体向适体作为模板组装的展示媒介物的效用增加了额外的能力。具体地说，其中可接近的模板仅在靶分子结合之后暴露的适体系统保证了减少非特异性单倍体相互作用。换句话说，在适体遇不到特定靶的环境中，模板都不可用于模板化组装。

在用于选择变构适体以供单倍体应用的方法的一些实施方案中，选择单态适体，其中仅暴露用于模板组装的末端模板序列并且在适体结合至特定靶分子之后是可接近的。此过程示意性地示于图20中，并且涉及阴性和阳性选择的循环。第一步涉及将未经选择的适体文库划分成在溶液中具有可接近的末端的那些成员和其末端不可接近以杂交的那些成员，如用生物素化探针序列所定义。文库的溶液可接近的成员可通过使退火探针结合至例如固相链霉抗生物素基质被除去。此过程因此阴性地选择在溶液中其模板序列不能接近所添加的探针分子的折叠适体。在此群体内，可对由于靶结合而生成可接近的模板序列的成员进行第二阳性选择(再次借助于例如生物素化探针序列)(参见图20)。此阳性选择类似于针对具有可接近的靶的单态适体的选择过程，如图8所示。当扩增所得的选定适体并制得适当的单链制剂时，所述过程可以循环形式重复进行。当所选群体的异质性在N个循环之后高度降低时，可克隆所得的群体并筛选个别适体。候选适体可符合原始选择标准，即难以在游离溶液中实现基于模板的相互作用，但在特定的模板存在下易于实现这种相互作用。变构诱导的可接近的模板也可允许单倍体的模板化组装。

具体说来，图20示出了适体变构性的选择过程，其中靶分子结合诱导模板序列的暴露和/或可接近性。其模板化序列在溶液中是可接近(在靶分子存在之前)的适体可通过与例如适当的生物素化探针序列初始杂交并且固定在例如固相链霉抗生物素基质上而被除去。可将上清液级分与靶分子在溶液中孵育。结合至靶分子并经历变构变化的适体是通过例如生物素化探针结合可选的，所述变构变化使模板序列转变为可接近的。其模板序列保持掩蔽或难接近的那些适体则不是。因此，前者在例如固相链霉抗生物素基质上的分离允许其实现选择性扩增。以此方式获得的洗脱的适体制剂随后可经受整个循环的重复。可进行循环直到所得群体的分析显示出高度降低的同质性，此后可进行特定克隆适体的分析。

在用于选择效应物部分部分应用的变构适体的方法的一些实施方案中，选择二元适体，其中包含二元形式的各单态组分的3'和5‘末端仅在靶分子结合之后暴露于可接近的邻近性处。针对目标靶的左适体和右适体最初都可以与本文所述方法相同的方式来衍生化，其中这两个适体仅在与靶分子相互作用之后展现在变构水平上可暴露的模板序列。这种靶导向的适体群体可经受共结合过程及夹板导向的原位连接。特定的二元对可通过将近端二元单元扩增为单个连续序列而被鉴别和表征(参见图11，引物a+d)。当鉴别特定的对时，夹板清除可通过使用RNA酶H(如图12中)实现，之后接合模板序列可用于单倍体模板化组装。此变构二元过程示于图21中。

具体说来，图21示出了针对连接的二元物的原位生成的适体变构效应的应用。二元适体对的每个左和右组分之间的连接模板序列仅在靶分子结合及在空间上邻近的末端模板的变构暴露之后可用。这种对可通过在原始靶上的共结合、RNA夹板介导的连接及扩增来鉴别。一旦已经鉴别了特定的二元适体对，它们便可以例如图12中所详述的相同方式用于单倍体模板化。

本公开还提供了向病原性细胞递送至少一个适体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：向病原性细胞施用治疗有效量的任何一个或多个本文所述的适体。在一些实施方案中，在病原性细胞中产生至少一个活性效应结构。在一些实施方案中，适体与一个或两个单倍体分开施用。在一些实施方案中，产生以下至少一种：病原性细胞的程序化细胞死亡、病原性细胞的凋亡、病原性细胞的非特异性或程序化坏死、病原性细胞的裂解、及病原性细胞的生长抑制。在一些实施方案中，病原性细胞选自由以下组成的组：病毒感染细胞、肿瘤细胞、感染了微生物的细胞、及产生可引起炎症、过敏或自身免疫性病状的疾病诱导或疾病调节分子的细胞。

参看附图，图1示出了一种用于蛋白质或其它大分子靶的代表性方法。与通过基于数字的杂交规则的核酸靶向不同，此形式的模板化是基于形状的，且因此在性质上被认为是“类似物(analog)”。弯曲箭头表示不同单倍体之间的邻近诱导的反应。

具体说来，图2示出了用于非核酸大分子模板化的适体的代表性布置。在一些实施方案中，将适体序列的区域用于带有生物正交反应性基团的单倍体的基于杂交的模板化。弯曲箭头表示不同单倍体之间的邻近诱导的反应。

在一些实施方案中，病原性细胞是病毒感染细胞且所述方法产生以下至少一种：病毒感染细胞的程序化细胞死亡、病毒感染细胞的凋亡、病毒感染细胞的非特异性或程序化坏死、病毒感染细胞的裂解、病毒感染的抑制、以及病毒复制的抑制。在一些实施方案中，病原性细胞是肿瘤细胞且所述方法产生以下至少一种：肿瘤细胞的程序化细胞死亡、肿瘤细胞的凋亡、肿瘤细胞的非特异性或程序化坏死、肿瘤细胞的裂解、肿瘤细胞生长的抑制、致癌基因表达在肿瘤细胞中的抑制、以及肿瘤细胞中的基因表达的修饰。在一些实施方案中，病原性细胞是微生物感染的细胞且所述方法产生以下至少一种：微生物感染细胞的程序化细胞死亡、微生物感染细胞的凋亡、微生物感染细胞的非特异性或程序化坏死、微生物感染细胞的裂解、微生物感染的抑制、以及微生物复制的抑制。

在一些实施方案中，肿瘤细胞是由适体所靶向以容许通过模板组装的选择性细胞杀伤。在一些实施方案中，特定的蛋白质或翻译后修饰的蛋白、蛋白复合物、碳水化合物、脂质、磷脂、糖脂、核酸及核糖核蛋白可关于适体结合和模板呈现而被靶向。特定的靶可以一些方式由正常形式改变以使得它们只限于细胞谱系特异性或任何肿瘤细胞，或者在其正常的细胞定位上改变。指定的靶分子可定位于细胞表面或见于细胞内，在胞质或细胞核任一者内。

在一些实施方案中，当突变的肿瘤蛋白具有改变的构象时，它们提供针对用于模板组装目的的适体介导的模板呈现的有用的靶。这种构象变化包括但不限于通常内化残基的错误折叠和暴露、朊病毒样结构域的诱导、以及改变的蛋白-蛋白相互作用。

在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白靶分子是需要的，并且是基于适体的模板化组装的潜在靶。它们包括但不限于突变的致癌基因、生长因子、细胞周期调节子和转录因子。

在一些实施方案中，非蛋白分子肿瘤标记是需要的，并且是基于适体的模板化组装的潜在靶。作为一个非限制性实例，磷脂(包括但不限于磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺)可在肿瘤细胞之外及肿瘤相关的脉管系统中以“由里向外的”方式异常地表达。

在一些实施方案中，病原性细胞内的靶分子最初可未必存在，但作为特定的早先或同时药物治疗的结果被表达。作为由药物诱导的肿瘤特异性标记表达的一个非限制性实例，脱甲基剂可优先在结肠直肠癌细胞中诱导内源性逆转录病毒序列(Roulois等人,Cell,2015,162,961-973)。作为此效应的另一非限制性实例，在肿瘤中的异常表面磷脂表达在一些情况下可通过常规的细胞毒性药物治疗选择性地提高。

在一些实施方案中，肿瘤细胞发育期间发生的表面分子的异常群集可用作基于适体的模板组装的靶。作为一个非限制性实例，已知细胞表面聚糖和糖蛋白的组成在某些肿瘤细胞中显著改变(Paszek等人,Nature,2014,511,319-325)，结果是其它分子的表面群集增加。因此，重要的信号传导蛋白如整联蛋白在这类肿瘤细胞表面上与匹配的正常组织细胞相比获得更大的空间邻近性。因此，在一些实施方案中，可针对合适的表面表达整联蛋白开发适体。

在一些实施方案中，靶向各种其它病原性细胞。其包括但不限于其清除有益于人或动物的病原性免疫细胞或免疫细胞。在这种情况下，特定的分子靶包括但不限于克隆B或T细胞各自的抗体或T细胞受体的独特型结构域、细胞谱系特异性表面标记、和细胞谱系特异性细胞因子。

在一些实施方案中，靶向病毒感染的细胞。病毒特异性靶可为胞内病毒转录物或宿主转录物，其由于病毒感染而被诱导成异常表达模式，或者还表现为病毒复制结果的表面结构。后者的非限制性实例包括磷脂如磷脂酰丝氨酸的异常表面表达。

在一些实施方案中，基于适体的模板组装的肿瘤特定靶分子可未被表征为特别是经历体内进行性进化变化的个体肿瘤，这些变化与提高的肿瘤异质性有关。在此，新型适体靶可通过物理扣除方法，借助于相同谱系的匹配的正常细胞来分离。最初，使用特定的目标肿瘤细胞类型，以及出于扣除目的使用匹配的正常对照细胞类型。作为后者的替代，且特别是当已随时间逐渐采集多个活检样品时，在进化过程较早阶段的肿瘤样品可用作“扣除(subtractor)”材料。

在一些实施方案中，肿瘤和同源正常细胞样品可具有各种描述。它们包括但不限于全细胞(针对细胞表面靶进行选择)、全细胞胞质裂解物(针对所有胞内靶进行选择，包括蛋白质、RNA和核糖核蛋白)、或全RNA。

在一些实施方案中，使用肿瘤来源的目标原始材料进行对于结合剂的初始一轮的左适体和右适体选择(参见图22)。如果原始材料是全细胞，那么可在结合选择期间通过低速离心和洗涤除去未结合的材料。如果原始材料是全细胞胞质裂解物或全细胞RNA，那么可通过例如差异PEG沉淀除去未结合的材料。此步骤之后可以是结合至材料的适体从同源正常来源中的扣除除去，其中结合与未结合的分离与初始步骤中是相同的。视情况而定，这些步骤可通过一系列循环(10个这类循环通常是足够的)重复。

具体说来，图22示出了结合来自肿瘤细胞来源的靶的适体与结合匹配的同源正常细胞的适体之间的扣除。原始材料可以是全细胞(针对细胞表面靶选择)、全细胞胞质裂解物(针对所有胞内靶选择，包括蛋白质、RNA和核糖核蛋白)、或全RNA。L-和R-适体文库最初可用于选择结合至肿瘤来源的亚群，并且其通过结合至相应的正常来源靶而逃避清除，以便富集排外地结合肿瘤相关分子的适体。这个结合和扣除过程可以重复合适的循环数(n，如所示)。将这类正常对应物直接结合至肿瘤的L-和R-适体文库也可针对过程的下一阶段来直接选择，使用相同的循环数(参见图23)。

在这种方法的一个变型中，正常的目标原始材料(对应于肿瘤原始材料)也可用于针对直接结合左适体和右适体群体进行选择，其中结合与未结合的分离与上文所述的相同。所得的结合正常靶分子的左适体和右适体的亚群可用于后续选择性目的。

在上述适当的循环之后所示的步骤之后，目标及扣除同源正常来源的左适体和右适体结合肿瘤来源的选定亚群可用于对相同原始肿瘤来源的共结合实验。它们对应于图23的共结合过程，其中L(TΔN)和R(TΔN)分别表示目标及扣除同源正常来源的左适体结合肿瘤来源、和目标及扣除同源正常来源的右适体结合肿瘤来源。另外，可能有用的是用L(TΔN)和R(TΔN)亚群进行测试，所述亚群连同相应的右和左适体一起共结合至肿瘤靶，这些适体先前针对与同源正常靶(分别是R(N)和L(N))的结合而被选择。其对应于图23中所示的共结合过程。

具体说来，图23示出了结合来自肿瘤细胞来源的靶的适体与结合匹配的同源正常细胞的适体之间的扣除。继续参照图22，可用L-和R-肿瘤结合、正常来源扣除的亚群进行共结合实验，(共结合过程1)而且还用与来自相应正常来源的R-和L-亚群(分别)共结合的这些L-和R-群体中的每一个。“半正常”二元物的用途是用于提高发现可扩增的二元产物的概率，其中至少一半具有肿瘤特异性。

图23中所示的扣除/共结合过程的基本原理来源于新型肿瘤特异性靶的未知表面密度。虽然由左和右肿瘤限制表位构成的二元物是需要的，但定义肿瘤子集的单态表位仍然很有价值。识别这样一个表位连同近端正常表位的适体保持其识别靶肿瘤细胞的能力，而且获得与二元适体有关的特异性和亲和力的改善。

在一些实施方案中，扣除过程涉及有和没有体外药物治疗的肿瘤靶细胞。在此，药物治疗的全肿瘤细胞或治疗的肿瘤细胞提取物可用于选择L-和R-适体结合物，并且相应的未治疗的肿瘤细胞同样经受相同的选择过程。对于用于药物治疗群组的每个选择循环，可除去结合未治疗的细胞或未治疗的提取物的适体。最终，可进行针对结合治疗的肿瘤靶的二元适体的共结合选择，其中L-和R-组分中的任一者或两者都排外地结合至治疗的制剂，类似于图23中所示的肿瘤/正常细胞。

在一些实施方案中，药物治疗的非限制性实例可为干扰素-β、Hsp90抑制剂、激酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性剂、DNA脱甲基剂或HDAC抑制剂。在这种方法范围内，还包括这种药物治疗的任何组合。

在一些实施方案中，模板组装过程可有效地用于体外细胞选择过程或细胞诊断。这尤其适用于二元方法，其中更容易在靶分子上组装二元物，如同L-DNA标签标记的二元物或二元变构适体一样。这可适合于体外应用，尤其是用于罕见细胞子集的导向鉴别和选择。

在一些实施方案中，针对鉴别或选择在体外靶向的细胞类型包括但不限于免疫细胞子集、天然干细胞子集、诱导的干细胞子集、内分泌细胞子集和神经细胞子集。

在用于诊断或研究目的的一些实施方案中，可在体外标记靶细胞亚群以用于借助于例如二元荧光适体结合及效应物部分部分模板化的基于荧光的细胞分选。荧光部分可由任一或两个适体携带，或借助于单倍体之间的反应。

在一些实施方案中，出于诊断、治疗、或研究目的，靶细胞亚群可在体外通过递送模板化组装介导的杀伤信号的二元适体被除去。此方法的一个实例是针对不被在这种环境中使用的特定二元适体所识别的亚群的阴性选择。

在一些实施方案中，出于诊断、治疗、或研究目的，特定的细胞亚群可在体外被导向模板化组装介导的阳性可选标记产生的二元适体所靶向。

在一些实施方案中，可选标记包括但不限于荧光部分、抗体可用的肽或其它分子结构、或针对可用的蛋白-配体系统的装配亲和力标签。

在一些实施方案中，二元适体的左和右组分是针对已知靶蛋白内的短的连续肽，所述靶蛋白的结构是可用的，或其结构具有较高的构象灵活性，或其结构固有地无序。其非限制性实例是人黑素皮质素-1受体(MC1R)的N末端胞外结构域，它是由36个氨基酸残基(参见图24，图A)构成并且广泛地在正常黑素细胞和黑色素瘤细胞上表达。在此序列段内的五肽序列可充当独立的适体靶，其中最佳候选物主要具有带电或亲水性残基。所选位点，在本文中称为“表位”(参见图24，图A；SQRRL和QTGAR，从N末端按顺序)，还带有一个或多个精氨酸残基，这对于针对由在中性pH下精氨酸侧链携带的正电荷而靶向的适体是有利的(Geiger等人,Nucleic Acids Res.1996,6,1029-1036)。尽管许多蛋白质带有这些五肽序列中的任一个，但具有这两个序列的已知蛋白质(除MC1R之外)不存在于现有的数据库中。

具体说来，图24(图A和B)示出了人MC1R蛋白的N末端胞外结构域(图A)。加框区域表示供适体靶向的两个潜在表位(SQRRL和QTGAR)。图B示出了用结合这些五肽的L-和R-适体亚群的组合的共结合实验。

在一些实施方案中，分别结合至SQRRL和QTGAR的L-和R-适体亚群可通过标准方法来选择(参见图4)。针对两种五肽的L-和R-适体的各组合可经受先前所述在完整黑色素瘤细胞上的结合过程以表达MC1R(参见图12和图24，图B)。L/R适体的特异性共结合在这种情况下出现在MC1R N-末端上而不是在别处。结合至MC1R的二元适体容许针对黑素细胞谱系(包括黑色素瘤细胞)的效应物部分的模板组装。

在此实施方案的变型中，可对于SQRRL和QTGAR序列的D-异构体选择L-和R-适体。这提供了随后合成L-适体(镜像异构体；来自具有D-核糖手性的所选正常适体的衍生序列)的机会，所合成的L-适体识别原始靶(正常的L-氨基酸)的相反手性。

在一些实施方案中，可接近的短氨基酸序列段可以是通过异常折叠而特异性地暴露在肿瘤相关蛋白上的疏水性残基，该异常折叠与未折叠的蛋白响应的诱导有关。

在一些实施方案中，在细胞内递送的单态或二元适体结合至折叠的RNA序列以便其借助于提供用于模板组装的可靶向的模板充当RNA的衔接子。在这种排列中，结合的适体出于模板化目的修改靶RNA，而不是使用靶RNA序列本身修改单倍体。这补充了在其中不存在用于在有用的靶RNA中导向模板组装的可接近且有效的位点的环境中的常规模板组装。

在一些实施方案中，效应物部分部分的适体介导的模板化导向由充分表征的治疗性抗体所识别的肽表位的组装。这类抗体包括但不限于识别HER-2/neu、EGFR和VEGF的抗体。当对应于靶抗原上的识别位点的短肽序列不可用时，此实施方案还包括用可用的目标抗体借助于例如肽噬菌体展示文库(如在鉴别淋巴瘤抗体结合特异性中所用)进行的肽表位鉴别。

在一些实施方案中，适体不管是作为二元对的成分抑或呈单态都结合至表面阴离子磷脂，包括但不限于磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇。在一些实施方案中，通过提供在中性pH下带有正电荷的辅因子来加强关于结合阴离子靶的适体的选择。它们包括但不限于小的胺，如腐胺、精胺和亚精胺。

在一些实施方案中，细胞表面靶是人整联蛋白-β1胞外结构域。

在一些实施方案中，已知的表面结构的配体可用引物位点共价地标记，并且寻找共结合(近端)单态适体。在鉴别目标适体之后，配体-引物和近端单态可作为二元适体与可除去的RNA夹板预连接，以便用单倍体进行细胞表面模板化(或与L-DNA序列进行点击-连接)。

与常规的模板化组装相比，适体介导的适应模板化存在众多优势。例如，适体极大地扩展了可靶向的分子的范围至以下：蛋白质、肽、碳水化合物、特定的两亲性脂(例如磷脂)、以及核酸结构(而不可另外通过常规的模板组装靶向)(如高度折叠的RNA二级结构)。适体也容许模板组装在细胞表面上进行。细胞表面模板化规避了许多递送问题，因为不需要细胞渗透。

与基于抗体的替代物相比，适体介导的适应模板化还存在众多优势。不同的细胞表面靶至用于免疫识别的常见靶结构的转化在适体存在下是可能的。例如，靶细胞表面结构的适体介导的识别容许由先前开发的抗体或CAR-T系统识别的无痕肽的模板化组装。靶细胞表面结构的适体介导的识别也容许由先前开发的抗体或CAR-T系统识别的点击连接的肽模拟物的模板化组装。在这两个实例中，适体模板化区域和带有反应性半表位的互补单倍体都是模块化的，并且如果使用L-DNA标签，那么所述系统可涉及生物正交杂交。

另外，当靶结构在先前已知时，抗体-药物复合物或CAR-T系统的开发是复杂且昂贵的。相比之下，在分离特异性识别适体之后，适应模板化系统是“待用的”并且利用已有的模板组装技术。

当最新定义靶结构时，开发将靶特异性与模板化组装模板组合的新型适体要比相应抗体快得多且便宜得多。

当靶结构未知时，可将适体文库用于扣除方法以检测在正常细胞不存在下肿瘤细胞上的新型表面结构或对比未治疗的肿瘤细胞在药物治疗的肿瘤细胞上的新型结构。在基于抗体的技术的情况下，这是不切实际的或要困难得多。

对于其中可使用抗体而非适体的所有情况，相对较小的适体在肿瘤微环境中提供接近肿瘤细胞的独特优势。并且极其可能的是，与大的蛋白质分子如抗体相比，适体可有效地在细胞内转染(对于结合胞内靶)。

为了能更有效地理解本文所公开的主题，在下文中提供实施例。应理解，这些实施例仅出于说明性目的，并且不应被视为以任何方式限制要求保护的主题。在这些实施例中，除非另外指示，否则分子克隆反应及其它标准重组DNA技术是根据Maniatis等人,Molecular Cloning-ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press(1989)中所述的方法，使用可商购获得的试剂进行。

实施例

实施例1：在固相靶上的共结合选择的例证及在共结合选择之后二元适体候选物的序列确认

在左适体和右适体文库的4个单独选择循环之后，将洗脱的亚群与生物素化免疫球蛋白Fab靶(针对BRD7蛋白；ThermoFisher)一起孵育，然后通过结合至链霉抗生物素-磁性珠粒转变为固相。在用0.5ml PBSM洗涤3次并用1x T4DNA连接酶缓冲液(NEB，含有1mMATP)洗涤1次之后，将制剂再分成两等份并用DNA夹板(5’-TCCAGATGTCTTTGCTTTCTTCAGGACACAG(SEQ ID NO:5)；100μl，1pmol/μl)通过在37℃下加热5分钟，然后在室温下保持1小时进行+/-退火。之后，用连接酶缓冲液再次洗涤制剂2次。然后将管再次分成两等份，并用+/-T4DNA连接酶处理。接着用引物Trz.F/Trz.R扩增这些反应的小样品(1μl)(参见图25)并在10％非变性丙烯酰胺凝胶上测试(参见图26)。这表明在第4循环材料下仅经由连接酶的作用且仅在夹板存在下观察到强的二元尺寸产物。值得注意地，从原始(未经选择的)适体左和右文库未见到相当强的产物条带(参见图26)。这说明与原始未经选择的群体相比，结合、洗涤和扩增的循环显著地富集Fab选择性结合物。测序揭示来自第4循环材料的共结合测试的扩增产物展示如经由夹板寡核苷酸所相连的左适体和右适体组分的理想融合(参见图26)。

具体说来，图26示出了在4个Fab选择循环之后成功的共结合以及共结合实验二元适体产物的序列分析。Cobind-01，即来自经历共结合过程的EL4左适体和右适体群体的克隆产物的任意实例(参见图12)。粗体序列是从原始适体文库中的随机化序列衍生的40-聚体序列段。加框序列是引物位点。无填充是引物Trz.F。浅灰色填充是引物AptInt.R(在此取向中呈反义)。加点填充是引物AptInt.F。无填充暗线是引物Trz.R(在此取向中呈反义)。如图11中所示，可将此特定的序列实例与二元适体的一般结构相比较。

实施例2：在Fab片段上的10个选择循环之后的单态适体分析和二元适体生成(共结合过程)

在针对单态左适体和右适体亚群在生物素化Fab靶上的10个单独选择循环(参见图4)之后，将所得的亚群克隆并测序。此处(与来自第4循环的结果对比)，观察到特定适体序列的多次重复出现。由14个测序特异性单态(来自左和右克隆群体各7个)可见特定的右适体的3次重复出现(指定为288/10AptR1；参见图27)。

然后如图28所示，使来自Fab靶的左和右第10循环适体亚群经历在Fab靶上的共结合工序(参见图12)。接着对所扩增的二元产物测序并表征。发现右适体克隆228/0AptR1(先前作为重复出现的单态克隆被观察到)(参见图27)也独立地见于5个独立的二元克隆中。显然，在这些二元克隆的一个(10CB-10)中，左适体组分(229/10AptL3)先前已从第10循环左适体亚群中被独立地分离并测序(参见图30)。相同序列在已针对Fab结合而选择的单态和二元适体亚群中的重复出现与亚群尺寸朝向具有有用Fab结合亲和力的一组适体的预期减小一致。

具体说来，图27示出了结合生物素化Fab的适体的第10循环分析。示出了重复出现的单态适体克隆228(10AptR1)。用相应引物序列(如所示)示出整个R-适体。

具体说来，图28示出了第10循环的L-和R-适体与生物素化Fab的共结合测试。观察所选(第10循环；泳道1)适体对的产物，但在此灵敏度水平下，在初级(未经选择的)适体时未见到这样的产物。共结合过程(示意性地示于图12中)等同于用于第4循环适体的过程(参见图27)。

具体说来，图30示出了特定的第10循环适体(10AprR1、10AptL3)与bFab的直接结合(使用链霉抗生物素磁性珠粒的直接结合测定)。将适体与bFab(2.5倍摩尔过量)一起孵育，然后结合至SAMB。取上清液，并且洗涤SAMB 3次。将结合的材料用0.1M NaOH洗脱，然后沉淀，洗涤，干燥并重构，之后将样品加样到变性丙烯酰胺凝胶上。“未生物素化的Fab”(bFab)表明在初始孵育期间不存在bFab，但随后用与(+)bFab管相同的SAMB处理适体。M是尺寸标记(上条带60个碱基；适体条带85个碱基)。

实施例3：特定的第10代单态适体与Fab靶的结合的直接例证为了评估第10循环单态适体与选择性剂(Fab靶)的结合，进行直接结合测定。此时，将单链适体制剂(通常自退火)在PBSM中在有或没有生物素化Fab片段下孵育，然后吸附到链霉抗生物素磁性珠粒上。在此孵育期之后，将珠粒磁性分离，并且保留上清液。在3次洗涤珠粒之后，借助于采用100μl 0.1M NaOH的2x 20第二次孵育洗脱结合的材料，且用0.3M乙酸钠和3体积乙醇立即沉淀洗脱液。用70％乙醇洗涤沉淀，并干燥。在5μl TE中重构之后，将1μl样品在甲酰胺中变性并在10％尿素(变性)凝胶上跑胶。采用候选单态适体228/10AptR1(参见图27和图29)和229/10AptL3(参见图29)和特定的任意未经选择的对照右适体(#136；序列对应于：GCAAAGACATCTGGACACGCCACTTATAGTCTACGTGAAGCACTGCGCTGGAACAGCCTAAAAAAGGAGAAGGAGACTTAGAGGC(SEQ ID NO:6)；其中下划线指示40-聚体适体序列段；其余序列是引物位点)的这种实验的结果示于图30中。仅在生物素化Fab存在下耗尽来自228/10AptR1与229/10AptL3结合(而非#136)的上清液。此外，来自链霉抗生物素磁性珠粒上的生物素化Fab的洗脱材料仅高度富集针对228/10AptR1和229/10AptL3的适体条带(参见图30)。这些结果强烈地提示，所选适体228/10AptR1和229/10AptL3显示出与Fab靶的显著和特异性相互作用。

具体说来，图29示出了由第10循环共结合实验获得的代表性二元克隆10CB-01(参见图29)。此二元物的左适体组分(229/10AptL3，如所示)先前从左单态亚群中直接独立地分离；右适体组分(228/10AptR1)先前从左单态亚群中直接独立地分离(参见图28)。

实施例4：特定的第10代二元适体与Fab靶的结合的直接例证尽管二元适体在其结合的靶上实现成功的原位组装(如在实施例1中)，但不能推断在溶液中形成的二元适体将能够结合相同的靶。这是使用如直接结合测试中使用的相同适体(实施例3；228/10AptR1和229/10AptL3)来评估，但其中最初借助于实施例1中使用的相同夹板寡核苷酸将适体连接在一起。在与实施例3相同的实验条件下，当等量的样品在变性凝胶上跑胶时，见到对应于二元产物的结合条带以及如所预期的相应夹板寡核苷酸(参见泳道A，图31)。将组分单态适体中的一个(228/10AptR1)用作对照，且如先前所示观察到结合条带(参见实施例6，图30)。未见到二元产物结合至单独的链霉抗生物素珠粒(参见泳道C，图31)，表明需要Fab结合。在此情况下，将另外的对照与直接对链霉抗生物素具有结合亲和力的已知适体一起使用，且此时如所预测，见到与Fab的存在无关的结合条带(参见泳道C，图31)。具体说来，图31示出了生物素化Fab靶被二元形式的已知Fab结合单态适体的结合。

实施例5：IgG1抗体上的共结合测试

虽然用于上述实施例中的选择的靶是生物素化的Fab，但希望由此过程产生的适体也能识别相同同种型的完整免疫球蛋白(鼠γ1)。此实施例充当以下一般示例：使用较大分子或分子复合物的较小组分来初始鉴别单独的左和右结合适体，然后使用这些初始亚群来鉴别识别更大所需靶的二元适体。

将来自生物素化Fab上的第10选择循环的左适体和右适体群体用于对完整鼠IgG1(Santa Cruz Laboratories)的共结合测试。这是以与先前在生物素化Fab上的共结合测试(参见图27)相同的方式进行，但其中IgG1代替Fab(以相同的摩尔量)，并且IgG1本身通过结合至蛋白G磁性珠粒(New England Biolabs)而被吸附到固相上。在夹板介导的连接、洗涤和洗脱(与实施例2一样)之后，用限定所连接的二元适体的引物扩增(25个循环)产物(参见图11)，并且在非变性丙烯酰胺凝胶上分析(参见图32)。结果显示所选的左适体和右适体群体产生二元产物条带，所述二元产物条带仅当存在夹板寡核苷酸和连接酶两者时才产生(参见图32)。未从初级(未经选择的)适体文库中观察到这种容易检测的条带。

具体说来，图32示出了第10循环Fab选定适体的IgG1靶上的共结合。用于共结合的方法(参见图12)等效于图27中所使用的方法，例外的是IgG1是靶而不是生物素化Fab，并且在固相上的选择通过IgG1结合至蛋白G-磁性珠粒来实现。

实施例6：在固相模板上的效应寡核苷酸模板化

对于适用于模板组装的适体，其应展示充当用于效应物部分的模板的足够长度的可接近序列。指定适体序列充当模板的能力最初借助于相应的脱硫生物素化寡核苷酸序列来评估，所述脱硫生物素化寡核苷酸序列通过捕获于链霉抗生物素磁性珠粒上而转变为固相。与适体接合区有关的模型模板的序列及互补测试寡核苷酸示于图33中。作为与无痕施陶丁格化学物的模板组装反应性的适宜模型，采用以Inverse Electron-Demand Diels-Alder(IEDDA)化学反应物修饰的寡核苷酸。为了做到这一点，在室温下将具有5’或3’氨基修饰的寡核苷酸(参见图33)与N-羟基琥珀酰亚胺活化的反式环辛烯(TCO)酯或相应的甲基四嗪(MTZ)酯在磷酸盐缓冲盐水中反应4小时。此后，通过脱盐柱(BioRad)除去未反应的酯。可在变性凝胶上经由明确的迁移率差异将所得的寡核苷酸加合物与未反应的对照相应寡核苷酸区分(参见图34)。

具体说来，图34示出了用于氨基末端寡核苷酸衍生化的TCO和MTZ试剂的结构，以及在修饰的207和208寡核苷酸产物中的迁移率改变的示例。

虽然与靶模板退火并经由IEDDA点击化学反应连接的测试寡核苷酸不能直接扩增，但如果寡核苷酸对的相对端被常规连接的话，则产物可通过反向PCR来扩增。为了实现这点，测试模板互补寡核苷酸(207和208，参见图33)配备有彼此相容的限制位点。在模板化测试中使用之前，TCO修饰的207和MTZ修饰的208寡核苷酸分别与它们的3’和5’末端互补的28-聚体寡核苷酸退火(参见图33和图34)。(与207的3’端互补的寡核苷酸：TGTAGGACTCTAGATCGGAAGTTGTAGC(SEQ ID NO:7)；与208的5’端互补的寡核苷酸：CTCGAAGGCTACGTGCTAGCGCATACAT(SEQ ID NO:8))。之后，分别用X ba I和Nhe I消化部分双链体的TCO修饰的207和MTZ修饰的208寡核苷酸。当这些寡核苷酸与其中它们的互补位点相邻的模板互相退火时，所消化的末端彼此非常接近并可通过T4连接酶有效地连接(参见图35)。

具体说来，图35示出了寡核苷酸207和208与靶模板的退火，以及所造成的双链体末端与相容的限制位点突出端的空间邻近性。连接产物可通过PCR相对于寡核苷酸的原始5’和3’末端反向扩增。

带有上述Xba I位点5’突出端的TCO修饰的207寡核苷酸与脱硫生物素化靶(适体-接合)寡核苷酸退火，然后使材料在含有1mM MgCl₂的磷酸盐缓冲盐水(PBSM)中结合至链霉抗生物素磁性珠粒。在用PBSM洗涤三次之后，添加过量的MTZ修饰的208寡核苷酸并且在37℃下孵育5分钟且在室温下孵育1小时，然后再进行三次洗涤。之后，将固相磁性珠粒制剂在含有1mM ATP的x1T4DNA连接酶缓冲液(NEB)中洗涤两次，并且分成有和没有400单位T4DNA连接酶的两份。在室温下2小时之后，将制剂在PBSM中洗涤，然后将结合的材料通过与100μMD-生物素(Sigma)一起孵育从链霉抗生物素磁性珠粒中洗脱。接着使样品在10％变性丙烯酰胺凝胶上跑胶。

结果显示在固相模板上形成的TCO修饰的207与MTZ修饰的208寡核苷酸之间的IEDDA点击产物(参见图36)。此条带通过限制位点末端的连接发生了尺寸移位(参见，泳道3对比泳道4，图36)，对应于预期的环化过程。未修饰的对照寡核苷酸未示出具有IEDDA产物迁移率的条带，但显示了对应于限制末端相连的连接特异性条带(参见，泳道1对比泳道2，图36)。

具体说来，图36示出了使用存在于适体中的序列进行的基于固相寡核苷酸的模板化。模板和寡核苷酸序列与图34中的一样。随后在相同洗脱材料下显示，PCR产物形成(相对于IEDDA连接位点呈反向)是可能的，但如所预期仅在限制末端的原位连接之后(参见图37)。这表明反向PCR是模型模板组装反应的原位模板化的合适读出。

具体来说，图33示出了二元适体接合和测试适体模板导向的连接寡核苷酸的序列。加框的N40位点是适体的随机区域。

具体说来，图37示出了固相链霉抗生物素磁性珠粒上的末端连接的寡核苷酸原位PCR产物形成(相对于IEDDA点击连接位点呈反向)。

实施例7：效应寡核苷酸在靶上的适体介导的模板化

在例证对应于二元适体模板化区域的固相寡核苷酸上的模板化之后，显示模板化可在适体模板本身上实现，同时原位结合至特定的靶。将针对结合生物素化抗BRD7Fab(bFab)选择的L-和R-适体以及任意未经选择的对照L-和R-适体分别自退火并且在有和没有35pmol bFab靶(参见表1)的适当组合(每个适体140pmol；25μl最终容积)中孵育。在室温下1小时之后，用100μl链霉抗生物素磁性珠粒在室温下在振荡下处理制剂30分钟(其中珠粒最初从储存介质中磁性分离，用1ml PBSM洗涤两次，并且在使用之前再悬浮于原始体积的PBSM中)。在此之后，将珠粒磁性地分离并用0.5ml PBSM洗涤一次，并且用100μl x1

连接酶缓冲液(New England Biolabs)洗涤两次，并且再悬浮于50μl还含有60单位鼠核糖核酸酶抑制剂(NEB)的

连接酶缓冲液(具有ATP)中。随后，添加140pmol(1.4μl)的RNA寡核苷酸，对应于L/R适体间区域的互补序列(参见图11)，具有序列：UCCAGAUGUCUUUGCUUUCUUCAGGACACAG(SEQ ID NO:9)。将制剂在37℃下退火5分钟，然后在30℃下退火1小时，之后添加25单位的

连接酶(New England Biolabs，对RNA模板上的DNA链具有高切口封接能力的小球藻连接酶)。在室温下1小时之后，将具有结合的bFab/适体-RNA双链体的磁性珠粒用100μl RNA酶H缓冲液(New England Biolabs)洗涤一次，然后在37℃下再悬浮于50μl具有5单位RNA酶H(New England Biolabs)的相同缓冲液中持续10分钟并在室温下持续20分钟。用0.5ml PBSM洗涤一次之后，将样品再悬浮于50μl PBSM中。然后使105pmol(5.3μl；相对于bFab的初始量呈3倍摩尔过量)甲基四嗪-3’-修饰的寡核苷酸208(如在实施例6中)在室温下30分钟，接着用0.5ml PBSM洗涤并且再悬浮于50μlPBSM中。随后，添加105pmol(5.3μl；相对于bFab的初始量呈3倍摩尔过量)反式环辛烯-5’-修饰的寡核苷酸207(参见实施例6)，也在室温下持续30分钟。接着用0.5ml PBSM洗涤制剂并且在室温下用100μl的0.1M NaOH/5mM EDTA的两种处理洗脱结合的DNA持续20分钟(磁性分离上清液的汇集)，然后立即在-20℃下用0.3M NaOAc、20μg糖原和3体积的100％乙醇沉淀(持续30分钟)。将制剂用1ml的70％乙醇洗涤，干燥并且再溶于4.0μl TE中。使样品(1.0μl)在15％尿素变性凝胶上跑胶。

表1.适体模板化实验(实施例7)

最初将140pmol各适体自退火，然后在有或没有35pmol生物素化抗BDR7Fab(bFab；40倍适体过量)的反应管中孵育。229、228：特定的L-和R-bFab结合适体；139、138：未针对bFab结合选择的任意L-和R-适体序列，以粗体表示。

凝胶分析显示介于模型点击标记的寡核苷酸之间的反应存在于作为结合至bFab的模板的两种特定适体上(参见图38，泳道1、2和4)。然而，在此情况下，L-(229)和R-(228)适体的夹板介导的连接是不必要的，因为当省略夹板/连接酶时观察到产物(参见泳道2)。示出了用对二元和(作为单态适体的一个实例)R-适体形式(关于引物构型，参见图11)两者都有特异性的引物经由夹板连接形成那些二元适体。如所预期，仅对于具有bFab-结合R-适体#228的制剂见到了具有R-引物的单态适体(参见图39)。当应用夹板和连接酶时仅观察到#228与其配偶体#229的二元产物(关于170bp二元条带，参见泳道1和2，图39)。

具体说来，图38示出了模型IEDDA点击反应通过同时原位结合至bFab靶的适体模板的模板化。最初选择适体#229和#228作为bFab靶上的近端二元物(p-228表示存在5’磷酸基以便能够实现经由RNA夹板与其配偶体适体的连接)；适体#139和#138是已知的非结合物。

具体说来，图39示出了原位结合至bFab的适体的结合和二元形成的PCR测试。具有#228的所有制剂(已知的R-适体bFab结合物；泳道1、2、3和6)都显示出良好的R-单态条带。然而，仅具有夹板+连接酶的一式两份制剂显示出存在二元条带。泳道3(未连接的#228/#229)显示出强的R-单态条带(示出了bFab结合)，但无二元条带(箭头)。

虽然单独的适体介导的邻近性可促进点击标记的寡核苷酸的模板化组装(参见图38)，但其它模板化应用也可受益于由二元L-R适体对提供的连续较长模板。因此，预成形的二元#229-#228适体通过以下操作来制备：在高浓度下使两条适体链与上述RNA模板退火，然后用RNA酶H除去模板(参见图40，图A)。为了除去剩余的单态链，将170-碱基二元链在琼脂糖凝胶上纯化(纯化材料的样品示于图40图B中)。随后，据证实组装的二元适体仍然结合至靶生物素化Fab，并且提供用于207-208标记的寡核苷酸点击反应的可接近的模板(参见图40，图C)。

具体说来，图40示出了二元适体在bFab靶上的原位形成和测试。图A示出了在溶液中在高浓度下RNA夹板介导的分别介于单态L-和R-适体#229与#228之间的二元适体的形成。图B示出了其中夹板被RNA酶H(变性丙烯酰胺凝胶)除去的170bp#229-#228二元物的纯化样品(1.5％琼脂糖)，图C示出了模型点击产物在结合至特定的bFab靶的二元适体上的形成。点击标记的寡核苷酸207和208的添加与图39的一样。

实施例8：可接近的模板在二元适体中借助于短茎-环桥的形成

虽然二元适体的形成可借助于可移除的RNA夹板原位实现(参见实施例6)，但开发了一种其中不需要连接的替代方法。在此，将短互补序列分别附加到L-和R-适体的3’和5’端上，其中它们邻近地结合至共同的靶。结果，适体的彼此互补修饰端形成短的茎-环桥，在图41中示意性地示出。已知出于模板组装目的，茎-环可用于模板化，证明了使用模型点击寡核苷酸。

或者，二元物可在溶液中经由茎-环杂交来组装。分别用彼此互补的10-碱基3’和5’端合成靶向生物素化Fab-BRD7蛋白的适体对#229(L)和#228(R)(参见图42)。虽然附加的区段序列是任意的，但在此将G/C序列用于使双链体稳定性最大化。需要短茎序列以使附加区段将干扰适体功能的机会最小化，并且由此排除与40-碱基适体区域互补的序列。然而，与适体功能相容的附加区段的成功添加仍应根据经验来测试。图43中示出了关于附加适体的这种功能测试。针对生物素化Fab的#229适体结合在茎-环标签下稍微减少，但在具有相同碱基组成但乱序序列的对照标签下则更少。#228适体在功能上极少受到附加标签存在的影响(参见图43)。

特具体说来，图41示出了来自近端二元适体对的模板借助于短的茎-环桥的替代原位形成的代表性示意图。已知茎-环结构一般可用于模型点击寡核苷酸模板化反应。

具体说来，图42示出了用于测试互补端茎-环桥二元模板化方法的适体的结构及相应序列。引物位点以黑色表示；适体40-聚体区段以灰色表示；且附加的10-聚体序列以粗体且加框表示。

具体说来，图43示出了适体延伸对于结合bFab-BRD7的能力的影响的测试。将140pmol自退火的适体在室温下与35pmol bFab(25μl最终体积)一起孵育3.5小时，然后在室温下吸附到50μl PBSM中的链霉抗生物素磁性珠粒上持续1小时。然后磁性地除去上清液，并且用0.5ml PBSM洗涤珠粒两次。将结合的材料用2x 100μl的0.1M NaOH/5mM EDTA洗脱，用20μg糖原/0.3M NaOAc、3体积乙醇沉淀，用1ml 70％乙醇洗涤一次，干燥并且再溶解于20μl TE中。使1μl样品直接在8M尿素变性凝胶上跑胶。

接着将延伸的适体关于其充当模型点击反应的模板的能力进行评估。将延伸的适体229-3’-Ext1和228-5’-Ext1在一起退火(在80℃下3分钟，然后在0℃下5分钟)，以便容许适体自退火以及经由彼此互补的10-碱基延伸段进行适体间杂交(示意性地示于图44图A中)。对照适体#229、#228和136-5’-Ext1以同样的方式分别自退火。将适体制剂与bFab靶一起孵育(参见图44，图B)，洗涤并用氢氧化钠洗脱结合的材料，与图39一样。在沉淀、洗涤和干燥之后，将洗脱的材料在10μl TE中重构，使1μl样品在变性尿素凝胶上跑胶。结果显示单独的近端适体(空间上接近，但缺乏二元连接)可提高模板点击反应性(参见泳道4，图44，图B)。同样，具有3’和5’延伸但无彼此互补性的对照适体能够实现相似的点击活性提高(参见泳道2，图44，图B)。然而，茎-环连接的二元制剂不仅可支持点击活性(参见泳道1，图44，图B)，而且产物水平相对于对照泳道2和4是提高的。不管这是靶结合本身改善的结果还是模板化增强的结果，最终结果仍显示出用于模板组装的模板化的改善。

具体说来，图44示出了用延伸的适体229-3’-Ext1和228-5’-Ext1进行的互补端二元茎-环适体方法的测试。将这些适体在溶液中同时自退火和共退火以形成茎-环连接的二元物(示意性地示出，图A)。将未延伸的适体对照通常分别自退火。图B示出了用点击标记的寡核苷酸207和208进行的模板化测试的结果(与图34、图35和图39是相同的方案)。

在此实施例内例证的原理类似于但不同于如上所述的L-DNA标签标记工序(参见图19)。

实施例9：针对特定适体的亲和力测量

针对明确的靶的适体亲和力可通过基于QPCR的方法连同用于在靶浓度范围上区分结合适体与未结合适体的方法一起测量。将此应用于适体#228，对于bFab结合选择所述适体作为单态和与其配偶体#229的二元结合。为了绘制结合曲线，将bFab靶的稀释物(从700nM往下，以2倍稀释度)与恒定浓度的自退火#228(10nM)一起孵育过夜(在PBSM中50μl最终体积)以便获得平衡状态。然后将制剂在室温下在振荡下与75μl链霉抗生物素磁性珠粒(在bFab的最高浓度上摩尔过量)一起孵育1小时。接着将珠粒从上清液中磁性分离，其中每个管经历用0.5ml PBSM的三次洗涤(将原始上清液与洗涤液合并以得到总的未结合级分)。随后将结合的材料通过以下操作从珠粒中洗脱：用0.1M NaOH/5mM EDTA进行2x 20秒第二孵育，将磁性分离的洗脱液上清液汇集到单个管中。将它们立即用20μg糖原/0.3M NaOAc/3体积乙醇沉淀(在-20℃下孵育30分钟)，然后用1.0ml 70％乙醇洗涤，干燥并于50μl PBSM中重构。接着将所有制剂的样品(1.0μl)在96孔板中借助于Bio-Rad CFX96Touch仪器通过QPCR一式三份来分析，其中的循环是：95℃持续30秒；40x(在95℃下5秒且在60℃下30秒)，于20μl体积中。反应混合物使用x1BioRad iTaq PCR混合物及6pmol各R-适体特异性引物。(正向R-引物：GCAAAGACATCTGGACACGC(SEQ ID NO:10)；反向R-引物：GCCTCTAAGTCTCCTTCTCCT(SEQ ID NO:11))。在循环期间分析孔的实时SYBR-绿色荧光，并且分配CT值。所有轮次均包括#228适体的连续稀释物的标准曲线。对一式两份结果求平均值并且针对每个数据点推导结合和未结合的CT值，由此计算总的结合级分。从这些结合分数值对应于相应[bFab]的图，可以导出非线性回归曲线(参见图45)。反过来，K_d估计值(约11nM)可从实验曲线的方程式(参见图45)获得，其中K_d对应于结合的级分＝0.5(Jing等人,Anal.Chim.Acta,2011,686,9-18)。

具体说来，图45示出了适体#228与生物素化的Fab-BRD7的结合曲线。非线性回归曲线方程是y＝0.1179ln(x)+0.2181。

实施例10：T细胞HLA-A2限制表位的适体介导的表面组装

适体可用于修改广泛多种表面结构作为用于模板组装过程的模板，并且此修改过程可包括多个识别分子，它们是呈“夹层(sandwich)”型排列。此实施例公开了二元适体对所导向的生物素化靶分子的用途。其还使用结合至所需和预定义的细胞表面标记上的生物素化初级识别分子及多价生物素结合桥连分子。

在此情况下，靶分子是生物素化抗BRD7Fab(参见实施例1-4和7-9)，初级识别分子是生物素化抗IgM(BD-Pharmingen)，且桥连分子是链霉抗生物素-藻红蛋白缀合物(SA-PE；Fitzgerald Industries)。也可使用单独的链霉抗生物素(Sigma-Aldrich)代替藻红蛋白缀合物。收获表达表面IgM的目标细胞(10⁶)(EBV转化的类淋巴母细胞系)，用x1PBS洗涤，并且在室温下用生物素化抗IgM在合适的浓度(如由制造商所推荐)下处理1小时。在3x PBS洗涤之后，将100pmol先前在适当的摩尔比下与生物素化抗BRD7Fab(bFab)复合的SA-PE与已引发的细胞悬液一起在室温下孵育1小时，伴有细胞的偶尔再悬浮。预组装的SA-PE复合物是以如下方式产生：将50pmol SA-PE与50-100pmol bFab一起在室温下在1x PBSM中孵育1小时。由于SA是四价的，所以这确保了所有bFab在可用的SA生物素-结合位点没有饱和的情况下被结合。这些步骤示于图46中。然后将细胞用PBSM洗涤两次，并且再悬浮于0.5ml PBSM中。将预退火的适体229-3’-Ext1和228-5’-Ext(如在实施例8中经由茎-环桥形成二元物；100pmol)在室温下添加到已引发的细胞中持续1小时，并且用1.0ml PBSM洗涤两次。所生成的复合物示于图47中。

从两方面分析多层夹层形成的成功。与以相同方式但排除初级抗IgM抗体的方式处理的对照细胞相比，靶表面抗原(IgM)的存在通过使复杂的细胞样品(初级抗IgM抗体/SA-PE/bFab/二元适体)经历在PE通道中关于荧光的流动分析来证明。用双标记的荧光夹板寡核苷酸(与实施例1中的DNA夹板(DNA夹板(5’–TCCAGATGTCTTTGCTTTCTTCAGGACACAG(SEQID NO:12)一样)，例外的是其在5’和3’端处用荧光FAM部分的修饰)例证适体结合。将荧光夹板(100pmol)与充分复合的细胞和对照(相同，例外的是排除bFab)一起在室温下在PBSM中孵育1小时，然后用0.5ml冷PBSM洗涤细胞三次，之后进行用荧光素通道的流动分析。

通过这些测试的制剂可用于组装由HLA-A2呈递的Melan A/MART表位(ELAGIGILTV(SEQ ID NO:13))，因为在此系统中的二元适体模板化区域(参见图11)被设计来与申请PCT国际公布WO14/197547中所述的单倍体人乳头状瘤病毒衍生的序列杂交。

在表达由初级生物素化抗体所识别的表面IgM的EBV转化的HLA-A2+细胞上的复合体具备如上在此实施例中详述的二元茎-环适体。在上述洗涤之后，将制剂与识别二元适体模板化区域并带有MART表位半肽的单倍体一起在室温下孵育1小时。在此孵育期间，单倍体与彼此接近的适体表面模板杂交，以允许形成完整组装的表位肽。然后用1ml PBSM洗涤细胞，并且在室温下进一步孵育2小时以容许发生胞吞作用(参见图47)。之后，将处理过的细胞用于测量组装肽的摄取、加工和HLA-A2呈递。在HLA-A2的情形下，使用以识别ELAGIGILTV的T细胞受体转染的Jurkat细胞来进行此测量，其中Jurkat激活的读出是IL-2的分泌，如由Haggerty等人,Assay Drug Dev.Technol.,2012,10,187-201所述。

由这个实施例示出的方法可涵盖许多其它实施方案，涉及在适体和靶向以及组装成单倍体对的产物的结构类型上的变型。因此，适体可直接靶向细胞表面结构、或其下的夹层结构的任何其它组分(如在图46和47中)。替代的单倍体组装产物可包括结合至任何其它MHC类别的肽、或被设计以便由抗体直接识别的结构。在后一类实施方案中，这种单倍体组装的化合物包括天然肽、肽模拟物结构或非肽小有机分子。靶向经由模板组装过程由单倍体组装的这种适体介导的结构的抗体又可以包括但不限于以下的多种方式促进靶细胞杀伤：抗体依赖性细胞毒性、补体途径、或经由与高度细胞毒性药物的抗体缀合物，所述高度细胞毒性药物包括但不限于刺孢霉素A和emtansine。

除了本文所描述的那些，根据上述说明，所述主题的各种修改对于本领域技术人员而言都是显而易见的。这种修改还旨在落入所附权利要求的范围内。在本申请中引用的每篇参考文献(包括但不限于期刊论文、美国和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、基因库登录号等等)都以引用的方式整体并入本文。

序列表

<110> 特里比奥迪卡有限责任公司 (TriBiotica LLC)

<120> 使用核酸适体用于导向的模板化组装的方法

<130> 189156.00402

<140>

<141>

<150> 62/339,981

<151> 2016-05-23

<160> 13

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 适体229 (10AptL3)

<400> 1

catctccacc tccataaccc acggacgggc gtctagagaa gtaggctgaa atatcgtggc 60

gagaacgagc tgtgtcctga agaaa 85

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 适体228 (10AptR1)

<400> 2

gcaaagacat ctggacacgc cactaagtgg aggtgatctg tacttcattt atgagatcgc 60

ggcgaggaga aggagactta gaggc 85

<210> 3

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 适体229-3'-Ext1

<400> 3

catctccacc tccataaccc acggacgggc gtctagagaa gtaggctgaa atatcgtggc 60

gagaacgagc tgtgtcctga agaaaccggc tgcgc 95

<210> 4

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 适体228-5'-Ext1

<400> 4

cgacgcgggc gcaaagacat ctggacacgc cactaagtgg aggtgatctg tacttcattt 60

atgagatcgc ggcgaggaga aggagactta gaggc 95

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA夹板

<400> 5

tccagatgtc tttgctttct tcaggacaca g 31

<210> 6

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 任意对照右-适体

<400> 6

gcaaagacat ctggacacgc cacttatagt ctacgtgaag cactgcgctg gaacagccta 60

aaaaaggaga aggagactta gaggc 85

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与TCO修饰的207的3'端互补的寡核苷酸

<400> 7

tgtaggactc tagatcggaa gttgtagc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与MTZ修饰的208的5'端互补的寡核苷酸

<400> 8

ctcgaaggct acgtgctagc gcatacAT 28

<210> 9

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L/R适体间区域的寡核苷酸互补序列

<400> 9

UCCAGAUGUC UUUGCUUUCU UCAGGACACA G 31

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向R适体引物

<400> 10

gcaaagacat ctggacacgc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向R适体引物

<400> 11

gcctctaagt ctccttctcc t 21

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 夹板寡核苷酸

<400> 12

TCCAGATGTC TTTGCTTTCT TCAGGACACA G 31

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Melan A/MART表位

<400> 13

Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val

1 5 10

Claims (10)

1.一种单态核酸适体复合物，其包含：

折叠成三级结构的第一部分，其包含核苷酸的随机序列；和

包含3’或5’末端区的第二部分，其中所述第二部分与第一单倍体和第二单倍体杂交；

其中所述第一单倍体包含：

与所述单态核酸适体的所述第二部分杂交的杂交区域；和

反应性效应物部分；

其中所述第二单倍体包含：

与所述单态核酸适体复合物的所述第二部分杂交的杂交区域；和

反应性效应物部分；

其中所述第一单倍体的反应性效应物部分在空间上邻近所述第二单倍体的反应性效应物部分。

2.如权利要求1所述的单态核酸适体复合物，其中所述第一部分和第二部分都在其末端处包含引物结合位点。

3.如权利要求1所述的单态核酸适体复合物，其中每个单态核酸适体复合物的所述第一部分和第二部分都在其末端处包含引物结合位点。

4.如权利要求1或2所述的单态核酸适体复合物，其中所述核酸包括DNA核苷酸、RNA核苷酸、硫代磷酸酯修饰的核苷酸、2-O-烷基化RNA核苷酸、卤化核苷酸、锁核酸核苷酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸类似物、假尿苷核苷酸、黄嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、或2-脱氧肌苷核苷酸、或其任何组合。

5.如权利要求1或2所述的单态核酸适体复合物，其中所述单倍体的杂交区域和所述单态核酸适体复合物与所述单倍体的杂交区域杂交的部分都包含L-DNA。

6.如权利要求1或2所述的单态核酸适体复合物，其中包含核苷酸随机序列的折叠成三级结构的第一部分被认定能够通过SELEX过程与细胞表面上的靶分子结合。

7.如权利要求1或2所述的单态核酸适体复合物，其中所述第一单倍体和/或所述第二单倍体的杂交区域包含10至18个核苷酸的长度。

8.如权利要求1或2所述的单态核酸适体复合物，其中所述第一单倍体与所述第二单倍体共价地连接到其各自的3’和5’端。

9.如权利要求1或2所述的单态核酸适体复合物，其中第一和第二单倍体各自的反应性效应物部分包括生物正交部分，所述生物正交部分彼此起化学反应，形成模板化组装产物，所述模板化组装产物包含第一和第二单倍体各自的两个反应性效应物部分。

10.一种核酸适体复合物的群体，其包含两个或更多个如前述权利要求中任一项所述的单态核酸适体复合物，其中选择所述单态核酸适体复合物的5’或3’端用于可接近第一和第二单倍体对。

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