JP6927618B2 - 多重特異性タンパク質薬物およびそのライブラリー、ならびに製造方法と使用 - Google Patents
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Description
具体的に、本発明は、L-核酸鎖フレームワークで複数の抗体薬物を連結して二重または多重特異性薬物を形成するプラットフォーム技術を提供し、便利かつ有効に複数の抗体薬物を複合化させ、疾患の個別化精密医療に有用な抗体薬物ライブラリーを構築することができる。
ここで、Cは2以上の正整数である、
タンパク質薬物ライブラリーを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、多重特異性タンパク質薬物である。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物単量体は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
もう一つの好適な例において、H1/H2の比は1〜100、好ましくは10〜50、より好ましくは10〜20である。
もう一つの好適な例において、前記の「解重合」とは、多量体のタンパク質薬物が解離し、タンパク質薬物単量体になることである。
もう一つの好適な例において、前記の体内とは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の体内である。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物エレメント部分と前記核酸エレメント部分は直接的に連結しているか、間接的に連結している。
もう一つの好適な例において、Qは2、1.5、1.2、1.1または1.05が好ましい。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物は、静脈内投与のタンパク質薬物である。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物単量体は、式Iで表される構造を有する。
P─X─L─Y─A─Z (I)
(式中において、
Pはタンパク質系薬物分子(すなわちタンパク質薬物エレメント部分)である。
Xはなしか、あるいは重複ペプチドである。
Lはリンカー分子である。
YおよびZはなしか、あるいは重複核酸である。
「─」は共役結合である。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、一本鎖抗体、ナノ抗体、Fab、モノクローナル抗体、またはその組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体の標的は、TNF-α、IL17からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体の標的は、CD3、HER2、PD-1からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記タンパク質系薬物分子Pは野生型または突然変異型である。
もう一つの好適な例において、前記突然変異は薬物の機能に影響がない。
もう一つの好適な例において、前記突然変異は抗体のカルボキシ基末端(C末端)への一つまたは複数のシステイン残基の導入を含む。
もう一つの好適な例において、Xは0〜30個のアミノ酸である。
もう一つの好適な例において、前記リンカー分子Lの活性基は、マレイミド、ハロアセチル基、チオピリジンから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ハロアセチル基は、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基から選ばれる。
もう一つの好適な例において、Yは0〜30個のヌクレオチドである。
もう一つの好適な例において、前記YはL-核酸である。
もう一つの好適な例において、前記YはAAAA、AAAまたはAAである。
もう一つの好適な例において、Zは0〜30個のヌクレオチドである。
もう一つの好適な例において、前記ZはL-核酸である。
もう一つの好適な例において、前記ZはAAAA、AAAまたはAAである。
もう一つの好適な例において、前記核酸AはL-核酸である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Aは、DNA、RNAから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記修飾基はNH2である。
もう一つの好適な例において、前記修飾基の前記核酸Aおよび/またはYにおける位置は、5'末端、3'末端、中間の任意の部位から選ばれる部位である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Aにおける任意の2つの相補的対合領域の間に長さが0〜10ntの過渡領域がある。
もう一つの好適な例において、前記過渡領域はAAAA、AAAまたはAAである。
本発明の第二の側面では、個別化医療に用いられるタンパク質薬物を組み立てる方法であって、
(a) 製薬情報に基づき、本発明の第一の側面に記載のタンパク質薬物ライブラリーから少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を選択する工程と、
(b) 前記の少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を混合することによって、多量体の形態の多重特異性タンパク質薬物に組み立てる工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の組み立ては、前記核酸エレメント部分の相補によって二本鎖対合構造になることである。
もう一つの好適な例において、前記の補助核酸分子は一本鎖の形態である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Tはタンパク質薬物と連結していない核酸である。
もう一つの好適な例において、前記核酸TはL-核酸、または修飾基によって修飾された核酸である。
もう一つの好適な例において、前記核酸Tの長さはすべての(b)における単量体の核酸の対合数の合計の1〜1.5倍である。
もう一つの好適な例において、前記組み立ての条件は、pH 6〜9である。
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質薬物単量体は、本発明の第一の側面に記載のタンパク質薬物ライブラリーからのタンパク質薬物単量体である。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は、多重特異性タンパク質薬物である。
もう一つの好適な例において、前記の多量体のタンパク質薬物は抗癌薬物である。
もう一つの好適な例において、H1/H2の比は1〜100、好ましくは10〜50、より好ましくは10〜20である。
本発明の第四の側面では、
(i) 活性成分として本発明の第三の側面に記載の多量体タンパク質薬物と
(ii) 薬学的に許容される担体と、
を含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物の剤形は、注射剤、冷凍乾燥製剤からなる群から選ばれる。
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて、2種類以上の異なるタンパク質薬物単量体を含み、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、前記核酸エレメント部分は体内のヌクレアーゼによる分解に耐性がある核酸(たとえばL-核酸)で、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になる、タンパク質薬物ライブラリーを開発し、必要によって(たとえばある個体の病状および診断結果によって)、前記タンパク質薬物ライブラリーから相応するタンパク質薬物単量体を選択し、快速に(1分間以内)、効率的に、低コストで、高収率で複数の標的に対する、体内で安定の多重特異性タンパク質薬物(たとえば多重特異性抗体)を組み立てることができ、これに基づいて本発明を完成させた。
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。本明細書で用いられるように、具体的に例示される数値で使用される場合、用語「約」とは当該値が例示される数値から1%以内で変わってもよい。たとえば、本明細書で用いられるように、「約100」という記述は99と101およびその間の全部の値(たとえば、99.1、99.2、99.3、99.4など)を含む。
本発明は、C種類の異なるタンパク質薬物単量体を含み、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖の対合構造を形成することによって、多量体のタンパク質薬物を構成することができ、ここで、Cは2以上の正整数である、タンパク質薬物ライブラリーを提供する。
本発明のライブラリーは、さらに、少なくとも2種類以上のタンパク質薬物単量体を含有し、好適なタンパク質薬物単量体は上記式Iの構造を有する。
多重特異性の多量体タンパク質薬物に組み立てると、治療の目的によって、相応する個体に使用することができる。
L-核酸とは、自然界に存在するD-核酸に対し、鏡像的な存在で、L-DNAとL-RNAに分かれる。左旋(キラル中心)は主に核酸のデオキシリボースまたはリボースの部分に存在し、鏡像的に回転する。そのため、L-核酸は血漿のあらゆる所に存在するヌクレアーゼ(たとえばエキソリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ)によって分解される。
本発明の多量体タンパク質薬物とは、D種類のタンパク質薬物単量体が核酸の相補によって二本鎖対合構造になった多量体で、ここで、Dは2以上の正整数で、ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は一つの別の異なるタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることが可能である。
もう一つの好適な例において、前記の核酸エレメント部分は、耐ヌクレアーゼ分解性のものである。
本発明の多量体タンパク質薬物は、たとえば式Iで表されるタンパク質薬物単量体の組み立てによって形成する。
典型的に、多量体タンパク質薬物とは、多量体抗体(多重特異性抗体)、たとえば二、三、四、五または六重特異性抗体である。
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ここで、pH値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、pH値は通常5〜8程度、好ましくは6〜8程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で投与することができ、経口投与、気道、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部投与が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の薬物組成物はそのまま治療(たとえば抗腫瘍治療)に使用することができるため、薬物の半減期の延長、またほかの治療剤の併用に有用である。
本発明の主な利点は以下の通りである。
(1)本発明の多重特異性抗体は製造が簡単で、快速で、一分間内でL-核酸鎖を介して複数の抗体の組み立てを完成させることができる。
1.L-核酸鎖フレームワークの設計と製造
本発明によれば、L-核酸鎖フレームワークは2本およびそれ以上のL-核酸一本鎖が塩基対合によって形成する。各L-核酸一本鎖の5'または3'末端はいずれも後の修飾に供する基(たとえばNH2など)活性化させた後、リンカー(たとえばSMCC、SM(PEG)、SPDPなど)の一方の末端でL-核酸一本鎖における活性化基と結合させる。リンカーを持つL-核酸は必要なL-核酸鎖フレームワークに組み立てることができる。リンカーを持つL-核酸がフレームワークに自己組織化することが可能と確認された後、リンカーを持つL-核酸一本鎖をそれぞれ抗体と連結させて後の組み立てを行う。
本発明のL-核酸フレームワークは基本的に以下のような工程によって製造することができる。
製造しようとする多重特異性抗体の種類(たとえば三重特異性抗体)を決定し、多重特異性抗体における抗体数Nによって必要なL-核酸一本鎖の数Mを決定し、相応する数のL-核酸一本鎖配列を設計し、塩基対合数を増減することによって目的核酸フレームワークの安定性を調整し、核酸鎖間の非特異的対合の可能性を減少させる。
L-核酸の活性化はその5'末端または3'末端の活性基修飾および後のリンカー結合を含む。活性基修飾は核酸合成会社によってオーダーメードで完成されてもよい。リンカーは通常二重機能基を有し、すなわち、一方の末端は核酸の活性基に結合することができ、もう一方の末端は抗体における特異性部位(たとえばSH)に連結することができる。
1.3 核酸フレームワークの重合度の検証
核酸フレームワークの重合度はたとえばアガロースゲル電気泳動によって検証することができる。
本発明の抗体は多重特異性抗体の用途と目的によって選択する。固形腫瘍に使用する場合、高透過性の多重特異性抗体が必要で、比較的に小さい抗体断片(たとえば一本鎖抗体、ナノ抗体など)を選択する。血液腫瘍に使用する場合、抗体でも抗体断片でも使用することができる。具体的な選択は治療の用途と機序によって決める必要がある。抗体断片の製造には、大腸菌または酵母などの低コストの発現系を選択し、全長の抗体は哺乳動物細胞発現系が必要である。
活性化されたL-核酸と結合しやすいように、抗体に一つの特異性の部位(たとえば突然変異部位、Cys)を導入し、リンカーの結合に使用する。
まず、L-核酸の5'または3'末端をNH2で修飾し、さらにリンカーによって、以下のいくつかの主な製造方法でもよいが、ここで、快速にL-核酸の一方の末端のNH2基に結合するように、リンカーの一方の末端の官能基はNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)またはSulfo-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム)である。異種二重官能基を含むリンカーはいずれもまずL-核酸のNH2と反応し、次に抗体におけるメルカプト基を還元した後、もう一方の末端の基がさらにメルカプト基と反応して安定した化学結合を形成する。
4本の四角形の形状で対合するL-核酸(図2に示す)を設計した。ここで、任意の1本のL-核酸一本鎖はほかの2本のL-核酸一本鎖と特異性相補的対合するが、4本目と対合しない。そして、特異性相補的対合のギブズエネルギー変化量ΔGは非特異性対合よりも遥かに小さく、特異性相補的対合のギブズエネルギー変化量ΔGは約-34キロカロリー/モル(kcal/mol)で、非特異性対合はいずれも-10ロカロリー/モル(kcal/mol)よりも小さく、これは四量体の組み立て方は非特異的な2つ同士の対合よりも生じやすく、四量体の形態は反応系で最も安定であることを示す。
以上の原則に沿って設計された4本のL-DNA一本鎖の配列は以下の通りである(5'から3')。
鎖1(L-DNA1):配列番号1
5’ AAAA CGACAGTCCGATGTGCC AAA CGGCTGGAAGTTGAGC AA 3’
鎖2(L-DNA2):配列番号2
5’ AAAA GGCACATCGGACTGTCG AAA GGCGTAGCCTAGTGCC AA 3’
鎖3(L-DNA3):配列番号3
5’ AAAA CGCTGATATGCGACCTG AAA GCTCAACTTCCAGCCG AA 3’
鎖4(L-DNA4):配列番号4
5’ AAAA CAGGTCGCATATCAGCG AAA GGCACTAGGCTACGCC AA 3’
生物技術サービス会社によって5'末端がNH2で修飾されたL-DNA一本鎖が合成されたが、4本の一本鎖の配列は実施例1に示す通りである。
リン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)でL-DNA一本鎖を溶解させ、最終濃度が200 μMの母液に調製した。ジメチルスルホキシド(DMSO)でSMCC粉末を溶解させ、新しく250 mMのSMCC母液を調製した。L-DNA一本鎖母液に10〜50倍モル量のSMCC母液を入れ、すぐに混合した後、室温で30min〜2h反応させた。反応完了後、反応液の10%体積の1M Tris-HCl(pH 7.0)を入れ、混合後、室温で20分間インキュベートし、過剰量のSMCCが反応し続けるのを止めた。インキュベート終了後、反応液の2倍体積の100%無水エタノールを入れ、均一に混合した後、-20度の冷蔵庫に25分間置き、L-DNAを十分に沈殿させた。遠心(12000rpm、10min)で沈殿を取り、1mLの70%エタノールで洗浄し、12000rpmで1min遠心して上清を除去し、繰り返して5回洗浄し、過剰量のSMCCを十分に除去した。残った白色沈殿を空气中で5〜10min自然乾燥した後、リン酸緩衝液で再懸濁、溶解させ、SMCC-L-DNA複合体(すなわちSMCC-L-DNA一本鎖)を得た。
一本鎖抗体のカルボキシ基末端にシステイン突然変異を導入した。一本鎖抗体にジスルフィド結合が存在するが、大腸菌の細胞質における環境はジスルフィド結合の形成に不利であるため、一本鎖抗体を大腸菌のペリプラズム空間に分泌させてフォールディングを行い、ジスルフィド結合を形成する必要がある。
配列番号5、抗PD1一本鎖抗体突然変異体(Anti-PD1 single-chain antibody mutants)のアミノ酸配列:
配列番号6、抗PD-L1一本鎖抗体突然変異体(Anti-PD-L1 single-chain antibody mutants)のアミノ酸配列:
配列番号7、抗CD3一本鎖抗体突然変異体(Anti-CD3 single-chain antibody mutants)のアミノ酸配列:
精製後の一本鎖抗体を10〜50倍モル比の過剰量の還元剤(たとえばTCEP、DTT、メルカプトエタノールなど)で室温で30minインキュベートした。インキュベート終了後、PD-10脱塩カラムで快速に反応系における還元剤を除去し、同時に緩衝液をリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)に置換した。一本鎖抗体の濃度を測定した後、1〜4倍モル比の過剰量のSMCC-L-DNA一本鎖(実施例2で製造された)を入れ、均一に混合した後、室温で1h反応させた。
一本鎖抗体が自己組織化で多量体になる可能性を排除するため、実施例4で連結反応が終わったばかりの一本鎖抗体-L-DNA反応液を使用して自己組織化実験を行った。反応終了後、未連結の一本鎖抗体があるように、連結反応における一本鎖抗体/SMCC-L-DNAの反応比率は1:0.5としたが、未反応のSMCC-L-DNA一本鎖を除去する必要がある。そのため、反応終了後、適量のProtein Lフィラーを入れ、10minインキュベートし、12000rpmで1min遠心して上清を除去し、1mLのリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl,pH 7.0)を入れてフィラーを洗浄し、遠心で上清を除去し、このように4回繰り返した。溶離緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 2.3)を入れ、フィラーに付着した一本鎖抗体および一本鎖抗体-L-DNAを除去するために10minインキュベートし、pHを7.0に調整した。実施例1における鎖1(L-DNA1)が抗PD-L1一本鎖抗体と、鎖2(L-DNA2)が抗PD-L1一本鎖抗体と、鎖3(L-DNA3)が抗PD-1一本鎖抗体3と、鎖4(L-DNA4)が抗CD3一本鎖抗体と連結した。
一本鎖抗体を大腸菌で単独で発現させると、通常、生物活性を有さない封入体になるが、一本鎖抗体の可溶性および生物活性を向上させるために、マルトース結合タンパク質MBPと3種類の一本鎖抗体(抗PD-L1/CD3/CEA一本鎖抗体、配列番号1、 2および3)を融合発現するベクターを構築し、MBP-ScFv融合タンパク質を形成した。MBPタグを切り除くために、MBPと一本鎖抗体の間にTEV酵素切断部位を導入し、そして遺伝子のの両末端にそれぞれNcoI和XhoI制限酵素切断部位を加えた後、pET21bプラスミドにおけるNcoI/XhoI部位の間にサブクローニングした。
PD-10脱塩カラムで快速に初歩的に精製されたMBP融合一本鎖抗体における過剰量の還元剤であるメルカプトエタノールを除去し、すぐに1〜4倍モル比の過剰量のSMCC-L-DNA一本鎖(実施例2で製造された)を入れ、均一に混合した後、室温で1h反応させた。アミロース樹脂アフィニティクロマトグラフィーの方法によって未反応のDNAを除去し、目的のタンパク質がアミロース樹脂カラムと結合し、10CV HEPES緩衝液(20mM HEPES+150mM NaCl、pH=7.4)を入れて洗浄し、未反応のDNAを除去した。その後、TEV酵素を入れて3時間インキュベートし、アミロース樹脂カラムから融合タンパク質を切り除き、流出液はMBP融合タンパク質を切り除いた一本鎖抗体で、流出液を収集した。DNAなどの核酸は負の電荷を持つため、アニオン交換カラム(HiTrap Q HPカラム)で一本鎖抗体-L-DNAを単離・精製し、TEV酵素を除去した。単離の過程は勾配溶離で実現し、仕込み緩衝液は20 mM Tris-Cl+15mM NaCl、pH=8.5で、溶離緩衝液は20 mM Tris-Cl+1M NaCl、pH 8.5、0-100%で、溶離緩衝液で勾配溶離を行い、TEV酵素および一本鎖抗体-L-DNAは順にピークが現れ、一本鎖抗体-L-DNAを収集した。一本鎖抗体-L-DNAを高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって精製し、サンプルをHEPES緩衝液(20mM HEPES+150mM NaCl、pH=7.4)で平衡化したSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE Healthcare)によって精製・単離した後、紫外吸収A280でサンプリングし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によってピークの出現位置およびサンプルの純度を検出した。抗CD3-L-DNA2を例とすると、図6に示すように、最終的に生物・物理的性質が均一で、純度が高い一本鎖抗体-L-DNA連結サンプルが得られ、その分子量の大きさは約40kDaであった。
実施例1における鎖1(L-DNA1)が抗CEA一本鎖抗体と、鎖2(L-DNA2)が抗PD-L1一本鎖抗体と、鎖3(L-DNA3)が抗CEA一本鎖抗体3と、鎖4(L-DNA4)が抗CD3一本鎖抗体と連結した。それぞれ300μlの抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3を取って37度で予め5min加熱した後、37の度条件において等体積で3種類の単量体を混合し、5minインキュベートした。反応後、30μlの反応液を取ってポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によって抗体の組み立ての状況をモニタリングしたが、図7の左の図に示すように、レーン1、2、3はそれぞれ抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3のタンパク質バンドで、レーン4は3種類の特異性抗体の自己組織化後のタンパク質バンドで、そのタンパク質の分子量は抗CEA-L-DNA1、抗PDL1-L-DNA2、抗CEA-L-DNA3が自己組織化して三量体になったことを示す。三量体を高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって精製して未反応の一本鎖抗体-L-DNA単量体を除去した。精製された三量体を最終濃度が0.1μMになるように希釈し、37度の条件において等体積・等濃度で抗CD3-L-DNA4を入れ、5minインキュベートした。反応後、30μlの反応液を取ってポリアクリルアミドゲル電気泳動技術によって抗体の組み立ての状況をモニタリングしたが、図7の右の図に示すように、レーン1は抗CD3-L-DNA4との反応前の三量体で、レーン2は抗CD3-L-DNA4との反応後の四量体で、その四量体のタンパク質の分子量は約168kDaであった。そのため、以上の実験によって、当該L-DNA四量体のフレームワークは四重特異性抗体などの多重特異性抗体の快速の製造に有用であることが証明された。
リン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)で4本のL-DNA一本鎖を溶解させ、最終濃度が20 μMの保存液に調製した。四量体DNAフレームワークの組み立てを最適化するために、組み立ての過程を2つの形態に分けて比較した。1.まず3本のL-DNA一本鎖を混合し、室温または37度で混合して5分間反応させ、30分間後、さらに4本目のL-DNA一本鎖を入れた。2.同時に4本のL-DNA一本鎖を混合し、37度で混合して5分間反応させた。反応終了後、各群のサンプルを5μl取って2%アガロースゲル電気泳動で分析した。
D-DNAと比べ、L-DNAの優勢は自然界におけるDNA酵素で分解されないことにある。人体に多くのDNA酵素が存在し、L-DNA四量体フレームワークがDNA酵素で分解または解離されるか、検証するために、DNAse I、T7 DNAエンドヌクレアーゼ(endonuclease)、S1ヌクレアーゼ(nuclease)、エクソヌクレアーゼI(Exonuclease I)を選んでD-DNAとL-DNAの四量体フレームワークを処理した。D-DNAとL-DNAの4本の単量体の配列はそれぞれ対応し、かつ組み立て方は実施例9で改良されたツーステップ法で組み立てた。各酵素をD-DNAまたはL-DNAの四量体フレームワークに入れた後、37度の水浴に17時間置き、サンプリング後2%アガロースゲル電気泳動で分析した。
L-DNAフレームワークも大分子量のタンパク質の組み立てに使用できることを証明するために、実施例1におけるL-DNA四量体フレームワークをMBP(マルトース結合タンパク質)-抗PDL1一本鎖抗体融合タンパク質(以下、融合タンパク質と略し、分子量は69 kDaである)の四量体の組み立てに使用した。MBP-抗PDL1一本鎖抗体融合タンパク質は実施例6を参照して製造した。L-DNA四量体フレームワークの4本のDNAを実施例7に記載の方法によって融合タンパク質を連結して精製し、4種類のL-DNA-融合タンパク質を得た。上記4種類のL-DNA-融合タンパク質の緩衝液をリン酸緩衝液(50 mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH 7.0)に置換し、そして最終濃度が1μMおよび2μMになるように37度で四量体の組み立てを行い、反応産物を10% SDS-PAGEおよび分子篩によって分析した。
抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体の体外活性を分析するために、大腸癌細胞系LS174T(CEA陽性細胞)を細胞モデルとして使用した。2万個のLS174T細胞を48ウェルプレートに敷き、24時間後、3-オクタデシル-2-[3-(3-オクタデシル-2(3H)-ベンゾオキサゾール-2-イル)-1-プロペン-1-イル]ベンゾオキサゾール過塩素酸塩(DiOC18、DIO細胞膜緑色蛍光プローブ)で染色した後、40万個のPBMC(末梢血単核細胞)を入れてさらにインキュベートし、同時に濃度が勾配希釈された抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体(0.001 nM〜20 nM)を入れ、計96時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウム(PI)で死亡細胞を標識した後、フローサイトメーターによって緑色蛍光プローブとヨウ化プロピジウム蛍光の二重シグナルの細胞数を検出した。陽性対照はTriton-X100処理、およびDynabeads(表面に連結した抗CD28/CD3抗体のビーズで、効率的にT細胞を活性化させることができる)で、陰性対照は抗体に使用された緩衝液である。Triton-X100処理群の細胞の死亡量を100%殺傷とし、緩衝液群を0%殺傷とした。
抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体によるT細胞の活性化の能力を分析するために、インターフェロンγ(IFN-γ)を検出対象とした。具体的な過程は以下のとおりである。大腸癌細胞系LS174Tを細胞モデルとした。2万個のLS174T細胞を48ウェルプレートに敷き、24時間後、40万個のPBMC(末梢血単核細胞)を入れてさらにインキュベートし、同時に濃度が勾配希釈された抗CEA/PD-L1/CD3四重特異性抗体(0.001 nM〜20 nM)を入れ、計96時間インキュベートした。ブレフェルジンA(Brefeldin A)でIFN-γをT細胞の表面に固定し、さらに蛍光標識抗CD3抗体でT細胞を標識した後、フローサイトメーターによってIFN-γ/CD3二重陽性の細胞数を検出した。陽性対照はDynabeads(表面に連結した抗CD28/CD3抗体のビーズで、効率的にT細胞を活性化させることができる)で、陰性対照は抗体に使用された緩衝液である。
Claims (8)
- タンパク質薬物ライブラリーであって、C種類の異なるタンパク質薬物単量体を含み、ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は少なくとも一つの別のタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることによって、多量体のタンパク質薬物を構成することができ、
ここで、Cは2を超える正整数であり、
前記のタンパク質薬物単量体は、式Iで表される構造を有する、
ことを特徴とするライブラリー。
P─X─L─Y─A─Z (I)
(式中において、
Pはタンパク質系薬物分子(すなわちタンパク質薬物エレメント部分)である。
Xはなしか、あるいは重複ペプチドである。
Lはリンカー分子である。
YおよびZはなしか、あるいは重複核酸である。
Aは一つの核酸配列で、前記核酸配列は、L-核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
「─」は共役結合である。
ここで、いずれかのタンパク質薬物単量体の核酸Aは少なくとも一つの相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域は前記タンパク質薬物ライブラリーにおける少なくとも一つのタンパク質薬物単量体の核酸Aの相補的対合領域と部分的にまたは完全に相補的である。) - 前記のタンパク質薬物エレメント部分と前記核酸エレメント部分は直接的に連結しているか、間接的に連結していることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
- 前記タンパク質系薬物分子Pは、抗体、受容体またはほかのタンパク質を活性化または抑制するリガンド、生物活性酵素、またはその組み合わせからなる群から選ばれること特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
- 前記抗体は、癌、自己免疫疾患、免疫チェックポイント、臓器移植拒絶、関節リウマチ、糖尿病、血友病を治療するための抗体から選ばれること特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
- 前記リンカー分子Lは二重機能ヘッドを有し、核酸AまたはYの修飾基を有する修飾末端および抗体PまたはXの特異的結合部位に連結することができること特徴とする請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリー。
- 個別化医療に用いられるタンパク質薬物を組み立てる方法であって、
(a) 製薬情報に基づき、請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリーから少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を選択する工程と、
(b) 前記の少なくとも2種類のタンパク質薬物単量体を混合することによって、多量体の形態の多重特異性タンパク質薬物に組み立てる工程と、
を含む方法。 - 多量体タンパク質薬物であって、D種類のタンパク質薬物単量体が核酸の相補によって二本鎖対合構造になった多量体で、ここで、Dは2を超える正整数で、
ここで、前記のタンパク質薬物単量体はタンパク質薬物エレメント部分および前記タンパク質薬物エレメント部分と連結した核酸エレメント部分を含み、かつ一つの前記タンパク質薬物単量体の前記の核酸エレメント部分は一つの別の異なるタンパク質薬物単量体の核酸エレメント部分と相補によって二本鎖対合構造になることが可能であり、
前記の核酸エレメント部分は、L-核酸、ロックド核酸、チオ修飾核酸、2'-フルオロ修飾核酸、5-ヒドロキシメチルシチジル酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、
タンパク質薬物単量体は、請求項1に記載のタンパク質薬物ライブラリーからのタンパク質薬物単量体であることを特徴とする薬物。 - (i) 活性成分として請求項7に記載の多量体タンパク質薬物と
(ii) 薬学的に許容される担体と、
を含むことを特徴とする薬物組成物。
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