KR102384538B1 - 다중특이적 단백질 약물 및 이의 라이브러리, 제조 방법 및 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중특이적 단백질 약물 및 이의 라이브러리, 제조 방법 및 응용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 C개 종류의 상이한 단백질 약물 단량체를 포함하는 단백질 약물 라이브러리에 관한 것으로서, 단백질 약물 단량체는 단백질 약물 요소 부분, 및 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하고, 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분 및 하나 이상의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성할 수 있고, 이에 의해 다량체성 단백질 약물을 구성하고, C는 2 이상의 양의 정수이다.

Description

다중특이적 단백질 약물 및 이의 라이브러리, 제조 방법 및 응용
본 발명은 약물 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 단백질 약물 라이브러리, 및 이의 다중특이적 단백질 약물(항체)의 구축 방법 및 응용에 관한 것이다.
기존의 단클론 항체는 하나의 항원 부위에 특이적으로 결합할 수 있으며, Fc 단부는 NK 세포 표면의 Fc 수용체에 결합될 수 있으므로, 면역 세포를 더 활성화시킨다. 그러나, 치명적인 살상력을 가진 T 세포를 모집할 수 없기 때문에 면역체계 활성의 변동을 극대화할 수 없다. 이밖에, 기존의 단일특이적 항체는 하나의 항원 부위와 결합하여 상기 항원에 기반한 신호 경로 또는 이와 관련된 보상 경로를 충분히 이용하거나 차단하기 어려우며, 치료 효과가 이상적이지 못하거나 약제 내성을 쉽게 생성하고, 예를 들어, CD20에 대한 복수 개의 항체는 CD20 표면의 상이한 부위를 식별하므로, 각각의 항체의 활성 차이는 현저하다. 교모세포종(GBM) 세포 표면 VEGF를 타겟팅하는 항체 치료는 안지오포이에틴-2(Ang-2) 발현 수준을 상향 조절함으로써 VEGF에 저항하는 항체의 약제 내성을 초래한다.
다중특이적 항체는 2개 이상의 항체 특이성을 포함하며, 복수 개의 항원에 결합되는 에피토프 또는 하나의 항원에 결합되는 복수 개의 에피토프를 타겟팅할 수 있으므로, 항원 자체 다운스트림 경로 또는 다른 단백질과의 상호 작용을 충분하게 차단할 수 있고, 이에 의해, 항체의 치료 효과를 향상시키고 약제 내성을 감소시킨다. 이중특이적 항체를 예로, 전 세계에서 현재 60 여개의 이중특이적 항체 연구 개발 기업과 수백 개의 이중특이적 항체 약물을 연구하는 기업이 있으며, 대부분 종양 세포 타겟-T 세포 모집 부위의 형태(예를 들어, CD3에 의해 살상성 T 세포를 모집 및 활성화시키고, CD16에 의해 자연 살상세포(NK 세포)를 모집함으로써 국부적으로 풍부한 면역세포 타겟에 의해 종양 세포를 죽임) 및 이중 타겟 부위의 형태(예를 들어, VEGF-PDGF, VEGF-Ang2, Her2-Her3은 2개의 관련된 신호 경로를 억제하여 잠재적인 약제 내성을 감소시킴)이다. 또한, 일부 이중특이적 항체는 MedImmun 사의 MEDI4276과 같은 하나의 항원의 복수 개의 부위에 대해, Her2의 제2 도메인 및 제4 도메인을 동시에 타겟팅하는 이중특이적 항체 커플링 약물(Bispecific ADC)이다. 따라서 단일특이적 항체에 비해, 다중특이적 항체는 보다 많은 조합 가능성, 상승 효과를 제공하며, T 세포의 참여도를 직접 증가시켜 약물 투여량을 감소시키는 동시에 항체의 면역 치료 효과(예를 들어, 항종양 효과)를 크게 증강시킨다.
현단계에서 가장 발전 잠재력을 갖고 있는 다중특이적(이중특이적) 항체 기술의 플랫폼은 주요하게 BiTE, DART, tandAB, Bi-nanobody, CrossMAB, Triomab 등이 있다. 이러한 플랫폼은 주요하게 상이한 항체 공정 기술에 의해 상이한 항체 식별 영역을 하나의 단백질 분자 내로 조립하는 것을 실현하여 다중특이성의 목적을 실현한다. 예를 들어, BiTE 및 Bi-nanobody 기술은 2개의 단일 가닥(scFv) 또는 나노항체(nanobody)를 유연한 펩타이드로 서로 연결시켜 함께 묶었으며, 동시에 2개의 항체 단위의 친화특성을 보존하는 것이다. Crossmab는 2개의 항체의 Fc 중쇄 영역에 상이한 돌연변이를 도입하여 동일한 항체의 중쇄가 공간 입체 장애로 인하여 조립될 수 없도록 하며, 상이한 항체의 중쇄는 공간 상호 보완되어 이황화 결합에 의해 완전한 항체 분자를 순리롭게 조립할 수 있고, 이에 의해 이중특이적 항체를 성공적으로 제조한다. 그러나, 단백질 공학을 통해 2개의 항체 또는 단편을 하나의 분자로 조립하면 항체의 친화력을 쉽게 감소시키거나 분실시키게 되며, 예를 들어, BiTE의 상이한 단일 가닥 항체 조합은 상이한 경쇄 중쇄 배열 순서로 시도해야만 최적의 이중특이적 항체 분자를 얻을 수 있다. Crossmab와 같은 전장 항체(full length antibody)는 경쇄 불일치의 문제에 직면해 있고, 비록 보편적 경쇄 기술로 해결할 수 있지만, 더 많은 디자인 및 선별 단계를 증가시켜 통용 기술로 다른 이중특이적 항체 조합에 직접 적용할 수 없다. Triomab, Crossmab, DVD-Ig, Ortho-Fab-IgG 등과 같은 전장 항체 형태의 다중특이적 항체는 포유동물 세포 발현 시스템(예를 들어, CHO, HEK293)에서만 대규모로 생산가능하고 공법은 항체 단편(scFv, Fab)에 비해 더 복잡하고 제조 비용이 더 높다.
따라서, 본 기술분야는 개인화된 정밀 치료에 적합한 단백질(예를 들어, 항체) 약물 라이브러리를 구축하기 위해 일반적이고, 비용이 낮으며, 수율이 높은 다중특이적 항체 제조 기술을 개발하는 것이 시급하다.
본 발명의 목적은 개인화된 정밀 치료에 적합한 단백질 약물 라이브러리를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명은 좌회전성 핵산 쇄 프레임워크로 복수 개의 항체 약물을 연결하여 이중특이적 또는 다중특이적 약물을 형성하는 플랫폼 기술을 제공하여, 복수 개의 항체 약물을 간단하고 효과적으로 커플링하여 질환 개인화된 정밀 치료에 적용가능한 항체 약물 라이브러리를 형성한다.
본 발명의 제1 양태에 있어서, 단백질 약물 라이브러리를 제공하며, 상기 단백질 약물 라이브러리는 C개 종류의 상이한 단백질 약물 단량체를 포함하되, 여기서 상기 단백질 약물 단량체는 단백질 약물 요소 부분, 및 상기 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하며, 하나의 상기 단백질 약물 단량체의 상기 핵산 요소 부분 및 하나 이상의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성할 수 있고, 이에 의해 다량체성 단백질 약물을 구성하고; 여기서, C는 2 이상의 양의 정수이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체성 단백질 약물은 다중특이적 단백질 약물이다.
다른 일 바람직한 예에서, C는 3 내지 100000의 어느 하나의 양의 정수이고; 비교적 바람직하게, C는 3 내지 10000이며; 보다 바람직하게 C는 5 내지 5000이고; 가장 바람직하게 C는 10 내지 5000이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체성 단백질 약물은 뉴클레아제 분해에 견디는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 요소 부분은 뉴클레아제 분해에 견디는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물 단량체는 뉴클레아제 분해에 견디는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체성 단백질 약물이 체내에서 해중합이 발생하는 반감기(H1)는 독립적인 단백질 약물 요소의 체내 반감기(H2)보다 크다.
다른 일 바람직한 예에서, H1/H2의 비율은 1 내지 100이고, 비교적 바람직하게 10 내지 50이며, 보다 바람직하게 10 내지 20이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 "해중합 발생"은 다량체성 단백질 약물이 해리되어 단백질 약물 단량체를 형성하는 것을 가리킨다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 체내는 인간 또는 비인간 포유동물 체내를 가리킨다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물 요소 부분은 상기 핵산 요소 부분과 직접적으로 연결되거나 간접적으로 연결된다.
다른 일 바람직한 예에서, 단백질 약물 단량체에 대해서, 포함된 핵산 요소 부분(E2)과 단백질 약물 요소 부분(E1)의 비(Q)(즉, E2/E1)(Q는 몰비임)는 10-1이며, 비교적 바람직하게 4-1이고, 보다 바람직하게 2-1이거나 약 1-1이다.
다른 일 바람직한 예에서, 바람직하게, Q는 2, 1.5, 1.2, 1.1 또는 1.05이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물은 정맥 주사로 투여되는 단백질 약물이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물 단량체는 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 가진다:
[화학식 I]
P─X─L─Y─A─Z
상기 식에서,
P는 단백질 약물 분자(즉, 단백질 약물 요소 부분)이고;
X는 부재하거나 중복된 펩타이드이며;
L는 연결자 분자이고;
Y 및 Z는 부재하거나 중복된 핵산이며;
A는 좌회전성 핵산, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 티오-변형된 핵산, 2'-플루오로-변형된 핵산, 5-히드록시메틸시토신 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택되는 핵산 서열이고;
"-"는 공유 결합이며;
임의의 단백질 약물 단량체의 핵산 A는 하나 이상의 상보적 접합 영역을 가지되, 상기 상보적 접합 영역은 상기 단백질 약물 라이브러리 중의 하나 이상의 단백질 약물 단량체의 핵산 A의 상보적 접합 영역과 부분적으로 또는 완전히 상보적이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물 분자 P는 항체; 활성화 수용체, 억제 수용체 또는 다른 단백질의 리간드; 생물학적 활성 효소; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 항체는 단일 가닥 항체, 나노 항체, Fab, 단클론 항체 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 항체는 항-PD-1 단일 가닥 항체, 항-PD-L1 단일 가닥 항체, 항-CTLA-4 단일 가닥 항체, 항-CD3 단일 가닥 항체 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 항체는 암, 자가면역 질환, 면역관문, 장기 이식 거부 반응, 류마티스 관절염, 당뇨병 또는 혈우병 질환을 치료하기 위한 항체로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 항체에 대한 타겟은 CD20, CD19, CD30, HER2, VEGFR, EGFR, RANK, VEGFR2, SLAMF7, GD2, CD33, TNF-a, IL12, IL23, IL6R, IL17, BlyS, CD11a, PD-1, CTLA-4, TIM-3, OX40, CD47, CD3, IL-2R, PCSK9 및 GPCR로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 항체는 TNF-a 및 IL17로부터 선택되는 것을 타겟으로 한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 항체는 CD3, HER2 및 PD-1로부터 선택되는 것을 타겟으로 한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물 분자 P는 야생형 또는 돌연변이형이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 돌연변이는 약물 기능에 영향을 미치지 않는다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 돌연변이는 항체의 카르복실 말단(C-말단)에 하나 또는 복수 개의 시스테인 잔기를 도입하는 것을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, X는 0 내지 30개의 아미노산이다.
다른 일 바람직한 예에서, X는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 연결자 분자 L은 이작용성 연결자를 가지며, 변형된 기를 가지는 핵산 A 또는 Y의 변형된 단부 및 항체 P 또는 X의 특이적 연결 부위와 커플링될 수 있다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 연결자 분자 L의 활성 라디칼은 말레이미드(Maleimide), 할로아세틸(Haloacetyl) 및 티오피리딘(Thiopyridine)으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 할로아세틸은 요오드아세틸(Iodoacetyl) 및 브로모아세틸(bromoacetyl)로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, Y는 0 내지 30개의 뉴클레오티드이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 Y는 좌회전성 핵산이다.
다른 일 바람직한 예에서, Y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 Y는 AAAA, AAA 또는 AA이다.
다른 일 바람직한 예에서, Z는 0 내지 30개의 뉴클레오티드이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 Z는 좌회전성 핵산이다.
다른 일 바람직한 예에서, Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 Z는 AAAA, AAA 또는 AA이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 A는 좌회전성 핵산이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 A는 DNA 및 RNA로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 변형 라디칼은 NH2, 알키닐기, 설프히드릴기(SH), 카르복실기(COOH) 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 변형 라디칼은 NH2이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 변형 라디칼은 상기 핵산 A 및/또는 Y의 위치에서 5' 단부, 3' 단부 및 중간 임의의 부위로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 A 중의 임의의 2개의 상보적 접합 영역 사이에 길이가 0 내지 10 nt인 전이 영역이 구비된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 전이 영역은 AAAA, AAA 또는 AA이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 상보적 접합 영역의 길이는 5 내지 100 nt이며, 비교적 바람직하게 8 내지 50 nt이고, 보다 바람직하게 10 내지 30 nt이며, 보다 더 바람직하게 12 내지 20 nt이고, 가장 바람직하게 10 내지 15 nt이다.
(a) 본 발명의 제2 양태에 있어서, 약학 정보에 기반하여 제1 양태에 따른 단백질 약물 라이브러리로부터 2개 이상의 단백질 약물 단량체를 선택하는 단계; 및 (b) 상기 2개 이상의 단백질 약물 단량체를 혼합하여 다량체 형태의 다중특이적 단백질 약물을 조립하는 단계를 포함하는 개인화된 치료를 위한 단백질 약물의 조립 방법을 제공한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 조립은 상기 핵산 요소 부분의 상호 보완에 의해 이중 가닥 접합 구조를 형성하는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체 형태의 다중특이적 단백질 약물에서, 각각의 하나의 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분과 1, 2 또는 3개의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 이중 가닥 접합 구조를 형성한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 조립은 상기 핵산 요소 부분과 보조 핵산 분자(즉, 핵산 T)의 단일 가닥 상보적 서열의 상호 보완에 의해 이중 가닥 접합 구조를 형성하는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 보조 핵산 분자는 단일 가닥 형태이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 T는 커플링되지 않은 단백질 약물의 핵산이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 T는 좌회전성 핵산이거나 변형 라디칼에 의해 변형된 핵산이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 T의 길이는 모든 (b) 중 단량체 핵산 접합 개수 총합의 1 내지 1.5배이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 약학 정보는 치료할 대상의 질환을 치료하는데 요구되는 단백질 약물 정보이며, 단백질 약물의 종류, 조합(예를 들어, 항체 조합), 비율(임의의 2개의 단백질 약물 P의 비율은 1:1 내지 1:20임)을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 조립 조건은 5 내지 50도(바람직하게 25 내지 40도)의 온도에서 1 내지 15분(바람직하게 5 내지 10분) 반응하는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 조립 조건은 pH 6 내지 9이다.
본 발명의 제3 양태에 있어서, 다량체성 단백질 약물을 제공하며, 상기 다량체성 단백질 약물은 D개 종류의 단백질 약물 단량체가 핵산 상호 보완에 의해 이중 가닥 접합 구조를 형성하여 이루어진 폴리머이되, 여기서 D는 2 이상의 양의 정수이고;
여기서, 상기 단백질 약물 단량체는 단백질 약물 요소 부분, 및 상기 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하며, 하나의 상기 단백질 약물 단량체의 상기 핵산 요소 부분과 다른 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 요소 부분은 뉴클레아제 분해에 견디는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 요소 부분은 좌회전성 핵산, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 티오-변형된 핵산, 2'-플루오로-변형된 핵산, 5-히드록시메틸시토신 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단백질 약물 단량체는 본 발명의 제1 양태에 따른 단백질 약물 라이브러리 중의 단백질 약물 단량체이다.
여기서, D는 2 내지 20의 양의 정수이고, 비교적 바람직하게, D는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체성 단백질 약물은 다중특이적 단백질 약물이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체성 단백질 약물은 항암 약물이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 다량체성 단백질 약물이 체내에서 해중합이 발생하는 반감기(H1)는 독립적인 단백질 약물 요소의 체내 반감기(H2)보다 크다.
다른 일 바람직한 예에서, H1/H2의 비율은 1 내지 100이고, 비교적 바람직하게 10 내지 50이며, 보다 바람직하게 10 내지 20이다.
본 발명의 제4 양태에 있어서, (i) 활성 성분인 제3 양태에 따른 다량체성 단백질 약물; 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 약학 조성물의 제형은 주사제 및 동결 건조제로부터 선택된다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술 특징과 아래(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술 특징은 모두 상호 조합될 수 있으며, 이로써 신규 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성한다. 편폭의 제한으로 인해 여기서 더이상 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 좌회전성 핵산 자기조립에 기반한 다중특이적 항체의 모식도이다. 이는 복수 개의 항체 또는 항체 단편, 자기조립 가능한 복수 개의 L-핵산, 연결자(linker)로 구성된다.
도 2는 사중특이적 항체의 L-DNA 프레임워크 형상 및 접합 방식의 모식도이다.
도 3은 4개의 SMCC-L-DNA의 자기조립 결과도이다. 3 %의 아가로스 겔 전기영동이다. 제1 레인 내지 제4 레인은 SMCC-L-DNA 단일 가닥이되, 여기서 제1 레인은 가닥 1이고, 제2 레인은 가닥 2이며, 제3 레인은 가닥 3이고, 제4 레인은 가닥 4이다. 제5 레인 내지 제8 레인은 조립 후의 밴드이되, 여기서 제5 레인 중의 마그네슘 이온 농도는 0 mM이고, 제6 레인, 제7 레인, 제8 레인의 마그네슘 이온 농도는 각각 1 mM, 2 mM 및 4 mM이다.
도 4는 사중특이적 항체의 자기조립 결과도이다. SDS-PAGE 겔을 선후로 브로민화 에티듐(Ethidium bromide, EB), 쿠마시 브릴리언트블루법으로 염색하여 각각 DNA 및 단백질 부분을 나타낸다. 레인 1은 커플링되지 않은 항-PD-1 단일 가닥 항체이고, 레인 2는 가닥 1(L-DNA)을 커플링한 항-PD-L1 단일 가닥 항체이며, 레인 3은 가닥 2(L-DNA)를 커플링한 항-PD-L1 단일 가닥 항체이고, 레인 4는 가닥 3(L-DNA)을 커플링한 항-PD-1 단일 가닥 항체이며, 레인 5는 가닥 4(L-DNA)를 커플링한 항-CD3 단일 가닥 항체이다. 레인 6은 4개의 단일 가닥 항체-L-DNA 반응액의 혼합물이다.
도 5의 왼쪽 도면은 MBP 융합 단일 가닥 항체 돌연변이체의 발현 결과 모식도이며, 왼쪽 도면의 레인 1은 IPTG 유도를 첨가하지 않은 대조 실험이고, 레인 2, 레인 3, 레인 4는 각각 MBP-항-CD3 단일 가닥 항체, MBP-항-CEA 단일 가닥 항체, MBP-항-PDL1 단일 가닥 항체의 단백질 발현 경우이다. 오른쪽 도면은 MBP 융합 단일 가닥 항체 돌연변이체의 가용 경우 모식도이며, 오른쪽 도면의 레인 1은 전체 균의 용해액이고, 레인 2는 가용 성분이며, 레인 3은 봉입체 성분이다.
도 6은 항-CD3-L-DNA2 정제 결과 모식도이다. 왼쪽 도면은 Superdex 200 10/300 GL 크로마토그래피 정제 결과이다. 오른쪽 도면은 폴리아크릴아미드(Polyacrylamide) 겔 전기영동 기술로 단백질 샘플의 순도를 검사한 결과이다.
도 7은 다중특이적 항체 자기조립 결과 모식도이다. 왼쪽 도면은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술로 다중특이적 항체의 삼량체 조립을 모니터링한 결과 모식도이며, 레인 1, 레인 2, 레인 3은 각각 항-CEA-L-DNA1, 항-PDL1-L-DNA2, 항-CEA-L-DNA3 단백질 밴드이고, 레인 4는 3개의 특이적인 항체 자기조립 후의 단백질 밴드이다. 오른쪽 도면은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술로 다중특이적 항체의 사량체 조립을 모니터링한 결과 모식도이며, 레인 1은 항-CD3-L-DNA4와 반응하기 이전의 삼량체이고, 레인 2는 항-CD3-L-DNA4와 반응한 후의 사량체이다.
도 8은 M은 DNA 표준 제품이고, 최소 밴드는 25 bp이며, 다른 밴드는 25 bp씩 증가함을 도시한다. 레인 1 내지 레인 4는 각각 4개의 L-DNA(20 μM)이고, 샘플링량은 5 μL이다. 레인 5 및 레인 6은 각각 실온 및 37℃ 조건에서 먼저 삼량체를 조립한 후 다시 네 번째 L-DNA를 추가하여 조립하는 방식이다. 레인 7은 37℃ 조건에서 4개의 L-DNA를 직접 혼합하여 조립하는 방식이다.
도 9는 레인 1은 임의의 뉴클레아제 처리를 거치지 않은 L-DNA 사량체(위 도면) 및 D-DNA 사량체(아래 도면)이고; 레인 2 내지 레인 5는 각각 DNAse I, 엑소뉴클레아제I(Exonuclease I), T7 DNA 엔도뉴클레아제(endonuclease), S1 뉴클레아제(nuclease) 처리 후의 L-DNA 사량체 샘플 또는 D-DNA 사량체 샘플임을 도시한다. 핵산 마커(Marker)의 최소 밴드는 25 bp이며, 각각의 밴드 차이는 25 bp이다.
도 10은 M은 넓은 분자량 단백질 마커이고; 1 내지 4는 1 μM의 L-DNA-융합 단백질 단량체이고, 5는 1 내지 4 조립의 생성물이다. 6 내지 9는 2 μM의 L-DNA-융합 단백질 단량체이고, 10은 1 내지 4 조립의 생성물임을 도시한다.
도 11은 L-DNA 사량체 프레임워크에 의해 매개되어 조립된 융합 단백질 사량체 분자 선별 분석 결과이다. 사용된 크로마토크래피는 Superose 6 10/300 분자 배제 크로마토그래피 칼럼(GE 사)이다.
도 12는 L-DNA 프레임워크 제조에 기반한 CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체 체외 활성 결과이다. 대장암 세포주 LS174T는 CEA 양성이며, 상기 체외 활성 실험의 세포 모델로 사용된다.
도 13은 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체가 T 세포를 활성시키는 실험 결과이다. CD3 양성 세포가 분비한 IFN-γ를 사용하여 검출 대상으로 한다. 양성 대조군은 Dynabeads(표면에 항-CD28/CD3 항체의 세포주를 커플링하였고, T 세포를 효과적으로 활성시킬 수 있음)이며, 음성 대조군은 항체에 사용된 완충액이다.
본 발명자는 광범위하고 깊은 연구를 거쳐, 최초로 단백질 약물 라이브러리를 개발하였으며, 상기 단백질 약물 라이브러리는 2개 이상의 상이한 단백질 약물 단량체를 포함하되, 상기 단백질 약물 단량체는 단백질 약물 요소 부분, 및 상기 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하며, 상기 핵산 요소 부분은 체내 뉴클레아제 분해에 견디는 핵산(예를 들어, 좌회전성 핵산)이고, 하나의 상기 단백질 약물 단량체의 상기 핵산 요소 부분과 하나 이상의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성할 수 있으며, 수요에 따라(예를 들어, 특정된 하나의 신체의 병세 및 진단 결과), 상기 단백질 약물 라이브러리로부터 대응되는 단백질 약물 단량체를 선택하여, 멀티 타겟, 체내 안정적인 다중특이적 단백질 약물(예를 들어, 다중특이적 항체)에 대해, 신속(1분 이내)하고 효율적이며 저비용, 고수율로 조립할 수 있고, 이에 의해 이의 기초상에서 본 발명을 완성한다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술과 과학 용어는 모두 본 발명의 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 함의와 동일하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 구체적으로 열거된 수치에서 사용될 경우, 용어 "약"은 해당 값이 열거된 값으로부터 1 %를 초과하지 않게 변동하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약 100"의 표현은 99와 101 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 발명에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 본 명세서는 바람직한 방법 및 재료를 열거한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 약물 단량체", "본 발명의 단백질 약물 단량체", "본 발명의 약물 단량체"는 상호 교환되어 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 약물 라이브러리", "본 발명의 단백질 약물 라이브러리", "본 발명의 약물 라이브러리"는 상호 교환되어 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 다량체성 단백질 약물", "다량체성 단백질 약물", "다중특이적 단백질 약물", "본 발명의 폴리머 약물 단백질", "폴리머 약물 단백질", "본 발명의 폴리머 단백질"은 상호 교환되어 사용될 수 있다.
단백질 약물 라이브러리
본 발명은 단백질 약물 라이브러리를 제공하며, 상기 단백질 약물 라이브러리는 C개 종류의 상이한 단백질 약물 단량체를 포함하되, 여기서 상기 단백질 약물 단량체는 단백질 약물 요소 부분, 및 상기 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하며, 하나의 상기 단백질 약물 단량체의 상기 핵산 요소 부분과 하나 이상의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성할 수 있고, 이에 의해 다량체성 단백질 약물을 구성하고; 여기서, C는 2 이상의 양의 정수이다.
본 발명의 라이브러리는 적어도 2개 이상의 단백질 약물 단량체를 더 포함하며, 바람직한 단백질 약물 단량체는 상기 화학식 I의 구조를 가진다.
본 발명의 단백질 약물 단량체는 특정적인 구조를 가지므로, 다량체 형태의 약물 단백질로 신속하게 조립할 수 있을 뿐만 아니라, 형성된 다량체성 단백질 약물은 다중특이적이고, 동시에 복수 개의 상이한 타겟을 타겟팅할 수 있고, 이에 의해 질환 치료 과정에서 동시에 또는 선후로 복수 개의 타겟에 대한 수요를 충족시킨다. 이밖에, 본 발명의 다량체성 단백질 약물은 예상밖의 체내 안정성을 더 갖고 있으며, 장시간 체내에 존재하고, 또 활성을 유지할 수 있으며, 빠르게 분해되지 않는다.
예를 들어, 암 치료에 있어서, 흔히 복수 개의 타겟 및 복수 개의 경로가 상관되며, 각각의 환자의 병인이 상이하고, 하나의 환자에 종양의 이질성이 존재하므로, 흔히 복수 개의 타겟에 대한 약물을 사용하여야 한다. 개인화된 치료 또는 정밀 치료 기술의 발전과 더불어, 비용이 낮고 타겟성이 좋으며, 안정적인 단백질 약물(예를 들어, 다중특이적 항체)를 신속하게 제조할 수 있는 개발이 본 기술분야에 있어서 시급하다. 본 발명의 라이브러리는 이러한 수요를 충족시킨다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 라이브러리는 본 발명의 상기 단백질 약물 단량체를 포함하거나 주로 포함하거나 전부 포함하지만, 상기 라이브러리는 다른 치료제를 더 포함하며, 특히 다른 단백질 약물을 포함하는데, 대표적인 예로, 항체, 화합물, 융합 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 라이브러리는 치료 작용을 가진 하나 또는 다수의 일반 항체를 별도로 포함할 수 있다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 라이브러리 중의 단백질 약물 단량체의 개수는 제한되지 않으며, 2 이상인 임의의 양의 정수 C일 수 있다. 예를 들어, C는 3 내지 100000의 임의의 양의 정수이며; C는 3 내지 10000이고, 보다 바람직하게 C는 5 내지 5000이며, 가장 바람직하게 C는 5 내지 5000이다.
이밖에, 본 발명에 있어서, 단백질 약물 단량체 중의 항체 요소는 특별히 제한되지 않으며, 대표적인 예는 단일 가닥 항체, 나노 항체, Fab, 단클론 항체 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 라이브러리에 대해, 다양한 유래의 항체를 사용하여 단백질 약물 단량체를 제조할 수 있다. 본 발명의 라이브러리의 하나의 돌출적인 특징은 원핵 시스템(예를 들어, 대장균) 및 진핵 시스템(예를 들어, 효모, CHO 세포)에 의해 발현된 항체 단편을 사용함으로써 생산 비용을 크게 감소시킬 수 있는 것이다.
전형적으로, 사용 시, 수요(예를 들어, 특정된 하나의 신체의 병세 및 진단 결과)에 따라, 대응되는 단백질 약물 단량체를 선택하여, 간단하게 핵산의 상보적 프레임워크에 의해 다중특이적 항체를 완성할 수 있다. 예를 들어, 적용 시, 환자의 질환의 타겟 경우에 따라, 단량체 종류, 개수 또는 비율(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 4개 이상)을 상응하게 결정한 다음 조립을 진행한다.
다량체성 단백질 약물을 제조할 경우, 라이브러리로부터 대응되는 상호 접합되어 커플링될 수 있는 단백질 약물 단량체를 선택하여 수요되는 항체 비율로 혼합한 후, 1분 이내에 조립 과정을 완성한다.
본 발명의 라이브러리에 있어서, 단백질 약물 단량체의 핵산 요소는 서열 설계에 의해 이량체, 삼량체, 사량체 등 중합체 프레임워크로 이루어질 수 있으며, 이에 따라 기존의 항체 공학으로 쉽게 달성하지 못하는 삼중특이적, 심지어 사중특이적 항체 등 다중특이적 항체 제조를 완성한다.
하나의 단부의 다중특이적인 다량체성 단백질 약물을 조립하여 형성하면 치료 목적에 따라 대응되는 개체에 적용할 수 있다.
좌회전성 핵산(L-핵산)
좌회전성 핵산은 자연계를 상대로 존재하는 우회전성 핵산(D-핵산)에 대해, 거울상으로 존재하는 것을 가리키며, 좌회전성 DNA(L-DNA) 및 좌회전성 RNA(L-RNA)로 나눌 수 있다. 좌회전성(카이랄 중심)은 주로 핵산의 디옥시리보오스(Deoxyribose) 또는 리보오스 부분에 존재하며 거울상 플립을 나타낸다. 따라서 좌회전성 핵산은 혈장 중 어디에나 존재하는 뉴클레아제(예를 들어, 핵산엑소뉴클레아제, 핵산엔도뉴클레아제)에 의해 분해되지 않는다.
본 발명의 다량체성 단백질 약물 및 이의 제조
본 발명의 다량체성 단백질 약물은 D개 종류의 단백질 약물 단량체가 핵산의 상호 보완에 의해 이중 가닥 접합 구조를 형성함으로써 형성된 폴리머를 가리키며, 여기서 D는 2 이상의 양의 정수이다. 상기 단백질 약물 단량체는 단백질 약물 요소 부분, 및 상기 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하며, 하나의 상기 단백질 약물 단량체의 상기 핵산 요소 부분과 다른 하나의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분은 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 요소 부분은 뉴클레아제 분해에 견디는 것이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 핵산 요소 부분은 좌회전성 핵산, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 티오-변형된 핵산, 2'-플루오로-변형된 핵산, 5-히드록시메틸시토신 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 다량체성 단백질 약물은, 예를 들어 화학식 I로 표시되는 단백질 약물 단량체의 조립에 의해 형성될 수 있다.
전형적으로, 다량체성 단백질 약물은 폴리머 항체(다중특이적 항체)를 가리키며, 예를 들어, 이중, 삼중, 사중, 오중 또는 육중특이적인 항체이다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 폴리머 항체는 2개 이상의 항체의 특이성을 함유하며, 복수 개의 항원에 결합되는 에피토프, 또는 하나의 항원에 결합되는 복수 개의 에피토프를 타겟팅할 수 있으므로, 항원 자체의 다운스트림 경로 또는 다른 단백질과의 상호 작용을 충분히 차단할 수 있고, 이에 의해 항체 치료 효과를 향상시키고 약제 내성을 감소시킨다.
하나의 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 단백질 약물은 좌회전성 핵산이 사용되는 다중특이적 항체이다. 본 발명의 연구 결과는, 핵산은 특이성 접합을 신속하게 진행할 수 있는 이중 가닥 분자이므로, 항체 단편(예를 들어, 단일 가닥 항체, 나노 항체, Fab 등)과 핵산 단일 가닥을 커플링시킬 경우, 핵산 서열을 설계하여 2개 이상의 핵산 단일 가닥을 신속하게 접합시켜 다량체를 형성할 수 있고, 이에 의해 항체 단편을 다량체를 형성하도록 유도하여 다중특이적 항체의 제조를 완성함을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 치료 효과를 향상시키기 위해, 특정 구조의 단백질 약물 단량체를 사용하여야 한다. 바람직한 예에서, 좌회전성 핵산(예를 들어, L-DNA, L-RNA 등)을 사용하여 우회전성 핵산(예를 들어, D-DNA, D-RNA)의 방식을 대체하여 치료 효과를 현저하게 향상시킬 수 있다. 하나의 원인은 L-핵산은 인체 체내에 존재하는 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 등에 의해 분해되지 못하므로 좌회전성 핵산(L-핵산) 자기조립에 의해 매개된 다중특이적 항체 조합에 의해 체내에서 극히 안정적으로 되는 것이다.
약학 조성물
본 발명은 조성물을 더 제공한다. 바람직한 예에서, 상기 조성물은 약학 조성물이며, 상기 항체 또는 이의 활성 단편 또는 그 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 물질은 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용가능한 수성 담체 매질 중에 배합될 수 있고, 여기서 pH는 통상적으로 약 5 내지 8이며, 비교적 바람직하게 pH는 약 6 내지 8이고, pH 값은 배합된 물질의 성질 및 치료될 병세에 따라 다소 변화될 수 있다. 그러나, 배합된 약학 조성물은 일반 경로에 의해 투여될 수 있고, 경구 복용, 호흡기관, 혹내, 복막내, 정맥내 또는 국부 투여 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 직접 치료(예를 들어, 항종양 치료)에 사용될 수 있으므로, 약물의 반감기를 연장하는데 사용될 수 있고, 이밖에, 다른 치료제도 동시에 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001 내지 99 wt %, 비교적 바람직하게 0.01 내지 90 wt %, 보다 바람직하게 0.1 내지 80 wt %)의 본 발명의 상기 단클론 항체(또는 이의 접합체(conjugate)) 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 해당 타입의 담체는 염수, 완충액, 글루코오스, 물, 글리세린, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 매칭되어야 한다. 본 발명의 약학 조성물은 주사약 형태로 이루어질 수 있고, 예를 들어, 생리염수 또는 글루코오스 및 다른 보조제를 포함한 수용액으로 일반 방법에 의해 제조한다. 주사약, 용액과 같은 약학 조성물은 무균 조건에서 제조하기에 적합하다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이며, 예를 들어, 매일 약 1 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중이다. 이밖에, 본 발명의 폴리펩타이드는 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
약학 조성물을 사용할 경우, 안전 유효량의 면역 접합체를 포유동물에 적용하고, 여기서 상기 안전 유효량은 통상적으로 적어도 약 10 μg/kg 체중이며, 대부분 경우, 약 8 mg/kg 체중을 초과하지 않고, 비교적 바람직하게, 상기 사용량은 약 10 μg/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중이다. 물론, 구체적인 사용량은 투여 경로, 환자 건강 상황 등 요소를 고려해야 하며, 이것은 모두 숙련된 의사 기술 범위 이내에 속한다.
본 발명의 주요 이점은 다음과 같다:
(1) 본 발명의 다중특이적 항체를 간편하고 빠르게 제조하여, 1분 이내에 좌회전성 핵산 가닥을 매개하여 복수 개의 항체의 조립을 완성할 수 있다.
(2) 본 발명의 다중특이적 항체의 개선 공간은 광범위하여 임의의 형태의 항체(예를 들어, 단일 가닥 항체, 나노 항체, Fab)를 다중특이적 항체로 조립할 수 있다.
(3) 본 발명의 다중특이적 항체를 제조하는 플랫폼 기술은 다중특이적 항체의 각 부분의 항체를 독립적으로 제조한 다음 간단한 체외 조립을 진행할 수 있다.
(4) 본 발명의 다중특이적 항체를 제조하는 플랫폼 기술은 본 발명에서의 다중특이적 항체의 중간산물(L-핵산-항체접합체)을 저장할 수 있으며, 수요에 따라 상이한 항원 또는 부위를 임의로 타겟팅하는 항체 조합을 유연하게 제조할 수 있고, 또 다중특이적 항체 중 특정된 항체의 비율을 조정할 수 있다.
(5) 본 발명의 다중특이적 항체를 제조하는 플랫폼 기술에 기반하여 항체 약물 라이브러리를 구축하며, 제공된 질환 및/또는 약학 정보에 따라 개인화된 정밀 치료에 적합한 항체 약물을 신속하고 간편하게 제조할 수 있고, 비용이 낮으며 통용성이 우수하다.
아래에 구체적인 실시예를 결부하여, 본 발명에 대해 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 아래 실시예에서 구체적 조건을 상세하게 표기하지 않은 실험 방법은 예를 들어, Sambrook 등 인간, 분자 클론: 실험실 안내서(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 중의 조건과 같은 통상적으로 일반 조건, 또는 제조업체가 건의하는 조건에 따른다. 달리 언급되지 않는 한, 백분율과 부는 중량을 기준으로 계산한다. 본 발명에 언급된 실험재료는 특별한 설명이 없는 한 모두 시장 구매에 의해 획득될 수 있다.
일반적인 방법
1. L-핵산 가닥 프레임워크의 설계 및 제조
본 발명에 따르면, L-핵산 가닥 프레임워크는 2개 이상의 L-핵산 단일 가닥으로 염기짝짓기에 의해 형성된다. 각각의 L-핵산 단일 가닥의 5' 단부 또는 3' 단부는 모두 후속적으로 변형된 라디칼(예를 들어, NH2 등)에 공급될 수 있도록 활성화되고, 다음, 연결자(예를 들어, SMCC, SM(PEG), SPDP 등)의 하나의 단부와 L-핵산 단일 가닥의 활성 라디칼을 커플링시킨다. 연결자를 보유한 L-핵산은 요구되는 L-핵산 가닥 프레임워크로 조립될 수 있다. 연결자를 보유한 L-핵산이 프레임워크로 성공적으로 자기조립될 수 있는 것이 결정된 후, 연결자를 보유한 L-핵산 단일 가닥을 각각 항체와 커플링하여 후속의 조립을 진행할 수 있다.
도 1은 좌회전성 핵산 자기조립에 기반하여 형성된 다중특이적 항체의 구조 모식도이며, 여기서 AN은 단일 가닥 항체, 나노 항체, Fab 등과 같은 항체 또는 항체 단편이다. L-핵산 프레임워크는 개수가 같지 않은 단일 가닥 핵산으로 조성되며, 단일 가닥 핵산의 하나의 단부는 활성 라디칼의 변형이 있고, 예를 들어, NH2 등이다. 단일 가닥 핵산의 개수는 다중특이적 항체의 유형에 따라 조정될 수 있으며, 예를 들어, 사중특이적 항체는 단일 가닥 핵산의 개수가 최저로 4개이다. 연결자(linker)는 단일 가닥 핵산의 활성 라디칼과 항체의 특이적 연결 부위(예를 들어, 돌연변이 시스테인 잔기의 SH 라디칼)를 연결하기 위한 것이다.
본 발명의 L-핵산 프레임워크는 기본적으로 하기와 같은 단계에 의해 제조될 수 있다.
1.1 신속하게 자기조립 가능한 L-핵산 단일 가닥의 설계
제조할 다중특이적 항체의 유형(예를 들어, 삼중특이적 항체)을 결정한다. 다중특이적 항체 중의 항체 개수 N에 따라 요구되는 L-핵산 단일 가닥의 개수 M을 결정한다. 대응되는 개수의 L-핵산 단일 가닥 서열을 설계하고, 염기짝짓기 개수를 증감하여 목적 핵산 프레임워크 안정성을 조절하며, 핵산 가닥 사이 비특이적 접합의 가능성을 감소시킨다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 따르면, 하나의 사량체 L-핵산 프레임워크(M = 4)를 설계하기 위하여, 일정한 규칙에 따라 접합되는 4개의 L-핵산(도 2에 도시된 바와 같음)을 설계한다. 여기서, 임의의 하나의 L-핵산 단일 가닥은 네 번째 접합 대신 다른 2개의 L-핵산 단일 가닥과 특이적인 상보적 접합을 진행할 수 있다. 특이적인 상보적 접합의 기브스 에너지(Gibbs energy) 변화량 △G는 비특이적 접합에 비해 훨씬 작고, 예를 들어, 상기 바람직한 실시형태에 있어서, 특이적인 상보적 접합의 기브스 에너지 변화량 △G는 약 -34 kcal/mole이며, 비특이적 접합은 모두 -10 kcal/mole보다 작은데, 이는 사량체의 조립 방식이 비특이성의 쌍쌍 접합보다 더 쉽게 발생하며, 사량체의 형태는 반응 시스템에서 가장 안정적인 것을 의미한다.
1.2 L-DNA 또는 L-RNA의 활성화
L-핵산의 활성화는 5' 단부 또는 3' 단부에서의 활성 라디칼 변형 및 후속의 연결자 커플링을 포함한다. 활성 라디칼 변형은 핵산 합성 회사의 주문제조에 의해 완성될 수 있다. 연결자는 일반적으로 이중 작용기를 포함하며, 즉 하나의 단부는 핵산의 활성 라디칼에 커플링될 수 있고, 다른 하나의 단부는 항체의 특이적 부위(예를 들어, SH)와 연결될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 따르면, 프레임워크를 구성하는 모든 L-핵산은 5' 단부에서 NH2 변형을 첨가한 다음, 연결자, 즉 이중 기능 라디칼 가교 시약 SMCC(4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카르복시산석신이미드에테르 나트륨염)를 이용하여 아미드 결합에 의해 핵산의 NH2와 커플링한다. 이경우, 연결자의 다른 하나의 단부의 말레이미드 라디칼은 유리 상태이며, L-핵산의 활성화가 완성될 때까지 후속적으로 항체에 커플링된 설프히드릴기(SH)에 사용될 수 있다.
1.3 핵산 프레임워크 중합도의 검증
핵산 프레임워크 중합도는 예를 들어, 아가로스 겔 전기영동에 의해 검증될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 따르면, 3 %의 아가로스 겔 전기영동을 선택하여 핵산 프레임워크 중합도를 분석한다. L-핵산의 단일 가닥 크기에 대비하여, 복수 개의 L-핵산 단일 가닥이 혼합된 후 형성된 프레임워크 크기를 쉽게 추산할 수 있고, 이에 의해 중합도를 얻는다.
본 기술분야의 기술자는 상기 반응 경로 및 바람직한 실시형태에서 설명된 방법에 따라 본 발명에 언급된 다른 L-핵산 프레임워크를 유사하게 제조할 수 있을 것이며, 제한성을 구비하지 않음을 이해할 수 있을 것이다.
2．항체의 선택 및 제조 방법
본 발명의 항체는 다중특이적 항체의 용도 및 목적에 따라 선택된다. 고형 종양 치료에 사용될 경우, 투과성이 높은 다중특이적 항체가 필요되며, 비교적 작은 항체 단편(예를 들어, 단일 가닥 항체, 나노 항체 등)을 선택한다. 혈액종양에 사용될 경우, 항체 또는 항체 단편 모두 선택해도 된다. 구체적인 선택은 치료의 용도 및 메커니즘에 의해 결정된다. 항체 단편의 제조에 대해, 대장균 또는 효모 등 저비용 발현 시스템을 선택한다. 전장 항체는 포유동물 세포 발현 시스템이 수요된다.
쉽게 활성화된 L-핵산과 커플링하기 위해, 항체에 연결자의 커플링에 사용하기 위한 하나의 특이적 부위(예를 들어, 돌연변이 부위, Cys)를 도입한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에 따르면, 항-PD-L1/PD-1/CD3의 단일 가닥 항체를 선택하여 삼중특이적 항체를 제조하며, 여기서 PD-1 및 CD3은 T 세포 표면의 부위에 위치하고, 주요 작용은 각각 항종양 활성을 해제하는 억제 작용 및 CD8 양성 T 세포를 활성화하는 것이다. PD-L1은 일부 종양 세포 표면에 위치하며, PD-L1과 작용하여 T 세포가 이에 대해 더 살상하는 것을 저지한다. 따라서, 2개의 항-PD-L1 단일 가닥 항체, 하나의 항-PD-1 단일 가닥 항체 및 하나의 항-CD3 단일 가닥 항체를 사용하여 삼중특이적 항체를 제조하며, 타겟 종양 및 면역세포에 사용되는 단일 가닥 항체 개수가 평형을 이루도록 하므로, 요구되는 L-핵산 프레임워크는 사량체(M = 4)이다. 각각의 단일 가닥 항체의 카르복실기 말단(C-말단)에 하나의 시스테인 돌연변이를 도입하여, SMCC 활성화의 L-DNA 단일 가닥과 커플링시키고, 각각의 단일 가닥 항체에 상이한 L-DNA 단일 가닥을 연결하며, 2개의 항-PD-L1 단일 가닥 항체는 다중특이적 항체의 하나의 단부에 있고, 항-PD-1 및 CD3의 단일 가닥 항체는 다른 하나의 단부에 있으며, 종양 세포에 T 세포를 쉽게 모집하기 위해서이다.
3．항체-L-핵산 복합물의 제조 방법
우선 L-핵산의 5' 단부 또는 3' 단부를 NH2로 변형시킨 다음, 연결자의 상이함에 따라 다음과 같은 주요 제조 방법이 있을 수 있으며, 여기서 연결자의 하나의 단부의 작용기는 L-핵산의 NH2 라디칼을 신속하게 커플링하기 위한 NHS(N-히드록시석신이미드) 또는 Sulfo-NHS(N-히드록시석신이미드술폰산나트륨염)이다. 이중 작용기를 포함한 연결자는 우선 L-핵산의 NH2와 반응하고, 다음, 항체의 설프히드릴기를 환원한 후, 다른 하나의 단부의 라디칼은 다시 설프히드릴기와 반응하여 안정적인 화학 결합을 형성한다.
3.1 말레이미드(Maleimide). 연결자가 항체의 설프히드릴기를 커플링하기 위한 라디칼은 말레이미드이다. 말레이미드는 항체에서 유리하는 설프히드릴기와 신속하게 반응하여 티오에테르 결합을 형성할 수 있다. 일반 연결자는 SMCC(4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카르복시산석신이미드에테르 나트륨염), SM(PEG)(폴리에틸렌글리콜 변형의 4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카르복시산석신이미드에테르 나트륨염) 등이 있다.
3.2 할로아세틸(Haloacetyl). 연결자가 항체의 설프히드릴기를 커플링하기 위한 라디칼은 할로아세틸이며, 예를 들어, 요오드, 브로모아세틸이다. 할로겐 이온은 항체의 설프히드릴기 친핵작용에 의해 치환되어 안정적인 티오에테르 결합을 형성할 수 있다. 일반 연결자는 SBAP(N-말레이미드메틸[4-브로모아세틸]아미노벤조에이트), SIAB(N-말레이미드메틸[4-요오드아세틸]아미노벤조에이트) 등이 있다.
3.3 티오피리딘(Pyridyldithiol). 연결자가 항체의 설프히드릴기를 커플링하기 위한 라디칼은 티오피리딘이다. 티오피리딘은 유리하는 설프히드릴기와 반응하여 이황화 결합을 형성할 수 있다. 일반 연결자는 SPDP(3-(2-피리딘디티오)프로피온산 N-히드록시석신이미드에테르) 등이 있다.
실시예 1: 사량체 DNA 구조 프레임워크의 설계
사각형 형상에 따라 접합된 4개의 L-핵산(예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같음)을 설계한다. 여기서, 임의의 하나의 L-핵산 단일 가닥은 다른 2개의 L-핵산 단일 가닥과 특이적인 상보적 접합을 진행할 수 있으며, 네 번째와 접합되지 않는다. 또한, 특이적인 상보적 접합의 기브스 에너지 변화량 △G는 비특이적 접합에 비해 훨씬 작고, 특이적인 상보적 접합의 기브스 에너지 변화량 △G는 약 -34 kcal/mole이며, 비특이적 접합은 모두 -10 kcal/mole보다 작은데, 이는 사량체의 조립 방식이 비특이성의 쌍쌍 접합보다 더 쉽게 발생하며, 사량체의 형태는 반응 시스템에서 가장 안정적인 것을 의미한다.
이상의 원칙에 따라 설계된 4개의 L-DNA 단일 가닥 서열은 하기와 같다(5'로부터 3').
가닥 1(L-DNA1): 서열번호 1
5' AAAA CGACAGTCCGATGTGCC AAA CGGCTGGAAGTTGAGC AA 3'
가닥 2(L-DNA2): 서열번호 2
5' AAAA GGCACATCGGACTGTCG AAA GGCGTAGCCTAGTGCC AA 3'
가닥 3(L-DNA3): 서열번호 3
5' AAAA CGCTGATATGCGACCTG AAA GCTCAACTTCCAGCCG AA 3'
가닥 4(L-DNA4): 서열번호 4
5' AAAA CAGGTCGCATATCAGCG AAA GGCACTAGGCTACGCC AA 3'
5' 단부에는 NH2 라디칼 변형이 존재하며, SMCC를 커플링하기 위한 NHS이다. AAAA 및 AAA 뒤의 염기 서열은 각각 다른 2개의 가닥과 상보적으로 접합되며, 각 부분의 접합의 기브스 에너지 변화량 △G는 약 -34 kcal/mole이다.
실시예 2: 사량체 DNA 프레임워크의 합성 및 검증
바이오기술서비스회사로부터 5' 단부 NH2 변형의 L-DNA 단일 가닥을 합성하였으며, 4개의 단일 가닥의 서열은 실시예 1에 표시된 바와 같다.
인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0)으로 L-DNA 단일 가닥을 용해시키고, 최종 농도가 200 μM인 모액으로 제조한다. 디메틸술폭시드(DMSO)로 SMCC 분말을 용해시키고, 250 mM인 SMCC 모액으로 신선하게 배합한다. L-DNA 단일 가닥 모액에 10 내지 50배 몰량의 SMCC 모액을 넣고, 빠르게 혼합한 후 실온에서 30 분 내지 2 시간 동안 반응시킨다. 반응이 완료된 후 반응액 10 % 부피의 1M Tris-HCl(pH 7.0)을 넣어 혼합한 후 실온에서 20분 동안 배양함으로써, 과량의 SMCC가 계속하여 반응하는 것을 정지시킨다. 배양이 종료된 후, 반응액 2배 부피의 100 % 무수에탄올을 넣고 균일하게 혼합한 후 -20℃ 냉장고에 25분 동안 넣어 L-DNA를 충분히 침전시킨다. 원심분리(12000 rpm, 10 분)하여 침전을 추출하고, 1 mL 70 % 에탄올로 세척하며, 12000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고 5회 반복하여 세척하여 과량의 SMCC를 충분히 제거한다. 나머지 백색 침전을 대기 중에서 5 내지 10 분 동안 자연 건조 시킨 다음 인산 완충액으로 재현탁, 용해시켜 SMCC-L-DNA 복합물(즉, SMCC-L-DNA 단일 가닥)을 얻는다.
각각의 SMCC-L-DNA 단일 가닥의 농도를 측정한다. 4개의 반응할 SMCC-L-DNA 단일 가닥을 적당한 량으로 취하여 40℃의 온도에서 5분 동안 예열한 다음 40℃의 온도 조건에서 같은 몰량의 4개의 SMCC-L-DNA 단일 가닥을 혼합하고 1분 동안 배양한다. 반응 시스템에 상이한 마그네슘 이온 농도를 설정하여 마그네슘 이온 농도가 프레임워크 형성에 미치는 영향을 탐색한다. 0.25 μL의 SMCC-L-DNA 단일 가닥 및 반응산물을 선택하여 3 % 아가로스 겔 전기영동으로 분석한다. 결과는, 도 3에 도시된 바와 같이, SMCC-L-DNA 단일 가닥의 크기는 약 25 bp 정도이고, 혼합 후 형성된 주 밴드는 약 100 bp 정도인데, 이는 4개의 상이한 SMCC-L-DNA 단일 가닥이 사량체 프레임워크를 형성하였음을 나타내며, 또한 상이한 마그네슘 이온 농도는 그 자기조립에 영향을 미치지 않고, 극히 높은 안정성을 가진다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 단일 가닥 항체 돌연변이체의 제조
단일 가닥 항체의 카르복실기 말단에 시스테인 돌연변이를 도입한다. 단일 가닥 항체에 이황화 결합이 존재하고, 대장균 세포질 중 환경이 이황화 결합의 형성에 불리하므로, 단일 가닥 항체를 대장균의 주변 세포질 공간에 분비하여 폴딩을 진행하여 이황화 결합을 형성하여야 한다.
항-PD-1/PD-L1/CD3 단일 가닥 항체의 유전자 서열을 대장균이 선호하는 코돈으로 최적화하고, 유전자 양단에 각각 NcoI 및 XhoI 제한효소 접합 부위를 첨가한 다음, pET22b 플라스미드 중의 NcoI/XhoI 부위 사이에 서브클로닝한다. 항-PD-1/PD-L1/CD3 단일 가닥 항체의 아미노산 서열은 각각 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7이다.
서열번호 5, 항-PD1 단일 가닥 항체 돌연변이체(Anti-PD1 single-chain antibody mutants) 아미노산 서열은 다음과 같다.
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSAGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKC
서열번호 6, 항-PD-L1 단일 가닥 항체 돌연변이체(Anti- PD-L1 single-chain antibody mutants) 아미노산 서열은 다음과 같다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSGSPFGMDVWGQGTTVTVSSAGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKC
서열번호 7, 항-CD3 단일 가닥 항체 돌연변이체(Anti-CD3 single-chain antibody mutants) 아미노산 서열은 다음과 같다.
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFSGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKC
pET22b 플라스미드는 pelB 신호 펩타이드 서열을 보유하므로, 단일 가닥 항체가 주변 세포질 공간에 분비되도록 유도할 수 있다. 1 μL의 구축된 발현 벡터를 취하여 대장균 BL21(DE3)로 전환시키고, 전환된 후의 BL21(DE3)을 선택하여 LB 배지(100 μg/mL 암피실린을 포함함)에서 단일 클로닝하며, 37℃에서 OD600 = 0.7이 될 때까지 배양하고, 최종 농도가 1 mM인 IPTG를 넣어 유도 발현시키며 37℃에서 계속하여 3시간 내지 4시간 동안 배양한다. 원심분리하여 발현이 완료된 후의 균체를 수집하고, 인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0), 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma)에서 재현탁하고 초음파를 이용하여 파쇄시킨다. DNaseI 가수분해 효소를 얼음에서 1시간 동안 배양시킨다. 배양이 종료된 후, 균액은 17000 rpm에서 20분 동안 원심분리되어 상청액을 수집한다. Hitrap Protein L 친화성 칼럼으로 상청액 중의 단일 가닥 항체를 정제하고, 상청액은 0.25 mL/분의 속도로 칼럼을 통과한 후 대량의 인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0)을 사용하여 1 mL/분의 유속으로 칼럼을 복합단백질이 흐르지 않을 때까지(AKTA 단백질 크로마토그래피 시스템에 따른 자외선 흡수) 세척하며, 0 내지 100 % 용리 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 2.3) 구배에 의해 칼럼 상에 결합된 단일 가닥 항체를 용리시킨다. 단일 가닥 항체 성분을 수집하여 pH를 7.0으로 조절한다.
실시예 4: 단일 가닥 항체-L-DNA의 커플링 및 정제
정제한 후의 단일 가닥 항체를 10 내지 50배 몰비를 초과한 환원제(예를 들어, TCEP, DTT, 설프히드릴에탄올 등)로 실온에서 30분 동안 배양한다. 배양이 종료된 후, PD-10 탈염 칼럼으로 반응 시스템 중의 환원제를 신속하게 제거하고, 동시에 완충액을 인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0)으로 치환한다. 단일 가닥 항체의 농도를 측정한 후, 1 내지 4배 몰비를 초과한 SMCC-L-DNA 단일 가닥(실시예 2에서 제조)을 즉시 넣고 균일하게 혼합한 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨다.
DNA와 같은 핵산은 음전하를 띠기 때문에, 음이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP 칼럼)으로 단일 가닥 항체-L-DNA를 분리 정제하여 반응하지 않은 단일 가닥 항체, 과량의 SMCC-L-DNA 단일 가닥을 제거한다. 분리 과정은 구배 용리에 의해 구현되며, 샘플링 완충액은 50 mM NaH2PO4, pH 7.0이고, 용리 완충액은 50 mM NaH2PO4, 1 M NaCl pH 7.0이며, 0 내지 100 %의 용리 완충액은 구배 용리를 진행하고, 반응하지 않은 단일 가닥 항체, 단일 가닥 항체-L-DNA, 과량의 SMCC-L-DNA 단일 가닥은 선후로 피크를 나타낸다. 단일 가닥 항체-L-DNA를 수집하여 농축시킨 후 PD-10 탈염 칼럼으로 완충액을 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0으로 치환한다.
실시예 5: 다중특이적 항체의 자기조립
단일 가닥 항체가 자체로 폴리머를 형성하는 가능성을 배제하기 위하여, 실시예 4에서 금방 커플링 반응을 완성한 단일 가닥 항체-L-DNA 반응액을 이용하여 자기조립 실험을 진행하였다. 커플링 반응 중의 단일 가닥 항체/SMCC-L-DNA 반응 비율은 1:0.5이며, 반응이 종료된 후 커플링되지 않은 단일 가닥 항체가 있음을 확보하나 반응하지 않은 SMCC-L-DNA 단일 가닥을 제거해야 한다. 따라서, 반응이 완료된 후, 적당한 량의 Protein L 필러를 넣고 10분동안 배양하며, 12000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하고 1Ml의 인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0)을 넣고 필러를 세척하며, 원심분리하여 상청액을 제거하되 이와 같이 4회 반복한다. 용리 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 2.3)을 넣고 10분 동안 배양하며, 필러 표면에 용리 흡착되는 단일 가닥 항체 및 단일 가닥 항체-L-DNA의 pH를 7.0으로 조절한다. 실시예 1 중의 가닥 1(L-DNA1)은 항-PD-L1 단일 가닥 항체와 커플링되고, 가닥 2(L-DNA2)는 항-PD-L1 단일 가닥 항체와 커플링되며, 가닥 3(L-DNA3)은 항-PD-1 단일 가닥 항체와 커플링되고, 가닥 4(L-DNA4)는 항-CD3 단일 가닥 항체와 커플링된다.
100 μL의 상기 Protein L 정제를 거친 단일 가닥 항체-L-DNA 반응액을 취하여 40℃의 온도에서 5분 동안 예열한 다음 40℃의 온도 조건에서 같은 부피의 단일 가닥 항체-L-DNA 반응액을 혼합하고 1분 동안 배양한다. 반응 후 30 μL를 취하여 SDS-PAGE로 분석한다. 전기영동이 종료된 후, SDS-PAGE 겔에 대해 우선 2 μg/mL의 브롬화에틸 용액으로 20분 동안 염색시키고, 초순수로 3회 세척한 후 자외선 하에서 발색시켜 DNA를 포함한 밴드(예를 들어, 단일 가닥 항체-L-DNA의 단량체, 다중특이적 항체)를 관찰할 수 있다. 다음, 동일 블럭의 겔을 쿠마시 브릴리언트블루법으로 염색하여 모든 단백질 샘플의 전기영동 상황을 관찰할 수 있다.
결과는, 도 4에 도시된 바와 같이, L-DNA를 커플링한 단일 가닥 항체에 비해, 커플링하지 않은 단일 가닥 항체에 현저한 편이 현상이 발생하였으며, L-DNA만 커플링한 단일 가닥 항체는 자외선 하에서 영상화될 수 있음을 나타낸다. 브롬화에틸(EB) 염색 후, 자외선 하에서 폴리머의 존재를 관찰할 수 있으며, 분자량의 크기에 따라 사량체와 이량체를 판단할 수 있다. 이량체의 존재는 항-CD3 단일 가닥 항체-L-DNA의 양이 다른 3개의 단일 가닥 항체-L-DNA보다 현저하게 적어야 하므로, 사량체로 전부 자기조립할 수 없게 되어 다른 3개의 단일 가닥 항체-L-DNA가 비특이적으로 쌍쌍 조합되어 이량체를 형성하는 경향을 갖도록 한다. 쿠마시 브릴리언트블루 염색 후, 다양한 단일 가닥 항체-L-DNA가 혼합된 후 단량체의 밴드가 소실되는 것을 관찰할 수 있으며, 150 kDa 정도에서 분명하지 못한 밴드가 나타나고, EB 염색 결과에 따라 사량체를 판단할 수 있다. 반응하지 않은 단일 가닥 항체 밴드는 아무런 변화가 발생하지 않았으며, 이는 사량체의 형성이 L-DNA의 상호 접합에 의한 형성임을 나타낸다. 따라서, 상기 L-DNA 사량체 프레임워크는 사중특이적 항체 등 다중특이적 항체를 신속하게 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 6: MBP 융합 단일 가닥 항체 돌연변이체의 발현 및 제조
단일 가닥 항체는 대장균에서 독립적으로 발현되어 흔히 생물 활성을 가지지 않는 포함체를 형성하며, 단일 가닥 항체의 가용성 및 생물 활성을 향상시키기 위하여, 맥아당 결합 단백질(MBP) 및 3개의 단일 가닥 항체(항-PD-L1/CD3/CEA 단일 가닥 항체, 서열번호 1, 2 및 3) 융합 발현의 담체를 구축하여 MBP-ScFv 융합 단백질을 형성한다. MBP 및 단일 가닥 항체 중간에 TEV 효소 접합 부위를 도입하여 MBP 태그 제거에 사용하며, 유전자 양단에 각각 NcoI 및 XhoI 제한효소 접합 부위를 첨가한 다음, pET21b 플라스미드 중의 NcoI/XhoI 부위 사이에 서브클로닝한다.
1 μL의 구축된 발현 벡터를 취하여 대장균 BL21(DE3)로 전환시키고, 전환된 후의 BL21(DE3)을 선택하여 LB 배지(100 μg/mL 암피실린을 포함함)에서 단일 클로닝하며, 37℃에서 OD600 = 0.7이 될 때까지 배양하고, 최종 농도가 0.1 mM인 IPTG를 넣어 유도 발현시키며 16℃에서 계속하여 12시간 내지 16시간 동안 배양한다. 같은 양의 균액을 조금 취하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술을 이용하여 단백질 발현 정황에 대해 모니터링하였으며, 도 5의 왼쪽 도면에 도시된 바와 같이, 레인 1은 IPTG를 넣지 않고 유도한 대조 실험이고, 레인 2, 레인 3, 레인 4는 각각 MBP-항-CD3단일 가닥 항체, MBP-항-CEA 단일 가닥 항체, MBP-항-PDL1 단일 가닥 항체의 단백질 발현 정황이며, 이는 MBP-ScFv 융합 단백질이 대장균 발현 시스템에서 그 발현 정황이 안정적이라는 것을 나타내고, 발현량은 비교적 높으며, 단백질 분자량은 약 69 kDa이다.
MBP-항-CEA 단일 가닥 항체를 예로, 원심분리하여 발현이 완료된 후의 균체를 수집하여, HEPES 완충액(20 mM HEPES + 150 mM NaCl, pH = 7.4)에서 재현탁하고, 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma), 환원제 설프히드릴에탄올, DNaseI 가수분해 효소를 넣고, 초음파를 이용하여 파쇄시키며, 39000 g을 40분 동안 원심분리하여 가용 성분으로서 상청액을 수집하고, 포함체 성분으로서 동일한 부피 HEPES 완충액에서 재현탁 침전시키며, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술을 이용하여 단백질 가용 정황에 대해 모니터링하였으며, 도 5의 오른쪽 도면에 도시된 바와 같이, 레인 1은 전체 균 용해액이고, 레인 2는 가용 성분이며, 레인 3은 포함체 성분이고, 이는 MBP-ScFv 융합 단백질이 대장균 발현 시스템에서 가용성이 양호하다는 것을 나타낸다.
니켈 칼럼 친화성 크로마토크래피 방법을 이용하여 MBP 융합 단일 가닥 항체 돌연변이체에 대해 초기 정제를 진행한다. MBP-ScFv 융합 단백질을 니켈 칼럼에 넣고, 30분 동안 흡착한 후 유출액을 제거하며, 각각 20 mM 및 40 mM 이미다졸로 복합단백질을 용리하고, 400 mM 이미다졸로 용리하여 목적 단백질을 수집하며, 단일 가닥 항체-L-DNA의 후속 커플링 및 정제를 기다린다.
실시예 7: 단일 가닥 항체-L-DNA의 커플링 및 정제
PD-10 탈염 칼럼으로 초기 정제된 MBP 융합 단일 가닥 항체 중의 과량 환원제 설프히드릴에탄올을 신속하게 제거하고, 1 내지 4배 몰비를 초과한 SMCC-L-DNA 단일 가닥(실시예 2에서 제조)을 즉시 넣고 균일하게 혼합한 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 직쇄 녹말 수지 친화성 크로마토크래피 방법에 의해 반응하지 않은 DNA를 제거하고, 목적 단백질과 직쇄 녹말 칼럼을 결합시켜, 10CV HEPES 완충액(20 mM HEPES + 150 mM NaCl, pH = 7.4)에 넣고 씻어내어 반응하지 않은 DNA를 제거한다. 다음, TEV 효소를 넣어 3시간 동안 배양하고, 직쇄 녹말 칼럼에서 융합 단백질을 절제하며, 유출액은 MBP 융합 단백질을 절제한 단일 가닥 항체이고, 유출액을 수집한다. DNA와 같은 핵산은 음전하를 띠기 때문에, 음이온 교환 칼럼(HiTrap Q HP 칼럼)으로 단일 가닥 항체-L-DNA를 분리 정제하여 TEV 효소를 제거한다. 분리 과정은 구배 용리에 의해 구현되며, 샘플링의 완충액은 20 mM Tris-Cl + 15 mM NaCl, pH = 8.5이고, 용리 완충액은 20 mM Tris-Cl + 1 M NaCl, pH = 8.5이며, 0 내지 100 %의 용리 완충액은 구배 용리를 진행하고, TEV 효소 및 단일 가닥 항체-L-DNA는 선후로 피크를 나타내며, 단일 가닥 항체-L-DNA를 수집한다. 단일 가닥 항체-L-DNA에 대해 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 정제를 진행하고, 샘플이 HEPES 완충액(20 mM HEPES + 150 mM NaCl, pH = 7.4)에 의해 평형된 후의 Superdex 200 10/300 GL 칼럼(GE Healthcare)으로 정제 분리된 후, 자외선에 따라 A280 샘플링을 흡수하며, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술을 이용하여 피크 위치 및 샘플 순도를 검사한다. 항-CD3-L-DNA2를 예로, 도 6에 도시된 바와 같이, 최종적으로 생물 물리학적 성질이 균일하고, 순도가 비교적 높은 단일 가닥 항체-L-DNA 커플링 샘플을 얻을 수 있으며, 그 분자량 크기는 약 40 kDa이다.
실시예 8: 다중특이적 항체의 자기조립
실시예 1 중의 가닥 1(L-DNA1)은 항-CEA 단일 가닥 항체와 커플링되고, 가닥 2(L-DNA2)는 항-PD-L1 단일 가닥 항체와 커플링되며, 가닥 3(L-DNA3)은 항-CEA 단일 가닥 항체와 커플링되고, 가닥 4(L-DNA4)는 항-CD3 단일 가닥 항체와 커플링된다. 각각 300 μL의 항-CEA-L-DNA1, 항-PDL1-L-DNA2, 항-CEA-L-DNA3을 취하여 37℃의 온도에서 5분 동안 예열한 다음 37℃ 조건에서 같은 부피로 3개의 단일 가닥 항체-L-DNA를 혼합하고 5분 동안 배양한다. 반응 후 30 μL의 반응액을 취하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술을 이용하여 항체 조립 정황에 대해 모니터링하였으며, 도 7의 왼쪽 도면에 도시된 바와 같이, 레인 1, 레인 2, 레인 3은 각각 항-CEA-L-DNA1, 항-PDL1-L-DNA2, 항-CEA-L-DNA3 단백질 밴드이고, 레인 4는 3개의 특이적인 항체 자기조립 후의 단백질 밴드이며, 그 단백질 분자량 결과는, 항-CEA-L-DNA1, 항-PDL1-L-DNA2, 항-CEA-L-DNA3은 자기조립하여 삼량체를 형성할 수 있음을 나타낸다. 삼량체에 대해 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 정제를 진행하여 반응하지 않은 단일 가닥 항체-L-DNA 단량체를 제거한다. 정제 후의 삼량체를 최종 농도가 0.1 μM이 될 때까지 희석하고, 37℃의 온도 조건에서 동일 부피 동일 농도로 항-CD3-L-DNA4를 넣어 5분 동안 배양한다. 반응 후 30 μL의 반응액을 취하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 기술을 이용하여 항체 조립 정황에 대해 모니터링하였으며, 도 7의 오른쪽 도면에 도시된 바와 같이, 레인 1은 항-CD3-L-DNA4과 반응하기 이전의 삼량체이고, 레인 2는 항-CD3-L-DNA4와 반응한 이후의 사량체이며, 그 사량체 단백질 분자량은 약 168 kDa이다. 따라서, 이상 실험으로부터 상기 L-DNA 사량체 프레임워크는 사중특이적 항체 등과 같은 다중특이적 항체의 제조에 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 9: 사량체 DNA 프레임워크의 조립 최적화
인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0)으로 4개의 L-DNA 단일 가닥을 용해시키고, 최종 농도가 20 μM인 저장액으로 배합한다. 사량체 DNA 프레임워크의 조립을 최적화하기 위해, 조립 과정을 두 가지 방식으로 나누어 비교를 진행한다. 첫째, 먼저 3개의 L-DNA 단일 가닥을 혼합하고 실온 또는 37℃의 온도에서 5분 동안 혼합 반응시키며, 30분 기다린 후, 다시 네 번째 L-DNA 단일 가닥을 넣는다. 둘째, 4개의 L-DNA 단일 가닥을 동시에 혼합하고, 37℃의 온도에서 5분 동안 혼합 반응시킨다. 반응이 종료된 후, 각 그룹의 샘플을 5 μL 취하여 2 % 아가로스 겔로 분석한다.
결과는, 도 8에 도시된 바와 같이, 4개의 L-DNA를 동시에 혼합하여 반응시킬 경우, 주요 산물은 사량체이지만, 많은 비특이 고중합도 조립 산물(레인 7)이 동시에 존재함을 나타낸다. 3개의 L-DNA를 먼저 혼합하고 다시 네 번째 L-DNA를 넣을 경우, 실온 및 37℃의 반응 결과는 모두 단일한 사량체 산물이며, 임의의 비특이적 밴드(레인 5 및 레인 6)가 없다. 결과는, 상기 DNA 프레임워크의 조립에 대해, 먼저 삼량체를 조립하고 다시 네 번째 L-DNA를 넣어 조립하는 방식이 4개를 직접 혼합시킨 방식보다 훨씬 우수함을 나타낸다.
실시예 10: D-DNA 및 L-DNA 사량체 프레임워크의 분해 내성 실험
D-DNA에 비해, L-DNA의 이점은 자연계 중의 DNA 효소에 의해 분해되지 못하는 것이다. 인체 내에 다양한 DNA 효소가 존재하며, L-DNA 사량체 프레임워크가 DNA 효소에 의해 분해될 수 있거나 해중합될 수 있는지 여부를 검증하기 위하여, DNAse I, T7 DNA 엔도뉴클레아제(endonuclease), S1 뉴클레아제(nuclease), 엑소뉴클레아제 I(Exonuclease I)를 선택하여 D-DNA 및 L-DNA 사량체 프레임워크에 대해 처리한다. D-DNA 및 L-DNA의 4개의 단량체 서열은 일대일로 대응되며, 조립 방식은 실시예 9에서 개선된 2단계법 조립을 이용한다. 다양한 효소에 D-DNA 또는 L-DNA 사량체 프레임워크를 넣은 후, 37℃ 수욕에 17시간 동안 담근 후, 샘플을 취하여 2 % 아가로스 전기영동으로 분석한다.
결과는, 도 9에 도시된 바와 같이, L-DNA 사량체 프레임워크는 4개의 DNA 효소의 처리에 견딜 수 있으며, 임의의 분해가 존재하지 않음을 나타낸다. D-DNA 사량체는 DNAse I 및 S1 뉴클레아제에 의해 거의 완전히 분해되며, 엑소뉴클레아제 1 및 T7 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 이중나선 구조가 파괴될 수 있다. 따라서, L-DNA 사량체 프레임워크는 일반적인 다양한 DNA 효소에 의해 분해되지 못한다.
실시예 11: L-DNA 프레임워크를 대분자량 단백질의 사량체 조립에 사용
L-DNA 프레임워크가 대분자량 단백질의 조립에도 사용될 수 있다는 것을 나타내기 위하여, 실시예 1 중 L-DNA 사량체 프레임워크를 MBP(맥아당 결합 단백질)-항-PDL1 단일 가닥 항체 융합 단백질(이하, 융합 단백질로 약칭함, 분자량은 69 kDa)의 사량체 조립에 사용한다. MBP-항-PDL1 단일 가닥 항체 융합 단백질은 실시예 6에 따라 제조된다. L-DNA 사량체 프레임워크의 4개의 DNA는 실시예 7의 방법에 따라 융합 단백질에 커플링하고 또 더 정제하여 4개의 L-DNA-융합 단백질을 얻는다. 4개의 L-DNA-융합 단백질의 완충액을 인산 완충액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.0)으로 치환하고, 최종 농도 1 μM 및 2 μM로 37℃에서 사량체 조립을 진행하며, 반응 산물은 10 % SDS-PAGE 및 분자 선별로 분석한다.
단백질 전기 영동 결과는, 도 10에 도시된 바와 같이, 융합 단백질은 L-DNA를 커플링시킨 후, 분자량이 커졌으므로, SDS-PAGE 상에서의 밴드가 위로 이동하였음을 나타낸다. 2개의 조립 농도(1 μM 및 2 μM) 하에서, 4개의 L-DNA-융합 단백질은 모두 융합 단백질 사량체로 특이적으로 조립될 수 있고, 반응하지 않은 융합 단백질 단량체(즉, L-DNA 커플링이 없는 융합 단백질)는 조립에 참여하지 않았다. 결과는, L-DNA 사량체 프레임워크는 융합 단백질 사량체의 조립을 매개하였고, 융합 단백질의 대분자량은 상기 L-DNA 프레임워크의 조립 효율에 영향을 미치지 않았음을 나타냈다.
분자 선별 결과는, 도 11에 도시된 바와 같이, 융합 단백질 사량체는 단일한 용리 피크를 나타냈으며, 피크형은 대칭되었는데 이는 융합 단백질 사량체가 매우 균일하여 한 가지 조립 방식만 존재한다는 것을 나타낸다.
실시예 12: L-DNA 프레임워크에 기반하여 제조된 사중특이적 항체 체외 활성 평가
항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체의 체외 활성을 분석하기 위하여, 대장암 세포계 LS174T(CEA 양성 세포)를 세포 모델로 한다. 2만 개의 LS174T 세포를 48 웰 플레이트에 펴고 24시간 후, 3-옥타데실-2-[3-(3-옥타데실-2(3H)-벤조옥사졸-2-일이덴)-1-프로펜-1-일]벤즈옥사졸 고염산염(3-octadecyl-2-[3-(3-octadecyl-2(3H)-benzoxazol-2-ylidene)-1-propen-1-yl]benzoxazole high chloride Acid salt)(DiOC18, DIO 세포막 녹색 형광 프로브)으로 염색한 다음, 40만 개의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로 더 배양하고, 동시에 농도 구배로 희석한 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체(0.001 nM 내지 20 nM)를 넣어 총 96시간 동안 배양한다. 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI)로 사멸된 세포를 표기한 후, 플로 사이토미터(flow cytometer)로 녹색 형광 프로브 및 프로피디움 요오드화물 형광 더블신호의 세포수를 검출한다. 양성 대조군은 Triton-X100 처리 및 Dynabeads(표면에 항-CD28/CD3 항체의 세포주를 커플링하여 T 세포를 고효율적으로 활성화시킴)이고, 음성 대조군은 항체에 사용되는 완충액이다. Triton-X100 처리 그룹의 세포 사멸수를 100 % 살상으로 하고, 완충액 그룹을 0 % 살상으로 한다.
결과는, 도 12에 도시된 바와 같이, 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체는 T 세포가 LS174 T 세포에 대한 살상을 고효율적으로 매개하였으며, 상기 살상 활성은 사용량에 의존함을 나타낸다. 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체의 EC50은 약 0.7 nM이다.
실시예 13: 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체의 T 세포 활성화 능력
항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체가 T 세포를 활성화시키는 능력을 분석하기 위하여, 인터페론γ(IFN-γ)를 선택하여 검출 대상으로 한다. 구체적 과정은 다음과 같다. 대장암 세포계 LS174T를 세포 모델로 한다. 2만 개의 LS174T 세포를 48 웰 플레이트에 펴고 24시간 후, 40만 개의 말초혈액 단핵세포로 더 배양하고, 동시에 농도 구배로 희석한 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체(0.001 nM 내지 20 nM)를 넣어 총 96시간 동안 배양한다. 브레펠딘 A(Brefeldin A)로 IFN-γ를 T 세포 표면에 고정시키고, 다시 형광으로 표기된 항-CD3 항체를 T 세포로 표기한 다음, 플로 사이토미터로 IFN-γ/CD3 더블 양성의 세포수를 검출한다. 양성 대조군은 Dynabeads(표면에 항-CD28/CD3 항체의 세포주를 커플링하여 T 세포를 고효율적으로 활성화시킴)이고, 음성 대조군은 항체에 사용되는 완충액이다.
결과는, 도 13에 도시된 바와 같이, 각각의 농도의 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체는 이것이 IFN-γ를 방출하도록 모두 T 세포를 활성화시킬 수 있으며, 이는 실시예 12 중의 체외 활성 실험 결과와 일치함을 나타낸다. 항-CEA/PD-L1/CD3 사중특이적 항체의 T 세포에 대한 활성화 능력은 양성 대조군(Dynabeads)에 상당하며, 음성 대조군(완충액)은 현저한 IFN-γ 방출이 없다.
본원에서 언급된 모든 문헌은 각각의 문헌이 단독으로 인용되는 것과 마찬가지로 모두 본원에서 참조로서 혼입된다. 또한, 본원의 상기 기술된 교시에 비추어, 본 기술분야의 기술자들이 본 발명에 대해 여러가지 변경 또는 수정을 진행할 수 있으며, 이러한 등가물은 본원의 청구범위에 의해 한정된 범위에 속함이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ASSEMBLY MEDICINE, LLC. <120> MULTISPECIFIC PROTEIN DRUG AND LIBRARY THEREOF, PREPARING METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOF <130> P2018-0396 <140> PCT/CN2018/080058 <141> 2018-03-22 <150> CN 201710322583.3 <151> 2017-05-09 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> L-DNA1 <400> 1 aaaacgacag tccgatgtgc caaacggctg gaagttgagc aa 42 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> L-DNA2 <400> 2 aaaaggcaca tcggactgtc gaaaggcgta gcctagtgcc aa 42 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> L-DNA3 <400> 3 aaaacgctga tatgcgacct gaaagctcaa cttccagccg aa 42 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> L-DNA4 <400> 4 aaaacaggtc gcatatcagc gaaaggcact aggctacgcc aa 42 <210> 5 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Anti-PD1 single-chain antibody mutants <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 130 135 140 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 195 200 205 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn 210 215 220 Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Cys 225 230 235 <210> 6 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Anti- PD-L1 single-chain antibody mutants <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asp Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Lys Ala His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Phe His Phe Val Ser Gly Ser Pro Phe Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val 130 135 140 Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 145 150 155 160 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 180 185 190 Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr Phe Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Cys 245 <210> 7 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Anti-CD3 single-chain antibody mutants <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 130 135 140 Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile 145 150 155 160 Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg 180 185 190 Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr 210 215 220 Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Cys 245

Claims (10)

  1. C개 종류의 상이한 단백질 약물 단량체를 포함하는 단백질 약물 라이브러리로서,
    단백질 약물 단량체가 단백질 약물 요소 부분, 및 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하고, 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분 및 하나 이상의 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분이 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성할 수 있고, 이에 의해 다량체성 단백질 약물을 구성하고, C가 2 초과의 양의 정수이고, 단백질 약물 단량체가 하기 화학식 I로 표시되는 구조를 가지는, 단백질 약물 라이브러리:
    [화학식 I]
    P─X─L─Y─A─Z
    상기 식에서,
    P는 단백질 약물 분자(즉, 단백질 약물 요소 부분)이고;
    X는 부재하거나 중복된 펩타이드이고;
    L는 연결자 분자이고;
    Y 및 Z는 각각 부재하거나 중복된 핵산이고;
    A는 좌회전성 핵산, 잠금 핵산, 티오-변형된 핵산, 2'-플루오로-변형된 핵산, 5-히드록시메틸시토신 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택되는 핵산 서열이고;
    -는 공유 결합이고;
    임의의 단백질 약물 단량체의 핵산 A는 하나 이상의 상보적 접합 영역을 가지되, 상보적 접합 영역은 단백질 약물 라이브러리 중의 하나 이상의 단백질 약물 단량체의 핵산 A의 상보적 접합 영역과 부분적으로 또는 완전히 상보적이고;
    단백질 약물 분자 P가 항체이고; 및
    연결자 분자 L의 반응기는 말레이미드, 할로아세틸, 티오피리딘으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    단백질 약물 요소 부분이 핵산 요소 부분에 직접적으로 연결되거나 간접적으로 연결되는, 단백질 약물 라이브러리.
  3. 제1항에 있어서,
    항체가 암, 자가면역 질환, 면역관문, 장기 이식 거부 반응, 류마티스 관절염, 당뇨병 또는 혈우병의 질환을 치료하기 위한 항체로부터 선택되는, 단백질 약물 라이브러리.
  4. 제1항에 있어서,
    연결자 분자 L이 이작용성 연결자를 가지고, 변형된 기를 가지는 핵산 A 또는 Y의 변형된 단부 및 항체 P 또는 X의 특이적 연결 부위와 커플링될 수 있는, 단백질 약물 라이브러리.
  5. (a) 약학 정보에 기반하여 제1항에 따른 단백질 약물 라이브러리로부터 2개 이상의 단백질 약물 단량체를 선택하는 단계; 및
    (b) 2개 이상의 단백질 약물 단량체를 혼합하여 다량체 형태의 다중특이적 단백질 약물을 조립하는 단계
    를 포함하는, 개인화된 치료를 위한 단백질 약물의 조립 방법.
  6. 핵산 상호 보완에 의해 이중 가닥 접합 구조를 형성하는 D개 종류의 단백질 약물 단량체에 의해 형성된 폴리머이되, D가 2 초과의 양의 정수인, 다량체성 단백질 약물로서,
    단백질 약물 단량체가 단백질 약물 요소 부분, 및 단백질 약물 요소 부분이 연결되는 핵산 요소 부분을 포함하고, 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분 및 상이한 단백질 약물 단량체의 핵산 요소 부분이 상호 보완되어 이중 가닥 접합 구조를 형성하고,
    핵산 요소 부분이 좌회전성 핵산, 잠금 핵산, 티오-변형된 핵산, 2'-플루오로-변형된 핵산, 5-히드록시메틸시토신 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택되며,
    단백질 약물 단량체는 제1항에 따른 단백질 약물 라이브러리로부터의 단백질 약물 단량체인, 다량체성 단백질 약물.
  7. (i) 활성 성분으로서 제6항에 따른 다량체성 단백질 약물; 및
    (ii) 약학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는, 항암 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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