ES2624653T3 - Andamios de tejidos porosos - Google Patents

Abstract

Un método para producir un material poroso a partir de una solución líquida que comprende un polímero biocompatible, comprendiendo el método: a. introducir la solución de polímero biocompatible en un recipiente térmicamente aislado con una superficie térmicamente conductora; b. opcionalmente, permitir que al menos parte de la solución de polímero biocompatible se gelifique, enfriando el recipiente en un dispositivo de enfriamiento a una temperatura en el intervalo desde el punto de fusión de la muestra (Tm) hasta 25 ºC; c. congelar el gel/solución de polímero biocompatible de manera controlada a través de la superficie térmicamente conductora mediante: (i) la caída rápida de la temperatura del dispositivo de enfriamiento entre aproximadamente -10 ºC y aproximadamente -50 ºC, en no más de 5 minutos, a fin de formar una capa fina de gel/solución de polímero biocompatible congelada sobre la superficie térmicamente conductora; (ii) la elevación rápida de la temperatura del dispositivo de enfriamiento, en no más de 5 minutos, a una temperatura más próxima pero todavía inferior a Tm; (iii) la reducción gradual de la temperatura del dispositivo de enfriamiento para inducir una velocidad de crecimiento unidireccional constante de cristales de hielo en el gel/solución de polímero biocompatible, iniciada a partir de la capa congelada formada en la etapa c (i); y d. liofilizar el producto de la etapa c (iii).

Description

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DESCRIPCION

Andamios de tejidos porosos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para producir materiales porosos, especialmente andamios de tejidos porosos con una geometria de poro distinta, a partir de soluciones de polimeros biocompatibles y de articulos biocompatibles producidos a partir de estos andamios.

Antecedentes de la invencion

Los biomateriales estan disenados para reemplazar tejidos lesionados o enfermos. Idealmente, son andamios para la regeneracion de tejidos con propiedades similares a las del tejido sano que reemplazan. Disenados para cubrir una superficie bidimensional o para rellenar un vacio tridimensional, los mismos deben ser absorbidos gradualmente, paralelamente a la cicatrizacion, de manera que, en ultima instancia, el sitio de la lesion se vuelva casi indistinguible del tejido circundante. Para alcanzar estos objetivos, el biomaterial debe cumplir varios requisitos de diseno: debe poseer una porosidad suficientemente grande, su quimica y topografia superficial deben ser adecuadas para la adhesion, proliferacion y diferenciacion celular; necesita poseer una arquitectura apropiada para guiar la regeneracion de tejidos; y debe permitir la absorcion controlada cuando el andamio ya no es necesario. Ademas, el andamio debe, a pesar de una alta porosidad global que debilita considerablemente sus propiedades mecanicas, poseer suficiente rigidez, resistencia y dureza para realizar la funcion del tejido natural mientras la herida esta cicatrizando. Los andamios de tejidos actualmente disponibles comprenden diferentes polimeros biocompatibles no absorbibles tales como tereftalato de polietileno; polimeros fluorados, tales como politetrafluoroetileno (PTFE) y fibras de PTFE expandido; y poliuretanos. Algunos andamios de tejidos disponibles comprenden polimeros absorbibles tales como acido polilactico, acido hialuronico, colageno y gelatina. Sin embargo, sus intervalos de geometria de poro no son optimos.

Los procedimientos convencionales para preparar dichos andamios polimericos porosos tridimensionales incluyen: una tecnica de colada en disolvente y lixiviacion de particulas que comprende mezclar un polimero con particulas de sal de un solo cristal, secar la mezcla y sumergir despues el material secado para lixiviar las particulas de sal (AG Mikos et al., Polymer, 35, 1068 (1994)); una tecnica de formation de gases que comprende expandir un polimero con gas CO2 (L.D. Harris et al., J. Biomed. Mater. Res., 42, 396 (1998)); una tecnica de separation de fases inducida termicamente que incluye sumergir un disolvente que contiene polimero en un no disolvente para hacer el polimero poroso (C. Schugens, et al., J. Biomed. Mater. Res., 30, 449 (1996)); y un metodo de liofilizacion que comprende disolver un polimero en un disolvente para preparar una solution polimerica y luego liofilizar la solution polimerica con nitrogeno liquido (K. Whang, Polymer, 36, 837 (1995). Una forma especializada de separacion de fase inducida termicamente, tambien conocida como colada por congelation direccional, ha obtenido andamios de tejidos porosos mas definidos hasta el momento y se ha descrito ampliamente en la bibliografia (Wegst et al., Phil. Trans. R. Soc. A 2010, 368 pag. 2099 - 212 y Madaghiele et al. J. Biomed. Mater. Res. parte A 2008, 85A pag. 757-767).

Este metodo depende de la solidification controlada de un disolvente, tal como agua, en una dispersion lo que da como resultado la separacion de la fase direccional entre el disolvente y el material dispersado debido al crecimiento direccional de cristales solventes solidos. Despues de la elimination del disolvente (por ejemplo, liofilizacion) sigue habiendo un material poroso. Este metodo permite un cierto control de la geometria del material controlando la velocidad a la que el frente de congelacion viaja a traves del material dispersado. Los materiales de andamiaje de tejidos Remaix y OptiMaix que comprenden colageno natural y elastina derivados de animales se preparan utilizando un metodo de colada por congelacion, que se describe en la patente US 6.447.701.

Sin embargo, para muchas aplicaciones es preferible que el material sea altamente uniforme (por ejemplo, la densidad del material, el tamano del poro y la orientation de los poros o las propiedades mecanicas deben tener una variation limitada en todo el material). Los andamios de tejidos porosos polimericos biocompatibles actuales carecen de suficiente uniformidad. Ademas, los polimeros biocompatibles hechos a medida preferidos con propiedades mejoradas para la fijacion y el crecimiento celular se disenan para ser completa y molecularmente solubles en un disolvente acuoso o una mezcla de disolventes. Ademas, es usualmente deseable que estos polimeros biocompatibles esten altamente purificados y libres de impurezas solubles e insolubles (en particulas). El uso de dicho polimero biocompatible disuelto molecularmente mejora la homogeneidad del soporte poroso resultante. El objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento mediante el que se pueden preparar andamios de tejidos de polimero biocompatibles altamente uniformes, que comprenden polimeros biocompatibles y articulos preparados con estos andamios de tejidos.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para producir un material poroso a partir de una solucion liquida que comprende un polimero biocompatible, comprendiendo el metodo:

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a. introducir la solucion de pollmero biocompatible en un recipiente termicamente aislado con una superficie termicamente conductora;

b. permitir, opcionalmente, que al menos parte de la solucion de pollmero biocompatible se gelifique, enfriando el recipiente en un dispositivo de enfriamiento a una temperatura en el intervalo desde el punto de fusion de la muestra (Tm) hasta 25 °C;

c. congelar el gel/solucion de pollmero biocompatible de manera controlada a traves de la superficie termicamente conductora mediante:

(i) la calda rapida de la temperatura del dispositivo de enfriamiento entre aproximadamente -1 °C y aproximadamente -50 °C, en no mas de 5 minutos, a fin de formar una capa fina de gel/solucion de pollmero biocompatible congelada sobre la superficie termicamente conductora;

(ii) la elevacion rapida de la temperatura del dispositivo de enfriamiento, en no mas de 5 minutos, a una temperatura mas proxima pero todavla inferior a Tm;

(iii) la reduccion gradual de la temperatura del dispositivo de enfriamiento para inducir una velocidad de crecimiento unidireccional constante de cristales de hielo en el gel/solucion de pollmero biocompatible, iniciada a partir de la capa congelada formada en la etapa c (i); y

d. liofilizar el producto de la etapa c (iii).

Preferentemente, el material poroso producido por el metodo de la presente invencion es un andamio de tejido poroso.

Tm, el punto de fusion de la muestra acuosa, es normalmente cercano a 0 °C, pero tras la adicion de algunos disolventes o sales organicas puede desviarse significativamente de 0 °C. Si se anaden a la muestra solventes y/o sales organicas, lo que da como resultado una disminucion de Tm, el punto de fusion de la muestra puede estar en el intervalo entre 0 y -10 °C, pero la mayor parte del tiempo Tm esta en el intervalo entre 0 y -5 °C.

El material de tejido poroso producido por este metodo tiene una estructura porosa uniforme en la que el diametro circular equivalente medio (ECD) esta en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 micrometres, dependiendo del tipo de celula y del tipo de tejido y de la ubicacion dianas, con una pequena desviacion estandar del ECD (ECDsd). Los valores convencionales obtenidos por la presente invencion para la ECDsd estan en el intervalo del 60 al 20 % del valor de ECD. Los valores de ECDsd preferidos son el 40 % o menos. Tambien se prefiere que el material poroso preparado mediante este metodo tenga un ECD medio de la estructura porosa columnar en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 micrometres y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 100 a 500 micrometres

El material de tejido poroso producido por el metodo de la invencion tiene una uniformidad mejorada con respecto a su densidad de material, tamano de poro y orientacion de poro en comparacion con los materiales descritos en la tecnica anterior. Esto lo hace particularmente adecuado para su uso en andamios de tejidos porosos y artlculos biocompatibles.

Definiciones generales

La expresion "que comprende" debe interpretarse como especificando la presencia de las partes, etapas o componentes indicados, pero no excluye la presencia de una o mas partes, etapas o componentes adicionales.

La referencia a un elemento por el artlculo indefinido "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que haya mas de uno de los elementos, a menos que el contexto exija claramente que exista uno y solo uno de los elementos. El artlculo indefinido "un" o "uno" significa por lo general "al menos uno".

Las expresiones 'andamio de tejido poroso' y 'andamio poroso' se utilizan indistintamente y se deben interpretar utilizandose aqul como una matriz molecular tridimensional de pollmeros biocompatibles que actua como un microambiente al que las celulas de tejido son atraldas y pueden unirse.

Los pollmeros biocompatibles tal como se utilizan aqul significan cualquier pollmero biodegradable o no degradable artificial o natural tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a; colageno, gelatina, quitosano, carragenano, alginato, acido hialuronico, dextrano, poli(acido lactico), poli(acido glicolico) (PGA), poli(acido lactico co-glicolico) (PLGA), poli(epsiloncarprolactona), poli(anhldridos), poliortoesteres, alcohol poli(vinllico), poli(etilenglicol), poliuretano, acido poli(acrllico), poli(N-isopropil acrilamida), copollmero(Pluronic (TM)) de oxido de poli(etileno)- oxido de poli(propileno)- oxido de poli(etileno), un copollmero de los mismos, o una mezcla de los mismos.

Las expresiones "uniforme" y "uniformidad" tal como se utilizan en la presente memoria deben interpretarse como una variacion limitada de parametros tales como, pero sin limitarse a, el tamano de poro, el diametro circular (ellptico), la forma de poro, el intervalo de angulos observados entre los poros dirigidos individuales, la rectitud de los poros y las propiedades mecanicas tales como, pero sin limitarse a, la rigidez, fragilidad, compresibilidad.

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La expresion "poro columnar" tal como se utiliza en la presente memoria debe interpretarse como una geometrla de poro del lumen de poro que se aproxima a un cilindro o cilindro ellptico en el que un cilindro se define como un cuerpo cuya superficie esta formada por los puntos a una distancia fija desde un segmento lineal dado, el eje del cilindro. El solido encerrado por esta superficie y por dos planos perpendiculares al eje se denomina tambien cilindro. Un cilindro ellptico es un cilindro cuya directriz es una elipse. Una seccion transversal perpendicular a la direccion del poro columnar longitudinal tal como se utiliza en la presente memoria puede tener una forma irregular con una redondez de 0,5 o mas. En una realization, el error de redondez es de 40 o menos.

La expresion redondez, (R), proporciona una medida de la circularidad de un poro. Un clrculo perfecto tiene una redondez de 1. R se calcula a partir del area del poro (A), y el diametro maximo (dmax) de acuerdo con la formula:

imagen1

La expresion Diametro de Clrculo Equivalente (ECD) se define como el area de un poro de forma irregular, A, que puede expresarse en terminos de un ECD. La correspondencia entre el ECD y el diametro real de un poro mejora obviamente con la creciente redondez de los poros. El ECD se proporciona por la formula:

(Mil

ECD = - 71

El ECD medio se determino contando los plxeles de poro para cada poro individual en un area de superficie fija dada y derivando cada ECD de poro individual mediante una simple transformation matematica. Luego se determina el ECD medio y la ECDsd. Estos parametros se determinan en una imagen en seccion transversal tomada perpendicularmente a la direccion del poro longitudinal.

Para mas detalles sobre estos y otros parametros que describen la conformation, forma y distribution de los poros en materiales de andamiaje biocompatibles, vease la Gula de la Norma ASTM para Interpretar Imagenes de Andamios de tejidos polimericos, Designation: F2603-06. Tambien se puede encontrar una definition de "ECD" en esta norma.

La expresion "diametro de poro cillndrico" tal como se utiliza en la presente memoria debe interpretarse como el ECD de poro medio, determinado contando los plxeles de poro para cada poro individual en un area de superficie fija dada y derivando cada ECD de poro individual mediante una simple transformacion matematica. Luego se determina el ECD medio y la ECDsd. Estos parametros se determinan en una imagen de seccion transversal tomada perpendicularmente a la direccion del poro longitudinal.

La expresion "sistema de cultivo in vitro" tal como se utiliza aqul se debe interpretar como cualquier kit, aparato o compuestos utilizados para el crecimiento de celulas, tejidos, organos o partes de organos ex vivo.

La expresion "artlculo biocompatible" tal como se utiliza en la presente memoria debe interpretarse como cualquier material utilizado para el tratamiento de una afeccion medica o para una correction cosmetica donde el material se coloca sobre o en el cuerpo de un ser humano o animal y que no evoca una respuesta inmunologica adversa. Esto incluye materiales que pueden degradarse y ser absorbidos por el cuerpo con el tiempo. Este material puede estar en cualquier forma tal como, pero sin limitarse a: vendas, polvos, esponjas, hemostatos y suturas, implantes de cualquier tipo, partlculas inyectables, microesferas, microvehlculos, geles o unguentos.

Las celulas pluripotentes y expresiones equivalentes se refieren a celulas que son capaces tanto de proliferar como de auto-renovarse en cultivo celular y de diferenciarse de varias poblaciones de celulas que incluyen aquellas que exhiben propiedades multipotentes, por ejemplo, las celulas ES pluripotentes pueden dar lugar a cada uno de los tres linajes de celulas embrionarias. Sin embargo, las celulas pluripotentes no pueden dar lugar a tejidos extraembrionarios como el amnio, el corion y otros componentes de la placenta, y pueden no ser capaces de producir un organismo entero, es decir, las celulas pluripotentes no son "totipotentes". La pluripotencia puede demostrarse proporcionando evidencia de un potencial de desarrollo estable, formar derivados de las tres capas germinales embrionarias de la progenie de una sola celula y generar un teratoma despues de la inyeccion en un raton inmuno-suprimido. Otras indicaciones de pluripotencia incluyen la expresion de genes que se sabe que se expresan en celulas pluripotentes y, morfologla caracterlstica. Las celulas pluripotentes de la presente invention se pueden derivar utilizando cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Las celulas pluripotentes incluyen, pero no se limitan a celulas madre, celulas pluripotentes inducidas (celulas iPS) tales como celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC), por ejemplo, celulas madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) o celulas madre embrionarias humanas (hESC), celulas partenogenicas y similares.

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"Totipotente", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la capacidad de una celula para desarrollarse en todos los tipos de celulas, incluyendo tejidos extraembrionarios (por ejemplo, placenta) y dar lugar a un organismo completo (por ejemplo, un raton o un ser humano).

"Auto-renovacion" se refiere a la capacidad de una celula madre para dividir y formar mas celulas madre con propiedades identicas a la celula madre padre, lo que permite que la poblacion de celulas madre se reponga indefinidamente.

La expresion "partlcula" tal como se utiliza en la presente memoria debe interpretarse como cualquier partlcula de materia solida de cualquier forma irregular o discreta con un "tamano de dimension menor" de al menos 20 a 50 nm que incluye microesferas, cualquier tipo de granulos, fibras o filamentos.

La expresion "libre de partlculas" tal como se utiliza en la presente memoria significa que la solucion esta esencialmente libre de partlculas de un tamano superior a 50 nm y preferentemente esta libre de partlculas de un tamano superior a 20 nm. El tamano de cualquier partlcula puede determinarse mediante tecnicas de inspeccion microscopica electronica o dispersion de luz laser, dinamica (PCS) o estatica (SLS). La presencia de partlculas puede detectarse por medio de diversos metodos independientes, tales como mapeo elemental (EDAX) de secciones transversales de muestra para observar densidades localmente mejoradas de elementos especlficos, o inspeccion microscopica (microscopla optica o electronica) de secciones transversales de muestra para detectar partlculas incrustadas, o utilizar encimas especlficas (por ejemplo, tripsina para colagenos o gelatinas) para hidrolizar la red polimerica de la muestra hasta su terminacion y utilizar tecnicas de dispersion de luz para detectar partlculas.

Las expresiones "colada por congelacion" y "separacion de fases inducida termicamente" se utilizan indistintamente y se refieren a metodos que crean estructuras porosas mediante la solidificacion de un disolvente dentro de una solucion, solucion de gel o dispersion mediante la reduccion de la temperatura de la solucion, dispersion o solucion de gel de tal manera que el disolvente se separa de los materiales disueltos y dispersos. Al eliminar el disolvente solidificado por un segundo proceso una estructura porosa del material disuelto permanece. Mediante el control de como se disipa el cambio de temperatura a lo largo de la dispersion, solucion o solucion de gel se puede ajustar la geometrla de los poros. Cuando el gradiente de temperatura se aplica en una direccion (tambien denominada direccion de desplazamiento frontal de congelacion) se conoce como 'colada por congelacion unidireccional'.

La expresion "perpendicular" tal como se utiliza en la presente memoria debe interpretarse como una llnea o plano que forma un angulo de aproximadamente 80 a 110 grados con otra llnea o plano.

Los terminos "protelna" o "polipeptido" o "peptido" se utilizan indistintamente y se refieren a moleculas que consisten en una cadena de aminoacidos, sin referencia a un modo especlfico de accion, tamano, estructura tridimensional u origen.

"Gelatina" y "similar a gelatina" como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier gelatina, ya sea extralda por metodos tradicionales o de origen recombinante o biosintetico, o a cualquier molecula que tenga al menos una caracterlstica estructural y/o funcional de la gelatina. La expresion abarca tanto la composicion de mas de un polipeptido incluido en un producto de gelatina, como tambien un polipeptido individual que contribuye al material de gelatina. Por lo tanto, La expresion gelatina, tal como se utiliza en referencia a la presente invencion, abarca tanto un material de gelatina que comprende polipeptidos de gelatina, como tambien un polipeptido de gelatina individual. Los polipeptidos a partir de los que se pueden derivar gelatinas son polipeptidos tales como colagenos, procolagenos y otros polipeptidos que tienen al menos una caracterlstica estructural y/o funcional del colageno. Un polipeptido de este tipo podrla incluir una unica cadena de colageno, o un homotrlmero de colageno o heterotrlmero, o cualquier fragmento, derivado, oligomero, pollmero o subunidad del mismo, que contenga al menos un dominio colageno (region Gly-Xaa-Yaa, donde Xaa y Yaa son Independientemente cualquier aminoacido). La expresion contempla especlficamente secuencias manipuladas que no se encuentran en la naturaleza, tales como secuencias de colageno alteradas, por ejemplo, una secuencia que se altera, a traves de supresiones, adiciones, sustituciones u otros cambios, a partir de una secuencia de colageno natural. Tales secuencias pueden obtenerse a partir, por ejemplo, de construcciones polinucleotldicas de colageno alteradas adecuadas como se describe en los documentos EP0926543, EP1014176, WO01/34646, WO04/085473, EP1894945, WO08/103041, WO08/103044, WO08/103043 y tambien especlficamente en los ejemplos de los documentos EP0926543 Y EP1014176.

Un "agente de reticulacion" como se describe en la presente memoria se refiere a una composicion que comprende un de reticulacion. El "agente de reticulacion", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un compuesto qulmico reactivo que es capaz de introducir enlaces qulmicos covalentes intra e intermoleculares en moleculas organicas.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra el perfil de temperatura/tiempo para producir un material poroso a partir de un pollmero

biocompatible de acuerdo con la invencion.

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La Figura 2 muestra la temperatura/tiempo para producir un material poroso a partir de un pollmero biocompatible de acuerdo con la invencion cuando se requieren poros columnares mas pequenos.

La Figura 3 muestra imagenes de microscopio electronico de barrido (SEM) del intervalo de tamanos de poros columnares que pueden prepararse uniformemente con soluciones de gelatina recombinante libres de partlculas, utilizando el metodo de acuerdo con la invencion. La fila superior son imagenes de secciones transversales cortadas lateral/verticalmente en la parte central de la muestra y la fila inferior es cortada transversal/horizontalmente 2 ~ 3 mm de arriba hacia abajo.

La Figura 4 muestra una micrografla optica de una seccion transversal lateral de todo el Ejemplo Comparativo. La altura de la muestra es de 12 mm y el diametro circular de la muestra es de 4,5 cm.

La Figura 5 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) del Ejemplo Comparativo 3 cortada en la region superior de la muestra

La Figura 6 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del ejemplo comparativo 3 cortada en la region inferior de la muestra.

La Figura 7 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Comparativo 3 cortada en la region superior de la muestra.

La Figura 8 muestra una micrografla optica de una seccion transversal lateral del Ejemplo Inventivo 1. La altura de la muestra es de 12 mm y el diametro circular de la muestra es de 4,5 mm.

La Figura 9 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) de toda la altura de muestra de una muestra preparada de acuerdo con el Ejemplo Inventivo 1 mostrando una capa de nucleacion densa y fina en la parte inferior y poros uniformemente paralelos de esta capa a la parte superior de la muestra.

La Figura 10 muestra una seccion transversal (horizontal) de la SEM del Ejemplo Inventivo 1 cortada en la region inferior, justo por encima de la capa de nucleacion.

La Figura 11 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Inventivo 1 cortada en la region superior de la muestra.

La Figura 12 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) del Ejemplo Comparativo 4 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 13 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) de Ejemplo Comparativo 4 cortada en una region cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 14 muestra una micrografla optica de una seccion transversal lateral del Ejemplo Comparativo 5 completa. La altura de la muestra es de 12 mm y el diametro circular de la muestra es de 4,5 mm.

La Figura 15 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) del Ejemplo Comparativo 5 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 16 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Comparativo 5 cortada cerca de la region inferior de la muestra justo por encima de la capa de nucleacion La Figura 17 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Comparativo 5 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 18 muestra una micrografla optica de una seccion transversal lateral de todo el Ejemplo Comparativo 6. La altura de la muestra es de 12 mm y el diametro circular de la muestra es de 4,5 mm.

La Figura 19 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) del Ejemplo Comparativo 6 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 20 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Comparativo 6 cortada cerca de la region inferior de la muestra justo por encima de la capa de nucleacion.

La Figura 21 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Comparativo 6 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 22 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) del Ejemplo Inventivo 3.

La Figura 23 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Inventivo 3 cortada cerca de la region inferior de la muestra justo por encima de la capa de nucleacion.

La Figura 24 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Inventivo 3 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

La Figura 25 muestra una imagen SEM de una seccion transversal lateral (vertical) del Ejemplo Inventivo4.

La Figura 26 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Inventivo 4 cortada cerca de la region inferior de la muestra justo por encima de la capa de nucleacion.

La Figura 27 muestra una imagen SEM de una seccion transversal (horizontal) del Ejemplo Inventivo 4 cortada cerca de la parte superior de la muestra.

Descripcion detallada de la invencion

Sorprendentemente se ha encontrado que utilizar un nuevo procedimiento de tres etapas durante un procedimiento de colada por congelacion, es posible preparar andamios de tejidos porosos que son mas uniformes con respecto a tener un tamano de poro columnar consistente a traves del material de andamiaje poroso. Este proceso se realiza en un recipiente que es termicamente conductor en al menos uno de sus lados. El proceso proporciona esencialmente el uso de una temperatura de enfriamiento ultra baja para enfriar y congelar rapidamente una pequena parte de toda la muestra para crear una capa de muestra congelada fina sobre todo el area de un lado del recipiente. Esta fina capa congelada actua posteriormente como un sitio de hielo de molde para el crecimiento de cristales de hielo en columnas en las etapas subsiguientes del proceso. La presencia de esta capa fina y densamente congelada proporciona un control mas uniforme y mejor del subsiguiente crecimiento de cristales de hielo en columnas y, por lo

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tanto, un mejor control del tamano, forma y densidad del numero de cavidades de poros dejadas en el material polimerico biocompatible. El espesor de esta capa se puede minimizar optimizando las propiedades termicas y la geometrla del diseno del recipiente de congelacion y la velocidad de enfriamiento y calentamiento en las etapas c (i) y c (ii). Los valores de espesor habituales son de 0,1 a 1,5 mm, dependiendo tambien del tipo de pollmero biocompatible y de su concentracion.

El control de congelacion/temperatura puede conseguirse utilizando cualquier dispositivo de enfriamiento adecuado que sea conocido por un experto en la materia. Preferentemente, el dispositivo de enfriamiento es un bano de enfriamiento.

La invencion se describira a continuation con referencia a las Figuras 1 y 2.

Las Figuras 1 y 2 muestran la solution de pollmero biocompatible que se introduce en el recipiente termicamente aislado con una sola superficie termicamente conductora en un bano de enfriamiento (T0, fe). Opcionalmente se pueden anadir aditivos tales como etanol, metanol o acido acetico u otros compuestos no toxicos u otros compuestos facilmente removibles para alterar el tamano medio de poro de la muestra liofilizada final.

i. La solucion de pollmero biocompatible se enfrla y al menos una fraction de la misma forma un gel (1 por ciento en volumen o mas con el gel ocupando normalmente el volumen mas cercano a la superficie enfriada) (T1, L).

A continuacion, se baja rapidamente la temperatura.

ii. El bano de enfriamiento se enfrla en 5 minutos (t2-L) hasta una temperatura (T2) y se permite que el gel/solucion de pollmero biocompatible forme una capa fina de solucion de pollmero biocompatible congelada en el lado termicamente conductor del recipiente (T3, t3).

iii. La temperatura del bano de enfriamiento se eleva a continuacion rapidamente a la temperatura (T4) en 5 minutos (t4-t3), donde T4 esta mas proxima a Tm que T2, pero es todavla inferior.

iv. Un tiempo de calda de temperatura en rampa lento y gradual (t5-t4) de al menos 5 minutos de T4 a T5 donde T5 es menor que T4 para inducir un crecimiento en columnas de cristales de hielo en la solucion o gel de pollmero biocompatible, iniciado por la capa ya congelada de solucion de gel biocompatible que es perpendicular al lado termicamente conductor del recipiente.

Los parametros de temperatura T0, T1, T2, T3, T4 y T5 y los parametros de tiempo ti, t2, t3, t4 y t5, para obtener una

estructura de poros dirigida y un ECD medio, deben optimizarse para cada tipo y concentracion de pollmeros biocompatibles y para la presencia de cualquier aditivo. Ademas, la altura de la muestra requiere la optimization de los parametros T5 y t5 con respecto a T4 y t4. Las muestras mas grandes requeriran una duration mas larga de la rampa de temperatura lenta de T4 a T5 para completar el proceso de congelacion.

Los poros columnares formados en el material poroso utilizando el metodo de la presente invencion tienen uniformidad y simetrla superiores en comparacion con los materiales descritos anteriormente. Preferentemente, se elimina el material que corresponde a la capa congelada fina formada en la etapa c i, que no tiene poros columnares. Esta capa inferior densa mide normalmente 0,1 a 2 mm de espesor pero, si se desea, se puede reducir a menos de 1 mm optimizando el perfil de temperatura del bano de enfriamiento. Especlficamente los parametros t2- t-1, T2, t3-t2, T3, T4 y t4-t3.

En una realization preferida, la temperatura T2 esta en el intervalo de aproximadamente menos 10 °C a aproximadamente menos 50 °C. La calda de la temperatura del bano de enfriamiento de T1 a T2 se alcanza preferentemente en 3 minutos y se alcanza, mas preferentemente, en menos de 2 minutos. El perfil de temperatura para este cambio de temperatura puede tener cualquier conformation o forma. Esto incluye perfiles lineales y no lineales y puede optimizarse para conseguir un tamano de poro uniforme especlfico.

En una realizacion preferida adicional, la temperatura T4 es aproximadamente menos 4 °C, pero siempre por encima de la temperatura T3. El aumento de temperatura del bano de enfriamiento de T3 a T4 se alcanza preferentemente en 2 minutos y se alcanza mas preferentemente en menos de 1 minuto. El perfil de temperatura para este cambio de temperatura puede tener cualquier conformacion o forma. Esto incluye perfiles lineales y no lineales y puede optimizarse para conseguir un tamano de poro medio uniforme y especlfico.

El perfil de temperatura T4 a T5 puede tener cualquier conformacion o forma. Esto incluye perfiles lineales y no lineales y puede optimizarse para conseguir un tamano de poro uniforme especlfico.

Por lo general, la T4 inferior se ajusta y cuanto mayor es la pendiente de la calda de temperatura de T4 a T5, menor sera el tamano de poro.

El recipiente termicamente aislado puede tener cualquier conformacion o forma y puede fabricarse de cualquier material adecuado. La superficie termicamente conductora se puede fabricar de cualquier material termicamente conductor adecuado tal como, por ejemplo, metales como cobre y aluminio e incluye ceramicas y pollmeros termicamente conductores.

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Preferentemente, el recipiente termicamente aislado es de PTFE o un plastico similar a teflon, opcionalmente en combinacion con un material espumado tal como poliuretano o una espuma ceramica, y la superficie termicamente conductora es un metal, particularmente buenos conductores termicos como aluminio o cobre.

Preferentemente, el recipiente es cillndrico, cillndrico ellptico o rectangular redondeado, cuyos lados y opcionalmente el lado superior estan termicamente aislados.

En la etapa d se puede usar cualquier metodo de liofilizacion adecuado conocido en la tecnica.

Preferentemente, despues de la liofilizacion, se elimina el material que corresponde a la capa fina y densa formada en la etapa c (i), y que no tiene poros en forma de columna.

Preferentemente, el material poroso formado por el metodo de la presente invencion comprende un material poroso que comprende un pollmero biocompatible que esta sustancialmente libre de partlculas, con una estructura porosa columnar uniforme simetrica y un ECD de poro medio entre aproximadamente 10 y 1000 micrometros. Mas preferentemente, el ECD de poro medio esta entre aproximadamente 50 (preferentemente 100) a 500 micrometros.

Preferentemente, la solucion de pollmero biocompatible se desgasifica antes de su uso. Esto se puede realizar por cualquier tecnica conocida en la tecnica. Preferentemente, la solucion de pollmero biocompatible se desgasifica bajando la presion atmosferica por debajo de 50 mbar durante al menos 10 minutos.

Tambien se prefiere que la solucion de pollmero biocompatible este esencialmente libre de partlculas. Utilizando soluciones moleculares esencialmente libres de partlculas de pollmeros biocompatibles, es posible preparar andamios de tejidos porosos que no solo son mas uniformes con respecto a tener un tamano de poro columnar consistente a traves del material de andamiaje poroso, en comparacion con los materiales de andamio porosos anteriormente descritos, sino tambien mas uniformes con respecto a la densidad del material, debido a la falta de partlculas. En la tecnica anterior, se utilizan suspensiones o dispersiones de materiales para preparar andamios porosos (Kuberka et al., 2002 Int J Artif Organs 20(1):67-73, Wegst et al Phil. Trans. R. Soc. A 2010, 368 pag. 2099 - 21212; Meghri et al. 2010 JOM 62(7): 71-75 y la patente de Estados Unidos 6.447.701). El inventor ha encontrado que las partlculas en estos materiales conducen a variaciones no solo en la densidad del material sino tambien en la simetrla y tamano del poro de los poros columnares. Se cree que este segundo efecto es el resultado de que las partlculas actuan como sitios de nucleacion para la formacion de hielo durante el proceso de colada por congelacion. En la presente invencion, la falta de tales partlculas disminuye la temperatura de nucleacion de la muestra de gel/solucion. Esto se demuestra por el hecho de que la formacion de hielo en soluciones moleculares de pollmeros biocompatibles ocurre a una temperatura mas baja que para los sistemas que contienen partlculas. Las temperaturas de nucleacion normales en soluciones de pollmeros biocompatibles libres de partlculas estan comprendidas entre -8 y -30 °C, mientras que Schoof et al., 2001, J. Biomed Mater Res 58 (4): 352-357) muestra que las suspensiones de colageno se congelan justo por debajo de 0 °C. Debido a esta temperatura mas baja, el crecimiento subsiguiente de los cristales de hielo formados en soluciones moleculares de pollmeros biocompatibles es mas repentino y menos controlable que en los sistemas que contienen partlculas. Sin embargo, el inventor de la presente invencion ha encontrado sorprendentemente que este problema puede ser eludido utilizando el nuevo procedimiento de tres etapas de la invencion durante el procedimiento de colada por congelacion.

Tambien se prefiere que la solucion de pollmero biocompatible se esterilice por filtracion antes de su uso preferentemente a traves de un filtro de 0,45 micrometres y mas preferentemente a traves de un filtro de 0,2 micrometres.

Preferentemente despues de la liofilizacion (en la etapa d), el material poroso se reticula.

Preferentemente, el procedimiento de la presente invencion se utiliza para preparar material de andamiaje de tejido poroso y, en este caso, el material liofilizado de la etapa d se reticula preferentemente.

La reticulacion puede utilizar cualquier agente de reticulacion y tecnica conocida por un experto en la materia.

En una realization preferida, el material poroso se reticula por un proceso que comprende reticulacion qulmica. Los agentes de reticulacion qulmicos adecuados incluyen aldehldos o dialdehldos, tales como formaldehldo y glutaraldehldo, carbodiimidas, diisocianatos, dicetonas, tales como diacetilo y cloropentanodion, bis(2-cloroetilurea), 2-hidroxi-4,6-dicloro-1,3, 5-triazina, compuestos que contienen halogeno reactivo descritos en el documento US 3.288.775, compuestos de carbamoilpiridinio en los que el anillo de piridina porta un sulfato o un grupo sulfato de alquilo descritos en los documentos US 4.063.952 y US 5.529.892, divinilsulfonas y derivados similares de la S- triazina como 2-hidroxi-4,6-dicloro-s-triazina. Tambien incluye tecnicas de reticulacion foto-activadas.

Los agentes de reticulacion qulmicos preferidos son 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y diisocianato de hexametileno (HMDIC).

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En otra realizacion preferida, el material poroso se reticula por un proceso que comprende la reticulacion dehidrotermal.

Preferentemente en una realizacion preferida, el pollmero biocompatible es bien un pollmero biodegradable sintetico seleccionado del grupo que consiste en acido poliglicolico (PGA), acido poli lactico (PLA) y acido poli(DL-lactico-co- glicolico) (PLGA), o un pollmero natural biodegradable seleccionado del grupo que consiste en quitosano, colageno, gelatina, un copollmero del mismo, o una mezcla de los mismos. En una realizacion aun mas preferida, la solucion de pollmero biocompatible comprende una protelna de tipo gelatina recombinante.

El uso de protelnas de tipo gelatinas recombinantes tiene un beneficio medico en comparacion con las gelatinas producidas convencionalmente a partir de fuentes animales. Existen problemas de seguridad con gelatinas naturales, tales como la preocupacion por posibles respuestas inmunogenicas, por ejemplo, antigenicas y alergenicas. Tambien la incapacidad para caracterizar completamente, purificar o reproducir satisfactoriamente mezclas de gelatina naturalmente derivadas es una preocupacion constante en las comunidades farmaceuticas y medicas. Tambien hay preocupaciones de seguridad adicionales con respecto a la contamination bacteriana y las cargas de endotoxinas resultantes de los procesos de extraction y purification.

La tecnologla recombinante permite el diseno de protelnas tipo gelatina con caracterlsticas superiores tales como, por ejemplo, baja inmunogenicidad, union celular mejorada y biodegradabilidad controlada. Los documentos EP0926543, EP1014176, WO01/34646, WO2004/085473, EP1894945, WO2008/103041, WO2008/103044, WO2008/103043 y tambien especlficamente los ejemplos de los documentos EP 0926543 y EP 1014176, describen gelatinas recombinantes y sus metodos de production, utilizando levaduras metilotroficas, en particular en las protelnas de tipo gelatina recombinante particulares de Pichia Pastoris.

Se prefiere que la solucion de pollmero biocompatible utilizada en el metodo de la presente invention comprenda una protelna de tipo gelatina recombinante que comprende al menos un motivo RGD. Mas preferentemente, la solucion de pollmero biocompatible comprende una protelna de tipo gelatina recombinante que esta enriquecida adicionalmente con motivos RGD. Las gelatinas enriquecidas con RGD en el contexto de la presente invencion se describen en los documentos WO2004/085473 y WO2008/103041.

Preferentemente, en la protelna de tipo gelatina recombinante, el porcentaje de motivos RGD relacionados con el numero total de aminoacidos es de al menos el 0,4 % y si dicha protelna de tipo gelatina recombinante comprende 350 aminoacidos o mas, cada tramo de 350 aminoacidos contiene al menos un motivo RGD.

Mas preferentemente, en la protelna de tipo gelatina recombinante, el porcentaje de motivos RGD relacionados con el numero total de aminoacidos es de al menos el 0,6 %, especialmente al menos el 0,8 %, mas especialmente al menos 1 el ,0 %, particularmente al menos el 1,2 % y mas particularmente al menos el 1, 5 %.

En una realizacion preferida adicional, la protelna de tipo gelatina recombinante tiene un nivel reducido de residuos de hidroxiprolina. La hidroxilacion de prolina es un requisito para la formation de helices triples en colageno que es una caracterlstica desfavorable para el material de andamiaje poroso formado por la presente invencion, ya que conduce a agregados de partlculas y fibras o filamentos de material protelnico. Preferentemente, en la protelna de tipo gelatina recombinante, menos del 10 %, mas preferentemente menos del 5 % de los residuos de aminoacidos de las protelnas de tipo gelatinas recombinantes son hidroxiprolinas. Se prefiere especialmente que la protelna de tipo gelatina recombinante estan libre de hidroxiprolinas. Un beneficio adicional descrito en el documento WO 2002/070000 de protelnas de tipo gelatinas recombinantes que estan libres de hidroxiprolinas es que no muestran reacciones inmunitarias que implican IgE, en contraste con la gelatina natural.

En una realizacion preferida adicional, las protelnas de tipo gelatina se funcionalizan para una union celular mejorada y/o con una inmunogenicidad minima tal como, por ejemplo, aquellas proteinas de tipo gelatina descritas en los documentos EP 1608681 y EP 1368056. Se pueden disenar proteinas de tipo gelatinas recombinantes funcionalizadas para que tengan propiedades mejoradas de union a celulas que estimulen la infiltration celular de tejidos que rodean al dispositivo medico despues de la implantation.

En otra realizacion adicional, las proteinas de tipo gelatinas recombinantes utilizadas en la presente invencion son proteinas de tipo gelatinas recombinantes con un punto isoelectrico calculado por encima de 5, preferentemente un punto isoelectrico calculado por encima de 6 y lo mas preferentemente un punto isoelectrico calculado por encima de 7.

En una realizacion adicional, las proteinas de tipo gelatina recombinantes utilizadas en la presente invencion tienen un peso molecular de al menos 20 kDa, mas preferentemente de 25 kDa, especialmente de al menos 35 kDa y mas especialmente de al menos 50 kDa.

Se prefiere que las proteinas de tipo gelatinas recombinantes utilizadas en la presente invencion tengan un peso molecular en el intervalo de 20 kDa a 75 kDa.

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Durante la preparation del material poroso que comprende una protelna de tipo gelatina, se puede utilizar mas de una forma de gelatina.

Cuando el metodo de la presente invention se utiliza para preparar un material de andamiaje de tejido poroso, es preferible que la gelatina utilizada sea biodegradable y, por lo tanto, no requiera procedimientos quirurgicos invasivos para su elimination despues de la estimulacion/regeneracion de tejidos. Ademas, la biodegradabilidad es otro importante factor estimulante en la regeneration del tejido. A priori no es obvio si las gelatinas recombinantes se descompondran o no por los mismos mecanismos que causan la degradation de las gelatinas naturales. Se sabe que las gelatinas y colagenos naturales se degradan en el cuerpo humano por proteasas y, mas especlficamente, por metaloproteinasas de matriz (MMP). Las metaloproteinasas de matriz (MMP) son endopeptidasas dependientes de zinc. Las MMP pertenecen a una familia mas grande de proteasas conocida como la superfamilia metzincin. Colectivamente son capaces de degradar todo tipo de protelnas de matriz extracelular, pero tambien pueden procesar una serie de moleculas bioactivas. Un grupo importante de MMP son las colagenasas. Estas MMP son capaces de degradar los colagenos fibrillares de triple helice en fragmentos distintivos de 3/4 y 1/4. Estos colagenos son los componentes principales del hueso y del cartllago, y las MMP son las unicas enzimas conocidas de mamlferos capaces de degradarlas. Tradicionalmente, las colagenasas son: MMP-1 (colagenasa intersticial), MMP-8 (colagenasa de neutrofilos), MMP-13 (colagenasa 3) y MMP-18 (colagenasa 4). Otro grupo importante de MMP esta formado por las gelatinasas. Los principales sustratos de estas MMP son colageno tipo IV y gelatina, y estas enzimas se distinguen por la presencia de un dominio adicional insertado en el dominio catalltico. Esta region de union a la gelatina se coloca inmediatamente antes del motivo de union al zinc y forma una unidad de plegado separada que no altera la estructura del dominio catalltico. Los dos miembros de este subgrupo son: MMP-2 (gelatinasa de 72 kDa, gelatinasa-A) y MMP-9 (gelatinasa de 92 kDa, gelatinasa-B). Sin embargo, la solicitud de patente internacional WO2008/103045 divulga que una gelatina recombinante que no comprende un sitio de escision conocido para MMP era degradable enzimaticamente por la metaloproteinasa de matriz humana 1 (MMP1). Aparentemente, muchos tipos mas de gelatina recombinante diferentes de los predichos pueden degradarse. Por lo tanto, un andamio de tejido poroso que comprende gelatina recombinante exhibira la biodegradation gradual requerida para una composition propocionando una funcion de soporte celular en primera instancia que se reemplaza gradualmente por matriz autologa extracelular a medida que se degrada.

Un aspecto preferido de la invencion proporciona un metodo para preparar un material de andamiaje de tejido poroso que comprende un metodo que comprende las siguientes etapas:

a. disolver el pollmero biocompatible en un disolvente o mezcla de disolventes;

b. desgasificar la solution de pollmero biocompatible;

c. introducir la solucion de pollmero biocompatible en un recipiente termicamente aislado con una sola superficie termicamente conductora, opcionalmente anadiendo aditivos;

d. opcionalmente, permitir que al menos parte de la solucion de pollmero biocompatible se gelifique enfriando el recipiente a una temperatura en el intervalo desde la Tm de muestra hasta 25 °C;

e. congelar unidireccionalmente la muestra, con control de la velocidad de congelation, exponiendo el recipiente a un dispositivo de enfriamiento que utiliza un perfil de temperatura que comprende al menos tres etapas:

(i) dejar caer rapidamente la temperatura del dispositivo de enfriamiento entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -50 °C, en no mas de 5 minutos, para formar una capa fina de gel/solucion de pollmero biocompatible congelado sobre la superficie termicamente conductora;

(ii) elevar rapidamente la temperatura del dispositivo de enfriamiento, en no mas de 5 minutos, a una temperatura mas proxima pero todavla por debajo de la Tm de muestra;

(iii) reducir gradualmente la temperatura del dispositivo de enfriamiento para inducir un crecimiento laminar de cristales de hielo en el gel/solucion de pollmero biocompatible, iniciado a partir de la capa congelada formada en la etapa e (i);

f. liofilizar el material obtenido en la etapa e a presion reducida;

g. liminar opcionalmente el material que corresponde a la capa fina y densa formada en la etapa e (i) que no tiene poros columnares; y

h. reticular el material obtenido en la etapa g.

Preferentemente, en la etapa a, la solucion esta sustancialmente libre de partlculas

Utilizando el metodo de acuerdo con la invencion se puede preparar material de andamiaje de tejido poroso con una amplia gama de poros columnares que tienen una desviacion estandar de ECD de poro estrecha EcDsd. Esto se consigue utilizando un perfil de temperatura de la etapa de enfriamiento de T4 a T3 que controla la velocidad del frente de congelacion a traves de la solucion de pollmero biocompatible. Por lo general, el diametro medio de los poros columnares disminuye con un aumento en la velocidad a la que se desplaza el frente de congelacion. Esta capacidad para ajustar el diametro medio de los poros columnares es ventajosa porque diferentes tipos celulares requieren un entorno diferente con respecto a la geometrla y propiedades mecanicas.

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En una realizacion, el metodo de la presente invencion prepara material de andamiaje de tejido poroso que tiene una estructura porosa columnar uniforme y un ECD de poros columnares medio en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 micrometros, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 micrometros y mas preferentemente en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 micrometros y especialmente en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 micrometros.

Un segundo aspecto de la invencion proporciona un material poroso que puede obtenerse por un metodo como se describe, y se prefiere, en el primer aspecto de la invencion.

Preferentemente, el material de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion es un andamio de tejido poroso.

Un tercer aspecto de la invencion proporciona un sistema de cultivo celular in vitro que comprende un andamio de tejido poroso de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.

Un cuarto aspecto de la invencion proporciona un artlculo biocompatible implantable que comprende un material de andamiaje de tejido poroso de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion.

Un quinto aspecto de la invencion proporciona un artlculo biocompatible implantable que comprende el material de andamiaje de tejido poroso de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion para su uso como material de relleno oseo o relleno oseo, preferentemente un relleno oseo dental.

Un sexto aspecto de la invencion proporciona un artlculo biocompatible implantable que comprende el material de andamiaje de tejido poroso de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion para su uso como microvehlculo para celulas, preferentemente celulas pluripotentes.

La invencion se explicara con mas detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos Metodo general:

1. Despues de la disolucion del pollmero biocompatible, se desgasifico la solucion de muestra a presion reducida (preferentemente inferior a 90 mbar durante al menos 5 minutos).

2. La muestra se filtro a continuacion a traves de un filtro de jeringuilla esterilizante (0,2 micrometros) y se deposito en un recipiente cillndrico de aluminio de pared fina revestido con Teflon termicamente conductor cuyos lados estan termicamente aislados con un casquillo de teflon y espuma de pollmero aislante entre el casquillo de teflon y los lados de aluminio.

3. La muestra se gelifico opcionalmente a una temperatura reducida T0 a T1, preferentemente a una temperatura entre la Tm de la muestra y +25 °C.

4. La solucion de muestra llquida o gelificada se congelo a continuacion direccionalmente al:

(a) reducir rapidamente la temperatura de la superficie termicamente conductora del recipiente de muestra a una temperatura por debajo cero inferior T2 (-10 a -50 °C) para formar una capa fina de muestra congelada, y

(b) cuando una capa fina de muestra congelada cubre toda la superficie termicamente conductora (T3, t3) aumentando la temperatura de la superficie termicamente conductora hasta la temperatura por debajo de cero T4 necesaria para la velocidad de congelacion de la muestra deseada.

(c) reducir gradualmente la temperatura experimentada por la superficie termicamente conductora, estando la velocidad de calda de temperatura dictada por la estructura de poro deseada y el tamano de poro (T4, t4 a T5, t5). El perfil de T de T4 a T5 no es necesariamente lineal, sino que puede optimizarse por un experto en la materia.

Las muestras congeladas se secan bajo vaclo como es comun en la tecnica para producir andamios secos y porosos. El andamio se reticula a continuacion en ausencia de agua por uno de los muchos agentes comunmente utilizados (HMDIC, EDC, glutaraldehldo, etc.) o un proceso (calentamiento bajo una condicion de vaclo).

Ejemplo Comparativo 1

La suspension de colageno basica utilizada en este ejemplo se preparo a partir de colageno de piel de becerro de tipo I comercialmente disponible, Sigma-Aldrich, n.° de produccion C3511. Se peso una cantidad en un matraz y se anadio agua para hacer una dispersion al 2 % (porcentaje en masa). A continuacion se anadio HCl para ajustar el valor de pH en 3,2. De acuerdo con (Schoof, Apel et al., 2001) se debe agregar acido acetico para crear estructuras de poros direccionales. Por tanto, se anadio 2,5 % en peso de acido acetico a la muestra. Esta preparacion de colageno es un colageno fibrilar insoluble de tipo I que se alsla de la piel bovina. De acuerdo con Schoof, esta suspension es un sistema polidisperso que contiene bajas concentraciones de moleculas, fibrillas y fibras. La longitud y el ancho de los agregados de colageno varlan en una amplia gama. Posteriormente, la dispersion se centrifugo para eliminar las burbujas y se deposito una cantidad de 204 gramos en un recipiente de congelacion. La

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muestra se dejo enfriar a 2 °C en un refrigerador durante 2 horas y despues se coloco en un bano de enfriamiento a -5 °C para permitir la congelacion completa.

Resultados

La estructura de esponja despues del secado mostro poros direccionales. Sin embargo, la homogeneidad de la estructura de los poros no era muy buena.

Ejemplo comparative 2

Para la muestra se utilizo gelatina CBE3 recombinante purificada (preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1 del documento EP 0926543 o Ejemplo 1 del documento EP 1014176 cuyo ejemplo se incorpora aqul como referencia). El etanol (abs) fue de J.T. Baker.

El agua utilizada fue ultrafiltrada y desionizada con las mismas especificaciones que el agua para inyeccion de calidad farmaceutica (WFI). La solucion se filtro pasando a traves de un filtro de jeringa Whatman PURADISC® 25 AS (PES) de 0,2 pm, utilizando una jeringa tipo Luer NORM-JECT® de 10 ml. El recipiente utilizado para la congelacion y secado de la muestra era un cuenco de poliestireno de 0,1 mm de espesor y de 10 cm x 10 cm x 2 cm (2 cm de altura). El secador por congelacion utilizado fue un Sublimador Zirbus 3x4x5. Un termometro K/J/T de doble entrada AZ 8852 con una sonda portatil Thermo-Electra n.° 80106 se utilizo para las mediciones de temperatura de la solucion. La inspeccion optica de la esponja se realizo con un microscopio Olympus SZX12 equipado con una camara digital Olympus C-3040ZOOM y software DP-Soft V3.2. La iluminacion de la muestra se realizo utilizando la fuente de luz interna o una fuente de luz externa FOSTEC ™ DCR (DDL). Se utilizo un microscopio de electrones de exploracion de campo Jeol JSM-6330F para generar imagenes SEM. El corte de muestra se realizo manualmente con cuchillas de afeitar de acero inoxidable GEM (sin revestimiento).

Preparacion de la muestra

Se peso una cantidad de gelatina CBE3 recombinante y se transfirio a un matraz de 300 ml y posteriormente se anadio agua caliente (50 - 60 °C) para obtener una concentracion del 4 % (porcentaje en masa). La solucion de CBE3 se agito a continuacion con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se dejaba enfriar a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaucion de que no se produjera una ebullicion excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. La solucion de muestra (20,4 g) se anadio al recipiente de congelacion utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que aparecieron en las muestras durante o despues del llenado. La solucion de CBE3 se dejo enfriar, a continuacion, a 2 °C durante 2 horas en un refrigerador y luego se puso en un bano de enfriamiento a -5 °C.

Resultados

La muestra permanecio en estado de gel y no se congelo al menos durante 24 horas. Despues de alterar ligeramente la muestra, la muestra comenzo inmediatamente a congelarse en el lugar alterado. Esto muestra que la congelacion direccional de abajo hacia arriba es imposible de acuerdo con este metodo.

Ejemplo Comparative 3

Se peso una cantidad de CBE3, se transfirio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (50 ~ 60 °C) para formar una solucion concentrada al 4 % (porcentaje en masa). La solucion se agito a continuacion con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se enfriaba a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaucion de que no se produjera una ebullicion excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. La solucion se anadio posteriormente en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelacion utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que apareclan en las muestras durante o despues del llenado. Para todas las muestras, la lamina de PE se utiliza como cubierta para excluir el polvo en el aire y evitar la evaporacion de agua o etanol de la parte superior de la muestra.

Las soluciones de muestra se gelificaron poniendolas en un refrigerador a 2 °C durante al menos 3 horas. La muestra (previamente gelificada) se sometio a continuacion a una condicion de congelacion de -10 °C en el bano de circulacion termostatico (2 a 3 mm de profundidad) durante 45 minutos hasta que se congelo completamente. La muestra congelada se seco despues al vaclo durante 2 dlas. Se realizo la reticulacion por tratamiento con DeHydroThermal (DHT) con las muestras cortadas al tamano deseado calentandolas en un horno de vaclo a 160 °C a una presion inferior a 2 mbar durante 2 dlas.

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Resultados

La estructura de poro resultante fue columnar (Vease Figuras 4 y 5). Sin embargo, existio una gran diferencia no deseada en el tamano de poro de la parte inferior (50 micrometros) a la parte superior (100 micrometros), vease tambien Figuras 6 y 7. La redondez fue mejor que 0,5. El ECD medio de poro en la parte superior fue de 155 micrometros con una ECDsd de 46 micrometros.

Ejemplo comparative 4

Se peso una cantidad de CBE3, se transfirio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (50 - 60 °C) para formar una solucion al 4 % (porcentaje en masa). La solucion se agito a continuacion con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se dejaba enfriar a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaucion de que no se produjera una ebullicion excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. La solucion se anadio posteriormente en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelacion utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometros. Se anadio una cantidad de 0,2 g de etanol (abs.) anadiendo lentamente el disolvente a traves de un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometros y la mezcla se agito creando un flujo de llquido utilizando una pipeta. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que apareclan en las muestras durante o despues del llenado. Para todas las muestras se utilizo lamina de PE como tapa para excluir el polvo en el aire y evitar la evaporacion del agua o etanol de la parte superior de la muestra. La solucion de muestra se gelifico en un refrigerador fijado a 2 °C durante al menos 3 horas. La muestra (previamente gelificada) se sometio a continuacion a una condicion de congelacion de -10 °C en el bano de circulacion termostatico (2 a 3 mm de profundidad) durante 45 minutos hasta que se congelo completamente. La muestra congelada se seco despues al vaclo durante 2 dlas. El reticulado por tratamiento con DeHydroThermal (DHT) se realizo con las muestras cortadas al tamano deseado calentandolas en un horno de vaclo a 160 °C a una presion inferior a 2 mbar durante 2 dlas.

Resultados

La estructura de poros resultante fue bastante homogenea sobre el volumen de la muestra con poros columnares de distribucion de tamano estrecha y un tamano medio grande de aproximadamente 350 micrometros (vease Figura 13). Sin embargo, habla una ligera pero todavla indeseada diferencia del tamano de poro de abajo hacia arriba debido al bano de enfriamiento de temperatura constante (vease Figura 12).

Ejemplo comparative 5

Se peso una cantidad de CBE3, se transfirio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (50 - 60 °C) para formar una solucion al 8 % (porcentaje en masa). La solucion se agito a continuacion con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se dejaba enfriar a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaucion de que no se produjo ebullicion excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. La solucion se anadio posteriormente en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelacion utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometros. Se anadio lentamente una cantidad de 0,2 g de etanol (abs.) a traves de un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometros y la mezcla se agito por "inyeccion" utilizando una pipeta. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que apareclan en las muestras durante o despues del llenado. Para todas las muestras se utilizo una lamina de PE como tapa para prohibir la sedimentacion del polvo en el aire y la evaporacion de agua o etanol de la parte superior de la muestra.

La solucion de muestra se gelifico en un refrigerador ajustado a 2 °C durante 45 minutos. La muestra (previamente gelificada) se sometio a continuacion a una condicion de congelacion de -10 °C en un bano de enfriamiento (2 a 3 mm de profundidad) durante 45 minutos hasta que se congelo completamente. La muestra congelada se seco despues al vaclo durante 2 dlas. Se realizo la reticulacion por tratamiento con DeHydroThermal (DHT) con las muestras cortadas al tamano deseado en una estufa de vaclo a 160 °C y una presion inferior a 2 mbar durante 2 dlas.

Resultado

La estructura de poro resultante era columnar sobre el volumen de la muestra con poros columnares de distribucion de tamano estrecha y un tamano medio grande de aproximadamente 350 micrometros en la mitad superior de la muestra. Tambien se observo un ensanchamiento de los poros columnares desde el volumen de muestra inferior al superior, vease Figuras 16 y 17. Se cree que esto se debio al uso de una temperatura de bano de enfriamiento constante en lugar de una subida de temperatura gradual. Por lo tanto, cuando el frente de congelacion se aleja del recipiente enfriado, se esperaba que la temperatura de congelacion local fuera siempre mas alta y debido a esto los poros estaban creciendo mas.

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Ejemplo Comparativo 6

Se peso una cantidad de CBE3, se transfirio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (50 - 60 °C) hasta obtener una solucion al 7,5 % (porcentaje en masa). La solucion se agito a continuacion con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se dejaba enfriar a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaucion de que no se produjo ebullicion excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. A continuacion se anadio la solucion en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelacion utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que apareclan en las muestras durante o despues del llenado. Para todas las muestras se utilizo una lamina de PE como una cubierta para excluir el polvo en el aire y evitar la evaporacion de agua o etanol de la parte superior de la muestra. La solucion de muestra se gelifico poniendo en un refrigerador a 2 °C durante 1 dla. La muestra se coloco despues en un bano de enfriamiento a 18 °C y la bomba A se puso en marcha, bombeando llquido (etanol) muy frlo (-72 ± 2 °C) al bano de enfriamiento con una mezcla vigorosa a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento descendio a una velocidad de 22 °C/min hasta que la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo -52 °C. Durante este descenso de T se observo la primera aparicion de formacion de hielo a una temperatura del bano de enfriamiento de -16 °C. En 10 minutos, el volumen de la muestra se habla congelado completamente. La muestra congelada se seco a continuacion al vaclo durante 4 dlas. Se realizo la reticulacion por tratamiento con DeHydroThermal (DHT) con las muestras cortadas al tamano deseado y despues se colocaron en un horno de vaclo a 160 °C y una presion inferior a 2 mbar durante 2 dlas.

Resultado

La estructura de poros resultante era columnar en todo el volumen de la muestra con poros columnares de distribucion estrecha (vease Figuras 18 y 19) y un tamano medio muy pequeno de aproximadamente 20 micrometres en la region inferior de la muestra (vease Figura 20). Sin embargo, todavla hay una diferencia no deseada del tamano de poro de arriba hacia abajo (compare Figuras 20 y 21).

Ejemplo inventivo 1

Se peso una cantidad de CBE3, se transfi rio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (50 - 60 °C) hasta obtener una solucion al 7,5 % (porcentaje en masa). La solucion se agito a continuacion con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se dejaba enfriar a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaucion de que no se produjera una ebullicion excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. La solucion se anadio posteriormente en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelacion utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres. Se anadio una cantidad de 0,2 g de etanol (abs.) anadiendo lentamente el disolvente a traves de un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres y la mezcla se agito por "inyeccion" utilizando una pipeta. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que apareclan en las muestras durante o despues del llenado. Para todas las muestras se utilizo una lamina de PE como tapa para excluir el polvo en el aire y evitar la evaporacion del agua o etanol de la parte superior de la muestra.

La solucion de muestra se gelifico en el bano de enfriamiento a 10 °C durante 20 minutos. El bano de enfriamiento se enfrio despues rapidamente bombeando llquido muy frlo (-72 ± 2 °C) (etanol) en el bano de enfriamiento con una mezcla vigorosa a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento descendio a una velocidad de 28 °C/min hasta que la temperatura alcanzo los -30 °C. Durante este descenso de T se observo la primera aparicion de formacion de hielo a una temperatura del bano de enfriamiento de -25 °C. Posteriormente se detuvo la bomba de llquido frlo A y la temperatura del bano de enfriamiento permanecio bastante constante dentro del tiempo que tomo para que todo el recipiente de muestra de contacto se cubriera con una capa de muestra congelada. Inmediatamente despues de una cobertura completa, la bomba de llquido (etanol) caliente (+40 °C) B se puso en marcha a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento se incremento a -4 °C a una velocidad de aproximadamente 100°C/minuto. Tan pronto como la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo los -4 °C, la bomba B se detuvo y la bomba A se puso en marcha a una velocidad muy lenta de tal manera que la temperatura del bano de enfriamiento se bajo a una velocidad de 0,1 °C/min hasta que el volumen completo de la muestra se congelo.

La muestra congelada se seco despues al vaclo durante 2 dlas. Se realizo la reticulacion DeHydroThermal (DHT) con las muestras cortadas al tamano deseado por calentamiento en un horno de vaclo a 160 °C a una presion inferior a 2 mbar durante 2 dlas.

Resultados

La estructura de poros resultante fue muy homogenea en el volumen de la muestra con poros columnares de distri bucion de tamano estrecha y un tamano medio grande de aproximadamente 350 micrometres. La estructura de

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poros en la region inferior de la muestra fue muy similar a la estructura en la region superior de la muestra (Figuras 10 y 1 1) en contraste con el Ejemplo Comparativo 6 (Figuras 20 y 21). La redondez de los poros fue superior a 0,5, como se prefiere. La capa inferior nucleada y densa (vease Figuras 8 y 9) se pudo cortar y descartar a voluntad. El ECD de poro medio para este ejemplo fue 300 micrometros con una ECDsd de 90 micrometros.

Ejemplo inventivo 2

Se peso una cantidad de gelatina de hueso-cal desionizada, se transfirio a un matraz de 300 ml y posteriormente se anadio agua caliente (50 - 60 °C) hasta obtener una solucion al 7,5 % (porcentaje en masa). La solucion se agito con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 30 minutos para disolver completamente la gelatina. Mientras la solucion se enfriaba a temperatura ambiente, se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. Se tomo la precaution de que no se produjera una ebullition excesiva controlando manualmente el vaclo cuando se observaba o se anticipaba tal efecto. La solucion se anadio posteriormente en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelation utilizando una jeringa y un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres. Se anadio lentamente una cantidad de 0,2 g de etanol (abs.) a traves de un filtro de jeringa PES de 0,2 micrometres y la mezcla se agito por "chorro" utilizando una pipeta. Se tomaron precauciones para eliminar todas las burbujas adheridas a la superficie que apareclan en las muestras durante o despues del llenado. Para todas las muestras se utilizo una lamina de Pe como tapa para evitar la contamination por polvo en el aire y la evaporation de agua o etanol de la parte superior de la muestra. La solucion de muestra se gelifico en el bano de enfriamiento a 10 °C durante 20 minutos. El bano de enfriamiento se enfrio despues rapidamente por bombeo de llquido (etanol) muy frlo (-72 ± 2 °C) dentro del bano de enfriamiento con una mezcla vigorosa a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento descendio a una velocidad de 28 °C/minuto hasta que la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo los -30 °C. Durante este descenso de T se observo la primera aparicion de formation de hielo a una temperatura del bano de enfriamiento de -25 °C. Posteriormente se detuvo la bomba de llquido frlo A y la temperatura del bano de enfriamiento permanecio bastante constante dentro del tiempo que tomo para que el recipiente de muestra de contacto total se cubriera con una capa de muestra congelada. Inmediatamente despues de una cobertura completa, la bomba de llquido (etanol) caliente (+ 40 °C) se puso en marcha a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento se incremento a -4 °C a una velocidad de aproximadamente 100°C/minuto. Tan pronto como la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo los -4 °C deseados, la bomba B se detuvo y la bomba A se puso en marcha a una velocidad muy lenta de tal manera que la temperatura del bano de enfriamiento disminuyo a una velocidad de 0,1 °C/minuto hasta que el volumen completo de la muestra fue congelado.

Resultados

La estructura de poros resultante fue similar al Ejemplo Inventivo 1. Fue muy homogenea en el volumen de la muestra con poros columnares de distribution de tamano estrecha y un tamano medio grande de aproximadamente 350 micrometres. La estructura de poros en la region inferior de la muestra fue muy similar a la estructura en la muestra superior. La redondez de los poros fue mejor que 0,5, como se prefiere. La capa inferior nucleada y densa se pudo cortar y descartar a voluntad.

Ejemplo Inventivo 3

Se peso una cantidad de kappa-carragenano, se transfi rio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (aproximadamente 70 °C) hasta obtener una solucion al 4,0 % (porcentaje en masa). La solucion se agito con un agitador magnetico a 70 °C en un termoelectrico durante 1 hora para disolver completamente el pollmero biocompatible. Mientras la solucion se mantenla caliente se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. A continuation se anadio la solucion en allcuotas de 20,4 gramos a los recipientes de congelacion utilizando una jeringa. Se tomo el cuidado de eliminar las burbujas de aire de la solucion una vez que se deposito en los recipientes de congelacion. Para todas las muestras se utilizo una lamina de PE como tapa para evitar la contaminacion por polvo en el aire y la evaporacion de agua o etanol de la parte superior de la muestra. La solucion de muestra se gelifico en un refrigerador a 2 °C durante 2 horas y la muestra se monto posteriormente en el bano de enfriamiento a una profundidad de unos pocos millmetros. El bano de enfriamiento se bajo a continuacion rapidamente en temperatura bombeando llquido (etanol) muy frlo (-73 °C) al bano de enfriamiento con mezcla vigorosa a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento disminuyo a una velocidad de entre 20 a 100 °C/minuto hasta que la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo -30 a -40 °C. Durante este descenso de T se observo la primera aparicion de formacion de hielo a una temperatura del bano de enfriamiento de -20 a -30 °C. Inmediatamente despues de que la parte inferior de la muestra contenla una fina capa de hielo, que cubre la parte inferior de todo el recipiente de congelacion, la bomba de llquido (etanol) caliente (+ 50 °C) B se puso en marcha a una velocidad elevada de modo que la temperatura del bano de enfriamiento aumento a una temperatura tasa de aproximadamente 100°C/minuto. Tan pronto como la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo los -4 °C deseados, la bomba B se detuvo y la bomba A se puso en marcha a una velocidad muy lenta de tal que la temperatura del bano de enfriamiento disminuyo a una velocidad de aproximadamente 0,5 °C/minuto hasta que todo el volumen de muestra se congelo.

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Resultados

La estructura de poros resultante fue similar a la del Ejemplo Inventivo n.° 1. Fue muy homogenea en el volumen de muestra con poros de distribucion de tamano estrecha y un tamano medio grande de 500 a 800 micrometros. La estructura de poros en la region inferior de la muestra fue muy similar a la estructura en la muestra superior. La redondez de los poros es mejor que 0,5, como se prefiere. El ECD de poro medio para este ejemplo es de 450 micrometros con una ECDsd de 200 micrometros. El espesor de la capa inferior nucleada denso fue inferior a medio millmetro y se pudo cortar y descartar a voluntad. Veanse las Figuras 22, 23 y 24.

Ejemplo Comparativo 7

Se peso una cantidad de quitosano de cascaras de camaron, se transfirio a un matraz de 300 ml y se anadio agua caliente (aproximadamente 50 °C) hasta obtener una solucion al 7,5 % (porcentaje en masa). La solucion se agito con un agitador magnetico a 50 °C en un vehlculo termico durante 1 hora para disolver completamente el pollmero biocompatible. Mientras la solucion se mantenla caliente se desgasifico durante 15 minutos bajo un vaclo de 20 a 90 mbar. A continuacion se anadio la solucion en allcuotas de 20,4 gramos al recipiente de congelacion utilizando una jeringa. Se tomo el cuidado de eliminar las burbujas de aire de la solucion una vez que se deposito en los recipientes de congelacion. Para todas las muestras se utilizo una lamina de PE como tapa para evitar la contaminacion por polvo en el aire y la evaporacion de agua o etanol de la parte superior de la muestra. La solucion de muestra se gelifico en un refrigerador a 2 °C durante 2 horas y la muestra se monto posteriormente en el bano de enfriamiento a una profundidad de unos pocos millmetros. El bano de enfriamiento se bajo a continuacion rapidamente en temperatura bombeando llquido (etanol) muy frlo (-73 °C) al bano de enfriamiento con mezcla vigorosa a una velocidad tal que la temperatura del bano de enfriamiento disminuyo a una velocidad entre 20 a 1 00 °C/minuto hasta que la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo -30 a -40 °C. Durante este descenso de T se observo la primera aparicion de formacion de hielo a una temperatura del bano de enfriamiento de -20 a -30 °C. Tan pronto como una fina capa de hielo cubrio toda la superficie de congelacion del recipiente, una bomba de llquido (etanol) caliente (+ 50 °C) B se puso en marcha a una velocidad elevada de modo que la temperatura del bano de enfriamiento se incremento a una velocidad de aproximadamente 100 °C/minuto. Cuando la temperatura del bano de enfriamiento alcanzo la temperatura deseada (-4 °C), la bomba B se detuvo y la bomba A se puso en marcha a una velocidad muy lenta de tal manera que la temperatura del bano de enfriamiento se bajo a una velocidad de aproximadamente 0,1 °C/minuto hasta que todo el volumen de muestra se congelo.

Resultados

La estructura de poro resultante fue muy homogenea en el volumen de la muestra con formas de poro estiradas y una distribucion de tamano estrecha. El tamano medio de los poros fue de aproximadamente 1 micrometre. La estructura de poros en la region inferior de la muestra fue muy similar a la estructura en la muestra superior. El ECD de poro medio para este ejemplo fue de 60 micrometres con una ECDsd de 27 micrometres. El espesor de la capa inferior nucleada y densa fue aproximadamente medio millmetro y se pudo cortar y descartar a voluntad. Veanse Figuras 25, 26 y 27.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir un material poroso a partir de una solucion llquida que comprende un pollmero biocompatible, comprendiendo el metodo:

   a. introducir la solucion de pollmero biocompatible en un recipiente termicamente aislado con una superficie termicamente conductora;

   b. opcionalmente, permitir que al menos parte de la solucion de pollmero biocompatible se gelifique, enfriando el recipiente en un dispositivo de enfriamiento a una temperatura en el intervalo desde el punto de fusion de la muestra (Tm) hasta 25 °C;

   c. congelar el gel/solucion de pollmero biocompatible de manera controlada a traves de la superficie termicamente conductora mediante:

   (i) la calda rapida de la temperatura del dispositivo de enfriamiento entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -50 °C, en no mas de 5 minutos, a fin de formar una capa fina de gel/solucion de pollmero biocompatible congelada sobre la superficie termicamente conductora;

   (ii) la elevacion rapida de la temperatura del dispositivo de enfriamiento, en no mas de 5 minutos, a una temperatura mas proxima pero todavla inferior a Tm;

   (iii) la reduccion gradual de la temperatura del dispositivo de enfriamiento para inducir una velocidad de crecimiento unidireccional constante de cristales de hielo en el gel/solucion de pollmero biocompatible, iniciada a partir de la capa congelada formada en la etapa c (i); y

   d. liofilizar el producto de la etapa c (iii).
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el material poroso es un andamio de tejido poroso.
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que despues de la liofilizacion se elimina el material que corresponde a la capa fina y densa formada en la etapa c (i), y que no tiene poros columnares.
4. 4. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que despues de la liofilizacion el material poroso se reticula.
5. 5. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion de pollmero biocompatible se desgasifica antes de su uso.
6. 6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion de pollmero biocompatible esta esencialmente libre de partlculas.
7. 7. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion de pollmero biocompatible se esteriliza por filtracion antes de su uso.
8. 8. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la solucion de pollmero biocompatible comprende una protelna de tipo gelatina recombinante.
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que la protelna de tipo gelatina recombinante comprende al menos un motivo RGD.
10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en el que en la protelna de tipo gelatina recombinante el porcentaje de motivos RGD relacionados con el numero total de aminoacidos es de al menos el 0,4 % y si dicha protelna de tipo gelatina recombinante comprende 350 aminoacidos o mas, cada tramo de 350 aminoacidos contiene al menos un motivo RGD.
11. 11. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en el que en la protelna de tipo gelatina recombinante el porcentaje de motivos RGD relacionados con el numero total de aminoacidos es de al menos el 0,6 %.
12. 12. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que proporciona un metodo para preparar un material de andamiaje de tejido poroso que comprende las siguientes etapas:

    a. disolver el pollmero biocompatible en un disolvente o una mezcla de disolventes;

    b. desgasificar la solucion de pollmero biocompatible;

    c. introducir la solucion de pollmero biocompatible en un recipiente termicamente aislado con una sola superficie termicamente conductora, opcionalmente anadiendo aditivos;

    d. opcionalmente, permitir que al menos parte de la solucion de pollmero biocompatible se gelifique enfriando el recipiente a una temperatura en el intervalo desde la Tm de la muestra hasta 25 °C;

    e. congelar unidireccionalmente la muestra, con control de la velocidad de congelacion, exponiendo el recipiente

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    a un dispositivo de enfriamiento que utiliza un perfil de temperatura que comprende al menos tres etapas:

    (i) dejar caer rapidamente la temperatura del dispositivo de enfriamiento entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -50 °C, en no mas de 5 minutos, para formar una capa fina de gel/solucion de pollmero biocompatible congelado sobre la superficie termicamente conductora;

    (ii) elevar rapidamente la temperatura del dispositivo de enfriamiento, en no mas de 5 minutos, a una temperatura mas proxima pero todavla por debajo de la Tm de la muestra;

    (iii) reducir gradualmente la temperatura del dispositivo de enfriamiento para inducir un crecimiento laminar de cristales de hielo en el gel/solucion de pollmero biocompatible, iniciado a partir de la capa congelada formada en la etapa e (i);

    f. liofilizar el material obtenido en la etapa (e) a presion reducida;

    g. eliminar opcionalmente el material que corresponde a la capa fina y densa formada en la etapa e (i) que no tiene poros columnares; y

    h. reticular el material obtenido en la etapa g.
13. 13. Un material poroso que puede obtenerse por un metodo como el descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el material poroso tiene un ECD (diametro circular equivalente) medio de poros columnares en el intervalo de 100 a 500 micrometros.
14. 14. Un material poroso de acuerdo con la reivindicacion 13, que es un andamio de tejido poroso.
15. 15. Un sistema de cultivo celular in vitro que comprende un andamio de tejido poroso de acuerdo con la reivindicacion 14.
16. 16. Un artlculo biocompatible implantable que comprende un andamio de tejido poroso de acuerdo con la reivindicacion 14.
17. 17. Un artlculo biocompatible implantable de acuerdo con la reivindicacion 16 para su uso como relleno de hueso dental.
18. 18. Un artlculo biocompatible implantable de acuerdo con la reivindicacion 16 para su uso como un microvehlculo para celulas pluripotentes.