CN105854078B - 一种功能性人造皮肤支架材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其以相对分子质量在1万以上的明胶为主要基材,以京尼平为交联剂,以去离子水、蒸馏水、生理盐水、注射用水或林格氏液为溶剂,在专用成型模具中,通过形成垂直方向的温度梯度冷冻成型,即得内部成蜂窝状多孔结构;且从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,上表面的孔径为5‑70μm,下表面的孔径为50‑200μm,每相邻两孔彼此贯通的、具有皮肤仿生结构的多孔材料。本发明制备工艺简单、易控,制造成本低,所制得的产品质量好、品质稳定,具有皮肤仿真结构、具有良好的吸水性、生物可降解性、生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用多孔材料的制备方法,尤其涉及一种功能性人造皮肤支架材料的制备方法。
背景技术
生物移植材料是生物医用材料的一种,通常是指由手术植入到人体内,用于组织器官的替换、修复、重建,并和人体组织、器官和血液保持长期接触的材料。生物医用植入材料按其在活性组织中的行为,可分为生物稳定的、生物可降解吸收的和生物可部分降解吸收的。其中生物可降解吸收的移植材料由于其既能为机体提供暂时的支架或屏障,又能在作用完成后,通过降解成为人体可吸收的物质而去除,避免体内因长期存在外来异物而产生的排异反应、非感染性炎症及其它一些不良影响,同时也避免了二次手术,故对于组织和器官的修复和重建有重要意义。
可降解吸收移植材料由于其使用环境的特殊性,临床上对其有着很严格的评价标准。除应满足基本的医疗功能外,可降解吸收移植材料还应具备优良的生物相容性、可降解性、降解产物的安全性和可吸收性等。明胶是胶原水解而成的水溶性蛋白质混合物,明胶保持了胶原的三螺旋结构,含有类似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列,具有优良的亲水性和生物相容性,能够促进细胞的粘附与生长,可吸收相当于重量5-10倍的水;同时,明胶去除了胶原的免疫原性,减少了可能存在的病原体感染。作为优良的天然生物材料,明胶已经广泛应用于组织工程领域。
京尼平来源于栀子苷,是一种天然的交联剂,毒性远远低于合成类交联剂,如戊二醛、甲醛、EDC/NHS以及二异氰酸盐等。作为水溶性的双功能交联剂,京尼平可以和明胶反应,制备得到力学性能优良的可降解吸收移植材料,在组织工程中应用广泛。另外,京尼平还可以通过交联反应,固定生长因子于支架内部,应用于组织再生修复。
组织工程皮肤支架能够为皮肤细胞的体外培养提供合适环境,以解决糖尿病足溃疡、烧伤等问题造成的皮肤缺损问题。临床常用或研究的皮肤组织工程支架多以均一孔径的支架为主,虽然材料制备简单,但是由于孔径单一,不适合全层皮肤的培养,使用于临床时容易造成瘢痕。有研究表明,具有皮肤仿生结构的梯度渐变组织工程支架更利于皮肤的再生,针对皮肤仿生结构的皮肤组织工程支架,研究报道多为采用双层或多层复合的方法或其他方法制备,该方法较为耗时如Harley及Oh等人研究使用旋转/离心技术结合冷冻干燥技术构建径向具有梯度孔结构的多孔支架,支架的孔径大小可以通过旋转速度来调节,但此技术一般只适用于制备血管用管状支架材料,对于构建其他支架材料不适用(Harley,B.A.,Hastings,A.Z.,Yannas,I.V.&Sannino,A.Fabricating tubular scaffolds with aradial pore size gradient by aspinning technique.Biomaterials 27,866-874,doi:10.1016/j.biomaterials.2005.07.012(2006);Oh,S.H.,Park,I.K.,Kim,J.M.&Lee,J.H.In vitro and in vivo characteristics of PCL scaffolds with pore sizegradient fabricated by a centrifugation method.Biomaterials28,1664-1671,doi:10.1016/j.biomaterials.2006.11.024(2007)),Wu、Zhang和Mao等人使用不同致孔剂结合冷冻干燥技术形成梯度孔或双层支架结构,通过调节致孔剂大小来控制孔径分布,但是致孔剂较难完全去除干净,残留致孔剂对材料后期使用不利(Wu,H.et al.Fabrication ofchitosan-g-polycaprolactone copolymer scaffolds with gradient porousmicrostructures.Materials Letters62,2733-2736,doi:10.1016/j.matlet.2008.01.029(2008);Zhang,Q.,Lu,H.,Kawazoe,N.&Chen,G.Preparation ofcollagen porous scaffolds with a gradient pore size structure using iceparticulates.Materials Letters107,280-283,doi:10.1016/j.matlet.2013.05.070(2013);Mao,J.S.,Zhao,L.G.,Yin,Y.J.&Yao,K.D.Structure and properties ofbilayer chitosan-gelatin scaffolds.Biomaterials 24,1067-1074,doi:Pii S0142-9612(02)00442-8),Mao等人将试样置于单向导热的环境中,制备了双层支架材料,由于预冻温度单一,形成的支架孔径不可调控,且未形成梯度孔结构,Tanya J.Levingstone等使用层层自组装的方法构建三层梯度仿生软骨支架,每层支架均通过冷冻干燥制备,制备一次软骨支架需要三次冷冻干燥过程,费时费力(Levingstone,T.J.,Matsiko,A.,Dickson,G.R.,O'Brien,F.J.&Gleeson,J.P.A biomimetic multi-layered collagen-basedscaffold for osteochondral repair.Acta Biomaterialia 10,1996-2004,doi:10.1016/j.actbio.2014.01.005(2014))。
完整皮肤具有表皮和真皮结构,而真、表皮细胞生长所需要的孔径大小不同。有研究表明,20μm更适合表皮细胞的生长,80μm更适合真皮成纤细胞的生长。并且,表皮细胞和真皮成纤细胞联合培养时细胞间的相互作用可更快促进伤口愈合,促进新皮的再生,并能避免瘢痕的形成。具有梯度孔结构的皮肤工程支架可同时容纳表皮细胞和真皮成纤细胞,比单层皮肤组织工程支架更具优越性。
发明内容
本发明的目的是,提供一种上述的功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其工艺简单、易控、制造成本低,产品质量稳定。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是,一种功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,原料制备
按溶质与溶剂的质量比为0.5-10︰100,将明胶置于去离子水、蒸馏水、生理盐水、注射用水或林格氏液中,加热搅拌至完全溶解;
然后,降温至40-50℃,再加入与明胶质量比为0.1-1:100的京尼平,搅拌至完全溶解,得到京尼平-明胶溶液;
上述明胶的相对分子质量≥1万;
第二步,在专用模具内冷冻成型
将京尼平-明胶溶液倾倒入专用模具中,控制液深为0.5-5mm,在温度20-50℃的环境中静置12-24h,以使其充分交联;然后,置于真空脱泡机中,在真空度1000Pa下脱泡0.5-1h;
接着,扣紧上盖并将专用模具置于平板式换热器换热表面上冷冻,直至冻结成型,得到固态多孔结构形式的京尼平-明胶;
上述平板式换热器的冷却媒质为液氮;
上述冷冻过程是按如下方法控制的:平板式换热器换热表面温度采用阶梯升温方式,以-75℃为起始温度、-15℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每升温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min;
或者,平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式,以-15℃为起始温度、-75℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每降温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min;
上述专用模具为一带上盖的平底容器,其周边壁面材质为绝热材料,底板材质为银或铜;
在专用模具内部底面上,均匀设置有若干数量、竖直朝上的导热针,所述导热针的长度≥5mm;所述导热针布置的疏密程度与仿生皮肤内毛孔分布的疏密程度一致;
第三步,真空干燥
将所得固态多孔材料从专用模具中取出,放入真空干燥机中,真空干燥至绝干,即得成品。
上述技术方案直接带来的技术效果是,制备工艺简单、易控,既有利于产品质量的稳定,有利于制造成本的降低。
所制得的明胶三维梯度人体皮肤仿真结构多孔材料具有皮肤仿生结构,其内部成蜂窝状,包括若干数量的孔,每相邻两孔彼此贯通;并且,从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,上表面的孔径为5-70μm,下表面的孔径为50-200μm。这种梯度孔结构的明胶多孔材料,其适于用作皮肤工程支架,可同时容纳表皮细胞和真皮成纤细胞,比单层皮肤组织工程支架更具优越性。
并且,由于多孔材料的主要化学成分为明胶和京尼平。因而具有良好的生物相容性、可降解性和良好的吸水性能。
更为重要的是,明胶不仅生物相容性良好,可生物降解,降解产物安全无毒,具有与皮肤类似的结构,优良的亲水性,可吸收相当于重量5-10倍的水,而且还具有促进细胞粘附和生长的功能。同时,明胶去除了胶原的免疫原性,减少了可能存在的病原体感染,已经广泛应用于组织工程领域。
上述技术方案中,在明胶中混入京尼平,其中的京尼平有两方面的用途。其一是,京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物,是一种优良的天然生物交联剂,其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂,具有良好的生物相容性,以京尼平作为明胶的化学交联剂,以使明胶多个线型分子相互键合交联成网状结构,可使材料的降解性能得到明显改善,并提升其力学性能;其二是,京尼平对于治疗肝脏疾病、降压、通便以及缓解II型糖尿病的症状具有显著作用。京尼平成分的加入,使得最终制备出的多孔材料具有良好的肝脏疾病、高血压、便秘以及II型糖尿病等疾病辅助治疗功能。
上述技术方案中,盛装有京尼平-明胶溶液的专用模具叠放在平板式换热器换热表面上,进行热交换(制冷)。此时,在竖直方向上的不同标高位置处,在京尼平-明胶溶液内部必然存在一定的温差或被冻结过程的先后顺序,且这种温差或被冻结过程的先后顺序必然导致最终冻结成型的京尼平-明胶多孔材料从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变。
概括而言,上述技术方案的关键点就在于:采用定向冷冻干燥法,通过控制模具内水平温度场的均匀性和纵向温度的渐变,孔径大小可由小孔5-70μm至大孔50-200μm梯度渐变,孔形态为蜂窝状连通结构的明胶多孔材料。
优选为,上述平板式换热器换热表面温度由计算机控制,平板式换热器的换热表面的降温速率为-5℃/min~-10℃/min、平板式换热器的换热表面的升温速率为+5℃/min~+10℃/min。
该优选技术方案直接带来的技术效果是,可以更好地保证三维梯度孔的成形质量。
进一步优选,上述导热针为锥形针,按细端在上、粗端在下方式布置。
该优选技术方案直接带来的技术效果是,“导热针为锥形针,按细端在上、粗端在下方式布置”这一技术特征,与所需获得的“从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变”这种结构形式的孔的形状相对应,这将更进一步地,尽快产品制备过程的冷冻成型速度和冷冻成型质量,更便于最终产品质量控制与质量稳定。
进一步优选,上述专用模具为组合式结构,包括底座与管筒,所述底座与所述管筒成过盈配合承插连接。
该优选技术方案直接带来的技术效果是,便于冷冻成型后的多孔材料的简单、快速脱模,并可降低脱模过程中可能因外力的施加,所造成的对多孔材料的冲击和损伤。
综上所述,本发明相对于现有技术,具有制备工艺简单、易控,所制备出的多孔材料产品具有“从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变”这种具有三维梯度孔结构形式;并且产品质量稳定、制造成本较低等有益效果。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进行详细说明。
说明:
一、以下各实施例的原料来源如下:
明胶:相对分子质量≥1万,为市售产品;
京尼平:为市售产品;
二、产品质量和性能参数指标检测与检验:
1、孔径的测量方法:使用手术刀,沿纵向剖切,置于电镜下,分别选择放大倍数30倍、50倍进行观测。
2、孔隙率的测量方法:液体位移法。
实施例1
按溶质与溶剂的质量比为2︰100,将明胶置于去离子水中,加热搅拌至完全溶解;
然后,降温至40℃,再加入与明胶质量比为0.5:100的京尼平,搅拌至完全溶解,得到京尼平-明胶溶液;
将京尼平-明胶溶液倾倒入专用模具中,控制液深为3mm,在温度20-50℃的环境中静置12-24h,以使其充分交联;然后,置于真空脱泡机中,在真空度1000Pa下脱泡0.5-1h;
接着,扣紧上盖并将专用模具置于平板式换热器换热表面上冷冻,直至冻结成型,得到固态多孔结构形式的京尼平-明胶;
上述冷冻过程是按如下方法控制的:平板式换热器换热表面温度采用阶梯升温方式,以-75℃为起始温度、-15℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每升温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min;
之后,将经过冷冻成型的样品,入真空冷冻干燥机冻干,即得产品。
经检验:
所得产品的空隙率为85%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为18μm,大孔孔径为96μm。
实施例2
除京尼平-明胶溶液液面至模具底板高度为0.5mm之外,其余均同实施例1。
经检验:
所得产品的空隙率为80%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为8μm,大孔孔径为145μm。
实施例3
除京尼平-明胶溶液液面至模具底板高度为5mm、冷冻过程的控制方法为:平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式,以-15℃为起始温度、-75℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每降温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min之外;
其余,均同实施例2。
经检验:
所得产品的空隙率为87%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为21μm,大孔孔径为137μm。
实施例4
除使用生理盐水替代去离子水之外;其余,均同实施例1。
经检验:
所得产品的空隙率为85%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为15μm,大孔孔径为105μm。
实施例5
除使用注射用水替代去离子水、冷冻过程的控制方法为:平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式,以-15℃为起始温度、-75℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每降温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min之外;
其余,均同实施例1。
经检验:
所得产品的空隙率为83%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为20μm,大孔孔径为120μm。
实施例6
除使用林格氏液替代去离子水之外;其余,均同实施例1。
经检验:
所得产品的空隙率为82%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为5μm,大孔孔径为145μm。
实施例8
除京尼平与明胶的质量比为0.3︰100、冷冻过程的控制方法为:平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式,以-15℃为起始温度、-75℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每降温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min之外;
其余,均同实施例1。
经检验:
所得产品的空隙率为85%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为58μm,大孔孔径为182μm。
实施例9
除京尼平与明胶的质量比为0.8︰100、冷冻过程的控制方法为:平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式,以-15℃为起始温度、-75℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每降温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min之外;
其余,均同实施例1。
经检验:
所得产品的空隙率为87%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为65μm,大孔孔径为185μm。
实施例10
除京尼平与明胶的质量比为2︰100,其余,均同实施例2。
经检验:
所得产品的空隙率为86%;从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,小孔孔径为62μm,大孔孔径为190μm。
说明:
1、我们的经验表明:京尼平-明胶溶液液面在专用模具内的深度,对最终产品的最大与最小孔的孔径,以及孔隙率指标等有很大的影响;
其次,降温速率、冷媒的供送方式,对最大与最小孔的孔径,以及孔隙率指标也有一定的影响。
2、平板式换热器换热表面温度由计算机控制,平板式换热器的换热表面的降温速率为-5℃/min~-10℃/min、平板式换热器的换热表面的升温速率为+5℃/min~+10℃/min。
3、专用模具为一带上盖的平底容器,其周边壁面材质为绝热材料,底板材质为银或铜;
在专用模具内部底面上,均匀设置有若干数量、竖直朝上的导热针,所述导热针的长度≥5mm;所述导热针布置的疏密程度与仿生皮肤内毛孔分布的疏密程度一致。
4、平板式换热器的冷却媒质为液氮。
Claims (4)
1.一种功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,原料制备
按溶质与溶剂的质量比为0.5-10︰100,将明胶置于去离子水、蒸馏水、生理盐水、注射用水或林格氏液中,加热搅拌至完全溶解;
然后,降温至40-50℃,再加入与明胶质量比为0.1-1:100的京尼平,搅拌至完全溶解,得到京尼平-明胶溶液;
上述明胶的相对分子质量≥1万;
第二步,在专用模具内冷冻成型
将京尼平-明胶溶液倾倒入专用模具中,控制液深为0.5-5mm,在温度20-50℃的环境中静置12-24h,以使其充分交联;然后,置于真空脱泡机中,在真空度1000Pa下脱泡0.5-1h;
接着,扣紧上盖并将专用模具置于平板式换热器换热表面上冷冻,直至冻结成型,得到固态多孔结构形式的京尼平-明胶;
上述专用模具为一带上盖的平底容器,其周边壁面材质为绝热材料,底板材质为银或铜;
在专用模具内部底面上,均匀设置有若干数量、竖直朝上的导热针,所述导热针的长度≥5mm,所述导热针为锥形针,按细端在上、粗端在下方式布置;所述导热针布置的疏密程度与仿生皮肤内毛孔分布的疏密程度一致;
上述平板式换热器的冷却媒质为液氮;
上述冷冻过程是按如下方法控制的:平板式换热器换热表面温度采用阶梯升温方式,以-75℃为起始温度、-15℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每升温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min;
或者,平板式换热器换热表面温度采用阶梯降温方式,以-15℃为起始温度、-75℃为终点温度,在起始温度下保温45min,之后每降温5℃保温一次,每次保温时间为30-45min;
第三步,真空干燥
将所得固态多孔材料从专用模具中取出,放入真空干燥机中,真空干燥至绝干,即得成品。
2.根据权利要求1所述的功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其特征在于,所述平板式换热器换热表面温度由计算机控制,平板式换热器的换热表面的降温速率为-5℃/min~-10℃/min、平板式换热器的换热表面的升温速率为+5℃/min~+10℃/min。
3.根据权利要求1所述的功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其特征在于,所述专用模具为组合式结构,包括底座与管筒,底座与管筒承插连接,成过盈配合。
4.根据权利要求1-3任一所述的功能性人造皮肤支架材料的制备方法,其特征在于,所制得的明胶三维梯度人体皮肤仿真结构多孔材料具有皮肤仿生结构,其内部成蜂窝状,包括若干数量的孔,每相邻两孔彼此贯通;并且,从下表面至上表面,各孔孔径分别从大到小成梯度渐变,其中,上表面的孔径为5-70μm,下表面的孔径为50-200μm。
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