ES2606452T3 - Hidrogel de quitosano para la reparación de tejido nervioso - Google Patents

Abstract

Micropartículas de hidrogel de quitosano de tamaño promedio d50, obtenido a partir de una distribución en número, comprendido entre 1 y 500 μm, teniendo el quitosano un grado de acilación menor o igual a 20 % y estando su concentración en el hidrogel comprendida entre 0,25 y 5 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, para su uso en la regeneración neuronal y/o en la reparación del sistema nervioso, ventajosamente del sistema nervioso central, y/o en el injerto de neuronas o precursores de células neurales y/o en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y/o en el tratamiento de lesiones isquémicas y/o en el tratamiento de parálisis.

Description

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DESCRIPCION

Hidrogel de quitosano para la reparacion de tejido nervioso

La presente invencion se refiere al campo general de la regeneracion axonal a traves de una cicatriz glial, producida en particular por un traumatismo del sistema nervioso central (SNC) o periferico (SNP) tal como las lesiones traumaticas de la medula espinal.

Las lesiones traumaticas de la medula espinal (ME) originan paralisis, perdida de sensibilidad y dolor cronico. En la mayona de los casos en seres humanos (como en roedores en los modelos experimentales), estas lesiones se traducen en la ruptura de conexiones nerviosas entre el cerebro y el resto del cuerpo, seguido por una neurodegeneracion progresiva desde el sitio de la lesion y la formacion de una cavidad rodeada de una cicatriz glial. El conjunto constituye una barrera a la vez ffsica y qmmica para el recrecimiento de los axones. La barrera qmmica se debe a una importante produccion, por las celulas no neuronales, de moleculas inhibidoras (citoquinas, proteoglicanos (es decir, CSpG (Chondroitin sulfate proteoglycans [proteoglicanos de condroitina sulfato]) de la materia extracelular y moleculas quimiorepulsoras). Otras moleculas inhibidoras proceden de la mielina (myelin- derived protein Nogo-A [protema Nogo-A derivada de mielina]), MAG (Myelin-Associated Glygoprotein [glicoprotema asociada a mielina] y Omgp Oligodendrocyte myelin glycoprotein [glicoprotema de la mielina del oligdendrocito] quedan expuestas a la mEC despues de la desmielinizacion de los axones. El aporte de factores troficos siga siendo, desgraciadamente, baja. Asf, la reparacion de la red neuronal rota queda bloqueada.

Ademas de estos efectos inhibidores, la biodisponibilidad de factores troficos que favorezcan la supervivencia y la regeneracion axonal es bastante limitada. En comparacion, el sistema nervioso periferico es bastante susceptible a una reparacion y a una regeneracion axonal, despues de una lesion traumatica, gracias a la rapida respuesta inflamatoria de los macrofagos y a la accion de las celulas de Schwann (celulas mielinizantes del SNP) que favorecen una eliminacion rapida de los restos celulares y de la mielina. Sin embargo, en el caso de las lesiones graves, la regeneracion completa a veces se ve limitada por la dificultad de guiar las fibras hacia los objetivos perifericos adecuados.

Sin embargo, el SNC de los mairnferos tiene una gran plasticidad neuronal. Asf, tras una lesion parcial de la ME, los axones no afectados pueden experimentar una reorganizacion y formar parte de una recuperacion funcional, esencialmente vinculada a un crecimiento de ramificaciones colaterales (o "sprouting" [brotado]). Estas son las observaciones que han desencadenado posteriormente el desarrollo de estrategias terapeuticas para la reparacion del sistema nervioso danado (Nothias F (2011) Stimuler la repousse axonale, en "Regeneration nerveuse, des cellules souches aux interfaces cerveau-machine"; numero especial de la revista, BIOFUTUR VOL 30/322 JUN2011, pp.36-40).

Se han desarrollado varios modelos experimentales para estimular el recrecimiento axonal en lucha contra la accion inhibidora de las protemas incluidas en la cicatriz glial:

- Inyeccion de anticuerpos IN1 para antagonizar el efecto inhibidor de determinados componentes de la mielina (Nogo, MAG y Omgp) que comparten el mismo receptor en las neuronas, Nogo-A.

- La degradacion mediante una enzima espedfica (ChABC, una condroitinasa de tipo ABC) en la matriz extracelular del proteoglicano CSPG, un inhibidor tambien del crecimiento axonal.

- Inyeccion de un peptido que imita el efecto de moleculas de adherencia favorable para el crecimiento axonal. Este es el caso del peptido que imita la funcion del oligosacarido PSA (acido polisialico) que, en el cerebro, esta vinculada a la molecula de adherencia NCAM (neural cell adhesion molecule [molecula de adherencia a celulas neurales]). Durante el desarrollo, la NCAM es rica en PSA y tiene un papel fundamental en el crecimiento y fasciculacion de haces de fibras.

- La manipulacion generica para reducir la reaccion glial, especialmente la de los astrocitos,

- Aporte de factores neurotroficos (BDNF (Brain derived neurotrophic factor) [factor neurotrofico derivado de cerebro], NT3 (Neurtrofina 3)) o de celulas que tienen un efecto trofico sobre las neuronas para aumentar la tasa de supervivencia y tambien para estimular el recrecimiento axonal.

- La sustitucion del tejido lesionado por un trasplante de neuronas embrionarias, de celulas madre os, celulas de Schwann (celulas mielinizantes del sistema nervioso periferico) o tambien las celulas envainantes del bulbo olfativo para guiar y eventualmente mielinizar los axones,

En la mayona de los modelos experimentales de reparacion de la medula espinal (ME) traumatica, solo se regeneran pocos axones, y menos llegan a atravesar el conjunto del sitio de la lesion. Quedan todavfa dos obstaculos importantes, que se deben evitar:

(i) es necesario controlar la ventana temporal para conseguir un recrecimiento axonal eficaz: se debe actuar lo antes posible despues de la lesion;

(ii) se debe tener en cuenta la organizacion espacial del sitio de la lesion para conseguir no solamente un medio adecuado, tambien una organizacion espacial que contribuya al guiado del recrecimiento.

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Materiales polimericos bioactivos y biodegradables, naturales o sinteticos, se han utilizado tambien para crear un soporte ffsico y mecanico para el crecimiento axonal, y/o imitar el efecto biologico de una matriz extracelular. El colageno, un componente mayoritario de la matriz extracelular, en forma de hidrogel, es el mas utilizado. Sin embargo, aunque su implante en el SNP ha llevado a una mejor regeneracion axonal, en el SNC, solamente su combinacion con un aporte de factores troficos mostro una mejora funcional parcial. Ademas, los implantes polimericos usados debenan tener, generalmente, una forma que permita guiar la regeneracion axonal (ejemplos: implantes tubulares en forma de puentes).

El quitosano es un polfmero bioactivo y biodegradable conocido en el estado de la tecnica, especialmente por sus propiedades de biocompatibilidad, de biorresorbabilidad y cicatrizantes. Estas propiedades se han usado en medicina y cirugfa, entre otras.

El quitosano es un polfmero de origen natural obtenido mediante la desacetilacion de la quitina. La quitina es un biopolfmero de elevado peso molecular, no toxico y biodegradable, y es, junto con la celulosa, el polisacarido mas extendido en la naturaleza. La quitina esta formada por una cadena lineal cuya estructura contiene unidades de repeticion de tipo glucosamina (GLcN) y N-acetilglucosamina (GLcNAc) unidas por un enlace p (1->4). La extraccion de la quitina a partir de caparazones de crustaceos y/o endoesqueletos de cefalopodos se realiza principalmente por metodos qmmicos, seguido de la transformacion mediante desacetilacion de la quitina en sosa concentrada en caliente, lo que permite obtener el quitosano. Por su biocompatibilidad con los tejidos humanos y sus propiedades cicatrizantes, el quitosano ha demostrado su eficacia en diversas formas ffsicas tales como geles, polvos o pelfculas, en diversos productos como apositos, escayolas, piel artificial, reparacion de la cornea, hilos de sutura quirurgica que se resorben de forma natural despues de la cicatrizacion, pero tambien en la reparacion osea o en la reparacion de cartflago (Montembault et al Biochimie, 88, 2006, paginas 551-564) y en cirugfa dental, en implantes o en la cicatrizacion de las encfas, en lentes de contacto bien toleradas.

El quitosano tambien se ha utilizado como implante intratecal subvertebral en la columna vertebral de ratas (Kim Howard et al. Journal of Biomedical Materials Research, 15 de junio de 2011, vol. 97A, numero 4, paginas 395-404). Sin embargo, el implante utilizado tema la forma de una hoja no porosa, y el ensayo puesto en practica tema como objetivo mostrar que dicho biopolfmero era biocompatible y se podfa utilizar, por tanto, en aplicaciones a largo plazo en la reparacion de la medula espinal. Dicho documento no describe, por tanto, el recrecimiento axonal en el caso de utilizar el quitosano en forma de hojas no porosas. Ademas, es muy probable que una respuesta de ese tipo sea imposible, vista la forma del quitosano utilizado.

En el artfculo de smtesis de Karin S. Straley et al, (J Neurotrauma. 2010 enero; 27(1): 1-19 dol: 10.1089/neu.2009.0948), se indica que se han utilizado andamios de quitosano para transferir injertos de nervios viables, celulas madre neurales, y celulas progenitoras neurales a la columna vertebral de ratas, lo que ha favorecido la regeneracion axonal. Sin embargo, en dichas aplicaciones, el quitosano nunca se ha utilizado solo y siempre se ha usado en forma de bloques. Ademas, el quitosano se cita entre otros numerosos biomateriales tales como el colageno, los poli-a-hidroxiacidos, el acido hialuronico y la fibrina, sin que el quitosano se indique como especialmente mas interesante que estos otros materiales.

De una manera general, los hidrogeles utilizados en el desarrollo de estrategias terapeuticas para la medula espinal o de los nervios perifericos, se han disenado esencialmente en forma de tubos de diametro grande, como soporte sobre el que adherir y confinar las celulas adecuadas para el recrecimiento axonal, como las celulas de Schwann. Por otra parte, varios de estos estudios han utilizado el quitosano mezclado con protemas o polisacaridos como gelatina, colageno, poli-D-lisina o incluso agarosa; teniendo el quitosano la menor concentracion en la mezcla (Zuidema et al., 2011, Acta Biomateriala 7:1634-1643; Karin et al., 2010, Journal of Neurotrauma, 27:1-19; Annabi et al., Tissue Eng Part B Rev. 2010, 16:371-383; revue de Yang T-L, 2011, Int. J. Mol. Sci, 12, 1936-1963; Pfister LA et al., 2007, J Biomed Mater Res A. 80:932-7).

La publicacion de Youngnam Cho et al. en Biological engineering 2010, 4, 2 titulada "Chitosan nanoparticle-based neuronal membrane sealing and neuroprotection following acrolein-induced cell injury" describe el uso de nanopartfculas de complejos formados por quitosano y sulfato de dextrano o tripolifosfato de sodio, a las que se han incorporado, o no, hidrazalina, y su uso se ha evaluado en un modelo in vitro del efecto neuroprotector. Teniendo en cuenta el tamano de las partfculas descritas en el presente documento, que es de 250-300 nm, se ha demostrado que las partfculas se asimilan en las celulas cultivadas in vitro (como se ilustra en la Figura 9).

De forma sorprendente, los inventores han descubierto que las micropartfculas de hidrogel de quitosano se podfan utilizar con exito como implante en la regeneracion axonal, con la condicion de que el quitosano tenga un grado de acetilacion bajo, sin necesidad de dotar al implante de una forma que permita guiar a los axones, tales como tubos. Efectivamente, el implante a base de micropartfculas tiene una forma ffsica abierta y porosa, mas importante de lo que puede ofrecer un bloque. Los resultados obtenidos en rata muestran que estas micropartfculas de hidrogel se pueden utilizar con exito, especialmente en la reparacion de lesiones de la medula espinal ya que los axones atraviesan el sitio de la lesion a larga distancia (de 3 a 4 mm como mmimo). Los inventores han descubierto que la introduccion del quitosano reduce la reaccion de los astrocitos, tanto morfologica como molecular. Efectivamente, se sabe que estas celulas reaccionan rapidamente a la introduccion de un elemento que no forma parte del tejido

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nervioso, forman una barrera con sus ramificaciones de forma que crean una frontera entre el tejido danado y el tejido sano. Tambien secretan moleculas que, en su mayor parte, son inhibidoras del recrecimiento axonal (por ejemplo, el CSPG), Por otra parte, los inventores han descubierto que incluso los astrocitos pueden migrar a traves del implante, y su prolongacion en la frontera de la lesion esta asociada a axones que recrecen, un fenomeno que se describe durante el desarrollo del sistema nervioso. Un efecto de ese tipo sobre los astrocitos y los axones no se habfa demostrado nunca en los modelos experimentales utilizados anteriormente: el numero de axones obtenidos en estos modelos era insuficiente para invadir el conjunto de las lesiones, aproximadamente un 10 %. Los inventores han descubierto que el quitosano no tiene solamente propiedades adhesivas, tambien tiene propiedades atractoras. Los inventores han senalado que la retraccion de los axones es muy baja, lo que explica las numerosas fibras que recrecen a traves de la lesion.

La presente invencion se refiere por tanto a micropartfculas de hidrogel de quitosano que tienen un tamano promedio d50 para una distribucion en numero comprendida entre 1 y 500 pm, teniendo el quitosano un grado de acilacion menor o igual al 20 % y su concentracion en el hidrogel esta comprendida entre 0,25 y 5 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, para un uso en la regeneracion neuronal y/o en la reparacion del sistema nervioso (central o periferico), ventajosamente del sistema nervioso central (en especial la medula espinal), y/o en el injerto de neuronas y/o en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (como la enfermedad de Alzheimer o de Parkinson) y/o en el tratamiento de las paralisis.

Ventajosamente, la reparacion o regeneracion o el tratamiento de las paralisis despues de una lesion, en especialmente traumatica del sistema nervioso (central o periferico tales como las lesiones graves de los nervios perifericos), aun mas ventajosamente del sistema nervioso central, en especial del cerebro o, preferentemente, de la medula espinal, Efectivamente, las micropartfculas se implantan, tanto en la lesion, especialmente en la lesion traumatica, para superar esta lesion, o bien en el punto donde debe tener lugar el recrecimiento axonal o la reparacion o el injerto. Las micropartfculas, por tanto, se implantan ventajosamente mediante inyeccion, de forma aun mas ventajosa mediante cirugfa.

Es posible que el tratamiento no sea posterior a una lesion traumatica como en el caso de las lesiones neurodegenerativas. Estas lesiones neurodegenerativas no se deben a un impacto ffsico. Conllevan la perdida de neuronas en sitios precisos. Los axones procedentes de otras regiones se encuentran entonces sin celulas diana y no pueden desempenar su funcion. Por una parte, el implante de las micropartfculas de acuerdo con la presente invencion en la lesion puede crear un medio favorable para estimular su recrecimiento hacia otras neuronas no danadas. Por otra parte, las neuronas conectadas a la salida de la region lesionada que se enfrentan a un deficit de entrada de informacion aferente, el implante de partfculas puede tambien estimular la respuesta de ramificaciones de los axones vecinos.

El quitosano utilizado en el marco de la invencion se obtiene mediante la desacetilacion de la quitina en medio alcalino (Robert GAF Chitin Chemistry, Macmillan Press Ltd Ed., Londres 1992), siendo la quitina el polfmero estructural de los exoesqueletos de los artropodos (A. Domard et G. Chaussard; New Approach in the Study of The Production of Chitosan from Squid Pens: Kinetics, Thermodynamic and Structural Aspects. En Adv. Chitin Sc. 5, 1-5. 2002; K. Kurita et al.; Squid Chitin as a Potential Alternative Chitin Source: Deacetylation Behavior and Characteristic Properties. J. Polym. Sci. Parte A 31, 485-491. 1993), los endoesqueletos de los cefalopodos (H.-M. Cauchie; An Attempt to Estimate Crustacean Chitin Production in the Hydrosphere. En Adv. Chitin Sci. 2, 32-39, 1992) e incluso en las paredes celulares de algunos hongos o algas. En consecuencia, salvo en los casos en que el grado de acetilacion es del 0 %, el quitosano es un copolfmero de los dos monomeros siguientes: la 2-acetamido-2-desoxi-D- glucopiranosa y la 2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa, unidas por un enlace glucosfdico p (1->4). En particular, el quitosano esta comercialmente disponible, por ejemplo, en Mahtani Chitosan mediante desacetilacion de la quitina de calamar o de gamba.

El quitosano de utilidad en el marco de la presente invencion tiene un grado de acetilacion menor o igual del 20 %, es decir, comprendido entre 0 y 20 %. Efectivamente, si se utiliza un grado de acetilacion mas importante, los inventores descubrieron que el quitosano no permite la regeneracion axonal y, ademas, induce una reaccion inflamatoria importante. Ventajosamente, el quitosano de utilidad en el marco de la presente invencion tiene un grado de acetilacion comprendido entre 0 y 10 %, de forma ventajosa menor del 5 %, de forma aun mas ventajosa comprendido ente 1 y 4 %, y en especial de aproximadamente un 3 %. El grado de acetilacion influye, ademas, sobre la bioresorbabilidad del quitosano, cuando este se implanta en un organismo, es decir, su degradacion en el organismo, en especial el cuerpo humano, que lleva a su desaparicion, y sus productos de degradacion se metabolizan o excretan por el organismo. Efectivamente, cuanto mayor es el grado de acetilacion, mas rapida es la cinetica de biodegradacion y bioabsorcion. Este se seleccionara, por tanto, dependiendo de la aplicacion prevista. En el marco de la presente invencion, el grado de acetilacion del quitosano se mide usando la tecnica de RMN de proton, siguiendo la metodologfa de Hirai (Asako Hirai, Hisashi Odani, Akio Nakajima, Polymer Bulletin (1991) Volumen: 26, Volumen: 1, Editor: Springer, Paginas: 87-94).

En una realizacion particular, el peso molecular del quitosano es mayor de 180.000 g/mol, ventajosamente superior a 200.000 g/mol, de forma ventajosa superior a 300.000 g/mol, de forma mas ventajosa inferior a 1.000.000 g/mol, de forma aun mas ventajosa inferior a 600.000 g/mol, en especial de aproximadamente 450.000 g/mol, Los

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inventores se han dado cuenta de que, de manera sorprendente, el elevado peso molecular permite obtener un hidrogel poco concentrado en quitosano, limitando la respuesta inflamatoria, y favoreciendo la bioresorbabilidad del hidrogel.

Por hidrogel, se entiende, en la presente invencion, una masa viscoelastica (que tiene un modulo de cizalladura complejo G*=G"+jG" tal que G'>10G" en un intervalo de frecuencia superior a 1 decada) que incluye como mmimo un 80 % en masa de agua, preferentemente al menos un 90 % en masa de agua, y preferentemente al menos un 95 % en masa de agua. Existen dos categoffas de hidrogeles: los hidrogeles qmmicos y los hidrogeles ffsicos. Se dice que un hidrogel es ffsico cuando las interacciones responsables de la reticulacion entre las cadenas son de tipo ffsico, y son especialmente enlaces de hidrogeno y/o interacciones hidrofobas, por oposicion a un hidrogel denominado qrnmico donde las interaccione entre las cadenas son de tipo enlace covalente.

En el marco de la presente invencion, la concentracion del quitosano en el hidrogel esta comprendido entre 0,25 y 5 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, ventajosamente inferior al 4 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, de forma ventajosa mayor del 0,5 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, en especial comprendido entre 1 y 3 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, mas especialmente de aproximadamente un 2,5 % en peso con respecto al peso total del hidrogel. Los inventores han observado que, cuando la solucion de quitosano tiene una concentracion menor del 0,25 % en peso, la solucion no se puede gelificar de forma que se obtiene un hidrogel macroscopico. Ademas, mas alla del 5 % en peso de quitosano en la solucion, su disolucion se vuelve diffcil, y la viscosidad de las soluciones obtenidas dificulta la elaboracion de los materiales.

En una realizacion ventajosa de la presente invencion, se utilizar un hidrogel ffsico de quitosano. La ventaja de este tipo de hidrogel es que no contiene reticulante qrnmico que pueda ser toxico. La formacion de este tipo de hidrogeles, por ejemplo, se describe en las publicaciones siguientes, que se podran consultar: A. Montembault; C. Viton et A. Dornard dans Rheometric study of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic medium. Biomaterials, 26(14), 1633-1643, 2004 et Montembault A, Viton C, Dornard A, Rheometric study of the gelation of chitosan in aqueous water without cross-linking agent, Biomacromolecules, 6(2): 653-662, 2005.

En particular, el hidrogel ffsico de acuerdo con la presente invencion se obtiene por la via acuosa o hidroalcoholica, ventajosamente por la via acuosa como, por ejemplo, el procedimiento que comprende las etapas sucesivas siguientes:

- preparacion de una solucion de quitosano de concentracion comprendida entre 0,25 % y 5 % en peso con respecto al peso total de solucion, por mezcla del quitosano purificado y liofilizado y de una solucion acuosa de acido acetico;

- gelificacion por contacto de la solucion obtenida con vapores de amoniaco; y

- lavado del hidrogel obtenido para eliminar el amomaco y las sales formadas durante la gelificacion. La ventaja de la via acuosa es que los hidrogeles obtenidos se degradan mas rapidamente en el cuerpo humano.

Las microparffculas de hidrogel de quitosano de utilidad en el marco de la presente invencion se caracterizan por un tamano promedio d50 comprendido entre 1 y 500 pm (para una distribucion en numero), ventajosamente entre 5 y 300 pm, de forma ventajosa entre 10 y 50 pm, en especial de aproximadamente 20 pm. El tamano promedio d50 de las microparffculas se mide, por ejemplo, mediante observacion realizada mediante un microscopio optico con contraste de fase, de la marca Zeiss (Axiovert 200M), con el programa informatico de adquisicion de imagenes Linkys32. La distribucion de los tamanos de las microparffculas de hidrogel se puede obtener mediante el tratamiento de imagenes con el programa informatico ImageJ
http://rsbweb.nih.gov/ii/. o como se describe en C Igathinathane et al (computers and electronics in agriculture 63 (2008) 168-182).

Las microparffculas de quitosano que tienen el tamano promedio d50 deseado se pueden obtener mediante trituracion del hidrogel, especialmente utilizando un homogeneizador ULTRATURAX de marca IKA (que funciona a una velocidad de rotacion de 11000 rpm durante 3x 10s y una parada de 30 segundos entre las secuencias) y recuperacion de las microparffculas del tamano adecuado mediante centrifugacion (por ejemplo, a 13000 rpm durante 3 minutos con un aparato de tipo Sigma 3K30 de marca Bioblock Scientific). Ventajosamente, el procedimiento de acuerdo con la presente invencion incluye una etapa de esterilizacion, en especial en autoclave, por ejemplo, a 121 °C durante 20 minutos, antes de la recuperacion de las microparffculas.

En una realizacion particular de la presente invencion, las microparffculas de acuerdo con la invencion se encuentran en forma de una suspension acuosa, que tiene ventajosamente una viscosidad mayor de 1000 Pa.s, de forma ventajosa mayor de 10.000 Pa.s, de forma aun mas ventajosa mayor de 100.000 Pa.s, en especial de aproximadamente 330 kPa.s, (medida en modo continuo a 22°C) para una velocidad de cizallamiento de 0,001 s'1, medida ventajosamente por reometffa cono-plano con un reometro de esfuerzo obligado Advanced Rheometer AR2000 de marca TA instruments. Es precisamente esta suspension la que se implanta. En este caso, el implante utilizado comprende una suspension acuosa que contiene las microparffculas de hidrogel. Ventajosamente, la suspension se puede inyectar o implantar mediante cirugfa. Por ejemplo, el valor caracteffstico de viscosidad de la suspension puede ser de 330 kPa.s tras una centrifugacion a 13000 rpm durante 3 minutos a partir de un hidrogel concentrado a un 2,5 % en quitosano de peso molecular 450.000 g/mol (Figura 5). Esta suspension debe ser, por

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tanto, lo suficientemente Ifquida para poderse inyectar directamente en el sitio de la lesion donde los axones se han cortado por el impacto que ha danado el tejido nervioso, y lo suficientemente viscosa para quedar confinada en el sitio de su implante. La ventaja analoga de que esta suspension sea inyectable es permitir una reparacion en el caso de una contusion que no genera obligatoriamente la rotura de la duramadre (la membrada que protege los tejidos nerviosos, justo por debajo del hueso (de las vertebras o el craneo)). En el caso del tratamiento del craneo, el impacto puede danar una zona profunda y una infeccion permite evitar la induccion de una lesion importante suplementaria. Esto tambien se puede aplicar a una lesion neurodegenerativa (es decir, que no se debena necesariamente debida a un impacto traumatico, sino el resultado de una muerte neuronal). Asf, esta suspension tiene, mas bien, la consistencia de una pasta.

En otra realizacion de la presente invencion, las micropartfculas de acuerdo con la invencion se mezclan con las celulas de Schwann y/o celulas madre y/o factores troficos.

Esta suspension se puede fabricar mediante la evaporacion de agua a partir del aglomerado de centrifugacion que contiene las micropartfculas de acuerdo con la presente invencion obtenidas mediante el procedimiento de fabricacion de micropartfculas indicado anteriormente, ventajosamente de forma que se obtenga una viscosidad mayor de 1000 Pa.s (medida de la viscosidad de la suspension en modo continuo a 22°C para una velocidad de cizallamiento de 0,001 s-1). Esta evaporacion puede, por ejemplo, realizarse depositando la suspension presente en el aglomerado de centrifugacion sobre una placa de vidrio y dejandola secar algunos minutos (por ejemplo, de 5 a 10 min) a temperatura ambiente (alrededor de 20°C) y al aire libre hasta obtener la consistencia requerida para cogerla con una pinza pequena y depositarla en el lugar de la lesion durante una intervencion quirurgica. Esto es valido en el caso de una lesion traumatica de la medula espinal. En el caso de una inyeccion, el aglomerado se puede resuspender en lfquido fisiologico o lfquido cefalorraqrndeo artificial.

La presente invencion se refiere, ademas, a un implante que comprende una suspension acuosa de micropartfculas tal como se ha definido anteriormente y las celulas de Schwann y/o las celulas madre y/o los factores troficos. La adicion de las celulas puede hacerse una o dos horas antes del implante, tiempo que tardan en adherirse a las micropartfculas dado que el quitosano tiene propiedades adhesivas que, por otra parte, los inventores habfan comprobado in vitro, en cultivos de celulas. De forma ventajosa, este implante no contiene condriocitos. De forma ventajosa, este implante es un implante destinado al sistema nervioso, en particular al sistema nervioso central, ventajosamente a la medula espinal. Por tanto, no debena suscitar ninguna reaccion inflamatoria en el lugar del implante, ademas de la creada por el impacto de la lesion.

La ventaja de las micropartfculas de acuerdo con la presente invencion es que proporcionan una superficie adecuada para la adhesion tanto celular y axonal por una parte, y por otra, para que los axones puedan utilizar la porosidad entre partfculas (entre las micropartfculas de suspension) para invadir el sitio de la lesion. Efectivamente, los inventores ya comprobaron que las neuronas en cultivo hacen crecer sus neuritas (entre otros axones) sobre un sustrato compuesto por la misma suspension de quitosano propuesta en el presente documento para su implante in vivo. Para crecer, los axones necesitan un punto de sujecion para crear una fuerza de extension.

La suspension o las micropartfculas tambien pueden utilizarse en sistemas de plurimembrana tales como por ejemplo las fibras plurimembrana descritas en la solicitud de patente WO 2009/044053 para la constitucion de implantes, por ejemplo, para lesiones traumaticas.

La presente invencion se refiere ademas a un metodo de regeneracion neuronal y/o de reparacion del sistema nervioso (central o periferico), ventajosamente del sistema nervioso central (en especial la medula espinal), y/o de injerto de neuronas o de precursores de celulas neurales (glfa y neuronas) y/o de tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (tales como la enfermedad de Alzheimer o Parkinson, o incluso la esclerosis multiple) y/o lesion isquemica y/o tratamiento de las paralisis que comprende el imparte de micropartfculas de acuerdo con la presente invencion en un paciente que necesita dicho tratamiento, especialmente para una lesion ventajosamente traumatica para superar estas lesiones, o en el punto donde debe tener lugar el recrecimiento axonal o la reparacion o el injerto. Ventajosamente, este implante se realiza por deposito, inyeccion o cirugfa.

La presente invencion se comprendera mejor con las figuras y los ejemplos siguientes.

La Figura 1 representa el esquema de una lesion traumatica de la medula espinal. Este esquema muestra que, alrededor del sitio de la lesion inicial, los axones que se han cortado, estan bloqueados y no recrecen (muchos de ellos se retraen o degeneran con el tiempo). Los astrocitos migran y rodean la lesion para formar la barrera ffsica y qrnmica, sin por migrar, por tanto, al interior del sitio de la lesion. La cicatrizacion frecuentemente va seguida de la formacion de una cavidad (observada en seres humanos y ratas, por ejemplo).

La Figura 2 representa las fotograffas de inmunofluorescencias dobles realizadas sobre cortes de medula espinal de rata adulta, 1 semana (1s, figuras a izquierda y en el medio) y 3 semanas (figuras a la derecha, 3s) tras la hemiseccion, tras implante de las microparttculas de acuerdo con el ejemplo 1 de la presente invencion (+quitosano, figuras al medio y a la derecha) o sin implante (mas a la izquierda). Las fotograffas de arriba muestran el marcado de los neurofilamentos (NF) que pone de manifiesto la presencia de axones de las neuronas. Las fotograffas de abajo (GFAP) muestran los astrocitos (celulas gliales del sistema nervioso central).

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Se debe indicar que, al cabo de una semana, numerosos axones salen del tejido hospedador y han invadido ya el sitio de la lesion, tanto del lado rostral (hacia el cerebro) como del lado caudal (hacia la cola del animal). A comparar la densidad de los axones una semana despues entre el corte con la lesion sola y el corte con la lesion + quitosano. Observando las figuras a 1 y 3 semanas lesion + quitosano, se puede observar que el numero de axones ha aumentado todavfa mas con el tiempo, y el recrecimiento se ha realizado sobre distancias mas grandes. Tambien se debe indicar que la reaccion glial sigue siendo baja.

La Figura 3 representa una fotograffa de un corte de medula espinal de rata adulta, 4 semanas despues de la

hemiseccion e implante de las microparffculas de hidrogel ffsico de quitosano que tiene un grado de acetilacion

elevado (35 %) en el sitio de la lesion traumatica. La fotograffa de la izquierda incluye un doble marcado con el anti-ED1 de los macrofagos y la fotograffa de la derecha un inmunomarcado de la laminina que resalta los microvasos sangumeos, y, por lo tanto, la vascularizacion. Este tipo de implante crea una fuerte reaccion inflamatoria, bloquea el recrecimiento axonal e incluso la migracion de las celulas endoteliales (celulas que originan los vasos sangumeos) a traves del implante, mientras que, para un grado de acetilacion bajo, se nota vascularizacion en el interior del implante de microparffculas.

La Figura 4 representa una fotograffa de un corte de medula espinal de rata adulta, 4 semanas despues de la

hemiseccion e implante de un bloque de hidrogel ffsico de quitosano que tiene un grado de acetilacion bajo (3 %)

en el sitio de la lesion traumatica. La fotograffa de la izquierda incluye un inmunomarcado con un anti-GFAP de los astrocitos y la fotograffa de la derecha, un inmunomarcado de los axones mediante un anti-neurofilamento. Incluso aunque la reaccion glial astrocitaria y la reaccion inflamatoria sean reducidas, los axones cerca del implante, se encuentran bloqueados en la frontera y no recrecen a traves del implante.

La Figura 5 representa la cuerva de evolucion de la viscosidad (en Pa.s) de una suspension de microparffculas de acuerdo con el ejemplo 1 de la invencion (obtenida tras la centrifugacion a 1300 rpm durante 3 minutos, comprendiendo el hidrogel un 2,5 % en peso de quitosano que tiene un grado de acetilacion del 3 %) en funcion de la velocidad de cizalladura (en s-1), midiendose la viscosidad de forma continua a 22°C por reometffa cono- plano con un reometro de esfuerzo obligado Advanced Rheometer AR2000 de marca TA instruments.

La Figura 6 permite observar en el microscopio optico con contraste de fases, en la primera lmea, una dispersion de microparffculas de hidrogel ffsico de quitosano de acuerdo con el ejemplo comparativo 3 y en la segunda lmea de acuerdo con un ejemplo realizado segun el ejemplo 1.

A- Esta fotograffa permite medir la distribucion de tamanos de las microparffculas de gel antes del implante, con una dimension mayor superior a 500 micrometros para una fraccion mayoritaria de parffculas, que corresponde, por tanto, a un valor de d50 superior a 500 pm. Cuatro semanas despues de implantar esta formulacion en la medula espinal de ratas adultas que se han sometido a hemiseccion (B-D), se puede observar que el poffmero permanece muy opaco al microscopio optico de contraste de fases; muy pocos axones (marcado espedfico de los axones en B), muy pocos astrocitos (marcado espedfico de los astrocitos en C) invaden el implante. Ademas, el marcado de los nucleos de las celulas (marcado espedfico de los nucleos celulares en D) muestra que pocas celulas invaden el implante, sin que las zonas ocupadas por los microgeles esten colonizadas.

E- Esta fotograffa permite medir la distribucion de tamanos de las microparffculas de gel antes del implante, con un tamano promedio aparente de los fragmentos comprendido entre 20 y 50 micrometros. Cuatro semanas despues de implantar esta formulacion en la medula espinal de ratas adultas que se han sometido a hemiseccion (B-D), se puede observar que la lesion esta invadida por numerosas celulas (marcado espedfico de los nucleos celulares en H), entre las que los astrocitos (marcado espedfico de astrocitos o celulas en forma de estrella en G) la reaccion astrocitaria que rodea el implante es muy poco importante (G), al contrario de lo que puede observar con las microparffculas de quitosano en la Figura 6 C. Ademas, numerosos axones (marcado espedfico de los axones en F) invaden el implante.

La Figure 7 presenta fotograffas de un corte de medula espinal de rata adulta que muestra la evolucion de la lesion tras el implante de las microparffculas de quitosano de acuerdo con la invencion de la Figura 6 ■ E, 4 semanas despues de la lesion y el implante. A-C; marcado por triplicado que muestra una neovascularizacion (marcado espedfico de los vasos en A) muy organizada en el implante, acompanada de un fuerte recrecimiento de los axones (marcado espedfico de los axones en B) y una invasion masiva por las celulas (marcado espedfico de los nucleos celulares en C). D-E: importante engrosamiento del implante que muestran la asociacion (flechas) de los axones (D) con los microvasos (E) de nueva formacion en el implante.

La Figura 8 presenta una fotograffa de un corte de medula espinal de rata adulta que muestra la evolucion del implante despues del implante de microparffculas de quitosano de acuerdo con la invencion de la Figura 6 ■ E. Entre las celulas que colonizan el implante, se destacan los oligodendrocitos (flecha), celulas que podffan mielinizar los axones en regeneracion, y restablecer de esta forma el impulso nervioso.

Ejemplo 1: fabricacion de microparffculas de acuerdo con la presente invencion

Disolucion de quitosano con un grado de acetilacion del 3 % procedente de quitina de calamar comercializado por la empresa Mahtani Chitosan, en una solucion acuosa de acido acetico (introducido en cantidades estequiometricas con respecto a las funciones amina), de forma que se obtuviera una solucion que contiene un 0,5 % en peso de quitosano.

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Filtracion en filtros de 3 micrometros, 1 micrometro y 0,45 micrometros.

Precipitacion mediante sosa o amoniaco hasta alcanzar un pH de 14. Recuperacion del precipitado mediante centrifugacion.

Lavado con agua desionizada hasta que el pH del agua de lavado sea neutro para la eliminacion de las sales. Liofilizacion del precipitado lavado para obtener un producto seco.

Preparacion de una solucion de quitosano de peso molecular de 450.000 g/mol al 2,5% en peso con respecto al peso total de solucion a partir del precipitado y de agua pura (Versol®).

Gelificacion por contacto de la solucion en placas Petri de algunos cenffmetros de diametro, en presencia de vapores de amomaco (72 h).

Lavado de los hidrogeles con agua desionizada para la eliminacion de amoniaco. Repeticion de la operacion un total de 7 lavados.

Verificacion de la consecucion del pH neutro.

Trituracion de los hidrogeles con el aparato ULTRATURAX marca lKA (funcionando a una velocidad de rotacion de 11000 rpm durante 3x 10 s y una detencion de 30 segundos entre secuencias).

Esterilizacion de las microparffculas de hidrogel en un autoclave (121°C durante 20 minutos).

Centrifugacion (13000 rpm durante 3 minutos con un aparato de tipo Sigma 3K30 de marca Bioblock Scientific) de forma que se recuperen las microparffculas esterilizadas que tengan un tamano promedio d50 de aproximadamente 20 pm. Estas microparffculas se utilizan a continuacion para la fabricacion de una suspension acuosa con una viscosidad minima de 1000 Pa.s. Para ello, se deposita el aglomerado de centrifugacion obtenido sobre una placa de vidrio, que se deja secar al aire libre a temperatura ambiente durante varios minutos. Se produce un secado parcial que permite aumentar la viscosidad hasta obtener una viscosidad hasta una viscosidad de 330 kPa.s medida a 22°C para una velocidad de cizallamiento de 0,001 s-1 (medida de forma continua mediante reometffa cono-plano con un reometro de esfuerzo obligado Advanced Rheometer AR2000 de marca TA Instruments) como se indica en la Figura 5.

Ejemplo comparativo 1: fabricacion de microparffculas de hidrogel ffsico de quitosano con grado de acetilacion elevado.

Se utiliza el mismo procedimiento que se describe en el ejemplo 1 (las microparticulas obtenidas tienen el mismo tamano promedio d50 que en el ejemplo 1, el contenido en quitosano es el mismo que en el Ejemplo 1, asf como la viscosidad de la suspension obtenida), salvo que el quitosano de partida 3 tiene un grado de acetilacion del 35 %. Para obtener un grado de acetilacion de ese tipo, el quitosano se ha vuelto a acetilar a partir de un quitosano con bajo grado de acetilacion (3 %) adquirido de Mahtani Chitosan y secado como se indica en el ejemplo 1, en medio hidroalcolico, como se describe en la publicacion siguiente: Biomacromolecules. 2001 2(3):765-72. Relation between the degree of acetylation and electrostatic properties of chitin and chitosan. Sorlier P, Denuziere A, Viton C, Domard A.

Ejemplo comparativo 2: fabricacion de bloques de hidrogel fisico de quitosano con grado de acetilacion bajo.

Se utiliza el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 1, salvo que no hay etapa de trituracion, centrifugacion y secado parcial sobre un porta de vidrio. El hidrogel ffsico obtenido se esteriliza directamente antes de recortarse a las dimensiones deseadas.

Ejemplo comparativo 3: fabricacion de microparticulas que presentan una d50 superior a 500 pm

El procedimiento de obtencion de estas parffculas es identico al del ejemplo 1, salvo que la concentracion de quitosano en el hidrogel de partida es del 3,5 % en peso de quitosano con respecto al peso total, y que la duracion de la trituracion del gel es de solo de 10 segundos, en lugar de 3x 10 segundos.

Ensayo de reparacion de lesion traumatica de la medula espinal

Para estos ensayos, la lesion de la medula espinal se practico mediante una hemiseccion lateral toracica entre las vertebras 8 y 9 de la ME de una rata adulta, seguida por una retirada de la parte dorsolateral (2 a 3 mm) del segmento descubierto. Este tipo de lesion se encuentra entre el ultimo segmento toracico y el primer segmento lumbar. En el caso de una hemiseccion, esto genera una hemiplagia de la pata posterior del mismo lado de la lesion. Ratas testigo se someten al mismo tipo de lesion, pero se dejan cicatrizar sin implante. Los implantes se introdujeron mediante cirugfa inmediatamente despues de practicar la lesion, y reduccion de la hemorragia causada por el traumatismo. Los implantes sometidos a ensayo son de tres tipos:

- una cantidad que representa aproximadamente 2-3 mm3 de la suspension acuosa de microparffculas de acuerdo con la presente invencion (obtenidas de acuerdo con el ejemplo 1)

- una cantidad que representa aproximadamente 2-3 mm3 de la suspension acuosa de microparffculas de hidrogel de quitosano con un grado de acetilacion elevado (obtenidas de acuerdo con el ejemplo 1)

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- o un bloque de aproximadamente 2-3 mm3 recortado del hidrogel ffsico de quitosano obtenido de acuerdo con el ejemplo comparativo 2.

Se analizaron 24 animales (12 con lesion + implante y 12 controles: lesion solamente).

En momentos variables tras las lesiones, los animales se anestesiaron profundamente y se perfundieron desde el corazon con un fijador (paraformaldetffdo al 4% en tampon fosfato 0,1 M, PBS) para fijar el tejido de interes. Se realizaron cortes de la medula espinal entre 1 (n=8) y 3 (n=8) a 4 (n=8) semanas despues de la lesion, de forma que se realizan analisis morfologicos e inmunohistologicos.

Tras la diseccion y toma de muestra, los tejidos de interes (medula espinal) se crioprotegen con sacarosa para realizar cortes de 30 mm en el criostato que se montan en portas y se conservadas a -80°C hasta su utilizacion en histologfa.

Tras la permeabilizacion (Triton al 0,3% en PBS) y saturacion de los sitios espedficos (NGS, (suero de cabra normal), 10 % en PBS), los cortes se incubaron en la solucion de anticuerpos primarios diluida en NGS al 5 % en PBS, toda la noche a 4°C. La incubacion con los anticuerpos secundarios acoplados a los fluorocromos adecuados se realizo durante 2 horas a temperatura ambiente, protegida de la luz. Tras el aclarado, los portaobjetos se montaron con Mowiol. Las marcas se analizaron mediante microscopfa de fluorescencia. Como se ilustra en la Figura 1, una lesion mecanica en la medula espinal conlleva la formacion de una barrera ffsica y qrnmica que rodea la lesion y bloquea el recrecimiento de los axones lesionados.

La Figura 2 muestra, en las tres fotograffas de abajo, astrocitos (celulas gliales del sistema nervioso central) que se activan despues de la lesion y que son responsables de la formacion de la barrera mostrada en la Figura 1. La Figura 2 muestra, en la primera fotograffa de arriba, que los axones de las neuronas no entran en la lesion delimitada por la barrera, 1 semana despues sin implanta del quitosano.

El implante de microparffculas de quitosano de acuerdo con la presente invencion permite, por el contrario, un cruce masivo de los axones a traves de la lesion, a 1 y 3 semanas (observar el intenso marcado fibrilar en el centro de la lesion y orientacion rectilmea del recrecimiento axonal a traves del sitio de la lesion) como se muestra en las dos ultimas fotos de la parte superior, a la derecha (NF) de la Figura 2.

Los analisis morfologicos e inmunohistologicos muestran claramente, por tanto, y de forma impresionante, los cambios que se producen despues del implante de las microparffculas de acuerdo con la invencion en la ME lesionada, en comparacion con una lesion sola sin implante:

- La reaccion glial astrocitaria esta claramente reducida. El cuerpo celular de los astrocitos esta menos atrofiado, sus procesos son mas finos y mas largos, muy frecuentemente orientados hacia el centro de la lesion. Esto hace que la frontera entre tejido intacto y lesionado sea menos clara, por falta de acumulacion de procesos astrocitarios que rodean el sitio de la lesion, de aid la reduccion de la barrera ffsica. Esto demuestra que existe una gran compatibilidad entre el tejido hospedador del implante. Por otra parte, este aspecto morfologico de los astrocitos -orientacion de sus prolongaciones hacia el epicentro de la lesion es un signo de que estas celulas tienen un papel favorable para el recrecimiento de los axones. Ademas, a la entrada del implante, se observa frecuentemente prolongaciones de astrocitos asociados con los axones en recrecimiento, con la misma orientacion (paralela) y a una larga distancia. Una observacion importante que refuerza esta compatibilidad es la presencia de astrocitos (identificacion de su cuerpo celular) en el seno del implante, lo que prueba que estas celulas tambien han migrado al interior del implante. Parece, por tanto, que las microparffculas de quitosano de acuerdo con la invencion forman un sustrato adecuado para este tipo de celulas gliales.

- A pesar del gran tamano de la lesion (3 a 4 mm de ancho), la introduccion de estas microparffculas no aumenta la reaccion inflamatoria (macrofagica) y la cavidad se reduce.

- Mediante el marcado nuclear con DAPI, se ha podido observar que las microparffculas de hidrogel de quitosano estan ocupadas por varias celulas: los macrofagos/microgffa; los astrocitos como se ha indicado anteriormente; las celulas endoteliales que constituyen nuevos vasos. Con este fin, el implante esta bien vascularizado, y la red o la citoarquitectura de la neovascularizacion se realiza de una forma mas organizada (como muestra la Figura 6). En el implante y en el tejido hospedador que rodea el sitio de la lesion, tambien se han identificado varios precursores de oligodendrocitos (celulas que mielinizan los axones del sistema nervioso central), lo que muestra que, en presencia del implante, la proliferacion de las NPC (celulas precursoras neurales multipotentes) endogenas se ve estimulada, y se favorece su diferenciacion hacia el fenotipo de oligodendrocitos. Esta observacion es importante porque se sabe que, despues de una lesion, se produce desmielinizacion en el mismo sitio en axones que no estan danados directamente. Esto sugiere que, mediante la estimulacion de la proliferacion y diferenciacion de los oligodendrocitos, puede tener lugar la reparacion y la remielinizacion, en consecuencia, la actividad electrica neuronal (como muestra la Figura 8). Dichas observaciones presagian por tanto el interes de las microparffculas de hidrogel de quitosano de acuerdo con la invencion para el tratamiento de la esclerosis multiple.

- Lo mas notable es la presencia de un numero importante de axones que atraviesan el sitio de la lesion, como muestra la Figura 2. Estos axones penetran en el implante, tanto hacia arriba como hacia abajo de la lesion. La

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Figura 2 tambien muestra, que la capacidad de recrecimiento se realiza a larga distancia. Estas observaciones se realizan a 1 y 4 semanas despues de la lesion, y se han confirmado posteriormente a los 3 meses de las lesiones. Tambien es interesante resaltar que el recrecimiento axonal en el interior del implante esta asociado con la vascularizacion (como muestra la Figura 7). Efectivamente, se ha demostrado, en un modelo de lesion muy pequena, y mediante obtencion de imagenes biofotonicas in vivo en el animal bajo anestesiado, que los axones que se intentan regenerar son guiados (o ayudados) al principio de su recrecimiento por los vasos circundantes (Dray C, Rougon G, Debarbieux F, Proc Natl Acad Sci U S A. 9 de junio de 2009;106(23):9459-64. dol: 10.1073/pnas.0900222106. Publicacion electronica, 21 de mayo de 2009). En el caso presente, se observa esta asociacion (sobre tejido fijado) despues de varias semanas. Se resalta que el enfoque in vivo en el animal despues de una lesion grave de la medula espinal no es factible.

El conjunto de estas observaciones en el implante confirma que las micropartfculas de quitosano de acuerdo con la invencion constituyen un sustrato, adecuado y atractivo, muy favorable para restaurar la medula espinal traumatizada. Su implante local en el sitio de la lesion crea un entorno favorable para el conjunto de celulas neurales, y resulta ser un sustrato adecuado y atractivo para el crecimiento axonal. Por otra parte, la invasion del implante por las celulas endogenas, y el establecimiento de una vascularizacion permiten recrear un puente tisular entre la parte rostral (hacia la cabeza) y caudal, y evitar que se forme una necrosis que, en el caso de la lesion sola, conduce a la formacion de una cavidad rodeada por una frontera de astrocitos y moleculas para proteger el tejido interno de una propagacion del dano. Ese efecto nunca se ha demostrado, ni siquiera en estrategias que combinen otros enfoques.

Por el contrario, la Figura 3 muestra, en la fotograffa de la izquierda, una reaccion inflamatoria (con el anti-ED1) (a destacar la corona de inmunomarcado alrededor del quitosano) y, en la fotograffa de la derecha, que la vascularizacion (segun inmunomarcado de la laminina) se limita al exterior del quitosano. Asf, esto prueba que el recrecimiento axonal esta bloqueado, y que las reacciones astrocitaria e inflamatoria son importantes. La importante reaccion inflamatoria genera analogamente una neoangiogenesis intensa, y una lesion secundaria mas grande.

Por ultimo, la Figura 4 muestra que la microestructura del implante tiene un impacto muy importante sobre la respuesta tisular. Efectivamente, es necesario utilizar micropartfculas y no un hidrogel monolftico, masivo o en forma de bloque: en este ultimo caso, el recrecimiento axonal queda bloqueado en la frontera del bloque de quitosano por la presencia del material.

De esta forma, estos ensayos muestran, de forma completamente sorprendente, que una suspension de micropartfculas de hidrogel ffsico de quitosano con un grado de acetilacion bajo, permite estimular y guiar el recrecimiento axonal en lesiones traumaticas de la medula espinal, sin provocar inflamacion.

Claims (11)

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   REIVINDICACIONES

   1. Micropartfculas de hidrogel de quitosano de tamano promedio d50, obtenido a partir de una distribucion en numero, comprendido entre 1 y 500 pm, teniendo el quitosano un grado de acilacion menor o igual a 20 % y estando su concentracion en el hidrogel comprendida entre 0,25 y 5 % en peso con respecto al peso total del hidrogel, para su uso en la regeneracion neuronal y/o en la reparacion del sistema nervioso, ventajosamente del sistema nervioso central, y/o en el injerto de neuronas o precursores de celulas neurales y/o en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y/o en el tratamiento de lesiones isquemicas y/o en el tratamiento de paralisis.
2. 2. Micropartfculas de acuerdo con la reivindicacion 1 caracterizadas por que la reparacion, la regeneracion o el tratamiento de paralisis se realiza despues de una lesion traumatica del sistema nervioso, ventajosamente de la medula espinal.
3. 3. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizadas por que su tamano promedio d50, obtenido a partir de una distribucion en numero, esta comprendido entre 5 y 300 pm.
4. 4. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas por que el grado de acetilacion del quitosano es menor de 5 %.
5. 5. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas por que la concentracion de quitosano en el hidrogel es menor de 4 % en peso con respecto al peso total del hidrogel.
6. 6. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas por que el hidrogel es un hidrogel ffsico de quitosano.
7. 7. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas por que se encuentran en forma de una suspension acuosa, que tiene ventajosamente una viscosidad mayor de 1000 Pa.s medida en modo continuo a 22°C para una velocidad de cizallamiento de 0,001 s-1,
8. 8. Micropartfculas de acuerdo con la reivindicacion 7 caracterizadas por que la suspension es inyectable o implantable mediante cirugfa.
9. 9. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizadas por que se mezclan con celulas de Schwann y/o celulas madre y/o factores troficos.
10. 10. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, de la enfermedad de Parkinson o de la esclerosis multiple.
11. 11. Implante que comprende una suspension acuosa de micropartfculas tales como las definidas en la reivindicacion 9.