ES2615888T3 - Plantas tolerantes a herbicidas - Google Patents

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Allan R. Wenck
Leon Neuteboom
Sherry R. Whitt
Dale R. Carlson
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Abstract

Una planta de arroz que comprende un acido nucleico de acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) plastidica de arroz mutagenizado que tiene una secuencia que se obtiene por un metodo de mutagenesis aleatoria inducida y que codifica una ACCasa plastidica de arroz que tiene, como resultado de dicha mutagenesis, una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion de aminoacido correspondiente a la posicion 1.781 de la ACCasa plastidica de Alopecurus myosuroides (Am), en donde la ACCasa plastidica de arroz es una proteina que comprende una version modificada de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y confiere a una planta de arroz tolerancia a 100 g i.a./ha de cicloxidim.

Description

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DESCRIPCION
Plantas tolerantes a herbicidas
El arroz es uno de los cultivos alimentarios mas importantes del mundo, particularmente en Asia. El arroz es un grano de cereal producido por plantas del genero Oryza. Las dos especies que se cultivan mas frecuentemente son Oryza sativa y Oryza glaberrima, siendo la O. sativa el arroz domestico que se cultiva mas frecuentemente. Ademas de las dos especies domesticas, el genero Oryza contiene mas de 20 especies silvestres. Una de estas especies silvestres, Oryza rufipogon (“arroz rojo” al que se hace referencia tambien como Oryza sativa subesp. rufipogon) presenta un gran problema para cultivarlo comercialmente. El arroz rojo produce semillas recubiertas rojas. Tras la cosecha, las semillas de arroz se muelen para retirar su cascara. Tras el molido, el arroz domestico es blanco, mientras que el arroz rojo silvestre esta descolorido. La presencia de semillas descoloridas reduce el valor del cultivo de arroz. Aunque el arroz rojo pertenece a la misma especie que el arroz cultivado (Oryza sativa), su conformacion genetica es muy similar. Esta similitud genetica hace que sea dificil el control con herbicidas del arroz rojo.
Se ha desarrollado un arroz domestico tolerante a los herbicidas de imidazolinona y actualmente se comercializan con la marca comercial CLEARFIELD®. Los herbicidas de imidazolinona inhiben la enzima acetohidroxiacido sintasa (AHAS) de las plantas. Cuando se cultiva el arroz CLEARFIELD®, es posible controlar el arroz rojo y otras semillas por aplicacion de los herbicidas imidazolinona. Desafortunadamente, se han desarrollado semillas y arroz rojo tolerantes al herbicida imidazolinona.
Las enzimas acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa; EC 6.4.1.2) sintetizan malonil-CoA al inicio de la ruta de sintesis de nuevos acidos grasos en los cloroplastos vegetales. La ACCasa en los cloroplastos de herbaceas es un polipeptido simple multifuncional, codificado por el genoma nuclear, muy grande, que se transporta al plastido por medio de un peptido de transito del extremo N. La forma activa en los cloroplastos herbaceos es una proteina homomerica, probablemente un homodimero.
Las enzimas ACCasas en las herbaceas se inhiben por tres clases de principios activos de los herbicidas. Las dos clases mas prevalentes son los ariloxifenoxipropanoatos (“FOP”) y ciclohexanodionas (“DIM”). Ademas de estas dos clases, se ha descrito una tercera clase de fenilpirazolinas (“DEN”).
Se han encontrado varias mutaciones de tolerancia al inhibidor de ACCasa (AIT) en especies herbaceas monocotiledoneas que presentan tolerancia a uno o mas herbicidas DIM o FOP. Ademas, BASF ha comercializado un maiz AIT. Todas dichas mutaciones se han descubierto en el dominio carboxiltransferasa de la enzima ACCasa, y parece que se localizan en un bolsillo de union al sustrato, que altera el acceso al sitio catalitico.
DIM y FOP son herbicidas importantes y serian ventajosos si se pudiera proporcionar un arroz que presentara tolerancia a estas clases de herbicidas. Actualmente, estas clases de herbicidas tienen un valor limitado en la agricultura del arroz. En algunos casos, las mutaciones que inducen tolerancia a herbicidas crean una falta grave de vigor en las plantas tolerantes. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de un arroz AIT que no presente tampoco una falta de vigor. Esta necesidad y otras se cubren con la presente invencion.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a plantas de arroz, semillas de arroz y celulas de arroz tolerantes a los herbicidas, y a metodos para producir y tratar las plantas tolerantes a los herbicidas. Las plantas de arroz, semillas de arroz y celulas de arroz de la presente invencion comprenden un acido nucleico mutado de acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) que tiene una secuencia que se obtiene por un metodo de mutagenesis aleatoria inducida y que codifica una ACCasa plastidica de arroz que tiene, como resultado de dicha mutagenesis, una sustitucion de isoleucina por leucina a una posicion de aminoacido que se corresponde con la posicion 1.781 de la ACCasa plastidica de Alopecurus myosuroides (Am), la ACCasa plastidica de arroz que hace que una planta de arroz tenga tolerancia a 100 g i.a./ha de cicloxidim. En una realizacion, la presente invencion proporciona una planta de arroz tolerante al menos a un herbicida que inhibe la actividad de la acetil-coenzima A carboxilasa a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz. La planta de arroz tolerante al herbicida de la invencion expresa una acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) en la que la secuencia de aminoacidos se diferencia de una secuencia de aminoacido de la acetil-Coenzima A carboxilasa de una planta de arroz de tipo silvestre. Por convencion, se hace referencia normalmente a las mutaciones en los restos de aminoacidos de la ACCasa de monocotiledoneas segun su posicion en la secuencia de ACCasa monomerica plastidica de Alopecurus myosuroides (hierba negra) (Genbank CAC84161.1) y se senala como (Am). Ejemplos de posiciones de aminoacidos adicionales en los que se diferencia una acetil-Coenzima A carboxilasa de una planta de la invencion tolerante a herbicidas de una acetil-Coenzima A carboxilasa de la correspondiente planta de tipo silvestre incluyen, pero no se limitan a, una de las siguientes posiciones: 1.785 (Am), 1.786 (Am), 1.811 (Am), 1.824 (Am), 1.864 (Am), 1.999 (Am), 2.027 (Am),
2.039 (Am), 2.041 (Am), 2.049 (Am), 2.059 (Am), 2.074 (Am), 2.075 (Am), 2.078 (Am), 2.079 (Am), 2.080 (Am),
2.081 (Am), 2.088 (Am), 2.095 (Am), 2.096 (Am), o 2.098 (Am). Ejemplos de las diferencias en estas posiciones de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a, una o mas de las siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido en la posicion
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1.811 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es distinto de glutamina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es distinto de acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es distinto de un alanina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es distinto de valina; el
aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es distinto de aspartato; el aminoacido en la posicion en la posicion 2.079
(Am) es distinto de serina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido en la posicion en la posicion 2.081 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es distinto de cisteina; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es distinto de glicina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es distinto de valina. En algunas realizaciones, la presente invention proporciona una planta de arroz que expresa una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente una o mas de las siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999
(Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido en la posicion 2.039
(Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es glutamico acido; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina.
Tambien se describen en el presente documento metodos para producir plantas tolerantes a herbicida y plantas producidas por dichos metodos. Un ejemplo de planta producida por los metodos descritos en el presente documento es una planta de arroz tolerante a herbicida que es tolerante al menos a un herbicida que inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa a niveles de herbicida de herbicida que inhibirian normalmente el crecimiento de dicha planta, en el que la planta tolerante a herbicida se produce: a) obteniendo celulas de una planta que no es tolerante a herbicida; b) poniendo en contacto las celulas con un medio que comprende uno o mas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa; y c) generando una planta tolerante a herbicidas a partir de las celulas. Las plantas tolerantes a herbicida que se produce por los metodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limita a, plantas tolerantes a herbicidas que se generan llevando a cabo los anteriores a), b) y c) y la progenie de una planta que se genera llevando a cabo los anteriores a), b) y c). Las celulas que se utilizan para la practica de estos metodos de este tipo pueden estar en forma de callo.
La presente invencion proporciona plantas de arroz que expresan enzimas acetil-Coenzima A carboxilasa que comprenden secuencias de aminoacidos determinadas. Por ejemplo, la presente invencion proporciona una planta de arroz, en la que uno o mas de los genomas de dicha planta de arroz codifican una proteina que comprende una version modificada de una o ambas de SEQ ID NO: 2 y 3, en la que la secuencia se modifica de manera que la proteina codificada comprenda una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente uno o mas de los siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina. La Figura 19 posterior proporciona un alineamiento de la secuencia de acetil- Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuro/'des (SEq ID NO: 1), la secuencia de acetil-Coenzima A carboxilasa de Oryza sat/Va tadica (SEQ ID NO: 2) y la secuencia de acetil-Coenzima A carboxilasa de Oryza sat/Va Japonica (SEQ ID NO: 3) indicandose ejemplos de posiciones donde las secuencias de tipo silvestre pueden diferenciarse de las secuencias de la invencion.
En otra realization, la presente invencion comprende semillas depositadas en un deposito aceptable de acuerdo con el Tratado de Budapest, las celulas derivadas de dichas semillas, las plantas que crecen de dichas semillas y las celulas derivadas de dichas plantas. La progenie de las plantas que crece de dichas semillas y las celulas derivadas de dicha progenie. El cultivo de las plantas producidas a partir de las semillas depositadas y la progenie de dichas plantas seran normalmente tolerantes a los herbicidas que inhiben la acetil-Coenzima A carboxilasa que inhibirian normalmente el crecimiento de una planta de tipo silvestre correspondiente. En una realizacion, la presente
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invention proporciona una planta de arroz que crece de una semilla producida de una planta de una cualquiera de las lmeas OsHFI2, OsARWII, OsARWI3, OsARWI8, o OsHFNI, una muestra representativa de semilla de cada lmea se ha depositado en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC) bajo el numero de designation de deposito de patente PTA-10267, PTA-10568, PTA-10569, PTA-10570, o PTA-10571, respectivamente. La presente invencion tambien engloba mutantes, recombinantes, y/o derivados modificados geneticamente preparados a partir de una planta de una cualquiera de las lineas OsHFI2, OsARWII, OsARWI3, OsARWI8, o OsHFNI, habiendose depositado una muestra representativa de semillas de cada linea en la ATCC bajo el numero de designacion de deposito de patente PTA-10568, PTA-10569, PTA-10570, o PTA-10571, respectivamente, asi como cualquier progenie de la planta cultivada o cruzada de una planta de una cualquiera de las lineas OsHFI2, OsARWl1, OsARWI3, OsARWl8, o OsHFN1, habiendose depositado una muestra de semillas de cada linea en la ATCC con el numero de designacion de deposito de patente pTa-10568, PTA-10569, PTA-10570, o PTA-10571, respectivamente, siempre que dichas plantas o progenie tengan las caracteristicas de tolerancia a herbicidas de la planta que se cultiva a partir de una planta de cualquiera de las lineas OsHPHI2, OsARWI1 OsARWI3, OsARWI8, o OsHPHN1, habiendose depositado una muestra representativa de semillas de cada linea en la ATCC bajo el numero de designacion de deposito de patente PTA-10568, PTA-10569, PTA-10570, o PTA-10571, respectivamente. La presente invencion tambien engloba las celulas cultivadas de dichas semillas y plantas y su progenie producida de las celulas cultivadas.
Una planta tolerante a herbicidas de la invencion puede ser un miembro de la especie O. sativa. Las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion son tolerantes normalmente a los herbicidas ariloxifenoxipropionato, herbicidas ciclohexanodiona, herbicidas fenilpirazolina o combinaciones de los mismos a niveles de herbicida que inhibirian normalmente el crecimiento de una planta de tipo silvestre correspondiente, por ejemplo, una planta de arroz. En algunas realizaciones la planta tolerante a herbicidas de la invencion no es una planta GMO. La presente invencion tambien proporciona una planta de arroz tolerante a herbicidas que se ha mutagenizado. La presente invencion tambien engloba celulas derivadas de las plantas y semillas de las plantas tolerantes a herbicidas descritas anteriormente.
La presente invencion se puede utilizar en metodos para controlar el crecimiento de malas hierbas. En particular, la presente invencion se puede utilizar en un metodo para controlar el crecimiento de malas hierbas en la vecindad de las plantas de arroz de la invencion. Dichos metodos pueden comprender la aplicacion a las malas hierbas y las plantas de arroz una cantidad de un herbicida inhibidor de la acetil-Coenzima A carboxilasa que inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa de origen natural, en el que dichas plantas de arroz comprenden una actividad alterada de la acetil-Coenzima A carboxilasa de manera que dichas plantas de arroz son tolerantes a la cantidad de herbicida que se aplica. Los metodos descritos en el presente documento se pueden llevar a la practica con cualquier herbicida que interfiera en la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa incluyendo, pero sin limitarse a, los herbicidas ariloxifenoxipropionato, los herbicidas ciclohexanodiona, los herbicidas fenilpirazolina o combinaciones de los mismos.
Un ejemplo de un metodo para controlar el crecimiento de malas hierbas en la vecindad de las plantas de arroz puede comprender la aplicacion de uno o mas herbicidas a las malas hierbas y a las plantas de arroz a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz, en el que al menos un herbicida inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Dichos metodos se pueden llevar a la practica con cualquier herbicida que inhiba la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos adecuados de herbicidas que se pueden utilizar en la practica de los metodos para controlar las malas hierbas incluyen, pero no se limitan a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos.
Un ejemplo de un metodo para controlar el crecimiento de malas hierbas puede comprender (a) cruzar una planta de arroz tolerante a herbicidas con otro germoplasma de arroz, y recolectar las semillas de arroz hibrido resultantes; (b) plantar la semilla de arroz hibrido; y (c) aplicar uno o mas herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa al arroz hibrido y las malas hierbas de la vecindad del arroz hibrido a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz. Dichos metodos pueden llevarse a la practica con cualquier herbicida que inhiba la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos adecuados de herbicidas que se pueden utilizar en la practica de los metodos para controlar las malas hierbas incluyen, pero no se limitan a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para seleccionar plantas de arroz tolerantes a herbicidas. Un ejemplo de dichos metodos puede comprender (a) cruzar una planta de arroz tolerante a herbicidas con otro germoplasma de arroz, y recolectar la semilla del arroz hibrido resultante; (b) plantar la semilla de arroz hibrido; (c) aplicar uno o mas herbicidas del arroz hibrido a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz, en el que al menos uno de los herbicidas inhibe la acetil-Coenzima A carboxilasa; y (d) recolectar las semillas de las plantas de arroz a las que se ha aplicado el herbicida. Dichos metodos se pueden llevar a la practica con cualquier herbicida que inhiba la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos adecuados de herbicidas que se pueden utilizar en la practica de los metodos para controlar las malas hierbas incluyen, pero no se limitan a, herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos.
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La presente invencion tambien engloba un metodo para cultivar plantas de arroz tolerantes a herbicidas de la invention y aplicar a las plantas y su vecindad un herbicida que inhibe la acetil-Coenzima A carboxilasa en una cantidad que inhiba el crecimiento de una planta de tipo silvestre correspondiente. Un ejemplo de dicho metodo comprende (a) plantar las semillas de arroz; (b) permitir que germinen las semillas de arroz; (c) aplicar uno o mas herbicidas a los brotes de arroz a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz, en el que al menos uno de los herbicidas inhibe la acetil-Coenzima A carboxilasa. Dichos metodos se pueden llevar a la practica con cualquier herbicida que inhiba la actividad de acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos adecuados de herbicidas que se pueden utilizar en la practica de los metodos para controlar las malas hierbas incluyen, pero no se limitan a, herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos.
Las semillas de la presente invencion se pueden utilizar para cultivar plantas de arroz tolerantes a herbicidas, en el que una planta cultivada a partir de las semillas es tolerante a al menos un herbicida que inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz. Ejemplos de herbicidas a los cuales las plantas que crecen a partir de semillas de la invencion serian tolerantes incluyen, pero no se limitan a, herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos.
En otra realization, la presente invencion proporciona una semilla de una planta de arroz, en la que una planta que crece de la semilla expresa una acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) en la que la secuencia de aminoacido se diferencia de una secuencia de aminoacidos de una acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre en la position 1.781 (Am) (por una sustitucion de isoleucina por leucina) y opcionalmente en una o mas de las siguientes posiciones: 1.785 (Am), 1.786 (Am), 1.811 (Am), 1.824 (Am), 1.864 (Am), 1.999 (Am), 2.027 (Am), 2.039 (Am), 2.041 (Am), 2.049 (Am), 2.059 (Am), 2.074 (Am), 2.075 (Am), 2.078 (Am), 2.079 (Am), 2.080 (Am), 2.081 (Am), 2.088 (Am),
2.095 (Am), 2.096 (Am), o 2.098 (Am). Ejemplos de diferencias en estas posiciones de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a, una o mas de las siguientes: el aminoacido de la posicion 1.785 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido de la posicion 1.786 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido de la posicion 1.811 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido de la posicion 1.824 (Am) es distinto de glutamina; el aminoacido de la posicion 1.864 (Am) es distinto de valina; el aminoacido de la posicion 1.999 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido de la posicion 2.027 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido de la posicion 2.039 (Am) es distinto de acido glutamico; el aminoacido de la posicion 2.041 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido de la posicion 2.049 (Am) es distinto de valina; el aminoacido de la posicion 2.059 (Am) es distinto de un alanina; el aminoacido de la posicion 2.074 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido de la posicion 2.075 (Am) es distinto de valina; el aminoacido de la posicion
2.078 (Am) es distinto de aspartato; el aminoacido de la posicion en la posicion 2.079 (Am) es distinto de serina; el aminoacido de la posicion 2.080 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido de la posicion en la posicion 2.081 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido de la posicion 2.088 (Am) es distinto de cisteina; el aminoacido de la posicion
2.095 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido de la posicion 2.096 (Am) es distinto de glicina; o el aminoacido de la posicion 2.098 (Am) es distinto de valina. En algunas realizaciones, una planta cultivada a partir de la semilla puede expresar una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente una o mas de las siguientes: el aminoacido de la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido de la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido de la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido de la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido de la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido de la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido de la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido de la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido de la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido de la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido de la posicion
2.059 (Am) es valina; el aminoacido de la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido de la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido de la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido de la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido de la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido de la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido de la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido de la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido de la posicion 2.095 (Am) es acido glutamico; el aminoacido de la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido de la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina.
La presente invencion engloba semillas de cultivares tolerantes de herbicida especificos. Un ejemplo de dichas semillas es una semilla de arroz del cultivar tadica, en el que una muestra representativa de dicho cultivar se deposito bajo el N° de acceso de la ATCC PTA- PTA-10267, pTa-10568, PTA-10569, o PTA-10570. Otro ejemplo de dichas semillas son los del cultivar Nipponbare tolerante a herbicidas, en los que una muestra representativa de la semilla de dicho cultivar se deposito bajo el N° de acceso de la ATCC PTA-10571. La presente invencion tambien engloba una planta de arroz, o una parte de la misma, producida cultivando las semillas asi como un cultivo tisular de las celulas producidas a partir de las semillas. Los cultivos tisulares de celulas se pueden producir a partir de una semilla directamente o a partir de una parte de una planta cultivada a partir de la semilla. Los cultivos tisulares de las celulas se pueden producir de una semilla directamente o a partir de una planta cultivad a partir de una semilla, por ejemplo, de las hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, celulas meristematicas, raices, apices radicales, pistilos, anteras, flores y/o tallos. La presente invencion tambien incluye plantas y su progenie que se ha generado a partir de cultivos tisulares de celulas. Dichas plantas normalmente tendran todas las caracteristicas morfologicas y fisiologicas del cultivar tadica.
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Tambien se describen en el presente documento metodos para producir una semilla de arroz. Dichos metodos pueden comprender el cruzamiento de una planta de arroz tolerantes a herbicidas con otro germoplasma de arroz; y recolectar la semilla de arroz hibrida resultante, en el que la planta de arroz tolerante a herbicidas en tolerantes a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o
combinaciones de los mismos a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz.
Tambien se describen en el presente documento metodos para producir una semilla F1 de arroz hibrida. Dichos metodos pueden comprender el cruzamiento de una planta de arroz tolerantes a herbicidas con una planta de arroz diferente; y recolectar la semilla F1 de arroz hibrida, en el que la planta de arroz tolerante a herbicidas es tolerante a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o
combinaciones de los mismos a niveles de herbicida que normalmente inhibiria el crecimiento de una planta de arroz.
Tambien se describen en el presente documento metodos para producir plantas F1 hibridas. Dichos metodos
pueden comprender el cruzamiento de una planta tolerante a herbicida con una planta diferente, y recolectar la
semilla F1 hibrida resultante y cultivar la planta F1 hibrida resultante, en la que la planta tolerante a herbicida es tolerante a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta.
Tambien se describen en el presente documento metodos de produccion de plantas de arroz tolerantes a herbicidas que pueden comprender tambien un transgen. Un ejemplo de dicho metodo puede comprender la transformacion de una celulas de una planta de arroz con un transgen, en el que el transgen codifica una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que confiere tolerancia a al menos un herbicida que se selecciona de entre el grupo que consiste en herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o
combinaciones de los mismos. Se puede utilizar cualquier celula adecuada en la practica de los metodos descritos en el presente documento, por ejemplo, la celulas puede estar en forma de un callo. El transgen puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacido que comprende una version modificada de una o ambas de SEQ ID NO: 2 y 3, en las que la secuencia se modifica de manera que codifica una proteina que comprende uno o mas de lo siguiente el aminoacido en la posicion 1.781 (Am) es leucina, treonina, valina, o alanina; el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion
2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina. Otro ejemplo de un metodo de produccion de una planta tolerante a herbicidas comprende un transgen que puede comprender trasformar una celula de una planta de arroz con un transgen que codifica una enzima que confiere tolerancia a herbicidas, en el que la celulas se produjo a partir de una planta de arroz o una semilla de la misma que expresa una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que confiere tolerancia a al menos un herbicida que se selecciona de entre el grupo que consiste en herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos. Se puede utilizar cualquier celulas adecuada en la practica de los metodos que se describen en el presente documento, por ejemplo, la celulas puede estar en forma de callo.
Ademas, se describen en el presente documento metodos de produccion de plantas recombinantes. Un ejemplo de un metodo para producir una planta recombinante de arroz puede comprender transformar una celula de una planta de arroz con un transgen, en el que la celulas producida de una planta de arroz que expresa una enzima acetil- Coenzima A carboxilasa que confiere tolerancia a al menos un herbicida se selecciona de entre el grupo que consiste en herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos. Se puede utilizar cualquier celula adecuada en la practica de los metodos que se describen en el presente documento, por ejemplo, la celulas puede estar en forma de callo. Un transgen para su uso en los metodos descritos en el presente documento puede comprender cualquier secuencia de acido nucleico deseada, por ejemplo, el transgen puede codificar una proteina. En un ejemplo, el transgen puede codificar una enzima, por ejemplo, una enzima que modifique el metabolismo de acidos grasos y/o el metabolismo de carbohidratos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fructosiltransferasa, levosacarasa, alfa-amilasa, invertasa y enzima de ramificacion de almidon o que codifica una antisentido de estearil-ACP desaturasa.
Los metodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir una planta, por ejemplo, una planta de arroz, que tienen cualquier caracteristica deseada. Un ejemplo de dicho metodo puede comprender: (a)
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cruzar una planta de arroz que se tolerante a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz con una planta de otro cultivar de arroz que comprende la caracteristica deseada para producir una progenie de plantas; (b) seleccionar una o mas de las plantas de la progenie que tengan la caracteristica deseada para producir plantas de la progenie seleccionadas; (c) cruzar las plantas de la progenie seleccionadas con las plantas tolerantes a herbicidas para producir un retrocruzamiento de plantas de la progenie;
(d) seleccionar entre la progenie del retrocruzamiento las plantas que tienen la caracteristica deseada y tolerancia a herbicidas; y (e) repetir los pasos (c) y (d) tres o mas veces sucesivas para producir plantas de la cuarta o mayor progenie de retrocruzamiento que comprenden la caracteristica deseada y la tolerancia a herbicidas. Se puede introducir cualquier caracteristica deseada utilizando los metodos descritos en el presente documento. Ejemplos de caracteristicas que se puede desear incluir, pero no limitados a, son esterilidad masculina, tolerancia a herbicidas, tolerancia a la sequia, resistencia a insectos, metabolismo de acidos grasos modificado, metabolismo de carbohidratos modificado y resistencia a enfermedades bacterianas, enfermedades fungicas o enfermedades viricas. Un ejemplo de un metodo para producir una planta de arroz masculina esteril puede comprender transformar la planta de arroz tolerantes a al menos un herbicida que inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz con una molecula de acido nucleico que confiera la esterilidad masculina.
Ademas, se describen en el presente documento composiciones que comprenden celulas vegetales, por ejemplo, celulas de una planta de arroz. Un ejemplo de dicha composicion comprende una o mas celulas de una planta de arroz, y un medio acuoso, en el que el medio comprende un compuesto que inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Las celulas se pueden derivar de una planta de arroz tolerante a herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos a niveles de herbicida que normalmente inhibirian el crecimiento de una planta de arroz. Se puede utilizar cualquier compuesto que inhiba la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa en las composiciones que se describen en el presente documento, por ejemplo, uno o mas de herbicidas de ariloxifenoxipropionato, herbicidas de ciclohexanodiona, y herbicidas de fenilpirazolina, o combinaciones de los mismos.
La presente invencion comprende moleculas de acido nucleico aisladas que codifican una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que esta comprendida por las plantas, semillas o celulas de la invencion. En algunas realizaciones, la invencion comprende una molecula de acido nucleico aislada y opcionalmente recombinante y/o sintetica que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) de arroz en la que la secuencia de aminoacidos se diferencia de una secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de una planta de arroz de tipo silvestre en la posicion 1,781 (Am) y opcionalmente en una o mas de las siguientes posiciones: 1,785 (Am), 1,786 (Am), 1,811 (Am), 1,824 (Am), 1,864 (Am), 1,999 (Am), 2,027 (Am), 2,039 (Am), 2,041 (Am), 2,049 (Am), 2,059 (Am), 2,074 (Am),
2,075 (Am), 2,078 (Am), 2,079 (Am), 2,080 (Am), 2,081 (Am), 2,088 (Am), 2,095 (Am), 2,096 (Am), o 2,098 (Am). Ejemplos de diferencias en estas posiciones de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a , una o mas de las siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es distinto de glutamina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es distinto de acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion
2.059 (Am) es distinto de una alanina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es distinto de aspartato; el aminoacido en la posicion en la posicion 2.079 (Am) es distinto de serina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido en la posicion en la posicion 2.081 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es distinto de cisteina; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es distinto de glicina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es distinto de valina. en algunas realizaciones, un acido nucleico de la invencion puede codificar una enzima acetil- Coenzima A carboxilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que comprenden una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente una o mas de las siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion
2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion
2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina. En algunas realizaciones, la invencion comprende un acido nucleico aislado y opcionalmente recombinante y/o sintetico que codifica una proteina que comprenden en todo o en parte una version modificada de una o ambas de SEQ ID NO: 2 y 3, en el que la secuencia se modifica de manea que la proteina codificada
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comprende una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente una de las siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina.
Ademas se describe en el presente documento una planta de un clado BEP tolerante a herbicidas. Normalmente dicha planta es la que tiene un aumento de tolerancia a un inhibidor de ACCasa (ACCI) en comparacion con la variedad de tipo silvestre de la planta. Dichas plantas pueden producirse por un proceso que comprende:
(I) las etapas de
(a) proporcionar celulas vegetales de un clado BEP que tiene un primer nivel, cero o no cero de tolerancia a ACCI;
(b) cultivar las celulas en contacto con un medio para formar un cultivo celular;
(c) poner en contacto las celulas de dicho cultivo con un ACCI;
(d) cultivar las celulas en contacto con un ACCI de la etapa (c) para formar un cultivo que contiene celulas que tienen un nivel de tolerancia a ACCI mayor que el primer nivel de la etapa (a); y
(e) generar, a partir de las celulas tolerantes de la etapa (d), una planta que tienen un nivel de tolerancia a ACCI mayor que el de la variedad de tipo silvestre de la planta; o
(II) las etapas de
(f) proporcionar una primera planta de un clado BEP tolerante a herbicidas que tiene un aumento de la tolerancia a un inhibidor de la ACCasa (ACCI) en comparacion con una variedad de tipo silvestre de la planta, habiendo sido dicha planta tolerante a herbicidas producida por un proceso que comprende las etapas de (a)-
(e); y
(g) producir a partir de la primera planta una segunda planta de un clado BEP tolerante a herbicidas que mantienen el aumento de las caracteristicas de tolerancia a herbicidas de la primera planta;
obteniendo de esta manera una planta de un clado BEP tolerante a herbicidas.
La planta del clado BEP tolerante a herbicidas que se describe en el presente documento puede ser una planta del subclado BET.
La planta del subclado BET tolerante a herbicida que se describe en el presente documento puede ser una planta de cultivo BET.
La planta tolerante a herbicidas que se describe en el presente documento puede ser un miembro del subclado Bambusoideae-Ehrhartoideae. Se puede utilizar cualquier medio adecuado para cultivas celulas vegetales en el proceso que se describe en el presente documento. El medio puede comprender un mutageno. De manera alternativa, el medio puede no comprender un mutageno. Una planta tolerante a herbicidas que se describe en el presente documento puede ser un miembro de la subfamilia Ehrhartoideae. Se puede utilizar cualquiera de las celulas adecuadas en la practica de los metodos que se describen en el presente documento, por ejemplo, las celulas pueden estar en forma de un callo. La planta tolerante a herbicidas de la invencion puede ser un miembro del genero Oryza, por ejemplo, puede ser un miembro de la especie O. sat/'va.
Las plantas de clado BEP tolerantes a herbicidas que se producen con los metodos anteriores pueden expresar una acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) en la que la secuencia de aminoacidos se diferencia de una secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de una planta de un clado BEP correspondiente con el tipo silvestre en una o mas de las siguientes posiciones: 1.781 (Am), 1.785 (Am), 1.786 (Am), 1.811 (Am), 1.824 (Am), 1.864 (Am), 1.999 (Am), 2.027 (Am), 2.039 (Am), 2.041 (Am), 2.049 (Am), 2.059 (Am), 2.074 (Am), 2.075 (Am), 2.078 (Am), 2.079 (Am), 2.080 (Am), 2.081 (Am), 2.088 (Am), 2.095 (Am), 2.096 (Am), o 2.098 (Am). Ejemplos de
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diferencias en estas posiciones de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a una o mas de las siguientes: el aminoacido en la posicion 1.781 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es distinto de alanina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es distinto de glutamina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es distinto de acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es distinto de un alanina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es distinto de triptofano; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es distinto de valina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es distinto de aspartato; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es distinto de serina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) es distinto de isoleucina; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es distinto de cisteina; el aminoacido en la posicion
2.095 (Am) es distinto de lisina; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es distinto de glicina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es distinto de valina. La planta del clado BEP tolerante a herbicidas descrito en el presente documento puede expresar una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una secuencia de aminoacidos que comprende uno o mas de los siguientes: el aminoacido en la posicion 1.781 (Am) es leucina, treonina, valina, o alanina; el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina o metionina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, o triptofano; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina.
En una realizacion, la presente invencion incluye tambien plantas de arroz que son tolerantes a los inhibidores de la ACCasa gracias a que solo tienen una sustitucion (una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) en la ACCasa plastidica en comparacion con la ACCasa de tipo silvestre correspondiente. En otra realizacion mas, la invencion incluye plantas de arroz que son tolerantes a los inhibidores de ACCasa gracias a que tienen una o mas sustituciones adicionales en su ACCasa plastidica en comparacion con la ACCasa de tipo silvestre correspondiente.
En una realizacion, la presente invencion proporciona plantas de arroz que son tolerantes a los inhibidores de la ACCasa gracias a que tienen dos o mas sustituciones en su ACCasa plastidica en comparacion con la ACCasa de tipo silvestre correspondiente, en la que las sustituciones son una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y una o mas sustituciones adicionales en las posiciones de aminoacidos que se seleccionan de entre el grupo que consiste en 1,781 (Am), 1,785 (Am), 1,786 (Am), 1,811 (Am), 1,824 (Am), 1,864 (Am), 1,999 (Am), 2,027 (Am), 2,039 (Am), 2,041 (Am), 2,049 (Am), 2,059 (Am), 2,074 (Am), 2,075 (Am), 2,078 (Am), 2,079 (Am), 2,080 (Am),
2,081 (Am), 2,088 (Am), 2,095 (Am), 2,096 (Am), o 2,098 (Am).
En una realizacion, la presente invencion proporciona plantas de arroz en las que las plantes de arroz comprenden una ACCasa plastidica que no es transgenica. En una realizacion, la presente invencion proporciona plantas en las que las plantas comprenden una ACCasa plastidica de arroz que es transgenica.
Ademas, se describen en el presente documento metodos para controlar el crecimiento de malas hierbas en la vecindad de una planta de arroz, que comprende aplicar a las malas hierbas y las plantas de arroz una cantidad de un herbicida inhibidor de la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa de origen natural, en el que dichas plantas de arroz comprenden una actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa alterada de manera que las plantas de arroz son tolerantes a la cantidad de herbicida que se aplica.
Ademas, se describen en el presente documento metodos para producir semillas que comprenden: (i) sembrar las semillas producidas de una planta de la invencion, (ii) cultivar las plantas de las semillas y (iii) recolectar las semillas de las plantas.
Tambien se describen plantas de un clado BEP tolerante a herbicidas que se producen por el proceso de (a) cruzar o retrocruzar una planta cultivada a partir de una semilla de una planta de un clado BEP tolerante a herbicidas producida como se ha descrito anteriormente con otro germoplasma; (b) cultivar las plantas resultantes de dicho cruzamiento o retrocruzamiento en presencia de al menos un herbicida que normalmente inhibe la acetil-Coenzima A carboxilasa, a niveles del herbicida que normalmente inhibiria el crecimiento de una planta; y (c) seleccionar plantas para posterior propagacion que resulten de dicho cruzamiento o retrocruzamiento, en el que las plantas seleccionadas son plantas que crecen sin un dano significativo en presencia del herbicida.
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La presente invencion tambien engloba una molecula de acido nucleico aislada y opcionalmente recombinante o sintetica que comprende una secuencia de nucleotido que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa mutagenizada de una planta en el clado BEP de la Familia Poaceae, en la que la secuencia de aminoacido de la acetil-Coenzima A carboxilasa mutagenizada se diferencia de una secuencia de aminoacidos de una acetil-Coenzima A carboxilasa de la planta del tipo silvestre correspondiente en la posicion 1.781 (Am) (por una sustitucion de una isoleucina por una leucina) y opcionalmente en una o mas de las siguientes posiciones: 1.785 (Am), 1.786 (Am), 1.811 (Am), 1.824 (Am), 1.864 (Am), 1.999 (Am), 2.027 (Am), 2.039 (Am), 2.041 (Am), 2.049 (Am), 2.059 (Am), 2.014 (Am), 2.075 (Am), 2.078 (Am), 2.079 (Am), 2.080 (Am), 2.081 (Am), 2.088 (Am), 2.095 (Am), 2.096 (Am), o 2.098 (Am). Dicha molecula de acido nucleico se puede producir por un proceso que comprende:
(I) las etapas de
(a) proporcionar celulas de una planta de un clado BEP que tiene un primer nivel, de cero o no cero de tolerancia a un inhibidor de la ACCasa (ACCI);
(b) cultivar las plantas en contacto con un medio para formar un cultivo celular;
(c) poner en contacto celulas de dicho cultivo con un ACCI;
(d) cultivar las celulas que se pusieron en contacto con un ACCI de la etapa (c) para formar un cultivo que contienen celulas que tienen un nivel de tolerancia a ACCI mayor que el primer nivel de la etapa (a); y
(e) generar, a partir de las celulas tolerantes a ACCI de la etapa (d), una planta que tiene un nivel de tolerancia a ACCI mayor que la de la variedad de la planta de tipo silvestre; o
(II) las etapas de
(f) proporcionar una primera planta de un clado BEP tolerante a herbicidas que tiene un aumento de tolerancia a un inhibidor de ACCasa (ACCI) en comparacion con la variedad de tipo silvestre de la planta, habiendose producido dicha planta tolerante a herbicidas por un proceso que comprende las etapas (a)-(e); y
(g) producir a partir de la primera planta una segunda plante de un clado BEP tolerante a herbicidas que mantiene el aumento de tolerancia a herbicidas caracteristica de la primera planta;
obteniendo de esta manera una planta de un clado BEP tolerante a herbicidas; y aislando un acido nucleico de la planta del clado BEP tolerante a herbicidas.
Ademas, se describen en el presente documento, metodos de exploracion, aislamiento, identificacion, y/o caracterizar las mutaciones tolerantes a herbicidas en las ACCasas plastidicas de monocotiledoneas. Se pueden utilizar los callos, o las lineas celulares vegetales. El material o celulas vegetales se pueden cultivar en un ambiente de cultivo tisular. Puede estar presente una membrana de nailon en el ambiente de cultivo tisular. El ambiente de cultivo tisular puede comprender un medio en fase liquida. De manera alternativa, el ambiente puede comprender medios semisolidos. El material vegetal se puede cultivar en presencia de herbicida (por ejemplo. cicloxidim) en medio liquido seguido por el cultivo en medio semisolido con herbicida De manera alternativa, el material vegetal se puede cultivar en presencia de herbicida en un medio semisolido seguido por el cultivo en medio liquido con herbicida.
Se puede aplicar directamente una dosis letal de herbicida (por ejemplo, cicloxidim). De manera alternativa, la dosis de herbicida puede aumentarse poco a poco, comenzando con una dosis sub-letal. Se pueden utilizar uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, o mas herbicidas en una etapa, o concurrentemente.
Se puede determinar la frecuencia de mutaciones por el numero de clones tolerantes a herbicidas mutantes como una fraccion del numero de callos individuales utilizados en el experimento. Por ejemplo, la frecuencia de mutaciones puede ser al menos del 0,03 % o mayor tal como al menos del 0,03 %, al menos del 0,05 %, al menos del 0,10 %, al menos del 0,15 %, al menos del 0,20 %, al menos del 0,25 %, al menos del 0,30 %, al menos del 0,35 %, al menos del 0,40 % o mayor. Las frecuencias de mutaciones pueden ser al menos de 2 veces, al menos de 3 veces, al menos de 4 veces, al menos de 5 veces, al menos de 6 veces, al menos de 7 veces, al menos de 8 veces, al menos de 9 veces, al menos de 10 veces o mayores que con otros metodos de exploracion, aislamiento, identificacion, y/o caracterizacion de las mutaciones tolerantes a herbicidas en ACCasas plastidicas de monocotiledoneas.
Los metodos descritos en el presente documento pueden englobar la identificacion de mutaciones tolerantes a herbicidas en la ACCasa. Ademas, se pueden recapitular las mutaciones tolerantes a herbicidas en celulas de plantas monocotiledoneas.
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En algunas realizaciones, la invencion engloba una celula o tejido aislado que tienen dicha celula o tejido de origen vegetal: a) una deficiencia en la actividad de la ACCasa derivada de un gen de la ACCasa de un huesped (es decir, endogeno); y b) una actividad ACCasa de un gen de la ACCasa plastidica del arroz como se describe en el presente documento.
Fuentes monocotiledoneas de ACCasa
Se describe adicionalmente en el presente documento ACCasas plastidicas o partes de las mismas de la familia de monocotiledoneas o plantas como se describe en el presente documento.
Ademas, se describe en el presente documento la exploracion de mutantes tolerantes a herbicidas de ACCasa plastidica de monocotiledoneas en celulas vegetales huesped.
Las celulas huesped preparadas se pueden utilizar para explorar mutantes tolerantes a herbicidas de ACCasa plastidica de monocotiledoneas. La celulas huesped que se describe en el presente documento puede carecer de actividad de ACCasa plastidica. De manera alternativa, las celulas huesped descritas en el presente documento puede expresar una ACCasa plastidica de monocotiledonea que es sensible a los herbicidas.
Los metodos descritos en el presente documento pueden comprender celulas huesped deficientes en la actividad de ACCasa debido a una mutacion del gen de la ACCasa plastidica genomico que incluye una unica mutacion puntual, multiples mutaciones puntuales, una delecion parcial, inactivacion parcial, una delecion completa y una inactivacion completa. De manera alternativa, la actividad de la ACCasa plastidica genomica se reduce o abole utilizando otras tecnicas de biologia molecular tales como ARNi, ARNip o ARN antisentido. Tales tecnicas de biologia molecular se conocen bien en la tecnica. En otra alternativa mas, la actividad de la ACCasa derivada del genoma se puede reducir o abolir por un inhibidor metabolico de la ACCasa.
La celula huesped puede ser una celula vegetal huesped de monocotiledoneas.
Ademas, se describe un metodo para producir una celula vegetal transgenica que comprende: a) aislar una celula que tiene un origen vegetal de monocotiledonea; b) inactivar al menos una copia de un gen de ACCasa genomico; c) proporcionar un gen de la ACCasa plastidica derivada de monocotiledoneas a dicha celula; d) aislar la celulas que comprenden el gen de la ACCasa plastidica derivada de monocotiledoneas; y opcionalmente; e) inactivar al menos una copia adicional de un gen de la ACCasa genomico y en el que dicha celula es deficiente en la actividad de ACCasa proporcionada por el gen de la ACCasa genomico.
La frecuencia de mutaciones tolerantes a cicloxidim puede ser mayor del 0,03 %.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que las celulas o tejidos vegetales tolerantes al cicloxidim tambien son tolerantes a otros inhibidores de la ACCasa.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que las celulas o tejidos vegetales tolerantes a cicloxidim solo comprenden una mutacion no presente en la ACCasa plastidica de monocotiledonea anterior al cultivo en presencia del herbicida.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que las celulas o tejidos vegetales tolerantes a cicloxidim comprende dos o mas mutaciones no presentes en la ACCasa plastidica de monocotiledonea anterior al cultivo en presencia del herbicida.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que el cicloxidim esta presente a una dosis sub-letal.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que el cultivo en presencia de cicloxidim se lleva a cabo aumentando gradualmente o poco a poco las concentraciones de cicloxidim.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que el metodo comprende el cultivo de celulas sobre una membrana. Preferentemente, el metodo de exploracion comprende el cultivo de celulas sobre una membrana de nailon.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para explorar celulas vegetales tolerantes al cicloxidim, en el que las celulas se cultivan en un medio liquido o un medio semisolido.
Ademas, se describe en el presente documento un metodo para la exploracion, en el que el metodo comprende adicionalmente comprende la identificacion de la al menos una mutacion no presente en la ACCasa plastidica de monocotiledoneas exogena antes del cultivo en presencia de cicloxidim.
En el metodo para la exploracion descrito en el presente documento dicha monocotiledonea puede ser el arroz.
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En el metodo para la exploracion descrito en el presente documento dicha ACCasa plastidica de monocotiledonea puede ser del arroz.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico de barras que muestra el crecimiento relativo de los callos de arroz derivados de Oryza sativa subesp. indica cultivados en presencia de niveles de seleccion diferentes de herbicida. La Figura 1A muestra los resultados obtenidos con tepraloxidim, la Figura 1B muestra los resultados obtenidos con setoxidim, y la Figura 1C muestras los resultados obtenidos con cicloxidim.
La Figura 2 es un diagrama del proceso de seleccion utilizado para producir plantas de arroz tolerantes a herbicidas.
La Figura 3 muestra fotografias de plantas tomadas una semana despues del tratamiento con herbicida.
La Figura 4 muestra fotografias tomadas dos semanas despues del tratamiento con herbicida.
La Figura 5 proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides (numero de acceso de Genbank CAC84161).
La Figura 6 proporciona el ARNm que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides (numero de acceso de GenBank AJ310767 region 157...7119) (SEQ ID NO: 4).
La Figura 7A proporciona la secuencia de nucleotidos genomicos del gen de acetil-Coenzima A carboxilasa de Oryza sativa indica y Japonica (SEQ ID NO: 5).
La Figura 7B proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Oryza sativa Indica y Japonica (SEQ ID NO: 6).
La Figura 7C proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Oryza sativa Indica (SEQ ID NO: 3).
La Figura 8A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Zea mays (SEQ ID NO: 11).
La Figura 8B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa (SEQ ID NO: 12).
La Figura 9A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Zea mays (SEQ ID NO: 13).
La Figura 9B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Zea mays (SEQ ID NO: 14).
La Figura 10A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Triticum aestivum (SEQ ID NO: 15).
La Figura 10B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Triticum aestivum (SEQ ID NO: 16).
La Figura 11A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Setaria italica (SEQ ID NO: 17).
La Figura 11B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Setaria italica (SEQ ID NO: 18).
La Figura 12A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Setaria italica (SEQ ID NO: 19).
La Figura 12B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Setaria italica (SEQ ID NO: 20).
La Figura 13A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Setaria italica (SEQ ID NO: 21).
La Figura 13B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Setaria italica (SEQ ID NO: 22).
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La Figura 14A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides (SEQ ID NO: 23).
La Figura 14B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides (sEq ID NO: 24).
La Figura 15A proporciona la secuencia de nucleotidos que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de Aegilops tauschii (SEQ ID NO: 25).
La Figura 15B proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Aegilops tauschii (SEQ ID NO: 26).
La Figura 16 proporciona una comparacion de mutantes unicos y dobles.
La Figura 17 proporciona un grafico que muestra los resultados de arroz mutante frente a varios inhibidores de ACCasa.
La Figura 18 proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides (N° de acceso de GenBank CAC84161). Los aminoacidos que se pueden alterar en las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas comprendidas en la plantas de la invencion se indican en negrita subrayados dos doble.
La Figura 19 proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Oryza sativa de tipo silvestre alineada con la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides con algunos restos criticos senalados.
Descripcion detallada de la invencion
Definicion
Como se utiliza en el presente documento, “tolerante” o “tolerante a herbicidas” indica una planta o parte de la misma capaz de crecer en presencia de una cantidad de herbicida que normalmente produce la inhibicion del crecimiento en una planta no tolerante o una parte de ella (por ejemplo, un tipo silvestre). Los niveles de herbicida que normalmente producen la inhibicion del crecimiento en una planta no tolerante se conocen y son determinados facilmente por los expertos en la tecnica. Ejemplos incluyen las cantidades recomendadas por los fabricantes para la aplicacion. La tasa maxima es un ejemplo de cantidad de herbicida que normalmente inhibiria el crecimiento de una planta no tolerante.
Como se utiliza en el presente documento, “recombinante” se refiere a un organismo que tiene un material genetico de distintas fuentes.
Como se utiliza en el presente documento, “mutagenizado” se refiere a un organismo que tienen un material genetico alterado en comparacion con el material genetico de un organismo de tipo silvestre correspondiente, en el que las alteraciones en el material geneticos se inducen y/o seleccionan por la accion del ser humano. Ejemplos de la accion del ser humano que pueden producir un organismo mutagenizado incluyen, pero no se limitan a, el cultivo tisular de celulas vegetales (por ejemplo, callos) en concentraciones sub-letales de herbicidas (por ejemplo inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa tales como cicloxidim o setoxidim), tratamiento de celulas vegetales con un mutageno quimico y la seleccion posterior con herbicidas (por ejemplo inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa); o por el tratamiento de celulas vegetales con rayos x y la seleccion posterior con herbicidas (por ejemplo, inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa tales como cicloxidim o setoxidim). Se puede utilizar cualquier metodo conocido en la tecnica para inducir mutaciones. Los metodos para inducir mutaciones pueden inducir mutaciones en posiciones aleatorias del material genetico o pueden inducir mutaciones en localizaciones especificas del material genetico (es decir, pueden ser tecnicas de mutagenesis dirigida).
Como se utiliza en el presente documento, un “organismo modificado geneticamente” (GMO) es un organismo cuyas caracteristicas geneticas se han alterado por la insercion de un material genetico de otro organismo fuente o la progenie de los mismos que mantienen el material genetico insertado. El organismo fuente puede ser un tipo de organismo diferente (por ejemplo, una planta GMO puede contener material genetico bacteriano) o del mismo tipo de organismo (por ejemplo, una planta GMO puede contener material genetico de otra planta). Como se utiliza en el presente documento, recombinante y GMO se consideran sinonimos e indican la presencia de material genetico de una fuente diferente mientras que mutagenizado indica el material genetico alterado de un organismo de tipo silvestre correspondiente pero no el material genetico de otro organismo fuente.
Como se utiliza en el presente documento, “tipo silvestre” o “planta de tipo silvestre correspondiente” significa la forma tipica de un organismo o su material genetico, segun se produce normalmente, segun se distingue de las formas mutagenizadas o recombinantes.
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Para la presente invention, las expresiones “tolerante a herbicidas” y “resistente a herbicidas” se utilizan de manera intercambiable y tienen la intention de tener un significado equivalente y un alcance equivalente. De manera similar las expresiones “tolerancia a herbicidas” y “resistencia a herbicidas” se utilizan de manera intercambiable y tienen la intencion de tener un significado equivalente y un alcance equivalente. De manera similar, los terminos “tolerante” y “resistente” se utilizan de manera intercambiable y tienen la intencion de tener un significado equivalente y un alcance equivalente.
Como se utiliza en el presente documento con respecto a los herbicidas utiles en varias realizaciones de los mismos, expresiones tales como herbicida auxinico, inhibidor de AHAS, inhibidor de acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa), inhibidor de PPO, inhibidor de EPSPS, imidazolina, sulfonilurea, y similares, se refieren a los ingredientes activos (a.i.) de herbicidas agronomicamente aceptables que se reconocen en la tecnica. De manera similar, los terminos fungicida, plaguicida, y similares se refieren a otros ingredientes activos reconocidos en la tecnica.
Cuando se utiliza en referencia a una enzima o polipeptido mutante en particular, las expresiones tales como tolerante a herbicidas (HT) y tolerancia a herbicidas se refieren a la capacidad de dicha enzima o polipeptido para llevar a cabo su actividad fisiologica en presencia de una cantidad de a.i. de un herbicida que normalmente inactivaria o inhibiria la actividad de la version de tipo silvestre (no mutante) de dicha enzima o polipeptido. Por ejemplo, cuando se utilizan especificamente con respecto a una enzima AHAS, o polipeptido AHASL, se refiere especificamente a la capacidad para tolerar un inhibidor de AHAS. Las clases de inhibidores de AHAS incluyen sulfonilureas, imidazolinona, triazolopirimidinas, sulfonilaminocarboniltriazolinonas, y primidiniloxi[tio]benzoatos.
Como se utiliza en el presente documento, “descendiente” se refiere a cualquier generation de plantas.
Como se utiliza en el presente documento, “progenie” se refiere a una primera generacion de plantas.
Plantas
Se describen en el presente documento las plantas monocotiledoneas tolerantes a herbicidas de la familia de herbaceas Poaceae. La familia Poaceae se puede dividir en dos clados principales, el clado que contiene las subfamilias Bambusoideae, Ehrhartoideae, y Pooideae (el clado BEP) y el clado que contiene las subfamilias Panicoideae, Arundinoeae, Chloridoideae, Centotecoideae, Micrairaiderae, Aristidoideae, y Dantonioideae (el clado PACCMAD). La subfamilia Bambusoideae incluye la tribu Oryzeae. La presente invencion se refiere a plantas del clado BEP, en particular plantas de la subfamilia Ehrhartoideae, a saber, plantas de arroz. Las plantas de la invencion normalmente son tolerantes a al menos un herbicida que inhibe la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa como resultado de la expresion de una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa de la invencion como se describe posteriormente. El clado BET incluye las subfamilias Bambusoideae, Ehrhartoideae, y el grupo Triticodae y ninguno mas de los grupos de la subfamilia Pooideae. Las plantas BET de cultivo son plantas que se cultivan para alimentation o forraje que son miembros del subclado BET, por ejemplo, cebada, maiz, etc.
Las monocotiledoneas tolerantes a herbicidas de importancia comercial que se describen en el presente documento incluyen la cana de azucar (Saccharum spp.) asi como los cespedes, por ejemplo, Poa pratensis (hierba azul), Agrostis spp. (agrostis), Lolium spp. (Raigras), Festuca spp. (festucas), Zoysia spp. (Zoysia), Cynodon (hierba de bermudas), Stenotaffrum secundatum (hierba de San Agustin), Paspalum spp. (hierba de bahia), Eremochloa ofiuroides (hierba de ciempies), Axonopus spp (hierba alfombra), Bouteloua dactyloides (hierba de bufalo), y Bouteloua var. spp. (grama).
Se describen en el presente documento las plantas tolerantes a herbicidas de la subfamilia Bambusoideae. Dichas plantas normalmente son tolerantes a uno o mas herbicidas que inhiben la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos de plantas tolerantes a herbicidas de la subfamilia Bambusoideae incluyen, pero no se limitan a, las de los generos Arundinaria, Bambusa, Chusquea, Guadua, y Shibataea.
Ademas, se describen en el presente documento las plantas tolerantes a herbicidas de la subfamilia Ehrhartoideae. Dichas plantas normalmente son tolerantes a uno o mas herbicidas que inhiben la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos de plantas tolerantes a herbicidas de la subfamilia Ehrhartoideae incluyen, pero no se limitan a, las de los generos Erharta, Leersia, Microlaena, Oryza, y Zizania.
Ademas, se describen en el presente documento las plantas tolerantes a herbicidas de la subfamilia Pooideae. Dichas plantas normalmente son tolerantes a uno o mas herbicidas que inhiben la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa. Ejemplos de plantas tolerantes a herbicidas de la subfamilia Pooideae incluyen, pero no se limitan a, las de los generos Triticeae, Aveneae, y Poeae.
Las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion son plantas de arroz. Las dos plantas de arroz mas frecuentemente cultivadas son Oryza sativa y Oryza glaberrima. Muchas subespecies de Oryza sativa son importantes comercialmente incluyendo Oryza sativa subesp. Indica, Oryza sativa subesp. japonica, Oryza sativa subesp. javanica, Oryza sativa subesp. glutinosa (arroz glutinoso), el grupo de Oryza sativa Aromatica (por ejemplo, basmati) y Oryza sativa (grupo de arroz flotante). La presente invencion engloba las plantas de arroz tolerantes a
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herbicidas de todas las especies y subespecies mencionadas anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento las plantas de trigo tolerantes a herbicidas. Se cultivan mas frecuentemente dos especies de trigo, Triticum aestivum, y Triticum turgidum. Otras muchas especies son importantes comercialmente incluyendo pero sin limitacion a, Triticum timofeevii, Triticum monococcum, Triticum zhukovskyi y Triticum urartu e hibridos de los mismos. Ejemplos de subespecies de T. aestivum son estivum (trigo comun), compactum (trigo club), macha (trigo macha), vavilovi (trigo vavilovi), spelta y sfaecrococcum ( (trigo shot). Ejemplos de subespecies de T. turgidum son turgidum, cartlicum, dicoccon, durum, palcoclochictma, polonicum, turanicum, y dicoccoides. Ejemplos de subespecies de T. monococcum son monococcum (einkorn) y aegilopoides. La planta de trigo puede ser un miembro de especies de Triticum aestivum, y mas particularmente el cultivar CDC Teal.
Ademas, se describen en el presente documento plantas de cebada tolerantes a herbicidas. Dos especies son las que se cultivan mas frecuentemente, Hordeum vulgare y Hordeum arizonicum. Muchas otras especies son comercialmente importantes incluyendo pero sin limitarse a, Hordeum bogdanii, Hordeum brachyanterum, Hordeum brevisubulatum, Hordeum bulbosum, Hordeum comosum, Hordeum depressum, Hordeum intercedes, Hordeum jubatum, Hordeum marinum, Hordeum parodii, Hordeum pusillum, Hordeum secalinum, y Hordeum spontaneum.
Ademas, se describen en el presente documento plantas de centeno tolerantes a herbicidas. Las especies comercialmente importantes incluyen, pero no se limitan a, Secale sylvestre, Secale strictum, Secale cereale, Secale vavilovii, Secale africanum, Secale ciliatoglume, Secale ancestrale, y Secale montanum.
Ademas, se describen en el presente documento plantas de cesped tolerantes a herbicidas. Muchas de las especies comercialmente importantes incluyen Zoysia japonica, Agrostris palustris, Poa pratensis, Poa annua, Digitaria sanguinalis, Cyperus rotundus, Kyllinga brevifolia, Cyperus amuricus, Erigeron canadensis, Hydrocotyle sibtorpioides, Kummerowia striata, Euforbia humifusa, y Viola arvensis.
Ademas de ser capaces de tolerar herbicidas que inhiben la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa, las plantas de la invencion pueden ser capaces tambien de tolerar herbicidas que funcionan sobre otros procesos fisiologicos. Por ejemplo, las plantas de la invencion pueden ser tolerantes a inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa y tambien tolerantes a otros herbicidas, por ejemplo, inhibidores de enzimas. Ejemplos de otros inhibidores de enzimas a los que las plantas de la invencion pueden ser tolerantes incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tal como glifosato, inhibidores de la acetohidroxiacido sintasa (AHAS) tal como imidazolinonas, herbicidas sulfonilureas y sulfonamida, e inhibidores de la glutamina sintasa tal como glufosinato. Ademas de los inhibidores de enzimas, las plantas de la invencion tambien pueden ser tolerantes a herbicidas que tienen otros modos de accion, por ejemplo, herbicidas auxinicos tales como 2,4-D o dicamba, inhibidores de pigmentos clorofila/carotenoides tales como inhibidores de la hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) o fitoeno desaturasa (PDS), inhibidores de protoporfirinogeno-IX oxidasa, destructores de la membrana celular, inhibidores de la fotosintesis tales como bromoxinil o ioxinil, inhibidores de la division celular , inhibidores de la raiz, inhibidores de brotes, y combinaciones de los mismos. Por lo tanto, las plantas de la invencion tolerantes a los inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa pueden hacerse resistentes a multiples clases de herbicidas.
Por ejemplo, las plantas de la invencion tolerantes a los inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa, tales como los “dims" (por ejemplo, cicloxidim, cletodim, o tepraloxidim), los “fops" (por ejemplo, clodinafop, diclofop, fluazifop, haloxifop, o quizalofop), y los “dens" (tales como pinoxaden), en algunas realizaciones, pueden ser tolerantes a herbicidas auxinicos, tolerantes a inhibidores de EPSPS, tales como glifosato; a inhibidores PPO, tal como la pirimidindiona, tal como saflufenacil, triazolinona, tal como sulfentrazona, carfentrazona, flumioxacina, difenileteres, tales como acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno, oxifluorfeno, N-fenilftalamidas, tales como flumiclorac, CGA-248757, y/o a inhibidores de GS, tales como glufosinato. Ademas de estas clases de inhibidores, las plantas de la invencion tolerantes a inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa tambien pueden ser tolerantes a herbicidas que tienen otros modos de accion, por ejemplo, inhibidores de pigmentos clorofila/carotenoides, destructores de la membrana celular, inhibidores de la fotosintesis, inhibidores de la division celular, inhibidores de raiz, inhibidores de brotes, y combinaciones de los mismos. Dicha caracteristica de tolerancia se puede expresar, por ejemplo, como proteinas EPSPS mutantes, o proteinas glutamina sintasa mutantes; o como ariloxialcanoato dioxigenasa nativa, endogamica, o transgenica mutante (AAD o DHT), haloarilnitrilasa (BXN), acido 2,2-dicloropropionico deshalogenasa (DEH), glifosato-N-acetiltransferasa (GAT), glifosato descarboxilasa (GDC), glifosato oxidorreductasa (GOX), glutation-S- transferasa (GST), fosfinotricina acetil transferasa (PAT o bar), o proteinas citocromo P-450 (CY450) que tienen una actividad degradante de herbicidas. Las plantas tolerantes a inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa pueden acumular otras caracteristicas que incluyen, pero no se limitan a, caracteristicas plaguicidas tal como Bt Cry y otras proteinas que tienen actividad plaguicida contra coleopteros, lepidopteros, nematodos, u otras plagas; caracteristicas nutritivas o nutraceuticas tales como caracteristicas modificadas de contenido de aceites y perfil de los aceites, caracteristicas de alta concentracion de proteinas o aminoacidos, y otros tipos de caracteristicas conocidas en la tecnica.
Ademas, las plantas cubren tambien que, ademas de ser capaces de tolerar herbicidas que inhiben la actividad de la
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acetil-Coenzima A carboxilasa, que sean capaces por el uso de tecnicas de ADN recombinante de sintetizar una o mas proteinas insecticidas, especialmente las que se conocen del genero bacteriano Bacillus, particularmente de Bacillus thuringiensis, tal como las 5-endotoxinas, por ejemplo, CryIA(b), CryIA(c), CrylF, CryIF(a2), CryIIA(b), CryMIA, CryIIIB(b1) o Cry9c;; protemas insecticidas vegetativas (VIP), por ejemplo, VIP1, VIP2, VlP3 o VIP3A; protemas insecticidas de bacterias que colonizan nematodos, por ejemplo, Fotorhabdus spp. o Xenorhabdus spp.; toxinas producidas por animales, tales como toxinas de escorpion, toxinas de aracnido, toxinas de avispa, u otras neurotoxinas especificas de insectos; toxinas producidas por hongos, tales como toxinas de Estreptomicetos, lecitinas vegetales, tales como lecitinas de guisante o de cebada; aglutininas; inhibidores de proteinasas, tales como inhibidores de tripsina, inhibidores de serina proteasa, inhibidores de patatina, cistatina o papaina; protemas inactivadoras del ribosoma (RIP), tales como ricino, RIP de maiz, abrina, lufina, saporina o briodina; enzimas del metabolismo de esteroides, tales como 2-hidroxi-esteroide oxidasa, ecdisteroide-IDP-glicosil-transferasa, colesterol oxidasas, inhibidores de ecdisoma o HMG-CoA-reductasa; bloqueantes de canales ionicos, tales como bloqueadores de canales del sodio o calcio; esterasa de hormonas juveniles; receptores de hormonas diureticas (receptores de helicoquinina), estilbeno sintasa, bibencil sintasa, quitinasas o glucanasas. Tambien se tiene que entender expresamente en el contexto de la presente invencion estas proteinas o toxinas insecticidas como pre- toxinas, proteinas hibridas, proteinas truncadas o modificadas de otra manera. Las proteinas hibridas se caracterizan por una nueva combinacion de dominios proteicos, (vease, por ejemplo, el documento WO 02/015701). Ejemplos adicionales de dichas toxinas o plantas modificadas geneticamente capaces de sintetizar dichas toxinas se desvelan, por ejemplo en los documentos EP-A 374 753, WO 93/007278, WO 95/34656, EP-A 427 529, EP-A 451 878, WO 03/18810 y WO 03/52073. Los metodos para producir dichas plantas modificadas geneticamente son conocidos por el experto en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las publicaciones mencionadas anteriormente. Estas proteinas insecticidas contenidas en las plantas modificadas geneticamente hacen que las plantas que producen estas proteinas tengan tolerancia a plagas perjudiciales de todos los grupos taxonomicos de insectos, especialmente a escarabajos (Coleopteros), insectos de dos alas (Dipteros), y mariposas (Lepidopteros) y para nematodos (Nematodos).
Ademas, en una realizacion, las plantas tambien cubren las que son capaces, por el uso de tecnicas de ADN recombinante y/o por cruzamiento y/o seleccionadas de otra manera por dichas caracteristicas, de sintetizar una o mas proteinas para aumentar la resistencia o tolerancia de las plantas a agentes patogenos bacterianos, viricos o fungicos. Los metodos para producir dichas plantas modificadas geneticamente son conocidos en general por el experto en la tecnica. Las plantas que se producen como se describe en el presente documento pueden acumular tambien otras caracteristicas que incluyen, pero no se limitan a, resistencia a la enfermedad, aumento del perfil mineral, aumento del perfil vitaminico, aumento del perfil de aceites (por ejemplo, alto contenido de acido oleico), perfil de aminoacidos (por ejemplo, maiz alto en lisina), y otros tipos de caracteristicas que se conocen en la tecnica.
Ademas, en una realizacion, las plantas tambien cubren , por ejemplo por el uso de tecnicas de ADN recombinante y/o por cruzamiento y/o por otros medios de seleccion, las que son capaces de sintetizar una o mas proteinas para aumentar la productividad (por ejemplo, la produccion de biomasa, rendimiento de grano, contenido de almidon, contenido de aceites, o contenido de proteinas), tolerancia a la sequia, salinidad u otros factores ambientales limitantes del crecimiento o tolerancia a plagas y agentes patogenos fungicos, bacterianos o viricos de las plantas.
Ademas, en una realizacion, las plantas cubren tambien las que contienen, por ejemplo, por el uso de tecnicas de ADN recombinante y/o por cruzamiento y/o por otros medios de seleccion, una cantidad modificada de sustancias de contenido o nuevas sustancias de contenido, especificamente para mejorar la nutricion humana o animal. Ademas, las plantas tambien cubren las que contienen, por el uso de tecnicas de ADN recombinante una cantidad modificada de sustancias de contenido o nuevas sustancias de contenido, especificamente para mejorar la produccion de materia bruta.
Ademas, en algunas realizaciones, las plantas de la presente invencion tambien cubren las que, por ejemplo, por el uso de tecnicas de ADN recombinante y/o cruzamiento y/o seleccionadas de otra manera por dichas caracteristicas, estan alteradas para contener mayores cantidades de vitaminas y/o minerales, y/o perfiles mejorados de compuestos nutraceuticos.
En una realizacion, las plantas de la invencion tolerantes a los inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa, con respecto a plantas de tipo silvestre, comprenden una mayor cantidad, o un perfil mejorado de, un compuesto que se selecciona de entre el grupo que consiste en: glucosinolatos (glucobrasicina), 1-metoxi-3-indolilmetil-glucosinolato (neoglucobrasicina)); fenolicos (por ejemplo, flavonoides (por ejemplo, quercetina, kaempferol), derivados del hidroxicinnamoilo (por ejemplo, 1,2,2'-trisinapoligentiobiosa, 1,2-diferuloilgeno-tiobiosa, 1,2'-disinapoil-2- feruloilgentiobiosa, acido 3-O-cafeoil-qumico (acido neoclorogenico)); y vitaminas y minerales (por ejemplo, vitamina C, vitamina E, caroteno, acido folico, niacina, riboflavina, tiamina, calcio, hierro, magnesio, potasio, selenio y zinc).
En otra realizacion, las plantas de la invencion tolerantes a los inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa, con respecto a las plantas de tipo silvestre, comprenden una mayor cantidad de, o un perfil mejorado de, un compuesto que se selecciona de entre el grupo que consiste en: progoitrina, isotiocianatos; indoles (productos de la hidrolisis de glucosinolato); glutation; carotenoides tales como beta-caroteno, licopeno, y carotenoides xantofilos tales como luteina y zeaxantina; fenolicos que comprenden flavonoides tales como flavonoles (por ejemplo, quercetina, rutina),
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los flavanos/taninos (tales como procianidinas que comprenden cumarina, proantocianidinas, catequinas, y antocianinas); flavonas; fitoestrogenos tales como cumestanos, lignanos, resveratrol, isoflavonas, por ejemplo, genisteina, daidzeina, y glicitema; lactonas del acido resordclico; compuestos organosulfurados; fitosteroles; terpenoides tales como carnosol, acido rosmarinico, glicirricina; clorofila; clorfilina, azucares, antocianinas, y vainilla.
En otras realizaciones, las plantas de la invencion tolerantes a los inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa, con respecto a una planta de tipo silvestre, comprenden una mayor cantidad, o un perfil mejorado de, un compuesto que se selecciona de entre el grupo que consiste en: vincristina, vinblastina, taxanos (por ejemplo, taxol (paclitaxel), baccatin III, 10-desacetilbaccatin III, 10-desacetil taxol, xilosil taxol, 7-epitaxol, 7-epibaccatin III, 10- desacetilcefalomanina, 7-epicefalomanina, taxotere, cefalomanina, xilosil cefalomanina, taxagifina, 8-benzoiloxi taxagifina, 9-acetiloxi taxusina, 9-hidroxi taxusina, taiwan-xam, taxano Ia, taxano Ib, taxano Ic, taxano Id, paclitaxel GMP, 9-dihidro 13-acetilbaccatin III, 10-desacetil-7-epitaxol, tetrahidrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), genisteina, diadzeina, codeina, morfina, quinina, shikonina, ajmalacina, serpentina, y similares.
La presente invencion tambien engloba la progenie de las plantas de la invencion asi como las semillas derivadas de las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion y las celulas derivadas de las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion en tanto que dicha progenie, semillas y celulas comprendan el acido nucleico de ACCasa de arroz mutagenizado de las plantas de la invencion.
Dichas plantas se pueden utilizar para producir productos vegetales. Por lo tanto, un metodo para preparar una semilla descendiente comprende plantar una semilla capaz de producir una planta de la misma, cultivar la planta resultante, y recolectar la semilla descendiente de la misma. Dicho metodo puede comprender adicionalmente la aplicacion de una composicion herbicida inhibidora de la ACCasa a la planta resultante. De manera similar, un metodo para producir un producto derivado de una planta de las mismas puede comprender procesar una planta de las mismas para obtener un producto derivado. Dicho metodo se puede utilizar para obtener un producto derivado que es cualquiera de, por ejemplo, forraje, pienso, harina de semillas, aceite o siembras de semillas revestidas con un tratamiento. Las semillas, semillas tratadas, y otros productos vegetales que se obtienen por dichos metodos son productos utiles que se pueden comercializar.
En varias realizaciones, la presente invencion proporciona la produccion de productos alimentarios, productos de consumo, productos industriales, y productos veterinarios de cualquiera de las plantas descritas en el presente documento.
Enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas
La presente invencion proporciona plantas que expresan enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas con secuencias de aminoacidos que se diferencia de la secuencia de aminoacido de la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que se encuentra en la planta de tipo silvestre correspondiente. Para facilitar la comprension, el sistema de numeracion de aminoacidos que se utiliza en el presente documento sera el sistema de numeracion de aminoacidos que se utiliza para la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides [Huds.] (al que se hace tambien referencia como hierba negra). La secuencia de ARNm que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa de A. myosuroides esta disponible con el n° de acceso del GenBank AJ310767 y la secuencia proteica esta disponible con el n° de acceso de GenBank CAC84161. El numero del aminoacido al que se haga referencia estara seguido por (Am) para indicar el aminoacido en la secuencia del Alopecurus myosuroides a la que corresponde el aminoacido. La Figura 18 proporciona la secuencia de aminoacidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides (n° de acceso del GenBank CAC84161). Los aminoacidos que se pueden alterar en las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas de la invencion se indican en negrita subrayado doble, y la Figura 18 representa la secuencia de aminoacidos de las acetil-Coenzima A carboxilasas de Oryza sativa de tipo silvestre alineada con la acetil-Coenzima A carboxilasa de Alopecurus myosuroides senalando algunos restos criticos.
Una acetil-Coenzima A carboxilasa que esta comprendida en las plantas de la invencion se diferencia de la acetil- Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.781 (Am). La acetil- Coenzima A carboxilasa de A. myosuroides de tipo silvestre tiene una isoleucina en la posicion 1.781 (Am) (I1781). Las mutantes de ACCasa en 1.781 (Am) tiene una leucina en esta posicion (I1781L).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.785 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una alanina en la posicion 1.785 (Am) (A1785). Las mutantes de ACCasa en 1.785 (Am) tendran un aminoacido distinto de alanina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, glicina (A1785G). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una glicina en la posicion 1.785 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.786 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una alanina en la posicion 1.785 (Am) (A1786). Las mutantes
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de ACCasa en 1.786 (Am) tendran un aminoacido distinto de alanina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, prolina (A1785P). En una realization, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una prolina en la posicion 1.785 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.811 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una isoleucina en la posicion 1.811 (Am) (I1811). Las mutantes de ACCasa en 1.811 (Am) tendran un aminoacido distinto de isoleucina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, asparagina (I1811N). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una asparagina en la posicion 1.811 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.824 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una glutamina en la posicion 1.824 (Am) (Q1824). Las mutantes de ACCasa en 1.824 (Am) tendran un aminoacido distinto de glutamina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, prolina (Q1824P). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una prolina en la posicion 1.824 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.864 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una valina en la posicion 1.864 (Am) (V1864). Las mutantes de ACCasa en 1.864 (Am) tendran un aminoacido distinto de valina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, fenilalanina (V1864F). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una glicina en la posicion 1.864 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 1.999 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una triptofano en la posicion 1.785 (Am) (W1999). Las mutantes de ACCasa en 1.999 (Am) tendran un aminoacido distinto de triptofano en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, cisteina (W1999C) y glicina (W1999G). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una glicina en la posicion 1.999 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.027 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una triptofano en la posicion 2.027 (Am) (W2027). Las mutantes de ACCasa en 2.027 (Am) tendran un aminoacido distinto de triptofano en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, cisteina (W2027C) y arginina (W2027R). En una realizacion, la enzima acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una cisteina en la posicion 2.027 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.039 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene un acido glutamico en la posicion 2.039 (Am) (E2041). Las mutantes de ACCasa en 2.039 (Am) tendran un aminoacido distinto de acido glutamico en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, glicina (E2039G). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una glicina en la posicion 2.039 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.041 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una isoleucina en la posicion 2.041 (Am) (I2041). Las mutantes de ACCasa en 2.041 (Am) tendran un aminoacido distinto isoleucina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, asparagina (I2041N), o valina (I2041V). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una asparagina en la posicion 2.041 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.041 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una valina en la posicion 2.041 (Am) (V2041). Las mutantes de ACCasa en 2.041 (Am) tendran un aminoacido distinto de valina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero
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no se limitan a, fenilalanina (V2041F), isoleucina (V2049I) y leucina (V2094L). En una realization, la enzima acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una fenilalanina en la position 2.041 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.059 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una alanina en la posicion 2.059 (Am) (A2059). Las mutantes de ACCasa en 2.059 (Am) tendran un aminoacido distinto de alanina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, valina (A2059V). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una valina en la posicion 2.059 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.074 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene un triptofano en la posicion 2.074 (Am) (W2074). Las mutantes de ACCasa en 2.074 (Am) tendran un aminoacido distinto de triptofano en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, leucina (W2074L). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 2.074 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.075 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una valina en la posicion 2.075 (Am) (V2075). Las mutantes de ACCasa en 2.075 (Am) tendran un aminoacido distinto de valina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, metionina (V2075M), leucina (V2075L) e isoleucina (V2075I). En una realizacion, la enzima acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 2.075 (Am). En algunas realizaciones, la enzima acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una valina en la posicion 2.075 (Am) y una valina adicional inmediatamente despues de la posicion 2.075 (Am) y antes de la valina en la posicion 2.076 (Am), es decir, puede haber tres valinas consecutivas mientras que la enzima de tipo silvestre tiene dos.
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.078 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene un aspartato en la posicion 2.078 (Am) (D2078). Las mutantes de ACCasa en 2.078 (Am) tendran un aminoacido distinto de aspartato en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, lisina (D2078K), glicina (D2078K), o treonina (D2078T). En una realizacion, la enzima acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una glicina en la posicion 2.078 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.079 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una serina en la posicion 2.079 (Am) (S2079). Las mutantes de ACCasa en 2.079 (Am) tendran un aminoacido distinto de serina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, fenilalanina (S2079F). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una fenilalanina en la posicion 2.079 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.080 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una lisina en la posicion 2.080 (Am) (K2080). Las mutantes de ACCasa en 2.080 (Am) tendran un aminoacido distinto de lisina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, acido glutamico (K2080E). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra un acido glutamico en la posicion 2.080 (Am). En otra realizacion, las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas normalmente tendran una deletion en esta posicion (A2080).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.081 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una isoleucina en la posicion 2.081 (Am) (I2081). Las mutantes de ACCasa en 2.081 (Am) tendran un aminoacido distinto de isoleucina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, glicina (E2081G). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una delecion en esta posicion (A2081).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.088 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una cisteina en la posicion 2.088 (Am) (C2088). Las mutantes
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de ACCasa en 2.088 (Am) tendran un aminoacido distinto de cistema en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, arginina (C2088R), triptofano (C2088W), fenilalanina (C2088F), glicina (C2088G), histidina (C2088H), lisina (C2088K), serina (C2088S), treonina (C2O88T), leucina (C2088L), o valina (C2088V),. En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una arginina en la posicion 2.088 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.095 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una lisina en la posicion 2.095 (Am) (K2095). Las mutantes de ACCasa en 2.095 (Am) tendran un aminoacido distinto de lisina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, acido glutamico (K2095E). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra un acido glutamico en la posicion 2.095 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.096 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una glicina en la posicion 2.096 (Am) (G2096). Las mutantes de ACCasa en 2.096 (Am) tendran un aminoacido distinto de glicina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, alanina (G2096A), o serina (G2096S). En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una alanina en la posicion 2.096 (Am).
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia adicionalmente de la acetil-Coenzima A carboxilasa correspondiente al tipo silvestre en la posicion de aminoacido 2.098 (Am). La acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre de A. myosuroides tiene una valina en la posicion 2.098 (Am) (V2098). Las mutantes de ACCasa en 2.098 (Am) tendran un aminoacido distinto de valina en esta posicion. Ejemplos de aminoacidos adecuados que se pueden encontrar en esta posicion de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas incluyen, pero no se limitan a, alanina (V2098A), glicina (V2098G), prolina (V2098P), histidina (V2098H), serina (V2098S) o cisteina (V2098C).. En una realizacion, la enzima acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una alanina en la posicion 2.098 (Am).
En una realizacion, la presente invencion engloba la acetil-Coenzima A carboxilasa de una planta tolerante a herbicidas de la invencion que se diferencia de la acetil-Coenzima A carboxilasa de la planta de tipo silvestre correspondiente solamente en la posicion 1.781 (Am). Ademas, se describen acetil-Coenzima A carboxilasas de las plantas tolerantes a herbicidas que se diferencian solo en una de las siguientes posiciones: 1,785 (Am), 1,786 (Am), 1,811 (Am), 1,824 (Am), 1,864 (Am), 1,999 (Am), 2,027 (Am), 2,039 (Am), 2,041 (Am), 2,049 (Am), 2,059 (Am), 2,074 (Am), 2,075 (Am), 2,078 (Am), 2,079 (Am), 2,080 (Am), 2,081 (Am), 2,088 (Am), 2,095 (Am), 2,096 (Am), o
2,098 (Am).
Las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas que se describen en el presente documento solamente pueden tener una de las siguientes sustituciones: una isoleucina en la posicion 2.075 (Am), glicina en la posicion 2.078 (Am), arginina en la posicion 2.088 (Am), glicina en la posicion 2.039 (Am), valina en la posicion 2.059 (Am), metionina en la posicion 2.075 (Am), una duplicacion de la posicion 2.075 (Am) (es decir, una insercion de valina entre 2.074 (Am) y 2.075 (Am), o una insercion de valina entre la position 2.075 (Am) y 2.076 (Am)), una delecion de la posicion de aminoacido 2.080 (Am), acido glutamico en la posicion 2.080 (Am), delecion de la posicion 2.081 (Am), acido glutamico en la posicion 2.095 (Am), una glicina en la posicion 1.785 (Am), una prolina en la posicion 1.786 (Am), una asparagina en la posicion 1.811 (Am), una leucina en la posicion 2.075 (Am), una treonina en la posicion 2.078 (Am), una delecion en la posicion 2.080 (Am), una triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, leucina, serina, treonina, o valina en la posicion 2.088 (Am), una serina en la posicion 2.096 (Am), una alanina en la posicion 2.096

(Am), una alanina en la posicion 2.098 (Am), una glicina en la posicion 2.098 (Am), una histidina en la posicion 2.098

(Am), una prolina en la posicion 2.098 (Am), una serina en la posicion 2.098 (Am), una leucina en la posicion 1.781

(Am), una treonina en la posicion 1.781 (Am), una valina en la posicion 1.781 (Am), una alanina en la posicion 1.781
(Am), una glicina en la posicion 1.999 (Am), una cisteina o arginina en la posicion 2.027 (Am), una arginina en la posicion 2.027 (Am), una asparagina en la posicion 2.041 (Am), o una valina en la posicion 2.041 (Am)
Los acidos nucleicos que codifican el polipeptido de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene solo una de las siguientes sustituciones: isoleucina en la posicion 2.075 (Am), glicina en la posicion 2.078 (Am), o arginina en la posicion 2.088 (Am) se pueden utilizar transgenicamente. Una celula vegetal de monocotiledonea se puede transformar con una construccion de vector de expresion que comprenda el acido nucleico que codifica el polipeptido de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene solo una de las siguientes sustituciones: isoleucina en la posicion 2.078 (Am), glicina en la posicion 2.078 (Am), o arginina en la posicion 2.088 (Am).
Se describen en el presente documento las plantas del clado BEP que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en solo una posicion de aminoacidos como se ha descrito anteriormente.
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Ademas, se describen en el presente documento plantas del subclado BET que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en solo una posicion de aminoacido como se ha descrito anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento plantas BET cultivables que comprenden acidos nucleicos que codifican los polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion solo en una posicion de aminoacido como se ha descrito anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en solo una posicion de aminoacido como se ha descrito anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en la posicion de aminoacido
1.781 (Am), en el que la posicion de aminoacido 1.781 (Am) se diferencia de la del tipo silvestre y no es leucina.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en la posicion de aminoacido 1.999 (Am), en el que la posicion de aminoacido 1.999 (Am) se diferencia de la del tipo silvestre y no es cisteina.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en la posicion de aminoacido
2.027 (Am), en el que la posicion de aminoacido 2.027 (Am) se diferencia de la del tipo silvestre y no es cisteina.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en la posicion de aminoacido 2.041 (Am), en el que la posicion de aminoacido 2.041 (Am) se diferencia de la del tipo silvestre y no es valina ni asparagina.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de la acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una sustitucion en la posicion de aminoacido 2.096 (Am), en el que la posicion de aminoacido 2.096 (Am) se diferencia de la del tipo silvestre y no es alanina.
Las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas comprendidas en las plantas de la presente invencion pueden tener una secuencia de aminoacidos que se diferencia en mas de una posicion de aminoacidos de la enzima acetil- Coenzima A carboxilasa que se encuentra en la planta de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, una acetil- Coenzima A carboxilasa se puede diferenciar en 2, 3, 4, 5, 6 o 7 posiciones de la acetil-Coenzima A carboxilasa que se encuentra en la planta de tipo silvestre correspondiente.
En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa se diferencia de la acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre correspondiente en la posicion de aminoacido 1.781 (Am) y en una o mas posiciones de aminoacido adicionales. El acido nucleico mutagenizado de las plantas de la presente invencion codifica una enzima acetil- Coenzima A carboxilasa plastidica de arroz que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am). Ademas, la enzima puede comprender tambien una o mas de una glicina en la posicion 1.785 (Am), una prolina en la posicion 1.786 (Am), una asparagina en la posicion 1.811 (Am), una prolina en la posicion 1.824 (Am), una fenilalanina en la posicion 1.864 (Am), una cisteina o glicina en la posicion 1.999 (Am), una cisteina o arginina en la posicion 2.027 (Am), una glicina en la posicion 2.039 (Am), una asparagina en la posicion 2.041 (Am), una fenilalanina, isoleucina o leucina en la posicion 2.049 (Am), una valina en la posicion 2.059 (Am), una leucina en la posicion 2.074 (Am), una leucina, isoleucina, metionina, o una valina adicional en la posicion 2.075 (Am), una glicina o treonina en la posicion 2.078 (Am), una fenilalanina en la posicion 2.079 (Am), un acido glutamico en la posicion 2.080 (Am), una delecion en la posicion 2.080 (Am), una delecion en la posicion 2.081 (Am), una arginina triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, o valina en la posicion 2.088 (Am), un acido glutamico en la posicion 2.095 (Am), una alanina o serina en la posicion 2.096 (Am), y una alanina, glicina, prolina, histidina, cisteina, o serina en la posicion 2.098 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una glicina en la posicion 1.785 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una prolina en la posicion 1.786 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una asparagina en la posicion 1.811 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una prolina en la posicion 1.824 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina en la posicion 1.864 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una cisteina o glicina en la posicion 1.999 (Am). En una realizacion, la acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una cisteina o una arginina en la posicion
2.027 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una glicina en la posicion 2.039 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una asparagina en la posicion 2.041 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina, leucina o isoleucina en la posicion 2.049
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(Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una valina en la posicion 2.059 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion
1.781 (Am) y una leucina en la posicion 2.074 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una leucina, isoleucina metionina, o valina adicional en la posicion 2.075 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una glicina o treonina en la posicion 2.078 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina en la posicion 2.079 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y un acido glutamico o una delecion en la posicion 2.080 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una delecion en la posicion 2.081 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una arginina, triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, o valina en la posicion 2.088 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y un acido glutamico en la posicion 2.095 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una alanina o serina en la posicion 2.096 (Am). En una realizacion, la acetil- Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una alanina, glicina, prolina, histidina, cisteina, o serina en la posicion 2.098 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am), una cisteina o arginina en la posicion 2.027 (Am), y una asparagina en la posicion 2.041 (Am). En una realizacion, la acetil-Coenzima A carboxilasa tendra una leucina en la posicion 1.781 (Am), una cisteina o arginina en la posicion 2.027 (Am), una asparagina en la posicion 2.041 (Am), y una alanina en la posicion 2.096 (Am).
En una realizacion preferida, la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene a leucina en la posicion 1.781 (Am) y una prolina en la posicion 1.824 (Am); la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una arginina en la posicion 2.027 (Am); o la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una glicina en la posicion 2.078 (Am) y una prolina en la posicion 1.824 (Am).
En una realizacion mas preferida, la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina en la posicion 2.049 (Am).
En una realizacion mas preferida, la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1,781 (Am) y una asparagina en la posicion 2,041 (Am); la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1,781 (Am) y una cisteina en la posicion 2,027 (Am); la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1,781 (Am) y una leucina en la posicion 2,075 (Am); la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1,781 (Am) y una fenilalanina en la posicion 1,864 (Am); la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion
1.781 (Am) y una alanina en la posicion 2,098 (Am); la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1,781 (Am) y una glicina en la posicion 2,098 (Am); o la acetil-Coenzima A carboxilasa tiene una leucina en la posicion 1,781 (Am) y una duplicacion 2,075 (Am).
Moleculas de acido nucleico
Se describe adicionalmente en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican todo o una parte de las enzimas acetil-Coenzima A carboxilasas descritas anteriormente. Las moleculas de acido nucleico de la invention puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una version modificada de una o ambas de SEQ ID NO: 2 y 3, en las que la secuencia se modifica de manera que la proteina codificada comprenda una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente uno o mas de los siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina o arginina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina, isoleucina o leucina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina , metionina o adicional valina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, leucina, serina, treonina, o valina; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es glutamico acido; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina. Ademas se describen las moleculas de acido nucleico complementarias de todas o parte de las secuencias codificantes. En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico de la invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que tenga multiples diferencias respecto a la acetil-Coenzima A carboxilasa de tipo silvestre que se describe anteriormente.
En una realizacion, la presente invencion engloba una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que se diferencia de la acetil-Coenzima A carboxilasa de plantas del tipo silvestre correspondiente solo en la posicion 1.781 (Am). Ademas, se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que
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codifican una acetil-Coenzima A carboxilasa que se diferencia de la acetil-Coenzima A carboxilasa de la correspondiente planta de tipo silvestre en solo una de las siguientes posiciones: 1.785 (Am), 1.786 (Am), 1.811 (Am), 1.824 (Am), 1.864 (Am), 1.999 (Am), 2.027 (Am), 2.039 (Am), 2.041 (Am), 2.049 (Am), 2.059 (Am), 2.074 (Am),
2.075 (Am), 2.078 (Am), 2.079 (Am), 2.080 (Am), 2.081 (Am), 2.088 (Am), 2.095 (Am), 2.096 (Am), o 2.098 (Am).
Una molecula de acido nucleico descrita en el presente documento puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene solo una de las siguientes sustituciones: isoleucina en la posicion 2.075 (Am), glicina en la posicion 2.078 (Am), arginina en la posicion 2.088 (Am), glicina en la posicion 2.039 (Am), valina en la posicion 2.059 (Am), metionina, en la posicion 2.075 (Am), duplicacion of position 2.075 (Am) (i.e., una insercion de valina entre 2.074 (Am) y 2.075 (Am), o una insercion de valina entre la position 2.075 (Am) y 2.076 (Am), una delecion en la posicion de aminoacido 2.088 (Am), glutamico acido en la posicion 2.080 (Am), una delecion of position 2.088 (Am), glutamico acido en la posicion 2.095 (Am), una glicina en la posicion 1.785 (Am), una prolina en la posicion 1.786 (Am), una asparagina en la posicion 1.811 (Am), una leucina en la posicion 2.075 (Am), una metionina en la posicion 2.075 (Am), una treonina en la posicion 2.078 (Am), una delecion en la posicion 2.080 (Am), una delecion en la posicion 2.081 (Am), una triptofano en la posicion 2.088 (Am), una serina en la posicion 2.096 (Am), una alanina en la posicion 2.096 (Am), una alanina en la posicion 2.098 (Am), una glicina en la posicion 2.098 (Am), una histidina en la posicion 2.098 (Am), una prolina en la posicion 2.098 (Am), o una serina en la posicion 2.098 (Am), una leucina en la posicion 1.781 (Am), una treonina en la posicion 1.781 (Am), una valina en la posicion 1.781 (Am), una alanina en la posicion 1.781 (Am), una glicina en la posicion 1.999 (Am), una cisteina en la posicion 2.027 (Am), una arginina en la posicion 2.027 (Am), una asparagina en la posicion 2.041 (Am), o una valina en la posicion 2.041 (Am).
En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una cisteina o glicina en la posicion 1.999 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una cisteina o arginina en la posicion 2.027 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil- Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una asparagina en la posicion 2.041 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil- Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina, isoleucina o leucina en la posicion 2.049 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una leucina o isoleucina en la posicion 2.075 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una glicina en la posicion 2.078 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una arginina en la posicion 2.088 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una alanina en la posicion 2.096 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una alanina en la posicion 2.098 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am), una cisteina en la posicion 2.027 (Am), y una asparagina en la posicion 2.041 (Am). En una realizacion, una molecula de acido nucleico de la presente invencion puede codificar una acetil-Coenzima A carboxilasa que comprende una leucina en la posicion 1.781 (Am), una cisteina en la posicion 2.027 (Am), una asparagina en la posicion 2.041 (Am), y una alanina en la posicion 2.096 (Am).
En una realizacion preferida, la invencion incluye una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una prolina en la posicion 1.824 (Am); y una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una arginina en la posicion 2.027 (Am).
En una realizacion mas preferida, la invencion incluye una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-
Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina en la posicion 2.049
(Am).
En una realizacion mas preferida, la invencion incluye, una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-
Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una asparagina en la posicion 2.041
(Am); una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una cisteina en la posicion 2.027 (Am); una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una leucina en la posicion 2.075 (Am); una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una fenilalanina en la posicion 1.864 (Am); una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una alanina en la posicion 2.098 (Am); una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.788 (Am) y una glicina en la posicion 2.098 (Am); y una molecula de acido nucleico que codifica una
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acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una leucina en la posicion 1.781 (Am) y una duplicacion 2.075 (Am).
Se describen en el presente documento plantas del clado BEP que comprenden acidos nucleicos que codifican polipeptidos de acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una o mas de las sustituciones que se han descrito anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento una planta del subclado BET que comprende acidos nucleicos que codifican un polipeptido de acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una o mas sustituciones que se describen anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento plantas BET cultivables que comprenden acidos nucleicos que codifican un polipeptido de acetil-Coenzima A carboxilasa que tienen una o mas sustituciones que se han descrito anteriormente.
Ademas, se describen en el presente documento plantas monocotiledoneas que comprenden acidos nucleicos que codifican un polipeptido de acetil-Coenzima A carboxilasa que tiene una o mas sustituciones que se han descrito anteriormente.
Una molecula de acido nucleico de la invention puede ser un ADN, derivado del ADN genomico o ADNc, o ARN. Una molecula de acido nucleico de la invencion puede ser de origen natural o puede ser sintetico. Una molecula de acido nucleico de la invencion puede ser recombinante.
Una molecula de acido nucleico de la invencion codifica una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa en el que la posicion de aminoacido en la posicion 1.781 (Am) es leucina. Ademas, se describe en el presente documento una molecula de acido nucleico que es complementaria a dicha molecula de acido nucleico de la invencion. Dichas moleculas de acido nucleico incluyen, pero no se limitan a, ADN genomico que funciona como matriz de una transcription primaria de ARN, una molecula de plasmido que codifica la acetil-Coenzima A carboxilasa, asi como un ARNm que codifica dicha acetil-Coenzima A carboxilasa.
Las moleculas de acido nucleico de la invencion pueden comprender secuencias no codificantes, que pueden ser transcritas o no. Las secuencias no codificantes que se pueden incluir en las moleculas de acido nucleico de la invencion incluyen pero no se limitan a, UTR 5' y 3', senales de poliadenilacion y secuencias reguladoras que controlan la expresion genetica (por ejemplo, promotores). Los acidos nucleicos de la invencion pueden comprender tambien secuencias que codifican peptidos de transito, sitios de escision de proteasas, sitios de modification covalente y similares. En una realization, las moleculas de acido nucleico de la invencion codifican una secuencia de peptido de transito al cloroplasto ademas de una secuencia que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa.
En otra realizacion, las moleculas de acido nucleico de la invencion pueden codificar una enzima acetil-Coenzima A carboxilasa que tenga al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de identidad de secuencia con una version modificada de una o ambas de SEQ ID NO: 2 y 3, en las que la secuencia se modifica de manera que la proteina codificada comprenda una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente uno o mas de los siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina o arginina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina, isoleucina o leucina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina , metionina o adicional valina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, leucina, serina, treonina, o valina; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es glutamico acido; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina. Ademas, se describen en el presente documento las moleculas de acido nucleico complementarias a todo o una parte de las secuencias codificantes.
Como se utiliza en el presente documento, “porcentaje ( %) de identidad de secuencia" se define como el porcentaje de nucleotidos o aminoacidos en la secuencia derivada candidata identicos a los nucleotidos o aminoacidos en la secuencia del sujeto (o la parte especificada de la misma), tras el alineamiento de las secuencias y la introduction de huecos, si fueran necesarios para conseguir el porcentaje maximo de identidad de secuencia, segun se genera con el programa BLAST disponible en http:/ blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi con los parametros de busqueda fijados en los valores por defecto.
Ademas, se describen en el presente documento moleculas de acido nucleico que se hibridan con moleculas de acido nucleico que codifican la acetil-Coenzima A carboxilasa de la invencion asi como moleculas de acido nucleico
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que se hibrida con las complementarias inversas de las moleculas de acido nucleico que codifican la acetil- Coenzima A carboxilasa de la invencion. Dichas moleculas de acido nucleico se pueden hibridar a una molecula de acido nucleico que codifica una o mas de una version modificada de una o ambas de SEQ ID NO: 2 y 3, en las que la secuencia esta modificada de manera que la proteina codificada comprende una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion 1.781 (Am) y opcionalmente uno o mas de los siguientes: el aminoacido en la posicion 1.785 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 1.786 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.811 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 1.824 (Am) es prolina; el aminoacido en la posicion 1.864 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 1.999 (Am) es cisteina o glicina; el aminoacido en la posicion 2.027 (Am) es cisteina o arginina; el aminoacido en la posicion 2.039 (Am) es glicina; el aminoacido en la posicion 2.041 (Am) es asparagina; el aminoacido en la posicion 2.049 (Am) es fenilalanina, isoleucina o leucina; el aminoacido en la posicion 2.059 (Am) es valina; el aminoacido en la posicion 2.074 (Am) es leucina; el aminoacido en la posicion 2.075 (Am) es leucina, isoleucina , metionina o adicional valina; el aminoacido en la posicion 2.078 (Am) es glicina, o treonina; el aminoacido en la posicion 2.079 (Am) es fenilalanina; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) es acido glutamico; el aminoacido en la posicion 2.080 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.081 (Am) se ha eliminado; el aminoacido en la posicion 2.088 (Am) es arginina, triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, leucina, serina, treonina, o valina; el aminoacido en la posicion 2.095 (Am) es glutamico acido; el aminoacido en la posicion 2.096 (Am) es alanina, o serina; o el aminoacido en la posicion 2.098 (Am) es alanina, glicina, prolina, histidina, o serina, asi como a las moleculas de acido nucleico complementarias en todo o una parte de las secuencias codificantes, o las complementarias inversas de dichas moleculas de acido nucleico en condiciones rigurosas. La rigurosidad de la hibridacion se puede controlar por la temperatura, fuerza ionica, pH, y la presencia de agentes desnaturalizantes tales como formamida durante la hibridacion y lavado. Las condiciones rigurosas que se pueden utilizar incluyen las que se definen en Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Chap. 2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994) y Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989) al que se hace referencia para ensenar sobre las condiciones rigurosas.
Se puede utilizar en la transformacion cualquiera de los mutantes descritos anteriormente en un plasmido con una combinacion del gen de interes.
En una realizacion, la presente invencion proporciona vectores de expresion que comprenden moleculas de acido nucleico que codifican cualquiera de las ACCasas mutantes descritas anteriormente.
Los acidos nucleicos de ACCasa mutantes y las proteinas codificadas por dichos acidos nucleicos de ACCasa mutantes que se han descrito anteriormente se pueden utilizar como marcadores geneticos.
Ademas, los oligonucleotidos que se describen en el presente documento se pueden utilizar como sondas de hibridacion, cebadores de secuenciacion, y/o cebadores de PCR. Dichos oligonucleotidos se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar una secuencia de codon en una posicion particular en una molecula de acido nucleico que codifica una acetil-Coenzima A carboxilasa, por ejemplo, por pCr especifica de alelo. Dichos oligonucleotidos pueden tener desde aproximadamente 15 a aproximadamente 30, desde aproximadamente 20 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 20-25 nucleotidos de longitud.
Ensayo de genes de ACCasa mutantes dobles “Ensayo DBLM”:
(1) En una poblacion de ensayo (de, por ejemplo, al menos 12 y preferentemente al menos 20) de plantas completas de arroz que contienen 1 o 2 copias de un gen de ACCasa transgenico que codifica al menos una ACCasa doble mutante (es decir, como minimo 1 y como maximo 2 inserciones cromosomicas del gen de ACCasa transgenico que se va a ensayar),
en el que las plantas son regenerantes t0 (“T-cero”)
y en paralelo con una poblacion de control de dichas plantas que se van a utilizar como plantas de comprobacion sin tratar;
(2) Aplicacion a la poblacion de ensayo con un volumen de pulverizacion de 200 l/ha de una composicion que comprende Tepraloxidim (AI) y un 1 % de concentrado de aceite de cultivo (COC), para proporcionar una tasa de aplicacion del IA equivalente a 50 g/ha de Tepraloxidim (IA);
(3) Determinar un valor de fitotoxicidad para cada planta de ensayo y de comprobacion, basandose en el sistema de valoracion de danos en plantas tradicional (por ejemplo, evaluando visualmente las pruebas de quemadura de herbicida, cambios en la morfologia de las hojas, marchitamiento, amarilleamiento, y otras caracteristicas morfologicas, preferentemente de acuerdo con una escala de danos tipica de 5 niveles);
(4) Analizar los datos recolectados para determinar si al menos el 75 % de las plantas en la poblacion de ensayo presentan una fitotoxicidad media, es decir un aumento de danos con respecto a las plantas de comprobacion de menos del 10 %; y
(5) Identificar un resultado positivo que se determina segun se demuestra que la ACCasa mutante doble proporciona una AIT aceptable.
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Herbicidas
La presente invencion proporciona plantas de arroz que son tolerantes a concentraciones de herbicida que normalmente inhiben el crecimiento de las plantas de tipo silvestre. Las plantas son normalmente resistentes a herbicidas que interfieren la actividad de acetil-Coenzima A carboxilasa. Se puede utilizar cualquier herbicida que inhiba la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa en conjuncion con las plantas de la invencion. Ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, herbicidas de ciclohexanodiona, herbicidas de ariloxifenoxi propionato, y fenilpirazol. En algunos metodos de control de malas hierbas y/o cultivo de plantas tolerantes a herbicidas, al menos se selecciona un herbicida de entre el grupo que consiste en setoxidim, cicloxidim, tepraloxidim, haloxifop, haloxifop- P o un derivado de cualquiera de estos herbicidas.
La Tabla 1 proporciona una lista de los herbicidas ciclohexanodiona (DIMS, a los que se hace referencia tambien como: ciclohexeno oxima ciclohexanodiona oxima; y CHD) que interfieren la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa y se pueden utilizar en conjuncion con las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion. Un experto en la tecnica reconocera que existen otros herbicidas en esta clase y se pueden utilizar en conjuncion con las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion. Tambien se incluye en la Tabla 1 una lista de herbicidas ariloxifenoxi propionato (a los que se hace referencia tambien como ariloxifenoxi propanoato; ariloxifenoxialcanoato; oxifenoxi; APP; AOPP; APA; APPA; FOP, notese que estos a veces se escriben con el sufijo “-oico”) que interfieren la actividad de la acetil-Coenzima A carboxilasa y se pueden utilizar en conjuncion con las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion. Un experto en la tecnica reconocera que se pueden utilizar otros herbicidas de esta clase en conjuncion con las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion.
Tabla 1
Inhibidor de ACCasa
Clase Compania Ejemplos de Sinonimos y Nombres comerciales
aloxidim
DIM BASF Fervin, Kusagard, NP-48Na, BAS 9021 H, Carbodimedon, Zizalon
butroxidim
DIM Syngenta Falcon, ICI-A0500, Butroxidim
cletodim
DIM Valent Select, Prism, Centurion, RE-45601, Motsa
Clodinafop-propargilo
FOP Syngenta Discover, Topik, CGA 184 927
clofop
FOP Fenofibric Acid, Alopex
cloproxidim
FOP
clorazifop
FOP
cicloxidim
DIM BASF Focus, Laser, Stratos, BAS 517H
cyhalofop-butilo
FOP Dow Clincher, XDE 537, DEH 112, Barnstorm
diclofop-metilo
FOP Bayer Hoegrass, Hoelon, Illoxan, HOE 23408, Dichlorfop, Illoxan
fenoxaprop-P-etilo
FOP Bayer Super Whip, Option Super, Exel Super, HOE-46360, Aclaim, Puma S, Fusion
fentiaprop
FOP Taifun; Joker
fluazifop-P-butilo
FOP Syngenta Fusilade, Fusilade 2000, Fusilade DX, ICI-A 0009, ICI-A 0005, SL- 236, IH-773B, TF-1169, Fusion
haloxifop-etotilo
FOP Dow Gallant, DOWCO 453EE
haloxifop-metilo
FOP Dow Verdict, DOWCO 453ME
haloxifop-P-metilo
FOP Dow Edge, DE 535
isoxapirifop
FOP
Metamifop
FOP Dongbu NA
pinoxaden
DEN Syngenta Axial
profoxidim
DIM BASF Aura, Tetris, BAS 625H, Clefoxidim
propaquizafop
FOP Syngenta Agil, Shogun, Ro 17-3664, Correct
quizalofop-P-etilo
FOP DuPont Assure, Assure II, DPX-Y6202-3, Targa Super, NC-302, Quizafop
quizalofop-P-tefurilo
FOP Uniroyal Pantera, UBI C4874
setoxidim
DIM BASF Poast, Poast Plus, NABU, Fervinal, NP-55, Sertin, BAS 562H, Cyetoxidim, Rezult
tepraloxidim
DIM BASF BAS 620H, Aramo, Caloxidim
tralcoxidim
DIM Syngenta Achieve, Splendor, ICI-A0604, Tralcoxidime, Tralcoxidym
trifop
FOP
Ademas de los herbicidas enumerados anteriormente, se pueden utilizar otros inhibidores de la ACCasa en conjuncion con las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion. Por ejemplo, se pueden utilizar los herbicidas inhibidores de la ACCasa de la clase fenilpirazol, tambien conocidos como DENS. Un DEN a modo de ejemplo es el pinoxaden, que es un miembro tipo fenilpirazolina de esta clase. Las composiciones de herbicidas que contienen pinoxaden se venden bajo las marcas Axial y Traxos.
Las composiciones herbicidas de los mismos comprenden uno o mas herbicidas inhibidores de acetil-Coenzima A carboxilasa, y opcionalmente otros I.A. agronomicos, una o mas sulfonilureas (SU) que se seleccionan de entre el
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grupo que consiste en amidosulfurona, flupisulfurona, foramsulfurona, imidazosulfurona, yodosulfurona, mesosulfurona, nicosulfurona, tifensulfurona, y tribenurona, sales y esteres agronomicamente aceptables, o una o mas imidazolinonas que se seleccionan de entre el grupo de imazamox, imazetapir, imazapir, imazapic, combinaciones de los mismos, y sus sales y esteres agricolamente aceptables, se pueden utilizar en cualquier formato agronomicamente aceptable. Por ejemplo, se pueden formular como soluciones acuosas, polvos, suspensiones listas para pulverizar; como soluciones, suspensiones, dispersiones u otras, acuosas u oleosas, concentradas o altamente concentradas; como emulsiones, dispersiones oleosas, pastas, polvos finos, granulos u otros formatos dispersables. Las composiciones herbicidas se pueden aplicar por cualquier medio conocido en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, pulverizacion, atomizacion, espolvoreado, diseminacion, humidificacion, tratamiento de semillas o co-plantando en una mezcla con la semilla. Las formas de uso dependen del fin pretendido; en cualquier caso, deberan asegurar la distribucion mas fina posible de los ingredientes activos.
En otras realizaciones, en las que el I.A. opcional incluye un herbicida de una clase diferente al que las plantas serian normalmente susceptibles, la planta que se va a utilizar se selecciona de entre las que comprende ademas una caracteristica de tolerancia a dicho herbicida. Dichas caracteristicas de tolerancia adicionales se pueden proporcionar a la planta por cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, incluyendo tecnicas de cruzamiento tradicional para obtener un gen caracteristico de tolerancia por hibridacion, introgresion. de mutagenesis, y/o transformacion. Dichas plantas se pueden describir como que tienen caracteristicas “acumuladas”.
Ademas, cualquiera de los herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa se pueden combinar con uno o mas herbicidas de otra clase, por ejemplo, cualquiera de los herbicidas inhibidores de la acetohidroxiacido sintasa, herbicidas inhibidores de la EPSP sintasa, herbicidas de la glutamina sintasa, herbicidas inhibidores de la biosintesis de lipidos o pigmentos, herbicidas destructores de membrana celular, herbicidas inhibidores de la fotosintesis o respiracion, o herbicidas inhibidores del crecimiento o reguladores del crecimiento que se conocen en la tecnica. Ejemplos no limitantes incluyen los que se enumeran en el Weed Science Society of America's Herbicide Handbook, 9a Edition editado por S.A. Senseman, copyright 2007. Una composicion herbicida en el presente documento puede contener uno o mas ingredientes activos agricolas que se seleccionan de entre fungicidas, fungicidas estrobilurina, insecticidas (incluyendo nematocidas), acaricidas, y molusquicidas agricolamente aceptables. Ejemplos no limitantes incluyen los enumerados en la 2009 Crop Protection Reference (
www.greenbook.net), Vance Publications.
En una realization de la invention, cualquiera de los herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa anteriores se combinan con herbicidas que presentan un dano bajo para el arroz, por lo que la tolerancia del arroz a dichos herbicidas puede ser opcionalmente el resultado de modificaciones geneticas de las plantas cultivadas. Ejemplos de dichos herbicidas son los herbicidas inhibidores de la acetohidroxiacido sintasa imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, azimsulfuron, bensulfuron, chlorimuron, ciclosulfamuron, etoxisulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, metsulfuron, ortosulfamuron, propirisulfuron, pirazosulfuron, bispiribac, pirimisulfan o penoxsulam, los herbicidas inhibidores de la EPSP sintasa glifosato o sulfosato, los herbicidas inhibidores de la glutamina sintasa glufosinato, glufosinato-P o bialafos, los herbicidas inhibidores de la sintesis de lipidos benfuresato, molinato o tiobencarb, los herbicidas inhibidores de la fotosintesis bentazon, paraquat, prometrin o propanil, los herbicidas decolorantes benzobiciclona, clomazona o tefuriltriona, herbicidas auxinas 2,4-D, fluroxipir, MCPA, quinclorac, quinmerac o triclopir, el herbicida inhibidor de microtubulos pendimetalin, los herbicidas inhibidores de VLCFA anilofos, butaclor, fentrazamida, ipfencarbazona, mefenacet, pretilaclor, acetoclor, metolaclor o S-metolaclor o los herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno-IX-oxidasa carfentrazona, oxadiazon, oxifluorfen, piraclonil o saflufenacil.
En una realizacion de la invencion, cualquiera de los herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa se combina con herbicidas que presentan un bajo dano a los cereales tales como el trigo, cebada o centeno, por lo que la tolerancia de los cereales a dichos herbicidas puede ser opcionalmente el resultado de modificaciones geneticas de las plantas de cultivo. Ejemplos de dichos herbicidas son los herbicidas inhibidores de la acetohidroxiacido sintasa, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, amidosulfuron, clorsulfuron, flucetosulfuron, flupirsulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, tritosulfuron, florasulam, piroxsulam, pirimisulfan, flucarbazona, propoxicarbazona o tiencarbazona, los herbicidas inhibidores de la EPSP sintasa glifosato o sulfosato, los herbicidas inhibidores de la glutamina sintasa glufosinato, glufosinato-P o bialafos, los herbicidas inhibidores de la sintesis de lipidos prosulfocarb, los herbicidas inhibidores de la fotosintesis bentazon, clorotoluron, isoproturon, ioxinil, bromoxinil, los herbicidas decolorantes diflufenican, flurtamone, picolinafen o pirasulfotole, los herbicidas auxinas aminociclopiraclor, aminopiral-id, 2,4-D, dicamba, fluroxipir, MCPA, clopiralid, MCPP, o MCPP-P, los herbicidas inhibidores de microtubulos pendimetalin o trifluralin, el herbicida inhibidor de VLCFA flufenacet, o los herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno-IX-oxidasa bencarbazona, carfentrazona o saflufenacil, o el herbicida difenzoquat.
En una realizacion de la invencion, cualquiera de los herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa anteriores se combinan con herbicidas que presentan un bajo dano al pasto, de manera que la tolerancia del pasto a dichos herbicidas puede ser opcionalmente el resultado de modificaciones geneticas de las plantas cultivadas. Ejemplos de dichos herbicidas son los herbicidas inhibidores de la acetohidroxiacido sintasa imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, flazasulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, trifloxisulfuron, bispiribac o tiencarbazona, los herbicidas inhibidores de la EPSP sintasa glifosato o sulfosato, herbicidas inhibidores
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de la glutamina sintasa glufosinato, glufosinato-P o bialafos, los herbicidas inhibidores de la fotosmtesis atrazina o bentazon, los herbicidas decolorantes mesotrione, picolinafen, pirasulfotole o topramezona, los herbicidas auxina aminociclopiraclor, aminopiralid, 2,4-D, 2,4-DB, clopiralid, dicamba, diclorprop, diclorprop-P, fluroxipir, MCPA, MCPB, MCPP, MCPP-P, quinclorac, quinmerac o triclopir, el herbicida inhibidor de microtubulos pendimetalin, herbicidas inhibidores de VLCFA dimetenamida, dimetenamida-P o ipfencarbazona, herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno-IX-oxidase saflufenacil o sulfentrazona, o el herbicida indaziflam.
Ademas, cualquiera de los herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa anteriores se pueden combinar con protectores. Los protectores son compuestos quimicos que evitan o reducen el dano de las plantas utiles sin tener un impacto importante sobre la accion herbicida de los herbicidas sobre las plantas no deseadas. Se pueden aplicar antes de la siembra (por ejemplo, en tratamientos de las semillas, brotes o plantulas) o en la aplicacion pre-germinacion o post-germinacion de la planta util. Los protectores y los herbicidas mencionados anteriormente se pueden aplicar simultaneamente o sucesivamente. Los protectores adecuados son por ejemplo, acidos (quinolin-8-oxi)acetico, acidos 1-fenil-5-haloalquil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxNicos, acidos 1-fenil-4,5-dihidro-5- alquil-lH-pirazol-3,5-dicarboxNicos, acidos 4,5-dihidro-5,5-diaril-3-isoxazol carboxilicos, dicloroacetamidas, alfa- oximinofenilacetonitrilos, adetofenonoximas, 4,6-dihalo-2-fenilpirimidinas, N-[[4-(aminocarbonil)fenil]sulfonil]-2- benzoico amidas, anhidrido 1,8-naftalico, acidos 2-halo-4-(haloalquil)-5-tiazol carbox^licos, fosfortiolatos y N-alquil-O- fenilcarbamatos. Ejemplos de protectores son benoxacor, cloquintocet, ciometrinil, ciprosulfamida, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifeno, mefenpir, mefenato, anhidrido naftalico, oxabetrinil, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaspiro[4.5-]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) y 2,2,5-trimetil-3- (dicloroacetil)-1,3-oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31-4).
En algunas realizaciones, una composition herbicida de las mismas puede comprender, por ejemplo, una combination de herbicida(s) auxinico(s), por ejemplo dicamba; inhibidor(es) AHAS, por ejemplo, imidazolinonas(s) y/o sulfonilurea(s); inhibidor(es) de ACCasa; inhibidor(es) de EPSPS, por ejemplo glifosato, inhibidor(es) de glutamina sintasa, por ejemplo, glufosinato; inhibidor(es) de protoporfirinogeno-lX (PPO), por ejemplo, saflufenacil; fungicida(s), por ejemplo fungicida(s) estrobilurina tales como piraclostrobina, y similares. En algunas realizaciones, una composicion herbicida de la misma puede comprender, por ejemplo, una combinacion de herbicida(s) auxinico, por ejemplo, dicamba, un herbicida inhibidor de microtubulos, por ejemplo, pendimetalina y fungicida(s) estrobilurina tal como pirasclostrobina(s). Una composicion herbicida se seleccionara de acuerdo con las tolerancias de una planta a la misma, y la planta se puede seleccionar de entre las que tienen caracteristicas de tolerancia acumuladas.
Los herbicidas individualmente y/o en combinacion que se describen en el presente documento se pueden utilizar como pre-mezclas, o mezclas de deposito. Dichos herbicidas tambien se pueden incorporar en composiciones agronomicamente aceptables.
Los expertos en la tecnica reconoceran que algunos de los herbicidas mencionados anteriormente y/o protectores son capaces de formar isomeros geometricos, por ejemplo, isomeros E/Z. Es posible utilizar ambos, los isomeros puros y mezclas de los mismos, en las composiciones que se utilizan de acuerdo con la invention. Ademas, algunos de los herbicidas y/o protectores mencionados anteriormente tienen uno o mas centros de quiralidad y, como consecuencia, se presentan como enantiomeros o diastereomeros. Es posible utilizar ambos, los enantiomeros y diastereomeros puros y sus mezclas, en las composiciones utilizadas de acuerdo con la invencion. En particular, algunos de los herbicidas ariloxifenoxi propionato son quirales, y algunos de ellos se utilizan comunmente en forma enantiomericamente enriquecida o enantiopura, por ejemplo, clodinafop, cyhalofop, fenoxaprop-P, fluazifop-P, haloxifop-P, metamifop, propaquizafop o quizalofop-P. Como un ejemplo adicional, se puede utilizar glufosinato en forma enantiomericamente enriquecida o enantiopura, tambien conocido como glufosinato-P.
Los expertos en la tecnica reconoceran que cualquier derivado de los herbicidas y protectores mencionados anteriormente se pueden utilizar en la practica de la invencion, por ejemplo sales y esteres agricolamente adecuados.
Los herbicidas y/o protectores, o las composiciones herbicidas que los comprenden, se pueden utilizar, por ejemplo, en forma de soluciones, polvos, suspensiones listos para pulverizar, tambien suspensiones o dispersiones u otras altamente concentradas acuosas u oleosas, emulsiones, dispersiones oleosas, pastas, polvos finos, materiales para dispersion, o granulos, por medio de pulverization, atomization, espolvoreado, dispersion, humidification o tratamiento de la semilla o mezclando con la semilla. Las formas de uso dependen del fin que se pretenda; en cualquier caso se deberia asegurar la distribution mas fina posible de los ingredientes activos que se utilizan de acuerdo con la invencion.
Las composiciones herbicidas comprenden una cantidad de herbicida eficaz de al menos uno de los herbicidas inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa y potencialmente de otros herbicidas y/o protectores y auxiliares que se ajustan para la formulation de agentes de protection de cultivos.
Ejemplos de los auxiliares a medida para la formulacion de los agentes de proteccion de cultivos son auxiliares inertes, vehiculos solidos, tensioactivos (tales como dispersantes, coloides protectores, emulsionantes, agentes humectantes y adhesivos), espesantes organicos e inorganicos, bactericidas, agentes anticongelantes,
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antiespumantes, opcionalmente colorantes y, para las formulaciones de semilla, adhesivos. El experto en la tecnica esta suficientemente familiarizado con las recetas de dichas formulaciones.
Ejemplos de espesantes (es decir que hacen que la formulacion tenga propiedades de fluidez modificadas, es decir, alta viscosidad en estado de reposo y baja viscosidad en movimiento) son polisacaridos, tales como goma de xantano (Kelzan® de Kelco), Rhodopol® 23 (Rhone Poulenc) o Veegum® (de R.T. Vanderbilt), y tambien minerales laminares organicos e inorganicos, tales como Attaclay® (de Engelhardt).
Ejemplos de antiespumantes son las emulsiones de silicio (tales como , por ejemplo, Silikon® SER, Wacker o Rhodorsil® de Rhodia), alcoholes de cadena larga, acidos grasos, sales de acidos grasos, compuestos organofluorados y mezclas de los mismos.
Se pueden anadir bactericidas para estabilizar las formulaciones herbicidas acuosas. Ejemplos de bactericidas y los bactericidas basados en diclorofeno y alcohol bencilico hemiforme (Proxel® de ICI o Acticida® RS de Thor Chemie y Katon® MK de Rohm y Haas), y tambien derivados de isotiazolinona, tales como alquilisotiazolinonas y benciso- tiazolinonas (Acticide MBS de Thor Chemie).
Ejemplos de agentes anticongelantes son etilenglicol, propilenglicol, urea o glicerol.
Ejemplos de colorante son pigmentos poco hidrosolubles y colorantes hidrosolubles. Ejemplos que se pueden mencionar son los colorantes que se conocen con los nombres Rodamina B, C.I. Pigmento Rojo 112 y C.I. disolvente Rojo 1, y tambien pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarillo 1, pigmento amarillo 13, pigmento rojo 112, pigmento rojo 48:2, pigmento rojo 48:1, pigmento rojo 57:1, pigmento rojo 53:1, pigmento naranja 43, pigmento naranja 34, pigmento naranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento blanco 6, pigmento marron 25, basico violeta 10, violeta basico 49, rojo acido 51, rojo acido 52, rojo acido 14, azul acido 9, amarillo acido 23, rojo basico 10, rojo basico 108.'
Ejemplos de adhesivos son polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, alcohol polivimlico y tilosa.
Auxiliares inertes adecuados son, por ejemplo, los siguientes: fracciones de aceite mineral de medio a alto punto de ebullicion, tales como queroseno y gasoleo, ademas aceites de alquitran y aceites de origen vegetal o animal , hidrocarbonos alifaticos, ciclicos y aromaticos, por ejemplo, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados y sus derivados, bencenos alquilados y sus derivados, alcoholes tales como metanol, etanol, propanol, butanol y ciclohexanol, cetonas tales como ciclohexanona o disolvente fuertemente polares, por ejemplo, aminas tales como N-metilpirrolidona, y agua.
Los vehiculos adecuados incluyen vehiculos liquidos y solidos. Los vehiculos liquidos incluyen, por ejemplo, disolventes no acuosos tales como hidrocarbonos ciclicos y aromaticos, por ejemplo parafinas, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados y sus derivados, bencenos alquilados y sus derivados, alcoholes tales como metanol, etanol, propanolol, butanol y ciclohexanol, cetonas tales como ciclohexanona, disolventes fuertemente polares, por ejemplo, aminas tales como N-metilpirrolidona, y agua asi como mezclas de los mismos. Los vehiculos solidos incluyen, por ejemplos tierras minerales tales como silices, geles de silicio, silicatos, talco, caolin, caliza, cal, yeso, tronco, loess, barro, dolomita, tierras de diatomeas, sulfato calcico, sulfato magnesico, y oxido magnesico, materiales sinteticos de suelo, fertilizantes tales como sulfato amonico, fosfato amonico, nitrato amonico, y ureas, y productos de origen vegetal tales como harina de cereales, corteza de arbol molida, madera molida y cascaras de frutos secos molidas, polvos de celulosa, u otros vehiculos solidos.
Los tensioactivos adecuados (adyuvantes, agentes humectantes, adhesivos, dispersantes y tambien emulsionantes) son las sales alcalinometalicas, sales alcalinoterreas y sales de amonio de acidos sulfonicos aromaticos, por ejemplo, acidos lignosulfonicos (por ejemplo, tipos Borrespers, Borregaard), acidos fenosulfonicos, acidos naftalenosulfonicos (tipos Morwet, Akzo Nobel) y acido dibutilnaftalenosulfonico (tipos Nekal, BASF AG), y de acidos grasos, alquil y alquilarilsulfonatos, alquil sulfatos, lauril eter sulfatos y sulfatos alcohol grasos, condensados de naftaleno sulfonado y sus derivados con formaldehido, condensados de naftaleno o de acidos naftalensulfonicos con fenol y formaldehido, polioxietileno octilfenol eter, isooctil, octil o nonilfenol, alquilfenil o tributilfenil poliglicol eter, isooctil, octil o nonilfenol etoxilado alquifenilo o tributilfenil poliglicol eter, alquilaril polieter alcoholes, alcohol isotridecilico, condensados de alcohol graso/oxido de etileno, aceite de ricino etoxilado, alquil eteres de polioxietileno o alquileteres de polioxipropileno, eter acetato de poliglicol alcohol laurilico, esteres de sorbitol, licores y proteinas residuales de lignosulfito, proteinas desnaturalizadas, polisacaridos (por ejemplo, metilcelulosa), almidones modificados hidrofobamente, alcohol polivimlico (ipos Mowiol Clariant), policarboxilatos (BASF AG, tipos Sokalan), polialcoxilatos, polivinilamina (BASF AG, tipos Lupamina), polietilenimina (BASF AG, tipos Lupasol), polinivilpirrolidona y copolimeros de los mismos.
Los polvos, materiales de dispersion y polvos finos se pueden preparar mezclando o moliendo concomitantemente los ingredientes activos junto con un vehiculo solido.
Los granulos, por ejemplo, los granulos revestidos, los granulos impregnados y granulos homogeneos, se pueden
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preparar uniendo los ingredientes activos a vehnculos solidos.
Las formas de uso acuoso se pueden preparar a partir de concentrados de emulsiones, suspensiones, pastas, polvos humectables o granulos dispersables en agua anadiendo agua. Para preparar las emulsiones, pastas o dispersiones oleosas, las composiciones herbicidas como tal o disueltas en un aceite o disolvente, se pueden homogeneizar en agua por medio de un agente humectante, adhesivo, dispersante o emulsionante. De manera alternativa, tambien es posible preparar concentrados que comprenden el compuesto activo, agente humectante, adhesivo, dispersantes o emulsionante y si se desea, disolvente o aceite, que son adecuados para la dilucion en agua.
Metodos para controlar las malas hierbas
Las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion se pueden utilizar en conjuncion con un herbicida al que son tolerantes. Los herbicidas se pueden aplicar a las plantas de la invencion utilizando cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica. Los herbicidas se pueden aplicar en cualquier proceso de cultivo de la planta. Por ejemplo, los herbicidas se pueden aplicar en el pre-plantado, en el plantado, en la pre-germinacion, post- germinacion o combinaciones de los mismos.
Las composiciones herbicidas de los mismos se pueden aplicar, por ejemplo, como tratamientos foliares, tratamientos del suelo, tratamientos de las semillas, o inundacion del suelo. La aplicacion se puede hacer, por ejemplo, por pulverizacion, espolvoreado, diseminacion, o cualquier otro metodo util conocido en la tecnica.
En una realizacion, los herbicidas se pueden utilizar para controlar el control de las malas hierbas que se pueden encontrar creciendo en la vecindad de las plantas tolerantes a herbicidas de la invencion. En realizaciones de este tipo, se puede aplicar un herbicida en un sembrado en el cual se cultivan plantas tolerantes a herbicidas de la invencion en vecindad de malas hierbas. Se puede aplicar entonces un herbicida al que la planta tolerante a herbicidas de la invencion es tolerante al sembrado a una concentracion suficiente para eliminar o inhibir el crecimiento de las malas hierbas. Las concentraciones de herbicidas suficientes para eliminar o inhibir el crecimiento se conocen en la tecnica.
Habiendo ya descrito la presente invencion en detalle, la misma se entendera mas claramente en referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen en el presente documento con fines de ilustracion solamente y no se pretende que limiten la invencion.
Uso de cultivos celulares para la selection de herbicida
Los cultivos tolerantes a herbicidas ofrecen a los agricultores opciones adicionales para el manejo de las malas hierbas. Actualmente, hay soluciones modificadas geneticamente (GMO) disponibles en algunos sistemas de cultivo. Se han utilizado tecnicas mutacionales adicionales para seleccionar las actividades o estructuras enzimaticas alteradas que dan lugar a la resistencia al herbicida tales como las soluciones actuales CLEARFIELD® de BASF. En los EE. UU., Arroz CLEARFIELD es la primera herramienta para manejar el arroz rojo en areas infestadas (USDA- ARS, 2006); sin embargo, el flujo genetico entre el arroz rojo y el Arroz CLEARFIELD representa un riesgo considerable para la tolerancia a AHAS ya que el cruzamiento externo, se ha informado hasta 170 hibridos F1/ha (Shivrain et al, 2007). Las directrices de administration incluyen, entre otros aspectos, la alternancia de Arroz no CLEARFIELD puede limitar la penetration en el mercado del Arroz CLEARFIELD. La generation de arroz cultivado con tolerancia a graminicidas de un modo de action diferente (MOA) reduciria estos riesgos y proporcionaria mas herramientas para el manejo de malas hierbas.
Una enzima que ya es una diana para muchos herbicidas de gramineas diferentes es la acetil-CoA carboxilasa (ACCasa, EC 6.4.1.2), que cataliza la primera etapa acometida en la biosintesis de acidos grasos (FA). Los herbicidas de tipo ariloxifenoxipropionato (APP o FOP) y ciclohexanodiona (CHD o DIM) se utilizan tras la germinacion en cultivos de dicotiledoneas, con la excepcion del cihalofop-butilo que es selectivo en el arroz para controlar las malas hierbas. Ademas, la mayoria de estos herbicidas tienen una persistencia relativamente baja en el suelo y proporciona a los agricultores flexibilidad para el control de malas hierbas y la rotation de cultivos. Se sabe que las mutaciones en esta enzima dan lugar a tolerancia a grupos especificos de FOPS y/o DIMS (Liu et al, 2007; Delye et al, 2003, 2005).
Los cultivos celulares ofrecen una estrategia alternativa en la que los grupos de callos representan cientos o incluso miles de celulas, cada una de las cuales se pueden seleccionar por una nueva caracteristica como la resistencia a herbicidas (Jain, 2001). Las mutaciones se producen espontaneamente en el cultivo tisular o por algun tipo de induction se pueden seleccionar directamente en el cultivo y seleccionar los eventos mutados.
La explotacion de la variation somatoclonica que es inherente a las tecnicas de cultivo tisular ha sido una estrategia satisfactoria para generar selectivamente mutaciones que dan lugar a tolerancia a DIM o FOP en maiz (Somers, 1996; Somers et al., 1994; Marshal et al., 1992; Parker et al., 1990) y en grama de rio (Heckart et al, 2009). En el caso del maiz, se pueden calcular las eficacias de production de eventos regenerables. En Somers et al., 1994, se
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obtuvieron plantas de maiz resistentes a setoxidim utilizando la seleccion en cultivos tisulares. Utilizaron 100 g de callo y se obtuvieron 2 lineas tolerantes siguiendo a la etapa de seleccion paso a paso a 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 y 10 |jM de setoxidim. Una tasa de mutacion calculada en su protocolo seria de 2 lineas /100 g de callo o 0,02 lineas/g.
En el caso de la grama de rio, Heckert utilizo directamente un alto nivel de setoxidim y recupero 3 lineas regenerables en aproximadamente 10.000 piezas de callo o, esencialmente, una tasa del 0,03 %. Aunque no es comparable, estos numeros se utilizaran despues para la comparacion con la mutagenesis del arroz en cultivo tisular. En el trabajo con maiz, los callos se seleccionaron constantemente en cada estadio de seleccion siendo transferidos solamente los callos en crecimiento; sin embargo, en el caso de la grama de rio, se transfirieron todos los callos a cada subcultivo. Los genes ACCasa son marcadores geneticos.
La transformacion de plantas implica el uso de genes de marcadores geneticos para identificar unas pocas celulas o individuos transformados de un grupo mas grande de celulas o individuos no transformados. Los genes del marcador genetico existen, pero estan limitados en numero y disponibilidad. Se necesitan marcadores geneticos alternativos para las caracteristicas acumuladas. Ademas, a menudo es deseable el uso de un marcador genetico que da lugar a una caracteristica agronomica (es decir, resistencia a un herbicida). Los genes de ACCasa se pueden utilizar como marcadores geneticos que se pueden anadir al limitado grupo actual de genes marcadores geneticos disponibles. Cualquiera de los mutantes descritos en el presente documento se puede introducir en un plasmido con un gen de interes y transformarse en la planta completa, tejido vegetal o celula vegetal para utilizarlos como marcadores geneticos. Un metodo detallado se perfila en el ejemplo 7 posteriormente. Los marcadores geneticos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir eventos que dan lugar a tolerancia de campo a un grupo determinado de herbicidas y otros en los que se ha demostrado una proteccion cruzada (es decir, FOPS).
Los sistemas de transformacion vegetales modernos de alto rendimiento necesitan un sistema de marcador genetico eficaz; sin embargo, hay un numero limitado disponible que se acepten en el mercado. Por lo tanto, los sistemas de seleccion que tambien cumplen las caracteristicas comerciales siempre son valiosos. El sistema que se describe en el presente documento es un sistema de seleccion eficaz en/para celulas vegetales que tambien codifica una caracteristica de tolerancia a herbicidas que es adecuada para su utilizacion en cualquier cultivo de monocotiledoneas.
Se describe en el presente documento un metodo para seleccionar una planta transformada que comprende la introduccion de una molecula de acido nucleico que codifica un gen de interes en una celula vegetal, en la que la molecula de acido nucleico codifica adicionalmente una acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) mutante en la que la secuencia de aminoacidos se diferencia de una secuencia de aminoacidos de una ACCasa de una planta de arroz de tipo silvestre correspondiente en una posicion de aminoacido; y poner en contacto las celulas vegetales con un inhibidor de la ACCasa para obtener la planta transformada, en la que dicha ACCasa mutante da lugar, al transformarse la planta, a un aumento de la tolerancia a herbicidas en comparacion con la variedad correspondiente de la planta de tipo silvestre cuando se expresa en ella.
Ademas, se describe en el presente documento un cruzamiento asistidos por marcador, el metodo comprende el cruzamiento de cualquier planta de la invencion con una segunda planta; y poner en contacto la progenie de la etapa de agrupamiento con un inhibidor de la ACCasa para obtener la progenie que comprende dicho mutante ACCasa; en el que dicha ACCasa mutante da lugar en las plantas de la progenie a un aumento de tolerancia a herbicidas en comparacion con la segunda planta.
Un unico gen de ACCasa se puede unir a un unico gen de interes. El gen de ACCasa se puede unir corriente arriba o corriente abajo del gen de interes.
El acido nucleico y proteina ACCasa como se ha descrito anteriormente se pueden utilizar en ensayos diagnosticos. Los usos del diagnostico por marcadores geneticos descritos en el presente documento se pueden emplear para identificar el gen ACCasa. Los metodos de diagnostico pueden incluir metodologias PC, ensayos proteicos, sondas marcadas, y cualquier otro de los metodos de diagnostico convencionales que se conocen en la tecnica.
Ejemplos
Ejemplo 1
Condiciones de cultivo tisular
Se desarrollo un ensayo de mutagenesis en cultivo tisular in vitro para aislar y caracterizar un tejido vegetal (por ejemplo, un tejido de arroz) que sea tolerante a herbicidas que inhibidores de la acetil-Coenzima A carboxilasa, por ejemplo, tepraloxidim, cicloxidim, y setoxidim. El ensayo utiliza la variacion somatoclonica que se encuentra en el cultivo tisular in vitro. Las mutaciones espontaneas derivadas de la variacion somatoclonica se puede aumentar por mutagenesis quimica y la posterior seleccion de una manera paso a paso, en concentraciones crecientes de herbicida.
Se describen en el presente documento las condiciones de cultivo tisular para promover el crecimiento de callos de
arroz embriogenicos friables que sean regenerables. Los callos se iniciaron a partir de 4 cultivares de arroz diferentes que englobaban ambas variedades de Japonica (Taipei 309, Nipponbare, Koshihikari) e Indica (Indica 1). Las semillas descascarilladas se esterilizaron en su superficie en un 70 % de etanol durante aproximadamente 1 minuto seguido por una lejia comercial Clorox al 20 % durante 20 minutos. Las semillas se aclararon con agua esteril 5 y se colocaron en placas en medio de induccion de callos. Se ensayaron varios medios de induccion de callos. Las listas de ingredientes de los medios ensayados se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2
Ingrediente
Suministrador R001M R025M R026M R327M R008M MS711 R
Vitamina B5
Sigma 1,0 X
Sales MS
Sigma 1,0 X 1,0 X 1,0 X 1,0 X
Vitaminas MS
Sigma 1,0 X 1,0 X
Sales N6
Phytotech 4,0 g/l 4,0 g/l
Vitamina N6
Phytotech 1,0 X 1,0 X
L-Prolina
Sigma 2,9 g/l 0,5 g/l 1,2 g/l
Aminoacidos de Cas
BD 0,3 g/l 0,3 g/l 2 g/l
Hidrolizado de Caseina
Sigma 1,0 g/l
Monohidrato de L- Asp
Phytotech 150 mg/l
Acido Nicotinico
Sigma 0,5 mg/l
Piridoxina HCl
Sigma 0,5 mg/l
Tiamina HCl
Sigma 1,0 mg/l
Mioinositol
Sigma 100 mg/l
MES
Sigma 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l 500 mg/l
Maltosa
VWR 30 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l
Sorbitol
Duchefa 30 g/l
Sacarosa
VWR 10 g/l 30 g/l
NAA
Duchefa 50 mg/l
2,4-D
Sigma 2,0 mg/l 1,0 mg/l
MgCh-6H2O
VWR 750 mg/l
^pH
5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,7
Gelrite
Duchefa 4,0 g/l 2,5 g/l
Agarosa Tipo 1
Sigma 7,0 g/l 10 g/l 10 g/l
^Autoclave
15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 20 min
Cinetina
Sigma 2,0 mg/l 2,0 mg/l
NAA
Duchefa 1,0 mg/l 1,0 mg/l
ABA
Sigma 5,0 mg/l
Cefotaxima
Duchefa 0,1 g/l 0,1 g/l 0,1 g/l
Vancomicina
Duchefa 0,1 g/l 0,1 g/l 0,1 g/l
Disulfato de G418
Sigma 20 mg/l 20 mg/l 20 mg/l
10
El medio de induccion de callos R001M se selecciono tras ensayar numerosos ensayos. Los cultivos se mantuvieron en oscuridad a 30 °C. Los callos embriogenicos se subcultivaron en medio nuevo tras 10-14 dias.
Ejemplo 2
15
Seleccion de callos tolerantes a herbicidas
Una vez que se determinaron las condiciones de cultivo, se establecieron condiciones de seleccion creadas adicionalmente por medio del analisis de la supervivencia tisular en curvas de destruccion con cicloxidim, 20 tepraloxidim, setoxidim (Figura 1) o haloxifop (no mostrado). Se llevo a cabo la cuidadosa consideracion de la acumulacion de herbicida en el tejido, asi como su persistencia y estabilidad en las celulas y en el medio de cultivo. Por medio de estos experimentos, se establecio una dosis subletal para la seleccion inicial de material mutado.
Despues del establecimiento de la dosis de partida de setoxidim, cicloxidim, tepraloxidim, y haloxifop en los medios 25 de seleccion, se seleccionaron los tejidos de una manera por etapas aumentando la concentracion del inhibidor de ACCasa con cada transferencias hasta que las celulas que crecian vigorosamente en presencia de dosis toxicas se recuperaban (vease la Figura 2). Los callos resultantes se subcultivaron adicionalmente cada 3-4 semanas en R001M con un agente selectivo. Se sometieron mas de 26.000 calos a la seleccion por 4-5 subcultivos hasta que la presion selectiva estaba por encima de los valores toxicos segun se determinaba por las curvas de destruccion y las
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observaciones de los cultivos continuos. Se determinaron que los niveles toxicos eran de 50 |jM de setoxidim, 20 |jM de cicloxidim, 2,5 jM de tepraloxidim (Figura 1) y 10 jM de haloxifop (no mostrado).
De manera alternativa, se iniciaron cultivos liquidos a partir de los callos en MS711R (Tabla 2) con agitado lento y subcultivos semanales. Una vez que se establecieron los cultivos liquidos, se anadio el agente de seleccion directamente al matraz de cada subcultivo. Tras 2-4 rondas de seleccion en liquido, los cultivos se transfirieron a filtros en medio R001M solido para cultivos adicionales.
Ejemplo 3
Regeneracion de las plantas
El tejido tolerante se regenero y caracterizo molecularmente respecto a las mutaciones en la secuencia genetica de la ACCasa y/o bioquimicamente respecto a la alteracion de la actividad de ACCasa en presencia del agente selectivo.
Despues de la seleccion por herbicidas, los callos se regeneraron utilizando un regimen de medio R025M durante 10-14 dias, R026M cada 2 semanas, R327M hasta que se formaron bien los brotes, y R008S hasta que los brotes se enraizaban bien para transferirlos al invernadero (Tabla 2). La regeneracion se llevo a cabo sin luz. No se incluyo ningun agente de seleccion durante la regeneracion.
Una vez que se establecieron raices fuertes, los regenerantes M0 se trasplantaron al invernadero en macetas de 25,81 centimetros cuadrados en una mezcla de arena, suelo margoso Sandhills NC y Redi-eart (2:4:6) suplementada con yeso. Los trasplantes se mantuvieron bajo una copa de plastico transparente hasta que se adaptaron a las condiciones del invernadero (ca. 1 semana). El invernadero se fijo con un ciclo dia/noche de 27 °C/21 °C (80 °F/70 °F) con luz de 600 W de sodio a alta presion que suplementaban luz para mantener una longitud del dia de 14 horas. Las plantas se regaron 2-3 veces al dia dependiendo del tiempo y se fertilizaron diariamente. Las plantas de arroz seleccionadas para el aumento de semillas se trasplantaron a macetas de 3,79 litros. Cuando las plantas se acercaban a la madurez y se preparaban para florecer, las macetas se colocaron en plataformas con una pequena corriente para mantener mejor el suministro de agua y nutrientes. Las plantas se controlaron respecto a insectos y la salud de la planta y se manejaron segun las practicas de manejo de plagas integradas convencionales.
Ejemplo 4
Analisis de secuencia
Se recolecto el tejido foliar de las plantas clonicas separadas por trasplante y se analizaron como individuales. Se extrajo el ADN genomico utilizando el kit Wizard® 96 Magnetic DNA Plant System (Promega, Patentes de EE. UU. N° 6.027.945 y 6.368.800) segun las directrices del fabricante. El ADN aislado se amplifico por PCR utilizando un cebador directo y un cebador inverso.
Cebadores directos:
OsACCpU5142: 5'-GCAAATGATATTACGTTCAGAGCTG-3' (SEQ ID NO:7)
OsACCpU5245: 5'-GTTACCAACCTAGCCTGTGAGAAG-3' (SEQ ID NO: 8)
Cebadores inversos:
OsACCpL7100: 5'-GATTTCTTCAACAAGTTGAGCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 9)
OsACCpL7054: 5'-AGTAACATGGAAAGACCCTGTGGC-3' (SEQ ID NO: 10)
Se llevo a cabo la amplificacion por PCR utilizando la ADN polimerasa Hotstar Taq (Qiagen) utilizando un programa de termociclado touchdown de la siguiente manera: 96 °C durante 15 min, seguido por 35 ciclos (96 °C, 309 seg; 58 °C-0,2 °C por ciclo, 30 seg; 72 °C, 3 min y 30 seg), 10 min a 72 °C.
Los productos de la PCR se verificaron respecto a la concentracion y tamano de los fragmentos por medio de electroforesis en gel de agarosa. Los productos de la PCR desfosforilados se analizaron por secuencia directa utilizando los cebadores de la PCR (marcas de ADN). los archivos traza del cromatograma (.scf) se analizaron respecto a una mutacion con respecto a to Os05g0295300 utilizando el Vector NTI Advance 10™ (Invitrogen). Basandose en la information de la secuencia, se identificaron dos mutaciones en varios individuos. I1.781 (Am)L y D2.078 (Am)G estaban presentes en el estado heterocigoto. Se llevo a cabo el analisis de secuencia en los cromatogramas representativos y el correspondiente alineamiento AlignX con los valores por defecto y se edito para apelar los picos secundarios.
Las muestras no consistentes con una mutacion de la ACCasa se ensayaron por pulverization en cuanto a la
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tolerancia y se desecharon como descartes. Sorprendentemente, la mayoria de las lmeas recuperadas eran heterocigotas para la mutacion 11.781 (Am)L y se generaron los eventos resistentes en todos los genotipos ensayados utilizando cicloxidim o setoxidim: Indica (> 18 lmeas), Taipei 309 (> 14 lmeas), Nipponbare (> 3 lineas), y Koshihikare (> 6 lineas). Una linea era heterocigota para una mutacion D2.078 (Am)G. Una lmea era heterocigota para una mutacion D2.078 (Am)G. La linea heterocigota D2.078 (Am)G aparecia atrofiada con hojas estrechas, mientras que los heterocigotos I1.781 (Am)L variaban de apariencia, pero la mayoria parecian normales con respecto a su genotipo parental. Se recuperaron varios descartes y se confirmaron por secuenciacion y ensayo de pulverizacion; sin embargo, los resultados de la secuenciacion de la region sensible a herbicida de la ACCasa revelo que los mutantes mas tolerantes eran heterocigotos para una mutacion D2.078 (Am)G, A por G. Hasta la fecha, todas las plantas recuperadas que carecian de una mutacion en ACCasa habian sido sensibles a la aplicacion de herbicidas en el invernadero.
Tabla 3: Genotipo de lineas de arroz recuperadas mediante la selection en cultivo tisular
Linea
Genotipo Parental Tipo de Arroz Mutacion Identificada ATCC® Designacion del deposito de la Patente
OsARWI1
Indica 1 indica I1781 (Am)L PTA-10568
OsARWI3
Indica 1 indica I1781 (Am)L PTA-10569
OsARWI8
Indica 1 indica I1781 (Am)L PTA-10570
OsARWI10
Indica 1 indica D2078 (Am)G NA, esteril
OSARWI315
Indica 1 indica I1781 (Am)L NA
OsHPHI2
Indica 1 indica I1781 (Am)L PTA-10267
OsHPHI3
Indica 1 indica I1781 (Am)L NA
OsHPHI4
Indica 1 indica I1781 (Am)L NA
OsHPHKl
Koshihikari Japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHK2
Koshihikari Japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHK3
Koshihikari japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHK4
Koshihikari japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHK6
Koshihikari japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHN1
Nipponbare japonica I1781 (Am)L PTA-10571
OsHPHT1
Taipei 309 japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHT4
Taipei 309 japonica I1781 (Am)L NA
OsHPHT6
Taipei 309 japonica I1781 (Am)L NA
Ejemplo 5
Demostracion de la tolerancia a herbicidas
Los mutantes seleccionados y los descartes se transfirieron a pequenas macetas. Los cultivares de tipo silvestre y 3 biovares de arroz rojo se germinaron de las semillas para servir de controles.
Tras ca. 3 semanas post-trasplante, los regenerantes MO se pulverizaron utilizando un dispositivo pulverizador con 400-1600 g i.a./ha de cicloxidim (BAS 517H) suplementado con un 0,1 % de aceite de semillas metilado. Despues de que se adaptaran las plantas a las condiciones del invernadero, se pulverizo un subgrupo con 800 g i.a./ha de cicloxidim. Una vez pulverizadas, las plantas se fotografiaron y se tasaron respecto al dano del herbicida a la 1 (Figura 3) y 2 semanas tras el tratamiento (Figura 4). No se observaba ningun dano en las plantas que contenian la mutacion heterocigota I1.178 (Am)L mientras que las plantas de control y los descartes del tejido tisular (plantas regeneradas negativas a las mutaciones secuenciadas) estaban gravemente danadas tras el tratamiento (Figuras 3 y 4). Las Figura 5-15 proporcionan las secuencias de acido nucleico y/o aminoacidos de las enzimas acetil- Coenzima A carboxilasa de varias plantas. La Figura 17 proporciona un grafico que muestra los resultados de los mutantes de arroz frente a varios inhibidores de ACCasa.
Ejemplo 6
Seleccion de herbicidas utilizando cultivos tisulares
Se selecciono el medio para su uso y se desarrollaron las curvas de destruction como se ha especificado anteriormente. Para la seleccion, se utilizaron diferentes tecnicas. Se aplico o una seleccion paso a paso, o se aplico un nivel letal de herbicida inmediatamente. En cualquier caso, todos los callos se transfirieron en cada nueva ronda de seleccion. La seleccion era de 4-5 ciclos de cultivo de 3-5 semanas cada ciclo. Los callos se colocaron en membranas de nailon par: facilitar la transferencia (hojas de 200 micras de poro, Biodesign, Saco, Maine). Se cortaron las membranas para ajustarse a placas de Petri de 100 x 20 mm y se esterilizaron en el autoclave antes de su uso. Se utilizaron 25-35 callos (siendo la media de peso/callo de 22 mg) en cada placa. Ademas, un grupo de callos se sometieron a seleccion en medio de cultivo liquido con subcultivos semanales seguido por seleccion
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adicional en medios semisolidos.
Las lmeas mutantes se seleccionaron utilizando cicloxidim o setoxidim en 4 genotipos de arroz distintos. Las eficacias de los mutantes que se obtienen eran altas basandose en un porcentaje de callos que daba lugar a una linea mutante regenerable o en el numero de lineas segun se determinaba por los gramos de tejido utilizado. En total, la frecuencia de mutacion en comparacion con la grama de rio es de 5 veces, y en comparacion con el maiz es de 2 veces. En algunos casos, esta diferencia era mucho mayor (> 10 veces) como se muestra en la Tabla 4 a continuacion.
Tabla 4
Genotipo
N° de Callos Seleccion Mutantes Tasa peso (g) N° / g de callo
Indica 1
1865 Cicloxidim 3 0,161 % 41,04 0,07
Indica 1
2640 Setoxidim 3 0,114 % 58,08 0,05
Koshi
1800 Cicloxidim 6 0,333 % 39,6 0,15
NB
3400 Cicloxidim 1 0,029 % 74,8 0,01
NB
725 Setoxidim 0 0,000 % 15,95 0,00
T309
1800 Cicloxidim 8 0,444 % 36,9 0,20
T309
1015 Setoxidim 0 0,000 % 22,33 0,00
Total
13245 21 0,159 % 291,39 0,07
Si se analizan los datos utilizando los criterios de seleccion, es posible ver que la seleccion con cicloxidim contribuye a una tasa mas alta de mutantes aislados que con setoxidim, como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5
Genotipo
N° de Callos Seleccion Mutantes Tasa peso (g) N° / g de callo
Indica 1
1865 Cicloxidim 3 0,161 % 41,03 0,07
Koshi
1800 Cicloxidim 6 0,333 % 39,6 0,15
NB
3400 Cicloxidim 1 0,029 % 74,8 0,01
T309
1800 Cicloxidim 8 0,444 % 39,6 0,20
Total
8865 18 0,203 % 195,03 0,09
Indica 1
2640 Setoxidim 3 0,114 % 58,08 0,05
NB
725 Setoxidim 0 0,000 % 15,95 0,00
T309
1015 Setoxidim 0 0,000 % 22,33 0,00
Total
4380 3 0,068 % 96,36 0,03
Utilizando este analisis, la tasa para el cicloxidim es de casi 10 veces mayor que el de las informaciones previas utilizando la seleccion con setoxidim, mientras que las tasas utilizando setoxidim son similares a las informaciones previas. Ademas, un 68 % de las lineas se confirmaron como mutantes cuando la seleccion era con cicloxidim en comparacion con un 21 % de las lineas cuando la seleccion era con setoxidim. Los aumentos parecen venir del uso de cicloxidim en vez de setoxidim como agente de seleccion. Ademas, el uso de membranas hace la transferencia de los callos significativamente mas facil que moviendo cada pieza individualmente durante los subcultivos. Se obtuvieron mas de 20 mutantes. La fertilidad parece ser mayor con la excepcion de un mutante que tenia una mutacion que se sabe que produce una falta de vigor (D2.078 (Am)G).
Ejemplo 7
Unos de genes de ACCasa mutantes como marcadores geneticos en la transformacion de plantas Metodos:
Se llevo a cabo la transformacion de arroz Indica y Nipponbare esencialmente como se describe en Hiei y Komari (2008) con la excepcion de las sustituciones de medio como se especifica (vease la tabla de medios adjunta para mas detalles). Los callos se indujeron en medio R001M durante 4-8 semanas antes de su uso en la transformacion. Se utilizo Agrobacterium LBA4404 (pSB1) (Ishida et al., 1996) transformado con RLM185 (L. Mankin, no publicado: contiene DsRed y un mutante AHAS para la seleccion), gen ACC que contenia I1781 (Am)L, gen ACC que contenia I1781 (Am)L y W2027C, gen ACC que contenia I1781 (Am)L y I2041 (Am)L, o gen ACC que contenia I1781 (Am)A o tipo silvestre que tambien contenia un gen AHAS mutante para la seleccion. El Agrobacterium cultivado durante 1-3 dias en medio solido se suspendio en medio M-LS-002 y la DO660 ajustado aproximadamente a 0,1. Los callos se sumergieron en la solucion de Agrobacterium durante aproximadamente 30 minutos. Se retiro el liquido, y luego se paso el callo a un papel de filtro para el co-cultivo en medio cc de arroz semisolido. El co-cultivo continuo durante 3
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d^as en oscuridad a 24 °C. Los filtros que conteman callos de arroz se transfirieron directamente a medio R001M que contema Timentin durante 1-2 semanas para la recuperacion y el cultivo en oscuridad a 30 °C. Los callos se subdividieron en medio R001M nuevo con Timentin y suplementado con 100 |jM de Imacetapir, 10 jM de Cicloxidim o 2,5 jM de Tepraloxidim. Tras 3-4 semanas, se transfirieron los callos a un medio nuevo de seleccion. Despues de otras 3-4 semanas, los callos en crecimiento se transfirieron a medio nuevo y se le permitio crecer antes del analisis Taqman. El analisis Taqman era para el terminador Nos y se llevo a cabo para proporcionar una confirmacion molecular de la naturaleza transgenica de los callos seleccionados. El crecimiento de los callos transgenicos se midio con varios agentes de seleccion subcultivando los callos en medios que conteman o 10 jM de Cicloxidim o Haloxifop, 2,5 jM de Tepraloxidim o 100 jM Imacetapir. El tamano de los callos se midio desde las imagenes escaneadas siguiendo el subcultivo inicial y luego ras aproximadamente 1 mes de cultivo.
La transformacion de embriones inmaduros de maiz se llevo a cabo esencialmente como ha descrito Lai et al. (remitido). En resumen, los embriones inmaduros se co-cultivaron con las mismas cepas de Agrobacterium utilizadas para la transformacion de arroz suspendidas en medio M-LS-02 a una DO660 de 1,0. El co-cultivo era en medio CC de maiz durante 3 dias en oscuridad a 22 °C. Se retiraron los embriones del co-cultivo y se transfirieron a un medio M-MS-101 durante 4-7 dias a 27 °C. Los embriones con respuesta se transfirieron a medio M-LS-202 para la seleccion con Imacetapir o medio M-LS-213 suplementado con 1 jM de Cicloxidim o 0,75 jM de Tepraloxidim y se trasladaron a la luz (16 h/8 h dia/noche) para la regeneracion. Los brotes aparecian entre 2-3 semanas y se transfirieron a cajas plantcon que conteman o M-LS-618 o M-LS-613 suplementados con 5 jM de Cicloxidim o 0,75 jM de Tepraloxidim para el desarrollo adicional de brotes y enraizamiento. Las muestras de hojas se remitieron para el analisis Taqman. Las plantas positivas se transfirieron al suelo para el crecimiento y la generacion de semilla. En el segundo grupo de experimentos, las condiciones eran identicas excepto por la seleccion con Tepraloxidim que disminuia a 0,5 jM durante la regeneracion y formacion de brotes y raices. En el tercer grupo de experimentos, tambien se ensayo el Haloxifop como agente de seleccion. En estos experimentos, se utilizo 1 M a lo largo de la seleccion.
Resultados y conclusiones
Los callos transgenicos se obtuvieron de los experimentos de transformacion de arroz Indica utilizando el gen ACC que contema I1781 (Am)L y W2027 (Am)C, y gen ACC que contema I1781 (Am)L y I2041 (Am)N. Un callo se obtuvo de un gen ACC que contema I1781 (Am)L y W2027 (Am)C siguiendo la seleccion con Tepraloxidim y 3 callos se obtuvieron del gen ACC que contema I1781 (Am)L y I2041 (Am)N. Se obtuvo un callo de un gen ACC que contema I1781 (Am)L y I2041 (Am)N utilizando la seleccion por Cicloxidim. El Nos Taqman mostraba que todos estos callos eran transgenicos. Se exploraron los callos respecto al crecimiento con distintos agentes de seleccion incluyendo el Imacetapir (Pursuit-P) por el marcador genetico mutante AHAS.
Como se puede observar en la Tabla 6, las construcciones mutantes dobles permiten el crecimiento con Cicloxidim y Tepraloxidim ademas de Haloxifop. Los niveles que se utilizan en estos experimentos de crecimiento son inhibidores para el material de tipo silvestre.
Tabla 6: Crecimiento del callo transgenico de Indica en distintos medios de seleccion. El crecimiento se midio como el % de cambio de tamano despues de 1 mes de cultivo en el medio de seleccion.
Seleccion mM
Construccion
H10 C10 T2.5 P100
I1781 (Am)L, W2027 (Am)C
1669 % 867 % 1416 % 739 %
I1781 (Am)L, I2041 (Am)N
1613 % 884 % 1360 % 634 %
Los resultados del primer grupo de experimentos en maiz revelan que se pueden utilizar tanto el mutante sencillo como el doble para la seleccion respecto a la resistencia a Cicloxidim o resistencia a ambos Cicloxidim y Tepraloxidim con una eficacia relativamente alta (Figura 16).
La eficacia entre los agentes de seleccion era relativamente comparable en estos experimentos con posiblemente una disminucion ligera en la eficacia total con el mutante sencillo en Cicloxidim en comparacion con la seleccion con Pursuit. Sin embargo, el doble mutante puede tener una eficacia ligeramente aumentada. La tasa descarte - el porcentaje de supuestos eventos no confirmados- era menor para Cicloxidim o Tepraloxidim. Ademas, en las condiciones descritas, era posible diferenciar entre los mutantes sencillos y dobles utilizando la seleccion de Tepraloxidim.
Se habian obtenido resultados similares en el segundo grupo de experimentos (no mostrado). En el tercer grupo de experimentos, el Haloxifop tambien es un marcador genetico eficaz para su uso en la transformacion con el mutante sencillo o doble (no mostrado).
El mutante sencillo es util para la transformacion de alta eficacia utilizando la seleccion con Cicloxidim o Haloxifop.
Tambien seria util con otros compuestos relacionados tales como el Setoxidim. El mutante doble es util para estos agentes de seleccion con la adicion de que se puede utilizar el Tepraloxidim. El mutante sencillo y doble se puede utilizar en una transformacion de dos etapas en las que el mutante sencillo se puede diferenciar del doble con la seleccion por Tepraloxidim. En combinacion con otros marcadores geneticos actuales de BASF, se dan dos 5 opciones mas para las transformaciones de alta eficacia de monocotiledoneas y de maiz en particular.
Los fenotipos de tolerancia a herbicidas segun se describen en el presente documento tambien se han presentado en plantas de arroz tolerantes a un inhibidor de ACCasa, en el campo con un tratamiento de Cicloxidim a 600 g/ha (datos no mostrados).
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Claims (17)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. Una planta de arroz que comprende un acido nucleico de acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) plastidica de arroz mutagenizado que tiene una secuencia que se obtiene por un metodo de mutagenesis aleatoria inducida y que codifica una ACCasa plastidica de arroz que tiene, como resultado de dicha mutagenesis, una sustitucion de isoleucina por leucina en la posicion de aminoacido correspondiente a la posicion 1.781 de la ACCasa plastidica de Alopecurus myosuroides (Am), en donde la ACCasa plastidica de arroz es una proteina que comprende una version modificada de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y confiere a una planta de arroz tolerancia a 100 g i.a./ha de cicloxidim.
  2. 2. La planta de arroz de la reivindicacion 1, en el que dicha ACCasa plastidica comprende ademas: una sustitucion de aminoacido en las posiciones 1.785; 1.786; 1.811; 1.864; 2.027; 2.039; 2.041; 2.049; 2.074; 2.075; 2.088; 2.080; 2.088; 2.095; 2.096 o 2.098 que se corresponde con la posicion de ACCasa plastidica de Alopecurus myosuroides (Am), una duplicacion de valina en la posicion 2.075 (Am) o una delecion del aminoacido en la posicion 2.080 (Am).
  3. 3. La planta de arroz de la reivindicacion 1 comprende ademas:
    a. una sustitucion por glicina en la posicion 1.785 (Am);
    b. una sustitucion por prolina en la posicion 1.786 (Am);
    c. una sustitucion por asparagina en la posicion 1.811 (Am);
    d. una sustitucion por glicina en la posicion 2.039 (Am);
    e. una sustitucion por isoleucina, leucina o fenilalanina en la posicion 2.049 (Am);
    f. una sustitucion por leucina en la posicion 2.074 (Am);
    g. una sustitucion por leucina, isoleucina o metionina en la posicion 2.075 (Am);
    h. una duplicacion de la valina en la posicion 2.075 (Am);
    i. una sustitucion por treonina o glicina en la posicion 2.078 (Am);
    j. una sustitucion por acido glutamico en la posicion 2.080 (Am);
    k. una sustitucion por arginina, triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, leucina, serina, treonina o valina en la posicion 2.088 (Am);
    l. una sustitucion por acido glutamico en la posicion 2.095 (Am); o
    m. una sustitucion por alanina, histidina, prolina, serina o glicina en la posicion 2.098 (Am).
  4. 4. La planta de arroz de la reivindicacion 1, en la que dicha planta es una planta de una cualquiera de las lineas: OsHPHI2, OsARWI1, OSARWI3, OsARWI8 u OsHPHN1, habiendose depositado una muestra representativa de semillas de cada linea en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con los numeros de Designacion de Deposito de Patente PTA-10267, PTA-10568, PTA-10569, PTA-10570 o pTA-10571, respectivamente; o es un hibrido, un descendiente o un derivado modificado geneticamente de una planta de una cualquiera de las lineas OsHPHI2, OsARWI1, OSARWI3, OsARWI8 u OsHPHN1.
  5. 5. La planta de arroz de la reivindicacion 1, en donde dicha planta es tolerante al menos a un herbicida que inhibe la ACCasa que se selecciona de entre aloxidim, butroxidim, cletodim, cloproxidim, cicloxidim, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, clorazifop, clodinafop, clofop, diclofop, fenoxaprop, fenoxaprop-P, fentiaprop, fluazifop, fluazifop-P, haloxifop, haloxifop-P, isoxapirifop, propaquizafop, quizalofop, quizalofop-P, quizalofop-P-etilo, quizalofop-P-tefurilo, trifop, pinoxaden y sales o esteres de los mismos agronomicamente aceptables.
  6. 6. Una semilla de arroz o una celula de arroz que comprenden un acido nucleico de la acetil-Coenzima A carboxilasa (ACCasa) mutagenizado que tiene una secuencia que se obtiene por un metodo de mutagenesis inducida aleatoria y que codifica una ACCasa plastidica que tiene, como resultado de dicha mutagenesis, una sustitucion de isoleucina por leucina en una posicion de aminoacido que corresponde con la posicion 1.781 de la ACCasa plastidica de Alopecurus myosuroides (Am), en donde la ACCasa plastidica es una proteina que comprende una version modificada de las SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y confiere a una planta de arroz tolerancia a 100 g i.a./ha de cicloxidim.
  7. 7. La semilla de arroz o la celula de arroz de la reivindicacion 6, en las que dicha ACCasa plastidica comprende ademas: una sustitucion de aminoacido en las posiciones 1.785; 1.786; 1.811; 1.864; 2.027; 2.039; 2.041; 2.049; 2.074; 2.075; 2.088; 2.080; 2.088; 2.095; 2.096; o 2.098 que se corresponde con la posicion de la ACCasa plastidica de Alopecurus myosuroides, una duplicacion de valina en la posicion 2.075 (Am) o una delecion del aminoacido en la posicion 2.080 (Am).
  8. 8. La semilla de arroz o la celula de arroz de la reivindicacion 6, que comprenden ademas:
    a. una sustitucion por glicina en la posicion 1.785 (Am);
    b. una sustitucion por prolina en la posicion 1.786 (Am);
    c. una sustitucion por asparagina en la posicion 1.811 (Am);
    d. una sustitucion por glicina en la posicion 2.039 (Am);
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    e. una sustitucion por isoleucina, leucina o fenilalanina en la posicion 2.049 (Am);
    f. una sustitucion por leucina en la posicion 2.074 (Am);
    g. una sustitucion por leucina, isoleucina o metionina en la posicion 2.075 (Am);
    h. una duplication de la valina en la posicion 2.075 (Am);
    i. una sustitucion por treonina o glicina en la posicion 2.078 (Am);
    j. una sustitucion por acido glutamico en la posicion 2.080 (Am);
    k. una sustitucion por arginina, triptofano, fenilalanina, glicina, histidina, lisina, leucina, serina, treonina o valina en la posicion 2.088 (Am);
    l. una sustitucion por acido glutamico en la posicion 2.095 (Am); o
    m. una sustitucion por alanina, histidina, prolina, serina o glicina en la posicion 2.098 (Am).
  9. 9. La semilla de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la semilla comprende ademas un tratamiento de la semilla que comprende un herbicida inhibidor de la ACCasa.
  10. 10. La semilla de la reivindicacion 9, en la que dicho herbicida inhibidor de la ACCasa comprende al menos uno de aloxidim, butroxidim, cletodim, cloproxidim, cicloxidim, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, clorazifop, clodinafop, clofop, diclofop, fenoxaprop, fenoxaprop-P, fentiaprop, fluazifop, fluazifop-P, haloxifop, haloxifop-P, isoxapirifop, propaquizafop, quizalofop, quizalofop-P, quizalofop-P-etilo, quizalofop-P-tefurilo, trifop, pinoxaden o una sal o un ester agronomicamente aceptables de los mismos.
  11. 11. Una ACCasa plastidica de arroz como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha ACCasa plastidica de arroz no es transgenica.
  12. 12. La planta o la semilla de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dichas planta o semilla no son transgenicas.
  13. 13. Un metodo para cultivar una planta de arroz con tolerancia a herbicidas, comprendiendo dicho metodo:
    a. cultivar la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 12, o cultivar una planta a partir de la semilla de arroz de una cualquiera de las reivindicaciones 6-10 o 12 permitiendo que la semilla germine; y
    b. aplicar a la planta y a la vecindad de la misma un herbicida inhibidor de la acetil-Coenzima A carboxilasa en una cantidad que inhibe el crecimiento de una planta de tipo silvestre correspondiente.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que dicho herbicida inhibidor de la ACCasa comprende al menos uno de: aloxidim, butroxidim, cletodim, cloproxidim, cicloxidim, setoxidim, tepraloxidim, tralcoxidim, clorazifop, clodinafop, clofop, diclofop, fenoxaprop, fenoxaprop-P, fentiaprop, fluazifop, fluazifop-P, haloxifop, haloxifop-P, isoxapirifop, propaquizafop, quizalofop, quizalofop-P, quizalofop-P-etilo, quizalofop-P-tefurilo, trifop, pinoxaden o una sal o un ester agronomicamente aceptables de los mismos.
  15. 15. El uso de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una semilla de una cualquiera de las reivindicaciones 6-10 para producir un producto alimentario, un producto de consumo, un producto industrial o un producto veterinario.
  16. 16. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de acido nucleico como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
  17. 17. Un metodo para identificar una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 12 o una semilla de una cualquiera de las reivindicaciones 6-10 o 12, que comprende:
    a. proporcionar un material biologico de una planta o una semilla;
    b. llevar a cabo una PCR o un ensayo de hibridacion de los genes de ACCasa en dicho material biologico para determinar si el material biologico comprende un acido nucleico de ACCasa como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y
    c. identificar, basandose en los resultados de la etapa (b), que la planta de la etapa (a) comprende el acido nucleico que se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
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