TW201113376A - Herbicide-tolerant plants - Google Patents

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TW201113376A
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glycine
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Scots L Mankin
Leon Neuteboom
Ulrich Schofl
Sherry R Whitt
Haiping Hong
Dale R Carlson
Allan R Wenck
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Basf Agrochemical Products Bv
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Description

201113376 六、發明說明： 【先前技術】 稻在世界上，尤其在亞洲為最重要之糧食作物之一。稻 為一種由稻屬（genus 植物產生之穀粒。兩種最常被 栽培之物種為亞洲栽培稻…幻及西非洲栽培稻 ，其中亞洲栽培稻（〇 勾為最常被 栽培之馴化稻（domestic rice)。除兩種馴化物種以外，稻 屬亦含有20種以上野生物種。此等野生物種之一宿根稻 心力>叹㈣）（「紅米（red rice)」，亦稱為亞洲栽培稻 宿根亞種（Or少π subsp rw/z>〇发〇n))在商業栽培中呈 現出一個重大問題。紅米產生紅色包衣種子。在收穫之 後’研磨稻種子以移除其外殼。在研磨之後，馴化稻為白 色，而野生紅米顯現變色。變色種子之存在會降低稻作物 之價值。因為紅米與栽培稻（亞洲栽培稻）屬於同一物種， 所以其遺傳組成極其相似。此遺傳相似性已使得對紅米的 除草控制難以進行。 已開發出耐咪唑啉酮除草劑之馴化稻且其目前以商品名 CLEARFIELD®出售…米㈣酮除草劑抑制㈣^⑽ 基酸合成酶（AHAS)。在栽培CLEARFIELD®稻時，右Λ ~ $ 有可能 藉由施用咪唑啉酮除草劑來控制紅米及其他雜草。不幸的 是，已形成耐咪唑啉酮除草劑之紅米及雜草。 乙醯輔酶續化酶（ACCase; EC 6·41·2)合成丙二酿基_ CoA作為植物葉綠體中重新脂肪酸合成路徑之開始。草二 綠體中之ACCase為多功能、核基因組編碼之極大單—= 150569.doc 201113376 肽:其經由N末端轉運肽（transitpepUde)轉運至質體中。 草葉綠體中之活性形式為同源二聚 聚體。 Y蛋白質’可能為同源二 草中之心“受三類除草活性成份抑制。兩種最普遍 的類別為芳氧基苯氧丙酸醋取曰遍 ，「ΓίΤλ/Τ 、/ν · J )及環己二酮 (DIM」）。除此兩類以外，亦已描 (「DEN」）。 二類本基吡唑啉 已在對-或多種職或F〇p除草劑展現耐受性之 植物雜草物種中發現許多ACCase抑制劑耐突 變。此外，⑽已出售玉米。所有此等突變皆在 ACCase之錢轉移酶結構域中發現，且此等突變似乎位 於受質結合袋中’從而改變接近催化部位的通路。 麵及F㈣重要除草劑且^可提供展料此等類別之 除4劑具有耐受性的稻’則將會為有利的。目冑，此等類 別之除草劑在稻米農業中之價值有限。在-些情況下，誘 發除草劑耐受性之突變會在耐受性植物中導致嚴重的適應 度損失⑼ness penalty)。因此，在此項技術中仍然需要亦 展現無適應度損失之AIT稻。此需要及其他需要可由本發 明滿足。 【發明内容】 本發明係關於耐除簟麻丨I夕# tβ Τ陈早釗之植物以及產生及處理耐除草劑 之植物之方法。在-實施例中，本發明提供一種對一般將 抑制稻植物生長之除草劑用量的至少一種抑制乙醯輔酶A 叛化酶活性之除草劑具有耐受性的稻植物。通常，本發明 150569.doc 201113376 之耐除草劑的稻植物表現胺基酸序列不同於野生型稻植物 之乙醯輔酶A羧化酶胺基酸序列的乙醯輔酶A羧化酶 (ACCase)。根據慣例，單子葉植物ACCase胺基酸殘基内 之突變通常參考其在大穗看麥娘wj/oiMroz’i/es， 黑草（blackgrass))質體之單體ACCase序列（Genbank C AC 84161_1)中之位置而提及且用（04 m)表示。本發明之而于 除草劑之植物的乙醯輔酶A叛化酶不同於相應野生型植物 之乙醯輔酶A羧化酶的胺基酸位置之實例包括（但不限於） 一或多個以下位置：l，781(04m)、l，785(01w」、、 ' \,^2A(Am) ' \,%6A(Am) ' l,999^mj 2,041 (Am) 2,015(Am) 2,0%\(Am) 2,039 (Am) 2,074(Am) 2,0S0(Am) 2^21 (Am) 2,059(Am) 2,079(Am) 2,095(Am)
^ (Am) 8fAmJ 峻位置處之 2,096(0i«ij 或 2,098(^4wj。此等胺基 差異之實例包括（但不限於）以下一或多者：位 胺基酸不 處之胺基酸不為異白胺酸；位置1,785(04/^處< 為丙胺酸；位置l,786(^wj處之胺基酸不為丙办 ]胺酸；位置 1，811 (04m)處之胺基酸不為異白胺酸；月念分 #基酸位置 l，824(^m)不為麩醯胺酸；胺基酸位置1,864(0^、 不為纈胺 酸；位置1，999MW處之胺基酸不為色脸私 峨酸；位置 2,027Mwj處之胺基酸不為色胺酸；胺基酸位署 夏 2,039(04 不為麩胺酸；位置2,041 處之胺基酸不皋s ^昇白胺酸； 位置2,049(^m)處之胺基酸不為纈胺酸；妝w 胺基酸位置
2,059(^所）不為丙胺酸；位置2,074(04m)處之脸M R暴酸不為色 150569.doc 201113376 胺酸；位置2,075(04mJ處之胺基酸不為纈胺酸；位置 2,078(04mj處之胺基酸不為天冬胺酸；位置2,079Mm」處之 胺基酸位置不為絲胺酸；位置2,080(^m)處之胺基酸不為 離胺酸；位置2,081 處之胺基酸位置不為異白胺酸； 位置2,088(04mj處之胺基酸不為半胱胺酸；位置2,095(^4m) 處之胺基酸不為離胺酸；位置2,096Mmj處之胺基酸不為 甘胺酸；或位置2,098Mm〉處之胺基酸不為纈胺酸。在一 些實施例中，本發明提供一種表現包含含有以下一或多者 之胺基酸序列之乙醯輔酶A羧化酶的稻植物：位置 1,7 8 1 處之胺基酸為白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺 酸；位置1,785β…處之胺基酸為甘胺酸；位置1,786(04^^ 處之胺基酸為脯胺酸；位置1,811 處之胺基酸為天冬 醯胺；位置1,824(04w」處之胺基酸為脯胺酸；位置 l，864(^w)處之胺基酸為苯丙胺酸；位置l，999(04m)處之胺 基酸為半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027(04mj處之胺基酸為 半胱胺酸；位置2,039(04…處之胺基酸為甘胺酸；位置 2,041(^m)處之胺基酸為天冬醯胺；位置204964m)處之胺 基酸為苯丙胺酸；位置2,059(04m)處之胺基酸為纈胺酸； 位置2,074(04m」處之胺基酸為白胺酸；位置2,075(04m)處之 胺基酸為白胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸；位置2,078(04m) 處之胺基酸為甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079Mm」處之胺基 酸為苯丙胺酸；位置2,080(04m)處之胺基酸為麩胺酸；位 置2,08〇β/^處之胺基酸缺失；位置2,08164mj處之胺基酸 缺失；位置2,08864mj處之胺基酸為精胺酸或色胺酸；位 150569.doc 201113376 置2,095(^~處之胺基酸為麩胺酸；位置2,〇96以⑷處之胺 基酸為丙胺酸或絲胺酸；或位置2,098Μ岣處之胺基酸為 丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸或絲胺酸。 本發明亦提供產生耐除草劑之植物之方法及由此等方法 產生之植物。由本發明方法產生之植物之實例為耐除草劑 之稻植物，其對在一般將抑制該植物生長之除草劑用量下 的至少一種抑制乙醯輔酶Α羧化酶活性之除草劑具有耐受 性’其中該耐除草劑之植物係由以下步驟產生：a)自不能 耐受該除草劑之植物獲得細胞；…使該等細胞與包含一或 多種乙醯輔酶A羧化酶抑制劑之培養基接觸；及勹自該等 細胞產生对除草劑之植物。由本發明方法產生之耐除草劑 之植物包括（但不限於）藉由進行以上a)、…及勹產生之耐除 草劑之植物以及藉由進行以上約、…及勹產生之植物的子 代。在一實施例中，用於實施此類方法之細胞將呈癒傷組 織（callus)之形式。 本發明提供表現包含確定的胺基酸序列之乙醯輔酶A羧 化酶的植物。舉例而言，本發明提供一種稻植物，其中該 稻植物之一或多個基因組編碼包含SEq ID N〇: 2及3中之 一或兩者之經修飾形式的蛋白質，其中修飾序列，以使所 編碼蛋白質包含以下一或多者：位置丨，781 Μ岣處之胺基 西文為白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置丨，785Μ一 處之胺基酸為甘胺酸；位置1786“㈨處之胺基酸為脯胺 酉欠’位置1，811 Μ…處之胺基酸為天冬醯胺·，位置 l，824Mm」處之胺基酸為脯胺酸；位置1864“…處之胺基 150569.doc 201113376 酸為苯丙胺酸；位置1，999Mmj處之胺基酸為半胱胺酸或 甘胺酸；位置2,027M…處之胺基酸為半胱胺酸；位置 2,039Mm)處之胺基酸為甘胺酸；位置2,〇41μ_處之胺基 酸為天冬醯胺；位置2,049(^m)處之胺基酸為苯丙胺酸； 位置2,059(04m)處之胺基酸為纈胺酸；位置2,〇74(〇4w)處之 胺基酸為白胺酸；位置2,075 處之胺基酸為白胺酸、 異白胺酸或曱硫胺酸；位置處之胺基酸為甘胺 酸或蘇胺酸；位置2,079(04m)處之胺基酸為苯丙胺酸；位 置2,080(^4~處之胺基酸為麵胺酸；位置2,〇8〇m一處之胺 基酸缺失’·位置2,081(^wJ處之胺基酸缺失；位置 2,088(^/7^處之胺基酸為精胺酸或色胺酸；位置2,〇95(04/7?) 處之胺基酸為楚胺酸；位置2,096(^4mj處之胺基酸為丙胺 酸或絲胺酸；或位置2,098(04m>處之胺基酸為丙胺酸、甘 胺酸、脯胺酸、組胺酸或絲胺酸。下圖i 9提供大穗看麥娘 乙醯辅酶A羧化酶序列（SEQ ID NO: 1)、在來稻 Μίίνα Indical)乙酿輔酶A叛化酶序列（SEQ ID NO: 2)及蓬 萊稻（<9ryza Μίίνα Japonica)乙醯輔酶A幾化酶序列（SEQ ID NO: 3)之比對’其中指示了野生型序列可不同於本發明序 列之位置的實例。 在另一實施例中，本發明包含根據布達佩斯條約 (Budapest Treaty)寄存在可接受寄存處之種子、源自此等 種子之細胞、自此等種子生長之植物及源自此等植物之細 胞、自此種種子生長之植物之子代及源自此子代之細胞。 由所寄存種子產生之植物及此等植物之子代的生長通常將 150569.doc 201113376 對在一般將抑制相應野生型植物生長之除草劑用量下的乙 醯輔酶A羧化酶抑制性除草劑具有耐受性。在一實施例 中，本發明提供一種自由以下任一株系之植物產生之種子 生長的稻植物：0sHPHI2、OsARWIl、OsARWI3、OsARWI8 或OsHPHNl，各株系種子之代表性樣本已分別以專利寄存 編號 PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570 或 PTA-10571寄存在美國菌種保存中心（ATCC)。本發明亦涵 蓋自以下任一株系之植物製備的突變體、重組體及/或經 遺傳工程改造之衍生物：OsHPHI2、OsARWIl、OsARWI3、 OsARWI8或OsHPHNl，各株系種子之代表性樣本已分別 以專利寄存編號 PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、 PTA-105 70或PTA-10571寄存在ATCC ;以及自以下任一株 系之植物生長或育種的植物之任何子代：OsHPHI2、 OsARWIl、OsARWI3、OsARWI8 或 OsHPHNl，各株系種 子之代表性樣本已分別以專利寄存編號PTA-10267、PTA-10568 、 PTA-10569 、 PTA-10570 或 PTA-10571 寄存在 ATCC，只要此等植物或子代具有自以下任一株系之植物 生長之植物的除草劑耐受性特徵即可：0sHPHI2、 OsARWIl、OsARWI3、OsARWI8 或 OsHPHNl，各株系種 子之代表性樣本已分別以專利寄存編號PTA-10267、PTA-10568 、 PTA-10569 、 PTA-10570 或 PTA-10571 寄存在 ATCC。本發明亦涵蓋自此等種子培養之細胞及由該等培 養細胞產生之植物及其子代。 本發明之耐除草劑之植物可為亞洲栽培稻物種之一員。 150569.doc 201113376 本發明之耐除草劑之植物通常能耐受在—般將抑制相應野 生型植物（例如稻植物）生長之除草劑用量下的芳氧基苯氧 丙酸醋除草劑、環己二酮除草劑、苯基吼㈣除草劑或其 組合。在-些實施例中’本發明之耐除草劑之植物不為 GMO植物。本發明亦提供—種經誘變之耐除草劑之植物， 例如經誘變之稻植物。本發明亦涵蓋源自上述耐除草劑之 植物的植物及種子之細胞。 本發明提供控制雜草生長之方法。在—實施例中，本發 明提供一種控制稻植物附近之雜草之生長的方法。 法可包含對雜草及稻植物施用一定量之抑制天然存在之乙 T輔酶續化酶活性的乙醯輔酶續化酶抑制 其：該等稻植物包含改變之乙酿輔酶塌化酶活性，^ 違專稻植物對所施用量之除草劑具有耐受性 (但不限於）芳氧基苯氧丙酸醋除草劑 ^括 苯基吼嗤琳除草劑或1以之任竹己一晌除草劑、 活性的除草劑來實施本發明方法。 羧化駟 本發明提供—種控制稻植物附近之雜草之 此等方法之-實例可包含對雜草及稻植物施用和。 稻植物生長之除草劑用量的一或多種除草劑，其 種除草劑抑制乙醯辅酶八羧化酶活性。此 ν 乙酿辅酶錢化酶活性之任何除草制 控制雜草之方法之除草劑的適合實例包；貫施 基苯氧丙酸酯除草劑、環 一限於）芳氧 劑或其組合。 衣己-綱除卓劑、苯基-麵除草 i50569.doc 201113376 二:A 一種控制雜草生長之方法。此等方法之-個 收㈣得3二除草劑之稻植物與其他稻種質雜交，及 雜^稻及:父!1種子；咖植該雜交稻種子，·及⑷對該 之除草劑用量的夕 &可抑制稻植物生長 劑。此等方Γ 乙醯輔酶场化酶抑制性除草 劑來實T 任何抑制乙酿輔酶續化酶活性之除草 例包=曰。不Γ於實施控制雜草之方法之除草劑的適合實 草劑、苯A (於)方氧基苯氧丙酸酿除草劑、環己二酮除 軍劑本基吡唑啉除草劑或其組合。 物：：去貫施例中，本發明包括-種選擇耐除草劑之稻植 物之方法。此等方法之— 植物與其他稻種 Μ⑷使耐除草劑之稻 該雜交稻種： 穫所得雜交稻種子；㈨種植 之⑷對該雜交稻施用-般可抑制稻植物生長 制至少—種除草劑抑 種子。Γ:及⑷自已施用除草劑之稻植物收獲 草劑來^方任何抑制乙醯輔酶錢化酶活性之除 =:於實施控制雜草之方法之除草劑的適合 :例包括(但不限於)芳氧基苯氧丙 除草劑、苯基吼㈣除草劑或其組合。 衣己一m C涵蓋-種使耐除草劑之稻植物生長之方法。此 芽，一個實例包含⑷種植稻種子’·⑻使該等稻種子萌 —二)對㈣施用一般可抑制稻植物生長之除草劑用量之 s夕種除草劑，其巾至少—種除 化酶。此簟古土 7 m 1刊G醞補酶八羧 方法可用任何抑制乙醯輔酶Am化酶活性之除 J 50569.doc 201113376 草劑來實施。可用於實施控制雜草之方法之除草劑的適合 實例包括（但不限於）芳氧基苯氧丙酸酯除草劑、環己二酮 除草劑、苯基吡唑琳除草劑或其組合。 在一實施例中，本發明提供一種耐除草劑之稻植物之種 子。此種子可用於使财除草劑之稻植物生長，其中自該種 子生長之植物對一般將抑制稻植物生長之除草劑用量的至 少一種抑制乙醯輔酶Α羧化酶活性之除草劑具有耐受性。 自本發明種子生長之植物將能耐受之除草劑的實例包括 (但不限於）芳氧基苯氧丙酸酯除草劑、環己二酮除草劑、 苯基吡唑啉除草劑或其組合。 在另一實施例中，本發明提供一種稻植物之種子，其中 自该種子生長之植物表現胺基酸序列在以下一或多個位置 處不同於野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶胺基酸序列的 乙酿輔酶 A 羧化酶（ACCase) : 1，781(^»^、l，785(^m」、 \,1^6(Am) ' \,%\\(Am) > \,^2A(Am) > l,864(AmJ ' l,999(AmJ ^ 2,027(Am) ' 2,039(Am) ^ 2,04l(Am) ^ 2,049(Am) ^ 2,059(Am) ' 2,0T4(Am) - 2,075(Am) > 2,0T^(Am) ' 2,079(Am) ' 2,080(AmJ ' 2,081^m； ' 2,088(^m)、2,095(^mJ、2,096(04/7^或2,098(^/?^。此等胺基 酸位置處之差異之實例包括（但不限於）以下一或多者：位 置l，781(^m)處之胺基酸不為異白胺酸；位置l，785(〇iwj處 之胺基酸不為丙胺酸；位置l,786(04mj處之胺基酸不為丙 胺酸；位置1,8 11 處之胺基酸不為異白胺酸；胺基酸 位置1，824(^_不為麩醯胺酸；胺基酸位置l，864(04m)不為 150569.doc 12 201113376 纈胺酸；位置1,999處之胺基酸不為色胺酸；位置 2,027處之胺基酸不為色胺酸；胺基酸位置2,039(^w) 不為麩胺酸；位置2,041 處之胺基酸不為異白胺酸； 位置2,04964m」處之胺基酸不為纈胺酸；胺基酸位置 2,059(^«^不為丙胺酸；位置2,074(^«^處之胺基酸不為色 胺酸；位置2,075Μ—處之胺基酸不為纈胺酸；位置 2,078(04—處之胺基酸不為天冬胺酸；位置2,079(^mj處之 胺基酸不為絲胺酸；位置2,080(04w)處之胺基酸不為離胺 酸；位置2,08 1 Mwj處之胺基酸位置不為異白胺酸；位置 2,088(^~處之胺基酸不為半胱胺酸；位置2,095β_處之 胺基酸不為離胺酸；位置2,096(04mj處之胺基酸不為甘胺 酸；或位置2,098(^m)處之胺基酸不為纈胺酸。在一些實 施例中，自種子生長之植物可表現包含含有以下一或多者 之胺基酸序列的乙醯輔酶A羧化酶：位置l，781(^m)處之胺 基酸為白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置 l，785(^m)處之胺基酸為甘胺酸；位置l，786(04mj處之胺基 酸為脯胺酸；位置1,81164m〉處之胺基酸為天冬醯胺；位 置l,824(^mj處之胺基酸為脯胺酸；位置l，86464m)處之胺 基酸為苯丙胺酸；位置l,999(^mj處之胺基酸為半胱胺酸 或甘胺酸；位置2,02764m)處之胺基酸為半胱胺酸；位置 2,039(04~處之胺基酸為甘胺酸；位置2,041β~處之胺基 酸為天冬醯胺；位置2,049(04m)處之胺基酸為苯丙胺酸；位 置2,059(^~處之胺基酸為纈胺酸；位置2,074(04m)處之胺 基酸為白胺酸；位置2,075 …處之胺基酸為白胺酸、異 150569.doc •13- 201113376 白胺酸或曱硫胺酸；位置2,〇78^4m)處之胺基酸為甘胺酸 或蘇胺酸；位置2,079(04m)處之胺基酸為苯丙胺酸；位置 2,080(04m)處之胺基酸為麩胺酸；位置2,〇8〇(^…處之胺基 酸缺失；位置2,〇81(^m)處之胺基酸缺失；位置2,〇88(〇4/„) 處之胺基酸為精胺酸或色胺酸；位置2,〇95(^所）處之胺基 酸為麵胺酸；位置2,096(04«^處之胺基酸為丙胺酸或絲胺 酸’或位置2,098(^W處之胺基酸為丙胺酸、甘胺酸、脯 胺酸、組胺酸或絲胺酸。 本發明涵蓋特定耐除草劑之栽培品種之種子。此等種子 之一貫例為稻栽培品種在來稻l(Indical)之種子，其中該 栽培品種之種子之代表性樣本以ATCc寄存編號pTA_ 10267、PTA-10568、PTA-10569 或 PTA-10570 寄存。此等 種子之另一實例為耐除草劑之日本晴（Nipp〇nbare)栽培品 種之彼等種子，其中該栽培品種之種子之代表性樣本以 ATCC寄存編號PTA_1〇571寄存。本發明亦涵蓋藉由使種子 生長而產生之稻植物或其一部分以及由種子產生之細胞的 組織培養物。細胞之組織培養物可由種子直接產生或由自 種子生長之植物的一部分，例如由葉、花粉、胚芽、子 ，、胚軸、分生細胞、根、根尖、雌蕊、花藥、花及/或 里產生。本發明亦包括已自細胞之組織培養物產生之植物 及其子代。此等植物通常將具有栽培品種在來稻〗之所有 形態及生理特徵。 本發明亦提供產生稻種之方法。此等方法可包含使耐除 草劑之稻植物與其他稻種質雜交；及收穫所得雜交稻種 150569.doc •14- 201113376 二:中該耐除草劑之稻植物對一般將抑制稻植物生長之 二 的方减苯氧丙酸除草劑、環己二酮除草 Μ、笨基吡唑啉除草劑或其組合具有耐受性。 入本方法亦包含產_雜交稻種子之方法。此等方法可包 :使对除草劑之稻植物與不同稻植物雜交；及收穫所州 :父：種子’丨中該耐除草劑之稻植物對—般將抑制稻植 長之除卓劑用量的芳氧基苯氧丙酸s旨除草劑、環己二 酮除草劑、苯基吡唑啉除草劑或其組合具有耐受性。- 本方法亦包含產生交植物之方法。此等方法可包含 使耐除草劑之植物與不同植物雜交；及收穫所得η雜交種 子且使所付F1雜父植物生長’其中該耐除草劑之植物對— 般將抑制植物生長之除草劑用量的芳氧基苯氧两酸醋除草 劑、％己-酮除草劑、苯基。比嗤琳除草劑或其組合具有耐 受性。 本發明亦提供產生亦可包含轉殖基因之耐除草劑之稻植 物的方法。此類方法之—實例可包含用轉殖基因轉型稻植 物細胞中該轉殖基因編碼賦予對至少一種選自由以下 組成之群之除草劑之耐受性的乙醯輔酶續化酶：芳氧基 苯氧丙酸_除草劑、環己二酮除草劑、苯基吡唑啉除草： 或其組合。任何適合的細胞皆可用於實施本發明方法舉 例而言’細胞可呈癒傷組織之形式。在一些實施例中，該 轉殖基因可包含編碼包含SEQ m N〇:如中之—或兩者 之經修飾形式的胺基酸序列之核酸序列’纟中修飾序列， 以使所編碼蛋白質包含以下一或多者 J50569.doc 15 201113376 之胺基酸為白胺酸、蘇胺酸'纈胺酸或丙胺酸；位置 1，785(^所）處之胺基酸為甘胺酸；位置^786“…處之胺基 酸為脯胺酸；位置1，811 Μ㈨處之胺基酸為天冬醯胺；位 置l，824Mm)處之胺基酸為脯胺酸；位置處之胺 基酸為苯丙胺酸；位置1999^4/^處之胺基酸為半胱胺酸 或甘胺酸；位置2,027(^岣處之胺基酸為半胱胺酸；位置 2,039(04岣處之胺基酸為甘胺酸；位置2,〇4iy岣處之胺基 酸為天冬醯胺；位置2,049以岣處之胺基酸為苯丙胺酸； 位置2,05964mj處之胺基酸為纈胺酸；位置2,〇74以…處之 胺基酸為白胺酸；位置2,075以~處之胺基酸為白胺酸、 異白胺酸或甲硫胺酸；位置2,〇78以㈤處之胺基酸為甘胺 酸或蘇胺酸；位置2,079MW)處之胺基酸為苯丙胺酸；位置 2,08〇Mmj處之胺基酸為麵胺酸；位置2,〇8〇y岣處之胺基 酸缺失；位置2,081㈣處之胺基酸缺失；位置2,〇 — 處之胺基酸為精胺酸或色胺酸；位置2,〇95y岣處之胺基 酸為麩胺酸；位置2,096㈣處之胺基酸為丙胺酸或絲胺 酸；或位置2,098以⑷處之胺基酸為丙胺酸、甘胺酸、脯 胺酸、組胺酸或絲胺酸。本發明亦涵蓋由此等方法產生之 植物。產生包含轉殖基因之耐除草劑之植物的方法之另一 實例可包含用編碼賦予除草劑耐受性之酵素的轉殖基因來 轉型稻植物細胞，#中該細胞由表現乙醯輔酶錢化酶之 稻植物或其種子產生，該乙醯輔酶A羧化酶賦予對至少一 種選自由α下組成之群之除草劑的耐受#:芳氧基苯氧丙 酸醋除草劑、環己二酮除草劑、苯基㈣錢草劑或其組 150569.doc 16 201113376 合。任何適合的細胞皆可田a 用於貫施本發明方法，舉例而 言，細胞可呈癒傷組織之形4、 义式。本發明亦涵蓋由此等方法 產生之耐除草劑之植物。 在一實施例中’本發明台人 匕3產生重組植物之方法。產生
重組稻植物之方法之一實你丨-τ a A 貝別可包含用轉殖基因轉型稻植物 細胞’其中該細胞由表 見乙酿輔酶A羧化酶之稻植物產 生，該乙醢辅酶A羧化酶賦早 巧予對至少一種選自由以下組成 之群之除草劑的耐受性：关氨 方虱基本氧丙酸酯除草劑、環己
二酮除草劑、苯基吡唑琳除I 1承皁劏或其組合。任何適合的細 胞皆可用於實施本發明方法， a * 舉例而s ’細胞可呈癒傷组 織之形式。用於本發明方法中之轉殖基因可包含任何所要 核酸序列，舉例而言，該轉殖基因可編碼蛋白質。在—麻 例中，該轉殖基因可編碼酵素，例如改進脂肪酸代謝及貝/ 或碳水化合物代謝之酵素。適合酵素之實例包括（但不限 於）果糖轉移H糖6果糖基轉移峰繼⑽⑽）、α_殿 粉酶、轉化酶及㈣分支酶或編碼硬脂醯基-Acp之反義分 $的去飽和酶。本發明亦涵蓋由本發明方法產生之重組植 心月方法可用於產生具有任何所要性狀之植物，例如 稻植物。此類方半 眘1 h人 顯万法之一貫例可包含：（a)使對一般將抑制稻 植物生長之除草劑用量的芳氧基苯氧丙酸醋除草劑、環己 一嗣除草劍、苯基。比°坐琳除草劍或其組合具有耐受性之稻 植物與包含所要性狀之另一稻裁培品種之植物雜交以產生 子代植物’ (b)選擇一或多株具有所要性狀之子代植物以產 150569.doc 201113376 生經選擇之子代植物；（c)使該等經選擇之子代植物與耐除 草劑之植物雜交以產生回交子代植物；（d)選擇具有所要性 狀及除草劑耐受性之回交子代植物；及⑷連續重複步驟 ⑷及⑷三次或三次以上以產生包含所要性狀及除草劑耐 受性之經選擇的第四次或四次以上回交之子代植物。可使 用本發明方法引入任何所要性狀。所要之性狀之實例包括 I但不限於）雄性不育性、除草劑耐受性、乾旱耐受性、抗 蟲性、改進之脂肪酸代謝、改進之碳水化合物代謝及對^ 菌性疾病、真菌性疾病或病毒性疾病之抗性。產生雄性不 育稻植物之方法之一實例可包含用賦予雄性不育性之核酸 分子轉型對一般將抑制稻植物生長之除草劑用量的至少一 種抑制乙醯輔酶績化酶活性之除草劑具有耐受性的稻植 物。本發明亦涵蓋由此等方法產生之雄性不育植物。 本發明提供包含植物細胞（例如稻植物細胞）之組合物。 =員組合物，一實例包含一或多個稻植物細胞，·及水性培 入土 ’其中該培養基包含抑制乙醯輔酶A羧化酶活性之化 =生Γ些實施财’該等細胞可源自對-般將抑制稻 植物生長之除草劑用量的芳氧基苯氧丙酸醋除草劑、環己 苯基。比哇琳除草劑或其組合具有耐受性的稻 A苯氧乙酿辅酶續化酶活性之任何化合物（例如芳氧 基本氧丙酸酯除草劑、環己二 劍及其组合中之—或多者卜^除^纟基⑼唾琳除草 一 )白可用於本發明組合物中。 八子發/匕3編碼所有或—部分乙酿辅酶續化酶之核酸 刀千。在一些實施例中，太 發月匕έ編碼胺基酸序列在以 150569.doc -18- 201113376 下一或多個位置處不同於野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化 酶胺基酸序列之稻乙醯輔酶A羧化酶（ACCase)的重組、經 誘變、合成及/或經分離之核酸分子：1,78 IMm)、 \,l^>5(Am) \ ,Ί^β(Αηι) \ ,%\ \ (Am) \,%2A(Am) \,%6A(Am) ' \,999(Am) ' 2,027(Am) ' 2,039(Am) ' 2,04l(Am) 、 2,049(Am) 、 2,059(Am) 、 2,074(Am)、 2,075(Am) 、 2,07S(Am) 、 2,079(Am) 、 2,0S0(Am)、 2,081(AmJ 、 2,0SS(Am) 、 2,095(Am) 、 2,096(^w)或 2,098β_。此等胺基酸位置處之差異之實例包括（但不限 於）以下一或多者：位置1,78 1 處之胺基酸不為異白胺 酸；位置l，785(^wj處之胺基酸不為丙胺酸；位置 1,786Μ~處之胺基酸不為丙胺酸；位置l，811MmJ處之胺 基酸不為異白胺酸；胺基酸位置l，824(^mj不為麩醯胺 酸；胺基酸位置1，864(^~不為纈胺酸；位置1,999(04—處 之胺基酸不為色胺酸；位置2,027處之胺基酸不為色 胺酸；胺基酸位置2,039β_不為麩胺酸；位置2,041(^m」 處之胺基酸不為異白胺酸；位置2,049Mmj處之胺基酸不 為纈胺酸；胺基酸位置2,059β_不為丙胺酸；位置 2,074(^_處之胺基酸不為色胺酸；位置2,075(^所）處之胺 基酸不為纈胺酸；位置2,078MW處之胺基酸不為天冬胺 酸；位置2,079(^wJ處之胺基酸位置不為絲胺酸；位置 2,080(04m)處之胺基酸不為離胺酸；位置2,081(C4m)處之胺 基酸位置不為異白胺酸；位置2,088MwJ處之胺基酸不為 半胱胺酸；位置2,095(^w)處之胺基酸不為離胺酸；位置 150569.doc •19· 201113376 2,096(^4/^處之胺基酸不為甘胺酸；或位置2,〇98(04mj處之 胺基酸不為绳胺酸。在一些實施例中，本發明之核酸分子 可編碼包含含有以下一或多者之胺基酸序列的乙醯輔酶A 羧化酶：位置1，78 1 處之胺基酸為白胺酸、蘇胺酸、 纈胺酸或丙胺酸；位置1,785處之胺基酸為甘胺酸； 位置1，786M所）處之胺基酸為脯胺酸；位置1,811(^4…處之 胺基酸為天冬醯胺；位置l，824(^m)處之胺基酸為脯胺 酸；位置l，864Mm)處之胺基酸為苯丙胺酸；位置 l，999(04w」處之胺基酸為半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027(04mj處之胺基酸為半胱胺酸；位置2,〇39(04m)處之胺 基酸為甘胺酸；位置2,041 處之胺基酸為天冬醯胺； 位置2,049^4mJ處之胺基酸為苯丙胺酸；位置2,〇59(04m)處 之胺基酸為纈胺酸；位置2,074(01m)處之胺基酸為白胺 酸；位置2,075(^4/^處之胺基酸為白胺酸、異白胺酸或曱 硫胺酸；位置2,078(04mj處之胺基酸為甘胺酸或蘇胺酸； 位置2,〇79Μ；7^處之胺基酸為苯丙胺酸；位置2,〇80(^m)處 之胺基酸為麵胺酸；位置2,080(^m」處之胺基酸缺失；位 置2,081Mm)處之胺基酸缺失；位置2,088(04»^處之胺基酸 為精胺酸或色胺酸；位置2,095 (04 w)處之胺基酸為楚胺 酸；位置2,096Mm)處之胺基酸為丙胺酸或絲胺酸；或位 置2,098(^mj處之胺基酸為丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組 胺酸或絲胺酸。在一些實施例中，本發明包含編碼包含所 有或一部分的SEQ ID NO: 2及3中之一或兩者之經修飾形 式的蛋白質的重組、經誘變、合成及/或經分離之核酸， 150569.doc -20- 201113376 其中修飾序列，以使所編碼蛋白質包含以下一或多者：位 置1，781 處之胺基酸為白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙 胺酸；位置l，785Mmj處之胺基酸為甘胺酸；位置 l，786Mm)處之胺基酸為脯胺酸；位置1811以㈣處之胺基 酸為天冬醯胺；位置1，824以㈣處之胺基酸為脯胺酸；位 置1，864以岣處之胺基酸為苯丙胺酸；位置^999“⑻處之 胺基酸為半胱胺酸或甘胺酸；位置2,〇27(〇4w)處之胺基酸 為半胱胺酸；位置2,〇39M~處之胺基酸為甘胺酸；位置 2,041MW)處之胺基酸為天冬醯胺；位置2,〇49以…處之胺 基酸為苯丙胺酸；位置2,059(04w〉處之胺基酸為纈胺酸； 位置2,074(04處之胺基酸為白胺酸；位置2,075 μ所）處之 胺基酸為白胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸；位置2,〇78(^~ 處之胺基酸為甘胺酸或蘇胺酸；位置2,〇79Μ…處之胺基 酸為笨丙胺酸；位置2,〇80(^mj處之胺基酸為麩胺酸；位 置2,080(04岣處之胺基酸缺失；位置2,〇81(〇4州處之胺基酸 缺失；位置2,088M~處之胺基酸為精胺酸或色胺酸；位 置2,095Mm)處之胺基酸為麩胺酸；位置2,〇96(〇ί叫處之胺 基酸為丙胺酸或絲胺酸；或位置2，〇 9 8 (04 m j處之胺基酸為 丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸或絲胺酸。 在一實施例中’本發明提供一種耐除草劑之BEP分枝系 (clade)植物。通常’此類植物為相較於野生型品種之植物 對ACCase抑制劑（ACCI)之耐受性增高的植物。此等植物 可由包含以下任一者之方法產生： (I)以下步驟： 150569.doc 21 201113376 (a) 提供具有第一、零或非零程度之acci耐受性之BEP 分枝系植物細胞； (b) 使該等細胞與培養基接觸生長以形成細胞培養物； (0使該培養物之細胞與ACCI接觸； (d) 使步驟⑷之經ACCI接觸之細胞生長以形成含有 ACCI耐受性程度大於步驟⑷之第一程度之細胞的培養 物；及 (e) 自步驟（d)之ACCI耐受性細胞產生ACCI耐受性程度 大於野生型品種之植物的植物；或 (Π)以下步驟： (f) 提供相較於野生型品種之植物對ACCase抑制劑 (ACCI)之耐受性增高的第一耐除草劑之BEp分枝系植物， s玄耐除草劑之植物由包含步驟（a)_(e)之方法產生；及 (g) 由s亥第一植物產生保留該第一植物之增高之除草劑 而才受性特徵的第二耐除草劑之BEP分枝系植物； 藉此獲得财除草劑之BEP分枝系植物。 在貫施例中’本發明之咐除草劑之BEP分枝系植物為 B E T次分枝系植物。 在一實施例中’本發明之耐除草劑之bet次分枝系植物 為BET作物植物。 在一些貫施例中’本發明之耐除草劑之植物可為竹亞 科-稻亞科（Bambusoideae-Ehrhartoideae)次分枝系之一員。 任何適合於使植物細胞生長之培養基皆可用於實施本發 明在一些貫化例中，培養基可包含突變劑，而在其他實 150569.doc •22- 201113376 施例中，培養基不包含突變劑。在一些實施例中，本發明 之耐除草劑之植物可為稻亞科之一員。任何適合的細胞皆 可用於實％本發明方法，舉例而言，細胞可呈癒傷組織之 形式。在一些實施例中，本發明之耐除草劑之植物可為稻 屬之一員’例如可為亞洲栽培稻物種之一員。 本發明包括由以上方法產生的耐除草劑之BEp分枝系植 物此專耐除草劑之植物可表現胺基酸序列在以下一或多 個位置處不同於相應野生型BEp分枝系植物之乙醯輔酶a 竣化酶胺基酸序列的乙醯輔酶A羧化酶（ACCase): l,78l(AmJ ^ l,785fAmJ > l,786fAmJ ^ ^ l,824(Am) l,864(Am) ' \,999(Am) > 2,027(Am)- 2,039fAmJ ' 2,041(AmJ ' 2,049fAmJ ' 2,059(Am) ^ 2，Q74(Am)、2，Q75(Am)、2,Q78(Am)、2,Q79(Am)、 2,0S0(Am) ' 2,0Sl(Am) > 2,0SS(Am) ' 2,095(Am) ^ 2,096(^m)或2,098Mm」。此等胺基酸位置處之差異之實例 包括（但不限於）以下一或多者··位置1，781以…處之胺基酸 不為異白胺酸；位置l，785^4Wy)處之胺基酸不為丙胺酸； 位置1，786以岣處之胺基酸不為丙胺酸；位置i，811y㈣處 之胺基酸不為異白胺酸；胺基酸位置1，824(〇ί岣不為麵醯 胺酸；胺基酸位置l，864Mm)不為纈胺酸；位置i,999Mmj 處之胺基酸不為色胺酸；位置2,〇27(04mj處之胺基酸不為 色胺酸；胺基酸位置2,039(^m」不為趄胺酸；位置 2,041(^mj處之胺基酸不為異白胺酸；位置2,〇49(Οί/«)處之 胺基酸不為纈胺酸；胺基酸位置2,059MW不為丙胺酸； 150569.doc -23- 201113376 位置2,074MmJ處之胺基酸不為色胺酸；位置2,075(^m)處 之胺基酸不為纈胺酸；位置2,078(04…處之胺基酸不為天 冬胺酸；位置2,079(04mj處之胺基酸位置不為絲胺酸；位 置2,080(^m)處之胺基酸不為離胺酸；位置2,081(04m)處之 胺基酸位置不為異白胺酸；位置2,088(^4一處之胺基酸不 為半胱胺酸；位置2,095(^~處之胺基酸不為離胺酸；位 置2,096(04m)處之胺基酸不為甘胺酸；或位置2,098Mm〉處 之胺基酸不為纈胺酸。在一些實施例中，本發明之耐除草 劑之BEP分枝系植物可表現包含含有以下一或多者之胺基 酸序列的乙醯輔酶A羧化酶：位置1，78 1 處之胺基酸為 白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，785(^(mj處之 胺基酸為甘胺酸；位置l，786^4mj處之胺基酸為脯胺酸； 位置1,811(04~處之胺基酸為天冬醯胺；位置1，824(^~處 之胺基酸為脯胺酸；位置1,864(^~處之胺基酸為苯丙胺 酸；位置1,999(04m〉處之胺基酸為半胱胺酸或甘胺酸；位 置2,027(04;^處之胺基酸為半胱胺酸；位置2,039(04mj處之 胺基酸為甘胺酸；位置2,04 1(04㈣處之胺基酸為天冬醯 胺；位置2,049(04m」處之胺基酸為苯丙胺酸；位置 2,059Mmj處之胺基酸為纈胺酸；位置2,074(04m)處之胺基 酸為白胺酸；位置2,075處之胺基酸為白胺酸、異白 胺酸或甲硫胺酸；位置2,078(^m)處之胺基酸為甘胺酸或 蘇胺酸；位置2,079(04m)處之胺基酸為苯丙胺酸；位置 2,080(^m)處之胺基酸為麩胺酸；位置2,080(04m)處之胺基 酸缺失；位置2,081Mmj處之胺基酸缺失；位置2,088(04m) 150569.doc •24- 201113376 處之胺基酸為精胺酸或色胺酸；位置2,〇95Μ所）處之胺基 酸為楚胺酸；位置2,〇96(^~處之胺基酸為丙胺酸或絲胺 酸；或位置2,098(^mj處之胺基酸為丙胺酸、甘胺酸、脯 胺酸、組胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明亦包括由於相較於相應野生型 ACCase在質體ACCase中僅具有一個取代而對ACCase抑制 劑具有耐受性的稻植物。在又一實施例中，本發明包括由 於相較於相應野生型ACCase在質體ACCase中具有兩個或 兩個以上取代而對ACCase抑制劑具有耐受性的稻植物。 在一貫施例中，本發明提供由於相較於相應野生型 ACCase在質體ACCase中具有兩個或兩個以上取代而對 ACCase抑制劑具有耐受性的稻植物，其中該等取代位於 選自由以下組成之群之胺基酸位置處：1，781以岣、 l，785Mm) 、 l，786Mm) 、 l,811^m； ^ l,824^m； ^ l,864(AmJ U999(Am) ^ 2,027(Am) > 2,039(Am) ^ 2,04l(Am) > 2,049(Am) > 2,059(Am) > 2,074(Am) > 2,075(Am) > 2,078fAmJ ， 2,079fAmJ ^ 2,080{AmJ ^ 2,081 ㈣、2,〇88 ㈣、2,〇95_;、2,〇96m_ 或 2,098^m) » 在-實施例中，本發明提供稻植物，其中該等稻植物包 含非轉殖基因質體ACCase。在一實施例中，本發明提供 植物’其中該等植物包含轉殖基因稻質體八^咖。 在實μ例中ϋ明提供控制如纟文所述之稻植物附 近内的雜草之生長的方法’ &包含對該等雜草及稻植物施
Q 150569.doc •25· 201113376 疋里之抑制天然存在之乙酿輔酶A叛化酶活性的乙酿 輔酶A鲮化酶抑制性除草劑，其中該等稻植物包含改變之 乙醯輔酶A羧化酶活性，以使該等稻植物對所施用量之除 卓劑具有财受性。 在一貫施例中，本發明提供產生種子之方法，其包含： (1)種植由本發明之植物產生之種子；（Η)使來自該種子之 植物生長；及（ii)自該等植物收穫種子。 本發明亦涵蓋由包含以下之方法產生的耐除草劑之BEP 分枝系植物：（a)使自如上所述產生之耐除草劑之bep分枝 系植物的種子生長的植物與其他種質雜交或回交；（b)使由 該雜交或回交產生之植物在一般將抑制植物生長之除草劑 用量下的至少一種一般抑制乙醯輔酶A羧化酶之除草劑存 在下生長；及（c)選擇由該雜交或回交產生之其他繁殖植 物’其中所選植物為在除草劑存在下生長無顯著損傷之植 物。 本發明亦涵蓋包含編碼禾本科（Family Poaceae)BEP分枝 系植物的經誘變之乙醯輔酶A羧化酶之核苷酸序列的重 組、經誘變、合成及/或經分離之核酸分子，其中該經誘 變之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序列在以下一或多個位置 處不同於相應野生型植物之乙醯輔酶A羧化酶胺基酸序 列：l，781(04w)、l，785Mw)、1，786(^岣、l，811(04wj、 1,824(04 …、l，864(04m) 、 l,999(Am) ' 2,027(Am) ^ 2,039MmJ、2,041Mmj 、2,049(04m)、2,059(04m)、 2,074(Am) ' 2,075(Am) ^ 2,07%(Am) > 2,079(Am) > 150569.doc •26- 201113376 2,080fAmJ ' 2,081^m； > 2,0SS(Am) ' 2,095(Am) ' 2,096(04/^或2,098(04m)。此類核酸分子可由包含以下任一 者之方法產生： (I)以下步驟： (a) 提供具有第一、零或非零程度之ACCase抑制劑 (ACCI)耐受性之BEP分枝系植物細胞； (b) 使該等細胞與培養基接觸生長以形成細胞培養物； (c) 使該培養物之細胞與ACCI接觸； (d) 使步驟⑷之經ACCI接觸之細胞生長以形成含有 ACCI耐受性程度大於步驟⑷之第一程度之細胞的培養 物；及 (e)自步驟（句之ACCI耐受性細胞產生ACCI耐受性程度 大於野生型品種之植物的植物；或 (II)以下步驟： (f)提供相較於野生型品種之植物對Accase抑制劑 (ACCI)之耐丈性增咼的第一耐除草劑之分枝系植物， 該耐除草劑之植物由包含步驟（a)_(e)之方法產生；及 ⑷由該第-植物產生保留該第—植物之增高之除草劑 耐受性特徵的第二耐除草劑之BEp分枝系植物； 藉此獲得财除草劑之BEP分枝系植物；且自料除草劑 之BEP分枝系植物分離出核酸。 分離、鑑別及/或| 在一實施例中’本發明涵 ，， ，麗/入/ %孓 徵單子葉植物質體ACCase中之除草劑耐受性突變之^ 法。在-實施例中，本發明涵蓋癒傷組織或植物細胞心 150569.doc •27· 201113376 用途。在其他實施财，本發明涵蓋在組織培養環境中對 1 直物材料或細胞進行培養。在其他實施例t，本發明涵蓋 ^且織培養環境中存在耐綸臈。在其他實施财，組織培 f環境包含液相培養基，而在其他實施财，該環境包含 固體培養基。在其他實施例中，本發明涵蓋在除草劑 (例如環料（eydQxydim))存在下在㈣料基t培養植物 材科丄接著在含有除草劑之半固體培養基中進行培養。在 :他實施例中’本發明涵蓋在除草劑存在下在半固體培養 土中培養植物材料’接著在含有除草劑之液體培養 行培養。 在-些實施射’本發明涵蓋直接施用致死劑量之除草 4(例如％权草）。在其他實施例中本發明涵蓋以次致死 劑量起料步增加除草_量。在其他實施例中，本發明 涵蓋u-步或並行地施用至少_種、至少兩種、至少三 種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八 種或八種以上除草劑。 在其他實施例中’突變頻率係由突變體耐除草劑之純系 ★對於只驗中所用之個別癒傷組織之數目的分率來 求出在些貫施例中，本發明涵蓋至少〇 〇3〇/〇或〇 〇3%以 上之犬邊頻率。在一些實施例中，本發明涵蓋至少 〇.〇3。/。、至少 〇·〇5%、至少、〇 1〇%、至少、〇 15%、至少 〇‘2〇%、1 少 G.25%、至少 G.3G%、至少 G.35%、至少 〇 4〇% 或0.40 /〇以上之突變頻率。在其他實施例+，本發明涵蓋 1檢刀離、鑑別及/或表徵單子葉植物質體AcCase中 150569.doc -28- 201113376 之除草劑耐受性突變之其他方法高至少2倍、至少3倍、至 少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍至少9 倍、至少10倍或10倍以上的突變頻率。 在-些實施財，本發明方^蓋鑑別Accase中之除 草劑耐受性突變。纟其他實施例中，本發明涵蓋重演 (recapitulate)單子葉植物細胞中之除草劑耐受性突變。 在-些實施例中，本發明涵蓋經分離之細胞或組織，源 於植物之該細胞或組織具有：a)源自宿主似脱（亦即内 源性）基因之ACC獄活性之缺& ;叫單+葉植物源性質 體ACCase基因之ACCase活性。 ACCase之單子葉植物來源 在其他實施例中，本發明涵蓋來自如本文所述之單子葉 植物科植物的質體ACCase或其部分。 在其他實施财’ |發明ί函蓋筛檢宿主植物細胞中單子 葉植物質體ACCase之耐除草劑的突變體。 ^其他實施例中，本發明涵蓋使用製備之宿主細胞來師 檢單子葉植物質體ACCase之耐除草劑的突變體。在一些 實施例中’本發明提供一種缺乏質體八⑽化活性之宿主 細胞。在其他實施例中，本發明之宿主細胞表現對除草劑 敏感之單子葉植物質體ACCase。 在其他實施例中’本發明方法包含由於基因組質體 ACCase基因之突變而缺乏ACCase活性的宿主細胞，該突 變包括單-點突變、多重點突變、部分缺失、部分剔除、 完全缺失及完全剔除。在另-實施例中，A用其他分子生 150569.doc •29· 201113376 物學技術（諸如RNAi、siRNA或反義RNA)來降低或除去基 因組質體ACCase活性。此等分子生物學技術在此項技術 中為熟知的。在其他實施例中，可用ACCase之代謝抑制 劑來降低或除去基因組ACCase源性活性。 在一些實施例中，宿主細胞為單子葉植物宿主細胞。 在其他實施例中，本發明涵蓋一種製備轉殖基因植物細 胞之方法，其包含：勾分離源於單子葉植物之細胞；…使 基因組ACCase基因之至少一個複本失活；c)對該細胞提供 單子葉植物源性質體ACCase基因；d)分離包含該單子葉植 物源性質體ACCase基因之細胞；及視情況而定，匀使基因 組ACCase基因之至少另一複本失活，且其中該細胞缺乏 由基因組ACCase基因提供之ACCase活性。 在一實施例中，耐環殺草之突變頻率大於〇 〇3%。 在貫施例中，本發明提供一種篩檢方法，其中耐環殺 草之植物細胞或組織亦能耐受其他ACCase抑制劑。 在-實施例中，本發明提供—種篩檢方法，其中耐環殺 草之植物細胞或組織僅包含一個在除草劑存在下進行培養 之前不存在於單子葉植物質體ACCase中的突變。 在-實施例中，本發明提供—種篩檢方法，其中耐環殺 草之植物細胞或組織包含兩個或兩個以上在除草劑存在下 進行培養之前不存在於單子葉植物質體ACCase中的突 變。 在一實施例中’本發明提供-種篩檢方法，其中環殺草 以次致死劑量存在。 又 150569.doc •30- 201113376 在-實施例中，本發明提供一種筛檢方法，其中在⑪ 卓存在下之培養以逐步或逐漸增加環殺草濃度之方_ 行。 疋· 在一實施例中’本發明提供—種 種師檢方法，其中該方法 包含在膜上培養細胞。在一較佳竇 平乂佳貫施例中，本發明提供一 種包含在耐綸膜上培養細胞之篩檢方法。 ’、 在實施例中’本發明提供—種篩檢财環殺草之植物細 =方法，其中在液體培養基或半固體培養基中培養細 在一實施例中’本發明提供_ 梗師檢方法，其中該方法 進一步包含鑑別至少一個在環 .^ , 隹衣杈草存在下進行培養之前不 存在於外源性單子葉植物質體ACCase中的突變。 在一實施例中，本發明提供— 種師k方法，其中該單子 葉植物為稻。 在一實施例中，本發明提供— ..^ l 裡師檢方法’其中該外源 性皁子葉植物質體ACCase來自稻。 【實施方式】 定義 、 如本文所用，「耐受性，弋「上 . A 次耐除草劑」指示植物或其 允忐夠在一定量之一般备在 曰在非耐受性（例如野生型）植物 或其4分中引起生長抑制的降 幻I示卓劑存在下生長。熟習此項 技術者已知且容易確定一炉合如^ ^ 般θ抑制非耐受性植物生長之除 =量。實例包括由製造商推薦之施用*。最大量為一 般將抑制非对受性植物生長之除草劑之量的實例。 150569.doc •31 · 201113376 如本文所用 傳物質。 重組體」係指有機體具有不同來源之遺 如本文所用’「經誘變」係指有機體之遺傳物質相較於 相應野生型有機體之遺傳物f已有改變，#中遺傳物質之 改變係由人類作用來誘發及/或選擇。可用於產生經誘變 之有機體的人類作用之實例包括(但不限於)以次致死濃度 之除草劑(例如乙醯輔酶八羧化酶抑制劑諸如環殺草或西 殺草)進行植物細胞之組織培養；用化學突變劑處理植物 細胞且隨後用除草劑（例如乙醯輔酶續化酶抑制劑，諸如 環殺草或西殺草）進行選擇m射線處理植物細胞且隨 後用除草劑（例如乙醯輔酶續化酶抑制劑，諸如環殺草或 西殺草）進订選擇。此項技術中已知之任何方法皆可用於 誘：突變。誘發突變之方法可誘發遺傳物質中隨機位置處 之突變或可誘發遺傳物質中特定位置處之突變（亦即可為 定點誘變技術）。 如本文所用，「經遺傳修飾之有機體」（GM〇)為遺傳特 徵已藉由插入另一來源之有機體或其子代之遺傳物質而經 改變的有機體，該另一來源之有機體或其子代保留有所插 入遺傳物質。來源有機體可為不同類型之有機體（例如 GMO植物可含有細菌遺傳物質）或來自相同類型之有機體 (例如G Μ Ο植物可含有另一植物之遺傳物質）。如本文所 用，重組體與GMO可視為同義語且指示存在不同來源之遺 傳物質，而經誘變指示相應野生型有機體之遺傳物質經改 變但無另一來源有機體之遺傳物質。 150569.doc •32· 201113376 如本文所用，「野生型」或「相應野生型植物」意謂如 有機體或其遺傳物質—般存在、不同於經誘變及/或重組 之形式的典型形式。 對於本發明，術語「耐除草劑」及「抗除草劑」可互換 思名人具有等效含義及等效範_。類似地，術語「除 草劑耐X性」&「除草劑抗性」可互換使用且意欲具有等 7 3義及等效範_。類似地，術語「對…具有财受性」及 「對…具有抗性」彳互換使用且意欲具有等效含義及等效 範_。 如本文關於適用於本文中之各種實施例中的除草劑所 用堵如生長素Uuxinic)除草劑、AHA_制劑、乙醯輔 酶續化酶（ACCase)抑制劑、pp〇抑制劑、EMps抑制劑、 米坐琳酮、續酿脲及其類似物之術語係指此項技術中認可 之彼等農藝學上可接受之除草劑活性成份(Α_Ι·)。類似 地諸如殺真菌劑、殺線蟲劑、殺蟲劑及其類似物之術語 係：此項技術中認可之其他農藝學上可接受之活性成份。 备關於特定突變體酵素或多肽使用時，諸如耐除草劑 (曰Η Τ)及除草劑耐受性之術語係指此酵素或多肽能夠在—定 置之般將滅活或抑制野生型（非突變體）形式之該酵素或 多肽=性的除草劑ΑΙ.存在下發揮其生理活性。舉例而 。田特定s之關於AHAS酵素或ahasl多肽使用時，其 特定言之係指耐受AHAS抑制劑之能力。AHAS抑制劑之類 別包括磺醯脲、咪唑啉酮、三唑幷嘧啶、磺醯基胺基羰基 二唑啉酮及嘧啶基氧基[硫基]苯甲酸酯。 150569.doc •33- 201113376 如本文所用，「後代」係指任一代植物。 如本文所用，「子代」係指第一代植物。 植物 本心月k供禾本科（grass family Poaceae)之耐除草劑的 單子葉植物。禾本科可分為兩個主要分枝系：含有竹亞 科、稻亞科及早熟禾亞科（p00ideae)之分枝系（BEp分枝系） 及含有黍亞科（Panicoideae)、蘆竹亞科（Arundin〇ideae)、 虎尾草亞科（Chloridoideae)、假淡竹葉亞科（Cent〇thec〇ideae)、 MiCrair〇ideae、三芒草亞科（Aristid〇ideae)及扁芒草亞科 (Danthonioideae)之分枝系（PACCMAD分枝系）。竹亞科包 括稻族（tribe 。本發明係關於BEp分枝系之植物， 特疋a之竹亞科及稻亞科之植物。如下所述，本發明之植 物由於表現本發明之乙醯輔酶A叛化酶而通常對至少一種 抑制乙醯輔酶A羧化酶活性之除草劑具有耐受性。bET分 枝系包括竹亞科、稻亞科及Triticodae群且無其他早熟禾 亞科群。BET作物植物為生長以用於食品或草料之植物， 其為BET次分枝系之成員，例如大麥 '玉米等。 本發明亦提供具有商業重要性之耐除草劑單子葉植物， 包括甘嚴（甘薦屬（Saccharum spp·))、以及草坪 (Turfgrasses)，例如原野早熟禾（poa pratensis，藍草 (Bluegrass))、剪股穎屬（Agrostis spp.，小糠草（Bentgrass))、黑 麥卓屬（Lolium spp. ’ 黑麥草（Ryegrass))、羊茅屬（Festuca spp.， 羊茅（Fescues))、芝草屬（Zoysia spp.，芝草（Zoysia grass))、 狗牙根屬（Cynodon spp..，百慕達草（Bermudagrass))、聖奥古 150569.doc -34- 201113376 斯丁草（Stenotaphrum secundatum，St. Augustine grass)、 雀稗屬（Paspalum spp·，百喜草（Bahiagrass))、娱蚣草 (Eremochloa ophiuroides ’ Centipedegrass)、地毯草屬（Axonopus spp. ’ 地毯草（Carpetgrass))、水牛草（Bouteloua dactyloides， Buffalograss)及格蘭馬草變種（Bouteloua var· spp.，格蘭馬 草（Grama grass)) ° 在一實施例中，本發明提供竹亞科之耐除草劑之植物。 此等植物通常對一或多種抑制乙醯輔酶A羧化酶活性之除 草劑具有耐受性。竹亞科之耐除草劑之植物之實例包括 (但不限於）青籬竹屬（Arundinaria)、箣竹屬（Bambusa)、丘 斯誇竹屬（ChUSquea)、瓜多竹屬（Guadua)及倭竹屬 (Shibataea)之彼等者。 在一貫施例中，本發明提供稻亞科之耐除草劑之植物。 此等植物通常對一或多種抑制乙醯輔酶八羧化酶活性之除 草劑具有耐受性。稻亞科之耐除草劑之植物之實例包括 (但不限於）皺桴草屬、李氏禾屬（^_)、 Micr〇laena、稻屬（〇ryza)反菰屬之彼等者。 在貫施例中，H a月提供早熟禾亞科《耐除草劑之植 此等植物通4對一或多種抑制乙醯輔酶A竣化酶活性 之除草劑具有耐受性。稻亞科之耐除草劑之植物之實例包 括(但广限於）小麥族（7W"C叫屬、燕麥族…㈣_屬及 羊茅族（Poeae)屬之彼等者。 :在—實施例中，本發明的耐除草劑之植物為稻植物。亞 洲栽培稻及西非洲栽培稻為最常載培之兩個稻物種。具有 150569.doc -35- 201113376 商業重要性之許多亞洲栽培稻亞種包括在來稻、蓬萊稻、 爪口圭稻subsp. 糯稻 subsp. ’ 糯米（glutinous rice))、香稻群（〇jza •sahva Aromatica group，例如印度香米（basmati))及亞洲栽 培稻（Or>»za ίαίζ’να，浮稻群（Floating rice group))。本發明 涵蓋所有上述物種及亞種之财除草劑之植物。 在一實施例中，本發明的耐除草劑之植物為小麥植物。 普通 4、麥（Triticum aestivum)反篆麥（Triticum turgidum)為 最常載培之兩個小麥物種。具有商業重要性之許多其他物 種包括（但不限於）提摩菲維小麥（7Wi/cwm iz'mop/zeevz·/)、一 粒小麥（TWi/cwm monococcww)、茹科夫斯基小麥（7>z_"cwm 及烏拉爾圖小麥（7Wi/cMm MrariM)及其雜種。本 發明涵蓋所有上述物種及亞種之财除草劑之植物。包含於 本發明内之普通小麥（T. aestivum)亞種之實例為普通小麥 原變種（aestivum, common wheat)、密穗小麥（compactum， club wheat)、莫迦小麥（macha，macha wheat)、瓦維洛夫小 麥（vavilovi，vavilovi wheat)、斯卑爾脫小麥（speita)及 sphaecrococcum(shot wheat) 〇包含在本發明内之圓錐小麥 (T. turgidum)亞種之實例為圓錐小麥原變種（turgidum)、波 斯小麥（carthlicum)、二粒小麥（dicoceon)、硬粒小麥（durum)、 栽培二粒小麥paleocolchicuna、波蘭小麥（p〇l〇nicum)、東方小 麥（turanicum)及野生二粒小麥（dicoccoides)。包含在本發明 内之一粒小麥（T. monococcum)亞種之實例為一粒小麥原變 種（monococcum，einkorn)及野生一粒小麥（aegii〇p〇ides) 0 150569.doc -36- 201113376 在本發明之一實施例中，小麥植物為普通小麥物種，且更 特定言之紅粒春小麥栽培品種（CDC Teal cultivar)之成 員。 在一實施例中，本發明的耐除草劑之植物為大麥植物。 大麥（Hordeum vw/容are)及亞利桑那大麥所 ar/zoWcMm)為最常載培之兩個大麥物種。具有商業重要性 之許多其他物種包括（但不限於）布頓大麥 (Hordeum—bogdanii)、野大麥[Hordeum_brachyantherum)、 短芒九麥（JFIordeum brevisubulatum)、珠 1 大麥{Hordeum bulbosum) 、 Hordeum comosum 、平展大麥{Hordeum depressum) 、Hordeum intercedens 、芒靜、大麥（Hordeum jubatum)、海濱:K 麥（Hordeum marinum)、Hordeum parodii、 小夫麥（Hordeum pusillum)、Hordeum—secalinum、反二後 野生大麥（//ori/ewm spcmiaweMw)。本發明涵蓋所有上述物 種及亞種之财除草劑之植物。 在一實施例中，本發明的耐除草劑之植物為黑麥植物。 具有商業重要性之物種包括（但不限於）森林黑麥（Secra/e •sy/vesire)、山黑麥（Seca卜 siriciww)、普通黑麥（Seca/e cerea/e)、瓦維洛夫黑麥（Seca/e vaW/〇Wz·)、非洲黑麥 {Secale africanum)、Secale ciliatoglume、Secale ancestrale良 山地黑麥（<Sec<3/e 。本發明涵蓋所有上述物種及 亞種之耐除草劑之植物。 在一實施例中，本發明对除草劑之植物為草皮植物。草 皮草之許多具有商業重要性之物種包括結縷草（Ζογζ’α 150569.doc -37- 201113376 、匍匐翦股穎（々ro价& 、肯塔基藍草 (Ρσα pr价《Α)、早熟禾（户口㈣⑽）、馬唐（识抑紐·β sawg'wma/zs)、香附子n?iW«i/Wls)、短葉水娱虫公 (Kyllinga brevifolia)、η 穆爾莎萆（Cyperus amuricUS)、加章 九遂（Erigeron canadensis)、天胡姿（Hydrocotyh sibthorpioides)、 難眼萆（KUmmerowia striata)、地鎢（Euph〇rbia humifus 幻及 野生堇菜（Wo/α arv⑼ίζ·匀。本發明涵蓋所有上述物種及亞 種之耐除草劑之植物。 除能夠耐受抑制乙醢輔酶A羧化酶活性之除草劑以外， 本發明之植物亦可耐受作用於其他生理過程之除草劑。舉 例而言，本發明之植物可耐乙醯輔酶A羧化酶抑制劑以及 其他除草劑，例如酵素抑制劑。本發明之植.物可耐受之其 他酵素抑制劑之實例包括（但不限於）5_烯醇丙酮酸莽草酸· 3-磷酸合成酶（EPSPS)抑制劑（諸如草甘膦（glyph〇sate))、 乙醯羥基酸合成酶（AHAS)抑制劑（諸如咪唑啉酮、磺醯脲 及磺醯胺除草劑）及麩醯胺酸合成酶抑制劑（諸如固殺草 (glufosinate))。除酵素抑制劑以外，本發明之植物亦可耐 丈具有其他作用模式之除草劑，例如生長素除草劑（諸如 2,4-D或麥草畏（dicamba))、葉綠素/類胡蘿蔔素色素抑制劑 (諸如羥苯基丙酮酸雙加氧酶（HppD)抑制劑或八氫番茄L 素去飽和酶（PDS)抑制劑）、原、外淋原_Ιχ氧化酶抑制劑、 細胞膜破壞劑、光合抑制劑（諸如溴苯腈或碘笨腈）、細胞 分裂抑制劑、根抑制劑、芽抑制劑及其組合。因此，可= 耐乙醯輔酶Α羧化酶抑制劑之本發明之植物對多種除草劑 150569.doc •38- 201113376 具有抗性。 舉例而言，耐乙醯輔酶Α缓化酶抑制劑（諸如「環己二 酮」類（例如環殺草（cycloxydim)、西殺草（sethoxydim)、 勉草同（clethodim)或得殺草（tepraloxydim))、「芳氧基苯氧 丙酸酯」類（例如炔草酸（clodinafop)、禾草靈（diclofop)、 0比氟禾草靈（fluazifop)、氟。比禾靈（haloxyfop)或喹禾靈 (quizalofop))及「苯基吡唑啉」類（諸如唑啉草_ (pinoxaden)))之本發明之植物在一些實施例中可耐生長素 除草劑、EPSPS抑制劑（諸如草甘膦）、ppo抑制劑（諸如„密 °定二酮（諸如嘧咬將草謎（saflufenacil))、三唾琳酮（諸如甲 磺草胺（sulfentrazone)、唑酮草酯（carfentrazone)、丙炔氣 草胺（flumioxazin))、二苯基醚（諸如三氟敌草喊 (acifluorfen)、氟磺胺草醚（f〇mesafen)、乳氟禾草靈 (lactofen)、乙氧氟草醚（OXyfluorfen))、N-苯基鄰笨二甲酿 亞胺（諸如氟胺草酯（flumiclorac)、CGA_248757))及/咬Gs 抑制劑（諸如固殺草）。除此等種類之抑制劑以外，耐乙酿 輔酶A羧化酶抑制劑之本發明之植物亦可耐受具有其他作 用模式之除草劑，例如葉綠素/類胡蘿蔔素色素抑制劑、 細胞膜瓦解劑、光合抑制劑、細胞分裂抑制劑、根抑制 劑、芽抑制劑及其組合。此等耐受性狀可表現為例如具有 除草劑降解活性之突變體E P S P S蛋白質或突變體麩胺醯胺 合成酶蛋白質；或突變體天然、近親交配或轉殖基因芳氧 基烷酸雙加氧酶（AAD4DHT)、_芳基腈水解酶（ΒχΝ)虱 2,2-二氯丙酸去函酶（DEH)、草甘膦_Ν_乙醯基轉移酶 150569.doc •39- 201113376 (GAT)、草甘膦脫羧酶（GDC)、草甘膦氧化還原酶（G〇x)、 麩胱甘肽-S-轉移酶（GST)、草胺膦乙醯基轉移酶（pAT或 bar)或細胞色素P450(CYP450)蛋白質。本文中耐乙醯輔酶 A羧化酶抑制劑之植物亦可堆疊有其他性狀，包括（但不限 於）殺蟲性狀，諸如具有針對鞘翅目（c〇le〇pteran)、鱗翅目 (lepidopteran)、線蟲或其他害蟲之殺蟲活性的出心丫及其 他蛋白質；營養或營養藥物性狀，諸如改進之油含量或油 概況性狀、高蛋白質或高胺基酸濃度性狀，及其他此項技 術中已知之性狀類型。 此外，除能夠耐受抑制乙醯輔酶A羧化酶活性之除草劑 之植物以外’植物亦涵蓋藉由使用重組DNA技術而能夠合 成一或多種殺昆蟲蛋白，尤其自芽孢桿菌屬細菌（特定言 之蘇力菌i/zwriwgz’e/m··!?))已知者的植物，該等殺 昆蟲蛋白諸如△-内毒素’例如CryIA(b)、CryIA(c)、
CrylF、CryIF(a2)、CryIIA(b)、CrylllA、CrylllB(bl)或
Cry9c ;營養期殺昆蟲蛋白（vip)，例如vipi、vjp]、 VIP3或VIP3A，拓殖線蟲之細菌（例如發光桿菌屬 spp.)或異桿菌屬spp.))之殺昆 蟲蛋白；由動物產生之毒素’諸如蠍毒素、蜘蛛毒素、黃 蜂毒素或其他昆蟲特異性神經毒素；由真菌產生之毒素， 諸如鏈黴菌（Streptomycetes)毒素；植物凝集素，諸如豌豆 或大麥凝集素；凝集素；蛋白酶抑制劑，諸如胰蛋白酶抑 制劑、絲胺酸蛋白酶抑制劑、馬鈴薯塊莖貯藏蛋白 (patatin)、胱抑素（cystatin)或木瓜蛋白酶（papain)抑制劑； 150569.doc -40- 201113376 核糖體失活蛋白（RIP)，諸如蓖麻毒素（ricin)、玉米RIp、 相思子毒素（abrin)、絲瓜毒素（luffin)、沙泊寧（saporin)或 欖香膠素（bryodin);類固醇代謝酶，諸如3_羥基類固醇氧 化酶、脫皮素-IDP-糖基轉移酶、膽固醇氧化酶、蜆皮激 素抑制劑或HMG-CoA還原酶；離子通道阻斷劑，諸如鈉 或鈣通道之阻斷劑；保幼激素醋酶；利尿激素受體（異株 瀉根毒蛋白（helicokinin)受體）；芪合成酶、聯苄合成酶、 殼質酶或葡聚醣酶。在本發明之情形下， 或毒素亦應明確理解為前毒素、雜交蛋白質=: 其他方式修飾之蛋白質。雜交蛋白f之特徵在於蛋白質域 之新組合（參見，例如W0 〇2/()157()1)。此等毒素或能夠合
成此等毒素之經遺傳修飾植物的其他實例揭示於例如Ep_A 374 753 ^ WO 93/007278 ^ WO 95/34656 ^ EP-A 427 529 > EP-A45! 878、彻 03/1881〇及觸〇3/52〇73中。用於產生 此等經遺傳㈣植物之方法通常為熟f此項技術者所已知 且描述於例如以上提及之公開案中。經遺傳修_物中所 含有之此等殺昆蟲蛋白保護產生此等蛋白質耐受性之植物 免遭來自節肢動物（athropod)之所有分類群之有宝害蟲， 尤其甲蟲（鞠翅目（C〇el_a)) ϋ昆蟲雙^目 (Μ—))及蛾（鱗翅目叫）以及線蟲（線蟲綱 (Nematoda))的侵害。 此外:在-實施例中，植物亦涵蓋藉由使用重組麵技 術及/或猎由育種及/或以其他方式針對能夠合成一 增強彼等植物對細菌、病毒或真菌病原體之抗性或耐二 150569.doc 41 201113376 之蛋白質的性狀選擇之植物。產生此等經遺傳修飾植物之 方法通常為熟習此項技術者已知。如本文所述產生之植物 亦可疊加有其他性狀，包括（但不限於）抗病性、礦物質概 況增強、維生素概況增強、油概況（例如高油酸含量）、胺 基酸概況（例如高離胺酸玉米）增強及其他此項技術中已知 之性狀類型。 此外，在一實施例中，植物亦涵蓋例如藉由使用重組 DNA技術及/或藉由育種及/或經由其他方式選擇之能夠合 成一或多種增強彼等植物之生產力（例如生物質量產生、 縠物產量、澱粉含量、含油量或蛋白質含量）、增強對乾 旱、鹽度或其他生長限料境因K耐受十生或對害蟲及真 菌、細菌或病毒病原體之耐受性之蛋白質的植物。 此外，在-實施例中，植物亦涵蓋例如藉由使用重組 DNA技術及/或藉由育種及/或經由其他方式選擇之含有改 變量之内含物質或内含新賴物f的植物，尤其以改良人類 或動物營養。此外，植物亦涵蓋藉由使用重組職技術而 含有改變量之内含物質或内含新穎物質的植物，尤其以提 高原料產量。 ^ 此外’在-些实施射，本发明之植物亦涵盖例如藉由 使用重组DNA技术及/或藉由育种及/或以其他方式针对经 改变以含有增加量之维生素及/或矿物质、及/或改良概况 之營養藥物化合物之性状选择的植物。 在-實施例中，相對於野生型植物，耐乙醯輔酶續化 酶抑制劑之本發明之植物包含増加量或改良概況之選自由 150569.doc -42· 201113376 以下組成之群的化合物：硫化葡萄糖苷（例如蘿蔔苦 (glucoraphanin，4-甲亞磺醯基丁基-硫化葡萄糖苷）、蘿蔔 硫素（sulforaphane)、3-吲哚基甲基-硫化葡萄糖苷（葡萄糖 芸苔素（glucobrassicin))、1-曱氧基-3-吲哚基曱基-硫化葡 萄糖皆（新葡萄糖芸苔素（neoglucobrassicin)));紛系（例如 類黃酮（flavonoid，例如樹皮素（qUercetin)、番營金黃素 (kaempferol))、經基桂皮酸基衍生物（例如1，2,2，_三芬子醯 基月I 膽·一糖（1，2,2'-trisinapoylgentiobiose)、1，2-二阿魏酿 基龍膽二糖（diferuloylgentiobiose)、1，2'-二芥子醯基 _2_阿 魏醯基龍膽二糖）、3-0-咖啡醯基-奎尼酿（新漂木酸 (neochlorogenic acid)));及維生素及礦物質（例如維生素 C、維生素E、胡蘿蔔素、葉酸、於酸、核黃素、維生素 B1、鈣、鐵、鎂、鉀、硒及鋅）。 在另一實施例中，相對於野生型植物’耐乙醯輔酶A羧 化酶抑制劑之本發明之植物包含增加量或改良概況之選自 由以下組成之群的化合物：前致甲狀腺腫素（pr〇g〇itrin); 異硫氰酸酯（isothiocyanate);吲哚（硫化葡萄糖苷水解產 物）；麩胱甘肽（glutathione);類胡蘿蔔素，諸如β_胡蘿蔔 素、番力α紅素、及葉百素類胡蘿蔔素，諸如黃體素（lutein) 及玉米黃素（zeaxanthin);包含類黃酮之酚系，諸如黃酮醇 (flavonol，例如樹皮素、芸香普（rutin))、黃烧/丹寧 (flavan/tannin ’諸如包含香豆素（coumarin)、原花青素 (proanthocyanidin)、兒命素（catechin)及花青素（anthocyanin)之原 矢車菊素（procyanidin))，黃酿| ;植物雖激素（phytoestrogen)， 150569.doc -43 - 201113376 諸如香豆雌酚（coumestan)、木酚素（lignan)、白藜蘆醇 (resveratrol)、異黃酮，例如金雀異黃素（genistein)、大豆 異黃酮（daidzein)及黃豆素黃酮（glycitein);二羥基苯曱酸 (resorcyclic acid)内酯；有機硫化合物；植物甾醇 (phytosterol);類萜’諸如鼠尾草醇（carnos〇l)、迷迭香酸 (rosmarinic acid)、甘草素（glycyrrhizin)及皂素（saponin); 葉綠素；葉綠酸（chlorphyllin)、糖、花青素及香草 (vanilla)。 在其他實施例中’相對於野生型植物，耐乙醯輔酶A羧 化酶抑制劑之本發明之植物包含增加量或改良概況之選自 由以下組成之群的化合物：長春新驗（vincristine)、長春花 鹼（vinblastine)、紫杉烷（taxane，例如紫杉醇（taxol，太平 洋紫杉醇（paclitaxel)))、漿果赤黴素 in(baccatin III)、1〇. 去乙醯基衆果赤黴素III(l〇-desacetylbaccatin III)、1〇_ 去 乙醯基紫杉醇、木糖基紫杉醇、7-表紫杉醇（7-epitaxol)、 7-表毁果赤黴素III(7-epibaccatin III)、10-去乙醯基三尖杉 寧驗（10-desacetylcephalomannine)、7-表三尖杉寧驗（7_ epicephalomannine)、紫杉德（taxotere)、三尖杉寧鹼 (cephalomannine)、木糖基三尖杉寧鹼（xylosyl cephalomannine)、歐紫杉吉吩（taxagifine)、8-苯甲醯基氧 基歐紫杉吉吩（8-benxoyloxy taxagifine)、9-乙醯氧基紫和 素（9-acetyloxy taxusin)、9-羥基紫杉素（9_hydr〇Xy taxusin)、taiwanxam、紫杉烷 la、紫杉烷 ib、紫杉烷 Ic、 紫杉院Id、GMP太平洋紫杉醇、9-二氫13-乙醯基漿果赤徵 150569.doc -44 - 201113376 素III(9-dihydro 13-acetylbaccatin ΠΙ)、10-去乙醯基_7•表 紫杉醇（lO-desacetyl-7-epitaxol)、四氫大麻酚 (tetrahydrocannabino卜 THC)、大麻二酚（cannabidio卜 CBD)、 金雀異百素、大豆異黃酮（diadzein)、可待因（c〇deine)、嗎 啡（morphine)、奎寧（quinine)、紫草素（shik〇nin)、四氫蛇 根驗（ajmalacine)、蛇根驗（serpentine)及其類似物。 本發明亦涵蓋本發明之植物以及源自本發明耐除草劑之 植物之種子及源自本發明耐除草劑之植物之細胞的子代。 在各種實施例中，本文中之植物可用於產生植物產品。 因此，製備後代種子之方法包含種植能夠產生本文中之植 物的種子、使所得植物生長及收穫其後代種子。在一些實 施例中，此類方法可進一步包含對所得植物施用 抑制性除草劑組合物。類似地，產生自本文中之植物獲得 之產品的方法可包含處理其植物部分來獲得所得產品。在 一些實施例中，此類方法可用於獲得係為例如以下任一者 的所得產品：秣料、飼料、種子⑽、油或經種子處理塗 佈之種子由此等方法獲得之種子、經處理種子及其他植 物產品為可商業化之適用產品。 在各種實施例中，本發明提供自任—本文所述之植物產 生食品、消費品、工業產品及獸醫產品。 乙酿輔輕A幾化酶 本毛月提[表現胺基酸序列不同於在相應野生型植物中 么見之乙醯輔酶續化酶胺基酸序列之乙醯輔酶A羧化酶 的植物。4 了便於理解，本文中使用之胺基酸編號系統將 J50569.doc •45· 201113376 為大穗看麥娘（Alopecurus myosuroides [Huds·]，亦稱為奪 草）乙醯輔酶A羧化酶所用之編號系統。編碼大穗看麥娘乙 醯輔酶A羧化酶之mRNA序列可以GenBank寄存編號 AJ310767獲得且蛋白質序列可以GenBank寄存編號 CAC84 1 6 1獲得’兩者均以引用之方式明確併入本文中。 所提及之胺基酸編號將由跟隨以指示胺基酸所對應之 大穗看麥娘序列中的胺基酸。圖1 8提供大穗看麥娘乙醯輔 酶A羧化酶胺基酸序列（GenBank寄存編號CAC84161)。在 本發明之乙醯輔酶A羧化酶中可經改變之胺基酸以粗體雙 下劃線指示，且圖19描述野生型亞洲栽培稻乙醯輔酶a敌 化酶與大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶比對之胺基酸序列， 其中指示了一些關鍵殘基。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置l，781(^4w)處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置1，781 64m)處具有異 白胺酸（11781)。本發明之1,781MW ACCase突變體在此位 置處將具有不為異白胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）白胺酸（I1781L)、纈胺酸（I1781V)、蘇胺酸 (Π781T)及丙胺酸（II781A)。在一實施例中，本發明乙醯 輔酶A酵素在位置i，7 81Mm)處將具有白胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置l，785Mwj處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置1，785處具有丙 150569.doc • 46 · 201113376 胺酸（A1785)。本發明之l，785(>4wj ACCase突變體在此位置 處將具有不為丙胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）甘胺酸（A1 7 8 5 G)。在一實施例中’本發明乙醯輔酶a酵 素在位置1,785 (04m」處將具有甘胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，786β~處不同於相應野生型乙醯輔酶a羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置i，786Mmj處具有丙 胺酸（A1786)。本發明之i，786^4w) ACCase突變體在此位置 處將具有不為丙胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）脯胺酸（A1786P)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶a酵 素在位置1，7 8 6 β 處將具有脯胺酸。 在一貫施例中，本發明之乙醯輔酶A叛化酶在胺基酸位 置1，8 11 (04 處不同於相應野生型乙醯輔酶a羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置i，8ii M 處具有異 白胺酸（11811)。本發明之1，811~_八^(^36突變體在此位 置處將具有不為異白胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）天冬醯胺（I1811N)。在一實施例令，本發明乙醯輔 酶A酵素在位置處將具有天冬醯胺。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，824Μ~處不同於相應野生型乙醯輔酶a羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置處具有麩 150569.doc -47- 201113376 醯胺酸（Q1824)。本發明之ACCase突變體在此位 置處將具有不為麩醯胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 酿輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）脯胺酸（q1824P)。在一實施例中，本發明乙醯輔 酶A酵素在位置處將具有脯胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，864(04處不同於相應野生型乙醯輔酶a敌化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置l，864(^m」處具有纈 胺酸（V1864)。本發明之l，864(04mj ACCase突變體在此位置 處將具有不為纈胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）苯丙胺酸（V1 864F)。在一實施例中’本發明乙醯輔酶a 酵素在位置l,864(04mj處將具有苯丙胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1,999 (04m)處不同於相應野生型乙醯輔酶a羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置l，999(Oim_；處具有色 胺酸（W1999)。本發明之i，999Mmj ACCase突變體在此位 置處將具有不同於色胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）半胱胺酸（W1999C)及甘胺酸（W1999G)。在一實施 例中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置1，999M…處將具有甘 胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯辅酶A羧化酶在胺基酸位 置2，0 2 7 M 處不同於相應野生型乙酸輔酶A缓化酶。野生 150569.doc •48- 201113376 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,02764mJ處具有色 胺酸（W2027)。本發明之2,027Μ~ ACCase突變體在此位 置處將具有不同於色胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）半胱胺酸（W2027C)及精胺酸（W2027R)。在一實施 例中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置2,〇27(04m)處將具有半 胱胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,03 9Mm)處不同於相應野生型乙醯輔酶a羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,039MmJ處具有麵 胺酸（E2039)。本發明之2,〇39Mm) ACCase突變體在此位置 處將具有不為麵胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 轉A叛化if中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）甘胺酸（E2039G)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶a酵 素在位置2,〇39(04mj處將具有甘胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,041(^m)處不同於相應野生型乙醯輔酶a羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,041 M處具有異 白胺酸（12041)。本發明之2,〇41(^m) ACCase突變體在此位 置處將具有不為異白胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）天冬醯胺（12041N)或纈胺酸（12041V)。在一實施例 中’本發明乙醯輔酶A酵素在位置2,〇41^4w)處將具有天冬 醯胺。 150569.doc 49· 201113376 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,049(^W處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,04964m)處具有纈 胺酸（V2049)。本發明之2,049MmJ ACCase突變體在此位置 處將具有不為纈胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）苯丙胺酸（V2049F)、異白胺酸（V2049I)及白胺酸 (V2049L)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置 2,049(04m)處將具有苯丙胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,059(04…處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯辅酶A羧化酶在位置2,059(^m)處具有丙 胺酸（A2059)。本發明之2,059Mm」ACCase突變體在此位置 處將具有不為丙胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）纈胺酸（A2059V)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A酵 素在位置2,05964~處將具有纈胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2074(04m)處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙酿輔酶A叛化酶在位置2074Mm」處具有色 胺酸（W2074)。本發明之2,074(04m) ACCase突變體在此位 置處將具有不同於色胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙 醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但 不限於）白胺酸（W2074L)。在一實施例中，本發明乙醯輔 150569.doc •50· 201113376 酶A酵素在2074(^w)處將具有白胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,075Mm)處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,075(^~處具有纈 胺酸（V2075)。本發明之2,075(04mj ACCase突變體在此位置 處將具有不為纈胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯辅 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）甲硫胺酸（V2075M)、白胺酸（V2075L)及異白胺酸 (V2075I)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置 2,075(04mj處將具有白胺酸。在一些實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶在位置2075 (04m)處將具有纈胺酸及在緊 隨位置2075(Oiwj處之後且在位置2076(04m)處之绳胺酸之前 具有另一纈胺酸，亦即可具有三個連續纈胺酸，而野生型 酵素具有兩個纈胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,078(04…處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,078 岣處具有天 冬胺酸（02078)。本發明之2,078(04»^)人(：€&36突變體在此位 置處將具有不同於天冬胺酸之胺基酸。可存在於本發明之 乙醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括 (但不限於）離胺酸（D2,078K)、甘胺酸（D2078G)或蘇胺酸 (D2078T)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置 2,078(^m〉處將具有甘胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶在胺基酸位 150569.doc 51 201113376 置2,079(04mj處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A叛化酶在位置2,0 7 9 (04 處具有絲 胺酸（S2079)。本發明之2,079(04m」ACCase突變體在此位置 處將具有不為絲胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）苯丙胺酸（S2079F)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A 酵素在位置2,079(04mJ處將具有苯丙胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,080(04一處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,08〇64所）處具有離 胺酸（K2080)。本發明之2,08〇Μ«^ ACCase突變體在此位置 處將具有不同於離胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯 輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不 限於）麩胺酸（K2080E)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A 酵素在位置2,080處將具有麩胺酸。在另一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶通常將具有此位置之缺失 (△2080)。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,081(^m)處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,081 處具有異 白胺酸（12081)。本發明之ACCase突變體在此位 置處將具有不為異白胺酸之胺基酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶通常將具有此位置之缺失（Δ2081)。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 150569.doc -52- 201113376 置2,08 8 (04m」處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,088(04mJ處具有半 胱胺酸（C2088)。本發明之2,088Mm> ACCase突變體在此位 置處將具有不同於半胱胺酸之胺基酸。可存在於本發明之 乙醯輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括 (但不限於）精胺酸（C2088R)、色胺酸（C2088W)、苯丙胺酸 (C2088F)、甘胺酸（C2088G)、組胺酸（C2088H)、離胺酸 (C2088K)、絲胺酸（C2088S)、蘇胺酸（C2088T)、白胺酸 (C2088L)或纈胺酸（C2088V)。在一實施例中，本發明乙醯 輔酶A酵素在位置2,088(^m)處將具有精胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,095(^mj處不同於相應野生型乙醯輔酶A缓化酶。野生 型大穗看麥娘乙酸輔酶A缓化酶在位置2,095(04處具有離 胺酸（K2095)。本發明之2,09564m) ACCase突變體在此位置 處將具有不同於離胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯 輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不 限於）麩胺酸（K2095E)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶a 酵素在位置2,09564mj處將具有麩胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2，0 9 6 (04 處不同於相應野生型乙酿輔酶a缓化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,096(0imy)處具有甘 胺酸（〇2096)。本發明之2,096(^所）人(1：€336突變體在此位置 處將具有不同於甘胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯 輔酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不 150569.doc -53- 201113376 限於）丙胺酸（G2096A)或絲胺酸（G2096S)。在一實施例 中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置2,096(^mj處將具有丙胺 酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,098(04mj處不同於相應野生型乙醯輔酶A羧化酶。野生 型大穗看麥娘乙醯輔酶A羧化酶在位置2,098處具有纈 胺酸（V2098)。本發明之2,098(^m) ACCase突變體在此位置 處將具有不為纈胺酸之胺基酸。可存在於本發明之乙醯輔 酶A羧化酶中之此位置處之胺基酸的適合實例包括（但不限 於）丙胺酸（V2098A)、甘胺酸（V2098G)、脯胺酸 (V2098P)、組胺酸（V2098H)、絲胺酸（V2098S)或半胱胺酸 (V2098C)。在一實施例中，本發明乙醯輔酶A酵素在位置 2,098(04mj處將具有丙胺酸。
在一實施例中，本發明涵蓋僅在以下一個位置處不同於 相應野生型植物之乙醯輔酶A羧化酶之本發明耐除草劑之 植物的乙醯輔酶A羧化酶：l，781^4mj、1,785(04…、 \,l%6(Am) \ ,%\\(Am) 1,824fAmJ l,864(AmJ \,999(Am) ' 2,0Π (Am) ' 2,039(Am) ' 2,041(Am) 2,049(Am) 、 2,059(Am) 、 2,01 A(Am) ' 2,015 (Am) 2,0TZ(Am) 、 2,019 (Am) 、 2,080fAmJ 、 2,081 (Am)
、 2,095(04mj 、 2,096(04mJ 或 2,098(04w^ 。 I 一 例中，本發明耐除草劑之植物之乙醯輔酶A羧化酶將僅在 以下一個位置處不同：2,078Mm)、2,0880m)或。 在一較佳實施例中，本發明耐除草劑之植物之乙醯輔酶A 150569.doc -54- 201113376 羧化酶將僅在以下一個位置處不同：2,039(04/7^、 2,059Mm」、2,08〇Μ_或2,095Mm」。在一更佳實施例中， 本發明耐除草劑之植物之乙醯輔酶A羧化酶將僅在以下一 個位置處不同：l，785(^(m)、l,786(^m)、l,811(04m」、
\ ,?>2A(Am) \^βΑ(Απι) ' 2,QA\(Am) ' 2,049(AmJ 2,0 7 4 (Oi 所 J 、 2，0 7 9 (01 、 2，0 8 1 (Οί 所）、2，0 9 6 (04 或 2,098(04m」。在一最佳實施例中，本發明耐除草劑之植物 之乙醯輔酶A羧化酶將僅在以下一個位置處不同： l,78lfAmJ ' l，999(C4m) 、 2,027Μ«^ 、 2,041(04w)或 2,096(04所」° 在一實施例中，本發明之乙酿輔酶A羧化酶將僅具有以 下一個取代：位置2,075 處之異白胺酸、位置 2,〇7864m>處之甘胺酸或位置2,088(^mJ處之精胺酸。在一 較佳實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將僅具有以下 一個取代：位置2,039(^mj處之甘胺酸、位置2,05964/7^處 之纈胺酸、位置2,075(04…處之曱硫胺酸、位置2,075(04wJ 處之重複（亦即在2,074μ?^與2,075(^4m)之間插入纈胺酸或 在位置2,075(04與2,076Mmj之間插入绳胺酸）、胺基酸位 置2,08〇64岣之缺失、位置2,080(^/^處之麩胺酸、位置 2,081(^所）之缺失、或位置2,095(^;^處之麵胺酸。在一更 佳實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將僅具有以下一 個取代：位置1，785^4~處之甘胺酸、位置l，786(^mj處之 脯胺酸、位置l，811(04m)處之天冬醯胺、位置2,075(04~處 之白胺酸、位置2,075(^/^處之曱硫胺酸、位置2,078(04_ 150569.doc -55- 201113376 處之蘇胺酸、位置2,080^4w)處之缺失、位置2,〇8iyWy)處 之缺失、位置處2,088Mmj之色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或綠胺 酸、位置2,096(^/7^處之絲胺酸、位置2,〇96以〜處之丙胺 酸、位置2,098(^m)處之丙胺酸、位置2,〇98(04mj處之甘胺 酸、位置2,098(^m)處之組胺酸、位置2,〇98(^«^處之脯胺 酸或位置2,098(^m)處之絲胺酸。在一最佳實施例中，本 發明之乙醯辅酶A缓化酶將僅具有以下一個取代：位置 1，7 8164W處之白胺酸、位置處之蘇胺酸、位置 1，781~⑷處之纈胺酸、位置ijSIMmj處之丙胺酸、位置 處之甘胺酸、位置2,〇27(04_處之半胱胺酸或精 胺酸、位置2,〇27Mm」處之精胺酸、位置2,〇41(04mj處之天 冬醯胺、位置2,041(04mj處之纈胺酸、位置2,〇96(^mj處之 丙胺酸及位置2，0 9 6 M m)處之絲胺酸。 在一實施例中’編碼僅具有以下一個取代之乙醯辅酶A 羧化酶多肽的核酸係以轉殖基因方式加以使用：位置 2,075(04wj處之異白胺酸 '位置2 078(^所）處之甘胺酸或位 置2,08 8M~處之精胺酸。在另一實施例中，用包含編碼 僅具有以下一個取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的表 現載體構築體轉型單子葉植物細胞：位置2,〇75(04;^處之 異白胺酸、位置2,078(^岣處之甘胺酸或位置2,088(^m)處 之精胺酸。 在一實施例中，本發明提供包含編碼僅在如上所述一個 胺基酸位置處具有取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的 150569.doc -56- 201113376 稻植物。 在一實施例中，本發明提供包含編碼僅在如上所述一個 胺基酸位置處具有取代之乙醯辅酶續化酶多狀之核酸的 BEP分枝系植物。 在一實施例中，本發明提供包含編竭僅在如上所述一個 胺基酸位置處具有取代之乙醯輔酶績化酶多狀之核酸的 BET次分枝系植物。 在一實施例中，本發明提供包含編碼僅在如上所述一個 胺基S文位置處具有取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的 BET作物植物。 在一實施例中，本發明提供包含編碼僅在如上所述一個 胺基酸位置處具有取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的 單子葉植物。 在一實施例令，本發明提供包含編碼在胺基酸位置 1，781 處具有取代之乙醯輔酶a叛化酶多肽之核酸的單 子葉植物，其中位置1，78 1 處之胺基酸不同於野生型 且不為白胺酸。 在一實施例中’本發明提供包含編碼在胺基酸位置 l，999^4m)處具有取代之乙醯輔酶a羧化酶多肽之核酸的單 子葉植物，其中位置l，999(04m)處之胺基酸不同於野生型 且不為半胱胺酸。 在一實施例中’本發明提供包含編碼在胺基酸位置 2,027(^4«^處具有取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的單 子葉植物，其中位置2,027(04m)處之胺基酸不同於野生型 150569.doc •57- 201113376 且不為半胱胺酸。 在一實施例中’本發明提供包含編碼在胺基酸位置 2,041(04m)處具有取代之乙醯輔酶a羧化酶多肽之核酸的單 子葉植物，其中位置2,〇41(^mj處之胺基酸不同於野生型 且不為纈胺酸或天冬醯胺。 在一實施例中，本發明提供包含編碼在胺基酸位置 2,096(04m)處具有取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的單 子葉植物，其中位置2,〇96(04α^處之胺基酸不同於野生型 且不為丙胺酸。 本發明亦涵蓋胺基酸序列在一個以上胺基酸位置中不同 於存在於相應野生型植物中之乙醯輔酶Α羧化酶之彼者的 乙醯輔酶A羧化酶。舉例而言，本發明之乙醯輔酶a羧化 酶可在2、3、4、5、6或7個位置中不同於存在於相應野生 型植物中的乙醯辅酶A羧化酶。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，781(04»1)處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶a羧化酶 在位置1，7 81 (Οί 處通常將具有白胺酸、蘇胺酸、網胺酸 或丙胺酸。此外，此實施例之酵素亦將包含以下一或多 者：位置l，785Mm)處之甘胺酸；位置i，786MW處之脯胺 酸；位置1，811β^處之天冬醯胺；位置1，824(04~處之脯 胺酸；位置1，864β/^處之苯丙胺酸；位置l，999M_處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027“州處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,039(04wj處之甘胺酸；位置2,〇4lMmj處之天冬 150569.doc -58· 201113376 醯胺；位置2,049(^m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,05 9(04~處之纈胺酸；位置2,074(^m)處之白胺 酸；位置2,075處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078(04mj處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,〇79(04w)處之苯丙胺酸；位置2,080^4…處之麩胺酸；位 置2,080(^mJ處之缺失；位置2,081MmJ處之缺失；位置 2,088Mwj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095Mmj處之麩胺酸；位置2,096(04m)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098Mm」處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置IJSIMW處之白胺酸、蘇胺酸、 纈胺酸或丙胺酸及在位置1，785 (Oimj處之甘胺酸。在一實 施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，781(04m」處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置1，7 8 6 M m)處之捕胺酸。在一實施例中，本發明之乙酉盘 輔酶A羧化酶將具有在位置i，781Mmj處之白胺酸、蘇胺 酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置1，8 11以㈨處之天冬醯胺。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，781〇4m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置l，824(Jm)處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置處之白胺酸、蘇胺 酸、綠胺酸或丙胺酸及在位置1，864(74岣處之苯丙胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 150569.doc •59- 201113376 1，781 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置1,999(01 w)處之半胱胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置ι，781 μ讲）處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置2,〇27(04m)處之半 胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧 化酶將具有在位置1，781 〇4m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺 酸或丙胺酸及在位置2,〇39〇4m)處之甘胺酸。在一實施例 中’本發明之乙醯辅酶A羧化酶將具有在位置i，781M…處 之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置2,041(04wj 處之天冬醯胺。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化 酶將具有在位置1，781 (04m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸 或丙胺酸及在位置2,049(^m)處之苯丙胺酸、白胺酸或異 白胺酸》在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置1，78 1 (dw)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺 酸及在位置2,059〇4m)處之纈胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，781(04m>處之白胺 酸、蘇胺酸、白胺酸或丙胺酸及在位置2,074(04m)處之白 胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有 在位置1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸 及在位置2,075 (04m)處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一绳胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶 將具有在位置l，781(^m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或 丙胺酸及在位置2,078(^mj處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施 例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置1，781 〇4m) 150569.doc -60- 201113376 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置 2,079(jm)處之笨丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A敌化酶將具有在位置i，781(jw)處之白胺酸、蘇胺 酸、顯胺酸或丙胺酸及在位置2,〇8〇(jw)處之麩胺酸或缺 失。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置1，78 1 (dm)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及 在位置2，0 8 1 (d m )處之缺失。在一實施例中，本發明之乙 酿輔酶A羧化酶將具有在位置ι，781 μ處之白胺酸、蘇胺 酸、顯胺酸或丙胺酸及在位置2,〇8864mJ處之精胺酸、色 胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇 胺酸或纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化 酶將具有在位置1，78 1 (04m」處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸 或丙胺酸及在位置2,095(^mj處之麵胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，781(^mj處 之白胺酸、絲胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置2,〇96(^m) 處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙酸輔酶 A叛化酶將具有在位置1,78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈 胺酸或丙胺酸及在位置2,098(Oiw)處之丙胺酸、甘胺酸、 脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置1,78 1 (04w)處之白胺 酸、蘇胺酸、绳胺酸或丙胺酸；在位置2,027處之半 胱胺酸或精胺酸及在位置2,041 (04處之天冬酿胺。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、缬胺酸或丙胺酸；在位 150569.doc -61 - 201113376 置2,027Mm」處之半胱胺酸或精胺酸；在位置2,處 之天冬醯胺及在位置2,096(^m)處之丙胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，7 85β~處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶Α羧化酶。本發明之乙醯輔酶Α羧化酶 在位置1，7 8 5 M 處通常將具有甘胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置l，781(^m)處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，786(^mj處之脯胺 酸；位置1,811(^所）處之天冬醯胺；位置1,824(04/72)處之脯 胺酸；位置l，864(04m」處之苯丙胺酸；位置l，999Mm〉處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027(04…處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,039(04wj處之甘胺酸；位置2,041(04wj處之天冬 醯胺；位置2,04964m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,059Mmj處之纈胺酸；位置2,074{^mJ處之白胺 酸；位置2,07 5(^wj處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078(04m」處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079(^m>處之苯丙胺酸；位置2,080(04_處之麩胺酸；位 置2,080(04m)處之缺失；位置2,081(04m)處之缺失；位置 2,088MW處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(04m)處之麩胺酸；位置2,096(04m)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置l，785Mm)處之甘胺酸及在位置 150569.doc -62- 201113376 1，7 8 1 (04 處之白胺酸、蘇胺酸、網胺酸或丙胺酸。在一 實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，785(04m)處之甘胺酸及在位置1786^…處之脯胺酸。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，785Mmj處之甘胺酸及在位置處之天冬醯胺。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，785「y4w〉處之甘胺酸及在位置i，824「^4m)處之脯胺酸。在 一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1，785(^4«7)處之甘胺酸及在位置1，864(^所）處之苯丙胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，785(^mj處之甘胺酸及在位置1999(^^處之半胱胺酸或 甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置l，785(^m)處之甘胺酸及在位置2,〇27(^_處之半 胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧 化海將具有在位置l，785(01m)處之甘胺酸及在位置 2,03964mj處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置處之甘胺酸及在位置 2,041 處之天冬醯胺。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置i，785(^w)處之甘胺酸及在位置 2,049(^m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置l，785(〇4w; 處之甘胺酸及在位置2,059(04mJ處之纈胺酸。在一實施例 中’本發明之乙醯輔酶八羧化酶將具有在位置1，785以_處 之甘胺酸及在位置2,074Mm〉處之白胺酸。在一實施例 150569.doc •63· 201113376 中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，785 (04 wj處 之甘胺酸及在位置2,075 M 處之白胺酸、異白胺酸、曱 硫胺酸或另一纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶 A缓化酶將具有在位置1,785(^所）處之甘胺酸及在位置 2，0 7 8 (04 處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置ι，785(處之甘胺酸及 在位置2,079(^mj處之苯丙胺酸。在一實施例中’本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置ι,785(^~處之甘胺酸及 在位置2,080(^m」處之麩胺酸或缺失。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，785(04mj處之甘胺 酸及在位置2，0 8 1 (04 處之缺失。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，785(^m)處之甘胺酸及 在位置2,088M⑹處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置l，785(04m)處之甘胺酸及在位置2,〇95MW處之麩胺 酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置1,785(04w」處之甘胺酸及在位置2,096(04»^處之丙胺酸 或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將 具有在位置1,785 (04m)處之甘胺酸及在位置2,〇98Mmj處之 丙胺酸、甘胺酸、捕胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置l,786(^mj處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 150569.doc •64- 201113376 在位置1，7 8 6 M m)處通常將具有脯胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置^“以岣處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1,785MW處之甘胺 酸；位置1,811(04;^處之天冬醯胺；位置L824MW處之胸 胺酸；位置l，864Mm)處之苯丙胺酸；位置i，999(^w處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027以岣處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,O39(04m)處之甘胺酸；位置2,〇41^4_處之天冬 酿胺；位置2,04964w」處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,059(^mJ處之纈胺酸；位置2,〇74(^w」處之白胺 酸；位置2,075(04㈣處之白胺酸 '異白胺酸、甲硫胺酸或 另一绳胺酸；位置2,078Μ~處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2，079 (04 處之苯丙胺酸；位置2, 〇8〇 μ 處之越胺酸或缺 失；位置2,081(^_處之缺失；位置2,〇8864wJ處之精胺 酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺 酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置2,〇95 (^4m)處之麵胺 酸；位置2,096Mm)處之丙胺酸或絲胺酸及位置2,〇98μ_ 處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在 位置處之脯胺酸及在位置ι，781(^岣處之白胺 酸、蘇胺酸、網胺酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置L786M…處之脯胺酸及在 位置l，785(04m)處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙 醯輔酶A羧化酶將具有在位置ι，786(〇4…處之脯胺酸及在位 置1，8 11〈JwJ處之天冬醯胺。在一實施例中，本發明之乙 150569.doc -65- 201113376 醯輔酶A羧化酶將具有在位置1,786處之脯胺酸及在位 置1，8 24^4_處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置l,786(04m)處之脯胺酸及在位置 1,864處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置l，786(04m)處之脯胺酸及在位置 1，999 (04m)處之半胱胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置l，786Mm)處之脯胺酸 及在位置2,027(^w)處之半胱胺酸或精胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置l，786(^m)處 之脯胺酸及在位置2,039處之甘胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置1,786β»^處 之脯胺酸及在位置2,041 處之天冬醯胺。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置l，786(^m」處 之脯胺酸及在位置2,04964m」處之苯丙胺酸、異白胺酸或 白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置1,78處之脯胺酸及在位置2,059β一處之纈 胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有 在位置1,786 處之脯胺酸及在位置2,0740! 處之白胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置l，786(04mj處之脯胺酸及在位置2,075Mmj處之白胺 酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一線胺酸。在一實施例中， 本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置l，786(^m)處之脯 胺酸及在位置2,078…處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施 例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置l,786(04m) 150569.doc -66· 201113376 處之脯胺酸及在位置2,〇79M岣處之苯丙胺酸。在一實施 例中，本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在位置 處之脯胺酸及在位置2,080(^4m」處之麵胺酸或缺失。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，786(^mj處之脯胺酸及在位置2,〇81Mm>)處之缺失。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，786(^mj處之脯胺酸及在位置2,〇88(^~處之精胺酸、色 胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸 '絲 胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置處之脯胺酸及在位置 2，0 9 5 M m)處之麩胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置i，786(04 m)處之脯胺酸及在位置 2,096(04m)處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，786m…處之脯胺酸及 在位置2,098(04m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，8 11 處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶Α羧化酶。本發明之乙醯輔酶Α羧化酶 在位置1，8 11 M 處通常將具有天冬醯胺。此外，此實施 例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1,78處之白 胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1,785(04—處之甘 胺酸；位置l，786^4m」處之脯胺酸；位置l，824(^wj處之脯 胺酸；位置l，864Mw」處之苯丙胺酸；位置l,999(^wj處之 150569.doc *67· 201113376 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027(04m)處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,03964mJ處之甘胺酸；位置2,041(^m)處之天冬 醯胺；位置2,04964mj處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,05964所」處之纈胺酸；位置2,074(^所）處之白胺 酸；位置2,075(^/7^處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078(04mJ處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079MmJ處之苯丙胺酸；位置2,080(04m」處之麩胺酸；位 置2,08〇β—處之缺失；位置2,081^4~處之缺失；位置 2,088Mmj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095 (04m」處之麩胺酸；位置2,096Mw」處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(04m」處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置1,8 11 處之天冬醯胺及在位置 1，78 1 (04m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1，811 (04m)處之天冬醯胺及在位置1,785 處之甘胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l,811Mm)處之天冬醯胺及在位置l，78664m)處之脯胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1,811^4/^處之天冬醯胺及在位置1，824^4_處之脯胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l,811Mmj處之天冬醯胺及在位置1，864(04~處之苯丙胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 150569.doc -68- 201113376 位置1，811 處之天冬醯胺及在位置1999^^)處之半胱 胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化 酶將具有在位置l，811(^w)處之天冬醯胺及在位置 2,027(^所）處之半胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在位置丨，8丨丨μ岣處之天冬醯 胺及在位置2,039(^m)處之甘胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置1>811 μ岣處之天冬醯 胺及在位置2,041Μ~處之天冬醯胺。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在位置丨，8丨丨處之天冬 醯胺及在位置2,049MWy)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置1，811MW處之天冬醯胺及在位置2,〇59(〇4~處之纈胺 酸。在一實施例令，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置l，811Mm」處之天冬醯胺及在位置2,〇74(〇4…處之白胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶八羧化酶將具有在 位置l，811〇4m)良之天冬醯胺及在位置2 〇75(Am)氮之白胺 酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸。在一實施例中， 本發明之乙醯輔酶a羧化酶將具有在位置處之天 冬醯胺及在位置2,078(^~處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實 施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1，811Μ~處之天冬醯胺及在位置2,〇79(^w)處之苯丙胺 酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置1，81164⑷處之天冬醯胺及在位置2,〇8〇(〇4~處之麵胺 酸或缺失。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將 150569.doc •69· 201113376 具有在位置l，811Mw)處之天冬醯胺及在位置2,〇81(^~處 之缺失。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置l，811Mw」處之天冬醯胺及在位置2,〇88~_處之 精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、 白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置丨，8丨丨處之天冬醯 胺及在位置2,095(^m)處之麩胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔麵A叛化酶將具有在位置處之天冬醯 胺及在位置2,096(04m)處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置1，811(^…處 之天冬醯胺及在位置2,098MW處之丙胺酸、甘胺酸、捕 胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置1，824(04w)處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶a羧化酶 在位置l，824Mm」處通常將具有脯胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置…處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1，785Μ…處之甘胺 酸；位置l，786(04m)處之脯胺酸；位置i，811(^w)處之天冬 酿胺；位置l，864(^mj處之苯丙胺酸；位置1999^4«^處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,02764m)處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,039(^mj處之甘胺酸；位置2,041MW處之天冬 醯胺；位置2,049(^??^處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,〇59(^mj處之纈胺酸；位置2,〇74(〇4wj處之白胺 150569.doc -70- 201113376 酸；位置2,075(04m)處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078(^m)處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079(^4⑻處之苯丙胺酸；位置2,0800/^處之麩胺酸；位 置2,080(04w)處之缺失；位置2,081(^4w)處之缺失；位置 2,0 88處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(^mJ處之麩胺酸；位置2,096(04wj處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(^w)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置l,864pl一處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置1,864^4mj處通常將具有苯丙胺酸。此外，此實施 例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1，78 1 64m)處之白 胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1,785處之甘 胺酸；位置處之脯胺酸；位置l，811(^4mj處之天 冬醯胺；位置1，824β_處之脯胺酸；位置l,999Mmj處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027(^m」處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,03 9(^mj處之甘胺酸；位置2,041(^m)處之天冬 醯胺；位置2,049(^_處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,059(^m)處之纈胺酸；位置2,074(04/^處之白胺 酸；位置2,075(^4_處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079(04mj處之苯丙胺酸；位置2,080(^4mJ處之麵胺酸；位 150569.doc 71 201113376 置2,080(04_處之缺失；位置2,081M…處之缺失；位置 2,088(^mj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(04W處之麩胺酸；位置2,096(04m」處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(04m」處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置l，999pi 一處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置l,999Mm)處通常將具有半胱胺酸或甘胺酸。此 外，此實施例之酵素亦將包含以下一或多者：位置 1,78 1 (04m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置 1，785(^_處之甘胺酸；位置1,786(04w)處之脯胺酸；位置 l，811(^m)處之天冬醯胺；位置l,824(^4m」處之脯胺酸；位 置1,864M一處之苯丙胺酸；位置2,027(04一處之半胱胺酸 或精胺酸；位置2,039(^m)處之甘胺酸；位置2,041(04mj處 之天冬醯胺；位置2,049(04m」處之苯丙胺酸、異白胺酸或 白胺酸；位置2,059(04m」處之纈胺酸；位置2,074(04m」處之 白胺酸；位置2,075 處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺 酸或另一纈胺酸；位置2,078處之甘胺酸或蘇胺酸； 位置2,079(^mj處之苯丙胺酸；位置2,080(04m)處之麩胺 酸；位置2,〇8〇0~處之缺失；位置2,081以~處之缺失； 位置2,088(^mj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺 150569.doc •72- 201113376 酸，位置2,〇95(^mJ處之麩胺酸；位置2,〇96(^w)處之丙胺 酸或絲胺酸及位置2,〇98(04»^處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺 酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置L999M…處之半胱胺酸 或甘胺酸及在位置1，78 1 ⑷處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺 酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶 將具有在位置l,999(^m彡處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置 1,785處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置1，999y ~處之半胱胺酸或甘胺酸 及在位置1，786β~處之脯胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯辅酶Α羧化酶在位置1999^4㈨處將具有半胱胺酸或 甘胺酸且在位置1，8 11 β 處具有天冬酸胺。在一實施例 中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶將具有在位置處 之半胱胺酸或甘胺酸及在位置1824^4^處之脯胺酸。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1,999(04 w)處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置處之 苯丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶將 具有在位置l，999(0imj處之半耽胺酸或甘胺酸及在位置 2,027Mmj處之半胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置ι，999(〇ί_處之半胱胺 酸或甘胺酸及在位置2,039^4W〉處之甘胺酸。在—實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置^999“岣處 之半胱胺酸或甘胺酸及在位置2,041 處之天冬醯胺。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 150569.doc •73· 201113376 1，999(04㈣處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置2,〇49Mm」處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，999(04m」處之半胱胺酸或 甘胺酸及在位置2,059Mm」處之半胱胺酸或纈胺酸。在一 實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 1，999以岣處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置2,〇74以⑷處之 白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置l，999(^m)處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置 2,075(04m)處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一绳胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置l，99964m」處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置2,〇78( 處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶 A羧化酶將具有在位置1,999(04 W處之半胱胺酸或甘胺酸及 在位置2,079(^m)處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置i，999MmJ處之半胱胺酸 或甘胺酸及在位置2,080(^mJ處之麩胺酸或缺失。在一實 施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，99964m)處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置2,〇81(^w)處之 缺失。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有 在位置l，999(04w」處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置 2,088(04»^處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 l，999Mmj處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置2,〇95Mw」處之 150569.doc -74- 201113376 麵胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置1，999β~處之半胱胺酸或甘胺酸及在位置 2,096(^mj處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置處之半胱胺酸 或甘胺酸及在位置2,098Mmj處之丙胺酸、甘胺酸 '脯胺 酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶在胺基酸位 置2,027 處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔轉A叛化酶。本發明之乙醯輔酶a缓化酶 在位置2,027Mmj處通常將具有半胱胺酸或精胺酸。此 外，此實施例之酵素亦將包含以下一或多者：位置 1，78 1 (04 w)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置 l，785(^m)處之甘胺酸；位置i，786m~處之脯胺酸；位置 l，811(^mj處之天冬醯胺；位置處之脯胺酸；位 置1，864β~處之苯丙胺酸；位置i，999(^w)處之半胱胺酸 或甘胺酸；位置2,039(^m)處之甘胺酸；位置2,041 (04m)處 之天冬醯胺；位置2,049(^m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或 白胺酸；位置2,059(04m)處之纈胺酸；位置 白胺酸；位置2,07564Wy)處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺 酸或另一纈胺酸；位置2,078處之甘胺酸或蘇胺酸； 位置2,079(04/^處之苯丙胺酸；位置2,080(^mj處之麩胺 酸；位置2,08〇Mm)處之缺失；位置2,081Mm)處之缺失； 位置2,088 (04⑹處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺 150569.doc -75- 201113376 酸；位置2,095Μ»^處之麩胺酸；位置2,096(^mJ處之丙胺 酸或絲胺酸及位置2,098 處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺 酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,027(04m)處之半胱胺酸 或精胺酸及在位置1，781 (04m)處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺 酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶 將具有在位置2,027(^mJ處之半胱胺酸或精胺酸及在位置 l，785(04m>處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,〇27(04mj處之半胱胺酸或精胺酸 及在位置l，786(^4mj處之脯胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶在位置2,027Mm)處將具有半胱胺酸或 精胺酸且在位置1,8 11 (04m)處具有天冬醯胺《在一實施例 中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在位置2,027^4m)處將具有 半胱胺酸或精胺酸且在位置1，824(^所）處具有脯胺酸。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在位置2,027Mwj 處將具有半胱胺酸或精胺酸且在位置l，864^4m)處具有苯 丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2,027(04 wj處之半胱胺酸或精胺酸及在位置 1，999(^mj處之半胱胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶在位置2,027(0im)處將具有半胱胺酸 或精胺酸且在位置2,039Mwj處具有甘胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇27(^mj處 之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,041 (04m」處之天冬醯胺。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 150569.doc •76· 201113376 2,027(^m)處之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,〇49Mmj處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A叛化酶在位置2,027(^mj處將具有半胱胺酸或精 胺酸且在位置2,059MW處具有纈胺酸。在一實施例中， 本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇27(04W處之半 胱胺酸或精胺酸及在位置2,074Mmj處之白胺酸。在一實 施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,027Mm〉處之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,075(^w」處之 白月女S文、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纟領胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇27(04mj處 之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,078(04m)處之甘胺酸或蘇 胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有 在位置2,027以_處之半胱胺酸或精胺酸及在位置 2，079(04m)處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇27以_處之半胱胺酸或精胺 酸及在位置2,08〇Mm」處之麩胺酸或缺失。在一實施例 中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇27MmJ處 之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,081(0imj處之缺失。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,02764m)處之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,〇88(〇4所」處之 精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、 白月女酸、絲胺酸、蘇胺酸或顯胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇27(^m」處之半胱胺 酸或精胺酸及在位置2,095(^m)處之麩胺酸。在一實施例 150569.doc -77- 201113376 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,027(^/^處 之半胱胺酸或精胺酸及在位置2,096Μ；^處之丙胺酸或絲 胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有 在位置2,027Μ~處之半胱胺酸或精胺酸及在位置 2,098(04m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱 胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,03 9 64m)處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,039(^m」處通常將具有甘胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置1,78 1 處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1，785 處之甘胺 酸；位置1，786(04所」處之脯胺酸；位置1,811(^所）處之天冬 醯胺；位置l,824(04m)處之脯胺酸；位置l,864^4m)處之苯 丙胺酸；位置1,999處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027(^~處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,041(^~處之天 冬醯胺；位置2,049(04m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,059(04m)處之纈胺酸；位置2,074Mmj處之白胺 酸；位置2,0 7 5 (04 m)處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078(04m)處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079(^~處之苯丙胺酸；位置2,080(^_處之麵胺酸；位 置2,080(0imj處之缺失；位置2,081(^4所）處之缺失；位置 2,088(04w)處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 150569.doc -78· 201113376 2’095(^mJ處之麩胺酸；位置2,〇96(^m)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(04m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,041 處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,041 (04m)處通常將具有天冬醯胺。此外，此實施 例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1，78 1 處之白 胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，785(0imj處之甘 胺酸；位置處之脯胺酸；位置l，811Mmj處之天 冬醯胺；位置1，824Μ/^處之脯胺酸；位置l，864(04m)處之 苯丙胺酸；位置1，999(^mJ處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,〇27(^所）處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,〇39MW處之甘 胺酸；位置2,〇4lMmj處之天冬醯胺；位置2,049Mm)處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,059(01m)處之纈胺 酸；位置2,074Mm)處之白胺酸；位置2,07564m)處之白胺 酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸；位置2,078(04⑷ 處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,〇79(^w)處之苯丙胺酸；位 置2,08〇Mmj處之麩胺酸；位置2,080(^mJ處之缺失；位置 2,081Mm)處之缺失；位置2,088(^m)處之精胺酸、色胺 酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺 酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置2,095(04mJ處之麩胺酸；位置 2,096(^4mJ處之丙胺酸或絲胺酸及位置2,〇98(04m」處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。在— 150569.doc -79· 201113376 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,041以；?^處之天冬醯胺及在位置1,78164讲）處之白胺酸、 蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置2,041 處之天冬醯胺及在位 置l，785(04m)處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置2,041 處之天冬醯胺及在位 置1，786處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶在位置2,04 IMmj處將具有天冬醯胺且在位置 1，811 (04 w)處具有天冬醢胺。在一實施例中，本發明之乙 醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,041 Mw)處之天冬醯胺及在 位置l，824(04mj處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之乙 醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇41〇4m)處之天冬醯胺及在 位置l，864〇4m)處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇41(04my)處之天冬醯胺及 在位置1，999β»ί」處之半胱胺酸或甘胺酸。在一實施例 中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇41(^^^處 之天冬醢胺及在位置2,027 處之半胱胺酸或精胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,041(jw)處之天冬醯胺及在位置2,〇39(心）處之甘胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,041M~處之天冬醯胺及在位置2,〇41(^w」處之天冬醯 胺。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,041(^m)處之天冬醯胺及在位置2,〇49以…處之苯丙 胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 150569.doc -80- 201113376 輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇41y岣處之天冬醢胺及在位 置2,059以_處之纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇41 μ…處之天冬醯胺及在位 置2,074Μ；^處之白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶Α羧化酶將具有在位置2,〇41 Μ岣處之天冬醯胺及在位 置2,075(04；^處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈 胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯辅酶Α羧化酶將具有 在位置2,041(04m)處之天冬醯胺及在位置2,〇78(^_處之甘 月女酸或蘇胺酸。在一實施例中，本發明之乙醢輔酶A叛化 酶將具有在位置2,041(04»^處之天冬醯胺及在位置 2,07964mj處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A羧化酶將具有在位置2,041(jw)處之天冬醯胺及在位 置2,080(Jm)處之麵胺酸或缺失。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,041(Jm)處之天冬醯胺 及在位置2,081(4/«)處之缺失。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,041MW處之異白胺酸及 在位置2,088Mmj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或網胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A叛化酶將具有在 位置2,〇410岣處之異白胺酸及在位置2,095β㈣處之麵胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在位置 2,041以所>)處之異白胺酸及在位置2,096(^_處之丙胺酸或 絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙酸輔酶A緩化酶將具 有在位置2,041Μ~處之異白胺酸及在位置2,098(^mJ處之 150569.doc -81 · 201113376 丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,049Mm」處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,049(04m>處通常將具有苯丙胺酸、異白胺酸或白 胺酸。此外，此實施例之酵素亦將包含以下一或多者：位 置1，7 8 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位 置l,785(04m」處之甘胺酸；位置l，786(04m)處之脯胺酸；位 置1，811M…處之天冬醯胺；位置l,824Mmj處之脯胺酸； 位置1，864M—處之苯丙胺酸；位置l，999(04m)處之半胱胺 酸或甘胺酸；位置2,027(^mJ處之半胱胺酸或精胺酸；位 置2,039(04m)處之甘胺酸；位置2,041(04m)處之天冬醯胺； 位置2,059(04w>處之纈胺酸；位置2,074(^m)處之白胺酸； 位置2,075處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈 胺酸；位置2,078(04~處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079(04m」處之苯丙胺酸；位置2,080(^m)處之麩胺酸；位 置2,080(^mj處之缺失；位置2,081Mmj處之缺失；位置 2,088(04m」處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(04…處之麩胺酸；位置2,096(04m)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,049β_處之苯丙胺酸、異白胺 酸或白胺酸及在位置1,78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈 150569.doc -82- 201113376 胺酸或丙胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化 酶將具有在位置2,049(^~處之苯丙胺酸、異白胺酸或白 胺酸及在位置l，785(^wj處之甘胺酸。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,049 處之苯丙 胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置1，786(04mj處之捕胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在位置 2,049<^岣處將具有苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸且在位 置1，811 (01 m)處具有天冬酿胺。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,049(04w)處之苯丙胺酸、 異白胺酸或白胺酸及在位置1，824(04mJ處之脯胺酸。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2，0 4 9 M 處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置 1，864β…處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶Α羧化酶將具有在位置2,〇49(^mJ處之苯丙胺酸 '異白 胺酸或白胺酸及在位置1,999Mw)處之半胱胺酸或甘胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,049(04 w)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位 置2，0 2 7 (04 處之半胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本 發明之乙酿輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇49yw處之苯丙 月女酉文 異白胺酉义或白胺酸及在位置2, 〇 3 9 M m)處之甘胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,049(^所^)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位 置2,041 處之天冬酿胺。在一實施例中，本發明之乙醯 輔_ A缓化S#將具有在位置2,〇49(^mj處之苯丙胺酸、異白 150569.doc -83- 201113376 胺酸或白胺酸及在位置2,059Mmj處之纈胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯輔酶A叛化酶將具有在位置2,〇49(〇4 處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置2,〇74 μ _處 之白胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將 具有在位置2,049(04mj處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸 及在位置2,075(^處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶 將具有在位置2,049(^4m」處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸及在位置2,078Mm」處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇49(^所）處 之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置處之 苯丙胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將 具有在位置2,049(04m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸 及在位置2,080(04m)處之麩胺酸或缺失。在一實施例中， 本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇49以_處之苯 丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置2,〇81(^~處之缺 失。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位 置2，0 8 8 (04 處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、 組胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纟領胺酸。在一實施例 中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇49(^~處 之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置2,〇9 5(04 處之 麵胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2,049(04m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及 150569.doc •84· 201113376 在位置2,096Mm)處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例中， 本發明之乙醯辅酶A羧化酶將具有在位置2,〇49m岣處之苯 丙胺酸、異白胺酸或白胺酸及在位置2,098M處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶Α羧化酶在胺基酸位 置2,05 9(^州處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A緩化酶。本發明之乙酿輔酶a緩化酶 在位置2，0 5 9 (Oi wj處通常將具有绳胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置15781(^_處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1785(04/^)處之甘胺 酸；位置l，786(^4mj處之脯胺酸；位置i，811(^mj處之天冬 醯胺；位置l，824(Mm)處之脯胺酸；位置i，864(04m)處之苯 丙胺酸；位置l，999(^w」處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027Mm〉處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,039(^w」處之甘 胺酸；位置2,041(^m」處之天冬醯胺；位置2,049(0imj處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,074(04m)處之白胺 酸；位置2,075(^所^)處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078Mm)處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079(^4~處之苯丙胺酸；位置2,〇8〇(〇4mj處之麩胺酸；位 置2,08〇Mmj處之缺失；位置2,〇8l(04m)處之缺失；位置 2,08864mJ處之精胺酸或色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(^所」處之麩胺酸；位置2,096(04/7^處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098Mm)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 150569.doc •85· 201113376 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,074(04mj處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙酿辅酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶a羧化酶 在位置2,074(04;^處通常將具有白胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置1,781(^_處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置丨，785 M 處之甘胺 酸；位置1,786(04⑷處之脯胺酸；位置處之天冬 酿胺；位置1,824(04/^處之脯胺酸；位置1864^4；^處之苯 丙胺酸；位置1，999(^«^處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027Mm〉處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,〇39(^_處之甘 胺酸；位置2,041(04…處之天冬醯胺；位置2,〇49(04mM之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,〇59Μ~處之纈胺 酸；位置2,075(04mj處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 另一顯胺酸；位置2,078(04~處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079Mmj處之苯丙胺酸；位置2,〇8〇(^_處之麩胺酸；位 置2,08〇Mmj處之缺失；位置2,〇81(Οί…處之缺失；位置 2,088(^mj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095以州處之麩胺酸；位置2,096(04m)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,09864m」處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,〇74m…處之白胺酸及在位置 1，781 ㈣處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸。在一 150569.doc •86- 201113376 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2.074 (04 w)處之白胺酸及在位置1,785 (04 wj處之甘胺酸。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2.074 (04m)處之白胺酸及在位置1,78 6 (04 m)處之脯胺酸。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在位置2,074μ~ 處將具有白胺酸且在位置1,8 11 處具有天冬醯胺。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,074Mm)處之白胺酸及在位置l,824(04m」處之脯胺酸。在 一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,074fyimj處之白胺酸及在位置l,864(v4mj處之苯丙胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,074Mm)處之白胺酸及在位置l，99964mj處之半胱胺酸或 甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2,074(0iw)處之白胺酸及在位置2,027〈v4m)處之半 胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧 化酶將具有在位置2,074(04mj處之白胺酸及在位置 2,03 9(^m)處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,074 處之白胺酸及在位置 2,041 處之天冬醯胺。在一實施例中，本發明之乙醯 輔酶A叛化酶將具有在位置2,0 7 4 M m)處之白胺酸及在位置 2,049(^w)處之苯丙胺酸、白胺酸或異白胺酸。在一實施 例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,074(^m) 處之白胺酸及在位置2,059(^m)處之纈胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,074(^4_處 150569.doc •87- 201113376 之白胺酸及在位置2,075(04mj處之白胺酸、異白胺酸、曱 -硫胺酸或另一纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯辅酶 A叛化扭將具有在位置2,〇74(OimJ處之白胺酸及在位置 2,078(^;^處之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇74(^mj處之白胺酸及 在位置2,079(04mj處之苯丙胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇74(04mj處之白胺酸及 在位置2,080(^mj處之麵胺酸或缺失。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,074 Mw)處之白胺 酸及在位置2,081 處之缺失。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇74(^mj處之白胺酸及 在位置2,088Mmj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。在一實 施例中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶將具有在位置 2,074Mm>處之白胺酸及在位置2,095(04m)處之麩胺酸。在 一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,074(^m)處之白胺酸及在位置2,096(04wJ處之丙胺酸或絲 胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有 在位置2,074(04wj處之白胺酸及在位置處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,075 處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶a羧化酶 在位置2,075 (04 m」處通常將具有白胺酸、異白胺酸、甲硫 150569.doc • 88 - 201113376 胺酸或另一練胺酸。此外，此實施例之酵素亦將包含以下 一或多者：位置l，781(C4mJ處之白胺酸、蘇胺酸或丙胺 酸，位置1,785 處之甘胺酸；位置1, "786 Mw)處之脯胺 酸；位置1,811(^所）處之天冬醯胺；位置1，824(^_處之脯 胺酸；位置l,864(04m)處之苯丙胺酸；位置l,999Mm)處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,02764mj處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,〇39(^mj處之甘胺酸；位置2,〇41(〇^)處之天冬 酿胺；位置2,049(04所」處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,059(04w)處之纈胺酸；位置2,0740m)處之白胺 酸；位置2,07864岣處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079(^m) 處之苯丙胺酸；位置2,〇80(〇4w」處之麵胺酸；位置 2,08〇MmJ處之缺失；位置2,〇81(^~處之缺失；位置 2,08864mJ處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(^m)處之麩胺酸；位置2,〇96Mm)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(04;^處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,〇75Mmj處之白胺酸、異白胺 酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸及在位置1,78 1 處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,075 Mm)處之白胺酸、異 白胺酸、甲硫胺酸或另一纈胺酸及在位置1，785 M 處之 甘胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2,075(04mJ處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 150569.doc -89- 201113376 另一绳胺酸及在位置處之脯胺酸。在一實施例 中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶在位置2,075(0ί/^處將具有 白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸且在位置 1，8 11 (04 m)處具有天冬醯胺。在一實施例中，本發明之乙 醢輔i# A叛化酶將具有在位置2,〇75^4m)處之白胺酸、異白 胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸及在位置l,999^4m)處之半 胱胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧 化酶將具有在位置2,075(04»^處之白胺酸、異白胺酸、曱 硫胺酸或另一纈胺酸及在位置2,〇27(〇iw)處之半胱胺酸或 精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2，07 5 ⑷處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一绳胺酸及在位置2,041以；^處之異白胺酸。在一實施 例中，本發明之乙醯辅酶Α羧化酶將具有在位置2,07564㈨ 處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈胺酸及在位置 2,049(04π)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在位置2,〇75(^~ 處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸及在位置 2,074Mwj處之白胺酸。在一實施例中，本發明之乙酷輔 酶A羧化酶將具有在位置2,〇75Mmj處之白胺酸、異白胺 酸、甲硫胺酸或另一纈胺酸及在位置2,〇78(^/«>處之甘胺 酸或蘇胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶 將具有在位置2,075Mmj處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺 酸或另一绳胺酸及在位置2,088〔^4/«〉處之精胺酸或色胺 酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺 150569.doc -90- 201113376 酸、蘇胺酸或纈胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶 A羧化酶將具有在位置2,〇75(^岣處之白胺酸、異白胺酸、 曱硫胺酸或另一網胺酸及在位置2,096(04 wj處之丙胺酸或 絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2,075 處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或 另一纈胺酸及在位置2,098(^4;^處之丙胺酸、甘胺酸、脯 胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A叛化酶在胺基酸位 置2,078(04；7〇處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶a羧化酶 在位置2,078(^m」處通常將具有甘胺酸或蘇胺酸。此外， 此實施例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1,781(04 — 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1，785Μ_ 處之甘胺酸；位置l，786(^mj處之脯胺酸；位置ι，811Μ~ 處之天冬醯胺；位置l,824Mm)處之脯胺酸；位置 l，864(^4m)處之苯丙胺酸；位置l，999(04mj處之半胱胺酸或 甘胺酸；位置2,027(04 處之半胱胺酸或精胺酸；位置 2,03964mj處之甘胺酸；位置2,〇41Μ_處之天冬醯胺；位 置2,049(^4w」處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置 2,059(04m)處之綠胺酸；位置2,074(04m)處之白胺酸；位置 2,075Μ_處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺 酸；位置2,07964m」處之苯丙胺酸；位置2,080(04/^處之楚 胺酸；位置2,〇8〇64w)處之缺失；位置2,081(^_處之缺 失；位置2,08 8Mmj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘 150569.doc -91 - 201113376 胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺 酸；位置2,095β«^處之麩胺酸；位置2,096Mm」處之丙胺 酸或絲胺酸及位置2,098(^/^處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺 酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸《在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,078 處之甘胺酸或 蘇胺酸及在位置1,78 1 處之白胺酸、蘇胺酸或丙胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,〇78^4mj處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置i，785Mm)處 之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將 具有在位置2,078MW處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置 1,786M處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,078(04m)處之甘胺酸或蘇胺酸及 在位置1，8 11 M 處之天冬醯胺。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,078MW處之甘胺酸或 蘇胺酸及在位置1，999(04m)處之半胱胺酸或甘胺酸。在一 實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,〇78(^/^處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置2,〇27(0im>處之半 胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A緩 化酶將具有在位置2,078(^4m」處之甘胺酸或蘇胺酸及在位 置2,〇41 處之異白胺酸。在一實施例中，本發明之乙 醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,078處之甘胺酸或蘇胺 酸及在位置2,049MwJ處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,07864mJ處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置2,〇74(04mj處 150569.doc -92· 201113376 之白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將 具有在位置2,078(^w)處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置 2,07 5(04mj處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,078Mm)處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置2,〇88(04m)處 之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺 酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。在一實施例中， 本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,078(^m)處之甘 胺酸或蘇胺酸及在位置2,096(04mj處之丙胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,078(^岣處之甘胺酸或蘇胺酸及在位置2,098(^/^處之丙 胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,079Mmj處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,079(04mJ處通常將具有苯丙胺酸。此外，此實施 例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1,7 8 1 M 處之白 胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1,785 64m」處之甘 胺酸；位置1，786(0ί/^處之脯胺酸；位置處之天 冬醯胺；位置l,824(04m)處之脯胺酸；位置l，864(04w)處之 苯丙胺酸；位置l，999Mm」處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027(^mj處之半胱胺酸或精胺酸·’位置處之甘 胺酸；位置2,041Mmj處之天冬醯胺；位置2,04964⑷處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,〇59(04m)處之纈胺 150569.doc • 93· 201113376 酸；位置2,074(^mj處之白胺酸；位置2,075(04mJ處之白胺 酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸；位置2,078Mm」 處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,08〇μ~處之麩胺酸；位置 2,080(04m)處之缺失：位置2,081(^_處之缺失；位置 2,08 8Mm)處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095(04mj處之麩胺酸；位置2,096Mmj處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(^m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,08〇Mmj處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,080(^mj處通常將具有麩胺酸或缺失。此外，此 實施例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1，78 1 處 之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1,785 處 之甘胺酸；位置l,786(04m)處之脯胺酸；位置l,811^4m)處 之天冬醯胺；位置l，824^4m/處之脯胺酸；位置l，864(04w) 處之苯丙胺酸；位置1,999^4mj處之半胱胺酸或甘胺酸； 位置2,02764mj處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,039M岣處 之甘胺酸；位置2,041Mmj處之天冬醯胺；位置2,049Μ~ 處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,059(04mj處之 纈胺酸；位置2,074(^m>處之白胺酸；位置2,075(04mj處之 白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸；位置 2,078^4mj處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079(^4m)處之苯丙 150569.doc • 94· 201113376 胺酸；位置2,081(04w)處之缺失；位置2,088yw)處之精胺 酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺 酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置2,〇95Mw>)處之麵胺 酸；位置2,096(^m)處之丙胺酸或絲胺酸及位置2,〇98(^~ 處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺 酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,081Μ~處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯辅酶Α羧化酶。本發明之乙醯輔酶a幾化酶 在位置2，0 8 1 (Oi 處通常將具有缺失。此外，此實施例之 酵素亦將包含以下一或多者：位置1，781(04»^處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，785Mw)處之甘胺 酸；位置l，786(^mj處之脯胺酸；位置l，811(^w)處之天冬 醯胺；位置l，824(^wj處之脯胺酸；位置l,864(^m>處之苯 丙胺酸；位置1，999(04m)處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027Mm)處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,〇39(^_處之甘 胺酸；位置2,041f^m〉處之天冬醯胺；位置2,〇49M—處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,05 處之纈胺 酸；位置2,〇74Mmj處之白胺酸；位置2,〇75Mmj處之白胺 酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈胺酸；位置2,078(04；^ 處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079(04α^處之苯丙胺酸；位 置2,08〇Mmj處之麩胺酸；位置2,080(04/7^處之缺失；位置 2,088^4mj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 150569.doc •95- 201113376 2,095(^4m)處之麩胺酸；位置2,096Mmj處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,09864m」處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,088(04 w)處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,08864m)處通常將具有精胺酸、色胺酸、苯丙胺 酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸 或纈胺酸。此外，此實施例之酵素亦將包含以下一或多 者：位置1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺 酸；位置l，785^4m)處之甘胺酸；位置l，786^4mj處之脯胺 酸；位置l,811(04m)處之天冬醯胺；位置l,824(04m」處之脯 胺酸；位置1,864(04«^處之苯丙胺酸；位置l,999(04mj處之 半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027(^m)處之半胱胺酸或精胺 酸；位置2,039(04mj處之甘胺酸；位置2,041(04m)處之天冬 醯胺；位置2,049(^m)處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸；位置2,059(^mJ處之纈胺酸；位置2,074MmJ處之白胺 酸；位置2,075 (04m」處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或 另一纈胺酸；位置2,078(^~處之甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079MmJ處之苯丙胺酸；位置2,08〇Mwj處之麩胺酸；位 置2,080(04m)處之缺失；位置2,081(^4m)處之缺失；位置 2,095(04所）處之麩胺酸；位置2,096(^所）處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098(04m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 150569.doc -96· 201113376 酶A叛化酶將具有在位置2,088(處之精胺酸、色胺酸、 苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、 蘇胺酸或缬胺酸及在位置1，78丨Μ…處之白胺酸、蘇胺 酸、顯胺酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶 Α叛化酶將具有在位置2,〇88(^岣處之精胺酸、色胺酸、苯 丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇 胺酸或纈胺酸及在位置1,785 (04m)處之甘胺酸。在一實施 例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,088 M W 處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺 酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸及在位置 l，786Mmj處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,〇88(^所）處之精胺酸、色胺酸、 苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、 蘇胺酸或纈胺酸及在位置1，81 IMm)處之天冬醯胺。在一 實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置 2,088(04mj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸及在位 置1,99964m)處之半胱胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,088(04…處之精胺 酸或色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺 酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸及在位置2,027(04w」處之半 胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧 化酶將具有在位置2,088^4…處之精胺酸、色胺酸、苯丙 胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺 150569.doc •97- 201113376 酸或網胺酸及在位置2,041 處之異白胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇88(〇4~ 處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺 酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸及在位置 2,〇49Mmj處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯辅酶A羧化酶將具有在位置2,〇88(〇4所) 處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺 酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸及在位置 2,074處之白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 酶A羧化酶將具有在位置2,〇88以岣處之精胺酸、色胺酸、 苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、 蘇胺酸或纈胺酸及在位置處之白胺酸、異白胺 酸、甲硫胺酸或另一顯胺酸。在一實施例中，本發明之乙 酿輔酶A羧化酶將具有在位置2,088m…處之精胺酸、色胺 酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺 酸、蘇胺酸或纈胺酸及在位置2,078(^w)處之甘胺酸或蘇 胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有 在位置2，0 8 8 (04 wj處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸 及在位置2,096Mwj處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇88(^w處 之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺 酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或網胺酸及在位置 2,098(^/7^處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱 150569.doc -98- 201113376 胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,095^4m)處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,095 處通常將具有麩胺酸。此外，此實施例 之酵素亦將包含以下一或多者：位置1，781M叫處之白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，785Mmj處之甘胺 酸；位置l，786(^m)處之脯胺酸；位置l，811(04mj處之天冬 醯胺；位置l，824Mm」處之脯胺酸；位置l，864MWy)處之苯 丙胺酸；位置1,999(04 處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027(04；^處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,039Mw〉處之甘 胺酸；位置2,041(^所）處之天冬醯胺；位置2,049(04mj處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,059Μ/^處之纈胺 酸；位置2,074(^mJ處之白胺酸；位置2,〇75Mmj處之白胺 酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈胺酸；位置2,〇78(^W 處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079(^m)處之苯丙胺酸；位 置2,080(^»^處之麩胺酸；位置2,〇8〇MW處之缺失；位置 2,081(04岣處之缺失；位置2,〇88(04/7〇處之精胺酸或色胺 酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺 酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置2,〇96(04m)處之丙胺酸或絲胺 酸及位置2,098 (04m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶在胺基酸位 置2,096Μ…處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 150569.doc -99· 201113376 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,096(04mj處通常將具有丙胺酸或絲胺酸。此外， 此實施例之酵素亦將包含以下一或多者：位置1,781 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，785Mm) 處之甘胺酸；位置1,786 處之脯胺酸；位置l，811(^4m) 處之天冬醯胺；位置l，824Mm)處之脯胺酸；位置 l，864(04m)處之苯丙胺酸；位置l,999Mm)處之半胱胺酸或 甘胺酸；位置2,027(04mj處之半胱胺酸或精胺酸；位置 2,039(^m)處之甘胺酸；位置2,041(04m)處之天冬醯胺；位 置2,049(^mj處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置 2,059(04mj處之纈胺酸；位置2,074(^4~處之白胺酸；位置 2,075 處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈胺 酸；位置2,07864m」處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079MW 處之苯丙胺酸；位置2,080^4w〉處之麩胺酸；位置 2,080(^4m)處之缺失；位置2,08 1 (04m)處之缺失；位置 2,08 8處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組 胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,09564mj處之麩胺酸及位置2,098(04mj處之丙胺酸、甘胺 酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。在一實施例 中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,096(04_處 之丙胺酸或絲胺酸及在位置1,78 1 處之白胺酸、蘇胺 酸或丙胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶 將具有在位置2,096(04~處之丙胺酸或絲胺酸及在位置 1,785(04m)處之甘胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔 150569.doc -100· 201113376 酶A叛化酶將具有在位置2,096μ㈣處之丙胺酸或絲胺酸及 在位置1，786(04wj處之脯胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A缓化酶將具有在位置2,〇96(^»^處之丙胺酸或絲 胺酸及在位置1，8 11 M wj處之天冬醯胺。在一實施例中， 本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,096 處之丙 胺酸或絲胺酸及在位置1，999(04吻處之半胱胺酸或甘胺 酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,096Mmj處之丙胺酸或絲胺酸及在位置2,〇27(04m)處 之半胱胺酸或精胺酸。在一實施例中，本發明之乙醢輔酶 A缓化酶將具有在位置2,096(^4m)處之丙胺酸或絲胺酸及在 位置2,041 處之異白胺酸。在一實施例中，本發明之 乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,096(0ί〜處之丙胺酸或絲 胺酸及在位置2,049Μ；^處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶Α羧化酶將具有在 位置2,096Mmj處之丙胺酸或絲胺酸及在位置2,074以《^處 之白胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A叛化酶將 具有在位置2,096(^4mJ處之丙胺酸或絲胺酸及在位置 2,075(^_處之白胺酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺 酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在 位置2,09664m)處之丙胺酸或絲胺酸及在位置2,078(^/^處 之甘胺酸或蘇胺酸。在一實施例中’本發明之乙醯輔酶A 羧化酶將具有在位置2,096(^w)處之丙胺酸或絲胺酸及在 位置2,088(04m)處之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纟镇胺 150569.doc -101 - 201113376 酸。在一實施例中，本發明之乙醢輔酶A叛化酶將具有在 位置2,096(04/^處之丙胺酸或絲胺酸及在位置2,098(^~處 之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺 酸。 在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A叛化酶在胺基酸位 置2,098 (04…處及在一或多個其他胺基酸位置處不同於相 應野生型乙醯輔酶A羧化酶。本發明之乙醯輔酶A羧化酶 在位置2,098(04mj處通常將具有丙胺酸、甘胺酸、脯胺 酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸。此外，此實施例之酵素 亦將包含以下一或多者：位置l，781(04m」處之白胺酸、蘇 胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置1，78564mj處之甘胺酸；位 置l，786(04mj處之脯胺酸；位置l，811Mm」處之天冬醯胺； 位置l，824(^mj處之脯胺酸；位置1,864(^W處之苯丙胺 酸；位置l,999(04m」處之半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027f^m)處之半胱胺酸或精胺酸；位置2,039(04m」處之甘 胺酸；位置2,041(^mj處之天冬醯胺；位置2,049Mm」處之 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,059處之纈胺 酸；位置2,074(^mj處之白胺酸；位置2,075(^4m)處之白胺 酸、異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸；位置2,078(^mj 處之甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079(04?^處之苯丙胺酸；位 置2,080(^4m)處之麩胺酸；位置2,08〇Mw)處之缺失；位置 2,081(^_處之缺失；位置2,088(04m)處之精胺酸、色胺 酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺 酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置2,095 處之麩胺酸及位置 150569.doc •102- 201113376 2,096(04mj處之丙胺酸或絲胺酸。在一實施例中，本發明 之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,098 處之丙胺酸、 甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位置 1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸。在一 實施例中，本發明之乙醯辅酶A羧化酶將具有在位置 2,098(^m)處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱 胺酸或絲胺酸及在位置1,785Mwj處之甘胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,098(04m) 處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺 酸及在位置1,786(04m)處之脯胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,098(04m)處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位 置1，8 11 (04 m)處之天冬醯胺。在一實施例中，本發明之乙 醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇98(04mj處之丙胺酸、甘胺 酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位置 l，999(04mj處之半胱胺酸或甘胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇98MW處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位 置2,027(04m)處之半胱胺酸或精胺酸。在一實施例中’本 發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇98(^m)處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位 置2,〇41 處之異白胺酸。在一實施例中，本發明之乙 酿輔酶A羧化酶將具有在位置2,〇98(^mj處之丙胺酸、甘胺 酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位置 150569.doc » 103- 201113376 2,〇49MW處之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸。在一實施 例中’本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,098M… 處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺 酸及在位置2,074^4m」處之白胺酸。在一實施例中，本發 明之乙醯輔酶A羧化酶將具有在位置2,098(^_處之丙胺 酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位 置2,075MmJ處之白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸或另一纈 胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具有 在位置2,098Mm」處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位置2,078Mmj處之甘胺酸或 蘇胺酸。在一實施例中，本發明之乙醯輔酶A羧化酶將具 有在位置2,098(04…處之丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位置2,088(^m)處之精胺酸或 色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、 絲胺酸、蘇胺酸或绳胺酸。在一實施例中，本發明之乙酿 輔酶A羧化酶將具有在位置2,098(04 w)處之丙胺酸、甘胺 酸、脯胺酸、組胺酸、半胱胺酸或絲胺酸及在位置 2,096(^m)處之丙胺酸或絲胺酸。 在一實施例中’本發明包括具有在位置2,075(04m)處之 異白胺酸及在位置l，999(^wj處之甘胺酸的乙醯輔酶A羧化 酶；具有在位置2,075處之曱硫胺酸及在位置 2,080(^/^處之麩胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置 2,075(04/^處之甲硫胺酸及在位置2,095(04所）處之麵胺酸的 乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,078Mm」處之甘胺酸及在 150569.doc 201113376 位置2,04IMm」處之纈胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,078(^_處之甘胺酸及在位置2,039(^~處之甘胺酸的 乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,078(04~處之甘胺酸及在 位置2,049Mmj處之丙胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,078(^_處之甘胺酸及在位置2,049^4~處之半胱胺酸 的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,078處之甘胺酸及 在位置2,049(^m)處之絲胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在 位置2,078Mm)處之甘胺酸及在位置2,049(04m)處之蘇胺酸 的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,078(^m)處之甘胺酸及 在位置2,059piw)處之纈胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在 位置2,078處之甘胺酸及在位置2,079^4m)處之苯丙胺 酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,078(^m)處之甘胺酸 及在位置2,079(^4 w)處之脯胺酸的乙醯辅酶A羧化酶；及具 有在位置2,078 (OimJ處之甘胺酸及在位置2,088 (yimj處之甘 胺酸的乙醯輔酶A羧化酶。 在一較佳實施例中，本發明包括具有在位置1，78 1 處之白胺酸及在位置l,824Mm)處之脯胺酸的乙醯輔酶A羧 化酶；具有在位置1,781 處之白胺酸及在位置 2,027(^m)處之精胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；及具有在位置 2,078處之甘胺酸及在位置1,824處之脯胺酸的乙 醯輔酶A羧化酶。 在一更佳實施例中，本發明包括具有在位置1，78 1 β㈨ 處之白胺酸及在位置2,049Mmj處之苯丙胺酸的乙醯輔酶A 羧化酶；具有在位置2,098(04m)處之丙胺酸及在位置 150569.doc -105- 201113376 2,049(04 處之白胺酸的乙醯輔酶A叛化酶；具有在位置 2,098(^_處之丙胺酸及在位置2,088(^/^處之組胺酸的乙 醯輔酶A叛化酶；具有在位置2,098(^m」處之丙胺酸及在位 置2,088(^m)處之苯丙胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,098(^m)處之丙胺酸及在位置2,088(^w」處之離胺酸的 乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,09864mJ處之丙胺酸及在 位置2,088(04一處之白胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,098(047^處之丙胺酸及在位置2,088(^~處之蘇胺酸的 乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置2,098(^m)處之甘胺酸及在 位置2,088(04m」處之甘胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,098^4m)處之甘胺酸及在位置2,088^4m〉處之組胺酸的 乙酿輔酶A缓化酶；具有在位置2,098(^4wj處之甘胺酸及在 位置2,088(^m)處之白胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,098(04m」處之甘胺酸及在位置2,088MmJ處之絲胺酸的 乙酸輔酶A級化酶；具有在位置2,098(04m〉處之甘胺酸及在 位置2,088(04m)處之蘇胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在位 置2,098(^m)處之甘胺酸及在位置2,088(^mj處之纈胺酸的 乙醯輔酶A緩化酶；具有在位置2,098Mm」處之半胱胺酸及 在位置2,088(04mj處之色胺酸的乙醯輔酶A羧化酶；具有在 位置2,098Mm」處之絲胺酸及在位置2,088(^m)處之色胺酸 的乙醯輔酶A羧化酶；及具有在位置2,080(04m)處之缺失及 在位置2,081(^mj處之缺失的乙龜輔酶A缓化酶。
在一最佳實施例中，本發明包括具有在位置1,78 1 處之白胺酸及在位置2,041(04mj處之天冬醯胺的乙醯輔酶A 150569.doc -106- 201113376 羧化酶；具有在位置l，781Mw〉處之白胺酸及在位置 2,027「v4w〉處之半胱胺酸的乙醯輔酶A缓化酶；具有在位置 1,781(04…處之白胺酸及在位置2,075(04;^處之白胺酸的乙 醯輔酶A羧化酶；具有在位置1，78 1 (04m)處之白胺酸及在位 置1，864(^/^)處之苯丙胺酸的乙醯輔酶a羧化酶；具有在位 置1，781<^~處之白胺酸及在位置2,〇98(OiwJ處之丙胺酸的 乙醯輔酶A羧化酶；具有在位置l5781(^一處之白胺酸及在 位置2,098(^m)處之甘胺酸的乙醯輔酶a羧化酶；具有在位 置1，781M~處之白胺酸及重複2,〇75(的乙醯輔酶a羧 化酶；具有在位置l，999(^w)處之甘胺酸及在位置 l，864Mm〉處之苯丙胺酸的乙醯輔酶a羧化酶；具有在位置 1，999(04~處之甘胺酸及在位置2,〇49(〇4所」處之異白胺酸的 乙醯辅酶A羧化酶；具有在位置ι，99964㈨處之甘胺酸及在 位置2,075Μ/^處之白胺酸的乙醯輔酶a羧化酶；及具有在 位置l，999(^mj處之甘胺酸及在位置2,〇98yw處之丙胺酸 的乙醯輔酶A羧化酶。 核酸分子： 本發明亦涵蓋編碼所有或一部分上述乙醯輔酶A羧化酶 之核酸分子。本發明核酸分子可包含編碼包含經修飾形式 之SEQ ID NO: 2及3之一或兩者之胺基酸序列的核酸序 列，其中修飾序列以使所編碼蛋白質包含以下一或多者： 位置處1，781〈_之胺基酸為白胺酸、蘇胺酸、網胺酸或 丙胺酸；位置1，785㈣處之胺基酸為甘胺酸；位置 1，786M~處之胺基酸為脯胺酸；位置㈨處之胺基 150569.doc -107- 201113376 酸為天冬醯胺；位置1,824(04處之胺基酸為脯胺酸；位 置1，864^4州處之胺基酸為苯丙胺酸；位置i，999(^w)處之 胺基酸為半胱胺酸或甘胺酸；位置2,027Mm)處之胺基酸 為半胱胺酸或精胺酸；位置2,039MW處之胺基酸為甘胺 酸；位置2,041(04wJ處之胺基酸為天冬醯胺；位置 2,04964mj處之胺基酸為苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸； 位置2,059(^/«)處之胺基酸為纈胺酸；位置2,〇74(〇4m)處之 胺基酸為白胺酸；位置2,075M…處之胺基酸為白胺酸、 異白胺酸、曱硫胺酸或另一纈胺酸；位置2,〇78M㈣處之 胺基酸為甘胺酸或蘇胺酸；位置2,079以~處之胺基酸為 苯丙胺酸；位置2,080(^m)處之胺基酸為麩胺酸；位置 2,080(^m)處之胺基酸缺失；位置2,〇81(04州處之胺基酸缺 失；位置2,088(04/«)處之胺基酸為精胺酸、色胺酸、苯丙 胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺 酸或纈胺酸；位置2,095 處之胺基酸為麵胺酸；位置 2,096Mm」處之胺基酸為丙胺酸或絲胺酸；或位置 2,098(04m)處之胺基酸為丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺 酸或絲胺酸’以及與所有或一部分編碼序列互補的核酸分 子。在一些實施例中’本發明核酸分子可編碼具有如上所 述與野生型乙醯輔酶A羧化酶之多個差異的乙醯輔酶a羧 化酶。 在一實施例中’本發明涵蓋編碼僅在以下一個位置處不 同於相應野生型植物之乙醯輔酶A羧化酶之乙醯輔酶a羧 化酶的核酸分子：1,781(04«^ ' 1，785(04»^、、 150569.doc -108· 201113376 \^\\(Am) ' l,S24(Am) ' \,S64(Am) ' l,999(Am) ' 2,0Π (Am) 、 2,039(Am) 、 2,04\(Am) 、 2,049(Am)、 2,059(Am) ' 2,074(Am) ' 2,0T5(Am) ' 2,078^m； ' 2,079(Am) 、 2,0S0(Am) 、 2,0Sl(Am) 、 2,0SS(Am)、 2,095^4m;、2,096(^wj 或 2,098(^4mJ » 在一實施例中，本發 明耐除草劑之植物之乙醯輔酶A羧化酶將僅在以下一個位 置處不同：2,078(^w)、2,08864mj 或 2,075Mm)。在一較佳 實施例中，本發明耐除草劑之植物之乙醯輔酶A羧化酶將 僅在以下一個位置處不同：2,039(04/7^、2,059^4m)、 2,〇8〇β…或2,095(^m)。在一更佳實施例中，本發明对除 草劑之植物之乙醯輔酶A羧化酶將僅在以下一個位置處不 同：l，785(04w)、1，786(^所）、l，811(04m)、l,824(^m)、 l,S64(Am) ' 2,04l(Am) > 2,049(Am) ' 2,074(Am) ' 2,079(04所）、2,081(04所）、2,096(04所）或2,098(04/?2)。在一最佳 實施例中，本發明耐除草劑之植物之乙醯輔酶A羧化酶將 僅在以下一個位置處不同：1,781 、l,999Mm)、 2,027(^4m)、2,041(^4w)或 2,096(0im」。 在一實施例中，本發明涵蓋編碼僅具有以下一個取代之 乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子：位置2，075 M 處之異白胺 酸、位置2,078(^所）處之甘胺酸或位置2,088(04m)處之精胺 酸。在一較佳實施例中’本發明涵蓋編碼僅具有以下一個 取代之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子：位置2,039(04mj處之 甘胺酸、位置2,〇59^4mJ處之纈胺酸、位置2,075(^m」處之 甲硫胺酸、位置2,075^4mj之重複（亦即在2,074(04mj與 150569.doc -109- 201113376 2,075 (04m)之間插入纈胺酸或在位置2,075 與2,076(^w) 之間插入纈胺酸）、胺基酸位置2,088(04/^之缺失、位置 2,080(^m)處之麩胺酸、位置2,088(04m)之缺失或位置 2,095 處之麩胺酸。在一更佳實施例中，本發明涵蓋 編碼僅具有以下一個取代之乙醯輔酶Α羧化酶的核酸分 子：位置l，785(^4mj處之甘胺酸、位置l，786(04m」處之脯胺 酸、位置1,811 處之天冬醯胺、位置2,075處之白 胺酸、位置2,075(04_處之曱硫胺酸、位置2,078^4m)處之 蘇胺酸、位置2,080(^m)處之缺失、位置2,081(^4mj處之缺 失、位置2,088(04 wj處之色胺酸、位置2,096(04w)處之絲胺 酸、位置2,096(^/^處之丙胺酸、位置2,098(^_處之丙胺 酸、位置2,098Mm)處之甘胺酸、位置2,098(04m)處之組胺 酸、位置2,098(04mj處之脯胺酸或位置2,098(04mj處之絲胺 酸。在一最佳實施例中，本發明涵蓋編碼僅具有以下一個 取代之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子：位置l，781MmJ處之 白胺酸、位置1,781 (04m」處之蘇胺酸、位置1,781 處之 纈胺酸、位置l,781(04m)處之丙胺酸、位置1,999Μ~處之 甘胺酸、位置2,027(^W處之半胱胺酸、位置2,027β—處 之精胺酸、位置2,041 (04m)處之天冬醯胺、位置2,041 (04m) 處之纈胺酸、位置2,096(04m)處之丙胺酸及位置2,096(04 — 處之絲胺酸。 在一實施例中，本發明核酸分子可編碼包含在位置 1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置1,999(^4_處之半胱胺酸或甘胺酸的乙醯輔酶A羧化酶。 150569.doc -110- 201113376 在一實施例中，本發明核酸分子可編碼包含在位置 1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置2,027(^m)處之半胱胺酸或精胺酸的乙醯輔酶a羧化酶。 在一實施例中’本發明核酸分子可編碼包含在位置 1，78 1 (04/w)處之白胺酸、蘇胺酸、顯胺酸或丙胺酸及在位 置2,041(^4m)處之天冬醯胺的乙酿辅酶a叛化酶。在一實施 例中’本發明核酸分子可編碼包含在位置1，78丨Μ_處之 白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置2,〇49(Oim>處 之苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸的乙醯輔酶A羧化酶。在 一實施例中’本發明核酸分子可編碼包含在位置 1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置2,075(^wJ處之白胺酸或異白胺酸的乙醯輔酶a羧化酶。 在一實施例中，本發明核酸分子可編碼包含在位置 1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位 置2,078f^m」處之甘胺酸的乙醯輔酶a羧化酶。在一實施例 中’本發明核酸分子可編碼包含在位置1，781 (04…處之白 胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸及在位置2,088(04mj處之 精胺酸的乙醯輔酶A缓化酶。在一實施例中，本發明核酸 分子可編碼包含在位置1,78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、 纈胺酸或丙胺酸及在位置2,096(^m)處之丙胺酸的乙醯輔 酶A羧化酶。在一實施例中，本發明核酸分子可編碼包含 在位置1,78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸 及在位置2,098(04m)處之丙胺酸的乙醯輔酶A缓化酶。在一 實施例中，本發明核酸分子可編碼包含在位置1，78 1 (Oim) 150569.doc -Ill - 201113376 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；在位置 2,027M所Μ之半胱胺酸及在位置2,041 (0^處之天冬醯胺 的乙醯輔酶Α羧化酶。在一實施例中，本發明核酸分子可 編碼包含在位置1，78 1 處之白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸 或丙胺酸；在位置2,027(04m)處之半胱胺酸；在位置 2,041(^m)處之天冬酸胺及在位置2,096(^m)處之丙胺酸的 乙酿輔酶A缓化酶。 在一實施例中，本發明包括編碼具有在位置2,075 處之異白胺酸及在位置l，999MmJ處之甘胺酸之乙醯輔酶A 羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,075Mmj處之曱硫 胺酸及在位置2,0 80(04 m)處之麩胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的 核酸分子；編碼具有在位置2,075(^m)處之曱硫胺酸及在 位置2,095 64mj處之麩胺酸之乙醯辅酶A羧化酶的核酸分 子；編碼具有在位置2,078(04wj處之甘胺酸及在位置 2,041Mm」處之纈胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編 碼具有在位置2,078Mmj處之甘胺酸及在位置2,039Mm)處 之甘胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位 置2,078(^»^處之甘胺酸及在位置2,049(04mj處之丙胺酸之 乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置2, 處之甘胺酸及在位置2,049 Mmj處之半胱胺酸之乙醯輔酶A 羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,078Μ_處之甘胺 酸及在位置2,049Mmj處之絲胺酸之乙醯輔酶Α羧化酶的核 酸分子；編碼具有在位置2,078(04»^處之甘胺酸及在位置 2,處之蘇胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編 150569.doc •112· 201113376 碼具有在位置2,078^4w>處之甘胺酸及在位置2,059(04m)處 之纈胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位 置2,07 8(^m)處之甘胺酸及在位置2,079(0im)處之苯丙胺酸 之乙醯辅酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置 2,078(^m)處之甘胺酸及在位置2,079(^w)處之脯胺酸之乙 醯輔酶A羧化酶的核酸分子；或編碼具有在位置2,〇78(04 W 處之甘胺酸及在位置2,088Mm)處之甘胺酸之乙醯辅酶A羧 化酶的核酸分子。 在一較佳實施例中，本發明包括編碼具有在位置 l，781Mwj處之白胺酸及在位置l，824Mm>處之脯胺酸之乙 醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置1,78 1 處 之白胺酸及在位置2,027(04»^處之精胺酸之乙醯輔酶A羧化 酶的核酸分子；或編碼具有在位置2,078Mmj處之甘胺酸 及在位置l，824^4m)處之脯胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸 分子® 在一更佳實施例中，本發明包括編碼具有在位置 l，7 81Mm>處之白胺酸及在位置2,049Mmj處之苯丙胺酸之 乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,〇98(04mj 處之丙胺酸及在位置2,049Μα^處之白胺酸之乙醯輔酶A羧 化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,09864m)處之丙胺酸 及在位置2,088 64叫處之組胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸 分子；編碼具有在位置2,〇98Mmj處之丙胺酸及在位置 2,088^4mj處之苯丙胺酸之乙醯輔酶a羧化酶的核酸分子； 編碼具有在位置2,098(C4…處之丙胺酸及在位置2,088μ~ 150569.doc •】13· 201113376 處之離胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在 位置2,098(04m)處之丙胺酸及在位置2,088(^4;«)處之白胺酸 之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置 2,098M…處之丙胺酸及在位置2,088Μ/^處之蘇胺酸之乙 醯輔酶Α羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,098MW處 之甘胺酸及在位置2,088Mmj處之甘胺酸之乙醯輔酶A羧化 酶的核酸分子；編碼具有在位置2,098(04/«〉處之甘胺酸及 在位置2,088(04/^處之組胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分 子；編碼具有在位置2,098(^mj處之甘胺酸及在位置 2,088Mmj處之白胺酸之乙醢輔酶A羧化酶的核酸分子；編 碼具有在位置2,098Mm」處之甘胺酸及在位置2,088(04m)處 之絲胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位 置2,098(^(mJ處之甘胺酸及在位置2,088Mm)處之蘇胺酸之 乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,098(04W 處之甘胺酸及在位置2,088(^4一處之纈胺酸之乙醯輔酶A羧 化酶的核酸分子；編碼具有在位置2,098(04mj處之半胱胺 酸及在位置2,088(^W處之色胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核 酸分子；編碼具有在位置2,098Mmj處之絲胺酸及在位置 2,088(^m)處之色胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；或 編碼具有在位置2,080(04m)處之缺失及在位置2081(^4mj處 之缺失之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子。 在一最佳實施例中，本發明包括編碼具有在位置 l，781Mmj處之白胺酸及在位置2,041(04m)處之天冬醯胺之 乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置l，781(^m) 150569.doc -114- 201113376
處之白胺酸及在位置2, 處之半胱胺酸之乙醯輔酶A 羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置i，78 1 (Olm)處之白胺 酸及在位置2,075Mmj處之白胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核 酸分子；編碼具有在位置1,78 1 岣處之白胺酸及在位置 l，864(^m>處之苯丙胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子； 編碼具有在位置1,781 處之白胺酸及在位置2,098 處之丙胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在 位置l，781(04wj處之白胺酸及在位置2,098(04wj處之甘胺酸 之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；編碼具有在位置 1，781(^;^處之白胺酸及重複2,〇75(^岣之乙醯輔酶人羧化 酶的核酸分子；編碼具有在位置1,999(04…處之甘胺酸及 在位置l，864(^m)處之苯丙胺酸之乙醯輔酶a羧化酶的核酸 分子；編碼具有在位置1,999(04w)處之甘胺酸及在位置 2,049^4m>處之異白胺酸之乙醯輔酶a羧化酶的核酸分子； 編碼具有在位置l，999Mm)處之甘胺酸及在位置2,075(04m) 處之白胺酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子；或編碼具有 在位置l，999(^mj處之甘胺酸及在位置2,〇98(^_處之丙胺 酸之乙醯輔酶A羧化酶的核酸分子。 在一實施例中，本發明提供包含編碼具有一或多個如上 所述取代之乙醯輔酶A叛化酶多肽之核酸的稻植物。 在一實施例中，本發明提供包含編碼具有一或多個如上 所述取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的BEP分枝系植 物。 在一實施例中，本發明提供包含編碼具有一或多個如上 150569.doc 115 201113376 所述取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的BET次分枝系 植物。 在一實施例中’本發明提供包含編碼具有一或多個如上 所述取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的BET作物植 物。 在一實施例中，本發明提供包含編碼具有一或多個如上 所述取代之乙醯輔酶A羧化酶多肽之核酸的單子葉植物。 本發明核酸分子可為源自基因組DNA或cDNA之DNA、 或RNA。本發明核酸分子可為天然存在或合成之核酸分 子。本發明核酸分子可為經分離、重組及/或經誘變之核 酸分子。 在一貫施例中’本發明核酸分子編碼位置1，78丨Μ⑷處 之胺基酸為白胺酸或丙胺酸的乙醯輔酶八羧化酶或與此類 核酸分子互補。此等核酸分子包括（但不限於）充當初級 RNA(primary RNA)轉錄範本之基因組DNA、編碼乙醯輔 酶A羧化酶之質體分子以及編碼此類乙醯輔酶八羧化酶之 mRNA。 本發明核酸分子可包含可經轉錄或不轉錄之非編碼序 列。可包括在本發明核酸分子中之非編碼序列包括（但不 限於）5’及3’ UTR、聚腺苷酸化信號及控制基因表現之調節 序列（例如啟動子）^本發明核酸分子亦可包含編碼轉運 肽、蛋白酶裂解位點、共價修飾位點及其類似物之序列。 在一實施例中，除編碼乙醯輔酶A羧化酶之序列以外，本 發明核酸分子亦編碼葉綠體轉運肽序列。 150569.doc •116· 201113376 在另一實施例中，本發明核酸分子可編碼與經修飾形式 之SEQ ID NO: 2及3之一或兩者具有至少5〇%、60%、 70%、75°/。、80%、85%、90%、95%或 95%以上序列一致 性的乙醯輔酶A羧化酶’其中修飾序列以使所編碼蛋白質 包含以下一或多者：位置1，781 64m」處之胺基酸為白胺 酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置l，785Mm)處之胺基 酸為甘胺酸；位置1，786(04m」處之胺基酸為脯胺酸；位置 l，811(^m)處之胺基酸為天冬醯胺；位置i,824(〇iw)處之胺 基酸為脯胺酸；位置1,864處之胺基酸為笨丙胺酸； 位置處1，999β~之胺基酸為半胱胺酸或甘胺酸；位置 2,027Μ…處之胺基酸為半胱胺酸或精胺酸；位置 2,039(04m)處之胺基酸為甘胺酸；位置2,〇41(〇lm>)處之胺基 酸為天冬醢胺；位置2049 M 處之胺基酸為笨丙胺酸、白 胺酸或異白胺酸；位置2,059(04m)處之胺基酸為纈胺酸； 位置2,074(04»^處之胺基酸為白胺酸；位置2,〇75(^wJ處之 胺基酸為白胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸或另一纈胺酸；位 置2,078Mmj處之胺基酸為甘胺酸或蘇胺酸；位置 2,079〔y4m」處之胺基酸為苯丙胺酸；位置2,〇8〇「4所）處之胺 基酸為麩胺酸；位置2,080(04«^處之胺基酸缺失；位置 2,081Mmj處之胺基酸缺失；位置2,088(^m)處之胺基酸為 精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、 白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置2,〇95 (04m)處之 胺基酸為麩胺酸；位置2,096Mmj處之胺基酸為丙胺酸或 絲胺酸；或位置2,098(04mj處之胺基酸為丙胺酸、甘胺 150569.doc •117· 201113376 酸、脯胺酸、組胺酸或絲胺酸，以及與所有或一部分編碼 序列互補之核酸分子。 如本文所用，「序列一致性百分比（％)」定義為如由可在 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi處獲得之 BLAST程式 (搜哥參數设定為内定值）所產生，在比對序列且必要時引 入間隙以獲得最大序列一致性百分比之後，與標的序列 (或其指定部分）中之核苷酸或胺基酸一致之候選衍生序列 中之核苷酸或胺基酸的百分比。 本發明亦涵蓋雜交至編碼本發明之乙醯輔酶A羧化酶之 核酸分子的核酸分子以及雜交至編碼本發明之乙醯輔酶A 羧化酶之核酸分子之反向互補序列的核酸分子。在一實施 例中’本發明核酸分子包含在嚴格條件（stringent condition)下雜交至編碼一或多種經修飾形式之SEq NO: 2及3之一或兩者之核酸分子的核酸分子，其中修飾序 列以使所編碼蛋白質包含以下一或多者：位置1，7 81 μ⑷ 處之胺基酸為白胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或丙胺酸；位置 l，785(04mj處之胺基酸為甘胺酸；位置1，786^4所）處之胺基 酸為脯胺酸；位置1，8 11 Mwj處之胺基酸為天冬醯胺；位 置1，82464㈨處之胺基酸為脯胺酸；位置ι，86464~處之胺 基酸為苯丙胺酸；位置l，999(04m)處之胺基酸為半胱胺酸 或甘胺酸；位置2,027“;^處之胺基酸為半胱胺酸或精胺 酸’位置2,039(^mj處之胺基酸為甘胺酸；位置2,〇4lM… 處之胺基酸為天冬醯胺；位置2,〇49^4w)處之胺基酸為苯 丙胺酸、異白胺酸或白胺酸；位置2,〇59MW處之胺基酸為 150569,doc .Π8- 201113376 绳胺酸；位置2,074Mm」處之胺基酸為白胺酸；位置 2,075(04岣處之胺基酸為白胺酸、異白胺酸或曱硫胺酸或 另一顯胺酸；位置2,〇78(^m>處之胺基酸為甘胺酸或蘇胺 酸；位置2,079(04m)處之胺基酸為苯丙胺酸；位置 2,08〇64m)處之胺基酸為麩胺酸；位置2,〇8〇(^岣處之胺基 酸缺失；位置2,081(^所^)處之胺基酸缺失；位置2,088MwJ 處之胺基酸為精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺 酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；位置 2,095Mm)處之胺基酸為麩胺酸；位置2,〇96(〇4w」處之胺基 酸為丙胺酸或絲胺酸；或位置2,〇98Mmj處之胺基酸為丙 胺酸、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸或絲胺酸，以及雜交至與 所有或一部分編碼序列互補之核酸分子、或此等核酸分子 之反向互補序列的核酸分子。雜交之嚴格性可由雜交及洗 滌期間之溫度、離子強度、pH值及變性劑（諸如甲醯胺）之 存在來控制。可使用之嚴格條件包括定義於 尸rc^co/H” M〇/ecw/ar 仏o/og3；，第【卷，第 2 1〇章，J〇hn
Wiley & Sons，Publishers (1994)及 Sambrook 等人，
Mo—r C/〇m_ng，Cold Spring Harbor (1989)中之彼等 者，上述文獻由於其係關於嚴格條件之教示而明確併入本 文中。 具有相關基因之組合之質體中的任何上述突變體皆可用 於轉型中。 在一實施例中，本發明提供句各绝, ^促仏巴3編碼任何上述ACCase 突變體之核酸分子的表現載體。 150569.doc -119- 201113376 在一實施例中’本發明提供突變體ACCase核酸及由此 等如上所述突變體AC Case核酸編碼之蛋白質作為可選擇 標記物的用途。 在一實施例中’本發明核酸分子涵蓋可用作雜交探針、 定序引子及/或PCR引子之募核苷酸。此等募核苷酸可例如 用於例如經由對偶基因特異性PCR來確定編碼乙醯輔酶a 羧化酶之核酸分子中特定位置處的密碼子序列。此等寡核 苦酸長度可為約1 5至約30、約20至約30、或約20-25個核 苷酸。 針對雙重突變體ACCase基因之測試（rDBLM檢定」）： (1) 在（例如數目至少12且較佳至少2〇之）測試群體中， 所有稻植物含有1或2個編碼至少雙重突變體ACCase之轉 殖基因ACCase基因（亦即欲測試之轉殖基因ACCase基因具 有最少1個且最多2個染色體插入）的複本， 其中該等稻植物為T0(「T-0」）再生物 且同時此等植物之對照群體將用作未處理之檢驗植物 (check plant)； (2) 以200公升/公頃之噴灑體積對測試群體施用包含得 才没草（AI)及1%作物油濃縮物（Cr〇p 〇丨1 c〇neentrate，coc) 之組合物以提供等於5G公克/公頃之得殺草（A_AI施用 量； (3) 基於傳統植物損傷評級系統(例如較佳根據典型至 :5等級廿損傷評級表評估除草劑灼傷、葉形態變化、洞 委、變育及其他形態特徵之視覺跡象）來確定各測試及檢 150569.doc •120· 201113376 驗植物之植物毒性得分； (4) 分析所收集之資料以確定測試群體中是否有至少 75 /。植物展現小於1 0%的平均植物毒性，亦即相對於檢驗 植物之損傷增加；及
(5) 鑑別確定為證明雙重突變體Accase提供可接受AIT 之1%性結果。 除草劑 本發明提供耐受一般抑制野生型植物生長之除草劑濃度 之植物，例如稻植物。該等植物通常對幹擾乙醯辅酶A羧 化酶活性之除草劑具有抗性。抑制乙醯輔酶A羧化酶活性 之任何除草劑皆可與本發明之植物結合使用。適合實例包 括（i_不限於）衩己二酮除草劑 '芳氧基苯氧丙酸酯除草劑 及苯基吡唑除草劑。在控制雜草及/或使耐除草劑之植物 生長之一些方法中，至少一種除草劑係選自由以下組成之 群西鈥草、環殺草、得殺草、氟比禾靈、精氟„比禾靈 (haloxyfo卜P)或任何此等除草劑之衍生物。 表1提仏幹擾乙醯輔酶A缓化酶活性且可與本發明之耐除 草刻之植物結合使用的環己二嗣除草劑（dim，亦稱為：環 己烯肟，％己二酮肟；及CHD)之清單。熟習此項技術者 將〜識到存在有其他屬於此類別之除草劑且其可與本發明 的耐除草劑之植物結合使用。表1中亦包括幹擾乙SM甫酶A _酶活1*生且可與本發明之耐除草劑之植物結合使用的芳 氧基+苯氧丙酸酷除草劑（亦稱為芳氧基苯氧丙酸醋；芳氧 笨氧烧^ S旨；氧基笨氧基；APP ; AOPP ; APA ; 150569.doc • 121 · 201113376 APPA ; FOP，應注意此等名稱有時以詞尾『酸（-〇ic)』加 以書寫）之清單。熟習此項技術者將認識到存在有其他屬 於此類別之除草劑且其可與本發明之耐除草劑之植物結合 使用。 表1 ACCase抑制劑 類別 公司 同義語及商標名之實例 亞汰草(alloxydim) DIM BASF Fervin、Kusagard、NP-48Na、 BAS 9021H、Carbodimedon、 Zizalon 丁 笨草酮(butroxydim) DIM Syngenta Falcon、ICI-A0500、Butroxydim 赴草同(clethodim) DIM Valent Select、Prism、Centurion、RE-45601 、 Motsa 炔草 S旨(Clodinafop-propargyl) FOP Syngenta Discover、Topik、CGA 184 927 草丙酸(clofop) FOP 非諾貝酸(Fenofibric Acid)、Alopex 氣丙氧定(cloproxydim) FOP 氣拉寄普(chlorazifop) FOP 環殺草(cycloxydim) DIM BASF Focus ' Laser ' Stratos ' BAS 517H 丁基賽伏草(cyhalofop-butyl) FOP Dow Clincher、XDE 537、DEH 112、 Barnstorm 禾草靈(diclofop-methyl) FOP Bayer Hoegrass、Hoelon、Illoxan、HOE 23408、Dichlorfop、Illoxan 精鳴坐禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl) FOP Bayer Super Whip、Option Super、Exel Super、HOE-46360、Aclaim、 Puma S、Fusion 售°坐禾草靈(fenthiaprop) FOP Taifun ' Joker 精D比敦禾草靈(fluazifop-P· butyl) FOP Syngenta Fusilade ' Fusilade 2000 ' Fusilade DX、ICI-A 0009、ICI-A 0005、 SL-236、IH-773B、TF-1169、 Fusion 敗0比乙禾靈(haloxyfop-etotyl) FOP Dow Gallant、DOWCO 453EE 氟^比甲禾靈(haloxyfop· methyl) FOP Dow Verdict、DOWCO 453ME 精氟/比甲禾靈(haloxyfop-P-methyl) FOP Dow Edge、DE 535 異 °惡草峻(isoxapyrifop) FOP 嗔β坐醜草胺(Metami fop) FOP Dongbu NA °全咐草醋(pinoxaden) DEN Syngenta Axial 環苯草 _ (pro f0Xy dim) DIM BASF Aura ' Tetris、BAS 625H、 Clefoxydim 普拔草(propaquizafop) FOP Syngenta Agil、Shogun、Ro 17-3664、 Correct 150569.doc -122· 201113376
精瘦禾靈乙醋(quizalofop-P-ethyl) FOP DuPont Assure ' Assure II ' DPX-Y6202-3、Targa Super、NC-302、 Quizafop 精°奎禾糠醋(quizalofop_P-tefuryl) FOP Uniroyal Pantera、UBI C4874 西殺草(sethoxydim) DIM BASF Poast、Poast Plus、NABU、 Fervinal、NP-55、Sertin、BAS 562H、Cyethoxydim、Rezult 得殺草(tepraloxydim) DIM BASF BAS 620H、Aramo、Caloxydim 三曱苯草綱(tralkoxydim) DIM Syngenta Achieve、Splendor、ICI-A0604、 Tralkoxydime ' Tralkoxidym 曲伏普(trifop) FOP 除以上所列之除草劑以外，其他ACCase抑制劑亦可與 本發明之耐除草劑之植物結合使用。舉例而言，可使用苯 基吡唑類ACCase抑制性除草劑（亦稱為DEN)。例示性DEN 為唑啉草酯，其為此類之苯基》比唑啉型成員。含有唑啉草 @旨之除草劑組合物以商標Axial及Traxos出售。 包含一或多種乙醒輔酶A缓化酶抑制性除草劑及視情況 選用之其他農藝學A.I.之本文中之除草組合物可以任何農 藝學上可接受之形式使用，該（等）其他農藝學A.I.例如一 或多種選自由以下組成之群的磺醢脲（SU):醯嘧磺隆 (amidosulfuron)、氟唆嘴績隆（flupyrsulfuron)、甲醯。密績 隆（foramsulfuron) ' 峻 比。密石黃隆（imazosulfuron)、埃曱石黃 隆（iodosulfuron)、曱石黃胺石黃隆（mesosulfuron)、煙嘧石黃隆 (nicosulfuron)、》塞吩磺隆（thifensulfuron)及苯確隆 (tribenuron)、其農藝學上可接受之鹽及酯；或一或多種選 自以下之群的°米°坐琳酿I :曱氧咪草煙（imazamox)、咪草煙 (imazethapyr)、滅草煙（imazapyr)、甲基咪草煙（imazapic)、 其組合及其農學上適合之鹽及酯。舉例而言，此等可調配 150569.doc •123· 201113376 成即噴灑水溶液、散劑、懸浮液；濃縮或高度濃縮水性、 油性或其他溶液、懸浮液或分散液；乳液、油性分散液、 糊劑、粉劑、顆粒劑或其他可播撒形式。除草劑組合物可 經由此項技術中已知之任何方式加以施用，該等方式包括 例如喷灑、霧化、粉塵化、散佈、噴水、種子處理或以與 種子之混雜物形式共種i使用形式視預定目的而在任 何情況下其皆應確保本發明活性成份之盡可能精細的分佈。 在其他實施例中’當視情況選用之AI.包括本文中植物 將一般對其敏感之不同種類的除草劑時，欲用植物尤其係 選自進-步包含耐受此除草劑之性狀的㈣ 技術中已知之任何方法，例如包括藉由雜交或基： _寧譲„)獲得耐受性狀基因之傳統育種、突變誘發及/ 或轉型之技術’對植物提供此進一步耐受性狀。此等植物 可描述成具有「堆疊」性狀。 此外’任何以上乙@Mi酶續化酶抑制性除草劑可鱼一 或多種另-種類之除草劑組合，另—種類之除草劑❹任 何乙醯經基酸合成酶抑制性除草劑、Epsp合成酶抑制性除 草劑、麵醯胺酸合成酶抑制性除草劑、脂^色素生物合 成抑制劑除草劑、細胞膜瓦解劑除草齊卜光合或呼吸
(_叫抑制劑除草劑、或此項技術中已知之生長調節 劑或生長抑制劑除草劑。非限制性實例包括敍述於由S.A
Senseman 所編之 Weed Science +
GnCe Soclety 〇f America's Herbicide —第9版，著作權2〇〇7中之彼等者。本文中除草組 合物可含有—或多㈣自農學上可接受之殺真菌劑、嗜毯 150569.doc •124· 201113376 果傘素（strobilurin)殺真菌劑、殺昆蟲劑（包括殺線蟲劑）、 殺壁虱劑（miticide)及殺軟體動物劑（m〇Uuscicide)的農學活 性成份。非限制性實例包括敍述於2〇〇9 Cr〇p pr〇tecti〇n
Reference (www.greenbook.net)，Vance publicati〇ns中之彼 等者。 在本發明之一實施例中，任何以上乙醯輔酶A羧化酶抑 制性除草劑與展現對稻之較低損害之除草劑組合，藉此稻 對此等除草劑之耐受性可視情況為作物植物之遺傳修飾的 結果。此等除草劑之實例為乙醯羥基酸合成酶抑制性除草 劑咪草酯（lmazamethabenz)、甲氧咪草菸（imazam〇x)、甲 基味草於（imazapic)、滅草菸（imazapyr)、滅草喹（imazaquin)、 咪草菸（imazethapyr)、四唑嘧磺隆（azimsulfur〇n)、苄嘧磺 隆（bensulfuron)、氣嘧磺隆（chl〇rimur〇n)、環丙嘧磺隆 (cycl〇SUlfamuron)、乙氧嘧磺隆（eth〇xysulfur〇n)、氟吡磺 隆（flucetosulfuron)、氣吡醚磺隆（hal〇suifuron)、唑吡嘧磺 隆（imazosulfuron)、曱績隆（metsuifuron)、鄰丙 0密續隆 (orthosulfamuron)、嗪 ρ米唾》密石黃隆（pr〇pyrisuifur〇n)、0比 σ密 % 隆（pyrazosulfuron)、雙草驗（bispyribac)、派瑞米蘇 (pyrimisulfan)或五氟績草胺（penoxsuiam) ; EPSP合成酶抑 制性除草劑草甘膦（glyph〇sate)或草硫膦（sulf〇sate);楚酿 月女酸合成酶抑制性除草劑固殺草（gluf〇sjnate)、固殺草_ P(glufosinate-P)或畢拉草（bialaph〇s);脂質生物合成抑制 劑除草劑。夫草場（benfuresate)、得草滅（m〇iinate)或殺丹 (thiobencarb)，光合抑制劑除草劑嗟草平（bentazon)、百草 150569.doc •125· 201113376 枯（paraquat)、撲草淨（prometryn)或敵稗（pr〇panii);漂白 劑除草劑苯並雙環酮（benzobicyclone)、可滅縱（clomazone) 或tefuryltrione ;生長素（auxin)除草劑2,4-D、氟草於 (fluroxypyr)、MCPA、二氯啥琳酸（quinclorac)、啥草酸 (qmnmerac)或綠草定（trici〇pyr);微管抑制劑除草劑二曱 戊樂靈（pendimethalin) ; VLCFA抑制劑除草劑莎稗磷 (amlofos)、去草胺（butachlor)、四唑醯草胺（fentrazamide)、 鹵苯胺唑（ipfencarbazone)、苯噻醯草胺（mefenacet)、丙草 胺（pretilachlor)、乙草胺（acetochl〇r)、異丙甲草胺（met〇丨achl〇r) 或南效異丙甲草胺（S-metolachlor)或原卟啉原-IX氧化酶 (protoporphyrinogen-IX-oxidase)抑制劑除草劑唾酮草酯 (carfentrazone)、。惡草酮（oxadiazon)、乙氧氟草驗 (oxyfluorfen)、雙唑草腈（pyracl〇nii)或嘧啶肟草醚 (saflufenacil)。 在本發明之一實施例中’任何以上乙醯輔酶A羧化酶抑 制性除草劑與展現對禾榖（諸如小麥、大麥或黑麥）之較低 損害之除草劑組合’藉此禾穀對此等除草劑之耐受性可視 情況為作物植物之遺傳修飾的結果。此等除草劑之實例為 乙醯羥基酸合成酶抑制性除草劑咪草酯、甲氧咪草於、甲 基咪草於、滅草菸、滅草喹、咪草菸、醯嘧磺隆 (amidosulfuron)、氣磺隆（chl〇rsuifuron)、氟吡磺隆、氟啶 喊磺龍（flupyrsulfuron)、碘曱磺隆（i〇d〇sulfur〇n)、甲石黃胺 續隆（mesosulfuron)、甲磺隆、磺嘧磺隆（sulf〇sulfur〇n)、 。塞吩磺隆（thifensulfuron)、醚苯磺隆（triasulfur〇n)、苯續 150569.doc -126- 201113376 隆（tribenuron)、三氟甲石黃隆（tritosulfuron)、雙氟石黃草胺 (florasulam)、吡惡草胺（pyroxsulam)、派瑞米蘇、氟酮磺 隆（flucarbazone)、丙氧石黃隆（pr〇p〇xyCarbazone)或 S同脲續 草吩（thiencarbazone) ; EPSP合成酶抑制性除草劑草甘膦或 草硫膦；麩醯胺酸合成酶抑制性除草劑固殺草、固殺草_P 或畢拉草；脂質生物合成抑制劑除草劑苄草丹 (prosulfocarb);光合抑制劑除草劑噻草平、綠麥隆 (chlorotoluron)、異丙隆（iSOprotur〇n)、峨苯腈（i〇xynii) ' 溴苯腈（bromoxynil);漂白劑除草劑吼氟草胺（diflufenican)、 呋草酮（flurtamone)、氟。比草胺（pic〇Hnafen)或吼磺托爾 (pyrasulfotole)；生長素除草劑環丙嘧啶酸 (aminocyclopyrachl〇r)、氯胺基吡啶酸（amin〇pyraHd)、 2,4-D、麥草畏（dicamba)、i草菸、McpA、克草立特 (el〇Pyfalid) ' MCPP或Mcpp_p ;微管抑制劑除草劑二甲戊 樂靈或I樂靈（Uifluralin) ; VLCFA抑制劑除草劑氟嗟草胺 (flufenaeet)或原。卜林原_Ιχ氧化酶抑制劑除草冑苯卡巴膝 (一一)、唾明草酷或㈣亏草喊；或除草劑野燕 枯（difenzoquat) 〇 在本發明之-實施例中’任何以上乙醯輔酶續化酶抑 制性除草劑與展現料皮之較低損害之除草劑組合，藉此 卓皮對此等除草劑之耐受性可視情況為作物植物之遺傳終 2結果。此等除草劑之實例為乙酿經基酸合成酶抑難 :草二=旨、：氧咪轉、甲㈣科、滅草於 '滅二 土 ’卡卓於…密咬石黃隆（flazasuifur〇n)、甲酿口密石黃隆 150569.doc -127- 201113376 (foramsulfuron)、氯吼峻續隆（hai〇suifur〇n)、三氟。定續隆 (tnfloxysulfuron)、雙草醚或酮脲磺草吩；epsp合成酶抑 制性除草劑草甘膦或草硫膦；麩醯胺酸合成酶抑制性除草 劑固殺草、固殺草-P或畢拉草；光合抑制劑除草劑莠去津 (atrazine)或噻草平；漂白劑除草劑甲基磺草鲷 (mesotnone)、氟吡草胺、吡磺托爾或托普美腙 (topramezone);生長素除草劑環丙嘧啶酸、氯胺基吡啶 酸、Μ-D、2,4-DB、克草立特、麥草畏、2,4_滴丙酸 (dichlorprop)、南 2,4-滴丙酸（dichl〇rprop-P)、氟草终、 MCPA、MCPB、MCPP、Mcpp_p、二氯喧琳酸、♦草酸或 綠草定；微管抑制劑除草劑二甲戊樂靈；VLCF_制劑除 草劑二六甲烯胺（dimethenamide)、二六曱烯胺_ P(dhnethenamide-P)4_*胺唾；原外啉原_ιχ氧化酶抑制 劑除草劑嘧啶肟草醚或甲磺草胺（sulfentraz〇ne);或除草 劑因達淨（indaziflam) » 此外，任何以上乙醯輔酶A幾化酶抑制性除草劑可盘安 全劑組合。安全劑為預防或降低對適用植物之損害而對除 草劑對不合需要植物之除草作用無較大影響的化合物。其 可施用在播種之前（例如對種子處理劑、芽或幼苗施用）或 在適用植物之出苗前施用或出苗後施用中。安全劑及上述 除草劑可同時或相繼施用。適合安全劑為例如（喧琳_8氧 基）乙酸、i-苯基-5-函烧基-叫从三^緩酸叫-苯 基-4,5-二氫 _5_ 烧基-1H-n比唾 _3,5_二竣酸、4,5_ 二氯·5 % 二 芳基-3-異嗯唑叛酸、二氯乙醯胺、α•經亞胺基苯乙腈’、； 150569.doc •128- 201113376 乙酮肟、4,6-二鹵-2-苯基嘧啶、N-[[4-(胺基羰基）苯基]磺 醯基]-2-苯甲醯胺、1,8-萘二甲酸酐、2-函-4-(齒烷基）-5-噻唑羧酸、硫代磷酸酯及N-烷基-0-烷基-胺基甲酸酯。安 全劑之實例為解草酮（benoxacor)、解毒啥（cloquintocet)、 解草胺腈（cyometrinil)、°塞普績醯胺（cyprosulfamide)、二 氣丙稀胺（dichlormid)、迪賽隆（dicyclonon)、迪艾索諾 (dietholate)、解草。坐（fenchlorazole)、解草。定（fenclorim)、 解草安（flurazole)、將草安（fluxofenim)、D夫喃解草唾 (furilazole)、雙苯D惡嗤酸（isoxadifen)、D比。坐解草自旨 (mefenpyr)、甲苯諾（mephenate)、萘二甲酸針、解草腈 (oxabetrinil)、4-(二氣乙醯基）―卜氧雜_4_氮螺[4 5]癸烷 (MON4660，CAS 71526-07-3)及 2,2,5-三曱基-3-(二氣乙醯 基）-1,3-噁唑啶（R-29148，CAS 52836-31-4)。 在一些實施例中，本文中除草組合物可包含例如以下之 組合：生長素除草劑，例如麥草畏；AHAS抑制劑，例如 咪唑啉酮及/或磺醯脲；制劑；制劑， 例如草甘膦；麩胺醯胺合成酶抑制劑，例如固殺草；原卟 啉原-IX氧化酶（PP0)抑制劑，例如嘧啶肟草醚；殺真菌 劑，例如嗜毬果傘素殺真菌劑，諸如百克敏 (Pyracl〇Str〇bin);及其類似物。在—些實施例中，本文中 除草組合物可包含例如以下之組合：生長素除草劑，例如 麥草畏，微管抑制劑除草添丨丨，办丨l 刊剞陈旱M，例如二曱戊樂靈及嗜毯果傘 素殺真菌劑，諸如百券鍁。w替 曰兄敏。除卓組合物將根據本文中植物 之对受性加以選擇，且植物 』兀其係選自具有堆疊耐受性 150569.doc -129- 201113376 狀之植物。 如本發明中所述之除草劑可以個別方式及/或組合方式 用作預混劑或桶混製劑。此等除草劑亦可併入農藝:上可 接受之組合物十。 Μ Μ㈣㈣上提及之除草劑及/或 安全劑能夠形成幾何異構體，例如Ε/ζ異構體。有可能在 本發明組合物中使用純異構體與其混合物兩者。此外，一 些以上提及之除草劑及/或安全劑具有-或多個對掌性中 心’因此以對映異構體或非對映異構體形式存在。有可# ΐ=Γ物中使用純對映異構體及非對映異構體與： 二掌言之一些芳氧基苯氧丙酸醋除草劑具 式力乂/U —些通常以對映異構性增濃或對映純形 “上用，例如块草酸、赛伏草一。〜)、精嗯嗤禾 固殺草;==ΤΖ一… Ρ)加以使用。 對映純形式（亦稱為固殺草- :=此項技術者將認識到以上提及之除草劑及/或安全 轉明㈣生物（例如農學上適合之鹽及醋）皆可用於實施 喷灌、劑、或包含其之除草組合物可藉助於 入 化、散佈、喷水或種子處理或與種子混 以下列形式加以使用··即喷灑水溶液、 "液、以及高度濃縮水性、油性或其他懸浮液或分散液： I50569.doc 201113376 乳液、油性分散液、_、_ 1於播撒之物質、或顆 粒劑。使㈣式視預定目的而定；在任何情況下其皆應確 保本發明活性成份之儘可能精細的分佈。 除卓組合物包含险^ ® >, . '、里之至少一種乙醯輔酶Α叛化 酶抑制性除草劑及潜·在1^ # 士，„ 千汉，日在具他除卓劑及/或安全劑及慣用於 調配作物保護劑之助劑。 ' It用於凋配作物保護劑之助劑的實例為惰性助劑、固體 載劑、介面活性劑(諸如分散劑、保護性膠體、乳化劑、 濕潤劑及增黏劑）、有機及無機增稠劑、殺細菌劑、防床 劑、消泡劑'視情況選用之著色劑及對種子調配物而言的 黏著劑。熟習此項技術者充分熟悉此等調配物之配方。 增稠劑（亦即，賦予調配物改變之流動性質（亦即在靜止 狀態下為高黏度且在運動狀態下為低黏度）的化合物）之實 例為多醋’諸如三仙膠（來自Kelc〇2Kelzan⑧）、Rh〇d〇p〇1⑧ 23(Rhone P〇ulenc)或 Veegum②（來自 R T Vanderbih);以及有 機及無機層狀礦物，諸如Attaclay(g)(來自Engelhardt)。 消泡劑之實例為聚矽氧乳液（諸如，siHk〇n⑧Sre， Wacker或來自Rhodia之Rhodorsil®)、長鏈醇、脂肪酸、脂 肪酸鹽、有機氟化合物及其混合物。 可添加殺細菌劑來穩定水性除草調配物。殺細菌劑之實 例為基於二氯酚及苄醇半縮甲醛之殺細菌劑（來自iCI之 Proxel®或來自 Thor Chemie之 Acticide® RS及來自Rohm & Haas之Kathon® MK);以及異噻唑啉酮衍生物，諸如烷基 異°塞°坐琳酮及苯並異π塞唾淋酮（來自Thor Chemie之Acticide 150569.doc -131 - 201113376 MBS)。 防床劑之貫例為乙二醇、丙二醇、尿素或甘油。 著色劑之實例為水微溶性顏料及水溶性染料兩者。可提 及之實例為在以下名稱下已 D、广了士 旳木料.右丹明B(Rh〇damin B)、C.1·顏料紅112及C.I.溶劑红丨、以s s …、工1以及顏料藍15:4、顏料 & 15·3、顏料藍15:2、顏料藍15.丨、顏 --u.i錤抖藍80、顏料黃卜 顏料頁13、顏料紅112、 、 叶，48_2顏料紅48:1、顏料紅 57_1、顏料紅53:1、顏料橙43、顏料 , 顏村役34、顏料橙5、顏料 、·表3 6、顏料綠7 '顏料白6、 湄枓栋25、鹼性紫1 0、鹼性紫 49、酸性紅51、酸性紅52、 、 f主、14、酸性藍9、酸性音 23、鹼性紅、鹼性紅108。 、 黏者劑之實例為聚乙烯吡 4眾乙酸乙烯酯、聚乙 烯酵及甲基纖維素（tylose)。 適合惰性助劑為例如以下者. 此丄红 卜者.具有中等至較高沸點之礦 物油館份’諸如煤油或柴油；此 Γ兩煤焦油及植物或動物 油；脂族、環狀及芳族煙’例如石蠛、四氫蔡、烧 基化萘及其衍生物、烧美化贫 初烷基化本及其衍生物；醇，諸如甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇及環己醇；_，諸如環己酮；或強 極性溶劑，例如胺’諸如Ν-甲基吡咯啶嗣；及水。 包括㈣及固體載劑。液體載劑包括例如非水 性浴劑’諸如環烴及芳族炉 ^ 方族焱例如石蠟、四氫萘、烷基化 減其衍生物、烧基化苯及其衍生物；醇，諸如甲醇 '乙 J 醇了酉子及％己醇，_，諸如環己酮；強極性溶 例如胺，諸如Ν-甲基料。定_;及水以及其混合物。 150569.doc •132· 201113376 固體載劑包括例如礦物土，諸如二氧化矽、矽膠、矽酸 鹽、.滑石、高嶺土、石灰石、石灰、白堊、紅玄武土、黃 土、黏土、白雲石、矽藻土、硫酸鈣、硫酸鎂及氧化鎂、 研磨合成材料；肥料，諸如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨及尿 素，及植物來源產品，諸如縠粕、樹皮粉、木屑及堅果殼 粉、纖維素粉或其他固體載劑。 適合介面活性劑（佐劑、濕潤劑、增黏劑、分散劑以及 乳化劑）為芳族磺酸（例如木質素磺酸（例如B〇rrespers型，
Borregaard)、齡項酸 '萘續酸（Morwet型，Akzo Nobel)及 二丁基萘磺酸（Nekal型，BASF AG))及脂肪酸之鹼金屬 鹽、驗土金屬鹽及銨鹽；烷基磺酸鹽及烷基芳基磺酸鹽； 炫基硫酸鹽；月桂基醚硫酸酯及脂肪醇硫酸酯；及硫酸化 十六醇、十七醇及十八醇之鹽、以及脂肪醇二醇醚之鹽； 續化萘及其衍生物與曱醛之縮合物；萘或萘磺酸與苯酚及 曱搭之縮合物；聚氧乙烯辛基酚醚；乙氧基化異辛基酚、 辛基酚或壬基酚；烷基苯基或三丁基苯基聚乙二醇醚；烷 基芳基聚醚醇；異十三烷基醇；脂肪醇/環氧乙烷縮合 物；乙氧基化蓖麻油；聚環氧乙烷烷基醚或聚環氧丙烷烷 基喊；月桂醇聚乙二醇醚乙酸酯；山梨糖醇酯；木質素亞 硫酸鹽廢液及蛋白質；變性蛋白質；多膽（例如曱基纖維 素）；疏水性改質澱粉；聚乙稀醇（Mowiol型，Clariant); 聚羧酸酯（BASF AG，Sokalan型）；聚烷氧基化物；聚乙烯 胺（BASF AG，Lupamin 型）；聚乙二亞胺（BASF AG，
Lupasol型）；聚乙烯吡咯啶酮及其共聚物。 150569.doc -133- 201113376 可藉由將活性成份連同固體載劑一起混和或相伴研磨 (concomitant grinding)來製備散劑、用於播撒之物質及粉 劑0 +例如塗佈顆㈣丨、浸潰顆粒劑及均㈣脉狀顆粒劑可 藉由使活性成份結合至固體載劑來製備。 水性使用形式可自乳液濃縮物、懸浮液、_或可渴性 散劑或水可分散顆粒劑藉由添加水來製備。為製備乳液、 糊劑或油性分散液’原樣或溶解於油或溶劑中之除草組合 物可藉助於濕潤劑、增黏劑、分散劑或乳化劑在水中均質 化。或者’亦有可能製備包含活性化合物、濕潤劑、Μ 劑、分散劑或乳化劑及（適當時）溶劑或油之濃縮物， 於用水稀釋。 〃 役剌雜单之方法 本發明的耐除草劑之植物可與其能耐受之除草劑結合1 用。可使用熟習此項技術者已知之任何技術來對本發明 植物施㈣㈣。料射在植㈣ j 施用。舉例而言，除草劑可在種植前'種植時、出= 出田後施用或以其組合方式施用。 ^中除草劑組合物可例如以葉處理劑、土壤處理劑 -i Γ理劑或土㈣服劑（S°H dr_h)形式施用。可例士 粉塵化、播撒或已知適用於此項技術中… 八他杈式來進行施用。 耐Sr㈣中，除草射用於㈣可發現正在本發明^ 之植物附近生長之雜草的生長。在此類型之實旋 150569.doc •134- 201113376 例中，除草劑可施用至正生長有本發明之耐除草劑之植物 的雜草附近的地塊。本發明的耐除草劑之植物能耐受之除 草劑可接著以足以殺傷或抑制雜草生長之濃度施用至該地 塊。足以殺傷或抑制雜草生長之濃度在此項技術中為已知 的。 一般熟習相關技術者將容易瞭解，對本文所述之方法及 施用的其他適合之修改及?文變為_而易㈣且可在不脫離 本發明或其任何實施例之範疇的情況下作出。 描述了本發明後，冑由參考以下實例可對本發明有更早2 ㈣實㈣出於㈣目的而被隨同包括且不 限制本發明。 ~ 使用組織培養來選擇除草劑 除草劑耐受作物提供農民管理雜草之其他選擇。目前， 在一些作物系統中存在可用的遺傳修飾（GM⑺解決方案。 其他突變技術已用於選擇賦予除草劑抗性之經改變酵素、 活性或結構，諸如當前BASF2 CLEARFIELiy解決方案。 在美國，（:LEARFIELD稻為管理受侵染區域中紅米之首要 工具（USDA-ARS ’ 2006);，然而，紅米與⑽鑛工助稻 之間的基因流（gene flow)表示AHAS耐受性之可觀風險， 因為已報導異系雜交（out-crossing)多達17〇個^雜種/公頃 (ShWrain等人’ 2007)。管理準則包括在許多其他態樣中交 替非CLEARFIELD稻可限制CLEARFIELD稻市場摻透 (market penetration)。對不同作用模式（m〇a)除草劑具有 耐受性之栽培稻的產生將降低此等風險且為雜草管理提供 150569.doc -135- 201113376 更多工具。 一種許多不同禾本科除草劑已乾向之酵素為乙醯輔酶A 叛化酶（AWEC6,4.1.2)，其催化脂肪酸（FA)生物合 成中之第一關鍵步驟。芳氣其贫条工从 方軋暴本氧丙酸酯（APP或FOP)及 環己二酮（⑽或麵)型除草劑在雙子葉植物作物出苗後 使用’但在稻中選擇性控制草地雜草之丁基赛伏草除外。 此外，大多數此等除草劑在土壤中具有相對較低之持久性 且提供種植者雜草控制及作物輪作（⑽p __之靈活 性。已知此酵素中之突變料對特定組之咖及/或讓之 耐受性（Liu等人，2007; Delye等人’ 2〇〇3 2〇〇5)。 組織培養提供一種替代方法，癒傷組織之單一塊表示成 百或甚至上千個細胞，各細胞皆可針對新顆性狀（諸如除 草劑抗性）選擇（Jain，2〇01)。在組織培養中自發或某種誘 導所發生的犬變可直接在培養及所選突變事件中選擇。 利用活體外組織培養技術固有之體細胞系變異（soma-clonal variation) 已 為一種選擇性 產生賦 予玉米 （s〇mers， 1996，Somers等人，1994 ; Marshal等人，1992 ; Parker等 人，1990)及海濱雀裨（seash〇re paspalum)(Heckart等人， 2009)DIM及FOP耐受性之突變的成功方法。就玉米而言， 可計算產生可再生事件之效率。在8〇1116„等人，1994中， 使用組織培養選擇獲得西殺草抗性玉米植物。彼等利用 100 g癒傷組織，在以0.5、1.〇、2.0、5.0及10 μΜ西殺草逐 步選擇之後獲得2個耐受性株系。其方案中之計算突變率 為每100公克癒傷組織2個株系或每公克癒傷組織〇.〇2個株 150569.doc -136. 201113376 系。 就海濱雀稗而言，Heckert直接利用高量之西殺草以 約10,000個癒傷組織片回收3個可再生株系，戍本質上 0.03%比率。儘管不可類比，但是此等數目稍後將用於與 稻組織培養誘變比較。在玉米研究中’在各選擇階段不斷 淘汰癒傷組織，僅生長之癒傷組織轉移；然而，就海濱雀 稗而言，所有癒傷組織皆在各繼代培養（subculture)轉移。 作為可選擇標記物之ACCase基因： 植物轉型涉及使用可選擇標記基因以自較大群非轉型細 胞或個體鑑別少數轉型細胞或個體。可選擇標記基因存 在’但其數目及可用性有限。替代標記基因為堆疊性狀所 需。此外’通常需要使用賦予農藝學性狀（亦即除草劑抗 性）之可選擇標記基因。本發明揭示作為可選擇標記物之 ACCase基因’其可添加至當前有限組之可用可選擇標記 基因中。任何本文所述突變體皆可引入具有相關基因之質 體中且轉型入完整植物、植物組織或植物細胞中用作可選 擇標記物。一種詳細方法概述於下文實例7中。可利用本 發明可選擇標記物來產生賦予田地对受既定群組除草劑之 事件及其他已顯示交叉保護（cross protection)(亦即FOP交 叉保護）之事件。 現代高通量植物轉型系統需要有效可選擇標記物系統； 然而’市場上可接受之可用數目有限。因此，亦傳達商業 性狀之選擇系統總有價值。本文所述系統為植物細胞中或 用於植物細胞之有效選擇系統，該等植物細胞亦編碼適用 150569.doc -137- 201113376 於任何單子葉作物中之除草劑财受性狀。 在實化例中’本發明提供選擇經轉型植物之方法，其 包含將編石馬相關基因之核酸分子引入植物細胞中，其中該 核醚刀子另外編碼胺基酸序列在一個胺基酸位置處不同於 相應野生型稻植物之ACCase胺基酸序列的突變體乙醯輔 酶A叛化酶（ACCase);及用ACCase抑制劑接觸該等植物細 胞以獲得經轉型植物，其中當該突變體ACCase表現於該 經轉型植物中時，其賦予該經轉型植物相較於相應野生型 品種之植物增高的除草劑耐受性。 在一貫施例中，本發明提供標記物輔助育種之方法，該 方法包含使任何本發明之植物與第二植物配種；且用 ACCase抑制劑接觸育種步驟之子代以獲得包含該突變體 ACCase之子代；其中該突變體ACCase賦予子代植物相較 於第二植物增高的除草劑耐受性。 在一實施例中，單一 ACCase基因被連接至單一相關基 因。ACCase基因可連接於相關基因之上游或下游。 在一實施例中，本發明提供如上所述之ACCase核酸及 蛋白質在診斷檢定中之用途。本文所述的可選擇標記物之 診斷用途可用於鑑別ACCase基因。診斷方法可包括pCR方 法、蛋白質檢定、經標記探針、及此項技術中已知之任何 其他標準診斷方法。 實例 實例1 組織培養條件 I50569.doc 138- 201113376 已開發出一項活體外組織培養誘變檢定來分離及表徵能 耐受乙醯輔酶A羧化酶抑制性除草劑（例如得殺草、環殺草 及西殺草）之植物組織（例如稻組織）。該檢定利用存在於活 體外組織培養中之體細胞系變異。源自體細胞系變異之自 發突變可藉由化學誘變及隨後以逐步增加除草劑濃度之方 式進行的選擇來增強。 本發明提供促進可再生之脆弱、胚芽發生性稻癒傷組織 生長的組織培養條件。癒傷組織起始於涵蓋蓬萊稻（臺北 309(Taipei 309)、日本晴（Nipponbare)、越光（Koshihikari)) 與在來稻（在來稻1)品種兩者之4個不同稻栽培品種。將去 殼種子在70%乙醇中進行表面滅菌約1分鐘，隨後用20%商 用Clorox漂白劑處理20分鐘。用無菌水沖洗種子且塗在癒 傷組織誘導培養基上。測試了各種癒傷組織誘導培養基。 所測試培養基之成份清單呈現於表2中。 表2
成份 供應商 R001M R025M R026M R327M R008M MS711R B5維生素 Sigma 1.0 x MS鹽 Sigma 1.0 x 1.0 x 1.0 x 1.0 x MS維生素 Sigma 1.0 x 1.0 x N6鹽 Phytotech 4.0 g/L 4.0 g/L N6維生素 Phytotech 1.0 x 1.0 x L-脯胺酸 Sigma 2.9 g/L 0.5 g/L 1.2 g/L 酪蛋白胺基酸 BD 0.3 g/L 0.3 r/L 2g/L 路蛋白水解產物 Sigma 1.0 r/L 單水合L-Asp Phytotech 150 mg/L 辂驗酸 Sigma 0.5 mg/L 鹽酸nb哆醇 Sigma 0.5 mg/L 鹽酸維生素B1 Sigma 1.0 mg/L 肌醇(myo-inositol) Sigma 100 mg/L MES Sigma 500 mg/L 500 mg/L 500 mg/L 500 mg/L 500 mg/L 500 mg/L 麥芽糖 VWR 3〇g/L 3〇g/L 3〇g/L 30g/L 山梨糖醇 Duchefa 3〇g/L 蔗糖 VWR 10g/L 3〇R/L NAA Duchefa 50 Mg/L 2,4-D Sigma 2.0 mg/L 1.0 mg/L •139· 150569.doc 201113376
成份 供應商 R001M R025M R026M R327M R008M MS7I1R MgCl2-6H20 VWR 750 mg/L —pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.7 水晶洋菜(Gelrite) Duchefa 4.0 £/L 2.5 g/L 1型瓊脂糖 Sigma 7.0 S/L l〇s/L 10s/L —高壓滅菌 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 20 min 活動素(Kinetin) Sigma 2.0 mg/L 2.0 mg/L NAA Duchefa 1.0 mg/L 1.0 mg/L ΑΒΑ Sigma 5.0 mg/L 頭孢噻肟 (Cefotaxime) Duchefa 0.1 g/L 0.1 g/L o.l g/L 萬古擻素 (Vancomycin) Duchefa 0.1 r/L o.l g/L o.l s/L G418二硫酸鹽 Sigma 20 mg/L 20 mg/L 20 mg/L 在測試多種變化形式之後選擇R001M癒傷組織誘導培養 基。使培養物在30°C下保持在黑暗中。在10-14天之後在 新鮮培養基中對胚芽發生性癒傷組織進行繼代培養。 實例2 对除草劑之癒傷組織之選擇 一旦確定組織培養條件後，即經由在環殺草、得殺草、 西殺草（圖1)或氟。比禾靈（未圖示）殺傷曲線中分析組織存活 率來進一步確立選擇條件。對除草劑在組織中之累積以及 其在細胞及培養基中之持久性及穩定性進行仔細考量。經 由此等實驗，確立了用於初始選擇突變材料的次致死劑 量。 在確立西殺草、環殺草、得殺草及氟吼禾靈在選擇培養 基中之起始劑量之後，以逐步增加每次轉移之ACCase抑 制劑濃度直至回收在中毒劑量存在下旺盛生長之細胞的方 式來選擇組織（參見圖2)。每3-4週在含有選擇試劑之 R001M中對所得癒傷組織進行進一步繼代培養。使超過 26,000個癒傷組織經受4-5次繼代培養之選擇直至選擇壓力 150569.doc -140- 201113376 超過如根據殺傷曲線及連續培養之觀測結果所確定的中毒 量。中毒量經確定為5〇μΜ西殺草、2〇 μΜ環殺草、2.5 μΜ 得殺草（圖1)及1 〇 μΜ氟吡禾靈（未圖示）。 . 或者’液體培養物起始於緩慢振盪及每週繼代培養下之 於MS711R(表2)中的癒傷組織。一旦形成液體培養物後， 即直接添加選擇試劑至各繼代培養之燒瓶中。在2_4輪液 體選擇之後，將培養物轉移至固體R001M培養基上之濾紙 上以進一步生長。 植物之再生 使耐文性組織再生且對ACCase基因序列突變進行分子 表徵及/或對選擇試劑存在下改變之ACCase活性進行生物 化學表徵。 在除草劑選擇之後，使用以下培養基方案再生癒傷組 織· R025M ’ 10-14 天；r〇26M，、約 2週；R327M，直至產 生完全成形之芽；及R_s，直至芽良好生根以轉移至溫 室（表2)。再生在光照下進行。在再生期間不包括選擇試 劑。 一旦形成強健的根’即將M〇再生物移植至溫室内4"方 盆中的補充有石膏之砂、Nc砂丘壤質土及⑽土⑽仏 _Χ2:4:6)之混合物中。使移植㈣持在透明㈣杯下 直至其適應溫室條件（約丨週）^溫室經設定為 7C/21C(80F/70F)之曰/夜循環，用6〇〇w高壓鈉燈補充 光以保持Μ小時之日長。視天氣而定對植物—天喷水^ 150569.doc -141 · 201113376 次且每日施肥。將選用於種子繁殖（seed increase)之稻植 物移植於1加侖之盆中。當植物接近成熟且準備結實時’ 將盆置放於少許浸水的淺苗床中以便更好地維持水及營養 傳遞。針對昆蟲及植物健康監測植物且根據標準害蟲綜合 管理（Integrated Pest Management)規範進行管理。 實例4 序列分析 自經分離以用於移植之純系植物收集葉組織且作為個體 加以分析。使用Wizard® 96磁性DNA植物系統套組 (Wizard® 96 Magnetic DNA Plant System kit，Promega， 美國專利第6,027,945及6,368,800號），如製造商所指示來 提取基因組DNA。使用一個正向及一個反向引子對經分離 DNA進行PCR擴增。 正向引子：
OsACCpU5142: 5,-GCAAATGATATTACGTTCAGAGCTG-3, (SEQ Π)ΝΟ:7)
OsACCpU5205: 5，-GTTACCAACCTAGCCTGTGAGAAG-3’（SEQ ID NO: 8) 反向引子：
OsACCpL7100: 5，-GATTTCTTCAACAAGTTGAGCTCTTC-3’（SEQ ED NO: 9)
OsACCpL7054: 5，-AGTAACATGGAAAGACCCTGTGGC-3,（SEQ ID NO: 10) 使用Hotstar Taq DNA聚合酶（Qiagen)，使用如下遞減 (touchdown)熱循環程式進行PCR擴增：96°C，15分鐘；隨 後35個循環（96°C，30秒；每個循環58t-0.2°C，30秒； 72°C，3分鐘及30秒）；72°C，10分鐘。 經由瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物之濃度及片段尺寸。 150569.doc -142- 201113376 使用PCR引子（DNA Landmarks)經由直接序列來分析去鱗 酸化 PCR產物。使用 Vector NTI Advance 10TM(Invitrogen) 分析層析圖跡線檔案（.scf)中相對於〇s〇5g〇295300之突 變。基於序列資訊，在若干個體中鑑別出兩個突變。 Il，781(Jm)L及D2,078〇4m)G以異型接合狀態存在。基於代 表性層析圖及具有内定設置值且經編輯以調用副峰 (secondary peak)之相應AlignX比對進行序列分析。 與ACCase突變不一致之樣本經喷灑測試耐受性且作為 野生者（escape)加以丟棄。令人驚奇的是，大多數回收株 系對於11，78 1 MmjL突變為異型接合的且使用環殺草或西 殺草在所有測試的基因型中皆產生抗性事件：在來稻 1 〇 1 8株系）、臺北3 09〇 14株系）、日本晴（>3株系）及越光 (26株系）。一個株系對於D2,078(〇4…g突變為異型接合 的。D2,078(^m)G異型接合子株系顯現長得矮小（葉子狹 小），而Il，781MmJL異型接合子外觀有差異，但是大多數 相對於其親本基因型看來正常。回收了若干野生者且藉由 疋序及噴灑測試加以確認；然而，ACCase之除草劑敏威 區之定序結果顯示大多數耐受性突變體對於 Il，781^4m)L、I1，781(^W)A 至 Il，781(^mJT突變為異型接合 的（參見表3)。一個株系〇sArwI010對於D2,078(04m)G、 D2,078(^mjA至D2,078MmjG突變為異型接合的。迄今為 止，缺乏ACCase突變之所有回收植物皆在溫室中對除草 劑施用敏感。 150569.doc •143· 201113376 表3 :經由組織培養選擇回收之稻株系之基因型
株系 親本基因型 稻類型 鑑別之突變 ATCC®專利寄存編號 OsARWIl 在來稻1 在來稻 l\lU(Am)L PTA-10568 OsARWB 在來稻1 在來稻 \\n\(Am)h PTA-10569 OsARWI8 在來稻1 在來稻 \\n\(Am)h PTA-10570 OsARWIlO 在來稻1 在來稻 D2078 ㈣ G NA，無菌 OsARWI15 在來稻1 在來稻 11781 ㈣ L ΝΑ OsHPHI2 在來稻1 在來稻 \\n\(Am)L PTA-10267 OsHPHI3 在來稻1 在來稻 \m\(Am)L NA OsHPHI4 在來稻1 在來稻 \m\(Am)L NA OsHPHKl 越光 蓬萊稻 11781 ㈣L NA OsHPHK2 越光 蓬萊稻 l\n\(Am)L NA OsHPHK3 越光 蓬萊稻 1178 If圳 L NA OsHPHK4 越光 蓬萊稻 11781 ㈣ L NA OsHPHK6 越光 蓬萊稻 \\n\(Am)h NA OsHPHNl 曰本晴 蓬萊稻 11781 fAmJL PTA-10571 OsHPHTl 臺北309 蓬萊稻 11781 ㈣L NA OsHPHT4 臺北309 蓬萊稻 11781 ㈣ L NA OsHPHT6 臺北309 蓬萊稻 11781 ㈣L NA 實例5 除草劑耐受性之證明 將所選突變體及野生者轉移至小盆中。使紅米之野生型 栽培品種及3個生物變種自種子萌芽以充當對照。 在移植後約3週之後，使用執道式噴麗器（track sprayer) 以補充有0.1%甲基化種子油之400-1600公克活性成份/公 頃之環殺草（BAS 517H)喷灑M0再生物。在植物已適應溫 室條件之後，用800公克活性成份/公頃之環殺草喷灑子組 (subset)。一旦經喷麗，即將植物保持在乾旱條件下24小 時，隨後再次喷水及施肥。對經噴灑植物進行拍照且對處 理後1週（圖3)及2週（圖4)之除草劑損傷評定等級。對含有 11,78 1 異型接合突變之植物未觀測到損傷，而對照 150569.doc -144- 201113376 植物及組織培養野生者（對於所定序突變為陰性之再生植 物）在處理之後損害嚴重（圖3及4)。圖5-15提供各種植物之 乙醢輔酶A羧化酶之核酸及/或胺基酸序列。圖17提供展示 突變體稻相對於各種ACCase抑制劑之結果的圖。 實例6 使用組織培養之除草劑選擇 根據用途及如上所述產生之殺傷曲線選擇培養基。對於 選擇’利用不同技術。應用逐步選擇，抑或應用即刻致死 畺之除草劑。在任一情況下，所有癒傷組織皆經轉移以供 各新一輪的選擇。選擇為培養之4_5次循環，各循環持續3_ 5週。將癒傷組織置放在耐綸膜上以促進轉移（2〇〇微米孔 薄片，Biodesign，Saco，Maine)。膜經切割以適合 1〇〇χ2〇 mm皮氏培養皿（Petri心)且在使用前高壓丨咸菌每個培養 盤中利用25_35個癒傷組織（每個癒傷組織之平均重量為22 mg)。此外，使一組癒傷組織在液體培養基中經受選擇， 每週進行繼代培養’隨後在半固體培養基中作進一步選 使用環殺草或西殺草在4鍤 種不同稻基因型中選擇突變骨 株系。獲得突變體之效率 έ0 ^ λ, ^ χ 』丹生犬變體株系之瘢名 組織的百分比或如所利 -知 皆較高。缒之…“ 1克數確疋之株糸的數目言- 玉乎兔h 、 肩省稗為5倍且相較方 王未為2倍。在—些情況下 得多（>1〇倍）。 表4中所示，此差異要凑 J50569.doc -145- 201113376 表4 基因型 #癒傷組織 選擇 突變體 比率 重量(g) #/公克 癒傷組織 在來稻1 1865 環殺草 3 0.161% 41.04 0.07 在來稻1 2640 西殺草 3 0.114% 58.08 0.05 越光 1800 環殺草 6 0.333% 39.6 0.15 NB 3400 環殺草 1 0.029% 74.8 0.01 NB 725 西殺草 0 0.000% 15.95 0.00 T309 1800 環殺草 8 0.444% 36.9 0.20 T309 1015 西殺草 0 0.000% 22.33 0.00 總計 13245 21 0.159% 291.39 0.07 如表5中所示，若使用選擇準則分析資料，則有可能觀 察到環殺草選擇有助於獲得高於西殺草的經分離突變體比 率。 表5 基因型 #癒傷組織 選擇 突變體 比率 重量(g) #/公克 癒傷組織 在來稻1 1865 環殺草 3 0.161% 41.03 0.07 越光 1800 環殺草 6 0.333% 39.6 0.15 NB 3400 環殺草 1 0.029% 74.8 0.01 T309 1800 環殺草 8 0.444% 39.6 0.20 總計 8865 18 0.203% 195.03 0.09 在來稻1 2640 西殺草 3 0.114% 58.08 0.05 NB 725 西殺草 0 0.000% 15.95 0.00 T309 1015 西殺草 0 0.000% 22.33 0.00 總計 4380 3 0.068% 96.36 0.03 使用此分析，環殺草比率幾乎比使用西殺草選擇之任一 前述報導高10倍，而使用西殺草選擇之比率類似於先前報 導之彼等者。此外，相較於選擇係針對西殺草時之21%株 系，選擇係針對環殺草時有68%株系經證實為突變體。增 加似乎由使用環殺草代替西殺草作為選擇試劑所致。此 外，在繼代培養期間使用膜使癒傷組織之轉移顯著地比以 -146- 150569.doc 201113376 個別方式移動各碎片容易。獲得了超過20個突變體。繁殖 力似乎較高’但具有已知導致適應度損失之突變 (D2,078(^4m>G)的一個突變體除外。 實例7 突變體ACCase基因作為可選擇標記物在植物轉型中之 * 使用 方法： 基本上如Hiei及Komari(2008)所述進行在來稻1及日本晴 柄癒傷組織轉型，但正如所述對培養基作替換（詳見所附 培養基表）。對癒傷組織在R001]VI培養基上誘導4-8週，隨 後用於轉型中。所用土壤桿菌為用RLM185(L Mankin，未 公開：含有DsRed及突變體AHAS以用於選擇）、含有 I1781(^w)L 之 ACC基因、含有 ii781(^m)L及 W2027C 之 ACC基因、含有i1781(^w几及I2041(0iw)N之ACC基因或含 有Π 781 A之ACC基因或亦含有用於選擇之突變體 AHAS基因之野生型轉型的LBA44〇4(pSB1)(Ishida等人 1996)。將在固體培養基上生長丨—3天之土壤桿菌懸浮於 LS 002培養基中且將〇£)66〇調整至約〇· 1。使癒傷組織潰浸 於土壤桿菌溶液中約30分鐘。移除液體，且接著將癒傷組 織移動至濾紙以在半固體稻“培養基上共培養。在24t下 在黑暗中進行共培養3天。將含有稻癒傷組織之濾紙直接 轉移至含有特美汀（Timentin)之R〇〇1]yu^養基中，持續1_2 週以供恢復且在3〇t下在黑暗中培養。將癒傷組織細分到 含有特美汀且補充有1 〇〇 μΜ咪草菸、1 〇 μΜ環殺草或2.5 150569.doc •147- 201113376 μΜ得殺草之新鮮膽⑽培養基上。在3_4週之t，將癒傷 組織轉移至新鮮選擇培養基。在又過了 3_4週之後，將生 長中之癒傷組織轉移至新鮮培養基且使其生長，隨後進行 Taqman分析。Taqman分析係針對n〇s終止子且加以進行以 提供所《傷組織之轉殖基因性質的分子確認。藉由在含 有10 μΜ%< &草或氣（禾靈' 2 5 _得殺草或 _味草 於之培養基上繼代培養癒傷纟續而量測轉殖基因癒傷組織 在各種選擇試劑下的生|。根據初始繼代培養之後及接著 在約1個月之生長之後的掃描影像來量測癒傷組織尺寸。 基本上如Lai等人（已提交）所述進行玉米纟成熟胚芽之轉 型。簡而言之，將未成熟胚芽與用於稻轉型之懸浮於m_ LS-002培養基中的同一土壤桿菌菌株共培養至〇d_【〇。 在22°C下在黑暗中於玉米cc培養基上共培養3天。自共培 養物移取胚芽且轉移至M_MS_1〇1培養基中，在27。〇下持 續4-7天。料應胚芽轉移至用於咪轉選擇2M_ls_2〇2 培養基或補充有1 μΜ環殺草或〇·75 μΜ得殺草2Mls_2i3 培養基中。培養胚芽2週且將生長中之癒傷組織轉移至第 二輪選擇，使用與前述才目同之培養&，但是環殺草選擇物 被增加至5 μΜ。將所選癒傷組織轉移至補充有5 μΜ環殺 草或0·75 μΜ得殺草之M_LS_5044M_LS_513培養基申且移 至光照（16小時/8小時，日/夜）下以進行再生。芽出現在2_3 週之間且轉移至含有補充有5 μΜ環殺草或〇75 μΜ得殺草 之M-LS-618或M-LS-613的Plantcon盒中以使芽進一步發育 及生根。對葉樣本進行Taqman分析。將陽性植物轉移至土 150569.doc -148- 201113376 壤中以進行生長及種子產生。在第二組實驗中，條件一 致，但得殺草選擇物在再生及芽及根形成期間減少至0.5 μΜ。在第三組實驗中，氟吡禾靈亦作為選擇試劑加以測 試。在此等實驗中，始終使用1 μΜ進行選擇。 結果及論述： 自使用含有11781(^_1^及\¥2027(^_(：之八(：(：基因以及 含有11781(^_[及12041(^所^^之八(：(：基因的在來稻1稻轉 型實驗獲得轉殖基因癒傷組織。在得殺草選擇之後自含有 I1781MmJL及W2027(^m)C之ACC基因獲得一個癒傷組織 且自含有11781(^_[及12041(^_]^之八(：(：基因獲得3個癒 傷組織。使用環殺草選擇自含有II 781 MmjL及12041 之ACC基因獲得一個癒傷組織。Nos Taqman顯示所有此等 癒傷組織皆為轉殖基因癒傷組織。針對在各種選擇試劑 (包括用作突變體AHAS可選擇標記物之咪草菸（普施特-P)) 下之生長對癒傷組織進行篩檢。 如可於表6中觀測出，除氟吼禾靈以外，雙重突變體構 築體亦允許在環殺草及得殺草兩者下生長。此等生長實驗 中之用量對於野生型材料為抑制性用量。 表6:轉殖基因在來稻1癒傷組織在各種選擇培養基上之 生長。生長係以在選擇培養基上培養1個月後尺寸變化之 %來量度。 選擇物μΜ 構築體 H10 CIO T2.5 P100 imi(Am)h > W2027^m；C 1669% 867% 1416% 739% I1781(^m；L ' l2041(Am)N 1613% 884% 1360% 634% 150569.doc -149· 201113376 第-組玉米實驗之結果顯示雙重突變體之兩種單— μ 體均可用於以相對較高的效率選擇環殺草抗性或環殺草: 得殺草抗性兩者（圖16)。 +我 選擇試劑之間的效率在此等實驗中相對類似，相較於並 施特選擇，單-突變體對環殺草之總效率可能略有增加: 然而，雙重突變體可具有略微增高之效率。非確認推 件之野生者比率-百分比對於環殺草或得殺草較低。此 外，在所述條件下，有可能使用得殺草選擇區分單— 體與雙重突變體。 < 類似結果已在第二組實驗中獲得(未展示)。在第三 財’氣°比禾靈亦為用於用單一或雙重突變體之轉^中的 有效可選擇標記物（未展示）。 單一突變體適用於使用, ^ 便用草或氟吡禾靈選擇之高效轉 i。其亦應適用於其你知M 人 於其他相關化合物，諸如西殺草。雙重突 .艾體適用於此等選擇試劑，外加可使用得殺草。單一及德 二=體可用於兩段轉型，因為單-突變體可用得殺草； 重突變體加以區分。與其他當前_選擇標記 錄。。’ 3k供㈣轉型單子葉植物且尤其玉米 兩種選擇。 如本文所述之除草劑耐受性表型亦已由其Accase抑制 =::在6°°公克/公頃環殺草處理下之一展 了t管上文已出於清晰度及理解之目的而相當詳細地描述 發明，但是熟習此項技術者在_本案之後應瞭解， I50569.doc 201113376 可在不偏離本發明及隨附申請專利範圍之真實料的情況 下對形式及細節作出各種改變。本文中引用之所有專利及 公開案皆以全文引用之方式併入本文t。 【圖式簡單說明】 圖1為展示源自在差異選擇用量之除草劑存在下生長之 亞洲栽培稻在來亞種（0ryza sativa subspu/c…的稻癒傷組 織之相對生長的條形圖。圖丨A展示由得殺草 獲彳于之結果，圖1B展示由西殺草㈤化⑽以丨⑷獲得之結 果’且圖1 C展示由環殺草獲得之結果； 圖2為用於產生耐除草劑之稻植物之選擇過程的圖； 圖3展不在用除草劑處理後一週所獲取之植物之相片； 圖4展示在用除草劑處理後兩週所獲取之植物之相片； 圖5 k供大穗看麥娘之乙醯輔酶a羧化酶之胺基酸序列 (GenBank 寄存編號 CAC84161); 圖6提供編碼大穗看麥娘之乙醯輔酶a羧化酶之 mRNA(GenBank 寄存編號 AJ310767 區域·· 157..7119); 圖7 A提供在來稻及蓬萊稻乙醯輔酶a羧化酶基因之基因 組核苷酸序列（SEQ ID NO: 5); 圖7B提供編碼在來稻及蓬萊稻乙醯輔酶A羧化酶之核菁 酸序列（SEQ ID NO: 6); 圖7C提供在來稻乙醯輔酶a羧化酶之胺基酸序列（SEQ ID NO: 3)； 圖8A提供編碼玉米（Zea mays)乙醯輔酶A叛化酶之核苦 酸序列（SEQ ID NO: 11); 150569.doc -151 - 201113376 圖8B提供玉米乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序列（SEQ ID NO: 12)； 圖9A提供編碼玉米乙醯輔酶a羧化酶之核苷酸序列（SEq ID NO: 13)；
圖9B提供玉米乙醯輔酶a羧化酶之胺基酸序列（SEq ID NO: 14)； 圖10A提供編碼普通小麥（心出⑶所乙醯輔酶a 羧化酶之核苷酸序列（SEQ ID NO: 15); 圖10B提供普通小麥乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序列 (SEQ ID NO： 16)； 圖11A提供編碼小米乙醯輔酶八羧化酶之 核苦酸序列（SEQ ID NO: 1 7); 圖11B提供小米乙醯辅酶A羧化酶之胺基酸序列（seq a NO: 18)； 圖12A提供編碼小米乙醯輔酶A羧化酶之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 19)； 圖12B提供小米乙醯辅酶績化酶之胺錢序列⑽q ι〇 NO: 20)； 圖1 3 A提供編碼小米乙酿輔疏a 'Ί* /ι_ . 砸顆羧化酶之核苷酸序列 (SEQ ID NO: 21)； 圖i3B提供小米乙醯辅酶績化酶之胺基酸序列（seq⑴ NO: 22)； 圖1 4 A提供編碼大穗看麥祕7a 百令娘乙醯輔酶A羧化酶之核苷酸 序列（SEQ ID NO: 23); 150569.doc -152- 201113376 圖148長：供大穗看麥娘乙醯輔酶a缓化酶之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 24)； 圖1 5A提供編碼粗山羊草乙醯輔酶a 羧化酶之核苷酸序列（SEQ ID NO: 25); 圖15Bk供粗山羊草乙醯輔酶a緩化酶之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 26)； 圖16提供單一突變體與雙重突變體之比較； 圖17提供展示突變體稻相對於各種ACCase抑制劑之結 果的圖； 圖18提供大穗看麥娘乙醯輔酶a羧化酶胺基酸序列 (GenBank寄存編號CAC84161)。在本發明之乙醯輔酶八竣 化酶中可加以改變之胺基酸以粗體雙下劃線指示；及 圖19提供野生型亞洲栽培稻乙醢輔酶a叛化酶與大穗看 麥娘乙醯輔酶A羧化酶比對之胺基酸序列，其中指示了 _ 些關鍵殘基。 150569.doc -153-

Claims (1)

  1. 201113376 七、申請專利範圍： 1 · 一種稻植物’其表現誘變或重組乙醯輔酶a羧化酶 (ACCase)，其中該胺基酸序列在胺基酸位置i，781(^一不 同於相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序 列’其中該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於 a亥相應野生型品種之植物增高的除草劑时受性。 2.如請求項1之植物，其中在位置U781(之胺基酸為白 胺酸。 3 ·如請求項1之植物，其中在位置i，78丨之胺基酸為丙 胺酸。 4.如請求項1之植物，其中在位置之胺基酸為纈 胺酸。 5·如請求項1之植物，其中在位置l，78iymj之胺基酸為蘇 胺酸。 6. 種稻植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶A羧化酶 (ACCase) ’其中該胺基酸序列在胺基酸位置1,999+ 同於相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序 列，其中該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於 野生型品種之該植物增高的除草劑财受性。 7. 如請求項6之植物，其中在位置1 999M岣之胺基酸為甘 胺酸》 8·如請求項6之植物，其中在位置1 999Μ_之胺基酸為半 胱胺酸。 9· 一種稻植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶A羧化酶 150569.doc 201113376 (ACCase)，其中該胺基酸序歹在胺基酸位置2,〇27<^m)不 同於相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序 列’其中該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於 野生型品種之該植物增高的除草劑财受性。 10. 如請求項9之植物，其中在位置2,0270m)之胺基酸為半 胱胺酸。 11. 如請求項9之植物，其中在位置2,〇27Mmj之胺基酸為精 胺酸。 12· —種稻植物’其表現誘變或重組乙醯輔酶a羧化酶 (ACCase)，其中該胺基酸序歹,j在胺基酸位置2,041 (04m；不 同於相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序 列’其中該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於 野生型品種之該植物增高的除草劑耐受性。 13.如請求項12之植物，其中在位置2,〇4IMm」之胺基酸為天 冬醯胺酸。 14·如請求項12之植物，其中在位置2,〇41Mm」之胺基酸為纈 胺酸。 15. —種稻植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶a羧化酶 (ACCase)，其中該胺基酸序歹ij在胺基酸位置2,096(04m；不 同於相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序 列’其中該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於 野生型品種之該植物增高的除草劑耐受性。 16. 如請求項15之植物，其中在位置2,096M…之胺基酸為丙 胺酸。 150569.doc 201113376 17. 如請求項15之植物’其中在位置2,〇96(之胺基酸為絲 胺酸。 18. —種稻植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶a羧化酶 (ACCase)，其中該胺基酸序列僅在以下一個位置不同於 相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序列： l,l^S(Am) ； l,786^m； ； \,%\\(Am) ； 2,0^9(Am)； 2,074M⑷；2,075(04m) ; 2,078Mm厂 2,08〇Mm)缺失； ;及2,098(^w)，其中該ACCase在該植物中表 現時賦予該植物相較於野生型品種之該植物增高的除草 劑财受性。 19_如請求項丨8之植物，其中該植物表現誘變或重組乙醯辅 酶Α羧化酶（ACCase) ’其中該胺基酸序列僅包含一個選 自由以下組成之群之取代：2,〇49(^_之異白胺酸、白胺 酸或苯丙胺酸；位置2,074(^…之白胺酸；位置 2,075Μ⑻之白胺酸、異白胺酸或曱硫胺酸，或位置 2,075Mmj重複；位置2,〇7864…之蘇胺酸、甘胺酸或離 胺酸；2,088(^4/^之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺 酸，及2,098Mm)之丙胺酸、組胺酸、脯胺酸、絲胺酸或 甘胺酸。 20.如請求項18之植物’其中該植物表現誘變或重組乙醯輔 酶A敌化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅包含一個選 自由以下組成之群之取代：位置1,785(〇4岣之甘胺酸；位 置1,786 64—之脯胺酸；及位置1，811(^岣之天冬醯胺 150569.doc 201113376 酸。 21 · —種稻植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶A羧化酶 (ACCase)，其中該胺基酸序歹|J僅在以下一個位置不同於 相應野生型稻植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺基酸序列： 2,039(Am) ； 2,059(Am) ； 2,0SQ(Am)；及 2,095(04w)，其中 該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於該相應野 生型品種之植物增高的除草劑财受性。 22. 如請求項2 1之植物，其中該植物表現誘變或重組乙醯輔 酶A羧化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅包含一個選 自由以下組成之群之取代：位置2,039(04m)之甘胺酸；位 置2,059(04~之纈胺酸；位置2,080(^~之麩胺酸；及位 置2,095M之楚胺酸。 23. —種表現誘變或重組質體之乙醯辅酶A羧化酶（ACCase) 之稻植物，其中該質體ACCase中僅一個胺基酸位置之突 變在該植物中表現時賦予該植物相較於相應野生型品種 之該稻植物增高的除草劑财受性。 24. 如請求項23之植物，其中該胺基酸位置係選自由以下組 成之群：l，785Mm」、l，786(^mj 、 l，811Mm」、 l,S24(Am) ' l,S64(Am) ' 2,039(Am) ' 2,049(Am) ' 2,059(Am) 、 2,074(Am) 、 2,075fAmJ 、 2,078fAmJ 、 2,019(Am) 、 2,0S0(Am) 、 2,0Sl(Am) ' 2,0SS(Am) ' 2,095(04mM2,098(^mJ ° 25. 如請求項23之植物，其中該突變體ACCase不為轉殖基因 者。 150569.doc 201113376 26. 如請求項1至22中任一項之植物，其中該等植物不為轉 殖基因植物。 27. 如請求項1至25中任一項之植物，其中該ACCase係由基 因組核酸編碼，且包含經修飾之SEQ m N〇: 2作為其胺 基酸序列，其中該等經修飾序列包含該修飾。 28. —種控制如請求項1至25中任一項之植物附近内雜草生 長的方法’其包含對該等雜草及植物施用抑制野生型植 物生長之量的乙醯輔酶A羧化酶抑制性除草劑。 29. 如請求項28之方法，其中至少一種除草劑係選自由以下 組成之群：亞汰草（alloxydim)、丁笨草酮（butroxy-dim)、姓草同（clethodim)、氯丙氧定（ci0pr0Xydim)、環 杀λ 草（cycloxydim)、西殺草（sethoxydim)、得殺草 (tepraloxydim)、三甲苯草酮（tralkoxydim)、氯拉寄普 (chlorazifop)、快卓酸（clodinafop)、卓丙酸（cl〇f〇p)、禾 草靈（diclofop)、°惡唾禾草靈（fenoxapr0p)、精。惡唾禾草 靈（fenoxaprop-P)、D塞嗤禾草靈（fenthiaprop)、°比氟禾草 靈（fluazifop)、精吡氟禾草靈（fiuazifop-p)、氟吡禾靈 (haloxyfop)、精氟吡禾靈（haloxyfop-P)、異噁草醚 (isoxapyrifop)、普拔草（propaquizafop)、啥禾靈 (quizalofop)、精喹禾靈（qUiZalofop-P)、曲伏普（trifop)及 唑嘴草酯（pinoxaden)或任何此等除草劑之農藝學上可接 受之鹽或酯，以一般可抑制野生型植物生長之除草劑之 量。 3 0. —種控制雜草生長之方法，其包含： 150569.doc 201113376 a. 使如凊求項1至25中任—工苜夕社l 貝之植物與其他植物種質 (germP】aSm)雜交，及收穫所得雜交種子； b. 種植該雜交種子；及 c. 對雜交植物及該雜交植物 又植物附近之雜草施用一般可抑制 野生型植物生長之除箪兩丨田θ & 羧化酶抑刺性除草劑 茛ι陈早4用I的一或多種乙醯輔酶Α 31. -種如請求項15_25中任一項之植物的植物細胞。 32. 一種如請求項】至25中任一項之植物的植物部分。 33. -種種子’其係由如請求項i至25中任一項之植物產 生0 34. -種產生雜交植物之方法，其包含用第二植物對如請求 項1至25中任一項之植物進行育種，其中該雜交植物展 現相較於該第二植物增高的除草劑耐受性。 35_ —種食品，其係由如請求項】至25中任一項之植物製 備。 3 6. —種消費品，其係由如請求項工至25中任一項之植物製 備。 37. —種工業產品，其係由如請求項i至25中任一項之植物 製備。 38. —種獸醫產品，其係由如請求項i至25中任一項之植物 製備。 3 9. —種經分離之重組或誘變之核酸分子，其編碼如請求項 1至25中任—項所述之AC Case。 40.種如凊求項3 9之核酸分子的用途，其係用作可選擇標 150569.doc 201113376 記物。 41·—種處理如請求項1至25中任一項之植物的方法，其包 含使該植物與農藝學上可接受之組合物接觸。 42. —種ΒΕΡ分枝系植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶八羧 化酶（ACCase) ’其中該胺基酸序列在胺基酸位置 1，781M岣不同於相應野生型bep分枝系植物之乙醯辅酶 A缓化酶之胺基酸序列’其中該ACCase在該植物中表現 時賦予該植物相較於該相應野生型品種之植物増高的除 卓劑耐受性。 43. 如請求項42之植物，其中在位置—之胺基酸為白 胺酸。 44_如請求項42之植物，其中在位置i，781(之胺基酸為丙 胺酸。 45_如請求項42之植物’其中在位置1，781(^/^之胺基酸為纈 胺酸。 46. 如請求項42之植物，其中在位置—之胺基酸為蘇 胺酸。 47. 種BEP分枝糸植物’其表現誘變或重組乙醯輔酶a緩 化S# (ACCase)，其中該胺基酸序列在胺基酸位置 1，99964岣不同於相應野生型BEP分枝系植物之乙醯辅酶 A羧化酶之胺基酸序列’其中該ACCase在該植物中表現 時賦予該植物相較於野生型品種之該植物增高的除草劑 耐受性。 48. 如請求項47之植物’其中在位置i，999MW之胺基酸為甘 150569.doc 201113376 胺酸。 49·如請求項47之植物，其中在位置1，999㈣之胺基酸為半 胱胺酸。 50. —種BEP分枝系植物，其表現誘變或重組乙醯辅酶a羧 化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列在胺基酸位置 2,027㈣不同於相應野生型BEp分枝系植物之乙酿輔酶 A羧化酶之胺基酸序列，其中該ACCase在該植物中表現 時賦予該植物相較於野生型品種之該植物增高的除草劑 耐受性。 51. 如請求項50之植物，其中在位置2,〇27(〇4㈣之胺基酸為半 胱胺酸。 52·如請求項50之植物，其中在位置2,027(^(岣之胺基酸為精 胺酸。 53· —種BEP分枝系植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶八羧 化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列在胺基酸位置 2,041Mmj不同於相應野生型bep分枝系植物之乙醯輔酶 A缓化酶之胺基酸序列’其中該ACCase在該植物中表現 時賦予該植物相較於野生型品種之該植物增高的除草劑 耐受性。 54.如請求項53之植物，其中在位置2,〇41(〇4w」之胺基酸為天 冬醯胺酸。 5 5.如請求項53之植物’其中在位置2,041 (04m)之胺基酸為缔 胺酸。 56_ —種BEP分枝系植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶a緩 150569.doc 201113376 化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列在胺基酸位置 2,096Mmj不同於相應野生型bep分枝系植物之乙醯輔酶 A羧化酶之胺基酸序列，其中該ACCase在該植物中表現 時賦予該植物相較於野生型品種之該植物增高的除草劑 耐受性。 57. 如請求項56之植物，其中在位置2,〇96以岣之胺基酸為丙 胺酸。 58. 如請求項56之植物，其中在位置2〇96(^w)之胺基酸為絲 胺酸。 59. —種ΒΕΡ分枝系植物’其表現誘變或重組乙醯辅酶a羧 化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅在以下一個位置不 同於相應野生型BEP分枝系植物之乙醯輔酶a羧化酶之 胺基酸序列：l，785(^m) ; l,786MmJ ; 1，811 ; 2,049fAmJ ； 2,074fAmJ ； 2,075(AmJ ； 2,078^m；； 2,08〇Μ«^ ; 2,08864mJ ;及 2,098Μ~，其中該ACCase在 該植物中表現時賦予該植物相較於野生型品種之該植物 增面的除草劑耐受性。 60. 如請求項59之植物，其中該植物表現誘變或重組之乙醯 辅酶A羧化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅包含一個 選自由以下組成之群之取代：2,049(04;^之異白胺酸、白 胺酸或苯丙胺酸；位置2,074(04 wj之白胺酸；位置 2,075Mwj之白胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸，或位置 2,075(^mj重複；位置2,07864m)之蘇胺酸、甘胺酸或離 胺酸；2,088之精胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甘胺 150569.doc 201113376 酸、組胺酸、離胺酸、白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺 酸；及2,098Mw)之丙胺酸、組胺酸、脯胺酸、絲胺酸或 甘胺酸。 61.如凊求項5 9之植物，其中該植物表現誘變或重組乙醯輔 酶A叛化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅包含一個選 自由以下組成之群之取代：位置1,785(^W之甘胺酸；位 置l，786(^mj之脯胺酸；及位置ι，811(〇4…之天冬醯胺 酸。 62‘一種BEP分枝系植物，其表現誘變或重組乙醯輔酶a羧化 酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅在以下一個位置不同於 相應野生型稻BEP分枝系之乙醯辅酶a羧化酶之胺基酸序 列：2,039如）；2,059如）；2,080(^m);及2,〇950m)。 63. 如請求項62之植物’其中該植物表現誘變或重組乙醯輔 酶A叛化酶（ACCase)，其中該胺基酸序列僅包含一個選 自由以下組成之群之取代：位置2,〇39(^w之甘胺酸；位 置2,059(04α^之纈胺酸；位置2,080(04w」之麩胺酸；及位 置2,095(04/^之麵胺酸。 64. 如請求項42至63中任一項之植物，其中該等植物不為轉 殖基因植物。 65. 如请求項42至63中任一項之植物，其中該BEp分枝系植 物為BET次分枝系植物β 66. 如請求項65之植物，其中該ΒΕΤ次分枝系植物為βετ作 物植物。 67. —種控制如請求項42至63中任一項之植物附近内的雜草 150569.doc •10· 201113376 生長的方法，其包含對料雜草及單子葉植物施用抑制 野生型植物生長之量的乙醯輔酶續化酶抑制性 劑。 ” 68. 69 70. 71. 72. 73. 士青求項67之方法’其中至少一種除草劑係選自由以下 組成之群：亞汰草、丁苯草酮、姓草同、氯丙氧定、環 殺草、西殺草、得殺草、三曱苯草酮、氣拉寄普、炔草 酸、草丙酸、禾草靈、噁唑禾草靈、精噁唑禾草靈、噻 唑禾草靈、吡I禾草靈、精吡I禾草靈 ' 敗吡禾靈、精 說°比禾靈、異°惡草喊、普拔草禾靈、精啥禾靈、曲 伏普及唑啉草酿或任何此等除草劑之農藝學上可接受之 鹽或醋，以一般可抑制野生型植物生長之除草劑之量。 一種控制雜草生長之方法，其包含： a·使如請求項42至63中任一項之植物與其他植物種質雜 交，及收穫所得雜交種子； b.種植該雜交種子；及 c.對雜交植物及該雜交植物附近之雜草施用一般可抑制 野生型植物生長之除草劑用量的一或多種乙酿輔酶A 叛化酶抑制性除草劑。 一種如請求項42至63中任-項之植物的植物細胞。 -種如請求項42至63中任一項之植物的植物部分。 一種種子’其係由如請求項42至63中任—項之稻植物產 生0 一種產生雜交植物之方法 其包含用弟二植物對如請求 其中該雜交植物展 項42至63中任一項之植物進行育種 -Π - 150569.doc 201113376 現相較於該第二植物增高的除草劑耐受性。 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 一種食品’其係由如請求項42至63中任—項之植物製 備0 一種消費品，其係由如請求項42至63中任—項之植物製 備。 -種工業產品’其係由如請求項42至63中任一項之 製備。 一種獸醫產品，其係由如請求項42至63中任一項之植 製備。 物 一種經分離之重組或誘變之核酸分子，其編螞如請求項 42至63中任一項所述之Accase。 一種如請求項78之核酸分子的用途，其係用作可選擇標 記物。 一種處理如請求項42至63中任一項之植物的方法，其包 含使该植物與農藝學上可接受之組合物接觸。 一種單子葉植物’其表現誘變或重組乙醯輔酶A羧化酶 (ACCase) ’其中該胺基酸序列僅在一個選自由以下組成 之群之胺基酸位置不同於相應野生型單子葉植物之乙醯 輔酶A羧化酶之胺基酸序列： a·位置l，781^4mj之胺基酸，其中位置i，78i(^w>)之胺基 酸不為白胺酸，且不為野生型胺基酸； b·位置l，999(^m)之胺基酸，其中位置l，99964w>之胺基 酸不為半胱胺酸，且不為野生型胺基酸； c.位置2,027(04…之胺基酸，其中位置2,027(04…之胺基 150569.doc -12- 201113376 酸不為半胱胺酸，且不為野生型胺基酸； d.位置2,041(^^^之胺基酸，其中位置2,04^^)之胺基 酸不為纈胺酸或天冬醯胺酸，且不為野生型胺基酸；及 e·位置2,096(^m)之胺基酸，其中位置2 〇96(^_之胺基 酸不為丙胺酸’且不為野生型胺基酸； 其中該ACCase在該植物中表現時賦予該植物相較於野 生型品種之該植物增高的除草劑耐受性。 8 2 ·如清求項8 1之植物，其中： 1，781 之差異為經丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸取代； l，999Mm」之差異為經甘胺酸取代；2,〇27(^m)之差異為 精胺酸；及2,096MmJ之差異為經絲胺酸取代。 83. —種單子葉植物’其表現誘變或重組乙醯輔酶a羧化酶 (ACCase) ’其中該胺基酸序列僅在以下一個胺基酸位置 不同於相應野生型單子葉植物之乙醯輔酶A羧化酶之胺 基酸序列： a. 選自由以下組成之群：i，785(^w) ; i,786mw); \,%\\(Am) ； 2,049^w； ； 2,014(Am) ； 2^15(Am)； 2,07864m) ; 2,081(04m) ; 2,088^4m);及 2,098(04/^ ;或 b. 選自由以下組成之群：2,039(0^) ; 2,059(^m); 2，Ο80M，及 2,095(^w」。 84_如請求項83之植物，其中： a.位置1，785之差異為經甘胺酸取代；位置 1，78664~之差異為經脯胺酸取代；位置之 差異為經天冬醯胺酸取代；位置2,〇49(^m)之差異為經 150569.doc -13- 201113376 苯丙胺酸、異白胺酸或白胺酸取代；其中位置 2,074以/^之差異為經白胺酸取代；其中位置 2,075“;^之差異為曱硫胺酸、白胺酸、異白胺酸或 2,075㈣重複；其中位置2，G78yw;之差異為離胺 酸、甘胺酸或蘇胺酸；其中位置2,〇9864一之取代為丙 ㈣、甘胺酸、脯胺酸、組胺酸、絲胺酸或半胱胺 酸；或 b.位置2,03964mj之差異為經甘胺酸取代；位置 2,059M~之差異為經纈胺酸取代；位置2,〇8〇64岣之 差異為經麩胺酸取代，或2,〇8〇Μ_缺失；及位置 2，0 9 5 M所）之差異為經楚胺酸取代。 85. -種控制如請求項81至84中任一項之植物附近内的雜草 生長的方法，其包含對該等雜草及單子葉植物施用抑制 野生型植物生長之量的乙醯輔酶A羧化酶抑制性除草 劑。 86. 如請求項85之方法’其中至少一種除草劑係選自由以下 組成之群：亞汰草、丁苯草酮、料同、氯丙氧定、環 殺草、©殺草、得殺草、三甲苯草酮、氯拉寄普、快草 酸、草丙酸、禾草靈H禾草靈、精ϋ禾草靈、。塞 唾禾草靈、。比氣禾草靈、精吼氟禾草靈、《L吡禾靈、精 ^比禾靈、異嗔草顿、普拔草、啥禾靈、料禾靈、曲 伏普及唾嘴草醋《任何此等料劑4農藝學上可接受之 鹽或酯，以一般可抑制野生型植物生長之除草劑之量。 87. —種控制雜草生長之方法，其包含： 150569.doc -14- 201113376 a•使如請求項81至84中体—TS _ 員之植物與其他植物種質雜 父，及收穫所得雜交種子； b‘種植該雜交種子；及 c ·對雜交植物及該雜交拮 又植物附近之雜草施用一般可抑制 野生型植物生長之除莖麻丨旦l 、， ”草齊丨用量的一或多種乙醯輔酶A 羧化酶抑制性除草劑。 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 一種如請求項81至84令任-項之植物的植物細胞。 種如β月求項8 1至84中任_項之植物的植物部分。 種種子’其係由如請求項81至84中任—項之植物產 生。 產生雜又植物之方法，其包含用第二植物對如請求 至84中任項之植物進行育種，其中該雜交植物展 現相較於該第二植物增高的除草劑耐受性。 -種食品’其係由如請求項81至84中任一項之植物製 備0 一種消費品，其係由如請求項81至84中任一項之植物製 備。 一種工業產品’其係由如請求項81至84中任一項之植物 製備。 一種獸醫產品，其係由如請求項81至84中任一項之植物 製備。 一種經分離之重組或誘變之核酸分子，其編碼如請求項 81至84中任—項所述之Accase。 ' 種如印求項％之核酸的用途’其係用作可選擇標記 150569.doc 15 201113376 物。 98_ —種處理如請求項81至84中任一項之稻植物的方法，其 包含使該植物與農藝學上可接受之組合物接觸。 99. 一種選擇經轉型植物細胞之方法，該方法包含： a. 將編碼相關基因之核酸分子引入植物細胞中，其中該 核酸分子另編碼突變乙醯輔酶A羧化酶（ACCase)，其 中該胺基酸序列在一個胺基酸位置不同於相應野生型 植物之ACCase之胺基酸序列；及 b. 使該植物細胞與ACCase抑制劑接觸以鑑別該經轉型植 物細胞，其中該突變ACCase展現相較於該相應野生型 ACCase對該ACCase抑制劑增高的除草劑耐受性。 100. —種育種方法，該方法包含： a. 用第二植物對包含如請求項99之細胞之植物進行育種 以獲得子代植物；及 b. 測定該子代植物是否表現該突變ACCase ; 其中該突變ACCase賦予該子代植物相較於該第二植物 增高的除草劑耐受性。 101. 如請求項99及100中任一項之方法，其中該突變ACCase 包含僅在一個選自由以下組成之群之胺基酸位置的取 代：1，781M—、1，785^4所」、1，786Μ_、1，811 、 l,824(AmJ ' l ,864(AmJ ' \,999(Am) ' 2,02T(Am) ' 2,039(Am) > 2,04\(Am) > 2,049(Am)、2,059(Am) ' 2,074 (Am) ' 2,075(Am) > 2,01%(Am) ' 2,019(Am) ' 2,080(AmJ ' 2,081fAmJ ' 2,088fAmJ ' 2,095(Am) ' 2,096(AmJ A 2,098 150569.doc -16- 201113376 (Am) ° 102. —種稻植物，其中： a. 該植物之生長能耐受一般可抑制稻植物生長之除草劑 用量的乙醯輔酶A羧化酶抑制性除草劑； b. 該植物為以下任一株系之植物：OsHPHI2、 OsARWIl、OsARWI3、OsARWI8 或 OsHPHNl，各株 系之種子之代表性樣本已分別以專利寄存編號PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570 或 PTA-10571寄存在美國菌種保存中心（ATCC);或為以下任 一株系之植物的突變體、重組體或經遺傳工程改造之 衍生物：OsHPHI2、OsARWIl、OsARWI3、OsARWI8 或OsHPHNl，各株系之種子之代表性樣本已分別以專 到寄存編號 PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、 PTA-10570或PTA-10571寄存在美國菌種保存中心 (ATCC);或為任何此等植物之子代植物；及 c. 該植物具有以下任一株系之植物的除草劑耐受性特徵： OsHPHI2、OsARWIl、OsARWI3、OsARWI8 或 OsHPHNl， 各株系之種子之代表性樣本已分別以專利寄存編號 PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570 或 PTA-10571寄存在美國菌種保存中心（ATCC)。 150569.doc •17-
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