ES2613405T3 - Método para evaluar cosméticos - Google Patents

Abstract

Un método para evaluar un cosmético, en donde la tasa de cambio de espesor del estrato córneo durante el proceso de hidratación del estrato córneo con el cosmético y posterior secado del estrato córneo se utiliza como un índice, cuyo método de evaluación comprende las etapas siguientes: medir el espesor (A) de las células o de una capa de células del estrato córneo seleccionada del grupo que consiste en estrato córneo aislado y una capa de estrato córneo cultivada; aplicar el cosmético a la célula o a la capa de células del estrato córneo con el fin de proporcionar estrato córneo hidratado; medir el espesor (B) de las células o de una capa de células del estrato córneo hidratado; secar la célula o la capa de células del estrato córneo hidratado con el fin de proporcionar estrato córneo seco; medir el espesor (C) de las células o de una capa de células del estrato córneo seco; calcular la tasa de cambio del espesor del estrato córneo durante el proceso de hidratación, y posterior secado del estrato córneo, donde dicho cálculo se lleva a cabo utilizando la fórmula siguiente (1) : tasa de cambio de espesor del estrato córneo >= (B - A) × 100/A - (C - B) × 100 / C (1); y determinar que el cosmético tiene un efecto de mejora en la piel si la tasa de cambio de espesor del estrato córneo es de 20% a 150%.

Description

DESCRIPCION

Metodo para evaluar cosmeticos Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo para evaluar cosmeticos. Preferiblemente, la invencion se refiere a un 5 metodo para evaluar el efecto de mejora en la piel, y mas preferiblemente, el efecto de mejora en la capa cornea, de los cosmeticos.

Estado de la Tecnica

La rugosidad de la piel se produce frecuentemente en la temporada de invierno de baja humedad y rara vez en la temporada de verano de alta humedad, y la experiencia demuestra que la retencion de la humedad es necesaria 10 para mantener la piel sana. Por otra parte, se considera que una piel bella es la piel que es trasparente y que tiene una textura de piel equilibrada, y se estan llevando a cabo investigaciones sobre metodos de evaluacion de la transparencia del estrato corneo y metodos de evaluacion de los medicamentos que aumentan la transparencia del estrato corneo (PTL 1 y 2), y se esta demostrando que la transparencia del estrato corneo esta asociada con la estructura de los lfpidos intercelulares en el estrato corneo (PTL 3). Aunque se sabe que la retencion de la humedad 15 es necesaria para mantener la piel sana, humeda, y que la transparencia es necesaria para una piel hermosa, la relacion entre el contenido de humedad del estrato corneo y la transparencia o la salud de la piel no han sido suficientemente estudiadas, y el estado actual del conocimiento es insuficiente.

Por otra parte, a fin de discernir la madurez de las celulas del estrato corneo y el estado de la piel, tambien se han descubierto metodos para medir del area y el espesor de las celulas del estrato corneo, y de este modo calcular el 20 mdice platimerico (PTL 4). Sin embargo, esta publicacion describe unicamente la medicion del area y espesor de las celulas del estrato corneo en un estado normal (estado no hidratado), mientras que no implica mediciones de la superficie de las celulas hinchadas con aguas cosmeticas o similares.

Ademas se conoce un metodo para determinar la eficacia de una composicion para el cuidado de la piel, el metodo comprende calcular la eficacia de una composicion para el cuidado de la piel en funcion de (a) el perfil de 25 concentracion de una sustancia activa en Raman asociado a la eficacia de la composicion para el cuidado de la piel en un test de la zona de la piel antes y despues de la aplicacion de la composicion para el cuidado de la piel utilizando la espectroscopia confocal Raman, y (b) el espesor del estrato corneo en el test de la zona de la piel antes y despues de aplicar la composicion para el cuidado de la piel (PTL 5).

Lista de documentos citados

30 Literatura Patente

[PTL 1] Publicacion de Patente Japonesa no examinada N° 2005-249672

[PTL 2] Publicacion de Patente Japonesa no examinada N° 2010-172200

[PTL 3] Publicacion de Patente Japonesa no examinada N° 2010-175264

[PTL 4] Publicacion de Patente Japonesa no examinada N° 2004-105700

35 [PTL 5] Publicacion de Patente Europea N° EP1760440

Literatura no patente

[NPL 1] Journal of the Japan Cosmetic Science Society vol.31, N° 1, pag.19-24 (2007)

Descripcion de la invencion Problemas a resolver por la invencion

40 Existe la necesidad de clarificar la relacion entre el contenido de humedad en el estrato corneo, y la piel sana y bella, y de un metodo para evaluar los cosmeticos que permitan el desarrollo de productos cosmeticos que pueden promover una piel bella sana, basado en este conocimiento. Ademas, se ha modificado una formulacion de acuerdo con las regiones en las que se van a comercializar los cosmeticos, y por lo tanto es necesario un metodo para evaluar los cosmeticos que comprenda una formulacion adecuada para el habitat de la region en la que se va a 45 comercializar.

Medios para resolver los problemas

Como resultado de una investigacion laboriosa sobre la relacion entre el contenido de humedad del estrato corneo y la belleza y salud de la piel, los presentes inventores han encontrado que el estrato corneo es opaco cuando se hidrata con agua, y que la transparencia aumenta a medida que se seca (Fig. 1), mientras que el estrato corneo

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hidratado con agua exhibe una funcion de barrera de la piel baja, y la funcion de barrera de la piel aumenta a medida que se seca (Fig. 2). Dado que la transparencia y la funcion de barrera del estrato corneo de la piel contribuyen a una piel bella y sana, respectivamente, estos resultados experimentales indicaron que para la piel bella sana, el estado seco es mas esencial que el estado humedo. Puesto que tradicionalmente se ha considerado que la retencion de humedad es importante para una piel bella sana y que se debe evitar el estado seco, esta resulto ser una observacion sorprendente.

Cuando se llevo a cabo una investigacion para estudiar las causas del aumento de la transparencia y de la funcion de barrera de la piel a medida que el contenido de humedad del estrato corneo disminuye, se encontro que la disminucion del contenido de humedad del estrato corneo esta asociada con la estructuracion ordenada de la estructura de queratina del estrato corneo, asf como con la estructuracion ordenada de los lfpidos intercelulares compuestos de ceramida, colesterol, acidos grasos y similares, provocando de esta manera la estabilizacion de la estructura laminar, y proporcionando una funcion de barrera (Fig. 3 ).

Los presentes inventores indujeron la hinchazon del estrato corneo con agua, con deterioro de la transparencia y de la funcion barrera de la piel, en donde el estrato corneo se sometfa a una liofilizacion, lo que dio como resultado la desintegracion de la estructura de queratina y de la estructura laminar, y posteriormente se sometio a un proceso de secado normal, y a continuacion, se encontro que la transparencia y la funcion de barrera de la piel eran restauradas por el proceso (Fig. 4 y 5). Se interpreto que la hinchazon del estrato corneo con agua desestabiliza la estructura de la queratina y la estructura laminar, y que la estructura de la queratina y la estructura laminar se reconstituyen de una manera ordenada durante el proceso de secado.

Sobre la base de este conocimiento, los presentes inventores llegaron a la conclusion de que en el proceso de cuidado de la piel para obtener una piel bella saludable, en lugar de simplemente hidratar como se ha hecho en el pasado, es importante llevar primero al estrato corneo a un estado humedo, suficientemente hinchado como para desestabilizar la estructura de la queratina y la estructura laminar, y luego secarlo para reconstituir la estructura de la queratina y la estructura laminar, y consiguieron inventar un metodo para evaluar si un cosmetico tiene este efecto o no.

Mas espedficamente, los presentes inventores encontraron que cuando un lfquido que tiene el efecto de mejorar la transparencia del estrato corneo, se utiliza en el proceso de hidratacion y posterior secado del estrato corneo, el grosor de las celulas del estrato corneo cambia y la tasa de cambio de espesor del estrato corneo aumenta con pocos cambios en el area de las celulas del estrato corneo, mientras que si se utiliza un lfquido que no mejora la transparencia del estrato corneo, no hay practicamente ningun cambio en el espesor y en el area de las celulas del estrato corneo (Figs. . 6 y 7). La tasa de cambio de espesor del estrato corneo es un mdice representado por la formula siguiente:

Tasa de cambio del espesor del estrato corneo (%) =

B - A x 100 / A -(C - B) x 100 / C.

en donde A es el espesor del estrato corneo antes de la hidratacion, B es el espesor del estrato corneo despues de la hidratacion, y C es el espesor del estrato corneo despues del secado. Sobre la base de este conocimiento, los presentes inventores realizaron una invencion relacionada con un metodo de evaluacion de la propiedad de mejora de la piel de un cosmetico aplicado, utilizando como mdice el grosor del estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en un estrato corneo aislado y una lamina de estrato corneo cultivado en estado humedo y, despues del secado. Espedficamente, la presente invencion esta definida en las reivindicaciones y se refiere a:

(1) Un metodo para evaluar un cosmetico, que utiliza como mdice la tasa de cambio de espesor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion del estrato corneo con el cosmetico y posterior secado del estrato corneo, el metodo de evaluacion comprende las etapas siguientes:

medir el espesor (A) de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo, seleccionada del grupo que consiste en estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivada antes de aplicar el cosmetico;

medir el espesor (B) de las celulas o de una capa de celulas en estado humedo despues de aplicar el cosmetico al estrato corneo;

medir el espesor (C) de las celulas o de una capa de celulas en estado seco despues de secar el estrato corneo;

calcular la tasa de cambio de espesor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion, y posterior secado del estrato corneo, donde dicho calculo se lleva a cabo utilizando al formula siguiente:

tasa de cambio de espesor del estrato corneo =

(B -A) x 100/A -(C -B) x 100 / C. (1); y

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determinar que el cosmetico tiene un efecto de mejora en la piel si la tasa de espesor del estrato corneo es de 20% a 150%.

(2) El metodo segun (1), donde se estima que el cosmetico tiene un efecto de mejora de la piel si la tasa de cambio del estrato corneo es de 25% a 100%.

(3) El metodo segun (1) o (2), donde el efecto de mejora en la piel es un efecto de mejora de la transparencia del estrato corneo.

Como resultado de una investigacion cuidadosa adicional de la etapa de secado, los presentes inventores encontraron que la transparencia del estrato corneo y la funcion de barrera de la piel vanan dependiendo de los cambios en la humedad durante la etapa de secado (Fig. 8 y Fig. 9). Espedficamente, se encontro que cuando el estrato corneo hinchado con agua ha sido secado bajo una humedad alta, tanto la funcion de barrera de la piel, como la transparencia del estrato corneo son superiores en comparacion con el secado bajo una humedad baja. Se cree que esto es debido a la lenta evaporacion del agua bajo una humedad alta, que da como resultado la reconstitucion ordenada de la estructura de la queratina y de la estructura laminar. En consecuencia, el ajuste de los componentes en el agua cosmetica para controlar la tasa de la etapa de secado permite evaluar si el cosmetico es adecuado para las condiciones ambientales, tales como el clima en el que se va a utilizar (es decir, la temperatura estandar y humedad estandar de la region en la que se va a comercializar).

A partir de aid, los presentes inventores desarrollaron un metodo para evaluar los cosmeticos adecuados para un habitat determinado, que comprende:

aplicar los cosmeticos al estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en un estrato corneo de la piel, un estrato corneo aislado y una lamina de estrato corneo cultivado (que no incluye melanina);

secar los cosmeticos a una temperatura prescrita y una humedad prescrita;

medir el contenido de humedad (%) y de transmitancia del estrato corneo (%) durante la etapa de secado, crear un diagrama de cajas y obtener una curva ajustada;

determinar si la curva ajustada obtenida en la etapa anterior esta dentro de un intervalo entre una curva ajustada (1) obtenida en una etapa de aplicacion de agua a la capa cornea y secado en las condiciones de temperatura prescritas y humedad variable de 30% a 90%, y una curva ajustada (2) obtenida en una etapa de secado en las condiciones de temperatura prescritas y 90% de humedad, o no; y

evaluar que el cosmetico es adecuado para el habitat si la curva ajustada esta contenida dentro de este intervalo.

En una realizacion preferida de este metodo de evaluacion el lfmite inferior de humedad bajo la condicion para obtener la curva ajustada (1) se selecciona del grupo que consiste en 60%, 70% y 80%.

Ademas, los presentes inventores desarrollaron un metodo para evaluar los cosmeticos que son adecuados para un habitat determinado, que comprende:

aplicar los cosmeticos al estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en un estrato corneo de la piel, un estrato corneo aislado y una lamina de estrato corneo cultivado (que no incluye melanina);

secar el cosmetico a una temperatura prescrita y a una humedad prescrita;

medir la transmitancia del estrato corneo despues del secado; y

evaluar que el cosmetico sea adecuado para el habitat si la transmitancia del estrato corneo es de 85% a 100%.

Efecto de la invencion

Los presentes inventores han encontrado que los cambios en el espesor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion y secado estan relacionados con la transparencia del estrato corneo tras el proceso de hidratacion y secado. Segun la invencion, por lo tanto, utilizar el grosor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion y secado como un mdice permite determinar si un lfquido utilizado es eficaz o no, en terminos de su efecto de mejora en la piel, y es util para el cribado primario durante el desarrollo del producto. Ademas, se determina la idoneidad de un cosmetico para un habitat determinado, facilitando de este modo el desarrollo del producto.

Breve descripcion de las figuras

Fig. 1 es un grafico que muestra la relacion entre el contenido de humedad del estrato corneo y la transmitancia total del estrato corneo.

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Fig. 2 es un grafico que muestra la relacion entre el contenido de humedad del estrato corneo y la transpiracion de la humedad, lo que demuestra que la funcion de barrera de la piel del estrato corneo aumenta a medida que el contenido de humedad del estrato corneo disminuye.

Fig. 3 es un grafico que muestra la relacion entre el contenido de humedad del estrato corneo y el grado de orden de los lfpidos.

Fig. 4 es un grafico que muestra la mejora en la transparencia del estrato corneo cuando el estrato corneo que se ha puesto rugoso por la liofilizacion se vuelve a hidratar con agua.

Fig. 5 es un grafico que muestra la mejora de la funcion de barrera de la piel cuando el estrato corneo que se ha puesto rugoso por la liofilizacion se vuelve a hidratar con agua.

Fig. 6 es un grafico que muestra el cambio en el espesor de una capa de estrato corneo cuando la capa del estrato corneo ha sido hidratada con un lfquido. El espesor aumenta cuando se hidrata con una disolucion acuosa de glicerina al 10% y una disolucion acuosa de parafina lfquida + glicerina + espesante, y posteriormente disminuye tras el secado, mientras que no hay cambios en el espesor cuando se hidratan con 100% de etanol.

Fig. 7 muestra la transparencia y los efectos de transmitancia del estrato corneo cuando una capa del estrato corneo liofilizado se ha hidratado con lfquido y posteriormente secado. La transparencia fue alta y la transmitancia de la capa del estrato corneo fue alta cuando se hidrata con una solucion acuosa de glicerina al 10% y una disolucion acuosa de parafina lfquida + glicerina + espesante, mientras que la transparencia era baja y la transmitancia del estrato corneo tambien fue baja cuando se hidrata con 100% etanol.

Fig. 8 es un grafico que muestra la relacion entre el contenido de humedad y la transmitancia total del estrato corneo tras el secado en condiciones con 30% de humedad, 60% de humedad y 90% de humedad. Fig. 9 es una funcion de barrera de la piel grafico que muestra despues de secar bajo condiciones de 30% de humedad, 60% de humedad y 90% de humedad.

Fig. 9 es un grafico que muestra la funcion de barrera de la piel, despues de secar bajo condiciones de 30% de humedad, 60% de humedad y 90% de humedad.

Descripcion de la realizacion de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para evaluar cosmeticos utilizando como mdice la tasa de cambio en el espesor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion y secado del estrato corneo. Este metodo de evaluacion permite evaluar los cosmeticos para el efecto de mejora de la transparencia del estrato corneo, para el efecto de mejora del estrato corneo, y ademas para el efecto de mejora de la piel y el efecto de embellecimiento de la piel, y por lo tanto para llevar a cabo la deteccion de los cosmeticos que son utiles para estos efectos.

En la presente invencion "estado hidratado" es un estado de equilibrio en el que se ha aplicado un cosmetico con el fin de hidratar suficientemente el estrato corneo, con la penetracion suficiente del cosmetico en el estrato corneo. El tiempo para alcanzar un estado humedo difiere segun el tipo de cosmetico y por lo tanto el tiempo requerido para alcanzar un estado humedo no se puede definir para todos los casos, sino que se puede considerar que se ha alcanzado un estado humedo si el cosmetico se mantiene de manera que no se seque durante al menos 1 minuto, preferiblemente al menos 5 minutos, mas preferiblemente al menos 10 minutos e incluso mas preferiblemente al menos 30 minutos tras la aplicacion del cosmetico. Puesto que es suficiente alcanzar un estado de equilibrio, por lo general no causa ningun problema si el tiempo de la aplicacion de cosmeticos es mas largo que este tiempo.

En la presente invencion la tasa de cambio de espesor del estrato corneo es la tasa de cambio durante el proceso de aplicacion y secado del cosmetico, y se define por la siguiente formula 1):

Tasa de cambio de espesor del estrato corneo (%) =

(B -A) x 100/A -(C -B) x 100 / C (1),

en donde A es el espesor de las celulas o de una capa de celulas de estrato corneo seleccionada del grupo que consiste en un estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivado, B es el espesor de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo en estado humedo despues de la aplicacion del cosmetico, y C es el espesor de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo tras el secado. Por lo tanto, el metodo para evaluar los cosmeticos de acuerdo con la invencion comprende preferiblemente los siguientes pasos:

una etapa en la que se mide el espesor (A) de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en, un estrato corneo aislado y una capa del estrato corneo cultivado antes de la aplicacion de un cosmetico;

una etapa en la que se mide el espesor (B) de las celulas o de una capa de celulas en estado humedo despues de aplicar el cosmetico al estrato corneo;

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una etapa en la que se mide el espesor (C) de las celulas o de una capa de celulas en estado seco tras secar el estrato corneo;

una etapa en la que se calcula la tasa de cambio de espesor del estrato corneo durante el proceso de

hidratacion y secado del estrato corneo, por medio de la formula 1);

una etapa en la que se determina que el cosmetico tiene un efecto de mejora de la piel si la tasa de cambio de espesor del estrato corneo es de 20% a 50%. Preferiblemente, se considera que se ha

obtenido un efecto de mejora en la piel si el lfmite inferior para el intervalo de la tasa de cambio de

espesor del estrato corneo se selecciona del grupo que consiste en 20%, 25%, 30% y 40%, y si el lfmite superior se selecciona del grupo que consiste en 100%, 120%, y 150%.

En la presente invencion "estrato corneo" se refiere a una preparacion “in vivo” de la piel, o un estrato corneo obtenido a partir de cultivo celular, principalmente un estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivado.

"Estrato corneo de la piel" se refiere espedficamente al estrato corneo de la piel humana, y cuando en la presente memoria se utiliza el termino "estrato corneo de la piel" se refiere a un metodo “in vivo” en el que el cosmetico se aplica directamente sobre el estrato corneo de la piel de un organismo. La ubicacion de la piel puede ser cualquier sitio o zona del cuerpo, tal como la mejilla, la barbilla, el dorso de la mano o el tronco.

El "estrato corneo aislado" se puede obtener por un metodo invasivo, tal como medios quirurgicos, pero con el proposito de valorar un cosmetico, preferiblemente se obtiene a partir de la piel mediante un metodo no invasivo, por razones de facilidad o eticas. Los metodos no invasivos incluyen los metodos de extraccion con cinta adhesiva y dermoabrasion que se emplean comunmente en el campo tecnico (NPL 1). La extraccion con cinta adhesiva se puede llevar a cabo aplicando una tira de cinta adhesiva o un Post-It (producto de Sumitomo-3M) a la capa superficial de la piel y despegandola para separar el estrato corneo de la piel directamente en la cinta adhesiva, y este es el metodo especialmente preferido para el proposito de la invencion.

Un metodo de extraccion con cinta adhesiva preferido es aquel en el que la superficie de la piel se cubre primero con una tira de cinta adhesiva o Post-it cortado a un tamano adecuado (por ejemplo, 5 x 5 cm) colocado ligeramente sobre la superficie de la piel, y se aplica una fuerza igual en toda la cinta para aplanarlo, despues de lo cual la cinta adhesiva se despega con una fuerza uniforme. La cinta adhesiva usada puede ser cinta de celofan disponible comercialmente, y, por ejemplo, puede ser Scotch Superstrenght Mailing Tape (3M) o similares. Tambien, el Post-it utilizado puede ser cinta para cubrir de Sumitomo-3M o similar.

Una capa de estrato corneo cultivado es una capa de estrato corneo obtenida por cultivo “in vitro”, e incluye capas de estrato corneo aislado a partir de tejido de piel cultivado y mantenido cultivando piel humana o de animales experimentales, y capas del estrato corneo obtenidas a partir de la piel cultivada tridimensionalmente obtenida mediante el cultivo de fibroblastos o de fibroblastos diferenciados “in vitro” a partir de celulas madre (por ejemplo, celulas madre epiteliales, celulas madre embrionarias o celulas madre pluripotentes inducidas), en un soporte de cultivo compuesto por un polfmero como colageno, fibrina o acido polilactico, o un polisacarido como la quitina, quitosano, sulfato de condroitina o acido hialuronico. La capa de estrato corneo se afsla del tejido epitelial cultivado en el soporte mediante un metodo como el tratamiento con una proteasa en una disolucion salina fisiologica con concentraciones de iones calcio y de iones magnesio controladas. La piel cultivada tridimensionalmente utilizada puede ser un modelo de epidermis humana cultivada en tres dimensiones producto comercialmente disponible de LabCyte EPI-MODEL (Japon Tissue Engineering).

Ademas se describe un metodo para evaluar el uso de un cosmetico basado en el mdice de cambio de espesor del estrato corneo. Espedficamente, el metodo para evaluar el metodo de la utilizacion de un cosmetico comprende las siguientes etapas:

una etapa en la que se mide el espesor (A) de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en un estrato corneo de la piel, un estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivado antes de la aplicacion de un cosmetico;

una etapa en la que se mide el espesor (B) de las celulas o de una capa de celulas en el estado humedo;

una etapa en la que se mide el espesor (C) de las celulas o de una capa de celulas en estado seco; y

una etapa en la que se calcula la tasa de cambio de espesor del estrato corneo durante el proceso de secado despues de que el estrato corneo ha sido hidratado, por medio la siguiente formula 1:

Tasa de cambio de espesor del estrato corneo (%) =

(B -A) x 100/A -(C -B) x 100 / C (1).

Se obtiene un efecto de mejora sobre la piel por el uso del cosmetico si el cambio de espesor del estrato corneo es superior al 20%. Mas preferiblemente, se puede determinar que el uso del cosmetico es adecuado cuando la tasa de cambio de espesor del estrato corneo es mayor que 20%, mayor que 25%, mayor que 30%, mayor que 40% o mayor

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que 50%. No hay restricciones particulares sobre el Ifmite superior, pero desde el punto de vista del Ifmite de hinchazon, se selecciona preferiblemente de entre menos que 100%, menos que 120%, menos que 150% y menos que 200%. Los metodos para evaluar los metodos de utilizacion de los cosmeticos, en los que los cosmeticos se aplican al estrato corneo de la piel, se emplean en los salones de belleza, tiendas de cosmeticos y salones de estetica.

El espesor del estrato corneo es generalmente el espesor de la capa de celulas del estrato corneo, pero desde el punto de vista de la medicion de la tasa de cambio del espesor del estrato corneo, la tasa de cambio del espesor del estrato corneo se puede medir comparando no solo el espesor de la capa de celulas del estrato corneo, sino tambien el espesor de una celula en el estrato corneo. El espesor del estrato corneo se puede medir usando cualquier metodo deseado utilizado convencionalmente, como un microscopio fluorescente o un microscopio de fuerza atomica (PTL 4 y NPL 1). Como alternativa se puede usar un microscopio laser de barrido multifotonico o un biomicroscopio confocal, o similares. Mas espedficamente, cuando se va a medir el espesor de la celula de estrato corneo aislado, se pueden usar un microscopio de fluorescencia o un microscopio de fuerza atomica para medir la longitud desde la membrana celular hasta la membrana celular en la direccion del espesor de las celulas de forma plana del estrato corneo, permitiendo de ese modo medir el espesor de las celulas en el estrato corneo aislado. Del mismo modo, el espesor de la capa de celulas de estrato corneo se puede medir como el espesor de la capa de celulas del estrato corneo aislado, mediante la medicion de la longitud de las membranas celulares desde las celulas de la capa mas inferior de las celulas del estrato corneo que forman las capas del estrato corneo aislado, hasta las membranas celulares de las celulas de la capa superior.

En la presente memoria, "cosmetico" se refiere a un cosmetico para ser aplicado a la piel, tal como el agua cosmetica, latex, esencia, crema, base o similares, pero no se limita a estos. Incluye todas las sustancias que no tienen como finalidad directa mejorar la piel, pero que se aplican sobre la piel y, por ejemplo, incluye los filtros solares, repelentes de insectos, agentes para la alopecia y recuperadores del cabello.

Ademas se describe un metodo para evaluar los cosmeticos adecuados para un habitat determinado. Espedficamente, se refiere a un metodo para evaluar los cosmeticos que son adecuados para un habitat determinado, el metodo comprende:

(1) una etapa en la que se aplica un cosmetico al estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en un estrato corneo de la piel, un estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivado;

(2) una etapa de secado del cosmetico a una temperatura prescrita y a una humedad prescrita;

(3) una etapa en la que se mide el contenido de humedad (%) y la transmitancia del estrato corneo (%) en la etapa de secado, creando de ese modo un diagrama de cajas y la obtencion de una curva ajustada;

(4) una etapa en la que se determina si la curva ajustada obtenida en la etapa anterior esta o no dentro de

un intervalo entre una curva ajustada obtenida en una etapa de aplicacion de agua al estrato corneo seleccionado del grupo que consiste en un estrato corneo de la piel, un estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivado (que no contiene melanina) y el secado en las condiciones de la temperatura prescrita y al menos 30% y menos que 90% de humedad, y preferiblemente al menos 60% y menos que

90% de humedad, y una curva ajustada obtenida en una etapa de secado en las condiciones de la

temperatura prescrita y 90% de humedad; y

(5) una etapa en la que se evalua que el cosmetico es adecuado para el habitat prescrito si la curva ajustada esta contenida dentro del rango.

Puesto que no habfa diferencia significativa en la funcion de barrera de la piel entre el secado a 60% de humedad y el secado a 90% de humedad (Fig. 9), se puede considerar que un cosmetico puede ser adecuado para un ambiente en particular, incluso cuando el metodo incluye, en lugar de las etapas (4) y (5) una etapa en la que se evalua si el cosmetico es adecuado para el habitat en particular, si la transmitancia total del estrato corneo es mayor que 85%, lo que corresponde a la transmitancia total del estrato corneo en el punto final de secado, cuando el secado ha tenido lugar en las condiciones de temperatura prescritas y 60% de humedad. En este caso, la transmitancia del estrato corneo es preferiblemente mayor que 90%.

La velocidad de secado del cosmetico puede variar dependiendo de la cantidad y la concentracion de los

componentes que contiene. Los componentes del cosmetico pueden incluir agua o alcoholes tales como etanol,

glicerina o polietilenglicol como bases, aminoacidos tales como glicina, betama, pirrolidona carboxilato de sodio o sacaridos tales como fructosa, maltitol, manitol o trehalosa, como humectantes, acido hialuronico, colageno, ceramida o similares como ingredientes activos, citrato de sodio, acido dtrico o de lactato de sodio como agentes de dilucion, y sales de acido benzoico o acido sorbico como agentes antisepticos, pero no se limita a estos. De estos, los componentes volatiles aumentan la velocidad de secado, mientras que los solutos, y especialmente las sustancias hidrofilas tales como los polfmeros, incluyendo el polietilenglicol, reducen la velocidad de secado, y por lo tanto la seleccion de estos componentes y sus cantidades alteran la velocidad de secado del cosmetico obtenido por la formulacion. El metodo permite evaluar si el cosmetico obtenido mediante la formulacion de estos componentes es adecuado para el habitat de la region en la que se va a comercializar o no.

En la presente memoria, el habitat de una region de comercializacion es el habitat de la region en la que el cosmetico va a ser comercializado, y por ejemplo, se refiere al clima, y en particular a la temperature y la humedad, que tambien vana ampliamente dependiendo de la estacion de la region de comercializacion. Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion mas preferida de la invencion, es posible evaluar si un cosmetico es adecuado para las 5 diferentes estaciones de la region de comercializacion, por ejemplo, para la estacion seca o para la estacion lluviosa, o para las estaciones de primavera, verano, otono o invierno.

La funcion de barrera de la piel se evalua mediante la perdida de agua transepidermica (TEWL). La TEWL es la cantidad de transpiracion de humedad a traves del estrato corneo, una TEWL baja indica una funcion de barrera del estrato corneo de la piel mayor y una TEWL alta indica que una funcion de barrera del estrato corneo de la piel 10 inferior. La relacion entre la funcion barrera de la piel y la rugosidad de la piel se describe en PTL 2.

A continuacion se proporcionan ejemplos concretos para una explicacion mas detallada de la invencion. Sin embargo, la invencion no esta, en modo alguno, limitada por los ejemplos.

Ejemplo 1: Evaluacion de la transparencia del estrato corneo en relacion con el contenido de humedad del estrato corneo

15 (Preparacion de la muestra del estrato corneo)

Un modelo de cultivo tridimensional de epidermis humana (LabCyte EPI-MODEL, Japon Tissue Engineering) se incubo en una placa de 12 pocillos durante 30 minutos a 37° C en una disolucion de tripsina al 0,1% /tampon fosfato isotonico, para preparar una capa de estrato corneo con un diametro de 10 mm aproximadamente. Cada capa de estrato corneo se seco a una temperatura de 34° C utilizando un termohigrostato MTH-2200 (Sanyo Electric Co., 20 Ltd.), para obtener capas de estrato corneo con diferentes contenidos de humedad del estrato corneo.

(Metodo de medicion del contenido de humedad del estrato corneo)

El peso humedo del estrato corneo, cuyo contenido de humedad interesa, se mide con un Mettler o similar. Se elimina la electricidad estatica, si fuera necesario con un ionizador (STABLO, Shimadzu Corp., Nagoya, Japon). Se lleva a cabo la medicion del peso cada segundo durante 1 minuto, y se registra el valor promedio. A continuacion, se 25 mide el peso seco absoluto del estrato corneo. Espedficamente, el estrato corneo se calienta a 120 grados durante 2 horas para eliminar la mayor parte de la humedad. A continuacion, se lleva a un estado seco absoluto con un equipo de adsorcion/desorcion de la humedad (IGAsorp, Hiden Isochema Ltd., WA, Reino Unido), mientras que se circula un flujo de gas nitrogeno con 0% de humedad durante 2 horas, y se mide el peso seco absoluto del estrato corneo a 0% de humedad con un equipo de adsorcion/desorcion de la humedad. El contenido de humedad del 30 estrato corneo, se calcula basandose en la siguiente formula.

Contenido de humedad del estrato corneo (%) =

(peso estrato corneo humedo - peso seco absoluto del estrato corneo / peso estrato corneo humedo) x 100

(Medicion de la transmitancia total del estrato corneo)

35 El aparato de medicion de transparencia de la invencion comprende una fuente de luz blanca como fuente de luz estandar de calificacion C de acuerdo con la CIE (Commission Internationale de l'Eclairage), un dispositivo de sujecion para la muestra del estrato corneo, una pantalla como escudo para que la luz que no pase a traves de la muestra del estrato corneo, una esfera de integracion que homogeniza luz que ha pasado a traves de la muestra del estrato corneo, y un fotometro que mide la intensidad de la luz guiada desde la esfera de integracion. Despues de 40 medir el contenido de humedad del estrato corneo, la capa del estrato corneo se monta en un equipo de medicion de transparencia de acuerdo con la invencion y se irradia con la luz blanca de la fuente de luz, la luz que pasa a traves de la capa del estrato corneo se dirige a la esfera de integracion, y se mide la intensidad de la luz homogeneizada. Los resultados para el valor de la transmision total medido, es decir, la intensidad de la luz que ha pasado a traves de la capa de estrato corneo, se expresan como un porcentaje, dividido por el valor medido para la intensidad de la 45 luz blanca guiada directamente desde la fuente de luz hacia la esfera de integracion, en un estado en blanco sin montar de la capa de estrato corneo (Fig.1)

Ejemplo 2: Evaluacion de la funcion de barrera de la piel del estrato corneo en relacion con el contenido de humedad del estrato corneo

(Medicion de la transpiracion de la humedad del estrato corneo)

50 La capa de estrato corneo seco se monta en una celula de Frank (PermeGear, Inc., EE.UU.). El lado del receptor de la capa de estrato corneo se pone a remojo con agua mientras que el lado donador se mantuvo vado, exponiendo de esta forma, el lado superior de la capa del estrato corneo a una fase de gas y el lado inferior a una fase lfquida, con la capa del estrato corneo situada en la interfaz gas-lfquido. Dos horas despues de la estabilizacion de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

transpiracion de la humedad del estrato corneo, se utilizo un VapoMeter (Delfin Technologies Ltd., Finlandia) para medir la transpiracion de la humedad en el modo de una (Fig. 2).

Ejemplo 3: Evaluacion del orden de los lfpidos en el estrato corneo en relacion con el contenido de humedad del estrato corneo,

(Preparacion de la muestra de estrato corneo)

Un modelo de cultivo tridimensional de epidermis humana (Labcyte EPI-MODEL, Japon Tissue Engineering) se incubo en una placa de 12 pocillos durante 30 minutos a 37° C en una disolucion de tripsina al 0,1% / tampon fosfato isotonico para preparar una capa de estrato corneo con un diametro de 10 mm aproximadamente.

(Reaccion con 5DSA)

La capa de estrato corneo se adhirio a una placa de vidrio (8 mm * 70 mm * 0,5 mm) y se trato con 50 ml de 0,001% de acido 5-doxil-estearico (5-DSA; producto de Aldrich) como sonda de espm, se hizo reaccionar a 37° C durante 1 hora y luego se enjuago con agua.

(Medicion de ESR)

Se utilizo un MTH-2200 para la incubacion de la capa de estrato corneo, a 34° C, 60% de humedad, y la medicion del ESR se realizo a las 0 horas, 30 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 5 horas y 18 horas desde el inicio de la incubacion. La medicion se llevo a cabo a temperatura ambiente usando un equipo de ESR en banda X (JESREIX, producto de JEOL Corp.). Se realizo un analisis de datos para determinar el grado de orden S por el metodo geometrico utilizado convencionalmente.

Las condiciones de medicion fueron los siguientes. Salida de microondas: 10 mW, amplitud de modulacion de campo: 0,2 mT, constante de tiempo: 1 segundo, tiempo de barrido: 8 minutos.

En base a los resultados del Ejemplo 1 y del Ejemplo 2, se mostro un aumento de la transparencia y de la funcion de barrera del estrato corneo con la disminucion del contenido de humedad del estrato corneo. Ademas, segun los resultados del Ejemplo 3, el grado de orden de los lfpidos intercelulares mejora cuando el contenido de humedad el estrato corneo disminuye. Esto se debe a que la estructuracion de los lfpidos a medida que avanza el secado, da como resultado una mayor estabilidad del estrato corneo. Esto demuestra que es necesaria la reduccion desde un estado hidratado suficientemente hasta un contenido de humedad del estrato corneo adecuado, para que la piel tenga una transparencia alta (belleza) y una funcion de barrera de la piel alta (piel sana).

Ejemplo 4: Evaluacion del efecto de hidratacion del agua en la transparencia del estrato corneo

Utilizando el metodo para medir la transparencia del estrato corneo del Ejemplo 1, se midio la transparencia del estrato corneo con las siguientes muestras: una capa de estrato corneo hidratada con agua, un capa de estrato corneo hidratada con agua y secada posteriormente durante 18 horas en las condiciones de 34 grados, 60% de humedad utilizando un bano termostatico (MTH-2200, Sanyo Electric, Tokio, Japon), una capa de estrato corneo hidratada con agua, congelada a -20 grados con un equipo de liofilizacion (VD-80, producto de Taitec) y liofilizada a continuacion durante 2 horas con el mismo equipo, y una capa de estrato corneo hidratada con agua y sometida posteriormente a la misma de liofilizacion, seguida de rehidratacion con agua y de secado posterior durante 18 horas en condiciones de 60% de humedad (Fig. 4 ). La hidratacion con agua y la rehidratacion con agua se llevaron a cabo mediante la colocacion en agua durante 18 horas.

Ejemplo 5: Evaluacion del efecto de hidratacion de agua en el estrato corneo en la funcion barrera de la piel

Utilizando el metodo para medir la funcion barrera de la piel del Ejemplo 2, se midio la transparencia del estrato corneo con las siguientes muestras: una capa del estrato corneo hidratado con agua, una capa estrato corneo hidratado con agua y despues secado durante 18 horas en las condiciones de 34° C, 60% de humedad, una capa del estrato corneo hidratado con agua, congelado a -20° C con un equipo de liofilizacion (VD-80, producto de Taitec) y despues se liofilizo durante 2 horas con el mismo dispositivo, y una capa estrato corneo hidratado con agua y despues sometido a secado por congelacion de la misma manera, rehidratado con agua y luego secado en las condiciones de 34° C, 60% de humedad. La hidratacion con agua y rehidratacion con agua se llevo a cabo mediante la colocacion en agua durante 18 horas.

A juzgar por los experimentos de los Ejemplos 4 y 5, la rehidratacion con agua y el secado del estrato corneo, danados por liofilizacion restauraron tanto la transparencia como la funcion de barrera de la piel del estrato corneo al mismo nivel que el estado seco a 60% de humedad en lugar de liofilizacion, lo que indica que la hidratacion con el agua y el secado mejora la condicion de la piel.

Ejemplo 6: Evaluacion de los reactivos para mejorar los efectos sobre la piel en funcion del cambio de grosor del estrato corneo

El espesor de un Modelo de Epidermis humana reconstituida J-TEC (capa de estrato corneo,) se midio antes del experimento con un calibrador (Caliper No.227-201 de Mitsutoyo Corp.) (cada uno una localizacion) (A). La capa de 5 estrato corneo se hidrato adicionalmente durante 30 minutos en una solucion acuosa de glicerina al 10%, una solucion acuosa de parafina lfquida (10%), glicerina (10%), POE (60) aceite de ricino hidrogenado (10%), polfmero de carboxivinilo (nombre del producto: cArBOPOL 981, Lubrizol Advanced Materials, Inc. ) (0,2%) y KOH (0,1%) (parafina lfquida+ glicerina + disolucion acuosa espesante), y en etanol al 100%, e inmediatamente despues de la finalizacion de la hidratacion, se midio el espesor de la capa de estrato corneo con un calibre de la misma manera 10 (B).

Se seco adicionalmente durante 18 horas en las condiciones de 34° C, 60% de humedad y se midio la capa del estrato corneo (C). Utilizando estos resultados, se mide la tasa de cambio de espesor (%) de la capa del estrato corneo en base a la siguiente formula 1:

Tasa de cambio de espesor % =

15 (B -A)* 100 A / -(C -B)x 100/C

Tras el posterior secado, se examino visualmente la transparencia de la capa del estrato corneo. Los resultados para el cambio de espesor y la transparencia de la capa del estrato corneo se muestran en la Tabla 1.

(Tabla 1)

Muestra

Tasa de cambio de espesor (%) Transparencia

Solucion glicerina 10%

88,4 Buena

Parafina lfquida+ glicerina+ disolucion espesante

29,9 Buena

Etanol 100%

3,9 Baja

20 A continuacion, un modelo de Epidermis humana reconstituida J-TEC (capa de estrato corneo,) se sometio a liofilizacion para obtener una capa de estrato corneo opaca de color blanco. La capa de estrato corneo liofilizado se humedecio durante 30 minutos en una solucion acuosa de glicerina al 10%, en una solucion acuosa de parafina lfquida (10%), glicerina (10%), POE (60) aceite de ricino hidrogenado (10%), polfmero de carboxivinilo (nombre del producto: CARBOPOL 981 por Lubrizol Advanced Materials, Inc. ) (0,2%) y kOh (0,1%) (parafina lfquida + glicerina 25 + disolucion acuosa espesante), y en etanol al 100%, y despues de eliminar el lfquido, se llevo a cabo el secado

durante 18 horas en una atmosfera a 34° C, 60% de humedad, y la capa fue fotografiada (fig. 7 ).

Se obtuvo un estrato corneo con alta transparencia cuando la humectacion se llevo a cabo en la solucion acuosa de glicerina 10% o en parafina lfquida + glicerina + disolucion acuosa espesante, pero se obtuvo una capa cornea todavfa con baja transparencia cuando la humectacion era con parafina lfquida. La transmitancia se midio usando un 30 espectrofotometro HR100 de Murakami Color de Research Laboratory Co., Ltd. La comparacion con la Tabla 1 muestra que el estrato corneo de transparencia alta, se obtiene cuando el cambio de espesor del estrato corneo es por lo menos del 20%. Puesto que una mayor transparencia del estrato corneo se puede considerar una condicion mas excelente de la piel, el estado de mejora de la piel se puede evaluar basandose en el cambio de espesor de las celulas o de la capa de celulas del estrato corneo, desde la hidratacion en un lfquido hasta el secado.

35 Ejemplo 7: Cambio en la transparencia del estrato corneo en base a la humedad de la etapa de secado

La etapa de secado en el experimento del Ejemplo 1 se realizo a un 30% y 60% de humedad y a un 90% de humedad, para representar la transmitancia total de estrato corneo frente al contenido de humedad (%) (Fig. 8). La Fig. 8 muestra que el secado a humedad alta da como resultado la mayor mejona de la transparencia del estrato corneo. Este experimento respalda el uso de un metodo para evaluar los cosmeticos que son adecuados para 40 determinados habitats. En otras palabras, cuando la transmitancia (%) del estrato corneo, se representa frente al

contenido de humedad (%) obtenido en la etapa de secado de un cosmetico de ensayo, a una humedad y temperatura prescrita, y se dibuja un diagrama de trama y se obtiene una curva ajustada, se evalua que el cosmetico sea adecuado para la mejora de la transparencia del estrato corneo, si la curva ajustada esta incluida dentro de la region entre una curva ajustada (1) obtenida en la etapa de aplicacion de agua a la capa cornea y el secado en las 45 condiciones de temperatura prescritas antes mencionadas y en por lo menos 30% y menos que 90% de humedad, y

una curva ajustada (2) obtenida en la etapa de secado en condiciones de temperatura prescritas mencionadas anteriormente y 90% de humedad. Se puede evaluar como un cosmetico aun mas adecuado cuando el lfmite inferior

para la humedad en las condiciones en que se obtiene la curva ajustada (1), es un Ifmite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en 60%, 70% y 80%.

Ejemplo 8: Cambio en la funcion barrera de la piel del estrato corneo en base a la humedad en la etapa de secado

La etapa de secado en el experimento del Ejemplo 2 se llevo a cabo con humedades de 30%,60% y 90%, y se midio 5 la transpiracion de humedad (Fig. 9). Este grafico muestra que la funcion de barrera de la piel del estrato corneo se mejora cuando el secado se realiza a alta humedad, mientras que el efecto sobre la funcion barrera de la piel era bajo cuando el secado era de 60% o de 90% de humedad.

Claims (3)

1. 10

   15

   20

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para evaluar un cosmetico, en donde la tasa de cambio de espesor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion del estrato corneo con el cosmetico y posterior secado del estrato corneo se utiliza como un mdice, cuyo metodo de evaluacion comprende las etapas siguientes:

   medir el espesor (A) de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo seleccionada del grupo que consiste en estrato corneo aislado y una capa de estrato corneo cultivada;

   aplicar el cosmetico a la celula o a la capa de celulas del estrato corneo con el fin de proporcionar estrato corneo hidratado;

   medir el espesor (B) de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo hidratado;

   secar la celula o la capa de celulas del estrato corneo hidratado con el fin de proporcionar estrato corneo seco;

   medir el espesor (C) de las celulas o de una capa de celulas del estrato corneo seco;

   calcular la tasa de cambio del espesor del estrato corneo durante el proceso de hidratacion, y posterior secado del estrato corneo, donde dicho calculo se lleva a cabo utilizando la formula siguiente (l) :

   tasa de cambio de espesor del estrato corneo =

   (B -A)x 100/A -(C -B) x 100 / C (1); y

   determinar que el cosmetico tiene un efecto de mejora en la piel si la tasa de cambio de espesor del estrato corneo es de 20% a 150%.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, donde se determina que el cosmetico tiene un efecto de mejora en la piel si la tasa de cambio de espesor del estrato corneo es de 25% a 100%.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el efecto de mejora en la piel es un efecto de mejora de la transparencia del estrato corneo.