JPH10323184A - 皮膚刺激性試験方法 - Google Patents
皮膚刺激性試験方法Info
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- JPH10323184A JPH10323184A JP9134785A JP13478597A JPH10323184A JP H10323184 A JPH10323184 A JP H10323184A JP 9134785 A JP9134785 A JP 9134785A JP 13478597 A JP13478597 A JP 13478597A JP H10323184 A JPH10323184 A JP H10323184A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】種々の刺激検出操作を加えずに、皮膚組織に対
する被験物質の角質層に及ぼす刺激性を試験する、簡便
な皮膚刺激性試験方法と季節間変動、被験者間差をなく
した皮膚刺激性試験法を提供する。 【解決手段】培養人工皮膚の表皮表面に、被験物質を接
触させることにより生じた表皮角質層の構造的変化を観
察することを特徴とする皮膚刺激性試験方法。
する被験物質の角質層に及ぼす刺激性を試験する、簡便
な皮膚刺激性試験方法と季節間変動、被験者間差をなく
した皮膚刺激性試験法を提供する。 【解決手段】培養人工皮膚の表皮表面に、被験物質を接
触させることにより生じた表皮角質層の構造的変化を観
察することを特徴とする皮膚刺激性試験方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、人工的に構築され
た培養人工皮膚を用いて、被験物質の皮膚に対する刺激
性を試験する皮膚刺激性試験法に関する。
た培養人工皮膚を用いて、被験物質の皮膚に対する刺激
性を試験する皮膚刺激性試験法に関する。
【０００２】
【従来の技術】種々の化学物質の使用に際して、皮膚刺
激性試験を実施し、その安全性の評価を行う必要があ
る。現在、皮膚刺激性の評価には、動物やヒトを用いた
試験結果が用いられている。
激性試験を実施し、その安全性の評価を行う必要があ
る。現在、皮膚刺激性の評価には、動物やヒトを用いた
試験結果が用いられている。
【０００３】動物を用いた皮膚刺激性試験には、ドレイ
ズ試験法が行われており、ウサギ、モルモット、ラット
などの動物が使用されている。動物を使用する毒性試験
は、時間と経費がかかるばかりか、研究施設間の結果の
再現性など種々の問題点を有する。動物試験の結果は、
ヒトに対する結果と異なる場合もあり、ヒトへの外挿に
困難を有する。すなわち、経験則にもとずく動物からヒ
トへの外捜の理論の科学的未熟さが、動物実験に内在す
る不確実性の一つとなり、問題点として提起されてい
る。加えて、最近、動物愛護の見地より次第に動物試験
法の使用が制限されるようになってきている。
ズ試験法が行われており、ウサギ、モルモット、ラット
などの動物が使用されている。動物を使用する毒性試験
は、時間と経費がかかるばかりか、研究施設間の結果の
再現性など種々の問題点を有する。動物試験の結果は、
ヒトに対する結果と異なる場合もあり、ヒトへの外挿に
困難を有する。すなわち、経験則にもとずく動物からヒ
トへの外捜の理論の科学的未熟さが、動物実験に内在す
る不確実性の一つとなり、問題点として提起されてい
る。加えて、最近、動物愛護の見地より次第に動物試験
法の使用が制限されるようになってきている。
【０００４】ヒトを用いた皮膚刺激性試験には、ヒト腕
の浸漬またはその修正法や、パッチテストが行われてい
る。ヒトに対する試験は、主に最終商品についてのみ行
われており、未知の原材料に対して刺激性を試験するこ
とは、倫理上困難である。さらに、ヒト試験において
は、被験者間の刺激感受性の個体差、並びに季節間変動
よる被刺激性の違いがあり、試験結果の再現性に問題が
ある。
の浸漬またはその修正法や、パッチテストが行われてい
る。ヒトに対する試験は、主に最終商品についてのみ行
われており、未知の原材料に対して刺激性を試験するこ
とは、倫理上困難である。さらに、ヒト試験において
は、被験者間の刺激感受性の個体差、並びに季節間変動
よる被刺激性の違いがあり、試験結果の再現性に問題が
ある。
【０００５】そこで、これらの問題提起に対する回答と
して、ヒト由来細胞の培養系を毒性試験法に採用するこ
とが提唱され、種々のインビトロ試験法の研究が行われ
てきた。インビトロ法については、主に化粧品業界にお
いて、近年、動物実験代替法の研究が精力的に進められ
てきており、初代細胞、株化細胞を利用した単層培養方
法をはじめ、種々の方法が考案されてきた。それらの方
法は、細胞をシャーレなどの培養器に播種し、培地中に
被験物質を入れ、その被験物質の細胞への直接的な毒性
作用を検出する方法が行われており、特に、刺激性の分
野では細胞の生存率、細胞死を測定している。これらの
試験濃度は、ヒトに対する刺激性を調べる上では、低濃
度となり、被験物質の実使用濃度との隔差により、検出
された結果のヒトへの外捜が難しい。
して、ヒト由来細胞の培養系を毒性試験法に採用するこ
とが提唱され、種々のインビトロ試験法の研究が行われ
てきた。インビトロ法については、主に化粧品業界にお
いて、近年、動物実験代替法の研究が精力的に進められ
てきており、初代細胞、株化細胞を利用した単層培養方
法をはじめ、種々の方法が考案されてきた。それらの方
法は、細胞をシャーレなどの培養器に播種し、培地中に
被験物質を入れ、その被験物質の細胞への直接的な毒性
作用を検出する方法が行われており、特に、刺激性の分
野では細胞の生存率、細胞死を測定している。これらの
試験濃度は、ヒトに対する刺激性を調べる上では、低濃
度となり、被験物質の実使用濃度との隔差により、検出
された結果のヒトへの外捜が難しい。
【０００６】皮膚に対する刺激性は、被験物質の暴露様
式から勘案すると、まず、被験物質が皮膚最外層の角質
層に作用し、角質の破壊、分解、浸透が行われる。これ
により、角質層のバリア障害が生じ、その後、被験物質
は、表皮生細胞層である顆粒層、有棘層、基底層、真皮
層へと移行、蓄積し、生細胞への直接的な刺激が起こ
る。このように、皮膚に対する刺激性は、細胞に対する
毒性のみでは、反映されず、角質層を含む表皮全体への
刺激を総合して予知する必要がある。すなわち、通常の
細胞毒性試験は、角質層を持たない細胞に対する過剰暴
露による細胞死を指標としているため、皮膚刺激性試験
において角質層透過性の少ない被験物質に対しても有意
な皮膚刺激性試験結果を生む。このように皮膚透過速度
と被験物質自体の細胞毒性度を考慮に入れ、刺激性評価
を行う必要がある。特に、最近、皮膚刺激試験では角質
層が重要な要因として注目されてきている。
式から勘案すると、まず、被験物質が皮膚最外層の角質
層に作用し、角質の破壊、分解、浸透が行われる。これ
により、角質層のバリア障害が生じ、その後、被験物質
は、表皮生細胞層である顆粒層、有棘層、基底層、真皮
層へと移行、蓄積し、生細胞への直接的な刺激が起こ
る。このように、皮膚に対する刺激性は、細胞に対する
毒性のみでは、反映されず、角質層を含む表皮全体への
刺激を総合して予知する必要がある。すなわち、通常の
細胞毒性試験は、角質層を持たない細胞に対する過剰暴
露による細胞死を指標としているため、皮膚刺激性試験
において角質層透過性の少ない被験物質に対しても有意
な皮膚刺激性試験結果を生む。このように皮膚透過速度
と被験物質自体の細胞毒性度を考慮に入れ、刺激性評価
を行う必要がある。特に、最近、皮膚刺激試験では角質
層が重要な要因として注目されてきている。
【０００７】最近、これらの欠点を補うために、ヒト皮
膚培養法の進歩に従い、皮膚刺激性を予測するために、
角質層を有する培養人工皮膚を用いた検討も行われてき
ており、素材として、その有用性が示されている。培養
人工皮膚を用いた刺激性の測定方法として、現在、生細
胞数、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）、乳酸脱水素酵素
（ＬＤＨ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、イ
ンターロイキン１（ＩＬ−１）等の測定法が使用されて
いるが、これらはすべて、角質を透過した被験物質によ
る細胞への直接的障害を評価する方法である（特開平 5
-336996 号公報、特開平 6-180311 号公報) 。特に、現
在、行われているインビトロ刺激性試験法は、ＭＴＴ試
験法やＬＤＨ試験法のような、細胞の生死を種々の検出
法で検出することに集中している。
膚培養法の進歩に従い、皮膚刺激性を予測するために、
角質層を有する培養人工皮膚を用いた検討も行われてき
ており、素材として、その有用性が示されている。培養
人工皮膚を用いた刺激性の測定方法として、現在、生細
胞数、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）、乳酸脱水素酵素
（ＬＤＨ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、イ
ンターロイキン１（ＩＬ−１）等の測定法が使用されて
いるが、これらはすべて、角質を透過した被験物質によ
る細胞への直接的障害を評価する方法である（特開平 5
-336996 号公報、特開平 6-180311 号公報) 。特に、現
在、行われているインビトロ刺激性試験法は、ＭＴＴ試
験法やＬＤＨ試験法のような、細胞の生死を種々の検出
法で検出することに集中している。
【０００８】これら検出法の内、比較的操作の簡便なＭ
ＴＴ試験法を挙げると、そこには、ＭＴＴと薬剤の反応
性を考慮するだけでなく、操作面にも、経験を有した技
量が必要であるため、検出上の手技的な刺激性の誤認の
危険性がある。さらに、これらの方法は、その主体は、
細胞毒性を指標としたものであり、上記細胞毒性試験と
同様に煩雑な測定操作が必要となる。さらに、皮膚への
最初の刺激様相を示す角質層の障害を直接的に反映した
ものではない。
ＴＴ試験法を挙げると、そこには、ＭＴＴと薬剤の反応
性を考慮するだけでなく、操作面にも、経験を有した技
量が必要であるため、検出上の手技的な刺激性の誤認の
危険性がある。さらに、これらの方法は、その主体は、
細胞毒性を指標としたものであり、上記細胞毒性試験と
同様に煩雑な測定操作が必要となる。さらに、皮膚への
最初の刺激様相を示す角質層の障害を直接的に反映した
ものではない。
【０００９】河合らは、インビボ試験であるヒトパッチ
テストにおいて、皮膚紅斑などの皮膚刺激指標で刺激性
を評価するのではなく、皮膚表層の角質形状に生じる鱗
屑、肥厚を障害の指標と定め皮膚刺激を解析することに
より、皮膚刺激性評価に対し、良好な結果を得ている。
皮膚の角質層に対する刺激性は、細胞死に至らない時点
で皮膚変化が生じることに起因する。これには、サイト
カイン（例えばＩＬ−１）や種々の炎症性物質（例えば
ＰＧＥ２）の関与が想定される。
テストにおいて、皮膚紅斑などの皮膚刺激指標で刺激性
を評価するのではなく、皮膚表層の角質形状に生じる鱗
屑、肥厚を障害の指標と定め皮膚刺激を解析することに
より、皮膚刺激性評価に対し、良好な結果を得ている。
皮膚の角質層に対する刺激性は、細胞死に至らない時点
で皮膚変化が生じることに起因する。これには、サイト
カイン（例えばＩＬ−１）や種々の炎症性物質（例えば
ＰＧＥ２）の関与が想定される。
【００１０】インビトロ試験法において、これらを測定
することが考案され、検討が進められているが、その溶
出量が微量であるため、検出が困難である。このよう
に、微量因子測定となり、測定操作上も煩雑な操作がよ
り必要となる。現在、皮膚刺激性評価の為、これら因子
の測定が試みられているが、単一の因子で刺激性を推察
できないこと、因子の刺激に関与する機序がわからない
ことが現状であり、皮膚刺激性評価に対する代替試験法
としては不明な点が多いことから、現在のところ、皮膚
刺激性への評価適応が難しい。
することが考案され、検討が進められているが、その溶
出量が微量であるため、検出が困難である。このよう
に、微量因子測定となり、測定操作上も煩雑な操作がよ
り必要となる。現在、皮膚刺激性評価の為、これら因子
の測定が試みられているが、単一の因子で刺激性を推察
できないこと、因子の刺激に関与する機序がわからない
ことが現状であり、皮膚刺激性評価に対する代替試験法
としては不明な点が多いことから、現在のところ、皮膚
刺激性への評価適応が難しい。
【００１１】ところで、上述したように、角質層に対す
る刺激性を知ることは、被験物質の皮膚刺激性の予測に
重要である。特に、インビトロ法によって、刺激を受け
た角質層の特徴的な障害を検出し、被験物質の皮膚刺激
性を予測することは重要である。上述のＭＴＴ試験やサ
イトカインや炎症性物質の測定は、各段階での刺激評価
法としては有用な検査法であるが、直接的に角質障害を
予知、観察することは出来ない。さらに、前述した様
に、操作は煩雑であり、種々の経験を有した研究者によ
る評価に限られる。
る刺激性を知ることは、被験物質の皮膚刺激性の予測に
重要である。特に、インビトロ法によって、刺激を受け
た角質層の特徴的な障害を検出し、被験物質の皮膚刺激
性を予測することは重要である。上述のＭＴＴ試験やサ
イトカインや炎症性物質の測定は、各段階での刺激評価
法としては有用な検査法であるが、直接的に角質障害を
予知、観察することは出来ない。さらに、前述した様
に、操作は煩雑であり、種々の経験を有した研究者によ
る評価に限られる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、種々の刺激検出操作を加えずに、皮膚組織に対
する被験物質の角質層に及ぼす刺激性を試験する、簡便
な皮膚刺激性試験方法と季節間変動、被験者間差をなく
した皮膚刺激性試験法を提供することにある。
目的は、種々の刺激検出操作を加えずに、皮膚組織に対
する被験物質の角質層に及ぼす刺激性を試験する、簡便
な皮膚刺激性試験方法と季節間変動、被験者間差をなく
した皮膚刺激性試験法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は培養
人工皮膚の表皮表面に、被験物質を接触させることによ
り生じた表皮角質層の構造的変化を測定することを特徴
とする皮膚刺激性試験方法である。
人工皮膚の表皮表面に、被験物質を接触させることによ
り生じた表皮角質層の構造的変化を測定することを特徴
とする皮膚刺激性試験方法である。
【００１４】
【発明の実施態様】まず、本発明の皮膚刺激性試験に用
いる培養人工皮膚とは、天然の皮膚組織に類似したもの
であって、生体より単離された皮膚の細胞から、細胞培
養技術を用いて、皮膚構造を再構築させたものであり、
表皮層と真皮層よりなる多細胞層の構造物、あるいは、
表皮層のみの多細胞層の構造物である。表皮層は、表皮
細胞層が積み重なった構造を有し、所定の分化した表皮
細胞群で構成され、各細胞は生存している。表皮細胞群
としては、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角質層より
なる。また、角質層表面は、適度に乾燥していることが
望ましい。表皮細胞群は、生存していることが必要であ
り、生存していないと、表皮細胞間の結合と角質層の構
造の破壊が起こり、角質層を介した刺激性を測定する上
で好ましくない。
いる培養人工皮膚とは、天然の皮膚組織に類似したもの
であって、生体より単離された皮膚の細胞から、細胞培
養技術を用いて、皮膚構造を再構築させたものであり、
表皮層と真皮層よりなる多細胞層の構造物、あるいは、
表皮層のみの多細胞層の構造物である。表皮層は、表皮
細胞層が積み重なった構造を有し、所定の分化した表皮
細胞群で構成され、各細胞は生存している。表皮細胞群
としては、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角質層より
なる。また、角質層表面は、適度に乾燥していることが
望ましい。表皮細胞群は、生存していることが必要であ
り、生存していないと、表皮細胞間の結合と角質層の構
造の破壊が起こり、角質層を介した刺激性を測定する上
で好ましくない。
【００１５】培養人工皮膚の構造は、具体的には、コラ
ーゲン等の細胞外マトリックス、またはそれに皮膚線維
芽細胞を含有する基材上に基底細胞層、有棘細胞層、顆
粒細胞層、角質層よりなる表皮層が重層した構造を持
ち、例えば、ベル（Bell) により報告されたものは、真
皮から採取された線維芽細胞をコラーゲンゲル中で培養
し、この上に表皮から採取した表皮細胞を培養するもの
である(Bell ら、Science, Vol.211, p.1052, 1981年)
（図４参照）。また、コラーゲンスポンジの上に、表皮
細胞を培養させ、製造する方法がある(Boyceら、Surger
y, Vol.103, p.421, 1988 年) 。培養人工皮膚の市販品
としては、ＬＳＥ（Living Skin Equivalent、東洋紡績
製) や Epiderm (MatTek Corporation製) などがある。
ーゲン等の細胞外マトリックス、またはそれに皮膚線維
芽細胞を含有する基材上に基底細胞層、有棘細胞層、顆
粒細胞層、角質層よりなる表皮層が重層した構造を持
ち、例えば、ベル（Bell) により報告されたものは、真
皮から採取された線維芽細胞をコラーゲンゲル中で培養
し、この上に表皮から採取した表皮細胞を培養するもの
である(Bell ら、Science, Vol.211, p.1052, 1981年)
（図４参照）。また、コラーゲンスポンジの上に、表皮
細胞を培養させ、製造する方法がある(Boyceら、Surger
y, Vol.103, p.421, 1988 年) 。培養人工皮膚の市販品
としては、ＬＳＥ（Living Skin Equivalent、東洋紡績
製) や Epiderm (MatTek Corporation製) などがある。
【００１６】本発明では、まず、培養人工皮膚を例え
ば、シャーレ又は培養プレートに入れ、さらに栄養培地
を培養皮膚底面に接触するように加え、皮膚表面は、空
気に曝された状態で培養できるようにする（図５参
照）。栄養培地としては、必須細胞栄養素を含む基礎培
地、あるいはその基礎培地に種々の添加物を含む培地で
あり、その一例としては、ハムF-12(HamF-12) 培地とダ
ルベッコ修正イーグル培地(DMEM)の混合培地に、牛胎児
血清などの添加物を加えた培地、例えば、ＬＳＥ用アッ
セイ培地（東洋紡績製）などを用いる。培養人工皮膚
は、基本的には、実験全体にわたり、約３７℃付近で、
約５〜１０％二酸化炭素下、湿潤雰囲気中で維持され
る。
ば、シャーレ又は培養プレートに入れ、さらに栄養培地
を培養皮膚底面に接触するように加え、皮膚表面は、空
気に曝された状態で培養できるようにする（図５参
照）。栄養培地としては、必須細胞栄養素を含む基礎培
地、あるいはその基礎培地に種々の添加物を含む培地で
あり、その一例としては、ハムF-12(HamF-12) 培地とダ
ルベッコ修正イーグル培地(DMEM)の混合培地に、牛胎児
血清などの添加物を加えた培地、例えば、ＬＳＥ用アッ
セイ培地（東洋紡績製）などを用いる。培養人工皮膚
は、基本的には、実験全体にわたり、約３７℃付近で、
約５〜１０％二酸化炭素下、湿潤雰囲気中で維持され
る。
【００１７】本発明においては、次いで培養人工皮膚の
表皮表面に被験物質を接触させる。被験物質を接触させ
る手段としては、ヒト皮膚パッチテスト等に用いられる
フィンチャンバー、コットンパッド、濾紙、スポンジ、
ガーゼ、不織布等に被験物質を浸み込ませるて接触させ
るか、直接、被験物質を該表皮表面に接触させてもよ
い。ここで適用される被験物質とは、液状、クリーム
状、ゲル状、固形状などの形状を有した物質及び製品を
示す。
表皮表面に被験物質を接触させる。被験物質を接触させ
る手段としては、ヒト皮膚パッチテスト等に用いられる
フィンチャンバー、コットンパッド、濾紙、スポンジ、
ガーゼ、不織布等に被験物質を浸み込ませるて接触させ
るか、直接、被験物質を該表皮表面に接触させてもよ
い。ここで適用される被験物質とは、液状、クリーム
状、ゲル状、固形状などの形状を有した物質及び製品を
示す。
【００１８】これらには、界面活性剤（アニオン系、カ
チオン系、または非イオン系）とこれらの界面活性剤を
含む製品、例えば、シャンプー、洗剤、コンディショナ
ー、食器洗浄液、スキンクレンザー、クリーニング剤お
よびスキンケア品目などがある。上記記載から明らかな
ように、皮膚と接触する他の成分または製品を適用して
もよい。本発明では培養人工皮膚の表面に密着するよう
に、被験物質を接触させる必要がある。密着していない
と、角質層への被験物質の浸透、刺激が不均一になる。
チオン系、または非イオン系）とこれらの界面活性剤を
含む製品、例えば、シャンプー、洗剤、コンディショナ
ー、食器洗浄液、スキンクレンザー、クリーニング剤お
よびスキンケア品目などがある。上記記載から明らかな
ように、皮膚と接触する他の成分または製品を適用して
もよい。本発明では培養人工皮膚の表面に密着するよう
に、被験物質を接触させる必要がある。密着していない
と、角質層への被験物質の浸透、刺激が不均一になる。
【００１９】本発明では、培養人工皮膚の表面に、密着
するように被験物質を適用した後、培養器内、または大
気上で、一定時間暴露させ、皮膚障害部位を作成する。
皮膚障害部位とは、被験物質により暴露された部位をい
う。このように、被験物質を適用した培養皮膚を培地上
に載せ、角質表面を培地と接触させないようにして一定
時間培養を行うことにより、皮膚角質層は、被験物質に
より暴露され、ヒトへの適用と同等の被験物質暴露様式
が保持される。栄養培地としては、必須細胞栄養素を含
む基礎培地、あるいはその基礎培地に種々の添加物を含
む培地であり、その一例としては、ハムF-12(HamF-12)
培地とダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)の混合培地
に、牛胎児血清などの添加物を加えた培地、例えば、Ｌ
ＳＥ用アッセイ培地（東洋紡績製）などを用いる。培養
人工皮膚は、基本的には、実験全体にわたり、約３７℃
付近で約５〜１０％二酸化炭素下、湿潤雰囲気中で維持
される。
するように被験物質を適用した後、培養器内、または大
気上で、一定時間暴露させ、皮膚障害部位を作成する。
皮膚障害部位とは、被験物質により暴露された部位をい
う。このように、被験物質を適用した培養皮膚を培地上
に載せ、角質表面を培地と接触させないようにして一定
時間培養を行うことにより、皮膚角質層は、被験物質に
より暴露され、ヒトへの適用と同等の被験物質暴露様式
が保持される。栄養培地としては、必須細胞栄養素を含
む基礎培地、あるいはその基礎培地に種々の添加物を含
む培地であり、その一例としては、ハムF-12(HamF-12)
培地とダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)の混合培地
に、牛胎児血清などの添加物を加えた培地、例えば、Ｌ
ＳＥ用アッセイ培地（東洋紡績製）などを用いる。培養
人工皮膚は、基本的には、実験全体にわたり、約３７℃
付近で約５〜１０％二酸化炭素下、湿潤雰囲気中で維持
される。
【００２０】本発明では一定時間培養後、被験物質で処
理された培養人工皮膚をシャーレまたは培養プレートか
ら取り出し、被験物質を除去し、表皮角質層の構造変化
を顕微鏡にて、角質層刺激所見（蛇行筋状または輝線
状）を観察する。
理された培養人工皮膚をシャーレまたは培養プレートか
ら取り出し、被験物質を除去し、表皮角質層の構造変化
を顕微鏡にて、角質層刺激所見（蛇行筋状または輝線
状）を観察する。
【００２１】該被験物質暴露部位の角質層の変化の顕微
鏡にて観察を行うことにより、刺激度評価を行う。その
結果、角質層内に、被験物質の刺激により、角質層刺激
所見（蛇行線状所見）が高感度、用量依存的に、再現性
をもって観察され、その変化の強弱は、被験物質の皮膚
に対する刺激性と相関することが認められる。この刺激
性評価は、各濃度の標準物質（例えば、ＳＬＳ）による
試験で得られた刺激所見を用い、刺激度分類することが
できる。または、刺激所見（蛇行線状所見）の画像解析
により行うことも出来る。必要ならば、検鏡前に組織染
色を行ってもよい。その観察の後、細胞生存率や組織化
学的評価を行うこともできる。
鏡にて観察を行うことにより、刺激度評価を行う。その
結果、角質層内に、被験物質の刺激により、角質層刺激
所見（蛇行線状所見）が高感度、用量依存的に、再現性
をもって観察され、その変化の強弱は、被験物質の皮膚
に対する刺激性と相関することが認められる。この刺激
性評価は、各濃度の標準物質（例えば、ＳＬＳ）による
試験で得られた刺激所見を用い、刺激度分類することが
できる。または、刺激所見（蛇行線状所見）の画像解析
により行うことも出来る。必要ならば、検鏡前に組織染
色を行ってもよい。その観察の後、細胞生存率や組織化
学的評価を行うこともできる。
【００２２】
【実施例】次に本発明を実施例を用いて具体的に説明す
る。実施例１ 培養人工皮膚（ＬＳＥ：Living Skin Equivalent、東洋
紡社製）を６穴のウェルを有する培養プレートに底面側
を下にして入れた。ＬＳＥはトランスウェル（コースタ
ー社製）内で培養された培養人工皮膚で、実験にはトラ
ンスウェルとともに使用した。この６穴プレートの各ウ
エルの培養人工皮膚の底面に接触するように、アッセイ
培地（東洋紡社製）を１．２ｍｌ加えた。次に、培養人
工皮膚の表面に約８ｍｍ角のコットンパッドを載せ、こ
のコットンパッドに５０μｌの０．２％ＳＬＳ溶液（So
dium Lauryl Sulfate)を加えた。炭酸ガスインキュベー
ター内で培養人工皮膚を１６時間、被験物質に暴露を施
した後、培養人工皮膚を炭酸ガスインキュベーターから
取り出し、顕微鏡を用いて、被験物質を暴露させた角質
層部分を観察した。また比較のために、ＳＬＳ溶液で処
理しなかった培養人工皮膚の角質層部分を観察した。そ
の結果を図１に示す。図１中、上部は未処理培養人工皮
膚であり、下部はＳＬＳ処理した培養人工皮膚である。
図１から明らかなように、本発明のＳＬＳ処理した培養
人工皮膚では、被験物質の刺激による蛇行線状所見が角
質層に観察された。
る。実施例１ 培養人工皮膚（ＬＳＥ：Living Skin Equivalent、東洋
紡社製）を６穴のウェルを有する培養プレートに底面側
を下にして入れた。ＬＳＥはトランスウェル（コースタ
ー社製）内で培養された培養人工皮膚で、実験にはトラ
ンスウェルとともに使用した。この６穴プレートの各ウ
エルの培養人工皮膚の底面に接触するように、アッセイ
培地（東洋紡社製）を１．２ｍｌ加えた。次に、培養人
工皮膚の表面に約８ｍｍ角のコットンパッドを載せ、こ
のコットンパッドに５０μｌの０．２％ＳＬＳ溶液（So
dium Lauryl Sulfate)を加えた。炭酸ガスインキュベー
ター内で培養人工皮膚を１６時間、被験物質に暴露を施
した後、培養人工皮膚を炭酸ガスインキュベーターから
取り出し、顕微鏡を用いて、被験物質を暴露させた角質
層部分を観察した。また比較のために、ＳＬＳ溶液で処
理しなかった培養人工皮膚の角質層部分を観察した。そ
の結果を図１に示す。図１中、上部は未処理培養人工皮
膚であり、下部はＳＬＳ処理した培養人工皮膚である。
図１から明らかなように、本発明のＳＬＳ処理した培養
人工皮膚では、被験物質の刺激による蛇行線状所見が角
質層に観察された。
【００２３】実施例２および比較例１ 炭素原子数４〜１８個のアルキルサルフェートのアルキ
ル鎖長による刺激性について、ＭＴＴ試験法との比較を
行った。アルキルサルフェートは、ヒトパッチテストに
おいて、炭素原子数１２〜１４個のアルキル鎖長を頂点
に、山状の皮膚刺激性を示すことが公知となっている
（Klaus-P, Wilhelmら、Journal of Investigative Der
matology, vol. 101, No.3, p.310-315, 1993)。
ル鎖長による刺激性について、ＭＴＴ試験法との比較を
行った。アルキルサルフェートは、ヒトパッチテストに
おいて、炭素原子数１２〜１４個のアルキル鎖長を頂点
に、山状の皮膚刺激性を示すことが公知となっている
（Klaus-P, Wilhelmら、Journal of Investigative Der
matology, vol. 101, No.3, p.310-315, 1993)。
【００２４】まず、培養人工皮膚（ＬＳＥ：Living Ski
n Equivalent、東洋紡社製）を６穴のウェルを有する培
養プレートに入れ、この６穴プレートの各ウエルの培養
人工皮膚の底面に接触するように、アッセイ培地（東洋
紡社製）を１．２ｍｌ加えた。次に、培養人工皮膚の表
面に約８ｍｍ角のコットンパッドをのせた。このコット
ンパッドに０．２％濃度に調製した炭素原子数が異なる
アルキル鎖長のアルキルサルフェート（Ｃ４、Ｃ６、Ｃ
８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）をそれ
ぞれ５０μｌ加えた。炭酸ガスインキュベーター内で１
６時間培養後、培養人工皮膚を炭酸ガスインキュベータ
ーから取り出し、コットンパッドをピンセットを用いて
除いた。その後、顕微鏡を用いて、アルキルサルフェー
トを暴露させた角質層部分を観察した。その結果を図２
に示す。
n Equivalent、東洋紡社製）を６穴のウェルを有する培
養プレートに入れ、この６穴プレートの各ウエルの培養
人工皮膚の底面に接触するように、アッセイ培地（東洋
紡社製）を１．２ｍｌ加えた。次に、培養人工皮膚の表
面に約８ｍｍ角のコットンパッドをのせた。このコット
ンパッドに０．２％濃度に調製した炭素原子数が異なる
アルキル鎖長のアルキルサルフェート（Ｃ４、Ｃ６、Ｃ
８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）をそれ
ぞれ５０μｌ加えた。炭酸ガスインキュベーター内で１
６時間培養後、培養人工皮膚を炭酸ガスインキュベータ
ーから取り出し、コットンパッドをピンセットを用いて
除いた。その後、顕微鏡を用いて、アルキルサルフェー
トを暴露させた角質層部分を観察した。その結果を図２
に示す。
【００２５】比較試験法であるＭＴＴ試験法は、予め被
験物質の薬剤暴露部位を確保するリング（東洋紡社製）
を表面に接着させた培養人工皮膚（ＬＳＥ：Living Ski
n Equivalent、東洋紡社製）を６穴のウェルを有する培
養プレートに入れ、この６穴プレートの各ウエルの培養
人工皮膚の底面に接触するように、アッセイ培地（東洋
紡社製）を１．２ｍｌ加えた。各リング中央部に０．２
％の各アルキルサルフェート溶液を８０μｌ加え、炭酸
ガスインキュベーター内で１６時間培養を行った。培養
終了後、アッセイ培地をＭＴＴ試薬が０．３３３ｍｇ／
ｍｌの濃度で含まれるＭＴＴ含有アッセイ培地に交換
し、さらに３時間炭酸ガスインキュベーター内で培養し
た。その後、被験物質暴露部を直径８ｍｍのバイオプシ
ーパンチでくり抜き、くり抜いた部分を０．３ｍｌの酸
性イソプロパノール液に漬け、生成した青紫色のホルマ
ザンの抽出を２時間行った。抽出終了後、９６穴マイク
ロプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍの吸光度を測
定した。その結果を図３に示す。
験物質の薬剤暴露部位を確保するリング（東洋紡社製）
を表面に接着させた培養人工皮膚（ＬＳＥ：Living Ski
n Equivalent、東洋紡社製）を６穴のウェルを有する培
養プレートに入れ、この６穴プレートの各ウエルの培養
人工皮膚の底面に接触するように、アッセイ培地（東洋
紡社製）を１．２ｍｌ加えた。各リング中央部に０．２
％の各アルキルサルフェート溶液を８０μｌ加え、炭酸
ガスインキュベーター内で１６時間培養を行った。培養
終了後、アッセイ培地をＭＴＴ試薬が０．３３３ｍｇ／
ｍｌの濃度で含まれるＭＴＴ含有アッセイ培地に交換
し、さらに３時間炭酸ガスインキュベーター内で培養し
た。その後、被験物質暴露部を直径８ｍｍのバイオプシ
ーパンチでくり抜き、くり抜いた部分を０．３ｍｌの酸
性イソプロパノール液に漬け、生成した青紫色のホルマ
ザンの抽出を２時間行った。抽出終了後、９６穴マイク
ロプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍの吸光度を測
定した。その結果を図３に示す。
【００２６】図２から明らかなように、本発明法では、
炭素原子数１２個を頂点に蛇行線状所見が観察され、炭
素原子数４〜１８個にわたり、山状の刺激分類がなされ
た。ところが、ＭＴＴ試験法では、図３から明らかなよ
うに、炭素原子数１２個において、著しい刺激性が観察
されたが、炭素原子数４〜１０個、１４〜１８個におい
ては、各アルキルサルフェートによる刺激性は検出され
なかった。
炭素原子数１２個を頂点に蛇行線状所見が観察され、炭
素原子数４〜１８個にわたり、山状の刺激分類がなされ
た。ところが、ＭＴＴ試験法では、図３から明らかなよ
うに、炭素原子数１２個において、著しい刺激性が観察
されたが、炭素原子数４〜１０個、１４〜１８個におい
ては、各アルキルサルフェートによる刺激性は検出され
なかった。
【００２７】
【発明の効果】本発明では、皮膚組織に類似した培養人
工皮膚を使用し、これに被験物質を適用し、角質層にお
ける皮膚刺激性を種々の刺激検出操作を加えずに、皮膚
角質層の変化を顕微鏡観察することによって、皮膚刺激
性を評価する方法である。本発明方法は、操作の簡便
性、刺激の識別性、感度、再現性、経済性の面からも、
優れた方法であり、インビトロ皮膚刺激性試験法として
有用である。
工皮膚を使用し、これに被験物質を適用し、角質層にお
ける皮膚刺激性を種々の刺激検出操作を加えずに、皮膚
角質層の変化を顕微鏡観察することによって、皮膚刺激
性を評価する方法である。本発明方法は、操作の簡便
性、刺激の識別性、感度、再現性、経済性の面からも、
優れた方法であり、インビトロ皮膚刺激性試験法として
有用である。
【図１】実施例１において、皮膚刺激指標となる蛇行線
状所見を示した図に代わる顕微鏡写真である。
状所見を示した図に代わる顕微鏡写真である。
【図２】実施例２において、炭素原子数４〜１８個のア
ルキルサルフェートに対して、試験された結果について
示した図に代わる顕微鏡写真である。
ルキルサルフェートに対して、試験された結果について
示した図に代わる顕微鏡写真である。
【図３】比較例１において、炭素原子数４〜１８個のア
ルキルサルフェートに対して、ＭＴＴ試験法で試験され
た結果について示した図である。
ルキルサルフェートに対して、ＭＴＴ試験法で試験され
た結果について示した図である。
【図４】培養人工皮膚の一例の構造を示す図である。
【図５】本発明の皮膚刺激性試験方法の一例を示す図で
ある。
ある。
Claims (3)
- 【請求項１】 培養人工皮膚の表皮表面に、被験物質を
接触させることにより生じた表皮角質層の構造的変化を
観察することを特徴とする皮膚刺激性試験方法。 - 【請求項２】 表皮角質層の構造変化が、顕微鏡観察
下、蛇行筋状または輝線状であり、構造的変化を顕微鏡
下に観察する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 培養人工皮膚が、分化したヒト皮膚表皮
細胞からなる角質層を有する請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9134785A JPH10323184A (ja) | 1997-05-26 | 1997-05-26 | 皮膚刺激性試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9134785A JPH10323184A (ja) | 1997-05-26 | 1997-05-26 | 皮膚刺激性試験方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10323184A true JPH10323184A (ja) | 1998-12-08 |
Family
ID=15136503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9134785A Pending JPH10323184A (ja) | 1997-05-26 | 1997-05-26 | 皮膚刺激性試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10323184A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013134087A (ja) * | 2011-12-26 | 2013-07-08 | Shiseido Co Ltd | 化粧料の評価方法 |
-
1997
- 1997-05-26 JP JP9134785A patent/JPH10323184A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013134087A (ja) * | 2011-12-26 | 2013-07-08 | Shiseido Co Ltd | 化粧料の評価方法 |
| US9714936B2 (en) | 2011-12-26 | 2017-07-25 | Shiseido Company, Ltd. | Method for evaluating cosmetic |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040426 |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061005 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061204 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070111 |