ES2610653T3

ES2610653T3 - Composiciones y métodos para la administración de óxido nítrico

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Publication number: ES2610653T3
Application number: ES11189807.8T
Authority: ES
Inventors: Stephen P. L. Cary; Elizabeth M. Boon; Jonathan A. Winger; Michael A. Marletta
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2017-04-28
Anticipated expiration: 2027-05-21
Also published as: IN2013MN00600A; EP2040740A2; IN2013MN00601A; US20150376250A1; JP2009538133A; BRPI0711767B8; CN101495506A; ES2525226T3; WO2007139767A2; US20130289252A1; JP5698906B2; US9493526B2; DK2463294T3; BRPI0711767B1; NZ573003A; JP2009538134A; WO2007139767A3; US10202428B2; CA2653080A1; EP2463297A1

Abstract

Una composicion farmaceutica que comprende (i) una cantidad farmaceuticamente aceptable de una proteina HNOX y (ii) un vehiculo farmaceuticamente aceptable, en la que (a) las koff, k1 o k2 para el NO de la proteina H-NOX son de entre 1 x 10-4s-1 y 10 s-1 a 37 °C y la constante de disociacion de O2 de la proteina H-NOX es de al menos 1 μM a 37 °C, o (b) la constante de disociacion para el NO de la proteina H-NOX esta dentro de 2 ordenes de magnitud de la de la hemoglobina alfa humana y la reactividad con el NO de la proteina H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina alfa humana, y en donde la composicion farmaceutica es adecuada para administrar NO a seres humanos y en donde la proteina H-NOX comprende al menos una mutacion en el bolsillo distal, siendo dicha mutacion de un resto de A, D, E o G en la alfa-helice.

Description

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También se describe en el presente documento un ácido nucleico recombinante que codifica para una cualquiera o más de las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento. En particular, el ácido nucleico puede incluir un segmento, o la secuencia del ácido nucleico completa, de cualquiera de los ácidos nucleicos mostrados en las FIGS. 2 - 4 D u 8A -8 DD. El ácido nucleico puede codificar para una proteína de fusión que incluye un dominio 5 de la H-NOX y parte de, o toda, otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana). El ácido nucleico puede incluir al menos aproximadamente cualquiera de los 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,

o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de la H-NOX y contiene una o más mutaciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mutaciones) en comparación con el ácido nucleico de la H-NOX del que deriva. El ácido nucleico mutante de la H-NOX puede contener menos de aproximadamente cualquiera de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones en comparación con el ácido nucleico de la H-NOX del que deriva. También se describen variantes degeneradas de cualquier ácido nucleico que codifique para una proteína H-NOX mutante.

También se describe un vector que incluye uno cualquiera o más de los ácidos nucleicos mutantes de la H-NOX descritos en el presente documento. También se describe una célula que incluye uno cualquiera o más de los ácidos

15 nucleicos mutantes de la H-NOX descritos en el presente documento. La célula puede incluir cualquier vector descrito en el presente documento.

En el presente documento se describe un método para la producción de una proteína H-NOX. Este método implica el cultivo de una célula con un ácido nucleico que codifica para una cualquiera o más de las proteínas H-NOX mutantes descritas en el presente documento en unas condiciones adecuadas para la producción de la proteína H-NOX mutante. También se describe la inclusión de la etapa de purificar la proteína H-NOX mutante.

La invención presenta composiciones farmacéuticas que incluyen una o más proteínas H-NOX, tales como las proteínas H-NOX naturales o mutantes descritas en el presente documento. En algunas formas de realización, la

25 composición farmacéutica incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de una proteína H-NOX descrita en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, la koff, la k1 o la k2 para el NO de la proteína H-NOX está entre aproximadamente 1 x 104 s1 y aproximadamente 10 s1 a 37 °C, y la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX es de al menos aproximadamente 1 µM a 37 °C. En algunas formas de realización, la constante de disociación del NO de la proteína H-NOX es de unos 2 órdenes de magnitud la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina.

En algunas formas de realización de las composiciones farmacéuticas, la constante de disociación del NO de la proteína H-NOX es de unos 2 órdenes de magnitud la de la hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como una 35 constante de disociación del NO de entre 0,1 y 10 veces o de entre 0,5 y 2 veces la de hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas formas de realización de las composiciones farmacéuticas, la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de hemoglobina alfa de Homo sapiens, tal como al menos 100 veces o

1.000 veces menor que la de hemoglobina alfa de Homo sapiens. En algunas formas de realización de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX es una proteína natural. En algunas formas de realización de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX es una proteína mutante según se describe en este documento. En varias formas de realización de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX tiene al menos una mutación que altera la constante de disociación del NO, la koff para el NO, la k1 para el NO, la k2 para el NO, la constante de disociación del O2, la estabilidad del NO, la reactividad del NO, la velocidad de autoxidación del grupo hemo o cualquier combinación de dos o más de los anteriores, en comparación con la correspondiente a una 45 proteína natural. En algunas formas de realización de las composiciones farmacéuticas, la proteína H-NOX se elige de entre el grupo que consiste en la H-NOX de T. tengcongensis natural, la H-NOX I5A de T. tengcongensis, la H-NOX I5L de T. tengcongensis, la H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, la H-NOX W9F de T. tengcongensis, la H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, la H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, la H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, la H-NOX W9Y de T. tengcongensis, la H-NOX W9N de T. tengcongensis, la H-NOX W9H de T. tengcongensis, la H-NOX N74E de T. tengcongensis, la H-NOX N74A de T. tengcongensis, la H-NOX N74H de T. tengcongensis, la H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, la H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, la H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, la H-NOX P115A de T. tengcongensis, la H-NOX R135Q de T. tengcongensis, la H-NOX Y140F de T. tengcongensis, la H-NOX Y40L de T. tengcongensis, la H-NOX Y140H de T. tengcongensis, la H-NOX Y140A de T. tengcongensis, la I75F-His6 de T. tengcongensis, la I75F de T. tengcongensis, la L144F-His6

55 de T. tengcongensis, la L144F de T. tengcongensis, la 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, la H-NOX de L. pneumophilia 1 natural, la H-NOX de L. pneumophilia 2 natural, la 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, la H-NOX de D. desulfuricans natural, la H-NOX (728 - 899) de D. desulfuricans, la H-NOX Y139L de D. desulfuricans, la H-NOX de

H. sapiens β1 natural, la H. sapiens de β1 I140Y, la β1 I145Y de H. sapiens, la β1 (1 - 385) de H. sapiens, la β1 (1 385) I145Y de H. sapiens, la β1 (1-385) I145H de H. sapiens, la (1 - 194) de H. sapiens β1, la β1 (1 - 194) I145Y de

H. sapiens, la β1 (1 -194) L9W-I145Y de H. sapiens, la β2 (1 -217) de H. sapiens, la β2 (1 -217) I142Y de H. sapiens, la β1 H-NOX H105G de H. sapiens, la β1 H-NOX H105F de H. sapiens, la β1 H-NOX C78S de H. sapiens, la β1 H-NOX C78E de H. sapiens, la β1 de la H-NOX de R. norvegicus natural, la β1 (1 -385) de R. norvegicus, la β1 (1 - 385) I145Y de R. norvegicus, la β1 (1 - 385) I145H de R. norvegicus,la β1 (1 - 194)de R. norvegicus, la β1 (1

-194) I145Y de R. norvegicus, la β1 (1 - 194) L9W-I145Y de R. norvegicus, la β2 (1 -217)de R. norvegicus, la β2 (1

65 - 217) I142Y de R. norvegicus, la β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, la β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, la sGC β1 H-NOX C78S de R. norvegicus, la sGC β1 H-NOX C78E de R. norvegicus, la H-NOX (1 - 175) de C. botulinum, la

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gambiae str PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae str PEST Q7PS01_ANOGA, Anopheles gambiae str PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24086_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, Drosophila melanogaster GCYDB_DROME, Drosophila melanogaster Q9VA09_DROME, 5 Drosophila pseudoobscura Q29CE1_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C7_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C8_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q29BU7_DROPS, Aplysia californica Q7YWK7_APLCA,Hemicentrotus pulcherrimus Q95NK5_HEMPU, Chlamydomonas reinhardtii, Q5YLC2_CHLRE, Anabaena sp Q8YUQ7_ANASP, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5 9FLA0, proteobacteria gamma marina HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, proteobacteria gamma marina HTCC2207 Q YTK4_9GAMM, Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum JF5 Q2DG60_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3JOU9_RHOS4, Silicibacterpomeroyi Q5LPV1_SILPO, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC1 Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella 15 pneumophila subsp pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF49_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S 14 Q1ZWE5_9VIBR, Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio alginolyticus 12G01 Q1VCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722 Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5E1F5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, Oceanobacter sp RED65 Q1N035_9GAMM, Desulfovibrio desulfuricans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensis Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutilicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT, Clostridium tetani

25 Q899J9_CLOTE, y Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE. En algunas formas de realización de las composiciones, la proteína H-NOX no tiene una mutación en el motivo Y-S-R, que incluye la Tyr135, la Ser137 y la Arg139 de la H-NOX humana.

Salvo que explícitamente se mencione o lo dicte el contexto, todas las proteínas mutantes y naturales y todas las composiciones farmacéuticas según se describe en este documento pueden usarse en cualquiera de los métodos de administración de NO descritos en el presente documento. La proteína H-NOX puede tener o no un grupo hemo y/o NO unido, y puede estar o no unida covalentemente a otra molécula o fracción, tal como polietilenglicol. En algunas formas de realización, la proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de la H-NOX y parte de,

o toda, otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana).

35 En el presente documento también se describen kits que incluyen una o más proteínas H-NOX. En algunas formas de realización, el kit incluye una proteína H-NOX e instrucciones para el uso del kit para la administración de NO a un individuo. La koff, la k1 la o k2 para el NO de la proteína H-NOX puede ser de entre aproximadamente 1 x 104 s1 y aproximadamente 10 s1 a 37 °C, y la constante de disociación del O2 de la proteína H-NOX es de al menos aproximadamente 1 µM a 37 °C. La constante de disociación del NO de la proteína H-NOX puede ser de unos 2 órdenes de magnitud la de la hemoglobina, y la reactividad del NO de la proteína H-NOX es al menos 10 veces menor que la de la hemoglobina. Salvo que explícitamente se mencione o lo dicte el contexto, todas las proteínas mutantes y naturales y todas las composiciones farmacéuticas según se describe en este documento pueden usarse en cualquiera de los kits descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, la proteína H-NOX

45 puede tener o no un grupo hemo y/o NO unido, y puede estar o no unida covalentemente a otra molécula o fracción, tal como polietilenglicol. La proteína H-NOX es una proteína de fusión que incluye un dominio de la H-NOX y parte de, o toda, otra proteína, tal como albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana).

En el presente documento también se describe una proteína H-NOX (tal como cualquiera de las proteínas naturales

o mutantes descritas en el presente documento) para su uso como un medicamento. La proteína H-NOX puede usarse en un método de administración de NO a un individuo. La proteína H-NOX puede usarse para el tratamiento de cualquier afección en la que sea beneficiosa la administración de NO, tal como una afección cardiovascular, hipertensión, una afección exacerbada por la hipertensión (por ejemplo, una insuficiencia cardiaca, una insuficiencia renal o una apoplejía), una afección vasoconstrictora, una apoplejía, o una deficiencia funcional en NO.

55 También se describe en el presente documento el uso de una proteína H-NOX (tal como cualquiera de las proteínas naturales o mutantes descritas en el presente documento) para la elaboración de un medicamento, tal como un medicamento para la administración de NO a un individuo.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A es una imagen de la estructura tridimensional de los residuos del bolsillo distal de las proteínas H-NOX de unión NO y de unión al O2 (por encima del grupo hemo). También se muestran los residuos de coordinación del grupo hemo de las proteínas H-NOX de unión NO y de unión al O2 (por debajo del grupo hemo).

65 La FIG. 1A se basa en la estructura tridimensional de la H-NOX de T. tengcongensis notificada por Pellicena, P. et al., (31 de agosto de 2004). "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble

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LI F142Y: kox = 1,8 koff = 1,73 d Leu9, Leu78, Tyr142

H-NOX eucariotas para las que la proteína natural no se une al O2

β2 (1 - 217): kox = 0,18 No se formó complejo Leu9, Cys76, Ile142

β2(1-217) I142Y: g Leu9, Cys76, Tyr142

β 1(1 - 194): kox = 4,3 No se formó complejo Leu9, Cys78, Ile145

β1 (1 - 194) 1145Y: kox = 2,8 g Leu9, Cys78, Tyr145

β1 (1 - 194) L9W-I145Y: kox ∼ 10 g Trp9, Cys78, Tyr145

β 1(1 - 385): Estable e No se encontró complejo Leu9, Cys78, Ile145

β 1(1 - 385) I145Y: kox = 0,72 koff = 2,69 Leu9, Cys78, Tyr145

β 1(1 - 385) I145H: Leu9, Cys78, His145

β 1(1 - 385) C78Y: Leu9, Tyr78, Ile145

Otras H-NOX de las que se ha predicho que se unen al O2 como el constructo natural

Dd H-NOX (728 - 899): kox = 0,98 koff = 5,80 Phe9, Phe75, Tyr139

Dd Y139L: Phe9, Phe75, Leu139

Cb H-NOX (1 - 175): Constructo no estable h g Trp9, Phe78, Tyr140

Cb H-NOX (1 - 186): Ligeramente más estable i g Trp9, Phe78, Tyr140

Ca H-NOX (1 - 197): Constructo no estable h g Trp9, Phe78, Tyr140

Ca H-NOX (1 - 183): Ligeramente más estable i g Trp9, Phe78, Tyr140

Ce GCY-35 (1 - 252): Estable Se une al O2 e Phe9, Thr78, Tyr144

a

El constructo es estable frente a la oxidación (evaluado mediante la velocidad de autoxidación, kox [h1] a 37 °C) y/o la pérdida del grupo hemo. b La actividad de unión al O2 fue evaluada mediante la velocidad de disociación del O2 del grupo hemo a 20 °C (s1). c Después de 24 horas a 37 °C, todavía no hay signos de autoxidación. d Sólo una pequeña porción de la proteína forma un complejo con O2, la velocidad indicada representa la cinética para esta población. La proteína se une al O2 pero no se determinó la koff. f Aunque es relativamente estable, esta proteína precipita cuando se oxida, haciendo difícil la medición de la kox. g No aplicable debido a una inestabilidad o una rápida oxidación.

h "Constructo no estable" significa que la proteína se oxida inmediatamente en las condiciones ensayadas i "Ligeramente más estable" significa que la proteína se oxida en un periodo de entre minutos y horas, pero no permanece estable más allá de 24 horas en las condiciones ensayadas.

La Tabla 7 ilustra la alteración en la velocidad de asociación del O2 (kon), en la velocidad de disociación del O2 (koff), en la constante de disociación del O2 (KD) y en la velocidad de autoxidación (kox) de proteínas H-NOX mediante la introducción de una o más mutaciones. En algunas formas de realización, se combina cualquiera de las mutaciones

5 individuales o dobles recogidas en la Tabla 7 con otra mutación (tal como otra mutación de la Tabla 7 o cualquier otra mutación descrita en el presente documento) para alterar adicionalmente la velocidad de asociación del O2, la velocidad de disociación del O2, la constante de disociación del O2, la velocidad de autoxidación o combinaciones de dos o más de los anteriores.

10 Tabla 7. Constantes cinéticas de unión al O2 para proteínas con un grupo hemo de FeII ligado por histidilo

Proteína: KD a kon b koff c kox d Ref.

Tt H-NOX: 89,7 ± 6,2 13,6 ± 1,0 1,22 ± 0,09 e I

Tt P115A: 21,2 ± 2,1 10,4 ± 1,1 0,22 ± 0,01 e J

Tt 15A: ~ 80 0,82 ± 0,03 0,7 J

Tt 15 L: ~ 1.000 9,50 ± 0,64 0,6 J

Tt 15L-P115A: ~ 30 0,28 ± 0,01 0,6 J

Tt W9F: 305 ± 31 6,02 ± 0,62 1,84 ± 0,17 e I

Tt Y140F: f 15,7 ± 1,4 15,7 ± 9,8 0,05 J

Tt Y140L: ~ 2.000 Geminal 20,1 ± 2,0 0,19 I

Tt Y140H: ~ 500 5,03 ± 0,69 0,87 J

Tt W9F-Y140H: ~ 2.500 23,4 ± 3,7 0,11 J

Tt W9F-Y140L: No se observó complejo con el O2 0,12 1

Tt F78Y-Y140F: ~ 150 1,48 ± 0,33 e J

Tt F78Y-Y140L: ~ 80 0,83 ± 0,17 e I

Tt W9F-N74A: Milimolar muy lenta J

Dd H-NOX: Milimolar muy lenta 7,13 ± 0,45 0,14 J

Dd Y139L: No se observó complejo con el O2 j

β1 (1 - 385) I145Y: 70.000,00 0,00004 2,69 ± 0,61 0,72 i

L2 F142Y: 9.200 ± 3.000 0,40 ± 0,14 3,68 ± 0,71 i

Hs Hb beta: 267 60 16 n

Hs Hb alfa: 560 50 28 k

Sw Mb: 880 17 15 0,006 k

Bj FixL: 140.000 0,14 20 2,7 l

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HemAT-B: 720 32 23 0,06 m

a constante de disociación a 20 °C (nM); b velocidad de asociación del O2 del grupo hemo a 20 °C (µM1 s1); c velocidad de disociación del O2 del grupo hemo a 20 °C (s1); d velocidad de autoxidación del grupo hemo (h1) a 37 °C; e después de 24 horas a 37 °C, todavía no hay signos de autoxidación; f sólo una pequeña porción de la proteína forma un complejo con el O2, aunque podría medirse la cinética para esta población; i Boon, E. M. et al., (junio de 2005). "Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanilate Ciclase", Nature Chemical Biology 1 (1): 53 - 59, j datos no publicados; k Springer, B. A. et al., (1994) "Family Physicians Key Partners in Preventing Suicide Among Youth", Chem. Rev. 94: 699 - 714; i Gilles-Gonzalez et al., (1994) "Heme-Based Sensors, Exemplified by the Kinase FixL, are a New Class of Heme Protein con Distinctive Ligand Binding and Autoxidation", Biochemistry 33: 8067 -8073. m Aono, S. et al., (2002) "Resonance Raman and Ligand Binding Studies of the OxygenSensing Signal Transducer Protein HemAT from Bacillus Subtilis",J. Biol. Chem. 277: 13528 - 13538. n Antonini, E. et al., (1971). "Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands", North-Holland Publ., Ámsterdam.

La Tabla 8 ilustra que la velocidad de asociación del O2, la velocidad de disociación del O2, la velocidad de autoxidación del O2, la reactividad del NO y la estabilidad de los complejos de FeIIO2 en las proteínas H-NOX pueden alterarse mediante la introducción de una o más mutaciones. En algunas formas de realización, se combina 5 cualquiera de las mutaciones individuales o dobles recogidas en la Tabla 8 con otra mutación (tal como otra mutación de la Tabla 8 o cualquier otra mutación descrita en el presente documento) para alterar adicionalmente la velocidad de asociación del O2, el O2, la velocidad de disociación del O2, la velocidad de autoxidación, la reactividad del NO o la estabilidad de los complejos de FeIIO2 en una proteína H-NOX. Como apreciará el artesano experto, puede usarse la introducción de una o más mutaciones adicionales, tales como las descritas en el presente

10 documento, para alterar adicionalmente estos valores.

Tabla 8. Velocidad de asociación del O2, velocidad de disociación del O2,O2, velocidad de autoxidación, reactividad del NO y estabilidad de los complejos de FeII-O2 en proteínas H-NOX.

Proteína: kon a koff b kox c Reactividad del NO d Estabilidad del complejo de Fell-O2

Hs Hb: 23 11 0,006 < 0,001 s (-7,000 s1) e se oxida o/n al aire a la TA, estable a 4 °C al aire, estable anaeróbico

Tt H-NOX: 13,6 1,22 muy lenta 0,54 ± 0,07 s1 siempre estable

Tt Y140H: ~ 10 5,03 0,87 1,7 ± 6,4 s1 se oxida o/n al aire a la TA, estable a 4 °C al aire, estable anaeróbico

β1 (1 - 385) I145Y: ~ 105 2,69 0,72 lenta hacia Felll-NO se oxida o/n al aire a la TA, estable a 4 °C al aire, estable anaeróbico

a Velocidad de asociación del O2 asociación del grupo hemo a 20 °C (µM1s 1); b Velocidad de disociación del O2 del grupo hemo a 20 °C (s1); c Velocidad de autoxidación del grupo hemo (h1) a 37 °C; d Para la determinación de las reactividades del NO: las proteínas purificadas (HNOX de Tt natural, Y140H HNOX de Tt, hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb)) se prepararon a 2 µM en tampón A y el óxido nítrico (NO) se preparó a 200 µM en Tampón A (Tampón A: Hepes 50 mM, a pH 7,5, NaCl 50 mM) a 20 °C. Usando una espectroscopía de flujo detenido, la proteína se mezcló rápidamente con NO en una proporción de 1:1 con un tiempo de integración de 0,00125 segundos. Las longitudes de onda del cambio máximo se ajustaron a una exponencial simple, midiendo esencialmente la etapa limitante de la velocidad de oxidación por parte del NO. Los productos finales de la reacción fueron NO férrico para las proteínas HNOX y férrico-acuoso para la Hs Hb. c Para la Hs Hb, la reacción de la proteína con el NO fue tan rápida que la reacción se completo durante el tiempo muerto del experimento (0,001 segundos). La reactividad del NO por la hemoglobina es de aproximadamente 7.000 s1 a 20 °C basándose en Eich, R. F. et al., (1996) "Mechanism of NO-Induced Oxidation of Myoglobin and Hemoglobin", Biochemistry 35: 6976 -6983.

15 La Tabla 9 muestra que la constante de disociación para la unión del O2 puede modificarse significativamente mediante la mutación de uno o más residuos de proteínas H-NOX. Los valores cinéticos de la KD para estos ejemplos de proteínas H-NOX varían entre 21,20 nM y 1.000.000,00 nM a 20 °C. Si se desea, puede alterarse adicionalmente la constante de disociación para la unión del O2 mediante la combinación de cualquiera de las mutaciones individuales o dobles recogidas en la Tabla 9 o mediante la introducción de una o más mutaciones

20 adicionales en una proteína H-NOX, según se describe en este documento.

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Tabla 9. Proteínas H-NOX naturales y mutantes y proteínas de referencia ordenadas según el valor de la constante de disociación para la unión del O2

Proteína: KD cinética (nM) 6 KD calculada (nM)

Tt P115A: 21,2 2,1

Tt N74H: 27

Tt I5L-P115A: 30

Tt N74A: 32

Tt I5A: 80

Tt F78Y-Y140L: 80

Tt H-NOX His6: 89

Tt H-NOX: 89,7 6,2

Tt natural: 90

Tt F78Y-Y140F: 150

Tt W9Y: 218

Tt R135Q His6: 252

Hs Hb beta: 267

Tt W9F: 305 31

Tt W9H: 456

Tt Y140H: 500

Hs Hb alfa: 560

Tt W9N: 573

Tt I75F-His6: 713 - 773

HemAT-B: 720

Sw Mb: 880

Tt I5L: 1.000

Tt L144F-His6: 1.092 -1.185

Tt Y140L: 2.000

Tt W9F-Y140H: 2.500

L2 F142Y: 9200 3000

Bj FixL: 14.0000

Tt W9F-N74A: 1.000.000

Dd H-NOX: 1.000.000

β1 (1 - 385) I145Y: 1.000.000

La Tabla 10 muestra que las velocidades de disociación para la unión del O2 pueden modificarse significativamente

5 mediante la mutación de uno o más residuos en proteínas H-NOX. Las velocidades de disociación para estos ejemplos de proteínas H-NOX varían entre 0,21 s1 y 23,4 s1 a 20 °C. Si se desea, puede alterarse adicionalmente la constante de disociación para la unión del O2 mediante la combinación de cualquiera de las mutaciones individuales

o dobles recogidas en la Tabla 10 o mediante la introducción de una o más mutaciones adicionales en una proteína

H-NOX, según se describe en este documento. 10

Tabla 10. Proteínas H-NOX naturales y mutantes y proteínas de referencia ordenadas según el valor de la constante de disociación para la unión del O2

Proteína: Koff (s1) ±

Tt N74A: 0,21 0,004

Tt P115A: 0,22 0,01

Tt I5L-P115A: 0,28 0,03

Tt N74E: 0,38 0,01

Tt N74H: 0,44 0,01

Tt I5A: 0,82 0,03

Tt F78Y-Y140L: 0,83 0,17

Tt H-NOX His6: 1,2 0,02

Tt H-NOX: 1,22 0,09

Tt F78Y-Y140F: 1,48 0,33

LI F142Y: 1,73

Tt W9F: 1,84 0,17

β1 (1 - 385) I145Y: 2,69 0,61

Tt W9Y: 3,07 0,1

Tt R135Q His6: 3,56 0,08

L2 F142Y: 3,68 0,71

Tt Y140H: 5,03 0,69

Tt W9H: 6,42 0,11

Dd H-NOX: 7,13 0,45

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Complejo: Proteína Soret β a α

Fe (III): Tt natural 413 550 585

Tt W9Y: 409 N. A.

Tt N74A: 416 554 586

Tt N74H: 408 N. A.

Tt N74A-Y140H: 407 N. A.

Tt W9H: 407 N. A.

Tt N74E: 408 N. A.

Tt W9N: 408 N. A.

Tt His6 natural: 413 550 586

Complejo: Proteína Soret β α

Fe(II) - NO: Tt natural 420 550 578

Tt W9Y: 420 552 576

Tt N74A: 421 572

Tt N74H: 424 562

Tt N74A-Y140H: 421 549 576

Tt W9H: 420 548 575

Tt N74E: 422 544 571

Tt W9N: 421 541 576

Tt His6 natural: 420 547 576

Complejo: Proteína Soret β α

Fe(II)-O2: Tt natural 416 556 591

Tt W9Y: 416 555 590

Tt N74A: 418 553 589

Tt N74H: 418 553 589

Tt N74A-Y140H: 414 555 584

Tt W9H: 418 556 589

Tt N74E: 417 555 587

Tt W9N: 416 588 553

Tt His6 natural: 416 556 591

a "N. A." representa bandas α y β no asignables debido a la baja señal a longitudes de onda más largas.

Tabla 14. Velocidades de autoxidación de las proteínas H-NOX de T. tengcongensis (Tt)

La Tabla 14 contiene las velocidades de autoxidación para algunos ejemplos de proteínas H-NOX de T. tengcongensis. Si se desea, la velocidad de autoxidación puede alterarse adicionalmente mediante la combinación de cualquiera de las mutaciones recogidas en la Tabla 14 o mediante la introducción de una o más mutaciones adicionales en una proteína H-NOX, según se describe en este documento. Los valores de 2 nm y 3 nm indicados en la Tabla 14 se refieren al desplazamiento en el pico de Soret en UV-Vis desde 2 hasta 3 nm durante el periodo de tiempo de observación; esto es un cambio extremadamente pequeño debido a la autoxidación.

Proteína: Velocidad de autoxidación (25 °C, h1) a

Tt natural: Estable

Tt W9Y: Estable

Tt N74A: Estable

Tt N74H: estable a 4 °C, muy lenta a la TA (2 nm)

Tt W9H: Estable

Tt N74E: muy lenta a 4 °C (2 nm), lenta a la TA

Tt W9N: estable a 4 °C, muy lenta a la TA (3 nm)

Tt His6 natural: Estable

Tt I75F-His6: Estable

Tt L144F-His6: Estable

a "Estable" representa una ausencia de oxidación del grupo hemo después de al menos 24 horas. "TA" representa la temperatura ambiente.

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Claims

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