BRPI0711767B1 - Composição farmacêutica transportadora de no gasoso sanguíneo, uso de uma proteína h-nox, kit, proteína de hnox recombinante e ácido nucléico recombinante - Google Patents

Abstract

composições e métodos para a liberação de óxido nítrico proteínas h-nox são mutadas para exibir propriedadescinéticas e termodinâmicas aumentadas ou ideais for liberação sangúínea de gás no. as proteínas h-nox projetadas compreendem mutações que transmitem ligação de ligante de o~ 2~ ou no alterada em relação ao domínio de h-nox do tipo selvagem correspondente, e são operacionais como transportadores sangúíneos de gás no em mamíferos fisiologicamente compatíveis. a invenção também fornece composições farmacêuticas, kits e métodos que utilizam proteínas h-nox do tipo selvagem ou mutantes para o tratamento de qualquer condição para a qual a liberação de no seja benéfica.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA TRANSPORTADORA DE NO GASOSO SANGUÍNEO, USO DE UMA PROTEÍNA H-NOX, KIT, PROTEÍNA DE HNOX RECOMBINANTE E ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE (51) Int.CI.: A61K 38/42; C12P 21/04 (30) Prioridade Unionista: 22/05/2006 US 60/921,505 (73) Titular(es): THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA (72) Inventor(es): STEPHEN P. L. CARY; ELIZABETH Μ. BOON; JONATHAN A. WINGER; MICHAEL A. MARLETTA

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COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA TRANSPORTADORA DE NO GASOSO SANGUÍNEO, USO DE UMA PROTEÍNA H-NOX, KIT, PROTEÍNA DE HNOX RECOMBINANTE E ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE

Este pedido reivindica o benefício de pedido provisório U.S. Número de série _, depositado em 22 de maio de 2006 por Michael A. Marietta, Stephen P.L. Cary, Elizabeth M. Boon, e Jonathan A. Winger, intitulado “Engineering H-NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery” (Caso UC N° B06-084) . Esse pedido provisório U.S.foi convertido a partir de pedido de utilidade U.S. número de série 11/440.588, depositado em 22 de maior de 2006, para um pedido provisório em 1 de maio de 2007, cujas revelações são aqui incorporadas em suas totalidades por referência.

Declaração com relação a pesquisa ou desenvolvimento patrocinado pelo Governo Federal

Esse trabalho foi apoiado pela Concessão No. DE-ACO37 6SF. O Governo dos Estados Unidos da América pode ter direitos em qualquer emissão de patente nesse pedido.

Campo técnico

Esse pedido pertence a proteínas H-NOX e métodos de uso delas para liberar óxido nítrico (NO). Proteínas H-NOX fornecem uma nova ferramenta terapêutica para liberação de NO a humanos e, para objetivos veterinários, a animais.

Fundamento da invenção

NO age como um mensageiro químico no controle de vários processos importantes in vivo, que incluem vasodilatação, neurotransmissão, inflamação, agregação plaquetária, e regulação do tônus do músculo liso gastrointestinal e vascular. Desde a descoberta em 1867 de 21/11/2017, pág. 10/178

2/150 pelos Drs. Lauder Brunton e William Murrell de que a nitroglicerina (GTN) é capaz de tratar condições de doença cardíaca como angina pectoris, nitratos orgânicos têm sido amplamente usados para tratar casos agudos de vasoconstricção. Nas últimas décadas, o mecanismo de vasodilatação foi elucidado. NO, que é sintetizado em células endoteliais, se difunde para células de músculo liso e ativa guanilato ciclase (sGC) solúvel para produzir GMP cíclico, e assim induzir a vasodilatação. Então presume-se que o mecanismo clínico de ação de nitratos orgânicos, necessite de sua biotransformação a NO e subseqüente ativação de sGC. No entanto, nitratos orgânicos deixam de ser efeicazes em pacientes após 24-48 horas, devido a um fenômeno chamado tolerância. Portanto, para tratamento de casos crônicos de hipertensão, compostos como n-bloqueadores e inibidores de ACE são usados, embora eles tenham limitações e efeitos colaterais. Portanto, nitrovasodilatores são mais úteis no tratamento de situações agudas em que a rápida vasodilatação é necessária para aliviar sintomas como angina e infarto do miocárdio. A administração prolongada de nitratos orgânicos resulta em eficácia reduzida, e a vasculatura torna-se não responsiva; essa tolerância evita seu uso adicional em casos agudos e crônicos. Portanto, para tratamento agudo, uso não contínuo de nitrovasodilator é empregado com efeito limitado. Para casos crônicos de vasoconstricção, outros modos de tratamento são empregados, tipicamente usando um regime misto de nitratos orgânicos e medicações para pressão sangüínea independente de NO, com sucesso misto.

Duas teorias conflitantes principais sobre o mecanismo de 21/11/2017, pág. 11/178

3/150 de tolerância correm em paralelo à pesquisa pelo mecanismo de biotransformação de nitratos que leva à liberação de NO. devido ao fato de acreditar-se que NO seja o mediador dos efeitos vasodilatadores de nitratos orgânicos, o mecanismo de liberação de NO de nitratos orgânicos por tornar-se inibido, resultando em tolerância. Mas como os nitratos orgânicos liberam metabolicamente NO em tecidos não é compreendido. Além disso, a teoria com base em mecanismo para tolerância é problemática porque a tolerância também reduz a eficácia de gás de NO endógeno e NO exógeno na mediação da vasodilatação. Portanto, o mecanismo de biotransformação de nitratos orgânicos parece ser separado da razão para tolerância. Uma teoria conflitante postula que a resposta a NO de nitratos orgânicos torna-se deprimida no tecido alvo, talvez porque a geração de NO e os subprodutos da reação inibam a resposta a NO, ou porque a ativação aguda da via de NO tenha um mecanismo de feedback que a dessensibilize a um estímulo adicional. Essa teoria é conhecida como tolerância end-organ. Recentemente, uma teoria unificadora foi proposta que inclui aspectos da biotransformação de nitratos orgânicos bem como as dessensibilização end-organ a NO. Essencialmente, a biotransformação de nitratos orgânicos parece resultar em maiores níveis de superóxido (O2) em tecidos. Superóxido reage na taxa de difusão com NO para produzir peroxinitrito (OONO). Essa reação aprisiona e destrói NO basal, evitando que el ative sGC. Níveis reduzidos de NO levam a vasoconstricção, e OONO^- é um poderoso oxidante que danifica os tecidos. O tratamento prolongado com nitratos orgânicos como GTN pode resultar em de 21/11/2017, pág. 12/178

4/150 hipertensão e dano tecidual em pacientes, e esse pode ser moderado com co-administração de antioxidantes como ascorbato. Portanto, um melhor terápico para a liberação de NO aos órgãos e tecidos para aliviar a vasoconstricção é um grande objetivo terapêutico.

Alguma pesquisa tem sido conduzida sobre o uso de transportadores com base em hemoglobina para liberar NO. No entanto, transportadores com base em hemoglobina são limitados devido a sua reatividade com NO na presença de

O2, o que leva à inativação de transportadores com base em hemoglobina. O NO reage diretamente com o O2 que está ligado à hemoglobina para formar metemoglobina e nitrato. Tanto o ferro de heme quanto o NO ficam oxidados pelos átomos ligados de oxigênio, e a reação ocorre tão rapidamente que não se observa nenhuma substituição de O2 por NO (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.455.676).

Como o NO é produzido e consumido continuamente, há um turnover natural de NO in vivo. Quando se administra hemoglobina sem células, o equilíbrio entre a produção e o consumo de NO é alterada por reações com a hemoglobina sem células. A reação oxidativa entre NO e O2 ligado à hemoglobina é irreversível, causando a destruição de NO, O2 e hemoglobina. A ligação de NO à hemoglobina sem O2 ligado é eficazmente irreversível no contexto fisiológico, na medida em que a meia-vida para a dissociação de nitrosilhemoglobina é de 5-6 horas inativando eficazmente, dessa forma, hemoglobina como um transportador de O2 sem células. Após uma molécula de NO reagir com a hemoglobina, ela é eliminada do pool de moléculas sinalizadoras causando, dessa forma, certas condições adversas. Por exemplo, a

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5/150 ligação do NO à hemoglobina (com ou sem O2 ligado) pode evitar o relaxamento vascular e potencialmente leva à hipertensão, a qual é observada algumas vezes após a administração de certas soluções de hemoglobina extracelular.

O NO também é necessário para mediar certas respostas inflamatórias. Por exemplo, o NO produzido pelo endotélio inibe a agregação plaquetária. Conseqüentemente, na medida em que o NO está ligado por hemoglobina sem célula (com ou sem O2 ligado), a agregação plaquetária pode aumentar. À medida que as plaquetas se agregam, elas liberam compostos vasoconstrictores potentes como, por exemplo, tromboxano A2 e serotonina. Esses compostos podem atuar sinergicamente com os níveis reduzidos de NO causados pela remoção de hemoglobina para produzir uma vasoconstricção significativa. Além de inibir a agregação plaquetária, o NO também inibe a adesão de neutrófilos às paredes celulares, o que, por sua vez, pode causar lesão da parede celular. Foi observado dano da parede endotelial com a infusão de certas soluções de hemoglobina. Transportadores com base em hemoglobina são também prejudicados pelo rápido clearance de hemoglobina sem células do plasma devido à presença de receptores para hemoglobina que removem hemoglobina sem células do plasma. Hemoglobina sem célula também pode causar toxicidade renal, possivelmente em conseqüência da depleção de NO nos glomérulos, causando constrição e subseqüente disfunção.

Em função das limitações das terapias vasodilatadoras, permanece um interesse significativo em terapias adicionais ou alternativas para a liberação de NO. Em particular, são de 21/11/2017, pág. 14/178

6/150 desejados transportadores de NO que produzam menos tolerância. Adicionalmente, são desejados transportadores de NO com uma baixa taxa de inativação por NO na presença de O2, como transportadores de NO que tenhma uma baixa reatividade de NO e/ou uma baixa afinidade por O2. Também são necessários transportadores de oxigênio com constantes de dissociação ou taxas inferiores para ligação de O2 que sejam adequadas para aplicações clínicas ou industriais específicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta surpreendente de que proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes possuem uma reatividade ao NO bem menor do que a hemoglobina e, dessa forma, são transportadores de NO desejáveis. Se desejadas, podem ser introduzidas mutações nas proteínas H-NOX para alterar sua ligação de O2 e ligantes de NO para otimizar ainda mais o uso de proteínas H-NOX como transportadores de NO. Em algumas modalidades, o uso de uma proteína H-NOX como um transportador de NO produz menos tolerância que o uso de vasodilatadores atuais, como nitratos orgânicos.

Em um aspecto, a invenção apresenta proteínas H-NOX mutantes. Conseqüentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína H-NOX isolada que possui pelo menos uma mutação que altera o NO, a constante de dissociação ou a reatividade ao NO, comparada com a de uma proteína H-NOX do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX mutante está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX de 21/11/2017, pág. 15/178

7/150 mutante é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina, como pelo menos 1.000 vezes menor que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C como cerca de 1x 10^-4 s^-1 a cerca de 0,012 s^-1 ou cerca de 1x 10^-4 s^-1 a cerca de 1x 10^-3 s^-1 a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é entre cerca de 1 pM a 37°C, como pelo menos cerca de 10 pM ou pelo menos cerca de 50 pM a 37°C.

Em algumas modalidades, a invenção apresenta uma proteína H-NOX isolada que possui pelo menos uma mutação que altera a koff, K1, ou K2 para NO ou altera a constante de dissociação de O2 comparada com aquela de uma proteína H-NOX do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a

37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C. Em algumas modalidades, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 0,012 s^-1 ou cerca de 1x 10^-4 s^-1 a cerca de 1x 10^-3 s^-1 a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 10 pM como pelo menos cerca de 50 pM a 37°C. Em algumas modalidades, a reatividade de NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina, como pelo menos 100 vezes menor que aquela da hemoglobina ou pelo menos de 21/11/2017, pág. 16/178

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1.000vezes menor que aquela da hemoglobina.

Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína H-NOX isolada selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX

T.

W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T.

tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, L2 F9W-F142Y, H-NOX(728-899) de D.

desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, β1(1-385), β1(1-385) I145Y, β1(1-385) I145H, β1(1-194), β1(1-194)

I145Y, β1(1-194) L9W-I145Y, β2(1-217), β2(1-217) I142Y, HNOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, e H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans. Em algumas modalidades, a proteína βl ou β2 é derivada de uma proteína β1 ou β2 de R. norvegicus ou H. sapiens.

Em algumas modalidades, a invenção fornece uma proteína H-NOX isolada selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX de 21/11/2017, pág. 17/178

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W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, HNOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75FHis6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144FHis6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 F9WF142Y de L. pneumophilia, H-NOX(728-899) de D.

desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, β1(1-385) I145H, β1(1-194), β1(1-194) I145Y, β1(1-194) L9W-I145Y, β2(1-217), β2(1-217)1142ν_ζ H-NOX(1-175) de C. botulinum, HNOX(1-186) de C. botulinum, H-NOX(1-197) de C.

acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum e H-NOX

GCY-35(1-252) de C. elegans. Em algumas modalidades, a proteína β1 ou β2 é derivada de uma proteína β1 ou β2 de R. norvegicus ou H. sapiens.

Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está entre 0,1 a 10 vezes aquela da hemoglobina, como entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como uma constante de dissociação de NO entre 0,1 a 10 vezes ou entre 0,5 a 2 vezes aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a de 21/11/2017, pág. 18/178

10/150 reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como pelo menos 100 vezes ou 1.000 vezes menor que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1 a 20°C, como menos que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 400 s^-1, 300 s^-1, 200 s^{- 1}, 100 s^-1, 75 s^-1, 50 s^-1, 25 s^-1, 20 s^-1, 10 s^-1, 5 s^-1, 3 s^-

A 2 s^-1, 1,8 s^-1, 1,5 s^-1, 1,2 s^-1, 1,0 s^-1, 0,8 s^-1, 0,7 s^-1 ou 0,6 s^-1 a 20°C. Em algumas modalidades das proteínas HNOX isoladas, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C, como pelo menos cerca de 10 pM ou pelo menos cerca de 50 pM a 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a koff, K1, ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 100 s^-1, 20 s^-1 ou 1,8 s^-1 a 20°C) . Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de de 1 pM a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 100 s^-1, 20 s^-1 ou 1,8 s^-1 a

20°C). Em algumas modalidades, a taxa de auto-oxidação de heme da proteína H-NOX mutante é de menos do que cerca de 1 de 21/11/2017, pág. 19/178

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h-1 a	37°C.	Em algumas	modalidades das	proteínas H-NOX
isoladas, a	koff, K1, ou	K2 para NO da proteína H-NOX está
entre	cerca	de 1 x 10-4	s-1 a cerca de 10	s-1 a 37°C, e a
taxa	de auto-oxidação da proteína H-NOX	é de menos que

cerca de h^-1 37°C. Em algumas modalidades das proteínas HNOX isoladas, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C, e a taxa de autooxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C, e a reatividade de NO da proteína HNOX é de menos que cerca de 700 s^-1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 100 s^-1, 20 s^-1 ou 1,8 s¹ a 20°C).

Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX contém uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações) comparada com a proteína H-NOX da qual foi derivada. Em várias modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX contém menos de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, comparada com a proteína H-NOX da qual foi derivada. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação da bolsa distal. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação que não está na bolsa distal. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação na qual um resíduo que corresponde a Tyr140 de T. tengcongensis H-NOX ou Phe 142 de L. pneumophila 2 é substituído por qualquer outro aminoácido. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos duas mutações, em que pelo menos uma mutação é a

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12/150 substituição de um resíduo que corresponde a Tyr140 de T. tengcongensís H-NOX ou Phe142 de L. pneumophila 2 por qualquer outro aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação na proteína H-NOX corresponde a uma mutação de Y140F ou uma mutação de Y140L de T. tengcongensís ou ou uma mutação F142Y de L. pneumophila 2. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, pelo menos um aminoácido Cterminal (como pelo menos cerca de 50 aminoácidos Cterminais contíguos ou entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos C-terminais contíguos) na proteína H-NOX foram removidos comparado à proteína de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma deleção que contém os primeiros 194, 217, ou 385 aminoácidos de uma proteína H-NOX como proteína β1 ou β2 de R. norvegícus ou H. sapíens.

Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX é derivada de uma proteína de mamífero (por exemplo, uma proteína humana como, por exemplo, β1) . Em várias modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX é derivada de uma proteína bacteriana (por exemplo, uma proteína de T. tengcongensís). Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção, por exemplo, polietileno glicol. Heme pode ou não estar ligado à proteína H-NOX. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, NO está ligado à proteína H-NOX. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).

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Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou L. pneumophilia 2 H-NOX F142Y. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, β1 H-NOX de tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 (1-385) de R. norvegicus, β1 H-NOX de tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, CG14885-PA H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, GCY-35 H-NOX de tipo selvagem de C. elegans, H-NOX de tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX de tipo selvagem de C.

crescentus, H-NOX de tipo selvagem de S. oneidensis, ou HNOX de tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC β1

HNOX H105F de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX C7 8S de R. norvegicus, ou sGC β1 H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é β2(1-217) de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-385) de

R. norvegicus, ou P1(1-385)I145Y de R. norvegicus. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis ou β1 H-NOX (1-385) I145Y de H.

sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y140H de T.

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 22/178

14/150 tengcongensis, β1 I1 40Y de H. sapiens ou β1 I145Y de H.

sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX

W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L.

pneumophilia, β1 H-NOX I140Y de H. sapiens, β1 I145Y de H. sapiens, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 H10 NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus sGC, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG 14885-PA

H-NOX do tipo selvagem D. melanogaster, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das proteínas

H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006;

22 de maio de 2006; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de

2007): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770,

SO214 4_Sone_2 4 37 37 02, Mdeg13 4 3_Mde_2 3027521,

VCA0720 Vch 15601476

CC2992 Ccr 16127222

Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi:

46192757)

Mmc10739_Mcsp_22999020

Tar4 Tte 20807169

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 23/178

15/150 (gi: 32566352, gi:

(gi: 71990146),

GCY1a3 Hs 20535603,

Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCS-beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391

86564713), gcy-35_Ce-17507861 gcy-37_Ce_17540904 (gi: 71985505),

GCY1a2-Hs_899477 ou GYCa99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003), “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4: 513) . As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde = Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Microbulbifer degradans; Npu = Nostoc punctiforme; Rhsp = Rhodobacter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch = Vibrio cholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemicentrotus pulcherrimus; Hs = Homo sapiens. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seqüências de proteínas seguintes disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de 2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007): Caenorhabditis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR,

Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis

Caenorhabditis briggsae briggsae Q61V90_CAEBR,

Caenorhabditis briggsae Q61A94_CAEBR,

Caenorhabditis

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 24/178

16/150 briggsae Q60TP4_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60M10_CAEBR, Caenorhabditis elegans GCY37-CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY36_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY32_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY34_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY33_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T040_ORYCU, Oryzias curvinotus Q75WF0_ORYCU, Oryzias latipes P79998_ORYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA, Tetraodon nigroviridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4S6K5_TETNG, Fugu rubripes Q9OVY5_ FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191 HYLLA, Mus musculus Q8BXH3 MOUSE, Mus

musculus	GCYB1 MOUSE,	Mus	musculus	Q3UTI4 MOUSE	, Mus
musculus	Q3UH83 MOUSE	, Mus	musculus	Q6XE41 MOUSE	, Mus
musculus Q80YP4 MOUSE,	Rattus	norvegicus	Q8OWX7_RAT,	Rattus
norvegicus	Q80WX8_RAT,	Rattus	norvegicus	Q920Q1 RAT,	Rattus
norvegicus	Q54A43_RAT,	Rattus	norvegicus	Q80WY0_RAT,	Rattus
norvegicus	Q8OWY4_RAT,	Rattus	norvegicus	Q8CH85_RAT,	Rattus
norvegicus	Q8OWY5_RAT,	Rattus	norvegicus	GCYB1 RAT,	Rattus
norvegicus	Q8CH90_RAT,	Rattus	norvegicus	Q91XJ7_RAT,	Rattus
norvegicus	Q80WX9_RAT,	Rattus	norvegicus	GCYB2 RAT,	Rattus
norvegicus	GCYA2 RAT,	Canis	familiaris	Q4ZHR9 CANFA, Bos

taurus GCYB1_BOVIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta O77106_MANSE,

Manduca sexta O76340_MANSE, Apis mellifera Q5UAF0_APIME,

Apis mellifera Q5FAN0 APIME, Apis mellifera Q6L5L6 APIME,

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 25/178

17/150

Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF3I_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae

5	Q7KQ93 ANOGA,	Drosophila	melanogaster	Q24086 DROME,
	Drosophila melanogaster GCYH	DROME, Drosophila melanogaster
	GCY8E DROME,	Drosophila	melanogaster	GCYDA_DROME,
	Drosophila	melanogaster	GCYDB_DROME,	Drosophila
	melanogaster	Q9VA09 DROME,	Drosophila	pseudoobscura
10	Q29CE1_DROPS,	Drosophila	pseudoobscura	Q296C7 DROPS,
	Drosophila	pseudoobscura	Q296C8 DROPS,	Drosophila
	pseudoobscura	Q29BU7 DROPS, Aplysia	californica
	Q7YWK7_APLCA,	Hemicentrotus	pulcherrimus	Q95NK5_HEMPU,
	Chlamydomonas	reinhardtii,	Q5YLC2_CHLRE,	Anabaena sp
15	Q8YUQ7_ANASP,	Flavobacteria	bacterium BBFL7	Q26GR8 9BACT,
	Psychrofl exus	torquis ATCC 700755	Q1VQE5 9FLAO,
	proteobactéria	marinha gama HTCC2207	Q1YPJ5_9GAMM,
	proteobactéria	marinha gama HTCC2207	Q1YTK4_9GAMM,

Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum

JF-5 Q2DG60_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9_RHOS4, Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TM1040 Q3QNY2_9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-1 Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL,

Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5 ALTAT, Shewanella oneidensis

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 26/178

18/150

Q1ZWE5_9VIBR, alginolyticus

Q2SFY7_HAHCH,

Oceanobacter

Q8EF49_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio

12G01 Q1VCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722

Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5EIF5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis

Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, sp RED65 Q1NO35 9GAMM, Desulfovibrio desulfuricans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensis

Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT,

Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOSE. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não é sGC β1 HNOX C78S de R. norvegicus ou sGC β1 H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades das proteínas H-NOX isoladas, a proteína H-NOX não possui uma mutação no motivo Y-S-R, que inclui Tyr135, Ser137 e Arg139 de H-NOX humana.

Em um aspecto, a invenção apresenta um ácido nucléico recombinante que codifica qualquer uma ou mais das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas. Em modalidades particulares, o ácido nucléico inclui um segmento ou toda a seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um dos ácidos nucléicos mostrados nas FIGS. 2-4D ou 8A-8DD. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 27/178

19/150 (por exemplo, albumina sérica humana). Em algumas modalidades, o ácido nucléico inclui pelo menos cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucléico de H-NOX e contém uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9 ou 10 mutações), comparado com o ácido nucléico de

H-NOX do qual foi derivado. Em várias modalidades, um ácido nucléico de H-NOX mutante contém menos do que cerca de qualquer uma de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. A invenção também apresenta variantes degeneradas de qualquer ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um vetor que inclui qualquer um ou mais dos ácidos nucléicos de HNOX mutantes aqui descritos. Em outro aspecto, a invenção apresenta uma célula que inclui qualquer um ou mais dos ácidos nucléicos de H-NOX mutantes aqui descritos. Em um aspecto, a invenção apresenta uma célula que inclui qualquer vetor aqui descrito.

Em	um	aspecto, a invenção apresenta um método de
produção	de	uma proteína H-NOX. Esse método envolve o
cultivo	de	uma célula que possui um ácido nucléico que

codifica qualquer uma ou mais das proteínas H-NOX mutantes 25 aqui descritas, sob condições adequadas à produção da proteína H-NOX mutante. Em algumas modalidades, a invenção ainda inclui a etapa de purificação da proteína H-NOX mutante.

Em um aspecto, a invenção apresenta composições 30 farmacêuticas que incluem uma ou mais proteínas H-NOX, como

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 28/178

20/150 qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui uma quantidade farmaceuticamente aceitável de uma proteína H-NOX aqui descrita e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a koff, k1 ou k2 para NO da proteína HNOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo

menos	cerca de 1 pM a	37	°C.	Em algumas	modalidades, a
constante de dissociação	de	NO	da proteína	H-NOX está em 2
ordens	de magnitude daquela	da	hemoglobina,	e a reatividade
de NO	da proteína H-NOX	é	pelo menos 10	vezes menor que
aquela	da hemoglobina.

Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapíens, como uma constante de dissociação de NO entre 0,1 a 10 vezes ou entre 0,5 a 2 vezes a da hemoglobina alfa de Homo sapíens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapíens como, por exemplo, pelo menos 100 vezes ou 1.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapíens .

Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX é uma proteína do tipo selvagem. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX é uma proteína mutante aqui descrita. Em várias modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff de 21/11/2017, pág. 29/178

21/150 para NO, a kl para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade ao NO, a reatividade de NO a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de duas ou mais das citadas anteriormente, comparada com a de uma proteína do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensís, H-NOX I5A de T. tengcongensís, H-NOX I5L de T. tengcongensís, H-NOX I5L10 P115A de T. tengcongensís, H-NOX W9F de T. tengcongensís,

H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensís, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensís, H-NOX W9Y de T. tengcongensís, H-NOX W9N de T. tengcongensís, HNOX W9H de T. tengcongensís, H-NOX N74E de T.

tengcongensís, H-NOX N74A de T. tengcongensís, H-NOX N74H de T. tengcongensís, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensís, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensís, H-NOX P115A de T. tengcongensís, H-NOX R135Q de T. tengcongensís, H-NOX Y140F de T. tengcongensís,

H-NOX Y40L de T. tengcongensís, H-NOX Y140H de T. tengcongensís, H-NOX Y140A de T. tengcongensís, I75F-His6 de T. tengcongensís, I75F de T. tengcongensís, L144F-His6 de T. tengcongensís, L144F de T. tengcongensís, 2 H-NOX

F142Y de L. pneumophílía, 1 H-NOX do tipo selvagem de L.

pneumophílía, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophílía,

F9W-F142Y de L. pneumophílía, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfurícans, H-NOX(728-899) de D. desulfurícans, H-NOX Y139L de D. desulfurícans, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapíens, β1 I145Y de H. sapíens, β1(1-385) de H. sapíens, β1(1-385) I145Y de H. sapíens, β1(1-385) I145H de H.

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 30/178

22/150 sapiens, β1(1-194) de H. sapiens, β1(1-194) I145Y de H.

sapiens, β1(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, β1 H-NOX H105G de H. sapiens, β1 H-NOX H105F de H. sapiens, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus, β1(1-385) I1 45Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R.

norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-194) I145Y de

R. norvegicus, β1(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, β1

H-NOX H105G de R. norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de

C. botulinum, H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster;

H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do de 21/11/2017, pág. 31/178

23/150 selvagem de pneumophilia 2 tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a composição farmacêutica inclui um ou mais lipossomos ou nanopartículas que incluem ou encapsulam a proteína H-NOX.

Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H10 NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo R. norvegicus, ou H-NOX F142Y de L. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis. Em algumas modalidades das composições 15 farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 H-NOX (1-385)de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de 20 D. melanogaster H-NOX, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C.

acetobutylicum. Em algumas modalidades das composições 25 farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T.

tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, sGC β1 HNOX H105G de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H 105F de R.

norvegicus, sGC β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC H-NOX C78S de R. norvegicus, ou sGC β1 H-NOX C78E de R.

norvegicus. Em algumas modalidades das composições

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 32/178

24/150 farmacêuticas, a proteína H-NOX não é β2(1-217) de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus, ou β1(1-385) I145Y de R. norvegicus. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis ou β1 H-NOX (1-385) I145Y de H sapiens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y140H de T. tengcongensis, β1 I140Y de H. sapiens ou β1 I14 5Y de H. sapiens. Em algumas modalidades composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX de tipo selvagem de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, β1 H-NOX I140Y de H. sapiens, β1 I14 5Y de H. sapiens, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus sGC, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG 14885-PA H-NOX do tipo selvagem D. melanogaster, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no de 21/11/2017, pág. 33/178

25/150

Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 21 2007; ou 22 de maio de maio de Npun59 0 5_Npu_2 312 9 60 6, SO2144_Sone_24373702, VCA0720_Vch_15601476, Rsph2043_Rhsp_22958463 Mmc107 3 9_Mcsp_2 2 99902 0, Ddes2822 Dde 23475919, de 2007) : alr2278_Ana_17229770, Mde g134 3_Mde_2 3 02 7 521, CC2992_Ccr_16127222, (gi: 46192757),

Tar4_Tte_20807169, CAC3243 Cac 15896488, gcy71990146), gcyGCY1a3 Hs 20535603,

31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215,

HpGCS-beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577,

CG4154_Dm_24646993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy32_Ce 13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi: 32566352, gi:

86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi

37_Ce_17540904 (gi: 71985505),

GCY1a2-Hs_899477 ou GYCa-99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003), “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4: 5-13). As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde = Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Microbulbifer degradans; Npu = Nostoc punctiforme; Rhsp = Rhodobacter sphaeroides; Sone =

Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch = Vibrio cholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemicentrotus pulcherrimus; Hs = Homo sapiens. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é sGC β1 H30 NOX C78S de R. norvegicus ou sGC β1 H-NOX C78E de R.

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 34/178

26/150 norvegicus. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de

2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007) : Caenorhabdítís briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabdítís briggsae Q61P44_CAEBR, Caenorhabdítís briggsae Q61R54_CAEBR, Caenorhabdítís briggsae Q61V90_CAEBR, Caenorhabdítís briggsae Q61A94_CAEBR, Caenorhabdítís briggsae Q60TP4_CAEBR, Caenorhabdítís briggsae Q60M10_CAEBR, Caenorhabdítís elegans GCY37_CAEEL, Caenorhabdítís elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabdítís elegans GCY36_CAEEL, Caenorhabdítís elegans GCY32_CAEEL, Caenorhabdítís elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabdítís elegans GCY34_CAEEL, Caenorhabdítís elegans GCY33_CAEEL, Oryzías curvínotus Q7T040_ORYCU, Oryzías curvínotus Q75 WF0_ORYCU, Oryzías latípes P79998_ORYLA, Oryzías latípes Q7ZSZ5_ORYLA, Tetraodon nigrovíridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigrovíridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigrovíridis Q4S6K5_TETNG, Fugu rubrípes Q90VY5_ FUGRU, Xenopus laevís Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191_HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYBI_MOUSE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3UH83_MOUSE, Mus musculus Q6XE41_MOUSE, Mus musculus Q80YP4 MOUSE, Rattus norvegicus Q80WX7 RAT, Rattus de 21/11/2017, pág. 35/178

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norvegícus	Q80WX8 RAT,	Rattus	norvegicus	Q920Q1 RAT,	Rattus
norvegícus	Q54A43 RAT,	Rattus	norvegicus	Q80WY0_RAT,	Rattus
norvegicus	Q80WY4_RAT,	Rattus	norvegicus	Q8CH85_RAT,	Rattus
norvegicus	Q80WY5_RAT,	Rattus	norvegicus	GCYB1_RAT,	Rattus
norvegicus	Q8CH90_RAT,	Rattus	norvegicus	Q91XJ7 RAT,	Rattus
norvegicus	Q80WX9_RAT,	Rattus	norvegicus	GCYB2_RAT,	Rattus
norvegicus	GCYA2_RAT,	Canis	familiaris	Q4ZHR9 CANFA, Bos
taurus GCYB1 BOVIN,	Sus	scrofa Q4ZHR7 PIG,	Gryllus

bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta O77106_MANSE,

Manduca sexta O76340_MANSE, Apis mellifera Q5UAF0_APIME, Apis mellifera Q5FAN0_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_ANOGA,

Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24086_DROME,

Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, melanogaster GCYDB_DROME, melanogaster Q9VA09_DROME, Drosophila

Drosophila pseudoobscura pseudoobscura Q296C8_DROPS,

Q29BU7_DROPS, Aplysia

Hemicentrotus pulcherrimus

Drosophila melanogaster

Q29CE1_DROPS,

Drosophila pseudoobscura

Q7YWK7 APLCA,

Drosophila pseudoobscura

Q296C7_DROPS,

Drosophila californica

Q95NK5 HEMPU,

Chlamydomonas reinhardtii, Q5YLC2 CHLRE, Anabaena sp Q8YUQ7

ANASP, Flavobacteria	bacterium	BBFL7	Q26GR8	9BACT
Psychrofl exus	torquis	ATCC	700755	Q VQE5	9FLAO
proteobactéria	marinha	gama	HTCC2207	Q1YPJ5	9GAMM
proteobactéria	marinha	gama	HTCC2207	QIYTK4	9GAMM

Caulobacter crescentus Q9A451 CAUCR, Acidiphilium cryptum

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 36/178

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JF-5 Q2DG60 ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9 RHOS4,

Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TMI 040 Q3QNY2 9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp 5 MC-1 Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, 10 Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF49_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio 12G01 Q1VCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722

Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5E1F5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH, Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, 20 Oceanobacter sp RED65 Q1NO35 9GAMM, Desulfovibrio

Q1ZWES_9VIBR, alginolyticus desulfuricans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensis Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT, Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVNO_CLOBE. Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína H-NOX não possui uma mutação no motivo Y-S-R, que inclui Tyr135, Ser137 e Arg139 de H-NOX humana.

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 37/178

29/150

A menos que observado explicitamente ou ditado pelo contexto, todas as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes aqui descritas podem ser usadas em qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas. A proteína H5 NOX pode ter ou não heme e/ou NO ligado, e pode estar ligada covalentemente ou não a outra molécula ou porção como polietileno glicol. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de HNOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).

Em um aspecto, a invenção fornece métodos de liberação de NO a um indivíduo (por exemplo, um mamífero como, por exemplo, um primata (por exemplo, um ser humano, um macaco, um gorila, um chipanzé, um lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino ou um felino) com o uso de uma proteína H-NOX. Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de contrair uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão, uma condição vasoconstrictora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO. Em modalidades particulares, uma condição exacerbada por hipertensão é insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC.

Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece um método de liberação de NO a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) pela administração a um indivíduo que dela necessita de uma proteína H-NOX em uma quantidade suficiente para liberar uma quantidade eficaz de NO ao indivíduo. Em algumas modalidades, a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 nM a cerca de 1 x

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 38/178

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10^-4 s^-1 a cerca de 10 s-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 μΜ a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina.

Em algumas modalidades dos métodos, NO é ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, o NO não está ligado à proteína H-NOX, antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo, e a proteína H-NOX transporta NO de uma localização no indivíduo para outra localização no indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é administrada por via oral, retal, ou ao sangue do indivíduo. Em modalidades particulares dos métodos, a proteína H-NOX é administrada ao sangue do indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é administrada ao indivíduo pelo menos duas vezes.

Em algumas modalidades dos métodos, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está dentro de 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens, como uma constante de dissociação de NO entre 0,1 a 10 vezes ou entre 0,5 a 2 vezes a da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens como pelo menos 100 vezes ou 1.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina alfa de Homo sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é uma proteína do tipo selvagem. Em algumas de 21/11/2017, pág. 39/178

31/150 modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é uma proteína mutante aqui descrita. Em várias modalidades dos métodos, a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação que altera a

constante	de	dissociação de NO, a	koff para	NO,	a k1 para
5 NO, a k2	para NO, a constante de dissociação	de O2, a
estabilidade	de NO, a reatividade	de NO a	taxa	de auto-
oxidação,	ou	qualquer combinação	de duas	ou	mais das

citadas anteriormente, comparada com a de uma proteína do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, HNOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX

W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T.

tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T.

tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX

F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T.

tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis,

I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, 2 H-NOX do tipo selvagem de L.

pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfuricans, H-NOX(728-899) de D.

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 40/178

32/150 desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapiens, β1 I14 0Y de H. sapiens, β1 I145Y de H. sapiens, β1(1-385) de H. sapiens, β1(1-385) I145Y de H. sapiens, β1(1-385) I145H de H. sapiens, β1(1194) de H. sapiens, β1(1-194) I145Y de H. sapiens, β1(1194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, β1 H-NOX H105G de H.

sapiens, β1 H-NOX H105F de H. sapiens, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus, β1(1-385) I1 45Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R.

norvegicus, β1(1-194) R. norvegicus, β1(1-194)I145Y de R. norvegicus, β1(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, β1 HNOX H105G de R. norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, H-NOX(1-175) de C. botulinum, H-NOX(1-186) de

C. botulinum, H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, GCY35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de

D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D.

melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster;

H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A.

de 21/11/2017, pág. 41/178

33/150 gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme. Em algumas modalidades dos métodos, um ou mais lipossomos ou nanopartículas incluem ou encapsulam a proteína H-NOX.

Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, sGC do tipo selvagem de R. norvegicus, ou L. pneumophilia 2 H-NOX F142Y. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX de tipo selvagem de L. pneumophilia, β1 H-NOX de tipo selvagem de H sapiens, sGC β1 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, β1 H-NOX de tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX de tipo selvagem de D. melangaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster H-NOX, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis ou H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, R. norvegicus. sGC β1 HNOX H105F, sGC β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus, sGC β1 HNOX C78S de R. norvegicus, ou sGC β1 H-NOX C78E de R.

de 21/11/2017, pág. 42/178

34/150 norvegicus. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é β2(1-217) de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-385) de R. norvegicus ou β1(1-385) I145Y de R. norvegicus. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis ou β1 H-NOX (1-385) I145Y de H.

sapiens. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX não é HNOX Y140H de T. tengcongensis, β1 I140Y de H. sapiens ou β1 I145Y de H. sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophilia, β1

H-NOX I140Y de H. sapiens, β1 I145Y de H. sapiens, β1 HNOX do tipo selvagem de H. sapiens, sGC β1 H-NOX (1-385) de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX (1-385) I145Y de R. norvegicus, sGC β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, R. norvegicus. sGC β1 H-NOX H105F, β1 H-NOX I145Y de R. norvegicus sGC, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster H-NOX, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do

tipo selvagem de	C.	crescentus,	H-NOX do	tipo selvagem	de
25 S. oneidensis	ou	H-NOX do	tipo	selvagem de	C.
acetobutylicum.	Em	algumas modalidades	dos métodos,	a
proteína H-NOX	não	é qualquer	uma das	proteínas H-	NOX

seguintes que estão listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no

Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 43/178

35/150 disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007) : Npun59 0 5_Npu_2 3129606, alr227 8_Ana_1722 97 7 0,

SO214 4_Sone_2 4 37 37 02, Mdeg13 4 3_Mde_2 3027521,

VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222,

Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi: 46192757),

Mmc107 3 9_Mcsp_2 2999020, Ta r4_T t e_2 0 8 07169,

Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy31_Ce_17568389, CO14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215,

HpGCS-beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577,

CG4154_Dm_24646993 (gi: NP_650424.2, gi: 62484298), gcy32_Ce 13539160,gcy-36_Ce 17568391 (gi: 32566352, gi:

86564713), gcy-35_Ce-17507861 (gi: 71990146), gcy-37_Ce_1

7540904 (gi: 71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2-Hs

899477 ou GYCa-99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003), “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4: 5-13) . As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp;

Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde = Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp = Magnetococcus sp. ; Mde = Microbulbifer degradans; Npu = Nostoc punctiforme; Rhsp = Rhodobacter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch = Vibrio cholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemicentrotus pulcherrimus; Hs = Homo sapiens. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é qualquer uma das proteínas H-NOX seguintes que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 44/178

36/150 exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de

2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007) : Caenorhabditis briggsae Q622M5 CAEBR, Caenorhabditis briggsae

Caenorhabditis

Caenorhabditis briggsae elegans GCY37 CAEEL, briggsae Q61P44_CAEBR,

Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61 V90_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61 A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR,

Q60M10_CAEBR, Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY36_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY32_CAEEL,

Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans

GCY34_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY33_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T040_ORYCU, Oryzias curvinotus Q75 WF0_ORYCU, Oryzias latipes P79998_ORYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA, Tetraodon nigroviridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4S6K5_TETNG, Fugu rubripes Q9OVY5_ FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N 192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191_HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYB1_MOUSE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3UH83_MOUSE, Mus musculus Q6XE41_MOUSE, Mus musculus Q80YP4_MOUSE, Rattus norvegicus Q8OWX7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A43_RAT, Rattus norvegicus Q80WY0_RAT, Rattus norvegicus Q80WY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RAT, Rattus norvegicus Q8OWY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB 1_RAT, Rattus de 21/11/2017, pág. 45/178

37/150 norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9_CANFA, Bos taurus GCYB1_BOVIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta O77106_MANSE, Manduca sexta O76340_MANSE, Apis mellifera Q5UAFO_APIME, Apis mellifera Q5FANO_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PSO1_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24086_DROME,

Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, melanogaster GCYDB_DROME,

Q9VA09_DROME, Drosophila

Drosophila pseudoobscura pseudoobscura Q296C8_DROPS,

Q29BU7_DROPS, Aplysia

Hemicentrotus pulcherrimus reinhardtii Q5YLC2 CHLRE,

Drosophila melanogaster

Q29CE1_DROPS,

Drosophila pseudoobscura

Q7YWK7_APLCA,

Chlamydomonas

Drosophila pseudoobscura

Q296C7_DROPS,

Drosophila californica Q95NK5_HEMPU, Anabaena sp

Q8YUQ7 ANASP, Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8 9BACT,

Psychrofl exus proteobactéria proteobactéria

Q1VQE5_9FLAO, Q1YPJ5_9GAMM, Q1YTK4 9GAMM, torquis ATCC 700755 marinha gama HTCC2207 marinha gama HTCC2207

Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, Acidiphilium cryptum

JF-5 Q2DG60_ACICY, Rhodobacter sphaeroides Q3J0U9 RHOS4,

Silicibacter pomeroyi Q5LPV 1_SILPO, Paracoccus denitrificans PD1222, Q3PC67_PARDE, Silicibacter sp TMJ040

Q3QNY2 9RHOB, Jannaschia sp Q28ML8 JANSC, Magnetococcus sp

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38/150

MC-1 Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43_COLP3, Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF49_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio

12G01 QiIVCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722

Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5EIF5_VIBFI, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, sp RED65 Q1NO35 9GAMM, Desulfovibrio

Q1ZWE5_9VIBR, alginolyticus

Q2SFY7_HAHCH,

Oceanobacter desulfurícans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensis

Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT, Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVNO_CLOBE. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não é sGC β1 H-NOX C78S de R. norvegicus ou sGC β1 H-NOX C78E de R. norvegicus. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína H-NOX não possui uma mutação no motivo Y-S-R, que inclui Tyr135, Ser137 e Arg139 de H-NOX humana.

A menos que observado explicitamente ou ditado pelo contexto, todas as proteínas do tipo selvagem e mutantes e

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 47/178

39/150 todas as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser usadas em qualquer um dos métodos de liberação de NO aqui descritos. A proteína H-NOX pode ter ou não heme e/ou NO ligado, e pode estar ligada covalentemente ou não a outra molécula ou porção como, por exemplo, polietileno glicol. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).

Em um aspecto, a invenção apresenta kits que incluem uma ou mais proteínas H-NOX. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit que inclui uma proteína H-NOX e instruções para utilização do kit para liberar NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina. A menos que observado explicitamente ou ditado pelo contexto, todas as proteínas do tipo selvagem e mutantes e todas as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser usadas em qualquer um dos kits aqui descritos. A proteína H-NOX pode ter ou não heme e/ou NO ligado, e pode estar ligada covalentemente ou não a outra molécula ou porção como, por exemplo, polietileno glicol. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra de 21/11/2017, pág. 48/178

40/150 proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana).

Em um aspecto, a invenção apresenta uma proteína H-NOX (como qualquer uma das proteínas do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas) para uso como um medicamento. Em algumas modalidades, a invenção apresenta uma proteína HNOX para uso em um método de liberação de NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é usada para tratar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica, como uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC), uma condição vasoconstritora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO.

Em algumas modalidades, a invenção apresenta o uso de uma proteína H-NOX (como qualquer uma das proteínas do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas) para a fabricação de um medicamento, por exemplo, um medicamento para a liberação de NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a invenção apresenta o uso de uma proteína H-NOX para a liberação de NO a um indivíduo. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é usada para tratar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica, como uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC), uma condição vasoconstrictora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1A é uma ilustração da estrutura tridimensional de resíduos da bolsa distal de proteínas H-NOX de ligação

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41/150 de NO e ligação de O2 (acima de heme) . Resíduos de coordenação de heme de proteínas H-NOX de ligação de NO e ligação de O2 também são mostrados (abaixo de heme). A FIG.

1A é baseada na estrutura tridimensional de H-NOX de T.

tengcongensis relatada por Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(35): 12.854-12.859.

A FIG. 1B é uma visão lateral estérea da estrutura tridimensional de H-NOX de T. tengcongensis que ilustra características estruturais do domínio de H-NOX. A dobra da proteína é representada por diagramas de fita. O heme, o ligante de di-oxigênio e a histidina proximal são mostrados como modelos ball-and-stick. As α-hélices são rotuladas AG de acordo com a nomenclatura mostrada na FIG. 5B. As fitas β são rotuladas 1-4. A FIG. 1B é de Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), “Crystal Structure of An

Oxygen-Binding	Heme Domain Related to Soluble	Guanylate
Cyclases”,	Proc	. Natl.	Acad. Sci. USA 101	(35)	: 12.854-
12.859.
As	FIGS.	1C-1H	são ilustrações	da	estrutura
tridimensional	de H-NOX	de T. tengcongensis	que	ilustram
resíduos	exemplares da	bolsa distal em	H-NOX de T.

tengcongensis. Os resíduos seguintes revelados nas FIGS. IC-1H são os resíduos principais que compreendem a bolsa distal de H-NOX: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 e Leu 144, que estão contidos dentro de hélices A, D, E e G. As FIGS. IC-1H foram criadas com o uso de PYMOL (DeLano Scientific, LLP).

A FIG. 2 é um alinhamento de seqüências das proteínas de 21/11/2017, pág. 50/178

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H-NOX seguintes que se ligam ou que se prevê que se liguem ao O2 e NO: Majority (ID. DE SEQ. N°: 1); Ce. gcy-31 (ID.

DE SEQ. N°: 2); Ce. gcy-33 (ID. DE SEQ. N°: 3); Ce. gcy-35 (ID. DE SEQ. N°: 4); Dm. CG14885 H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 5);

Dm. CG4154 H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 6); Ms. Beta3 H-NOX (ID.

DE SEQ. N°: 7); Tt H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 8); e Ca H-NOX (ID. DE SEQ. N°: 9). Prevê-se que essas proteínas H-NOX se liguem ao O2, bem como ao NO, porque possuem a tirosina na posição que corresponde ao Y140 de H-NOX de T.

tengcongensís. A numeração de aminoácidos usada na FIG. 2 começa com o primeiro aminoácido no domínio de H-NOX ou na proteína de comprimento total como resíduo número 1. O alinhamento foi gerado com o uso dos parâmetros padronizados no programa MegAlign. As abreviações usadas na

FIG. 2 são descritas abaixo com relação às FIGS. 4A-4D.

As FIG. 3A-3D são um alinhamento de seqüências das proteínas H-NOX seguintes que se ligam ou que se prevê que se liguem ao NO, mas não ao O2: Majority (ID. DE SEQ. N°: 10); Dm. sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 11); sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 12); hs. sGC beta1 proteína (ID.

DE SEQ. N°: 13); hs. beta2 proteína (ID. DE SEQ. N°:14); Ms. sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 15); Mm. sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 16); Np. beta1 HD-like (ID. DE

SEQ. N°: 17); Tr. sGC beta1

Anopheles_gambiae|XP_310919

Apis_mellifera|NP_001011632 beta1 proteína (ID. DE reinhardtii|AAR02 (ID.

Oryzias_curvinotus|BAC98396

Oryzias_latipes|BAA7669I

prote	ína	(ID. DE	SEQ. N°:	18);
(ID	.	DE SEQ.	N°:	19);
(ID.	DE	SEQ. N°:	20); Bt.	sGC
SEQ.	N°	: 21);	Chlamydomonas
DE		SEQ.	N°:	22);
(ID	.	DE SEQ.	N°:	23);
ID.	DE SEQ.	N°:	24);

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43/150

Strongylocentrotus_purpuratus|X (ID. DE SEQ. N°: 25); e Sus scrofa beta1|NP_001018042+ (ID. DE SEQ. N°: 26). O alinhamento foi gerado com o uso dos parâmetros padronizados no programa MegAlign. As abreviações usadas nas FIGS. 3A-3D são descritas abaixo com relação à FIG. 4.

As FIGS. 4A-4D são um alinhamento de seqüências de proteínas H-NOX das FIGS. 2 e 3A-3D: Majority (ID. DE SEQ. N°: 27); Dm. sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N° : 11); sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 12); hs. sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 13); hs. beta2 proteína (ID. DE SEQ. N°:

14); Mm. sGC beta1 proteína (ID. DE SEQ. N°: 16); Np. beta1 HD-like (ID. DE SEQ. N°: 17); Tr. sGC beta1 proteína (ID.

DE SEQ. N°: 18); Chlamydomonas reinhardtii|AAR02 (ID. DE

SEQ. N°: 22); Oryzias_curvinotus|BAC98396 (ID. DE SEQ. N°:

23); Strongylocentrotus_purpuratus|X (ID. DE SEQ. N°: 25);

Sus scrofa beta1|NP_001018042 (ID. DE SEQ. N°: 26); gcy-31a (ID. DE SEQ. N°: 2); gcy-33 (ID. DE SEQ. N°: 3); Ca. H-NOX

(ID. DE	SEQ.	N°: 9); T. beta1 HD-like (ID.	DE	SEQ. N°:	8);
Ms. sGc	beta	3 proteína (ID. DE SEQ. N°:	7);	CG14885	(ID.
20 DE SEQ.	N°:	5); e Dm. sGC variante curta	(ID.	DE SEQ.	N°:

6). O alinhamento foi gerado com o uso dos parâmetros padronizados no programa MegAlign. Para as FIGS. 2-4D, “Dm. sGC beta1 proteína” representa β1 H-NOX de Drosophila melanogaster; “sGC beta1 proteína” representa β1 H-NOX de

Rattus norvegicus; “hs. sGC beta1 proteína” representa Homo β1 H-NOX de H. sapiens; “hs. beta2 proteína” representa Homo β2 H-NOX de H. sapiens; “Mm. sGC beta1 proteína” representa β1 H-NOX de Mus musculus; “Np. beta1 HD-like” representa H-NOX de Nostoc punctiforme; “Tr. sGC beta1 proteína” representa β1 H-NOX de Takifugu rubripes;

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44/150

Anopheles_gambiae|XP_310919” representa β1 H-NOX de Anopheles gambiae; Apis_mellifera|NP_001011632” representa β1 H-NOX de Apis mellifera; Bt. sGC beta1 proteína” representa β1 H-NOX de Bos taurus; Chlamydomonas reinhardtii|AAR02” representa β1 H-NOX de Chlamydomonas reinhardtii; Oryzias_curvinotus|BAC98396 representa β1 HNOX de Oryzias curvinotus; Oryzias_latipes|BAA76691” representa β1 H-NOX de Oryzias latipes; Strongylocentrotus_purpuratus|X” representa β1 H-NOX de Strongylocentrotus purpuratus; Sus scrofa beta1 SNP 001018042+” representa β1 H-NOX de Sus scrofa; gcy-31a” representa Gcy-31a H-NOX de Caenorhabditis elegans; gcy33” representa Gcy-33 H-NOX de Caenorhabditis elegans; gcy-35” representa Gcy-35 H-NOX de Caenorhabditis elegans; Ca. H-NOX” representa H-NOX de Clostridium acetobutiylicum; T. beta1 HD-like” representa H-NOX de Thermoanaerobacter tengcongensis; Ms. sGc beta 3 proteína” representa β3 H-NOX de Manduca sexta; CG14885” representa CG14885 H-NOX de Drosophila melanogaster; Dm. sGC variante curta” representa Gcy-88-E-S H-NOX de Drosophila melanogaster e Dm. CG4154 H-NOX” representa CG4154 H-NOX de Drosophila melanogaster.

A FIG. 5A é um alinhamento de seqüências de membros da família de H-NOX. A numeração de seqüências é aquela de HNOX de T. tengcongensis. Resíduos não variantes são indicados por um V”, resíduos muito altamente conservados são indicados por s”. Y140 de H-NOX de T. tengcongensis é indicado por um H”. Os resíduos de tirosina previstos da bolsa distal que podem estabilizar um complexo de FeII-O2 em outras proteínas H-NOX são: posição 70 para de 21/11/2017, pág. 53/178

45/150

Caenorhabditis elegans GCY-35; posição 140 em Drosophila melanogaster CG14885-PA; posição 138 de Caenorhabditis elegans GCY-35; posição 140 de Clostridium acetobutylicum; numerado de acordo com Thermoanaerobacter tengcongensis. Os números de acesso são: Homo H. sapiens β1 [gi: 2746083] (ID. DE SEQ. N°: 28), Rattus norvegicus β1 [gi: 27127318] (ID. DE SEQ. N°: 29), Drosophila melanogaster β1 [gi:

861203] (ID. DE SEQ. N°: 30), Drosophila melanogaster CG

14885-PA [gi: 23171476]

Caenorhabditis elegans GCY-35 N°: 32), Nostoc punctiforme [gi:

33) , Caulobacter crescentus [gi:

34) , Shewanella oneidensis [gi:

ID. DE	SEQ.	N°	: 31),
[gi: 52782806]	(ID.	DE SEQ.
: 23129606]	(ID.	DE	SEQ. N°:
: 16127222]	(ID.	DE	SEQ. N°:
24373702]	(ID.	DE	SEQ. N°:

35), Legionella pneumophila (ORF 2) [CUCGC_272624] (ID. DE

SEQ. N°: 36), Clostridium acetobutylicum [gi: 15896488]

(ID. DE	SEQ. N°:	37)
[gi: 20807169] (ID.	DE
gerados	com o uso	do
Star,	(vej a

a página na Internet dnastar.com/products/megalign.php). Foram usados os parâmetros padronizados de Clustal-W.

A FIG. 5B é um alinhamento de seqüências de domínios de H-NOX exemplares. As anotações da estrutura secundária e a numeração no topo do alinhamento correspondem ao domínio de H-NOX de T. tengcongensis. As α-hélices são representadas por espirais, e fitas β por setas. A bolsa distal é definida por α-hélices aA, aD, aE e aG. os números de acesso de Pubmed/NCBI são os seguintes: Ther_tengcongensis gi | 208071691 (ID. DE SEQ. N°: 39), Clos acetobutylicum gi | 158964881 (ID. DE SEQ. N°: 40), de 21/11/2017, pág. 54/178

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	Clos tetani GI:	75543266 (ID.	DE	SEQ.	N°:	41) ,
	Desu desulfuricans	gi | 23475919	| (ID	DE	: SEQ.	N°	42),
	Vibr vulnificus gi	| 273617341	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 43),
	Caul crescentus gi	| 16127222 |	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 44),
5	Micr degradans gi	| 23027521 |	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 45),
	Vibr cholerae gi |	15601476 |	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 46),
	Shew oneidensis gi	| 24373702 |	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 47),
	Rat beta1 sGC gi |	27127318 |	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 48),
	Rat beta2 sGC gi |	21956635 |	(ID.	DE	SEQ.	N°	: 49),
10	Nost junctiforme gi	| 23129606 |	(ID.	DE	SEQ.	N°:	50) e
	Nost sp. gi | 17229770 | (ID. DE SEQ. N'	°: 51). A	. seqüência
	de consenso é mostrada na parte de	baixo	da	FIG.	5B	(ID. DE

SEQ. N°: 52) . Os alinhamentos foram gerados com o uso do programa MULTALIN (Corpet, F. (1988) Nucleic Acids Res. 16:

10.881-10.890), e a FIG. 5B foi preparada com o uso do programa ESPRIPT (Gouet, P. e cols. (1999) Bíoínformatícs 15: 305-308).

As FIGS. 6A e 6B são ilustrações da estrutura tridimensional do ambiente heme do domínio de H-NOX de T.

tengcongensis. As FIGS. 6A e 6B são de Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc. Natl. Acad. Sci USA 101(35): 12.85412.859.

As FIGS. 7A-7F são gráficos da espectroscopia de UV visível de proteínas H-NOX após redução anaeróbica (complexos não ligados de Fe^IZ; linha de cima em cada gráfico), antes e depois de serem expostas ao ar (complexos de Fe^IZ-O2; a linha de baixo em cada gráfico) para Tt H-NOX (FIG. 7A), Tt Y140L (FIG. 7B), Tt W9F-Y140L (FIG. 7C), Tt

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F78Y-Y140L (FIG. 7D), L2 H-NOX e L2 F142Y (FIG. 7E) e β1(1385) e β1(1-385) I145Y (FIG. 7F) . Além dos complexos de Fe^IZ e Fe^IZ-O2 de L2 F142Y e β1(1-385) I145Y, o espectro de L2 H-NOX e β1-(1-385) H-NOX do tipo selvagem após redução e exposição ao ar são mostrados na linha do meio na FIG. 7E e 7F, respectivamente, para demonstrar que essas proteínas não se ligam ao O2 antes da adição de uma tirosina da bolsa distal. Os dois ou três números escritos no canto superior esquerdo de cada painel representam o comprimento de onda para o pico das linhas no gráfico. Os números são escritos verticalmente na ordem a qual as linhas correspondentes aparecem verticalmente no gráfico. Por exemplo, o valor de 430 nm na FIG. 7A representa o pico do comprimento de onda para a linha de cima no gráfico (que representa um complexo de Fe não ligado), e o valor de 416 nm na FIG. 7A representa o pico do comprimento de onda para a linha de baixo no gráfico (que representa um complexo de Fe^II-O2). Uma mudança no comprimento de onda na presença de ar indica que a proteína se liga ao O2. A formação de um pico duplo entre 500 e 600 nm na presença de ar também é indicativa de ligação de O2. As FIGS. 7A-7F são de Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1: 53-59.

As FIGS. 8A-8DD contêm seqüências de polinucleotídeos de ácidos nucléicos exemplares que codificam proteínas HNOX e as seqüências de aminoácidos das proteínas H-NOX correspondentes (IDS. DE SEQ. N^os: 53-162).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta surpreendente de que proteínas H-NOX possuem uma de 21/11/2017, pág. 56/178

48/150 reatividade ao NO bem menor do que hemoglobina. Essa baixa reatividade intrínseca ao NO (e alta estabilidade ao NO) torna as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes transportadores de NO desejáveis, por causa da baixa probabilidade de inativação de proteínas H-NOX por NO na presença de O2. Significativamente, a presença de uma tirosina da bolsa distal em algumas proteínas H-NOX (Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to

Soluble Guanylate Cyclases”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

101(35): 12.854-12.859) é sugestiva de reatividade ao NO alta, indesejável, contra-indicando o uso como um transportador de NO. Por exemplo, por analogia, uma proteína de hemoglobina de Mycobacterium tuberculosis, com uma tirosina da bolsa distal estruturalmente análoga, reagem de forma extremamente rápida com NO, e é usada pelo Mycobacterium para remover e evitar eficazmente o NO defensivo produzido por um hospedeiro infectado (Ouellet, H. e cols. (30 de abril de 2002), “Truncated Hemoglobin HbN

Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) : 5.902-5.907) . No entanto, descobrimos surpreendentemente que proteínas H-NOX na verdade possuem uma reatividade ao NO bem menor do que aquela da hemoglobina, o que torna possível seu uso como transportadores de NO.

Adicionalmente, foi constatado que a utilidade de proteínas H-NOX como transportadores de NO pode ser melhorada por modificação de suas afinidades para NO ou O2 para maximizar a quantidade de NO que é ligado à proteína

H-NOX e para reduzir a quantidade de proteína H-NOX que é

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49/150 oxidada pela reação de NO com O2 ligado à proteína H-NOX. Em particular, a afinidade de proteínas H-NOX para NO ou O2 e a capacidade das proteínas H-NOX de discriminar entre ligantes de NO e O2 pode ser alterada pela introdução de uma ou mais mutações de aminoácido, permitindo que sejam desenhadas proteínas H-NOX para ligar NO ou O2 com afinidades desejadas. Por exemplo, a constante de dissociação ou taxa de dissociação para NO ou ligação de O2 por proteínas H-NOX pode ser alterada pela introdução de uma única mutação de aminoácido. Mutações adicionais podem ser introduzidas para também alterar a afinidade para NO e/ou O2. A família da proteína H-NOX pode, portanto ser manipulada para exibir propriedades cinéticas e termodinâmicas aumentadas ou ideais para a liberação de NO. Por exemplo, podem ser geradas proteínas H-NOX mutantes com constantes de dissociação alteradas e/ou taxas de dissociação para ligação de NO que aumentam a utilidade das proteínas H-NOX para diversas aplicações clínicas e industriais. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX com uma baixa afinidade por O2 (como uma constante de dissociação de O2 de pelo menos cerca de 1 pM a 37°C) é usada para minimizar a quantidade de O2 que liga a proteína H-NOX, assim facilitando a ligação de NO à proteína H-NOX e reduzindo a quantidade of proteína H-NOX que é oxidada devido à reação de NO com O2 ligado ao heme da proteína HNOX. Essa redução na oxidação de proteínas H-NNOX resulta em menor destruição de NO e O2 que pode ser usado pelos órgãos, tecidos, e células do indivíduo tratado. A capacidade de modular proteínas H-NOX para ligar e liberar NO é uma via terapêutica que discute e supera as de 21/11/2017, pág. 58/178

50/150 desvantagens centrais dos vasodilatadores atuais. Portanto, a presente invenção fornece proteínas, composições, kits, e métodos para a liberação de NO.

Há vários benefícios da utilização de proteínas H-NOX para a liberação de NO. Nitratos orgânicos são eficazes por um tempo limitado devido á tolerância. Uma vez que as proteínas H-NOX liberam NO diretamente a indivíduos sem necessitar da bioconversão dos nitratos a NO, a eficácia das proteínas H-NOX como transportadores de NO não é limitada por inibição dessa via de bioconversão. As maiores limitações de transportadores de NO com base em hemoglobina são sua alta afinidade por O2 e sua propensão a serem inativados por NO. Como mencionado acima, a destruição de níveis mesmo baixos de NO por transportadores com base em hemoglobina pode ter efeitos sérios sobre o estado de repouso tônico da vasculatura e dos órgãos, e leva à hipertensão e ao sofrimento gastrintestinal. Entrecruzamento intra- e intermolecular foram usados para minimizar a toxicidade de veículos com base em hemoglobina quando usados como transportadores de oxigênio (“Blood Substitutes,” R. Winslow ed. Academic Press, 2006). Embora essas modificações superem algumas das questões de toxicidade graves relacionadas ao extravasamento de hemoglobina, permaneceu a alta reatividade de NO. Em contraste, proteínas H-NOX têm uma reatividade de NO muito menor que hemoglobina. Essa menor reatividade leva a menos destruição de NO, O2, e proteína H-NOX uma vez que menos NO reage com O2 ligado à proteína H-NOX. A capacidade de selecionar proteínas H-NOX com constantes de dissociação e taxas de dissociação desejadas para NO também pode de 21/11/2017, pág. 59/178

51/150 minimizar efeitos colaterais ao evitar que muito NO seja liberado (causando hipotensão) e evitando NO de ser liberado em locais indesejados (por exemplo, locais que não são vasoconstritos). A construção proteínas H-NOX para ligar e liberar NO com reatividade de NO mínima fornece um novo transportador de NO gasoso no sangue em que as proteínas H-NOX liberam NO sem serem inativadas por NO. Essas proteínas H-NOX, composições, kits e métodos serão descritos com mais detalhe nessa especificação.

Para liberação de NO, a construção de proteínas H-NOX representa uma importante alternativa que supera o problema persistente de tolerância com os nitrovasodilatadores atuais. O uso de proteínas H-NOX como veículso de liberação para NO fornece uma nova via terapêutica para o tratamento de doenças exacerbadas por hipertensão crônica.

Proteínas H-NOX

Visão geral da família de proteínas H-NOX

A menos que indicado de forma diferente, qualquer proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante pode ser usada nas composições, kits e métodos aqui descritos. Como aqui usado, o termo uma “proteína H-NOX” significa uma proteína que possui um domínio de H-NOX (denominada para domínio de ligação Heme-Óxido nítrico e Oxigênio). Uma proteína H-NOX pode ou não conter um ou mais domínios diferentes, além do domínio de H-NOX. As proteínas H-NOX são membros de uma família altamente conservada, bem caracterizada, de hemoproteínas (Iyer, L.M. e cols. (3 de fevereiro de 2003), “Ancient Conserved Domains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins”, BMC Genomics 4(1): 5; Karow, D.S. e cols. (10 de agosto de de 21/11/2017, pág. 60/178

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2004), “Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, Biochemistry 43(31): 10.203-10.211; Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis

For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1: 53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), “Ligand

Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4): 892-902). As proteínas

H-NOX também são denominadas proteínas Pfam 07700 ou proteínas HNOB (Pfam - uma base de dados de alinhamentos de família de domínios de proteínas e Modelos Ocultos de

Markov, Marca Registrada (C) 1996-2006 “The Pfam

Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc.”, 59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EUA) . Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX possui, ou prevê-se que possua, uma estrutura secundária que inclui seis hélices alfa, seguidas por duas fitas beta, seguidas por uma hélice alfa, seguida por duas fitas beta. Uma proteína H-NOX pode ser uma apoproteína que é capaz de ligação com heme ou uma holoproteína com heme ligado. Uma proteína HNOX pode se ligar de forma covalente ou não covalente a um grupo heme. Algumas proteínas H-NOX se ligam ao NO, mas não ao O2, e outras se ligam tanto ao NO quanto ao O2. Os domínios de H-NOX de aeróbios facultativos que foram isolados se ligam ao NO, mas não ao O2. As proteínas H-NOX de procariotas aeróbicos obrigatórios, C. elegans e D.

melanogaster, se ligam ao NO e ao O2. Mamíferos possuem

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53/150 duas proteínas H-NOX: β1 e β2. Um alinhamento de seqüências de H-NOX de camundongo, rato, vaca e humanas mostra que essas espécies compartilham >99% de identidade. Em algumas modalidades, o domínio de H-NOX de uma proteína H-NOX ou toda a proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25,

30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 ou 99,5% idêntico àquele da região correspondente de uma proteína HNOX de Thermoanaerobacter tengcongensis de ocorrência natural ou uma proteína sGC de ocorrência natural (por exemplo, uma proteína sGC β1 de ocorrência natural) . Como aqui discutido anteriormente, uma proteína H-NOX pode opcionalmente conter uma ou mais mutações em relação à proteína H-NOX de ocorrência natural correspondente. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX inclui um ou mais domínios, além do domínio de H-NOX. Em modalidades particulares, a proteína H-NOX inclui um ou mais domínios ou toda a seqüência de outra proteína. Por exemplo, a proteína H-NOX pode ser uma proteína de fusão que inclui um domínio de H-NOX e parte de outra proteína ou outra proteína inteira, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina sérica humana). Em algumas modalidades, apenas o domínio de H-NOX está presente.

Uma estrutura cristal de uma H-NOX de ligação de O2 procariótica de Thermoanaerobacter tengcongensis (Nioche,

P. e cols. (26 de novembro de 2004), “Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum”, Science 306 (5.701): 1.550-1.553; Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), “Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 101 (35): 12.854-12.859) mostra que um

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54/150 grupo hidroxil da cadeia lateral de tirosina forma uma ligação H crítica para a porção Fe^II-O2. Essa rede de ligação de hidrogênio da bolsa distal, que envolve principalmente Y140, estabiliza um complexo de Fe^II-O2 (FIG.

6B). Essa tirosina não está presente em proteínas H-NOX que discriminam contra O2 e só se ligam ao NO. Por exemplo, prevê-se que essa rede de ligação de hidrogênio esteja ausente nas proteínas H-NOX de sGCs e procariotas aeróbicos, sugerindo que esse é um fator molecular fundamental na seletividade de ligante acentuada contra O2 exibida por essas proteínas heme. As FIGS. 7A-7G demonstram nitidamente que a adição de uma tirosina na bolsa distal de uma proteína H-NOX do tipo selvagem que se liga ao NO, mas não ao O2, pode permitir que a proteína H-NOX mutante se ligue ao O2. Dessa forma, uma tirosina na bolsa heme distal da dobra heme de H-NOX atua como um interruptor para ativar e desativar a ligação do O2.

Como ilustrada nas FIGS. 6A e 6B, a estrutura da porfirina é altamente distorcida. Como ilustrado na FIG.

6A, o motivo conservado Y-S-R forma interações de ligação de hidrogênio com as cadeias laterais de ácido propiônico do grupo heme. Na FIG. 6B, o H102 conservado é o ligante proximal ao heme (FIG. 6B).

Como aqui usado, o termo proteína inclui proteínas e fragmentos de proteínas, sejam eles isolados de fontes naturais, produzidos por técnicas recombinantes ou sintetizados quimicamente. Uma proteína pode ter uma ou mais modificações, por exemplo, uma modificação póstradução (por exemplo, glicosilação etc.) ou qualquer outra modificação (por exemplo, PEGuilação etc.). A proteína pode

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55/150 conter um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural (por exemplo, um aminoácido com uma modificação da cadeia lateral). Em várias modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos cerca de 50, 100, 150, 181, 200, 250, 300, 350,

400, ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas H-NOX podem incluir de cerca de 50 a cerca de 600 aminoácidos como, por exemplo, cerca de 100 a cerca de 500 aminoácidos, cerca de 150 a cerca de 400 aminoácidos, cerca de 150 a cerca de 300 aminoácidos ou cerca de 175 a cerca de 200 aminoácidos.

Fontes de proteínas H-NOX

As proteínas H-NOX de qualquer gênero ou espécie podem ser usadas nas composições, kits e métodos aqui descritos. Em várias modalidades, a proteína H-NOX é uma proteína de um mamífero (por exemplo, um primata (por exemplo, um ser humano, um macaco, um gorila, um chipanzé, um lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino ou um felino), um inseto, uma levedura ou uma bactéria, ou é derivada de uma proteína desse tipo. Proteínas H-NOX de mamíferos exemplares incluem guanilato ciclase solúvel humana e de rato do tipo selvagem (por exemplo, a subunidade β1) . Exemplos de proteínas H-NOX incluem proteínas H-NOX de mamíferos do tipo selvagem, por exemplo, de H. sapiens, M. musculus, C. familiaris, B. taurus e R. norvegicus; e proteínas H-NOX do tipo selvagem de vertebrados não mamíferas, por exemplo, de X. laevis, O. latipes, O. curivatus e F. rubripes. Exemplos de proteínas H-NOX de ligação de NO do tipo selvagem não mamíferas incluem proteínas H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, A.

gambiae e M. sexta; exemplos proteínas H-NOX de ligação de

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56/150 melanogaster β1 CG14885-PA [gi:

[gi: 52782806],

Caulobacter crescentus

O2 não mamíferas do tipo selvagem incluem proteínas H-NOX do tipo selvagem de C. elegans gcy-31, gcy-32, gcy-33, gcy34, gcy-35, gcy-36, e gcy-37; de D. melanogaster CG14885,

CG14886 e CG4154; e de M. sexta beta-3; exemplos de proteínas H-NOX procarióticas do tipo selvagem incluem T. tengcongensis, V. cholera, V. fischerii, N. punctiforme, D. desulfuricans, L. pneumophila 1, L. pneumophila 2 e C. acetobutylicum.

Os números de Acesso no NCBI para proteínas H-NOX 10 exemplares incluem os seguintes: Homo sapiens β1 [gi: 2746083], Rattus norvegicus β1 [gi: 27127318], Drosophila [gi: 861203], Drosophila melanogaster

23171476], Caenorhabditis elegans GCY35 Nostoc punctiforme [gi: 23129606],

Caulobacter crescentus [gi: 16127222], Shewanella oneidensis [gi: 24373702], Legionella pneumophila (ORF 2) [CUCGC 272624], Clostridium acetobutylicum [gi: 15896488] e Thermoanaerobacter tengcongensis [gi: 20807169].

Proteínas H-NOX exemplares também incluem as seguintes 20 proteínas H-NOX que são listadas pelo nome de seu gene, seguido pela abreviatura de sua espécie e Identificadores no Genbank (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades): Npun59 0 5_Npu_2 3129606, alr227 8_Ana_1722 97 7 0,

SO214 4_Sone_2 4 37 37 02, Mdeg13 4 3_Mde_2 3027521,

VCA0720_Vch_15601476, CC2992_Ccr_16127222,

Rsph2043_Rhsp_22958463 (gi: 46192757),

Mmc10739 Mcsp 22999020, Tar4 Tte 20807169,

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Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy31_Ce_17568389, CG_14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCS-beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577,

CG4154 Dm 24646993 (gi:	NP_650424.2,	gi:	62484298),	gcy-
5 32_Ce_13539160, gcy-36	_Ce_17568391	(gi	: 32566352,	gi:
86564713), gcy-35_Ce-	17507861 (gi		71990146),	gcy-

37_Ce_17540904 (gi: 71985505), GCY1a3_Hs_20535603,

GCY1a2-Hs_899477 ou GYCa-99B_Dm_729270 (gi: 68067738) (Lakshminarayan e cols. (2003), “Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl ciclases and bacterial signaling proteins”, BMG Genomics 4: 5-13). As abreviações de espécies usadas nesses nomes incluem: Ana = Anabaena Sp; Ccr = Caulobacter crescentus; Cac = Clostridium acetobutylicum; Dde - Desulfovibrio desulfuricans; Mcsp =

Magnetococcus sp. ; Mde = Microbulbifer degradans; Npu = Nostoc punctiforme; Rhsp = Rhodobacter sphaeroides; Sone = Shewanella oneidensis; Tte = Thermoanaerobacter tengcongensis; Vch = Vibrio cholerae; Ce = Caenorhabditis elegans; Dm = Drosophila melanogaster; Hpul = Hemicentrotus pulcherrimus; Hs = Homo sapiens.

Outras proteínas H-NOX exemplares incluem as seguintes proteínas H-NOX que estão listadas por seu nome do organismo e número de acesso na base de dados Pfam (por exemplo, as seguintes seqüências de proteínas disponíveis em 21 de maio de 2006; 22 de maio de 2006; 17 de maio de 2007; 21 de maio de 2007; ou 22 de maio de 2007, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades): Caenorhabditis briggsae Q622M5_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61P44_CAEBR, Caenorhabditis briggsae

Q61R54_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q61V90_CAEBR,

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Caenorhabditis briggsae Q61A94_CAEBR, Caenorhabditis briggsae Q60TP4_CAEBR, Caenorhabditis briggsae

Q60M10_CAEBR, Caenorhabditis elegans GCY37_CAEEL,

Caenorhabditis elegans GCY31_CAEEL, Caenorhabditis elegans

GCY36_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY32_CAEEL,

Caenorhabditis elegans GCY35_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY34_CAEEL, Caenorhabditis elegans GCY33_CAEEL, Oryzias curvinotus Q7T040_ORYCU, Oryzias curvinotus Q75WF0_ORYCU, Oryzias latipes P79998_ORYLA, Oryzias latipes Q7ZSZ5_ORYLA,

Tetraodon nigroviridis Q4SW38_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4RZ94_TETNG, Tetraodon nigroviridis Q4S6K5_TETNG, Fugu rubripes Q9OVY5_FUGRU, Xenopus laevis Q6INK9_XENLA, Homo sapiens Q5T8J7_HUMAN, Homo sapiens GCYA2_HUMAN, Homo sapiens GCYB2_HUMAN, Homo sapiens GCYB1_HUMAN, Gorilla gorilla Q9N193_9PRIM, Pongo pygmaeus Q5RAN8_PONPY, Pan troglodytes Q9N192_PANTR, Macaca mulatta Q9N194_MACMU, Hylobates lar Q9N191_HYLLA, Mus musculus Q8BXH3_MOUSE, Mus musculus GCYB1_MOUSE, Mus musculus Q3UTI4_MOUSE, Mus musculus Q3UH83_MOUSE, Mus musculus Q6XE41_MOUSE, Mus musculus Q80YP4_MOUSE, Rattus norvegicus Q8OWX7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX8_RAT, Rattus norvegicus Q920Q1_RAT, Rattus norvegicus Q54A43_RAT, Rattus norvegicus Q80WY0_RAT, Rattus norvegicus Q8OWY4_RAT, Rattus norvegicus Q8CH85_RAT, Rattus norvegicus Q8OWY5_RAT, Rattus norvegicus GCYB 1_RAT, Rattus norvegicus Q8CH90_RAT, Rattus norvegicus Q91XJ7_RAT, Rattus norvegicus Q80WX9_RAT, Rattus norvegicus GCYB2_RAT, Rattus norvegicus GCYA2_RAT, Canis familiaris Q4ZHR9 CANFA, Bos taurus GCYB1_BOVIN, Sus scrofa Q4ZHR7_PIG, Gryllus bimaculatus Q59HN5_GRYBI, Manduca sexta O77106_MANSE,

Manduca sexta O76340 MANSE, Apis mellifera Q5UAFO APIME,

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Apis mellifera Q5FANO_APIME, Apis mellifera Q6L5L6_APIME, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PYK9_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7Q9W6_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7QF31_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PS01_ANOGA, Anopheles gambiae cepa PEST Q7PFY2_ANOGA, Anopheles gambiae Q7KQ93_ANOGA, Drosophila melanogaster Q24086_DROME, Drosophila melanogaster GCYH_DROME, Drosophila melanogaster GCY8E_DROME, Drosophila melanogaster GCYDA_DROME, Drosophila melanogaster GCYDB_DROME, Drosophila melanogaster Q9VA09_DROME, Drosophila pseudoobscura Q29CE 1_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C7_DROPS, Drosophila pseudoobscura Q296C8 DROPS, Drosophila pseudoobscura

Q29BU7_DROPS, Aplysia

Hemicentrotus pulcherrimus reinhardtii, Q5YLC2_CHLRE, californica Q95NK5_HEMPU, Anabaena sp

Q7YWK7_APLCA, Chlamydomonas Q8YUQ7 ANASP,

Flavobacteria bacterium BBFL7 Q26GR8_9BACT, Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5 9FLAO, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, proteobactéria marinha gama HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM, Caulobacter crescentus Q9A451_CAUCR, cryptum JF-5 Q2DG60_ACICY,

Q3J0U9 RHOS4,

Acidiphilium sphaeroides Q5LPVI_SILPO, Q3PC67 PARDE,

Rhodobacter

Silicibacter pomeroyi denitrificans PD1222,

Paracoccus

Silicibacter sp TM1 040 Q3QNY2 9RHOB,

Jannaschia sp Q28ML8_JANSC, Magnetococcus sp MC-1 Q3XT27_9PROT, Legionella pneumophila Q5WXP0_LEGPL, Legionella pneumophila Q5WTZ5_LEGPL, Legionella pneumophila Q5X268_LEGPA, Legionella pneumophila Q5X2R2_LEGPA, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZWM9_LEGPH, Legionella pneumophila subsp. pneumophila Q5ZSQ8_LEGPH, Colwellia psychrerythraea Q47Y43 COLP3, Pseudoalteromonas

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Q1ZWE5_9VIBR, alginolyticus

Q2SFY7_HAHCH,

Oceanobacter atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT, Shewanella oneidensis Q8EF49_SHEON, Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2, Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2, Vibrio angustum S14 Vibrio vulnificus Q8DAE2_VIBVU, Vibrio

12G01 QIVCP6_VIBAL, Vibrio sp DAT722

Q2FA22_9VIBR, Vibrio parahaemolyticus Q87NJ1_VIBPA, Vibrio fischeri Q5E1F5_VIBF1, Vibrio vulnificus Q7MJS8_VIBVY, Photobacterium sp SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, Hahella chejuensis Oceanospirillum sp MED92 Q2BKV0_9GAMM, sp RED65 Q1NO35 9GAMM, Desulfovibrio desulfuricans Q310U7_DESDG, Halothermothrix orenii H 168 Q2AIW5_9FIRM, Thermoanaerobacter tengcongensís Q8RBX6_THETN, Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, Clostridium acetobutylicum Q97E73_CLOAB, Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT, Clostridium tetani Q899J9_CLOTE e Clostridium beijerincki NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE. Prevê-se que essas seqüências codifiquem proteínas H-NOX com base na identificação dessas proteínas como pertencentes à família da proteína H-NOX com o uso da base de dados Pfam aqui descrita.

Proteínas H-NOX e ácidos nucléicos adicionais que podem ser adequados para uso nas composições farmacêuticas e métodos aqui descritos podem ser identificados com o uso de métodos padronizados. Por exemplo, programas padronizados de alinhamento de seqüências e/ou de previsão de estrutura podem ser usados para identificar proteínas HNOX e ácidos nucléicos adicionais com base na similaridade de sua estrutura primária e/ou secundária de proteína prevista com aquela de proteínas H-NOX e ácidos nucléicos conhecidos. Por exemplo, a base de dados Pfam usa de 21/11/2017, pág. 69/178

61/150 algoritmos de alinhamento definidos e Modelos Ocultos de Markov (por exemplo, Pfam 21.0) para categorizar as proteínas em famílias como, por exemplo, a família da proteína H-NOX (Pfam - uma base de dados de alinhamentos de domínio de família de proteína e Modelos Ocultos de Markov, Marca Registrada (C) 1996-2006 “The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation, Inc.”, 59 Temple Place Suite 330, Boston, MA 02111-1307, EUA) . Bases de dados padronizadas como, por exemplo, a base de dados “swissprottrembl” (na Internet em “expasy.org”, “Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU” - 1 rue Michel Servet CH-1211 Genebra 4, Suíça) também podem ser usadas para identificar membros da família da proteína H-NOX. A estrutura secundária e/ou terciária de uma proteína H-NOX pode ser prevista com a utilização dos ajustes padronizados de programas padronizados de previsão de estrutura como, por exemplo, PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nova York, N.Y. 10032, EUA) . Alternativamente, a estrutura secundária e/ou terciária real de uma proteína H-NOX pode ser determinada com a utilização de métodos padronizados.

Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui o mesmo aminoácido na posição correspondente que qualquer um dos seguintes resíduos da bolsa distal em H-NOX de T. tengcongensis: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140, Leu144 ou qualquer combinação de dois ou mais dos citados anteriormente. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui uma prolina ou uma arginina em uma posição que corresponde àquela de Pro115 ou Arg135 de H-NOX de T. tengcongensis, respectivamente, com base no alinhamento de seqüências de suas seqüências de de 21/11/2017, pág. 70/178

62/150 aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui uma histidina que corresponde a His105 de R. norvegicus β1 H-NOX. Em algumas modalidades, a proteína HNOX possui ou prevê-se que tenha uma estrutura secundária que inclui seis hélices alfa, seguidas por duas fitas beta, seguidas por uma hélice alfa, seguida por duas fitas beta. Essa estrutura secundária foi relatada para proteínas HNOX.

Se desejado, uma proteína H-NOX recém-identificada pode ser testada para determinar se ela se liga ao heme com a utilização de métodos padronizados. A habilidade de uma proteína H-NOX para funcionar como um transportador de NO pode ser testada determinando-se se a proteína H-NOX se liga ao NO com a utilização de métodos padronizados como aqueles aqui descritos. Se desejado, uma ou mais das mutações aqui descritas podem ser introduzidas na proteína H-NOX para otimizar suas características como transportador de NO. Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais mutações para alterar sua constante de dissociação de NO, a koff para NO, k1 para NO, k2 para NO, constante de dissociação de O2, a estabilidade ao NO, reatividade de NO taxa de auto-oxidação de heme ou qualquer combinação de dois ou mais das citadas anteriormente. Técnicas padronizadas, tais como aquelas aqui descritas, podem ser usadas para medir esses parâmetros.

Como aqui discutido, proteínas H-NOX mutantes (por exemplo, mutantes de classe I e de classe II discutidos abaixo) podem ser derivados por mutagênese a partir dessas ou de outras seqüências-fonte naturais do tipo selvagem (por exemplo, as seqüências listadas nas FIGS. 2-4D ou 8Ade 21/11/2017, pág. 71/178

63/150 aleatória, constantes reatividade fisiológica

8DD ou qualquer outra seqüência aqui descrita). Como aqui usado, o termo “derivada de” refere-se à fonte da proteína na qual uma ou mais mutações é introduzida. Por exemplo, uma proteína que é “derivada de uma proteína de mamífero” refere-se à proteína de interesse que resulta da introdução de uma ou mais mutações na seqüência de uma proteína do tipo selvagem de mamífero (ou seja, uma seqüência que ocorre na natureza).

Proteínas H-NOX mutantes

Como aqui discutido anteriormente, uma proteína H-NOX pode conter uma ou mais mutações, por exemplo, uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a taxa de auto-oxidação, a reatividade ao NO, a estabilidade ao NO, ou qualquer combinação de duas ou mais das citadas anteriormente, comparadas com aquelas da proteína do tipo selvagem correspondente. Podem ser gerados painéis de proteínas H-NOX projetadas por mutagênese seguida por rastreamento empírico para de dissociação, taxas de dissociação, ao NO, estabilidade, compatibilidade necessárias ou desejadas, ou qualquer combinação de dois ou mais das citadas anteriormente, à luz dos ensinamentos aqui fornecidos com a utilização de técnicas aqui descritas e, adicionalmente, como conhecido por aqueles habilitados na técnica. Alternativamente, a mutagênese pode ser direcionada seletivamente para regiões ou resíduos específicos, tais como resíduos da bolsa distal aparentes a partir da estrutura tridimensional determinada experimentalmente ou prevista de uma proteína H-NOX (FIG. 1A nessa especificação; e veja, por exemplo, Boon, E.M. e de 21/11/2017, pág. 72/178

64/150 cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1: 5359, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação às seqüências de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes) ou resíduos conservados evolutivamente identificados a partir de alinhamentos de seqüências (FIGS. 2-4 nessa especificação; e veja, por exemplo, Boon E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1: 53-59, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação às seqüências de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes).

Como aqui usado, o termo “proteína mutante” significa uma proteína com uma ou mais mutações, comparada com uma proteína que ocorre na natureza. Em uma modalidade, a proteína mutante possui uma seqüência que difere daquela de todas as proteínas que ocorrem na natureza. Em várias modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína mutante é pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 ou 99,5% idêntica àquela da região correspondente de uma proteína que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, a proteína mutante é um fragmento de proteína que contém pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou 400 aminoácidos contíguos de uma proteína de comprimento total. A identidade de seqüência pode ser medida, por exemplo, com o uso de um software de análise de seqüências com os parâmetros padronizados aqui especificados (por exemplo, Pacote de Softwares de Análise de Seqüências do “Genetics Computer Group”, “University of de 21/11/2017, pág. 73/178

65/150

Wisconsin Biotechnology Center”, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Esse programa combina seqüências similares por atribuição de graus de homologia para várias substituições, eliminações e outras modificações de aminoácidos.

Como aqui usado, o termo “mutação” significa uma alteração em um ácido nucléico ou em uma seqüência de aminoácidos de referência que ocorre na natureza. Mutações de ácidos nucléicos exemplares incluem uma inserção, eliminação, mutação estrutural, mutação silenciosa, mutação do tipo nonsense ou mutação do tipo missense. Em algumas modalidades, a mutação do ácido nucléico não é uma mutação silenciosa. Mutações de proteínas exemplares incluem a inserção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, a inserção de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos), a eliminação de um ou mais aminoácidos (por exemplo, a eliminação de resíduos do terminal N, do terminal C e/ou internos como, por exemplo, a eliminação de pelo menos cerca de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou mais aminoácidos, ou uma eliminação de cerca de 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 ou 400 aminoácidos), a substituição de um ou mais aminoácidos (por exemplo, a substituição de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos), ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente. Um truncamento funcional exemplar de uma proteína H-NOX inclui os resíduos 1-385 da seqüência de β1. Em algumas modalidades, uma proteína mutante possui pelo menos uma alteração de aminoácido, comparada com uma proteína que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, uma seqüência de ácidos nucléicos mutante codifica uma proteína que possui pelo menos uma de 21/11/2017, pág. 74/178

66/150 alteração de aminoácido, comparada com uma proteína que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, o ácido nucléico não é uma versão degenerada de um ácido nucléico que ocorre na natureza que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácídos idêntica a uma proteína que ocorre na natureza. A nomenclatura usada para se referir a uma mutação de aminoácido em particular identifica, inicialmente, o aminoácido do tipo selvagem, seguido pelo número do resíduo e, finalmente, o aminoácido substituto. Por exemplo, Y140L significa que tirosina foi substituída por uma leucina no número de resíduo 140.

Uma “mutação conservada evolutivamente é a substituição de um aminoácido em uma proteína por um aminoácido na posição correspondente de outra proteína na mesma família de proteína. Mutações conservadas evolutivamente exemplares (também denominadas mutações da classe I) estão listadas na Tabela 1A. Na Tabela 1A, as mutações são numeradas/anotadas de acordo com a seqüência de H-NOX β1 humana, mas são análogas para todas as seqüências de H-NOX. Dessa forma, a posição correspondente em qualquer outra proteína H-NOX pode ser mutada para o resíduo indicado. Por exemplo, Phe4 de H-NOX β1 humana podem ser mutada para uma tirosina, uma vez que outras proteínas H-NOX possuem uma tirosina nessa posição. O resíduo de fenilalanina correspondente pode ser mutado para uma tirosina em qualquer outra proteína H-NOX. Em modalidades específicas, uma ou mais mutações estão confinadas aos resíduos conservados evolutivamente. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem incluir pelo menos uma mutação conservada evolutivamente e pelo de 21/11/2017, pág. 75/178

67/150 menos uma mutação não conservada evolutivamente. Se desejado, essas proteínas H-NOX mutantes são submetidas ao rastreamento empírico para constantes de dissociação de NO/O2, reatividade ao NO, estabilidade e compatibilidade fisiológica à luz dos ensinamentos aqui fornecidos.

Tabela 1A. Mutações de H-NOX da Classe I exemplares dirigidas aos resíduos conservados evolutivamente

F4Y	Q30G	I145Y
F4L	E33P	I145H
H7G	N61G	K151E
A8E	C78H	I157F
L9W	A109F	E183F

Em algumas modalidades, a mutação é uma mutação da bolsa distal, por exemplo, uma mutação de um resíduo na hélice alfa A, D, E ou G (Pellicena, P. e cols. (31 de agosto de 2004), “Crystal Structure of An Oxygen-Binding

Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(35): 12.854-12.859). Mutações exemplares da bolsa distal (também denominadas mutações da classe II) estão listadas na Tabela 1B. Na Tabela 1B, as mutações são numeradas/anotadas de acordo com a seqüência de H-NOX β1 humana, mas são análogas para todas as seqüências de H-NOX. Como várias substituições fornecem mutações viáveis em cada resíduo citado, o resíduo em cada posição indicada pode ser alterado para qualquer outro aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural (denominado “X”) . Estas mutações podem produzir proteínas H-NOX com diversas características desejadas de afinidade, estabilidade e reatividade.

Tabela 1B. Mutações de H-NOX da Classe II exemplares

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68/150 direcionadas aos resíduos da bolsa distal

V8X	M73X	I145X
L9X	F77X	I14 9X
F7 0X	C78X

Em modalidades particulares, a mutação é uma mutação de heme da bolsa distal. Como aqui descrito, um determinante molecular crucial que evita a ligação ao O2 em membros da família de H-NOX de ligação ao NO é a ausência de um doador de ligação H na bolsa distal do heme. Conseqüentemente, em algumas modalidades, a mutação altera a ligação de H entre o domínio de H-NOX e o ligante dentro da bolsa distal. Em algumas modalidades, a mutação rompe um doador de ligação H da bolsa distal e/ou transmite redução de ligação de ligante de O2 em relação ao domínio de H-NOX do tipo selvagem correspondente. Resíduos da bolsa distal exemplares incluem hr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 e Leu144 de H-NOX de T.

tengcongensís e os resíduos correspondentes em qualquer outra proteína H-NOX.

Resíduos que não estejam na bolsa distal também podem afetar a estrutura tridimensional do grupo heme; essa estrutura, por sua vez, afeta a ligação de O2 e de NO ao ferro no grupo heme. Conseqüentemente, em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui uma ou mais mutações fora da bolsa distal. Exemplos de resíduos que podem ser mutados, mas que não estão na bolsa distal, incluem Pro115 e Arg135 de H-NOX de T. tengcongensís. Em algumas modalidades, a mutação está na bolsa proximal que inclui His105 como um resíduo que se liga ao ferro de heme.

Em algumas modalidades, quando duas ou mais mutações

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69/150 estão presentes, pelo menos uma mutação está na bolsa distal, e pelo menos uma mutação está fora da bolsa distal (por exemplo, uma mutação na bolsa proximal). Em algumas modalidades, todas as mutações estão na bolsa distal.

Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína H-NOX não é idêntica à seqüência de uma proteína que é produzida por um organismo na natureza. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína H-NOX não é idêntica a uma seqüência encontrada em qualquer base de dados em 21 de maio de 2006 ou em 22 de maio de 2006 (por exemplo, todas as seqüências previstas conhecidas ou conhecidas como sendo uma seqüência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de H-NOX). Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos da proteína H-NOX não é idêntica a uma seqüência encontrada em qualquer base de dados em 21 de maio de 2007 ou em 22 de maio de 2007 (por exemplo, todas as seqüências previstas conhecidas ou conhecidas como sendo uma seqüência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de HNOX).

Para reduzir a imunogenicidade de proteínas H-NOX derivadas de outras fontes que não seres humanos, os aminoácidos em uma proteína H-NOX podem ser mutados para os aminoácidos correspondentes em uma H-NOX humana. Por exemplo, um ou mais aminoácidos na superfície da estrutura terciária de uma proteína H-NOX não humana podem ser mutados para o aminoácido correspondente em uma proteína HNOX humana. Em algumas variações, uma mutação de um ou mais aminoácidos de superfície pode ser combinada com uma mutação de dois ou mais resíduos da bolsa distal, uma mutação de um ou mais resíduos fora da bolsa distal (por de 21/11/2017, pág. 78/178

70/150 exemplo, uma mutação na bolsa proximal), ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente.

Mutações exemplares são mostradas na Tabela 2. Além disso, qualquer um dos resíduos listados na Tabela 2 pode ser mutado para qualquer outro aminoácido. A invenção também está relacionada a qualquer combinação de mutações aqui descritas como, por exemplo, mutações duplas, triplas ou maiores. Por exemplo, combinações de qualquer uma das mutações aqui descritas podem ser feitas na mesma proteína H-NOX. Observe que mutações em posições equivalentes em outras proteínas H-NOX de mamíferos ou não mamíferos também são englobadas por essa invenção. Se desejado, resíduos diferentes daqueles mencionados na Tabela 2 também podem ser mutados. Proteínas H-NOX mutantes exemplares compreendem uma ou mais mutações que transmitem alteração da ligação de ligante de O2 ou NO em relação ao domínio de H-NOX do tipo selvagem correspondente, e são operacionais como um transportador de NO gasoso sangüíneo fisiologicamente compatível de mamíferos.

Na Tabela 2 e em todas as tabelas subseqüentes, o número de resíduo para uma mutação indica a posição na seqüência da proteína H-NOX em particular descrita. Por exemplo, T. tengcongensís I5A refere-se à substituição de isoleucina por alanina na quinta posição em H-NOX de T. tengcongensís. A mesma mutação de isoleucina em alanina pode ser feita no resíduo correspondente em qualquer outra proteína H-NOX (esse resíduo pode ou não ser o quinto resíduo na seqüência de outras proteínas H-NOX) . Como a seqüências de aminoácidos dos domínios de β1 H-NOX mamíferos diferem em, no máximo, dois aminoácidos, esperade 21/11/2017, pág. 79/178

71/150 se também que as mutações que produzem as proteínas H-NOX mutantes desejáveis, quando introduzidas nas proteínas β1 H-NOX do tipo selvagem de rato, produzam proteínas H-NOX mutantes desejáveis quando introduzidas em proteínas β1 H5 NOX do tipo selvagem de outros mamíferos, por exemplo, seres humanos.

Em algumas modalidades a proteína H-NOX possui pelo menos uma mutação na qual um resíduo que corresponde a Ile5, Trp9, Asn74, Pro115, Arg135 ou ou Tyr140 de H-NOX de

T. tengcongensis ou I145 de β1(1-385) ou Phe142 de L. pneumophila 2 é substituído por qualquer outro aminoácido. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX possui pelo menos duas mutações, em que pelo menos uma mutação é a substituição de um resíduo que corresponde a Ile5, Trp9,

Asn74, Pro115 ou Arg135, ou Tyr140 de H-NOX de T.

tengcongensis, I145 de β1(1-385) ou Phe142 de L.

pneumophila 2 por qualquer outro aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação na proteína H-NOX corresponde a uma mutação de I5A, uma mutação de I5L, uma mutação de W9F, uma mutação de Y140F, uma mutação de YI40L, uma mutação de

Y140H, uma mutação dupla de W9F Y140H ou uma mutação dupla F78Y Y 140F de T. tengcongensis ou uma mutação de I145Y de β1. Em algumas modalidades, a mutação na proteína H-NOX corresponde a uma mutação de W9Y, uma mutação de W9H, uma mutação de W9N, uma mutação de N74H, uma mutação de N74E, uma mutação de N74A, uma mutação de P115A, uma mutação de RQ135, um mutante duplo de I5L P115A, um mutante duplo de N74A Y140H, ou um mutante duplo W9F N74A de T. tengcongensis. Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido do terminal C (como pelo menos cerca de 50

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72/150 aminoácidos contíguos do terminal C ou entre cerca de 25 a cerca de 200 aminoácidos contíguos do terminal C) na proteína H-NOX foram removidos, comparados com a proteína do tipo selvagem correspondente (como R. norvegícus ou H sapiens βΐ).

Tabela 2. H-NOX mutantes exemplares de T. tengcongensis

(Tt), L	pneumophila	(Lp), D.	desulfuricans (Dd), V.
cholera	(Vc) , N.	punctiforme (Np)	, C. botulinum (Cb) , C.
acetobutylicum,	(Ca), de	rato, humanas, de C.	elegans	(Ce) .
			Outras
Tt	Lp	Dd	bactérias	Rato	Humana	Verme
	ΖΛ/Η- NOX(728-				Ce GCY-
Tt H-NOX	L2 H-NOX	899)	Vc H-NOX	β 1(1-385)	31(1-385)	35(1-252)
Tt H-NOX				β 1(1-385)	31(1-385)
Hísó	Z2FI42Y	ZWY139L	Np H-NOX Cb H-	I145Y	Ι145Υ
	L2 F9W-		NOX(1-	β 1(1-385)	31(1-385)
7ΪΙ5Α	F142Y		175)	1145H	1145Η
			C&H- NOX(1-	β 1(1-385)	31(1-385)
77I5L	LI H-NOX		186)	C78Y	C78Y
			Ca H-
7?15L-			NOX0-
Ρ1Ι5Α	LI F142Y		197) CüH- NOX(I-	βΙ(Ι-194)	31(1-194)
Tt W9F			183)	βΐ H105F	β1 H105F
7?W9F- Y140L				βΐ H105G	βΐ H105G
7) W9F-				β 1(1-194)	31(1-194)
Y140H				1145Υ	1145Υ
					β!(1 -194)
Tt W9F-				31(1-194)	L9W-
N74A				L9W-I145Y	1145Υ
n v.9Y				β2(1-217)	32(1-217)
				β2(1-217)	32(1-217)
Tt W9N				JI42Y	IÍ42Y
Tt W9H
Tf N74E
7ΪΝ74Α

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73/150

Tt N74H TrN74AΎΙ40Η Tt T75F Hisó

Tt F7SYY140L Tt F78ΥΥΙ 4OF 7ΪΡ115Α Tt R135Q Hisó

Tt YI40F 7>YI4ftL Ti Y140H Tt Y140A Z/L144F Hisó

Modificações nas proteínas H-NOX

Qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes pode ser modificada e/ou formulada com a utilização de métodos padronizados para aprimorar as aplicações terapêuticas ou industriais. Por exemplo, e particularmente aplicados às proteínas H-NOX heterólogas projetadas, diversos métodos são conhecidos na técnica para o isolamento desses agentes da vigilância imunológica, incluindo entrecruzamento, PEGuilação, decoração de carboidrato etc. (por exemplo, Rohlfs, R.J. e cols. (15 de maio de 1998), Arterial Blood Pressure Responses to CellFree Hemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric Oxide, J. Biol. Chem. 273(20): 12.128-12.134; Migita, R. e cols. (junho de 1997), Blood Volume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion With Hemoglobin-Based

Oxygen Carriers, J. Appl. Physiol. 82(6): 1.995-2.002;

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74/150

Vandegriff, K.D. e cols. (15 de agosto de 2004), “Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)Conjugated Human Haemoglobin”, Biochem. J. 382 (Pt 1): 183189, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à modificação de proteínas), bem como outras técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A fusão de uma proteína H-NOX com uma proteína humana como, por exemplo, albumina sérica humana, pode aumentar a meia-vida sérica, a viscosidade e a pressão oncótica coloidal. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX é modificada durante ou depois de sua síntese para diminuir sua imunogenicidade e/ou para aumentar seu tempo de retenção plasmática. As proteínas HNOX também podem ser encapsuladas (por exemplo, encapsulação dentro de lipossomos ou nanopartículas).

Características de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes

Como aqui descrito, foi gerado um grande número de proteínas H-NOX mutantes variadas que fornecem intervalos de constantes de dissociação de NO e de O2, koff de NO, de koff de O2, de reatividade ao NO, taxa de auto-oxidfação, tempo de retenção de plasma, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados a qualquer um dos compostos atualmente usados para liberação de NO, como

Como acima discutido, a baixa reatividade intrínseca de NO (e alta estabilidade de NO) tornam a proteína H-NOX de tipo selvagem e mutante transportadores de NO desejáveis por causa da menor probabilidade de inativação das proteínas H-NOX por NO na presença de O2. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX tem uma baixa afinidade por

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O2 (coo uma constante de dissociação de O2 de pelo menos cerca de 1 pM a 37°C) ou nenhuma afinidade detectável por O2. Um vez que pouco, se houver, O2 é ligado à proteína HNOX, há oxidação mínima por NO de O2 ligado ao heme da proteína H-NOX. Portanto, NO, O2, e proteína H-NOX mínimos são inativados por essa oxidação de NO. Portanto, mais NO

pode	ser	liberado	a locais	desejados em um indivíduo	e
menos	O2	que pode	ser usado	pelos tecidos no indivíduo	é
destruído	.
10		Como aqui	usado, o	termo “hemoglobina” significa

uma proteína ou um mutante desta da família bem caracterizada de hemoglobinas, que são metaloproteínas de transporte de O2 que contêm ferro, em células sangüíneas vermelhas. A hemoglobina humana purificada, sem estroma, possui uma Kd cinética para o O2 de cerca de 200-500 nM. Esse valor depende da subunidade.

Por “um complexo 6-coordinado de Fe^II-NO” entende-se um 6-coordenado ferroso-nitrosil que produz um pico UV-Vis Soret em aproximadamente 416-422 nm, como descrito, por exemplo, por Boon, E. M. e cols., (agosto 2006), “Niytic Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain,” J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação à determinação do percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 6-coordenado Fe^II-NO e o percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 5-coordenado FeNO.

Por “um complexo 5-coordenado Fe^II-NO” entende-se um

5-coordenado ferroso-nitrosil que produz um pico UV-Vis

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76/150

Soret em aproximadamente 397-400 nm, como descrito, por exemplo, por Boon, E. M. e cols., (agosto 2006), “Nitic Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain,” J. Biol. Chem. 281(31) : 21892-21902, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação à determinação do percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 6-coordenado Fe^II-NO e o percentual de uma amostra de proteína H-NOX que contém um complexo 5-coordenado FeNO.

Como aqui usado, o termo “koff” significa uma taxa de dissociação, como a taxa de liberação de O2 ou de NO por uma proteína. Um valor numérico de koff menor indica uma taxa de dissociação mais lenta. Para uma proteína H-NOX com um complexo 6-coordenado Fe^II-NO, a koff para NO é calculada como descrito por Boon, E. M. et al., (agosto 2006), “Nitic Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain,” J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902, e Boon, E.M. et al. (2005) . “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,” Nature Chemical Biology 1:53-59, que são que incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO para proteínas H-NOX. Para uma proteína H-NOX com um complexo 5-coordenado Fe^II-NO, a koff para NO é descrita pela k1 para NO e a k2 para NO, como descrito por Winger, J. A. e cols., (janeiro 2007) “Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanyilate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”. J. Biol. Chem. 282(2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, de 21/11/2017, pág. 85/178

77/150 particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, kl de, e k2 de NO para proteínas H-NOX. Para uma proteína HNOX que contém uma mistura de complexos 5-coordenado e 6coordenado Fe^II-NO, a koff para NO é descrita pela k1 para NO e a k2 para NO, como descrito por Winger, J. A. e cols., (janeiro 2007) “Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanyilate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs”. J. Biol. Chem. 282(2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, k1 de, e k2 de NO para proteínas H-NOX.

Em algumas modalidades, a koff, k1 ou k2 para NO para uma proteína H-NOX é entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C como entre 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 0,012 s^-1, cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 0, 007 s^-1, cerca de 0, 005 s¹ a cerca de 0, 011 s^-1, ou cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 1 x 10^-3 s^-1. Em várias modalidades, a koff para O2 para uma proteína H-NOX é entre cerca de 1 a cerca de 1.000 s^-1 a

37°C, como cerca de 1 a cerca de 50 s^-1, cerca de 50 a cerca de 100 s^-1, cerca de 100 a cerca de 250 s^-1, cerca de

250 a cerca de 500 s^-1, cerca de 500 a cerca de 750 s^-1, ou cerca de 750 a cerca de 1.000 s^-1 a 37°C.

O termo kon significa uma taxa de associação, por exemplo, a taxa de ligação de O2 ou NO a uma proteína. Um valor numérico menor da kon indica uma taxa de associação mais lenta. Em várias modalidades, a koff para O2 para uma proteína H-NOX é entre cerca de 0,14 a cerca de 60 μΜ^-1 s^-1 a 20°C como, cerca de 6 a cerca de 60 μΜ^-1 s^-1, cerca de 6 a 12 μΜ^-1 s^-1, cerca de 15 a cerca de 60 μΜ^-1 s^-1, cerca de 5 a cerca de 18 μΜ^-1 s^-1 ou cerca de 6 a cerca de 15 μΜ^-1 s^-1.

de 21/11/2017, pág. 86/178

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Por “constante de dissociação” significa uma “constante de dissociação cinética” ou uma “constante de dissociação calculada”. Uma “constante de dissociação cinética” ou “Kd” significa uma proporção de taxa cinética off (koff) para a taxa cinética on (kon), por exemplo, um valor de Kd determinado como um valor absoluto com a utilização de métodos padronizados (por exemplo, métodos espectroscópicos, de fluxo interrompido ou de fotólise instantânea padronizados), incluindo métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica e/ou aqui descritos. A “constante de dissociação calculada” ou “Kd calculada” refere-se a uma aproximação da constante de dissociação cinética com base em uma koff medida. Um valor para a kon é derivado por meio da correlação entre a Kd cinética e a koff, como aqui descritas. Para a KD calculada para NO, o valor para a kon para NO para uma proteína H-NOX é 710 μΜ^-1 s^-1, que é uma kon relatada para β1 (1-385) que foi medida a 4°C e não aumenta significativamente a 37°C (Zhao, e cols., (1999). “A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase,” PNAS. 96:14753-14758, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de kon de NO para proteínas H-NOX) . Para a KD calculada para O2, um valor para kon é derivado por meio da correlação entre KD cinético e koff como aqui descrito.

Em várias modalidades, a Kd cinética ou calculada para a ligação de NO por uma proteína H-NOX está dentro de cerca de 0,01 a cerca de 100 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (por exemplo, a 20°C), por exemplo, entre cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes ou entre cerca de 0,5 a cerca de de 21/11/2017, pág. 87/178

79/150 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (como a 20°C) . Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está entre cerca de 0,1 a cerca de 20 pM a 37°C, como cerca de 0,5 a cerca de 15, cerca de 0,5 a cerca de 12, cerca de 0,7 a cerca de 4, ou cerca de 0,7 a cerca de 3 a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 0,1 pM a 37°C, como pelo menos cerca de qualquer um de 0,5, 1, 3, 5, 10, 12, 50, 100, 400, 500, 1.000, 2.000, 3.000, ou 4.000 pM a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX is less menos que cerca de 5.000 pM a 37°C, como menos que cerca de qualquer um de 4.000 pM, 3.000 pM, 2.000 pM, 1.000 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM, 50 pM, 12 pM, 10 pM, 5 pM, 3 pM ou 1 pM a 37°C.

Em várias modalidades, a Kd cinética ou calculada para a ligação de O2 por uma proteína H-NOX está dentro de cerca de 0,01 a cerca de 100 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (por exemplo, a 20°C), por exemplo, entre cerca de 0,1 a cerca de 10 vezes ou entre cerca de 0,5 a cerca de 2 vezes a da hemoglobina sob as mesmas condições (por exemplo, a 20°C). Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C, como pelo menos cerca de 5 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, ou 100 pM a 37°C. Em algumas modalidades, não há qualquer ligação detectável a O2 a 37°C, como a ausência de ligação de O2 detectavel com o uso de espectroscopia visível de UV como aqui descrito (por exemplo, uma ausência de um pico observável a ~418 nm na presença de O2, como quando o pico de Soret permanece a ~431 nm como observado na ausência de de 21/11/2017, pág. 88/178

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O2 ou quando o pico de Soret troca para ~410 nm devido à proteína oxidada).

Como aqui usado, o termo “afinidade por NO” é um termo qualitativo que se refere à potência da ligação de NO a uma proteína (como a ligação a um grupo heme ou a um oxigênio ligado a um grupo heme associado com uma proteína) . Essa afinidade é afetada tanto pela koff quanto pela kon por NO. Um valor de Kd por NO numericamente inferior significa uma afinidade maior. “Afinidade por oxigênio” é um termo qualitativo que se refere à potência da ligação de oxigênio à porção heme de uma proteína. Essa afinidade é afetada tanto pela koff quanto pela kon por oxigênio. Um valor de Kd por oxigênio numericamente inferior significa uma afinidade maior.

Como aqui usado, o termo “estabilidade ao NO” referese à estabilidade ou resistência de uma proteína à oxidação por NO na presença de oxigênio. Por exemplo, a habilidade da proteína para não ser oxidada quando ligada ao NO na presença de oxigênio é indicativa da estabilidade da proteína ao NO. Em algumas modalidades, menos do que cerca de 50, 40, 30, 10 ou 5% de uma proteína H-NOX são oxidados após incubação por cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 ou 20 horas a 20°C.

Como aqui usado, o termo “reatividade ao NO” refere-se à taxa na qual o ferro no heme de uma proteína de ligação de heme é oxidado por NO na presença de oxigênio em uma concentração de 2 μΜ de proteína. Um menor valor numérico para a reatividade ao NO em unidades de s^-1 indica uma reatividade ao NO menor. Em várias modalidades, a reatividade ao NO de uma proteína H-NOX é de menos do que de 21/11/2017, pág. 89/178

81/150 cerca de 700 s^-1 a 20°C como, por exemplo, menos do que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 400 s^-1, 300 s^-1, 200 s^-1, 100 s^-1, 75 s^-1, 50 s^-1, 25 s^-1, 20 s^-1, 10 s^-1, 50 s^-1, 3 s^-1, 2s^-1, 1,8 s^-1, 1,5 s^-1, 1,2 s^-1, 1,0 s^-1,0,8 s^-1, 0,7 s^-1 ou 0,6 s^-1 a

20°C. Em várias modalidades, a reatividade ao NO de uma proteína H-NOX é entre cerca de 0,1 a cerca de 600 s^-1 a 20°C como, por exemplo, entre cerca de 0,5 a cerca de 400 s^-1, cerca de 0,5 a cerca de 100 s^-1, cerca de 0,5 a cerca de 50 s^-1, cerca de 0,5 a cerca de 10 s^-1, cerca de 1 a cerca de 5 s^-1 ou cerca de 0,5 a cerca de 2,1 s^-1 a 20°C. Em várias modalidades, a reatividade de uma proteína H-NOX é pelo menos cerca de 10, 100, 1.000 ou 10.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina sob as mesmas condições, por exemplo, a 20°C.

Como aqui usado, o termo “taxa de auto-oxidação” refere-se à taxa na qual o ferro no heme de uma proteína de ligação de heme é auto-oxidado. Um valor numérico menor da taxa de auto-oxidação em unidades de s^-1 indica uma taxa de auto-oxidação menor. Em várias modalidades, a taxa de auto-

oxidação	de heme	de	uma	proteína H-NOX é de	menos	do	que
cerca de	1,0 h-1	a	37°C	como, por exemplo,	menos	do	que
cerca de	0,9 h-1,	0,	8 h-1,	0,7 h-1, 0,6 h-1, 0,	5 h-1,	0,4	h-1,

0,3 h^-1, 0,2 h^-1, 0,1 h^-1 ou 0,05 h^-1 a 37°C. Em várias modalidades, a taxa de auto-oxidação de heme de uma proteína H-NOX é entre cerca de 0,006 a cerca de 5,0 h^-1 a 37°C como, por exemplo, cerca de 0,006 a cerca de 1,0 h^-1, 0, 006 a cerca de 0,9 h^-1 ou cerca de 0,06 a cerca de 0,5 h^-1 a 37°C.

Em várias modalidades, uma proteína H-NOX mutante possui: (a) uma constante de dissociação de O2 ou NO, uma de 21/11/2017, pág. 90/178

82/150 taxa de associação (kon para O2 ou NO) ou uma taxa de dissociação (koff para O2 ou NO) dentro de 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, (b) possui uma afinidade por NO mais fraca (por exemplo, pelo menos cerca de 10 vezes, 100 vezes ou 1.000 vezes mais fraca) do que aquela de sGC β1, (c) uma reatividade ao NO com O2 ligado pelo menos 1.000 vezes menor do de retenção plasmática in 1.000 vezes maior do que qualquer combinação de

que a	hemoglobina, (d)	um tempo
vivo	pelo	menos 2, 10,	100 ou
aquele da	hemoglobina,	ou (e)
dois	ou	mais dos	citados

anteriormente.

Transportadores de NO adequados exemplares fornecem constantes de dissociação dentro de duas ordens de magnitude daquela da hemoglobina, ou seja entre cerca de 0,01 e 100 vezes, como entre cerca de 0,1 e 10 vezes, ou entre cerca de 0,5 e 2 vezes daquelas da hemoglobina. Podem ser usadas diversas técnicas estabelecidas para quantificar as constantes de dissociação, por exemplo, as técnicas aqui descritas (Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1: 53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4) : 892-902), Vandegriff, K.D. e cols. (15 de agosto de 2004), “Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin”, Biochem. J. 382(Pt 1): 183-189, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, de 21/11/2017, pág. 91/178

83/150 particularmente com relação à medida de constantes de dissociação), além daquelas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Transportadores de NO exemplares fornecem reatividade da proteína H-NOX ao NO baixa ou minimizada com O2 ligado, como uma reatividade ao NO menor do que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a reatividade ao NO é bem menor como, por exemplo, pelo menos cerca de 10, 100, 1.000 ou 10.000 vezes menor do que aquela da hemoglobina. Podem ser usadas diversas técnicas estabelecidas para quantificar a reatividade ao NO (Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1: 53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), “Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4): 892-902), Vandegriff, K.D. e cols. (15 de agosto de 2004), “Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin”, Biochem. J. 382(Pt 1): 183-189, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida da reatividade ao NO), além daquelas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Como as H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis possuem uma reatividade ao NO muito baixa, outras proteínas H-NOX do tipo selvagem e proteínas H-NOX mutantes podem ter uma baixa reatividade ao NO similar. Por exemplo, H-NOX Y140H de T. tengcongensis possui uma reatividade ao NO similar àquela da H-NOX do tipo selvagem de T.

de 21/11/2017, pág. 92/178

84/150 tengcongensis.

Mutantes de exemplo para liberação de NO têm uma afinididade mais fraca por NO, preferivelmente pelo menos 10 vezes, 100 vezes, ou 1.000 vezes mais fraca que aquela de sGC β1. Para a liberação terapêutica de NO (por exemplo, durante/após um ataque cardíaco, cirurgia cardíaca aberta, ou AVC) várias proteínas H-NOX projetadas com afinidades variáveis são empiricamente testadas para eficácia emn estados de doença particulares, com uma faixa em algumas modalidades de afinidades de NO de 0,1 a 1.000 nM.

Além disso, transportadores de NO adequados fornecem estabilidade elevada ou maximizada, particularmente estabilidade in vivo. Podem ser utilizadas diversas medidas da estabilidade, como a estabilidade oxidativa (por exemplo, estabilidade à auto-oxidação ou à oxidação por NO) , estabilidade à temperatura e a estabilidade in vivo. Podem ser usadas diversas técnicas estabelecidas para quantificar a estabilidade, como as técnicas aqui descritas (Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E.M. e cols. (outubro de 2005), “Ligand Discrimination in Soluble. Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins”, Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5): 441-446; Boon, E.M. e cols. (2005), “Ligand Specificity of H-NOX Domains: From sGC to Bacterial NO Sensors”, J. Inorg. Biochem. 99(4): 892-902), além daquelas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Para a estabilidade in vivo no plasma, sangue ou tecido, medidas exemplares da estabilidade incluem o tempo de retenção, a taxa de depuração e a meia-vida. Espera-se que de 21/11/2017, pág. 93/178

85/150 as proteínas H-NOX de organismos termofílicos sejam estáveis em temperaturas elevadas. Em várias modalidades, os tempos de retenção plasmática são pelo menos cerca de 2, 10, 100 ou 1.000 vezes maior do que aquela da hemoglobina (por exemplo, Bobofchak, K.M. e cols. (agosto de 2003), “A Recombinant Polymeric Hemoglobin With Conformational, Functional, And Physiological Characteristics of an in vivo O2 transporter”, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2) : H549-H561) . Como será observado por aqueles habilitados na técnica, transportadores com base em hemoglobina são limitados pela depuração rápida da hemoglobina sem células do plasma em função da presença de receptores para hemoglobina que removem hemoglobina sem células do plasma. Como não há receptores para proteínas H15 NOX no plasma, espera-se que as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes tenham um tempo de retenção plasmática mais longo do que o da hemoglobina. Se desejado, o tempo de retenção plasmática pode ser aumentado por PEGuilação ou entrecruzamento de uma proteína H-NOX ou por fusão de uma proteína H-NOX com outra proteína com a utilização de métodos padronizados (por exemplo, aqueles aqui descritos e aqueles conhecidos por aqueles habilitados na técnica).

Em várias modalidades, a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina. Em algumas modalidades, a koff, k1 ou k2 para NO da proteína

H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C. Em algumas modalidades,

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86/150 a koff, kl ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C. a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1 a 20°C (por exemplo, less menos que cerca de 600 s¹, 500 s^-1, 100 s^-1, 20 s^-1, ou 1,8 s^-1 a 20°C) . Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da proteína

H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C, e a reatividade de NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1 a 20°C (por exemplo, menos que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 100 s^-1, 20 s^-1, ou 1,8 s^-1 a 20°C) . Em algumas modalidades, a koff, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x

10^-4 s^-1 a cerca de 10 s^-1 a 37°C, e a taxa de auto-oxidação de heme da proteína H-NOX é de menos cerca de 1 h^-1 a 37°C. Em algumas modalidades, a constante de dissociação de O2 da

proteína	H-NOX é pelo menos	cerca de 1 pM a	37°C,	e	a taxa
de auto-	oxidação da proteína	H-NOX é de menos que	cerca de
2 0 1 h-1 a	37°C. Em algumas	modalidades, a	taxa	de	auto-
oxidação	da proteína H-NOX	é de menos que	cerca	de	h-1 a
37°C, e	a reatividade de NO	da proteína H-	NOX é	de	menos

que cerca de 700 s^-1 a 20°C (por exemplo, less menos que cerca de 600 s^-1, 500 s^-1, 100 s^-1, 20 s^-1, ou 1,8 s^-1 a

20°C). Em algumas modalidades, a viscosidade da solução de proteína H-NOX é entre 1 e 4 centipoise (cP) . Em algumas modalidades, a pressão oncótica coloidal da solução de proteína H-NOX é entre 20 e 50 mm Hg.

A Tabela 3 lista tamanhos, afinidades por oxigênio, estabilidades à auto-oxidação, taxas de reatividade ao NO e

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87/150 modificações exemplares para proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes. Na Tabela 3, o tamanho do veículo refere-se ao peso molecular de uma proteína H-NOX modificada (por exemplo, PEGuilada) ou não modificada

Tabela 3: Modalidades exemplares para proteínas H-NOX

Tamanho	Afinidade	Estabilidade	Afinidade	Reativi-	Decoração
do	ao	(auto-	ao NO	dade ao	da
veículo	oxigênio	oxidação)		NO (s-1)	partícula
>1 MD	< 1 nM	1 hora	1 pM	0,01 a	Entrecru-
				0,1	zamento
0,5 kD a	1 nM a	1 h a 12 h	5 00 pM	0,1 a 1	PEGuilaçã
1 MD	100 nM				o
0,1 kD a	100 nM a	12 h a 48 h	1 nM	1 a 10	Encapsu-
0,5 kD	1 pM				lação
0,01 kD	1 pM a 10	48 h a 2	1pM	10 a 100
a 0,1 kD	pM	semanas

Dados exemplares para mutantes particulares são registrados nas Tabelas 4-14. Nas Tabelas 4-14, β1 e β2 referem-se às proteínas derivadas de proteínas H-NOX de rato. Como as seqüências de aminoácidos de domínios de proteínas β1 H-NOX de mamíferos diferem em, no máximo, dois aminoácidos, esperam-se resultados similares para as mutações correspondentes em proteínas β1 H-NOX de outros mamíferos, como β1 humana.

A Tabela 4 demonstra que a constante de dissociação para ligação de NO pode ser significativamente alterada por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX.

Adicionalmente, a capacidade de reguladores alostéricos para afetar dramaticamente a constante de dissociação e taxa de dissociação de NO para sGC sustenta a capacidade de

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88/150 mutações que alteram a estrutura de sGC ou outras proteínas H-NOX para alterar a constante de dissociação e taxa de dissociação de NO. Se desejado, a constante de dissociação para ligação de NO pode ser ainda alterada por combinação de qualquer uma das mutações listadas na Tabela 4 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.

Table 4. Vlored e KD para ligação de NO a H-NOX e outras hemoproteínas

Hemop r o t e i na	(yM-1»') .	kttfr	KD (pM)
sGC	> [4Ob	0,001 a 0.66^	0.71 a. 4710
01 (1-385)	710b	0.0023 a 0.0087 cü	3.24 a 12.3
Hb(T)	I8t,f	0.004 c f	411 *(222)
Hb (R)	I8a,f	0.00005 e*r	5.14“ (2,28)
Mb	]?e.h	0,00012^	13.1 “(7.06)
Tt H-NOX	[	0,00056J	0.78
Tt H-NOX	I	0,00013J	0 18
YI40L
Ll H-NOX	[	0,00103 a 0.0087J	1.45 a 123
L2 H-NOX	I	0.00036 a 0.00218J	0.51 a 3.1
L2 H-NOX	I	0.00051 J	0.72
F142Y

^acalculado a partir da proporção koff:kon; ^bZhao, e cols., (1999). A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by

Soluble Guanylate Cyclase, PNAS. 96:14753-14758, medido a

4°C, as taxas se aproximam da taxa de difusão e não aumentam significativamente a 37°C; Winger, J. A. e cols., (janeiro de 2007) Dissociation of Nitric Oxide from

Soluble Guanylate Cyclase and Heme- Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs J. Biol. Chem. 282(2):897-907; ^d as faixas mais amplas de valores de k combinam da dissociação de NO da 5-coordenada e 6- coordenada, cada uma com média de 2 — 4 experimentos de dissociacao com o uso de

CO de saturação e 30 mM Na₂S2O4 como o NO trap e contendoi

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0,88 — 2,2 μΜ de proteína. Os dados forma melhor adequados por uma equação exponencial dupla:

ΔΑ,^ΔΑ,ίΙ-έ· 'líAAjfl-e e medido a 20°C; ^f Morris, e cols., 1980 J Biol. Chem. 255: 8050-8053; 9 cálculo de KD, ajustado a 37°C, assumindo duplicação de taxa a cada 10°C, valor a 20°C mostrdo em parênteses; ^h Moore, e cols., (1976). Cooperativity in the Dissociation of Nitric Oxide from Hemoglobin, J Biol. Chem. 251: 2788-2794; Assumindo a mesma kon que a de βΐ (1-385) (710 pM^_1s^_1) ; Boon, E. M. et al., (agosto de 2006), Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain,J. Biol. Chem. 281(31): 21892-21902.

A Tabela 5 demonstra que a constante de dissociação (koff) para ligação de NO pode ser significativamente alterada por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. A koff para essas proteínas H-NOX mutantes de exemplo varia de 0,00013 a 0,011 s^_1 a 37°C. Para a Tabela 5, as taxas de dissociação de NO de hemoproteínas são derivadas com o uso de traps químicos como indicado em cada referência citada. Para comparação, as taxas de dissociação de NO de nitratos orgânicos e NONOatos são medidas com o uso de um eletrodo de NO e confirmadas com o ouso de um trap de oxihemoglobina. Quando necessário, os valores são ajustados para 37°C com o uso do fato de que as taxas duplicam aproximadamente para cada 10°C. Se desejado, a koff para ligação de NO pode ser também alterada por combinação de qualquer uma das mutações única ou dupla listadas na Tabela 5 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.

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Tabela 5. Comparação de taxas de dissociação de NO de hemoproteína e nitrovasodilatador a 37°C.

Heinoproteina ou Nitrovasodilatador	kotr (δ1)
sGC	0.001* 0.66*
pl (1-385)	0.0023 * 0.0087 *
p2 (1-217)	0.0069 * 0.0 ll 9
pl (1-194)	0.0009 a 0.0041 ’
ΤΪ H-NOX	0.00056 b
Tí H-NOX Y140L	0.00013*
Tt H-NOX Y140F	20±0,3í 104’
LI H-NOX	0.00103 * 0.0087 b
L2 H-NOX	0.00036* 0.00218
L2 H-NOX F142Y	0.00051b
Hb(T)	0.004 c
Hb(R>	0.00005 c
Mb	0.00012 d
Nitro for in (pH 5.0)	0.02 to 21 ç
Nitroforin (pH8.0)	0.6 to 15 *
DEA/NO	0.0083 f
nPRONO	0.00012f
C1CH2CH20NO	0.000022 f
tBuONO	0.000008 f

^a Winger, J. A. e cols., (janeiro de 2007) Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and HemeNitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs J. Biol. Chem. 282(2): 897-907; ^b Boon, E. M. e cols., (August

2006) , Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase βΐ HONOX Domain,J. Biol. Chem.

281(31): 21892-21902; ^c Morris, e cols., (1980). The role of diffusion in limiting the rate of ligand binding to hemoglobin J Biol. Chem. 255:8050-8053; ^d Moore, e cols., (1976). Cooperativity in the dissociation of nitric oxide from hemoglobin, J BioL Chem. 251: 2788-2794; ^e Maes, e cols., (2004) Role of Binding Site Loops in Controlling

Nitric Oxide Release: Structure and Kinetics of Mutant Forms of Nitrophorin 4 Biochemistry 43(21):6679-90; ^f Artz, J.D. e cols., (1998) NO Release from NO Donors e Nitrovasodilators: Comparisons between Oxyhemoglobin and

Potentiometric Assays, Chem. Res. ToxicoL 11(12):1393Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 99/178

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1397; ^g Boon, E. M e cols., (2006) “Sensitive and Selective Detection of Nitric Oxide Using an H-NOX Domain,” JACS

128:10022-10023.

Como mostrado na Tabela 6, a introdução de uma ou mais 5 mutações nas proteínas H-NOX de tipo selvagem permite que sejam alteradas a taxa de auto-oxidação e a taxa de dissociação de O2. Se desejado, a taxa de auto-oxidação ou a taxa de dissociação de O2 também podem ser alteradas por combinação de qualquer uma das mutações única ou dupla listadas na Tabela 6 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína HNOX, como aqui descrito.

Tabela 6. Estabilidade à auto-oxidação, propriedades de ligação de O2 (por exemplo, taxa de dissociação de O2) e resíduos de ligação de H da bolsa distal estão listados para proteínas H-NOX da classe II do tipo selvagem e mutantes

Proteína	Estabilidade	Atividade de ligação de O2	Resíduos da bolsa distal
Tt H-NOX, uma H-NOX procariótica e um forte ligante de O2
Tt H-NOX	kox ~0°	koff = 1,22	Trp9, Phe78, Tyr140
Tt Y140F	kox = 0,05	koff = 15,7 d	Trp9, Phe78, Phe140
Tt Y140L	kox = 0,19	koff = 2 0 d	Trp9, Phe78, Leu140
Tt Y140H	Kox = 0,87	koff = 5,03	Trp9, Phe78, His140
Tt Y140A	Estável a	Complexo parcial	Trp9, Phe78, A1a140

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Tt W9F	kox ~0° c	koff = 1,84	Phe9, Phe78, Tyr140
Tt W9F-Y140L	Kox = 0, 12	Sem complexo formado	Phe9, Phe78, Leu140
Tt W9F-Y140H	Kox = 0,11	koff = 23,4	Phe9, Phe78, His140
Tt F78Y- Y140L	kox ~0°	koff = 0,83	Trp9, Tyr78, Leu140
Tt F78Y- Y140F	kox ~0°	koff = 1,48	Trp9, Tyr78, Phe140
Proteínas H-NOX procarióticas para as quais a	proteína do
tipo selvagem não se liga	ao O2
L2 H-NOX	Estável a	Sem complexo formado	Phe9, Phe78, Phe142
L2 F142Y	Estável f	koff = 3,68	Phe9, Phe78, Tyr142
L2 F9W-F142Y	Estável f	Se liga ao O2 e	Trp9, Phe78, Tyr142
L1 H-NOX	kox = 0,31	Sem complexo formado	Leu9, Leu78, Phe142
L1 F142Y	kox = 1,8	koff = 1,73 d	Leu9, Leu78, Tyr142
H-NOX eucariótica para a qual a proteína do tipo selvagem não se liga ao O2
β2(1-217)	kox = 0,18	Sem complexo formado	Leu9, Cys76, Ile142
β2(1-217) I142Y		g	Leu9, Cys76, Tyr142
β1(1-194)	kox = 4,3	Sem complexo formado	Leu9, Cys78, 11e145

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β1(1- 194)I145Y	kox — 2,8	g	Leu9, Cys78, Tyr145
β1 (1-194)	kox ~ 10	g	Trp9, Cys78,
L9W-I145Y			Tyr145
β1 (1-385)	Estável e	Sem complexo	Leu9, Cys78,
		formado	Ile145
β1 (1-385)	kox — 0,72	koff — 2.69	Leu9, Cys78,
I145Y			Tyr145
β1 (1-385)			Leu9, Cys78,
I145H			His145
β1 (1-385)			Leu9, Tyr78,
C78Y			Ile145
Outra H-NOX prevista para	se ligar ao O2 como	a construção
do tipo selvagem
Dd H-	kox — 0,98	koff — 5,80	Phe9, Phe75,
NOX(728-899)			Tyr139
Dd Y 139L			Phe9, Phe75,
			Leu139
Cb H-NOX(1-	Construção	g	Trp9, Phe78,
175)	não estável h		Tyr140
Cb H-NOX(1-	Ligeiramente	g	Trp9, Phe78,
186)	mais estável i		Tyr140
Ca H-NOX(1-	Construção	g	Trp9, Phe78,
197)	não estável h		Tyr140
Ca H-NOX(1-	Ligeiramente	g	Trp9, Phe78,
183)	mais estável i		Tyr140
Ce GCY-35 (1-	Estável	Se liga ao O2 e	Phe9, Thr78,
252)			Tyr144
a A construção é estável à	oxidação (avaliada	pela taxa de
auto-oxidação, kox [h b] a 37°C) e/ou perda de	heme. b A

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94/150 atividade de ligação de O2 foi avaliada pela taxa de dissociação de O2 do heme a 20°C (s^-1) . ^c Após 24 horas a 37°C, ainda não há indicação de auto-oxidação. ^d Apenas uma pequena porção da proteína forma um complexo com O2; a taxa relatada representa a cinética para essa população. ^eA proteína se liga ao O2, mas a koff não foi determinada. ^f Embora relativamente estável, essa proteína se precipitava à medida que era oxidada, tornando difícil medir a kox. ^g Não aplicável em função da instabilidade ou da oxidação rápida. ^h “Construção não estável” significa que a proteína se oxida imediatamente sob as condições testadas. ⁱ “Ligeiramente mais estável” significa que a proteína se oxida ao longo de um período de minutos a horas, mas não permanece estável além de 24 horas sob as condições testadas.

A Tabela 7 ilustra a alteração da taxa de associação de O2 (kon) , a taxa de dissociação de O2 (koff) , a constante de dissociação de O2 (Kd) e a taxa de auto-oxidação (kox) em proteínas H-NOX pela introdução de uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 7 é combinada com outra mutação (por exemplo, outra mutação na Tabela 7 ou qualquer outra mutação aqui descrita) para alterar ainda mais a taxa de associação de O2, a taxa de dissociação de O2, a constante de dissociação de O2, a taxa de auto-oxidação ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente.

Tabela 7. Constantes de cinética de ligação de O2 para proteínas heme Fe¹¹ ligadas por histidil

Proteína	Kd a	kon b	koffc	k d kox	Ref,
Tt H-NOX	89, 7 ± 6,2	13,61 ±	1,22 ±	e	i

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		1,0	0,09
		10,4 ±	0,22 ±
Tt P115A	21,2 ± 2,1	1,1	0,01	e	j
			0,82 ±
Tt I5A	~80		0,03	0,7	j
			9,50 ±
Tt I5L	~1.000		0,64	0,6	j
			0,28 ±
Tt 15L-P115A	~30		0,01	0,6	j
		6, 02 ±	1,84 ±
Tt W9F	305 ± 31	0, 62	0,17	e	i
		15,7 ±
Tt Y140F	f	1,4	15,7 ± 9,8	0, 05	j
Tt Y140L	~2.000	Geminada	20,1 ± 2,0	0, 19	i
			5,03 ±
Tt Y140H	~500		0,69	0,87	j
Tt W9F-	~2.500		23,4 ± 3,7	0, 11	j
Y140H
	Nenhum	complexo	com O2
Tt W9F-Y140L		observado		0,12	i
Tt F78Y-	~150		1,48 ±	e	j
Y140F			0,33
Tt F78Y-	~80		0,83 ±	e	i
Y140L			0,17
		Muito
Tt W9F-N74A	Milimolar	lenta			j
		Muito	7,13 ±
Dd H-NOX	Milimolar	lenta	0,45	0,14	j
	Nenhum	complexo	com O2
Dd Y139L		observado			j

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β1 (1-385) I145Y	70.000,00	0,00004	2,69 ± 0,61	0,72	i
L2 F142Y	9.200 ± 3.000	0,40 ± 0,14	3,68 ± 0,71		i
Hs Hb beta	267	60	16		n
Hs Hb alfa	560	50	28		k
Sw Mb	880	17	15	0,006	k
Bj FixL	140.000	0, 14	20	2,7	L
HemAT-B	720	32	23	0,06	m
a Constante de dissociação a 20°C (nM); b Taxa de associação de O2 ao heme a 20°C (pM-1s-1) ; c Taxa de dissociação de O2 do heme a 20°C (s-1); d Taxa de auto- oxidação de heme (h-1) a 37°C; e Após 24 horas a 37°C, ainda não havia indicação de auto-oxidação; f Apenas uma pequena porção da proteína forma um complexo com O2, embora a cinética para essa população pudesse ser medida; i Boon, E.M. e cols. (junho de 2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1(1) : 53-59, j Dados não publicados; k Springer, B.A. e cols. (1994) “Family Physicians Key Partners in Preventing Suicide Among Youth”, Chem. Rev. 94: 699-714; l Gilles-Gonzalez e cols. (1994) “Heme-Based Sensors, Exemplified by the Kinase FixL, are a New Class of Heme Protein with Distinctive Ligand Binding and Autoxidation”, Biochemistry 33: 8.067-8.073. m Aono, S. e cols. (2002) “Resonance Raman and Ligand Binding Studies of the Oxygen-Sensing Signal Transducer Protein HemAT from Bacillus Subtilis”, J. Biol. Chem. 277: 13.528- 13.538. “Antonini, E. e cols. (1971), “Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands”, North-Hollano

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PublAmsterdam.

A Tabela 8 ilustra que a taxa de associação de O2, a taxa de dissociação de O2, o O2, a taxa de auto-oxidação, a reatividade ao NO e a estabilidade de complexos de Fe^II-O2 em proteínas H-NOX podem ser alterados pela introdução de uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 8 é combinada com outra mutação (por exemplo, outra mutação na Tabela 8 ou qualquer outra mutação aqui descrita) para alterar ainda mais a taxa de associação de O2, a taxa de dissociação de O2, o O2, a taxa de auto-oxidação, a reatividade ao NO ou a estabilidade dos complexos de Fe^II-O2 em uma proteína H-NOX. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a introdução de uma ou mais mutações adicionais, tais como aquelas aqui descritas, pode ser usada para alterar ainda mais esses valores.

Tabela 8. Taxa de associação de O2, taxa de dissociação de O2, O2, taxa de auto-oxidação, reatividade ao NO e estabilidade de complexos de Fe^II-O2 em proteínas H-NOX.

Proteína	kon a	kof b	kox c	Reatividade ao NO d	Estabilidade do complexo de FeII-O2
Hs Hb	23	11	0,006	<0,001 s (~7.000 s-1)c	Oxida-se o/n no ar em temperatura ambiente, estável a 4°C no ar, anaeróbica estável
Tt H-NOX	13, 6	1,22	Muito lenta	0,54 ± 0, 07 s-1	Sempre estável
Tt Y140H	~10	5,03	0,87	1,7 : 0,4 s-1	Oxida-se o/n no ar em temperatura

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					ambiente, estável a 4°C no ar, anaeróbica estável
β1 (1-385) I145Y	~105	2,69	0,72	Lenta para FeII-NO	Oxida-se o/n no ar em temperatura ambiente, estável a 4°C no ar, anaeróbica estável
a Taxa de O2 associação ao heme a 20°C (pM-1 s-1) ; b Taxa de dissociação de O2 do heme a 20°C (s-1); c Taxa de auto- oxidação de heme (h-1) a 37°C; d Para determinação de reatividades ao NO: proteínas purificadas (Tt WT H-NOX, Tt V140H H-NOX, hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb)) foram preparadas a 2 μΜ em Tampão A, e óxido nítrico (NO) foi preparado a 200 μΜ em Tampão A (Tampão A: 50 mM Hepes, pH 7,5, 50 mM NaCl) a 20°C. Com o uso de espectroscopia de fluxo interrompido, a proteína foi rapidamente misturada com NO em uma proporção 1:1 com um tempo de integração de 0,00125 segundo. Os comprimentos de onda de mudança máxima foram ajustados para uma exponencial simples, medindo basicamente a etapa de taxa limitante da oxidação por NO. Os produtos finais da reação foram férrico-NO para as proteínas H-NOX e férrico-água para Hs Hb. e Para Hs Hb, a reação da proteína com NO foi tão rápida que a reação estava completa dentro do tempo morto do experimento (0,001 segundo). A reatividade ao NO para a hemoglobina é de aproximadamente 7.000 s-1 a 20°C, com base em Eich, R.F. e cols. (1996) “Mechanism of NO-Induced Oxidation of Myoglobin and Hemoglobin”, Biochemistry 35: 6.976-6.983.

A Tabela 9 demonstra que a constante de dissociação

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99/150 para ligação de O2 pode ser alterada significativamente por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. Os valores da Kd cinética para essas proteínas H-NOX exemplares variam de 21,20 nM a 1.000.000,00 nM a 20°C. Se desejado, a constante de dissociação para ligação de O2 pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 9 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.

Tabela 9. Proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes e proteínas de referência dispostas pelo valor da constante de dissociação para ligação de O2

Proteína	Kd cinética (nM)	+	Kd calculada (nM)
Tt P115A	21,2	2,1
Tt N74H			27
Tt 15L-P115A			30
Tt N74A			32
Tt I5A			80
Tt F78Y-Y140L			80
Tt H-NOX His6			89
Tt H-NOX	89, 7	6, 2
Tt wt			90,
Tt F78Y-Y140F			150
Tt W 9			218
Tt R135Q His6			252
Hs Hb beta			267
Tt W9F	305	31
Tt W9H			456
Tt Y140H			500

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Hs Hb alfa			560
Tt W9N			573
Tt I75F-His6			713-773
HemAT-B			720
Sw Mb			880
Tt I5L			1.000
Tt L144F-His6			1.092-1.185
Tt Y140L			2.000
Tt W9F-Y140H			2.500
L2 F142Y	9.200	3.000
Bj FixL			140.000
Tt W9F-N74A			1.000.000
Dd H-NOX			1.000.000
β1(1-385) I145Y			1.000.000

A Tabela 10 demonstra que as taxas de dissociação para a ligação de O2 podem ser alteradas significativamente por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. As taxas de dissociação para essas proteínas H-NOX exemplares variam de 0,21 s^-1 a 23,4 s^-1 a 20°C. Se desejado, a taxa de dissociação para a ligação de O2 pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 10 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.

Table 10. Proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes e proteínas de referência dispostas pelo valor da taxa de dissociação para a ligação de O2

Proteína	koff (s-1)	±
Tt N74A	0,21	0, 004
Tt P115A	0,22	0, 01

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Tt 15L-P115A	0,28	0, 03
Tt N74E	0,38	0, 01
Tt N74H	0,44	0, 01
Tt I5A	0, 82	0, 03
Tt F78Y-Y140L	0, 83	0, 17
Tt H-NOX His6	1,2	0, 02
Tt H-NOX	1,22	0, 09
Tt F78Y-Y140F	1,48	0,33
LI F142Y	1,73
Tt W9F	1, 84	0, 17
β1(1-385) I145Y	2, 69	0, 61
Tt W9Y	3, 07	0,1
Tt R135Q His6	3,56	0, 08
L2 F142Y	3, 68	0,71
Tt Y140H	5, 03	0, 69
Tt W9H	6, 42	0, 11
Dd H-NOX	7, 13	0,45
Tt W9N	8, 09	0, 14
Tt 15L	9,5	0, 64
Tt I75F-His6	10,48	0, 12
Sw Mb	15
Tt Y140F	15, 7	9,8
Hs Hb beta	16
Tt L144F-His6	16, 06	0,21
B FixL	20
Tt Y140L	20, 1	2
HemAT-B	23
Tt W9F-Y140H	23,4	3,7
Hs Hb alfa	28

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102/150

A Tabela 11 demonstra que as taxas de associação para a ligação de O2 podem ser alteradas significativamente por mutação de um ou mais resíduos nas proteínas H-NOX. As taxas de associação para essas proteínas H-NOX exemplares variam de 60 pM^-1s^-1 a 0,14 pM^-1s^-1 a 20°C. Se desejado, a taxa de associação para a ligação de O2 pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 11 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito

Tabela 11. Proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes e proteínas de referência dispostas pelo valor da taxa de associação para a ligação de O2

Proteína	kon (pM-1s-1)	±
Hs Hb beta	60
Hs Hb alfa	50
HemAT-B	32
Sw Mb	17
Tt Y 140	15, 7	1,4
Tt H-NOX	13, 6	1
TtP115A	10,4	1,1
Tt W9F	6, 02	0, 62
L2 F142Y	0,4	0, 14
Bj FixL	0, 14
Tt W9F-N74A	muito lenta a
Dd H-NOX	muito lenta a
β1(1-385) I145Y	muito lenta a
a “Muito lenta” significa mais lenta do que
hemoglobina, por exemplo, aproximadamente uma a
duas ordens de magnitude mais lenta	do que

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103/150 hemoglobina .

A Tabela 12 ilustra o efeito de mutações de H-NOX exemplares sobre a ligação de O2 e NO. Cada número listado na Tabela 10 para a forma de Fe não ligada é para um pico único (que está listado entre as colunas β e a) . Quando o

O2 ou o NO se liga, esse pico único se divide em dois picos, β e a (que estão listados abaixo das colunas β e a, respectivamente) . Se desejado, a ligação de O2 ou NO pode

ainda ser alterada	por combinação de	qualquer	uma	das
mutações simples ou	duplas listadas na	Tabela 12	ou	por
10 introdução de uma	ou mais mutações	adicionais	em	uma
proteína H-NOX, como	aqui descrito.

Tabela 12: Posições ^a de pico do UV visível para alguns complexos de proteína heme FeII ligados por histidil

Proteína	Soret	β		a
Complexo de FeII:	não ligado
sGC	431		555
β1(1-385) I145Y	429		549
Tt H-NOX	431		565
Tt W9F-Y140L	430		560
Vc H-NOX	429		568
Np H-NOX	430		555
L2 H-NOX	428		557
L2 F142Y	428		557
Tt I75F-His6	431		569
Tt L144F-His6	433		564
Hb	430		555
Complexo de FeII	-NO
sGC	398	537		572
β1(1-385) I145Y	399/416	542		574

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Tt	H-NOX	420	547	575
Tt	W9F-Y140L	423		540	573
Vc	H-NOX	398		540	573
Np	H-NOX	416/400	543	576
L2	H-NOX	399/416	544	575
L2	F142Y	417		544	578
Tt	I75F-His6	418		545	574
Tt	L144F-His6	416		544	574
Hb		418		545	575
Complexo de Fe11	-O2
SGC		Nenhum	complexo	observado
β1(1-385) I145Y	416		541	575
Tt	H-NOX	416		556	591
Tt	W9F-Y140L		Nenhum	complexo	observado
Vc	H-NOX		Nenhum	complexo	observado
Np	H-NOX		Nenhum	complexo	observado
L2	H-NOX		Nenhum	complexo	observado
L2	F142Y	417		542	577
Tt	I75F-His6	416		552	589
Tt	L144F-His6	416		544	574
Hb		415		541	577
a nm (a 2 0° C)

A Tabela 13 contém posições de pico UV visível para alguns complexos de Fe (II), Fe (III), Fe (II)NO e Fe(II)O2. Quando uma hemoglobina ou proteína H-NOX é anaeróbica, ela possui um pico de Soret a ~431 nm, e está em um estado não ligado. Caso a proteína H-NOX não se ligue ao NO, então o pico de Soret não será alterado quando o NO for adicionado. Caso a proteína H-NOX se ligue ao NO e forme um complexo 6-coordenado ferroso-nitrosil, então seu pico de

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Soret será alterado entre 420 nm e 424 nm quando NO for adicionado. Se a proteína H-NOX. Caso a proteína H-NOX se ligue ao NO e forme um complexo de ferroso-nitrosil de 5 coordenadas, o pico de Soret irá mudar para ~399 nm. Se a proteína H-NOX não liga O2, então o pico de Soret não será alterado quando O2 for adicionado. Se a proteína H-NOX liga O2, então o pico de Soret será alterado entre 414 nm e 418 nm quando O2 for adicionado, que é a mesma alteração que ocorre na hemoglobina, indicativa de O2 ligado ao heme.

Picos de Soret para H-NOX (Fe(III)) oxidada podem ser relevantes para o estado da proteína H-NOX após estocagem iu uso. Se desejado, a ligação de O2 ou NO pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações simples ou duplas listadas na Tabela 13 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito.

Tabela 13. Posições possíveis do pico de UV visível para alguns complexos de Fe (II), Fe (III), Fe(II)-NO e Fe(II)O2.

Complexo	Proteína	Soret	β	α
Fe (II)	Tt wt	430	563
	Tt W9Y	430	569
	Tt N74A	433	558
	Tt N74H	431	561
	Tt N74A-Y140H	430	567
	Tt W9H	431	563
	Tt N74E	433	559
	Tt W9N	431	569
	Tt wt His6	430	565

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Complexo	Proteína	Soret	β a	α
Fe (III)	Tt wt	413	550	585
	Tt W9Y	409	N.A.
	Tt N74A	416	554	586
	Tt N74H	408	N.A.
	Tt N74A-Y140H	407	N.A.
	Tt W9H	407	N.A.
	Tt N74E	408	N.A.
	Tt W9N	408	N.A.
	Tt wt His6	413	550	586

^a N.A.” representa bandas α e β não atribuíveis em conseqüência de sinal baixo em comprimentos de onda mais longos.

Complexo	Proteína	Soret	β	α
Fe(II)-NO	Tt wt	420	550	578
	Tt W9Y	420	552	576
	Tt N74A	421	572
	Tt N74H	424	562
	Tt N74A-Y140H	421	549	576
	Tt W9H	420	548	575
	Tt N74E	422	544	571
	Tt W9N	421	541	576
	Tt wt His6	420	547	576
Complexo	Proteína	Soret	β	α
Fe(II) -O2	Tt wt	416	556	591
	Tt W9Y	416	555	590
	Tt N7 4A	418	553	589
	Tt N74H	418	553	589

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107/150

	Tt N74A-Y140H	414	555	584
	Tt W9H	418	556	589
	Tt N74E	417	555	587
	Tt W9N	416	588	553
	Tt wt His6	416	556	591

A Tabela 14 contém taxas de auto-oxidação para proteínas H-NOX de T. tengcongensís exemplares. Se desejado, a taxa de auto-oxidação pode ainda ser alterada por combinação de qualquer uma das mutações listadas na

Tabela 14 ou por introdução de uma ou mais mutações adicionais em uma proteína H-NOX, como aqui descrito. Os valores médios de 2 nm e 3 nm na Tabela 14 referem-se a uma mudança no pico de Soret de UV-Vis por 2 a 3 nm ao longo do período de tempo da observação; essa mudança extremamente pequena pode ser causada por auto-oxidação.

Tabela 14. Taxas de auto-oxidação para proteínas H-NOX de T. tengcongensis (Tt)

Proteína	Taxa de auto-oxidação (25°C, hora-1)a
Tt wt	Estável
Tt W9Y	Estável
Tt N74A	Estável
Tt N74H	Estável a 4°C, muito lenta em temperatura ambiente (2 nm)
Tt W9H	Estável
Tt N74E	Muito lenta a 4°C (2 nm), lenta em temperatura ambiente
Tt W9N	Estável a 4°C, muito lenta em temperatura ambiente (3 nm)
Tt wt His6	Estável

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108/150

Tt I75F-His6	Estável
Tt L144F-His6	Estável

^a Estável representa ausência de oxidação de heme após pelo menos 24 horas.

Rt repersenta temperatura ambiente

Ácidos nucléicos de H-NOX

A invenção também apresenta ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas. Como aqui usado, o termo ácido nucléico refere-se a dois ou mais desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos na forma de fita simples ou dupla e, a menos que limitado de forma diferente, engloba análogos conhecidos de nucleotídeos de ocorrência natural que hibridizam para os ácidos nucléicos de forma similar aos nucleotídeos modalidades, recombinante natureza. Em algumas é um ácido nucléico que ocorrem na o ácido nucléico

O termo ácido nucléico recombinante significa um ácido nucléico de interesse que é livre de um ou mais ácidos nucléicos (por exemplo, genes), os quais, no genoma que ocorre na natureza do organismo do qual o ácido nucléico de interesse é derivado, flanqueia o ácido nucléico de interesse. Em algumas modalidades, um ácido nucléico de H-NOX está ligado operacionalmente a outro ácido nucléico que codifica toda ou uma porção de outra proteína, de tal forma que o ácido nucléico recombinante codifique uma proteína de fusão que inclui uma proteína HNOX (por exemplo, um domínio de H-NOX, com ou sem outro domínio de uma proteína H-NOX) e toda ou parte de outra proteína, por exemplo, albumina sérica humana. Portanto, o termo inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é de 21/11/2017, pág. 117/178

109/150 incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus que se replica de forma autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA, um fragmento de DNA genômico ou um fragmento de cDNA produzido por PCR ou digestão por endonuclease de restrição) independente de outras seqüências.

A invenção também apresenta vetores com um ou mais ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das proteínas H-NOX mutantes que são aqui descritas. Como aqui usado, o termo vetor significa uma construção que é capaz de liberação e, opcionalmente expressar, um ou mais ácidos nucléicos de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, sem limitação, plasmídeos, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA, cosmídeos e vetores de fago. Em algumas modalidades, o vetor contém um ácido nucléico sob o controle de uma seqüência de controle de expressão. Uma seqüência de controle de expressão significa uma seqüência de ácidos nucléicos que dirige a transcrição de um ácido nucléico de interesse. Uma seqüência de controle de expressão pode ser um promotor, por exemplo, um promotor constitutivo ou um promotor indutível, ou um intensificador. A seqüência de controle de expressão está ligada operacionalmente ao segmento de ácido nucléico a ser transcrito.

Em modalidades específicas, o ácido nucléico inclui um segmento ou toda a seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um dos ácidos nucléicos mostrados nas FIGS. 2-4D ou 8A-8DD. Em algumas modalidades, o ácido nucléico inclui pelo menos cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, de 21/11/2017, pág. 118/178

110/150

700, 800 ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucléico de H-NOX, e contém uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações), comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. Em várias modalidades, um ácido nucléico de H-NOX mutante contém menos do que cerca de 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 mutações, comparado com o ácido nucléico de H-NOX do qual foi derivado. A invenção também apresenta variantes degeneradas de qualquer ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante.

A invenção também inclui uma célula ou uma população de células que contêm pelo menos um ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante aqui descrita. Células exemplares incluem células de insetos, plantas, leveduras, bacterianas e mamíferas. Essas células são úteis para a produção de proteínas H-NOX mutantes com a utilização de métodos padronizados como, por exemplo, aqueles aqui descritos.

Formulações de proteínas H-NOX

Qualquer proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante aqui descrita pode ser usada para a formulação de composições farmacêuticas ou não farmacêuticas. Como discutido com mais detalhe anteriormente, essas formulações são úteis em diversas aplicações terapêuticas e industriais.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui uma ou mais das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes (por exemplo, qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes aqui descritas) e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em várias modalidades, a de 21/11/2017, pág. 119/178

111/150 proteína H-NOX é uma proteína isolada ou purificada. O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” significa qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e não provoque uma resposta imune inaceitável (por exemplo, uma alergia grave ou um choque anafilático) à luz dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica. Exemplos incluem, sem limitação, qualquer um dos veículos farmacêuticos padronizados como, por exemplo, soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões como, por exemplo, emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umidificantes. Um diluente exemplar para administração em aerossol ou parenteral é a solução salina tamponada com fosfato ou solução salina normal (0,9%). Composições que compreendem esses veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (veja, por exemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18^a edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e “Remington, The Science and Practice of Pharmacy”, 20a Ed. Mack Publishing, 2000, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação às formulações).

Embora qualquer veículo adequado conhecido por aqueles habilitados na técnica possa ser empregado nas composições farmacêuticas dessa invenção, o tipo de veículo irá variar, dependendo do modo de administração. As composições podem ser formuladas por qualquer meio de administração adequado, incluindo, por exemplo, administração intravenosa, intraarterial, intravesicular, por inalação, intraperitoneal, intrapulmonar, intramuscular, subcutânea, intratraqueal, de 21/11/2017, pág. 120/178

112/150 transmucosa, intra-ocular, intratecal ou transdérmica. Para administração parenteral, por exemplo, injeção subcutânea, o veículo pode incluir, por exemplo, água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode ser empregado qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose ou carbonato de magnésio. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, polilactato poliglicolato) também podem ser usadas como veículos.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas ou não farmacêuticas incluem um tampão (por exemplo, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato etc.), um carboidrato (por exemplo, glicose, manose, sacarose, dextrana etc.), um antioxidante, um agente quelante (por exemplo, EDTA, glutationa etc.), um conservante, outro composto útil para ligação e/ou transporte de oxigênio, um ingrediente inativo (por exemplo, um estabilizante, um enchimento etc.), ou combinações de dois ou mais dos citados anteriormente. Em algumas modalidades, a composição é formulada como um liofilizado. As proteínas H-NOX também podem ser encapsuladas dentro de lipossomos ou nanopartículas com a utilização de tecnologia bem conhecida. Outras formulações exemplares que podem ser usadas para proteínas H-NOX são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. N^os 6.974.795 e 6.432.918, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente com relação às formulações de proteínas.

de 21/11/2017, pág. 121/178

113/150

As composições aqui descritas podem ser administradas como parte de uma formulação de liberação sustentada (por exemplo, uma formulação como uma cápsula ou esponja que produz a liberação lenta do composto após administração). Essas formulações podem geralmente ser preparadas com a utilização de tecnologia bem conhecida, e administradas, por exemplo, por via oral, retal ou implantação subcutânea, ou por implantação no local-alvo desejado. Formulações de liberação sustentada podem conter uma proteína H-NOX dispersa em uma matriz de veículo e/ou contida dentro de um reservatório, circundada por uma membrana que controla a taxa de liberação. Veículos para uso com estas formulações são biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis. Em algumas modalidades, a formulação fornece um nível relativamente constante de liberação de proteína H-NOX. A quantidade de proteína H-NOX contida dentro de uma formulação de liberação sustentada depende do local de implantação, da taxa e da duração da liberação esperadas, e da natureza da condição a ser tratada ou evitada.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém uma quantidade eficaz de uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante. O termo “quantidade eficaz” significa uma quantidade de uma ou mais proteínas aqui descritas que, em combinação com seus parâmetros de eficácia e toxicidade, deve ser eficaz em certa forma terapêutica com base no conhecimento do profissional especialista. Como é do conhecimento da técnica, uma quantidade eficaz pode ser em uma ou mais doses. Como faz parte do contexto clínico, uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica pode ou não ser obtida em conjunto com outro fármaco, composto ou de 21/11/2017, pág. 122/178

114/150 composição farmacêutica. Dessa forma, uma quantidade eficaz pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável ou benéfico puder ser ou for obtido.

Uma dose exemplar de hemoglobina como substituto do sangue é de cerca de 10 mg a cerca de 5 gramas ou mais de hemoglobina extracelular por quilograma de peso corporal do paciente. Doses similares de proteínas H-NOX podem ser usadas para a liberação de NO. Dessa forma, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma proteína H-NOX para administração a um ser humano é entre poucas gramas a até mais de cerca de 350 gramas. Outras doses exemplares de uma proteína H-NOX incluem cerca de 4,4, 5, 10 ou 13 g/dl (em que g/dl é a concentração da solução de proteína H-NOX, antes da infusão na circulação) em uma taxa de infusão apropriada como cerca de 0,5 ml/min (veja, por exemplo, Winslow, R. Capítulo 12 em “Blood Substitutes”). Em algumas modalidades, uma dose de menos que 10 mg de proteína H-NOX é usada para vasodilatação temporária. Será observado que o teor da unidade de ingredientes ativos contido em uma dose individual de cada forma de dosagem não precisa, por si mesmo, constituir uma quantidade eficaz, na medida que a quantidade eficaz necessária poderia ser obtida pelo efeito combinado de várias administrações. A seleção da quantidade de uma proteína H-NOX a ser incluída em uma composição farmacêutica depende da forma de dosagem utilizada, da condição tratada e do objetivo específico a ser obtido de acordo com a determinação daqueles habilitados na técnica.

de 21/11/2017, pág. 123/178

115/150 operacional como um sangüíneo de mamífero

Composições exemplares incluem proteínas H-NOX recombinantes projetadas geneticamente, que podem ser isoladas ou purificadas, que compreendem uma ou mais mutações que coletivamente transmitem ligação de ligante de O2 ou NO alterada em relação à proteína H-NOX do tipo selvagem correspondente, e transportador de gás NO fisiologicamente compatível. Por exemplo, as proteínas HNOX mutantes aqui descritas.

A invenção também fornece transportadores de NO que compreendem ou consistem basicamente em uma ou mais das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes. Tampões e outros ingredientes adequados à formulação de proteínas (como proteínas liberadas ao sangue ou sistema gastrointestinal) são conhecidos na técnica.

Para reduzir ou evitar uma resposta imune em indivíduos humanos que recebem a administração de uma composição farmacêutica, podem ser usadas proteínas H-NOX humanas (proteínas humanas do tipo selvagem ou proteínas humanas nas quais uma ou mais mutações foram introduzidas) ou outras proteínas H-NOX não antigênicas (por exemplo, proteínas H-NOX de mamíferos). Para reduzir ou eliminar a imunogenicidade de proteínas H-NOX derivadas de outras fontes não humanas, os aminoácidos em uma proteína H-NOX podem ser mutados para os aminoácidos correspondentes em uma H-NOX humana. Por exemplo, um ou mais aminoácidos na superfície da estrutura terciária de uma proteína H-NOX não humana podem ser mutados para o aminoácido correspondente em uma proteína H-NOX humana.

de 21/11/2017, pág. 124/178

116/150

Aplicações terapêuticas das proteínas H-NOX

Qualquer uma das proteínas H-NOX do tipo selvagem ou mutantes (por exemplo, proteínas H-NOX isoladas ou purificadas) ou composições farmacêuticas aqui descritas podem ser usadas em aplicações terapêuticas.

Proteínas H-NOX particulares podem ser selecionadas para estas aplicações com base na constante de dissociação de NO, constante de dissociação de O2, koff de NO, koff de O2, reatividade ao NO, estabilidade ao NO, taxa de autooxidação, no tempo de retenção plasmática desejado, meiavida ou qualquer combinação de dois ou mais dos citados anteriormente para a indicação específica tratada. As proteínas H-NOX podem ser usadas para tratar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica. As indicações de exemplo incluem doenças da deficiência funcional de NO, como quando um vasodilatador ou um transportador de NO é indicado, incluindo condições exacerbadas por hipertensão crônica, como insuficiência cardíaca, insuficiência renal, e AVC. Em várias modalidades, a condição tratada é uam condição cardiovascular (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca), hipertensão, uma condição vasoconstrictora (por exemplo, AVC), disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. Para o tratamento de constipação ou obstrução intestinal, proteínas H-NOX podem ser usadas para liberar NO para tratar um déficit de controle de esfíncter, assim relaxando a musculatura lisa. Por exemplo, proteínas H-NOX que funcionam no sistema digestivo podem relaxar a musculatura lisa do íleo uma vez que as proteínas H-NOX passam através do sistema digestivo.

de 21/11/2017, pág. 125/178

117/150

Os métodos e composições são aplicáveis tanto a situações agudas (fornecendo NO rápido aos tecidos ou um local específico, por exemplo, infarto agudo do miocárdio ou AVC) quanto crônicas (por exemplo, hipertensão crônica ou recuperação pós aguda de infarto do miocárdio ou AVC).

Em várias modalidades, a invenção apresenta um método de liberação de NO a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, como um primata (por exemplo, um ser humano, um macaco, um gorila, um chipanzé, um lêmure etc.), um bovino,

um eqüino, um	suíno, um	canino	ou	um felino)	pela
administração a	um indivíduo que	dela	necessita de	uma
proteína H-NOX	do tipo	selvagem	ou	mutante em	uma
quantidade suficiente para	liberar	NO	ao indivíduo	. Em
algumas modalidades, a	invenção	fornece métodos	de

transporte ou liberação de gás sangüíneo a um indivíduo como um mamífero, que compreendem a etapa de liberação ao sangue do indivíduo (por exemplo, um mamífero) de uma ou mais das composições de H-NOX. Métodos para a liberação de proteínas ao sangue, sistema digestivo ou aos tecidos (por exemplo, sangue ou tecidos de mamíferos) são conhecidos na técnica. Em várias modalidades, a proteína H-NOX é uma apoproteína que é capaz de se ligar ao heme, ou é uma holoproteína com heme ligado. A proteína H-NOX pode ter ou não heme ligado, antes da administração da proteína H-NOX ao indivíduo. Em algumas modalidades, NO é ligado à proteína H-NOX, antes de ser liberada ao indivíduo. Em outras modalidades, NO não está ligado à proteína H-NOX antes da administração da proteína ao indivíduo, e a proteína H-NOX transporta NO de uma localização no indivíduo para outra localização no indivíduo. Por exemplo, de 21/11/2017, pág. 126/178

118/150 em modalidades particulares, proteínas H-NOX ligam NO na corrente sangüínea e apenas o liberam quando as concentrações de NO estão muito baixas (como em locais de vasoconstricção). Essa liberação direcionada de NO pode produzir menos efeitos colaterais que os vasodilatadores convencionais que liberam NO independente da concentração local de NO e assim funcionam sistemicamente, com efeitos colaterais como dores de cabeça e formigamento periférico.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para o tratamento de qualquer indivíduo. Para uso nesta especificação, a menos que claramente indicado de forma diferente, “um indivíduo”, como aqui usado, significa um mamífero, incluindo, sem limitação, um primata (por exemplo, um ser humano, macaco, gorila, chimpanzé, lêmure etc.), um bovino, um eqüino, um suíno, um canino e um felino. Dessa forma, a invenção encontra utilidade tanto na medicina humana quanto no contexto veterinário, incluindo uso em animais agrícolas e animais domésticos de estimação. O indivíduo pode ter sido diagnosticado, ser suspeito de ter ou está em risco de desenvolver uma indicação como uma condição cardiovascular (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca), hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC), uma condição vasoconstritora (por exemplo, AVC), uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. O indivíduo pode exibir um ou mais sintomas associados à indicação. O indivíduo pode estar geneticamente ou de algum outro modo predisposto ao desenvolvimento desta condição.

Como aqui usado, o termo “que necessita deste” inclui de 21/11/2017, pág. 127/178

119/150 indivíduos que possuem uma condição ou doença (por exemplo, uma condição cardiovascular como infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão como insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC, uma condição vasoconstritora como AVC, uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal ou estão “em risco” para a condição ou doença. Como aqui usado, o termo um indivíduo “em risco” é um indivíduo que está em risco para o desenvolvimento de uma condição como uma doença cardiovascular (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca) , hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC), uma condição vasoconstrictora (por exemplo, AVC), uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. O indivíduo pode exibir um ou mais sintomas associados à indicação. Um indivíduo “em risco” pode ter ou não uma doença ou condição detectável, e pode ter ou não exibido doença detectável antes dos métodos de tratamento aqui descritos. “Em risco” representa que um indivíduo possui um ou mais dos denominados fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que estão correlacionados com o desenvolvimento de uma doença ou condição, e são conhecidos na técnica. Um indivíduo que possui um ou mais desses fatores de risco possui uma probabilidade maior para o desenvolvimento da doença ou condição do que um indivíduo sem esses fatores de riscos. Esses fatores de risco incluem, sem limitação, idade, sexo, raça, dieta, história de doença prévia, presença de doença precursora, fatores genéticos (ou seja, hereditários) de 21/11/2017, pág. 128/178

120/150 considerações e exposição ambiental.

Esses métodos podem ser usados para tratar ou retardar qualquer condição para a qual a liberação de NO seja benéfica. Por tratamento ou “que trata” significa uma abordagem para a obtenção de um resultado benéfico ou desejado, incluindo resultados clínicos. Para as finalidades dessa invenção, resultados benéficos ou desejados incluem, sem limitação, o alívio dos sintomas associados a uma condição (como, sem limitação, uma condição cardiovascular, como infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão como insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC, uma condição vasoconstritora como AVC, uma deficiência funcional de NO, disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal, diminuição da extensão dos sintomas associados a uma condição ou prevenção de uma piora dos sintomas associados a uma condição. Em algumas modalidades, o tratamento com uma ou mais proteínas aqui reveladas é acompanhado por ausência ou redução dos efeitos colaterais em relação aos que estão associados às terapias atualmente disponíveis.

Como aqui usado, o termo retardo do desenvolvimento de uma doença ou condição significa adiar, impedir, tornar mais lento, retardar, estabilizar e/ou postergar o desenvolvimento da doença ou condição, como uma doença cardiovascular, (por exemplo, infarto do miocárdio ou cirurgia cardíaca), hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão (por exemplo, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, ou AVC), uma condição vasoconstrictora (por exemplo, AVC), uma deficiência funcional de NO, de 21/11/2017, pág. 129/178

121/150 disfunção erétil, constipação, ou obstrução intestinal. Esse retardo pode ser de durações de tempo variáveis, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo tratado. Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, um retardo suficiente ou significativo pode, na verdade, englobar a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença ou condição. Por exemplo, o método pode reduzir a probabilidade do desenvolvimento da doença em certo intervalo de tempo e/ou reduzir a extensão da doença em certo intervalo de tempo, quando comparado com a não utilização do método. Em algumas modalidades, essas comparações se baseiam em estudos clínicos com a utilização de um número estatisticamente significativo de indivíduos. O desenvolvimento da doença pode ser detectável com a utilização de técnicas clínicas padronizadas. O desenvolvimento também se refere à progressão da doença que pode ser inicialmente não detectável, e inclui ocorrência, recorrência e surgimento.

Em algumas modalidades, para a liberação direta de uma proteína H-NOX com NO ligado a um local específico no corpo (por exemplo, um tecido, órgão), a koff para NO é mais importante do que o valor de Kd, pois o NO já está ligado à proteína (o que torna o kon menos importante) , e o NO precisa ser liberado em um local específico (ou próximo a ele) no corpo (em uma taxa influenciada pela koff). Em algumas modalidades, para o tratamento de condições agudas, a proteína H-NOX tem uma koff, k1, ou k2 relativamente altas para NO (como pelo menos cerca de 0,05 s^-1 ou 1,0 s^-1) de modo que a vasodilatação ocorra rapidamente. Em algumas modalidades para administração sistêmica, a proteína H-NOX de 21/11/2017, pág. 130/178

122/150 tem uma koff, k1, ou k2 para NO relativamente baixa (como menos que cerca de 0,05 s^-1, 0,01 s^-1, ou 0,001 s^-1) de modo que NO não seja liberado até que a proteína H-NOX atinja um local de caixa concentração de NO (por exemplo, um local vasoconstrito).

As proteínas H-NOX também podem ser usadas para exames de imagem. Em particular, imagens ópticas (por exemplo, tomografia de coerência óptica; veja, por exemplo, Villard,

J.W. (2002), “Use of a Blood Substitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickening with Optical Coherence Tomography”, Circulation 105: 1.8431.849, que é incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à tomografia de coerência óptica) são ofuscadas por eritrócitos. A perfusão com uma solução de H-NOX permite imagens mais nítidas da circulação e das paredes dos vasos, pois a proteína H-NOX é bem menor do que os eritrócitos.

As proteínas H-NOX e as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas a um indivíduo por qualquer meio convencional como, por exemplo, por administração oral, tópica, intra-ocular, intratecal, intrapulmonar, intratraqueal, ou por aerossol; por adsorção transdérmica ou por membrana mucosa; ou por injeção (por exemplo, por injeção subcutânea, intravenosa, intraarterial, intravesicular ou intramuscular). As proteínas HNOX também podem ser incluídas em soluções parenterais de grande volume para administração ao sangue. Em modalidades exemplares, a proteína H-NOX é administrada no sangue (por exemplo, administração a um vaso sangüíneo como, por exemplo, uma veia, uma artéria ou um capilar) do indivíduo.

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Em algumas modalidades, é usada uma formulação de liberação contínua sustentada da composição. A administração de uma proteína H-NOX pode ocorrer, por exemplo, por um período de segundos a horas, dependendo da finalidade da administração. Para condições agudas, uma duração de tempo de administração é tão rápida quanto possível. Outros períodos de tempo exemplares incluem cerca de 10, 20, 30, 40, 60, 90 ou 120 minutos. Taxas de infusão exemplares para soluções de H-NOX são de cerca de 30 ml/hora a cerca de 13.260 ml/hora como, como cerca de 100 ml/hora a cerca de 3.000 ml/hora. Uma dose total exemplar de proteína H-NOX é de cerca de 900 mg/kg administrada ao longo de 20 minutos a 13.260 ml/hora. Uma dose total exemplar de proteína H-NOX para um suíno é de cerca de 18,9 gramas.

Freqüências de dosagem exemplares incluem, sem limitação, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 vezes (ou seja, diariamente) por semana. Em algumas modalidades, uma proteína H-NOX é administrada pelo menos 2, 3, 4 ou 6 vezes ao dia. A proteína H-NOX pode ser administrada, por exemplo, ao longo de um período de poucos dias ou semanas. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX é administrada por um período mais longo como, por exemplo, poucos meses ou anos. A freqüência de dosagem da composição pode ser ajustada ao longo do período do tratamento, com base na avaliação do médico responsável pela administração.

Como observado anteriormente, a seleção de quantidades de dosagem para as proteínas H-NOX depende da forma de dosagem utilizada, da freqüência e do número de administrações, da condição tratada e da finalidade de 21/11/2017, pág. 132/178

124/150 específica a ser obtida de acordo com a determinação daqueles habilitados na técnica. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma proteína H-NOX para administração a seres humanos é entre poucas gramas a mais de 350 gramas.

Em algumas modalidades, duas ou mais proteínas H-NOX diferentes são administradas simultânea, seqüencial ou concomitantemente. Em algumas modalidades, outro composto ou terapia útil para a liberação de NO é administrado simultânea, seqüencial ou concomitantemente à administração de uma ou mais proteínas H-NOX.

Aplicações industriais das proteínas H-NOX

As proteínas H-NOX e composições aqui descritas também podem ser usadas para diversas aplicações in vitro ou industriais (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.455.67 6, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, particularmente com relação às aplicações in vitro ou industriais) . Proteínas H-NOX específicas podem ser selecionadas para essas aplicações com base na constante de dissociação de NO, constante de dissociação de O2, koff de NO, koff de O2, reatividade de NO, estabilidade de NO, taxa de auto-oxidação, meia-vida, ou qualquer combinação de dois ou mais das citadas anteriormente para a aplicação específica. Em várias modalidades de aplicações industriais, a proteína H-NOX é uma apoproteína que é capaz de se ligar ao heme, ou é uma holoproteína com heme ligado.

As proteínas H-NOX podem ser usadas para adicionar NO a soluções para as quais o NO é desejável. Em modalidades que usam biorreatores que requerem fermentação anaeróbica, proteínas H-NOX são usadas para liberar NO para as células.

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Por exemplo, a liberação de NO para mitocôndria pode limitar a fosforilação oxidativa e aumentar o metabolismo através da via de lactato. A proteína H-NOX em Clostridium acetobutylicum, que é cultivado sob fermentação anaeróbica como um gerador de biocombustível, podem servir naturalmente a essa função. Além disso, as proteínas H-NOX podem ser usadas para remover NO de soluções que requerem a remoção de NO. Por exemplo, proteínas H-NOX podem ser usadas para absorver ou remover NO em bio-reatores quando NO é um inibidor de proliferação celular e/ou função mitocondrial. A remoção de NO pode melhorar a função mitocondrial, limitar a apoptose, aumentar a produtividade por célula, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores.

Kits com proteínas H-NOX

Também são fornecidos artigos manufaturados e kits que incluem qualquer uma das proteínas H-NOX aqui descritas e uma embalagem adequada. Em algumas modalidades, a invenção inclui um kit com: (i) uma proteína H-NOX (por exemplo, uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante aqui descrita, ou formulações desta, como aqui descritas) e (ii) instruções para utilização do kit para a liberação de NO a um indivíduo. Em várias modalidades, a invenção apresenta um kit com: (i) uma proteína H-NOX (por exemplo, uma proteína H-NOX do tipo selvagem ou mutante aqui descrita, ou formulações desta, como aqui descritas) e (ii) instruções para utilização do kit para qualquer um dos usos industriais aqui descritos (por exemplo, a adição de NO a uma solução ou remoção de NO de uma solução).

Embalagens adequadas às composições aqui descritas são de 21/11/2017, pág. 134/178

126/150 conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, frascos (por exemplo, frascos lacrados), vasos, ampolas, garrafas, jarras, embalagens flexíveis (por exemplo, bolsas Mylar ou plásticas), e semelhantes. Esses artigos manufaturados podem ainda ser esterilizados e/ou lacrados. Também são fornecidas formas de dosagem unitária que compreendem as composições aqui descritas. Essas formas de dosagem unitária podem ser armazenadas em uma embalagem adequada em dosagens unitárias únicas ou múltiplas, e também podem ainda ser esterilizadas e lacradas. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções que possam ser lidas por máquinas (por exemplo, instruções fornecidas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis. As instruções relacionadas ao uso de proteínas H-NOX geralmente incluem informações sobre a dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento ou uso industrial desejado. O kit pode ainda compreender uma descrição da seleção de um indivíduo adequado ou tratamento.

Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidoses) ou doses subunitárias. Por exemplo, também podem ser fornecidos kits que contêm dosagens suficientes de proteínas H-NOX aqui reveladas para fornecer tratamento eficaz para um indivíduo por um período de tempo prolongado como, por exemplo, cerca de uma semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, ou mais. Os kits também podem incluir doses de 21/11/2017, pág. 135/178

127/150 unitárias múltiplas de proteínas H-NOX e instruções para uso, e embaladas em quantidades suficientes para armazenamento e uso em farmácias, por exemplo, farmácias hospitalares e farmácias de manipulação. Em algumas modalidades, o kit inclui uma composição seca (por exemplo, liofilizada) que pode ser reconstituída, re-suspensa ou rehidratada para formar geralmente uma suspensão aquosa estável de proteína H-NOX.

Métodos exemplares para a produção de proteínas H-NOX

A presente invenção também fornece métodos para a produção de qualquer uma das proteínas H-NOX mutantes aqui descritas. Em algumas modalidades, o método envolve o cultivo de uma célula que possui um ácido nucléico que codifica uma proteína H-NOX mutante sob condições adequadas à produção da proteína H-NOX mutante. Em várias modalidades, a H-NOX mutante também é purificada (por exemplo, purificação da proteína H-NOX das células ou do meio de cultura).

Como observado anteriormente, as seqüências de várias proteínas H-NOX do tipo selvagem e de ácidos nucléicos são conhecidas e podem ser utilizadas para a geração de proteínas H-NOX mutantes e ácidos nucléicos da presente invenção. Técnicas para a mutação, expressão e purificação de proteínas H-NOX recombinantes foram descritas, por exemplo, por Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1: 53-59 e Karow, D.S. e cols. (10 de agosto de 2004), “Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Herne Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, de 21/11/2017, pág. 136/178

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Biochemistry 43(31): 10.203-10.211, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à mutação, expressão e purificação de proteínas HNOX recombinantes. Essas técnicas ou outras técnicas padronizadas podem ser usadas para a geração de proteína HNOX mutante.

Em particular, as proteínas H-NOX mutantes aqui descritas podem ser geradas por diversos métodos que são conhecidos na técnica. A mutação pode ocorrer no nível de aminoácido por modificação química de um aminoácido ou no nível de códon por alteração da seqüência de nucleotídeos que codifica certo aminoácido. A substituição de um aminoácido em certa posição em uma proteína pode ser obtida por alteração do códon que codifica aquele aminoácido. Isso pode ser obtido por mutagênese sítio-dirigida, por exemplo: (i) a técnica de Amersham (kit de mutagênese Amersham, Amersham, Inc., Cníveland, Ohio) com base nos métodos de Taylor, J.W. e cols. (20 de dezembro de 1985), “The Use of Phosphorothioate-Modified DNA in Restriction Enzyme Reactions to Prepare Nicked DNA”, Nucleic Acids Res. 13(24): 8.749-8.764; Taylor, J.W. e cols. (20 de dezembro de 1985) , “The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High Frequency Using Phosphorothioate-Modified DNA”, Nucleic Acids Res. 13(24) : 8.765-8.785; Nakamaye,

K.L. e cols. (22 de dezembro de 1986), “Inhibition of Restriction Endonuclease Nci I Cleavage by Phosphorothioate Groups and its Application to Oligonucleotide-Directed Mutagenesis”, Nucleic Acids Res. l4(24): 9.679-9.698; e

Dente e cols. (1985), em “DNA Cloning”, Glover, Ed., IRL Press, páginas 791-802, (ii) o kit Promega (Promega Inc., de 21/11/2017, pág. 137/178

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Madison, Wis.), ou (iii) o kit Biorad (Biorad Inc., Richmond, Calif.), com base nos métodos de Kunkel, T.A. (janeiro de 1985), “Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(2): 488-492; Kunkel, T.A. (1987), “Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic, Selection”, Methods Enzymol. 154: 367-382; Kunkel, Patente U.S. N° 4.873.192, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à mutagênese de proteínas. A mutagênese também pode ser obtida por outros meios comercialmente disponíveis ou nãocomerciais, por exemplo, aqueles que utilizam mutagênese sítio-dirigido com oligonucleotídeos mutantes.

A mutagênese sítio-dirigido também pode ser obtida com o uso de mutagênese baseada em PCR, por exemplo, aquela descrita em Zhengbin e cols. (1992), páginas 205-207 em “PCR Methods and Applications”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York; Jones, D.H. e cols. (fevereiro 1990), “A Rapid Method For Site-Specific Mutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase Chain Reaction to Generate Recombinant Circles”, Biotechniques 8(2): 178-183; Jones, D. Fl. e cols. (janeiro 1991), “A Rapid Method For Recombination And Site-Specific Mutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction”, Biotechniques 10(1) : 62-66, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente com relação à mutagênese de proteínas. A mutagênese sítio-dirigida também pode ser obtida com o uso de mutagênese por cassete com técnicas que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

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Um ácido nucléico de H-NOX mutante pode ser incorporado em um vetor, como um vetor de expressão, com o uso de técnicas padronizadas. Por exemplo, podem ser usadas enzimas de restrição para clivar o ácido nucléico de H-NOX mutante e o vetor. A seguir, as extremidades compatíveis do ácido nucléico clivado de H-NOX mutante e o vetor clivado podem ser ligados. O vetor resultante pode ser inserido em uma célula (por exemplo, uma célula de inseto, uma célula de planta, uma célula de levedura ou uma célula bacteriana) com o uso de técnicas padronizadas (por exemplo, eletroporação) para expressão da proteína H-NOX codificada.

Em particular, foram expressas proteínas heterólogas em diversos sistemas de expressão biológicos, como células de inseto, células de planta, células de levedura e células bacterianas. Dessa forma, qualquer sistema de expressão biológico de proteína adequado pode ser utilizado para a produção de grandes quantidades de proteína H-NOX recombinante. Em algumas modalidades, a proteína H-NOX (por exemplo, uma proteína H-NOX mutante ou do tipo selvagem) é uma proteína isolada. Como aqui usado, uma “proteína isolada” significa uma proteína separada de um ou mais componentes com os quais a proteína está naturalmente associada na natureza, incluindo, por exemplo, ácidos nucléicos, lipídeos e outras proteínas. Uma proteína isolada também não ocorre em uma biblioteca de proteínas, por exemplo, uma biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 ou mais proteínas diferentes. Uma proteína isolada pode ser obtida, por exemplo, por expressão de um ácido nucléico recombinante que codifica a proteína ou por síntese química da proteína.

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Se desejado, as proteínas H-NOX podem ser purificadas com o uso de técnicas padronizadas. Como aqui usado, o termo “proteína purificada” significa uma proteína (por exemplo, uma proteína H-NOX mutante ou do tipo selvagem) que foi separada de um ou mais componentes que estão presentes quando a proteína é produzida. Em algumas modalidades, a proteína é pelo menos cerca de 60%, por peso, livre de outros componentes que estão presentes quando a proteína é produzida. Em várias modalidades, a proteína é pelo menos cerca de 75%, 90% ou 99%, por peso, pura. Uma proteína purificada pode ser obtida, por exemplo, por purificação (por exemplo, extração) de uma fonte natural, de um sistema de expressão recombinante ou de uma mistura de reação para síntese química. Métodos de purificação exemplares incluem imunoprecipitação, cromatografia em coluna, por exemplo, cromatografia por imunoafinidade, purificação por imunoafinidade com glóbulo magnético e cozimento com um anticorpo ligado à placa, além de outras técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. A pureza pode ser avaliada por qualquer método apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise por HPLC. Em algumas modalidades, a proteína purificada é incorporada em uma composição farmacêutica da invenção ou usada em um método da invenção. A composição farmacêutica da invenção pode ter aditivos, veículos ou outros componentes, além da proteína purificada.

EXEMPLOS

Os exemplos, que têm a intenção de serem puramente exemplares da invenção e, portanto, não devem ser de 21/11/2017, pág. 140/178

132/150 considerados como limitantes da invenção de forma alguma, também descrevem e detalham aspectos e modalidades da invenção discutidos acima. Os exemplos não visam representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. A menos que indicado de forma diferente, a temperatura está em graus Centígrados e a pressão está na pressão atmosférica ou próxima a ela. Exemplo 1: Produção de proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes

As proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes foram produzidas, expressas e purificadas com a utilização de métodos padronizados, basicamente como descrito por Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1: 5359 e Karow, D.S. e cols. (10 de agosto de 2004), “Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis”, Biochemistry 43(31): 10.203-10.211, ambos aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à mutagênese, expressão e purificação de proteínas H-NOX. A mutagênese foi efetuada com a utilização do protocolo QuickChange® de Strategene (La Jolla, CA) . A expressão das proteínas em cultura de células e a purificação subseqüente das proteínas foram realizadas como descrito por Karow, D. S. e cols. (10 de agosto de 2004), “Spectroscopic

Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme

Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter

Tengcongensis”, Biochemistry 43(31): 10.203-10.211.

Exemplo 2: Caracterização de proteínas H-NOX mutantes de 21/11/2017, pág. 141/178

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Kd calculada para NO: proporção de koff para kon

Para determinar a Kd calculada para NO, os valores para a kon para NO para uma proteína H-NOX é assumido como sendo 710 pM^-1 s^-1, e a taxa de dissociação para NO (koffpara uma proteína H-NOX com um complexo 6-coordenado Fe^IZNO ou k1 ou k2 para uma proteína H-NOX com um complexo 5coordenado Fe^II-NO) é determinada como descrito abaixo.

Koff, kl e k2 (taxas de dissociação de NO)

Valores de koff para proteínas H-NOX com um complexo 6coordenado Fe^II-NO

Para uma proteína H-NOX com um complexo 6-coordenado Fe^II-NO, a koff para NO é calculada como descrito por Boon, E. M. e cols., (August 2006), “Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain,” J. Biol. Chem. 281(31): 21892- 21902 e Boon, E.M. e cols. (2005). “Molecular Basis Para NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,” Nature Chemical Biology 1:53-59, que são aqui incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO para proteínas H-NOX. Resumidamente, complexos FeNO da proteína H-NOX (5 pM heme concentração final) diluídos em trietanolamina, tampão anaeróbico 50 mM, 50 mM NaCl, pH 7,5, foram rapidamente misturados com monóxido de carbono saturado e 30 mM (concentração final) de trap de ditionita (Na2S2O₄) no mesmo tampão (anaeróbico) (Kharitonov, V. G. e cols. (1997) . Biochemistry 36:68146818 e Moore, E. G. et al. (1976). J. Biol. Chem. 251:27882794, que são aqui incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de taxas e dissociação de NO). Foi estabelecido previamente que a de 21/11/2017, pág. 142/178

134/150 ligação de CO não é limitada por taxa nesses experimentos (Kharitonov, V. G. et al. (1997) Biochemistry 36:6814 —

6818); isso foi confirmado em experimentos que usa, apenas 30 mM Na2S2O4 sem CO como um trap. Os dados foram adquiridos por rastreamento periódico em um espectrofotômetro Cary 3E equipado com um conjunto de banho de temperatura constante Neslab RTE-100 para temperaturas variáveis (0-70°C) com o uso de uma cuveta de quartzo com um tamanho de 100 pL a 1 mL e um comprimento de 1 cm (Cary 3E, Varian, Inc., Paio Alto, CA) . A dissociacao de NO de heme foi monitorada como a formação tion do complexo Fe^-CO a 423 nm. Diferenças de espectro foram calculadas por subtração do primeiro scan de cada scan subseqüente. A taxa de dissociação de NO foi determinada a partir do aumento na absorvência a 423 nm versus tempo e ajustada com um único exponencial da forma f (χ) =A χ (1 - e“^kx) usando Kaleidagraph 3.X (Synergy Software, Reading, PA) . Em particular, um único aumento exponencial na concentração de heme-CO (por ligação de CO do trap de NO) pode ser descrito pela equação 1:

ΔΑχ = ΔA_T(l - e'^fc|t) (equação 1) em que ÁAt é a mudança na amplitude de sinal no tempo t; ΔΑΤ é a mudança total na amplitude de sinal, e kl é a constante de taxa de reação observada. Cada experimento foi realizada por um mínimo de seis vezes, e as taxas resultantes tiveram a média calculada. As taxas de dissociação medidas são independentes da concentração de CO e ditionita (3, 30, e 300 mM ditionita foram testados).

Valores de kl e k2 para proteínas H-NOX com um complexo 5coordenado Fe¹¹-NO

Para uma proteína H-NOX com um complexo 5-coordenado de 21/11/2017, pág. 143/178

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Fe^-NO, a koff para NO é calculada pela k1 para NO e a k2 para NO como descrito por Winger, J. A. et al., (janeiro de 2007) “Dissociation of nitric oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme- nitric oxide/Oxygen Binding Domain Constructs” I Biol. Chem. 282(2) : 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, k1 de NO e k2 de NO para proteínas H-NOX. Resumidamente, a dissociação de NO do heme de proteínas H-NOX com um complexo 5-coordenado Fe^II-NO foi medida a 37 e 10°C com o uso do método de trapping de CO/ditionita previamente descrito (Cary, S. P. L., e cols. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S. A. 102: 13064 —13069 e Kharitonov, V. G. e cols. (1997) Biochemistry 36:6814-6818, que são aqui incorporados em suas totalidades por referência, particularmente com relação ao cálculo de taxas e dissociação de NO). A solução de trapping foi preparada como se segue: uma solução de ditionita de sódio (Na2S2O4) em 50 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl foi preparada em um Reacti-Vial selado de Teflon (Pierce) com o uso de uma câmara anaeróbica (Coy Laboratory Products). A solução foi removida da câmara anaeróbica e saturada com CO por borbulhamento do gás através da solução por 10 minutos. Complexos de proteína H-NOX-NO foram formados por incubação com excesso de DEA/NO (em 10 mM NaOH) a 25°C em 50 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl por 10 min. Completa conversão à espécie nitrosil foi verificada seguindo a alteração no máximo de Soret de 431 para 399 nm. As proteínas H-NOX foram colocadas em uma cuveta anaeróbica selada por septo (uma cuveta de quartzo com um tamanho de 100 pL a 1 mL e um comprimento de 1 cm) e desoxigenada com de 21/11/2017, pág. 144/178

136/150 o uso de um “ oxygen-scavenged gas train”. Uma pequena quantidade de DEA/NO (~3 eq) foi adicionada logo antes da desoxigenação para manter a espécie nitrosil (qualquer restante foi subseqüentemente destruído pelo grande excesso de Na2S2O4 na solução de trapping) . O espaço superior da cuveta anaeróbica foi substituído com CO, e a cuveta e soluções de trap foram equilibradas em temperatura de ensaio por 1 minuto. A reação foi iniciada por adição de solução de CO/ditionita à cuveta anaeróbica com uma seringa de gás Hamilton e mistura. A concentração final de Na2Õ2O4 na mistura de reação foi de 30 mM. As concentrações finais da proteína foram 1,9 a 2,5 pM para β1(1-194), β1(1-385), e β2(1-217), e 0,88 a 2,5 pM para sGC. A coleta de dados foi iniciada 10 segundos depois da adição do trap. A reação foi monitorada por espectroscopia de absorção eletrônica com o uso de um espectrofotômetro Cary 3E equipado com um controlador de temperatura Neslab RTE-100 (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA) . Os dados foram coletados por uma faixa de 380 - 450 nm a 909 nm/min com um intervalo de ponto de dados de 1,5-nm. Os espectros foram registrados a cada 18 segundos por 5 minutos, cada 1 minuto por 10 minutos, e cada 2 minutos depois por um total de 3 horas, ou até que a reação estivesse completa. Uma linha de base de tampão foi subtraída de cada espectro, e os espectros foram corrigidos para movimento de linha de base por normalização a um ponto isosbéstico a 410 nm. Diferenças de espectros foram obtidas por subtração do espectro de tempo 0 de todos os espectros subseqüentes. Os valores para a mudança na absorvência a 423 nm (ÁA423; β1(1-194) e β1(1385)) ou 424 nm (ÁA424; sGC e β2(1-217)) foram extraídas da de 21/11/2017, pág. 145/178

137/150 diferença de espectro e colcoada em gráfico versus tempo para obter durações de tempo de dissociação para cada experimento. As durações de tempo de dissociação foram obtidas em duplicata ou triplicata, e cada experimento foi repetido 2-5 vezes por vários dias. Geralmente, por causa da relativa dificuldade na obtenção de grandes quantidades de sGC purificado, os valores de ΔΑ424 para sGC de comprimento total, que são proporcionais às concentrações de proteína experimental, foram menores que para as construções de domínio de heme

Ajuste de curva, análise de dados e geração de figura foram realizados com o uso de Kaleidagraph 3.X (Synergy Software Reading, PA) . Os dados de cada experimento de dissociação foram ajustados a exponenciais duplos como mostrado na Equação 2 abaixo para obter constantes de taxa observadas. Em particular, a equação 2 descreve um aumento de dois-exponenciais na concentração de heme-CO (pela ligação de CO do trap de NO):

(equação 2)

Δ A, = ΛΑχ (I - e ^fc|t) + ΔΑ₂ (1 - ej em que ÁAt é a mudança na amplitude de sinal no tempo t; ΔΑ1 e ΔΑ2 são as contribuições de cada processo exponencial para a mudança total na amplitude de sinal, e kl e kl são as constantes de taxa observadas para cada processo.

Os dados observados são consistentes com um modelo em que a dissociação prossegue a partir de uma mistura de equilíbrio inicial de dois complexos 5-coordenados heme-NO, como apontado no Esquema 1. Portanto, kl corresponde à dissociação de NO da conformação heme-NOsc, enquanto k2 de 21/11/2017, pág. 146/178

138/150 representa a taxa de reação observada, que corresponde a ko— kc, que é limitada pela conversão mais lenta de heme-NO

NO*5c a heme-NOsc.

heme-NO^ hírtie-NGfcc ^l—► hcme^CO

Esquema 1

Valores de kl e k2 para proteínas H-NOX com uma mistura de complexo 5-coordenado e 6-coordenado Fe¹¹-NO

Para uma proteína H-NOX que contém uma mistura de complexos 5-coordenado e 6-coordenado Fe^IZ-NO, a koff para NO é descrita pela kl para NO e a k2 para NO. A kl e a k2 para NO são medidas como acima descrito para proteínas HNOX com um complexo 5-coordenado Fe^IZ-NO, como descrito por Winger, J. A. et al. , (janeiro de 2007) Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and HemeNitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs J. Biol. Chem. 282(2): 897-907, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, particularmente com relação ao cálculo de koff de NO, kl de NO e k2 de NO para proteínas

H-NOX.

Kd calculada para NO

Para medir a Kd calculada para NO, o valor para a k_on para NO para uma proteína H-NOX é 710 μΜ^_1 s^_1, que é uma kon relatada para βΐ (1-385) que foi medida a 4°C e não aumenta significativamente a 37°C (Zhao, e cols., (1999). A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase, PNAS. 96:14753-14758, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência, de 21/11/2017, pág. 147/178

139/150 particularmente com relação ao cálculo de kon de NO para proteínas H-NOX) . Portanto, a KD calculada para NO pe determinada por cálculo da proporção de koff, k1, ou k2 (medidas como acima descrito) para kon (assumida como sendo 710 μΜ^-1 s^-1) .

Kd cinética para O2: proporção de koff para kon

O valor da Kd cinética para O2 foi determinado para as proteínas H-NOX do tipo selvagem e mutantes basicamente como descrito por Boon, E.M. e cols. (2005), “Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase”, Nature Chemical Biology 1: 53-59, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à medida das taxas de associação de O2, das taxas de dissociação de O2, das constantes de dissociação para a ligação de O2, das taxas de auto-oxidação e das taxas de dissociação de NO.

kon (taxa de associação de O2)

A associação de O2 ao heme foi medida com o uso de fotólise instantânea a 20°C. Não foi possível vaporizar o complexo de Fe°-O2 em conseqüência da cinética de recombinação geminada muito rápida; dessa forma, o complexo de Fe°-O2 foi submetido à fotólise instantânea com luz de laser a 560 nm (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA), produzindo o intermediário de Fe¹¹ de 5 coordenadas, do qual a ligação de O2 molecular foi seguida em vários comprimentos de onda. As amostras de proteína foram feitas por redução anaeróbica com 10 mM ditionita, seguida por dessalinização em uma coluna PD-10 (Millipore, Inc., Billerica, MA) . As amostras foram então diluídas até 20 μM de heme em tampão de 50 mM de TEA, 50 mM de NaCl, pH 7,5, em um cadinho de quartzo com de 21/11/2017, pág. 148/178

140/150 atmosfera controlada, com um tamanho de 100 μΐ até 1 ml, e um comprimento de trajeto de 1 cm. O gás CO foi fluído sobre o headspace desse cadinho por 10 minutos para formar o complexo de Fe^II-CO, cuja formação foi verificada por espectroscopia de UV visível (Soret máximo de 423 nm). Essa amostra ou foi usada para medir a cinética da re-ligação de CO após fotólise instantânea, enquanto ainda sob 1 atmosfera de gás CO, ou foi aberta e agitada no ar por 30 minutos para oxigenar completamente o tampão, antes da fotólise instantânea para observar os eventos de re-ligação de O2. A associação de O2 ao heme foi monitorada em vários comprimentos de onda versus tempo. Esses traços foram ajustados com uma exponencial única com o uso do software Igor Pro (Wavemetrics, Inc., Oswego, OR; última versão 2005). Essa taxa era independente do comprimento de onda de observação, mas dependente da concentração de O2. A espectroscopia de UV visível foi usada ao longo do experimento para confirmar todos os complexos e intermediários (Cary 3K, Varian, Inc. Palo Alto, CA) . Os dados da adsorção transitória foram coletados com o uso de instrumentos descritos em Dmochowski, I.J. e cols. (31 de agosto de 2000), “Enantiomeric Discrimination of RuSubstrates by Cytochrome P450cam”, J. Inorg. Biochem. 81(3) : 221-228, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à instrumentação. O instrumento possui um tempo de resposta de 20 ns, e os dados são digitalizados a 200 mega-amostras s^-1.

koff (taxa de dissociação de O2)

Para medir a koff, complexos de Fe^II-O2-proteína (5 μΜ de 21/11/2017, pág. 149/178

141/150 de heme), diluídos em tampão anaeróbico de 50 mM de TEA, 50 mM de NaCl, pH 7,5, foram misturados rapidamente com um volume igual do mesmo tampão (anaeróbico) contendo várias concentrações de ditionita e/ou gás CO saturante. Os dados foram adquiridos em um espectrofotômetro de fluxo interrompido HI-TECH Scientific SF-61 equipado com um banho Neslab RTE-100 em temperatura constante ajustado em 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). A dissociação de O2 do heme foi monitorada como um aumento na absorvência a 437 nm, um máximo no espectro de diferença de Fe^II—Fe^II-O2, ou 425 nm, um máximo no espectro de diferença de Fe^II—Fe^II-CO. Os traços finais foram ajustados para uma exponencial única com o uso do software que é parte do instrumento. Cada experimento foi feito um mínimo de seis vezes, e foram calculadas as médias das taxas resultantes. As taxas de dissociação medidas são independentes da concentração de ditionita (100, 50, 25, 10, 5 e 2,5 mM de ditionita foram testadas) e independentes do CO saturante como um cerco para a espécie reduzida, com e sem a presença de 10 mM de ditionita.

Kd cinética para O2

A Kd cinética para O2 é determinada pelo cálculo da proporção de koff para kon com a utilização das medidas de koff e kon descritas acima.

Kd calculada

Para medir a Kd calculada, os valores para a koff e Kd cinética que foram obtidos como descritos acima foram colocados em um gráfico. Um relacionamento linear entre koff e a Kd cinética foi definido pela equação (y = mx + b). Os valores de koff foram então interpolados ao longo da linha, de 21/11/2017, pág. 150/178

142/150 para derivar a Kd calculada usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA) . Na ausência de uma kon medida, essa interpolação fornece uma forma para relacionar koff à

Kd.

Taxa de auto-oxidação

Para medir a taxa de auto-oxidação, as amostras de proteína foram reduzidas anaerobicamente, depois diluídas até 5 μΜ de heme em tampão aeróbico de 50 mM de TEA, 50 mM de NaCl, pH 75. Essas amostras foram então incubadas em um espectrofotômetro Cary 3E equipado com um banho Neslab RTE100 em temperatura constante ajustado em 37°C, e rastreadas periodicamente (Cary 3E, Varian, Inc., Palo Alto, CA) . A taxa de auto-oxidação foi determinada pela diferença entre o máximo e mínimo no espectro de diferença Fe^II—Fe^I1 plotado versus tempo, e ajustada com uma exponencial única usando Excel: MAC 2004 (Microsoft, Redmond, WA).

Taxa de reação com NO

A reatividade ao NO foi medida com o uso das proteínas purificadas (Tt WT H-NOX, Tt Y140H H-NOX e hemoglobina de Homo sapiens (Hs Hb)) preparadas a 2 pM em tampão A, e o NO foi preparado a 200 pM em Tampão A (Tampão A: 50 mM de Hepes, pH 7,5, 50 mM de NaCl). Os dados foram adquiridos em um espectrofotômetro de fluxo interrompido HI-TECH Scientific SF-61 equipado com um banho Neslab RTE-100 em temperatura constante a 20°C (TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, Reino Unido). A proteína foi misturada rapidamente com NO em uma proporção de 1:1 com um tempo de integração de 0,00125 segundo. Os comprimentos de onda de mudança máxima foram ajustados até uma exponencial única com o uso do software que é parte do espectrômetro, medindo-se de 21/11/2017, pág. 151/178

143/150 basicamente a etapa de taxa limitante da oxidação por NO. Os produtos finais da reação foram férrico-NO para as proteínas H-NOX e férrico-água para Hs Hb.

Medidas da p50

Se desejado, o valor de p50 para proteínas H-NOX mutante ou do tipo selvagem pode ser medido como descrito por Guarnone, R. e cols. (setembro/outubro de 1995), “Performance Characteristics of Hemox-Analyzer For Assessment of The Hemoglobin Dissociation Curve”, Haematologica S0(5): 426-430, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação à medida de valores de p50. O valor de p50 é determinado com o uso de um analisador HemOx. A câmara de medida começa a 0% de oxigênio e é lentamente elevada, de forma incremental, em direção a 100% de oxigênio. Uma sonda de oxigênio na câmara mede o % de saturação de oxigênio. Uma segunda sonda (luz UV-Vis) mede dois comprimentos de onda de adsorção, ajustados para os espectros UV-Vis dos picos alfa e beta da hemoproteína (por exemplo, uma proteína como H-NOX em complexo com heme). Esses picos de adsorção aumentam linearmente à medida que a hemoproteína se liga ao oxigênio. A mudança percentual de não ligado a 100% ligado é então plotada contra os valores do % de oxigênio para gerar uma curva. A p50 é o ponto na curva onde 50% da hemoproteína estão ligados ao oxigênio.

Especificamente, o Analisador Hemox (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA) determina a curva de dissociação de oxi-hemoproteína (ODC) por exposição de 50 pl de sangue ou hemoproteína a uma pressão parcial crescente de oxigênio e sua desoxigenação com gás nitrogênio. Um eletrodo de de 21/11/2017, pág. 152/178

144/150 oxigênio Clark detecta a mudança da tensão de oxigênio, que é registrada no eixo x de um gravador x-y. O aumento resultante na fração de oxi-hemoproteína é simultaneamente monitorado por espectrofotometria de comprimento de onda duplo a 560 nm e 576 nm, e exibida no eixo y. São coletadas amostras de sangue da veia medial do antebraço, anticoaguladas com heparina e mantidas a 4°C em gelo úmido até o ensaio. Cinqüenta pl de sangue total são diluídos em 5 pl de solução Hemox, um tampão fornecido pelo fabricante que mantém o pH da solução em um valor de 7,4 ± 0,01. A amostra-tampão é aspirada para um cadinho que é parte do analisador Hemox, e a temperatura da mistura é equilibrada e elevada até 37°C; a amostra é então oxigenada até 100% com ar. Após ajuste do valor de pO2, a amostra é desoxigenada com nitrogênio; durante o processo de desoxigenação, a curva é registrada em um papel de gráfico. O valor de P50 é extrapolado no eixo x como o ponto no qual a saturação de O2 é de 50% com o uso do software que é parte do analisador Hemox. O tempo necessário para um registro completo é de aproximadamente 30 minutos.

Os valores de p50 para qualquer uma das proteínas HNOX podem ser comparados com aqueles da hemoglobina como uma indicação da afinidade relativa da proteína H-NOX por O2, comparados com aquele da hemoglobina. A Tabela 15 lista os valores de p50 relatados previamente para hemoglobina.

Tabela 15. Variantes de hemoglobina e suas afinidades registradas por oxigênio

Nome	Modificação	Kd (nM)	p50 (100 kPa)	Referência/ fabricante
Hemoglobina		~400	14

de 21/11/2017, pág. 153/178

145/150

(sem estroma)
Hemoglobina (RBC's)			27
Hemopure (HBOC-201)	Polimerizada bovina		36	Biopure
Oxiglobina (14130C- 301	Polimerizada bovina		54	Biopure
Hemospan (MP4)	Maleimida- PEG		5	Sangart
Poliheme	Piridoxal		28-30	Northfield Labs
Hemolink	0-rafinose		40	Hemosol
Hemassist	Diaspirin		32	Baxter

Medidas da viscosidade

Se desejado, a viscosidade das soluções de H-NOX pode ser medida com o uso de um reômetro de cone/placa (modelo DV-III, Brookfield; Middleboro, MA) com o fuso cone CPE-40 em uma taxa de cisalhamento de 200/s. As soluções com viscosidades entre 1 e 4 centipoise (cP) administradas em experimentos de liberação de oxigênio em hemodiluição são relatadas como seguras (Winslow, R.M. e cols. (outubro de 2004), “Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat”, J. Appl Physiol. 97(4): 1.527-1.534, Patentes U.S. N^os 6.974.795 e

6.432.918, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida de viscosidade). Conseqüentemente, em algumas modalidades, a viscosidade da solução de proteína H-NOX é entre 1 e 4 cP. Medidas da pressão oncótica coloidal

Se desejado, a pressão oncótica coloidal pode ser

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 154/178

146/150 medida usando um osmômetro colóide de acordo com as instruções do fabricante (modelo 4420, Wescor; Logan, UT). Métodos exemplares para medir a pressão oncótica coloidal são descritos em Vandegriff, K.D. e cols. (novembro de 1997), “Colloid Osmotic Properties of Modified Hemoglobins: Chemically Cross-Linked Versus Polyethilene Glycol SurfaceConjugated”, Biophys. Chem. 69(1): 23-30, em uma página na Internet anaesthesiamcq.com/FluidBook/f12_4.php; Patentes U.S. N^os 6.974.795 e 6.432.918, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades, particularmente com relação à medida da pressão oncótica coloidal. Soluções com pressão oncótica coloidal entre 20 e 50 mm Hg administradas em experimentos de liberação de oxigênio em hemodiluição são relatadas como seguras (Winslow, R. M. e cols. (outubro de 2004), Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat, J. Appl. Physiol. 97(4): 1.527-1.534). Conseqüentemente, em algumas modalidades, a pressão oncótica coloidal da solução de proteína H-NOX é entre 20 e 50 mm Hg.

Exemplo 3: Modelos de doença cardíaca para mutantes de HNOX de transportador de NO

Dois modelos animais podem ser usados para comparar a eficácia de proteínas H-NOX como transportadores de NO para terapia padronizada de nitrato. Para comparar os efeitos das proteínas H-NOX com liberação autentica de NO com isosorbide dinitrato (ISDN) em um modelo de rato de doença cardiovascular crônica, uma adaptação de um protocolo estabelecido (Shimamura, S. e cols. (2006) . J Vet Med Sci Vol. 68(3):213-7, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, particularmente com relação a modelos de de 21/11/2017, pág. 155/178

147/150 doença cardiovascular) podem ser realizados com o uso de machos de ratos Wistar. Para simular hipertrofia cardiovascular, a aorta abdominal é constrita (constrição da aorta abdominal ou modelo AC) via laparotomia abdominal ventral e aplicação de um manguito de constricção por uma agulha inserida de calibre 21, que é então removida para permitir a constrição uniforme do vaso. Ratos falsamente operados passam por cirurgia similar, mas sem a criação de AC. Após a cirurgia, os ratos são aleatoriamente divididos em grupos de tratamento de 14 animais por grupo (7 sob medicação e 7 em placebo), e deixados em recuperação por 7 dias. Os tratamentos por grupo (grupos de controle são pareados com cada caso de teste como placebo) são: (1) ratos AC administrados por via oral com sr-ISDN ou placebo; (2) ratos AC administrados por via IV com uma ou mais proteínas H-NOX de tipo selvagem ou mutantes aqui descritas ou placebo (por exemplo, uma proteína H-NOX inativada); (3) e (4) Ratos falsamente operados tratados como em (1) ou (2), respectivamente. Os tratamentos são uma vez ao dia por 12 semanas, depois do que os animals são sacrificados, e os corações são retirados para análises padrão de histopatologia para a determinação da morfologia de cardiomiócito, fibrose, depósito de colágeno, diâmetro ventricular, morfologia aórtica, e outras análises padrão para avaliação da progressão ou prevenção da doença.

Para comparar a eficácia de proteínas H-NOX àquela de ISDN na medicação de remodelagem ventricular esquerda de longa duração após infarto agudo do miocárdio, um modelo de cão, em que ISDN mostrou alguma eficácia via administração crônica, é realizado com o uso de um protocolo padrão (Bodh de 21/11/2017, pág. 156/178

148/150

I. Jugdutt, MBChB, MSc; Mohammad I. Khan, MBBS (1994). Circulation 89(S)) . Para cada experimento, quarenta cães saudáveis mestiços (peso de 16 a 29 kg) de ambos os sexos recebem uma toracotomia lateral esquerda sob anestesia geral (pentobarbital de sódio, 30 mg/kg IV) . Cateters de polietileno são inseridos na veia jugular external, artéria carótida interna, e átrio esquerdo, preenchidos com solução salina heparinizada, e suas extremidades exteriorizadas atrás do pescoço. Uma ligadura de seda é colocada ao redor da artéria coronária descendente anterior esquerda, entre o primeiro e segundo ramos diagonais, e apertada. Glóbulos de metal são suturados as superfícies epicárdicas anterior, lateral, e posterior no plano de eixo curto no nível ventricular esquerdo médio para orientação ecocardiográfica consistente para topografia serial. O pericárdio e tronco foram então fechados. Penicilina (1 milhão de unidades) e estreptomicina (1 g) são dados por via intramuscular, e os cães são devolvidos a suas gaiolas.

Dois dias depois da laqueadura da artéria coronária, os 70 sobreviventes saudáveis são aleatoriamente destinados a terapia com nitrato (n=10), terapia com proteína H-NOX (por exemplo, uma ou mais proteínas H-NOX de tipo selvagem ou mutantes que foram opcionalmente caracterizadas in vitro com o uso de qualquer um dos ensaios aqui descritos e opcionalmente foram submetidas a otimização para toxicidade e/ou farmacocinética) (10), e subgrupos de controle combinados (sem tratamento, n=20): subgrupo 1 (10 controle, 10 nitrato), e subgrupo 2 (10 controle, 10 proteína H-NOX). Os cães têm livre acesso a fluidos, e nenhuma tentativa é feita para tratar insuficiência cardíaca por restrição de de 21/11/2017, pág. 157/178

149/150 fluido ou farmacoterapia. Em seis semanas, os cães sobreviventes são anestesiados, e os corações são interrompidos em diástole com uma overdose de cloreto de potássio intravenoso, retirados, lavados em solução salina normal, e pesados. As amostras de sangue são retiradas para monitoramento de gases sangüíneos, hemogramas, e eletrólitos. Com o uso dos procedimentos padrão, as medições durante a cicatrização são feitas (como ECG, hemodinâmica etc.), e as análises post-mortem incluem aquelas medidas acima descritas para insuficiência cardíaca crônica (por exemplo, acúmulo de colágeno, morfologia do miócito etc.) . As proteínas H-NOX que são tão eficazes ou mais eficazes que ISDN (o padrão de tratamento de terapias com base em nitrato para insuficiência cardíaca aguda e crônica) no infarto do miocárdio e/ou nos experimentos de modelo de AC crônico são particularmente úteis para o tratamento de infarto do miocárdio e/ou AC crônico. Tais proteínas H-NOX também são úteis para tratar outras indicações para as quais a liberação de NO seja benéfica.

Os exemplos e a descrição detalhada apresentados anteriormente são oferecidos apenas como forma de ilustração, e não como forma de limitação. Todas as publicações, pedidos de patente e patentes citados nessa especificação são aqui incorporados por referência como se cada publicação, pedido de patente ou patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Embora a invenção tenha sido descrita com algum detalhe como forma de ilustração e exemplo a fim de facilitar sua compreensão, ficará facilmente aparente por aqueles habilitados na técnica à de 21/11/2017, pág. 158/178

150/150 luz dos ensinamentos dessa invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas a ela, sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações em anexo.

A menos que definidos de forma diferente, os significados de todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são aqueles comumente conhecidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence. Aqueles habilitados na técnica também irão observar que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também podem ser usados para a prática ou teste da invenção.

Para uso nesse pedido, a menos que claramente indicado de forma diferente, o uso dos termos um, uma, e semelhantes refere-se a um ou mais.

Referências feitas nesse pedido a um valor de cerca de ou parâmetro incluem (e descrevem) modalidades que são dirigidas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição que se refere a cerca de X inclui a descrição de X.

Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descritas incluem que compreende, que consiste e que consiste basicamente em aspectos e modalidades.

Petição 870170089552, de 21/11/2017, pág. 159/178

1/16

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES

1/46 modeio de homoiogia de β1 ^DE Ηογπο sapians H-NOX ^de T. tengcogensis

1. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, caracterizada por compreender: (i) uma quantidade farmaceuticamente aceitável de uma proteína HNOX, em que a proteína H-NOX é projetada para compreender uma mutação da bolsa distal, em que a referida proteína HNOX se liga e distribui NO com uma reatividade mínima ao NO, e em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está dentro de 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor do que aquela da hemoglobina, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.

2/46

2/16

H-NOX é de menos que cerca de 7 00 s^-1.

6. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a

5, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C.

7. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a

6, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C.

8. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a

7, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1.

9. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a k1 para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.

10. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido C-terminal na proteína H-NOX mutante de 21/11/2017, pág. 161/178

3/16 foi removido comparado a uma proteína de tipo selvagem correspondente.

11. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX

T.

W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de tengcongensis, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T.

tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, H-NOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, HNOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T.

tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140H de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L.

pneumophilia, 2 F9W-F142Y de L. pneumophilia H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans β1 I140Y de H. sapiens, β1 I145Y de H. sapiens, β1(1-385) de

H. sapiens, β1(1-385)I145Y de H. sapiens, β1(1-385) I145H de H. sapiens, β1(1-194) de H. sapiens, β1(1-194) I145Y de

H. sapiens, β1(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de

H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, β1 H-NOX H105G de H. sapiens, β1 H-NOX H105F de H. sapiens, β1(1-385) de de 21/11/2017, pág. 162/178

4/16

R. norvegicus, β1(1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1194) I145Y de R. norvegicus, β1(1-194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1-175), Cb H-NOX(1-186), H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans.

12. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.

13. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína humana é β1 ou é derivada de β1.

14. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína bacteriana ou é derivada de uma proteína bacteriana.

15. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.

16. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da de 21/11/2017, pág. 163/178

5/16 proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C.

17. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína HNOX é de menos que cerca de 700 s^-1.

18. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1 .

19. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a k1 para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.

20. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-P115A de T. tengcongensis, H-NOX de 21/11/2017, pág. 164/178

6/16

W9F de T. tengcongensís, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensís, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensís, H-NOX W9Y de T. tengcongensís, H-NOX W9N de T. tengcongensís, H-NOX W9H de T. tengcongensís, H-NOX N74E de T. tengcongensís, H-NOX N74A de T. tengcongensís, H-NOX N74H de T. tengcongensís, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensís, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensís, HNOX P115A de T. tengcongensís, H-NOX R135Q de T. tengcongensís, H-NOX Y140F de T. tengcongensís, H-NOX Y40L de T. tengcongensís, H-NOX Y140A de T. tengcongensís, I75FHis6 de T. tengcongensís, I75F de T. tengcongensís, L144FHis6 de T. tengcongensís, L144F de T. tengcongensís, 2 HNOX F142Y de L. pneumophílía, 2 F9W-F142Y de L. pneumophílía, H-NOX(728-899) de D. desulfurícans, H-NOX

Y139L de D. desulfurícans, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapíens, β1 I145Y de H. sapíens, β1(1-385) de H. sapíens, β1(1-385) I145Y de H. sapíens, β1(1-385) I145H de H.

sapíens, β1(1-194) de H. sapíens, β1(1-194) I145Y de H.

sapíens, β1(1-194) L9W-I145Y de H. sapíens, β2(1-217) de H. sapíens, β2(1-217) I142Y de H. sapíens, β1 H-NOX I-1105G de H. sapíens, β1 H-NOX H105F de H. sapíens, β1(1-385) de R. norvegicus, β1(1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385)

I145H de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1194) I145Y de R. norvegicus, β1(1-194) L9W-I145Y de R.

norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de

R. norvegicus, β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1-175), Cb H-NOX(1-186), H-NOX(1-197) de C. acetobutylícum, H-NOX(1-183) de C.

acetobutylícum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C.

de 21/11/2017, pág. 165/178

7/16 elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans.

21. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.

22. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a proteína de mamífero é uma proteína humana, e em que a proteína humana é β1 ou é derivada de β1.

23. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.

24. Uso de uma proteína H-NOX, caracterizado por ser para preparar um medicamento para liberação de NO a um indivíduo em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C.

26. Uso, de acordo com as reivindicações 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína Hde 21/11/2017, pág. 166/178

8/16

NOX é de menos que cerca de 7 00 s^-1.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a koff para NO, a k1 para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.

28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensís, H-NOX I5A de T. tengcongensís, H-NOX I5L de T. tengcongensís, H-NOX I5LP115A de T. tengcongensís, H-NOX W9F de T. tengcongensís, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensís, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensís, H-NOX W9Y de T. tengcongensís, H-NOX W9N de T. tengcongensís, HNOX W9H de T. tengcongensís, H-NOX N74E de T. tengcongensís, H-NOX N74A de T. tengcongensís, H-NOX N74H de T. tengcongensís, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensís, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensís, H-NOX P115A de T. tengcongensís, H-NOX R135Q de T. tengcongensís, H-NOX Y140F de T. tengcongensís, H-NOX Y40L de T. tengcongensís, H-NOX Y140A de T. tengcongensís, I75F-His6 de T. tengcongensís, I75F de T. tengcongensís, L144F-His6 de T. tengcongensís, L144F de T. tengcongensís, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophílía, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophílía, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophílía, 2 F9W-F142Y de L. pneumophílía, H-NOX de 21/11/2017, pág. 167/178

9/16 do tipo selvagem de D. desulfurícans, H-NOX(728-899) de D. desulfurícans, H-NOX Y139L de D. desulfurícans, β1 H-NOX do tipo selvagem de H. sapíens, β1 I14 5Y de H. sapíens, β1(1385) de H. sapíens, β1(1-385) I145Y de H. sapíens, β1(1385) I145H de H. sapíens, β1(1-194) de H. sapíens, β1(1194) I145Y de H. sapíens, β1(1-194) L9W-I145Y de H.

sapíens, β2(1-217) de H. sapíens, β2(1-217) I142Y de H.

sapíens, β1 H-NOX H105G de H. sapíens, β1 H-NOX H105F de H. sapíens, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegícus, β1(1385) de R. norvegícus, β1(1-385) I145Y de R. norvegícus, β1(1-385) I145H de R. norvegícus, β1(1-194) de R. norvegícus, β1(1-194) I145Y de R. norvegícus, β1(1-194)

L9W-I145Y de R. norvegícus, β2(1-217) de R. norvegícus, β2(1-217) I142Y de R. norvegícus, β1 H-NOX H105G de R. norvegícus, β1 H-NOX H105F de R. norvegícus, Cb H-NOX(1175), Cb H-NOX(1-186), H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylícum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylícum, H-NOX(1183) de C. acetobutylícum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster;

H-NOX do tipo selvagem de N. punctíforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneídensís, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. famílíarís, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegícus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. laevís, H-NOX do tipo selvagem de O. latípes, H-NOX do tipo selvagem de O. curívatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubrípes, H-NOX do tipo selvagem de A.

de 21/11/2017, pág. 168/178

10/16 gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme.

29. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a k off^, k1 ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10 ⁴ s ¹ e cerca de 10 ^-1 a 37°C, , e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C. 30. Uso de acordo com a reivindicação 29,

caracterizado pelo fato de que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1. 31. Uso, de acordo com as reivindicações 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX compreende

pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO, a Koff para NO, a k1 para NO, a k2 para NO, a constante de dissociação de O2, a estabilidade de NO, a taxa de auto-oxidação, ou qualquer combinação de dois ou mais dos anteriores comparados aqueles de uma proteína de tipo selvagem correspondente.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX do tipo selvagem de T. tengcongensis, H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5LP115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, de 21/11/2017, pág. 169/178

11/16

H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensís, H-NOX W9F-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensís, H-NOX W9Y de T. tengcongensís, H-NOX W9N de T. tengcongensís, HNOX W9H de T. tengcongensís, H-NOX N74E de T. tengcongensís, H-NOX N74A de T. tengcongensís, H-NOX N74H de T. tengcongensís, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensís, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensís, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensís, H-NOX P115A de T. tengcongensís, H-NOX R135Q de T. tengcongensís, H-NOX Y140F de T. tengcongensís, H-NOX Y40L de T. tengcongensís, H-NOX Y140A de T. tengcongensís, I75F-His6 de T. tengcongensís, I75F de T. tengcongensís, L144F-His6 de T. tengcongensís, L144F de T. tengcongensís, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophílía, 1 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophílía, 2 H-NOX do tipo selvagem de L. pneumophílía, 2 F9W-F142Y de L. pneumophílía, H-NOX do tipo selvagem de D. desulfurícans, H-NOX(728-899) de D. desulfurícans, H-NOX Y139L de D. desulfurícans, β1 H-NOX do

tipo selvagem de H. sapíens, β1 I145Y de H. sapíens , β1(1- 385) de H. sapíens , β1(1-385) I145Y de H. sapíens , β1(1- 385) I145H de H. sapíens , β 1(1-194) de H. sapíens , β1(1- 194) I145Y de H. sapíens , β 1(1-194) L9W-I145Y de H.

sapíens, β2(1-217) de H. sapíens, β2(1-217) I142Y de H.

sapíens, β1 H-NOX H105G de H. sapíens, β1 H-NOX H105F de H. sapíens, β1 H-NOX do tipo selvagem de R. norvegicus, β1(1385) de R. norvegicus, β1(1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-194) I145Y de R. norvegicus, β1(1—194)

L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, β1 H-NOX H105G de R.

norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1de 21/11/2017, pág. 170/178

12/16

175), Cb H-NOX(1-186), H-NOX do tipo selvagem de C. acetobutylicum, H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1183) de C. acetobutylicum, GCY-35 H-NOX do tipo selvagem de C. elegans, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans, β1 H-NOX do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14885-PA do tipo selvagem de D. melanogaster, CG14886 do tipo selvagem de D. melanogaster, CG4154 do tipo selvagem de D. melanogaster;

H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme, H-NOX do tipo selvagem de C. crescentus, H-NOX do tipo selvagem de S. oneidensis, H-NOX do tipo selvagem de M. musculus, H-NOX do tipo selvagem de C. familiaris, H-NOX do tipo selvagem de B. taurus, R. norvegicus do tipo selvagem; H-NOX do tipo selvagem de X. laevis, H-NOX do tipo selvagem de O. latipes, H-NOX do tipo selvagem de O. curivatus, H-NOX do tipo selvagem de F. rubripes, H-NOX do tipo selvagem de A. gambiae, H-NOX do tipo selvagem de M. sexta; gcy-31 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-32 de C. elegans, gcy-33 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-34 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-35 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-36 do tipo selvagem de C. elegans, gcy-37 do tipo selvagem de C. elegans; H-NOX do tipo selvagem de V. cholera, H-NOX do tipo selvagem de V. fischerii e H-NOX do tipo selvagem de N. punctiforme.

33. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma proteína de mamífero ou é derivada de uma proteína de mamífero.

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX está ligada covalentemente a outra molécula ou porção.

de 21/11/2017, pág. 171/178

13/16

35. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 34, caracterizado pelo fato de que o indivíduo sofre ou está em risco de contrair uma condição cardiovascular, hipertensão, uma condição exacerbada por hipertensão, uma condição vasoconstritora, AVC, ou uma deficiência funcional de NO.

36. Uso, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que uma condição exacerbada por hipertensão é insuficiência cardíaca, insuficiência renal ou um AVC.

37. Kit, caracterizado por compreender (i) uma quantidade farmaceuticamente aceitável de uma proteína HNOX, em que a referida proteína H-NOX se liga e distribui NO com uma reatividade mínima ao NO, em que a proteína HNOX é projetada para compreender uma mutação da bolsa distal, e em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável, em que uma composição compreendendo a proteína H-NOX e o veículo farmaceuticamente aceitável é embalada em frascos, vasos, ampolas, garrafas, jarras ou embalagens flexíveis.

38 . Kit, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína H- NOX é de menos que cerca de 700 s^-1. 39. Kit, de acordo com a reivindicação 37,

caracterizado pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da de 21/11/2017, pág. 172/178

14/16 proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C, e (ii) instruções para uso do kit para liberar NO a um indivíduo.

40. Kit, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a taxa de auto-oxidação da proteína H-NOX é de menos que cerca de 1 h^-1 a 37°C, e em

que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1. 41. Kit, de acordo com as reivindicações 37 ou 40, caracterizado pelo fato de que a proteína H-NOX é uma selecionada do grupo que consiste em H-NOX I5A de T. tengcongensis, H-NOX I5L de T. tengcongensis, H-NOX I5L-

P115A de T. tengcongensis, H-NOX W9F de T. tengcongensis, H-NOX W9F-Y140L de T. tengcongensis, H-NOX W9F-YI40H de T. tengcongensis, H-NOX W9F-N74A de T. tengcongensis, H-NOX W9Y de T. tengcongensis, H-NOX W9N de T. tengcongensis, HNOX W9H de T. tengcongensis, H-NOX N74E de T. tengcongensis, H-NOX N74A de T. tengcongensis, H-NOX N74H de T. tengcongensis, H-NOX N74A-Y140H de T. tengcongensis, H-NOX F78Y-Y140F de T. tengcongensis, H-NOX F78Y/Y140L de T. tengcongensis, H-NOX P115A de T. tengcongensis, H-NOX R135Q de T. tengcongensis, H-NOX Y140F de T. tengcongensis, H-NOX Y40L de T. tengcongensis, H-NOX Y140A de T. tengcongensis, I75F-His6 de T. tengcongensis, I75F de T. tengcongensis, L144F-His6 de T. tengcongensis, L144F de T. tengcongensis, 2 H-NOX F142Y de L. pneumophilia, 2 F9WF142Y de L. pneumophilia, H-NOX(728-899) de D. desulfuricans, H-NOX Y139L de D. desulfuricans, β1 I145Y de H. sapiens, β1(1-385) de H. sapiens, β1(1-385) I145Y de H.

de 21/11/2017, pág. 173/178

15/16 sapiens, β1(1-385) I145H de H. sapiens, β1(1-194) de H. sapiens, β1(1-194) I145Y de H. sapiens, β1(1-194) L9W-I145Y de H. sapiens, β2(1-217) de H. sapiens, β2(1-217) I142Y de H. sapiens, β1 H-NOX H105G de H. sapiens, β1 H-NOX H105F de H. sapiens, β1(1-385) de R. norvegicus, β1(1-385) I145Y de R. norvegicus, β1(1-385) I145H de R. norvegicus, β1(1-194) de R. norvegicus, β1(1-194) I145Y de R. norvegicus, β1(1194) L9W-I145Y de R. norvegicus, β2(1-217) de R. norvegicus, β2(1-217) I142Y de R. norvegicus, β1 H-NOX H105G de R. norvegicus, β1 H-NOX H105F de R. norvegicus, Cb H-NOX(1-175), Cb H-NOX(1-186), H-NOX(1-197) de C. acetobutylicum, H-NOX(1-183) de C. acetobutylicum, H-NOX GCY-35(1-252) de C. elegans.

42. Proteína de H-NOX recombinante, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação que altera a constante de dissociação de NO ou reatividade ao NO comparada aquela de uma proteína de H-NOX de tipo selvagem correspondente, em que a constante de dissociação de NO da proteína H-NOX mutante está em 2 ordens de magnitude daquela da hemoglobina, em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX mutante é pelo menos 10 vezes menor que aquela da hemoglobina, em que a mutação da bolsa distal corresponde a pelo menos um de Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, e Leu144 de H-NOX de T. tengcongensis

43. Proteína de H-NOX recombinante, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C.

44. Proteína de H-NOX recombinante, de acordo com as de 21/11/2017, pág. 174/178

16/16 reivindicações 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s^-1.

45. Proteína de H-NOX recombinante, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, em que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C.

46. Proteína de H-NOX recombinante, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a koff, k1, ou k2 para NO da proteína H-NOX mutante está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s-1.

47. Proteína de H-NOX recombinante, de acordo com as reivindicações 45 ou 46, caracterizada pelo fato de que a constante de dissociação de O2 da proteína H-NOX mutante é pelo menos cerca de 1 pM a 37°C, e em que a reatividade ao NO da proteína H-NOX mutante é de menos que cerca de 700 s^{- 1}.

48. Proteína de H-NOX recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizada pelo fato de que a proteína H-NOX de tipo selvagem correspondente é uma proteína de mamífero.

49. Ácido nucléico recombinante caracterizado por codificar uma proteína H-NOX como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 48.

de 21/11/2017, pág. 175/178

2. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a reatividade ao NO da proteína H-NOX é de menos que cerca de 700 s^-1.

3. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C.

4. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 0,012 s^-1 a 37°C.

5. Composição farmacêutica transportadora de NO gasoso sanguíneo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a koff, K1 ou K2 para NO da proteína H-NOX está entre cerca de 1 x 10^-4 s^-1 e cerca de 10 s^-1 a 37°C e em que a reatividade ao NO da proteína de 21/11/2017, pág. 160/178

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