JP2017137337A - 一酸化窒素の送達のための組成物および方法 - Google Patents

一酸化窒素の送達のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】一酸化窒素の送達のための組成物および方法の提供。
【解決手段】血中ガスＯ２送達のための向上した、又は最適な速度論的及び熱力学的な特性を示すようにＨ−ＮＯＸ蛋白を変異させる。操作されたＨ−ＮＯＸ蛋白は対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと相対比較して改変されたＯ２又はＮＯリガンド結合を付与する変異を含む。本発明は又Ｏ２の送達が有益である何れかの状態の治療のための野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白を使用する医薬組成物、キット及び方法を提供する。本発明の一つの実施形態においては、本発明は対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白のものと比較してＯ２解離定数又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を有する単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を提供する。
【選択図】なし

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈ−ＮＯＸ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ａｎｄ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（ＵＣ Ｃａｓｅ Ｎｏ．Ｂ０６−０８４）という表題の、Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｍａｒｌｅｔｔａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｐ．Ｌ．Ｃａｒｙ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｍ．Ｂｏｏｎによる、２００６年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９２１，５０５号の利益を請求する。この仮特許は、２００６年５月２２日に出願された米国特許出願第１１／４４０，５８８号から、２００７年５月１日における仮特許出願に変更され、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（政府支援の研究または開発に関する陳述）
本研究は、助成金番号ＤＥ−ＡＣ０３−７６ＳＦに支援された。米国政府は、本出願にかかる任意の特許に権利を有し得る。
（技術分野）
本出願はＨ−ＮＯＸ蛋白、及び酸素を送達するためにそれらを使用する方法に関する。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヒトに対して、そして獣医科用途に関しては、動物に対してＯ２を送達するための新しい治療ツールを与える。
（発明の背景）
現在の血液銀行システムは固有の危険性及び重篤な制限事項を有する。血液型判別の誤り、免疫原性、細菌物質の伝播、及びＨＩＶ−１及び肝炎等のウィルス感染が輸液患者に対して致命的な危険をもたらしている。更に又、ドナーの限定された入手性、特定の血液型の必要性、赤血球の短いシェルフライフ、及び冷蔵保存の必要性はすべて、患者に対する輸液の使用し易さを制限している。安定な血液代替物の開発は現在の血液銀行システムの危険性を排除し、そして大部分の環境において患者に対する輸液の使用し易さを向上させると考えられる。即ち、失血又は低酸素に起因する症状を軽減するための臓器及び組織への酸素（Ｏ２）の送達は主要な治療上の目標である。
ヘモグロビン系の治療は合衆国においてはヒトにおける使用に関しては認可されていない。潜在的な治療法としては種々のＯ２担体が挙げられる非特許文献１において考察されている）。しかしながら一部の潜在的な血液代替物、例えばヘモグロビン系の血液代替物は酸化窒素（ＮＯ）とのそれらの反応性のために限定されている。特にＮＯはインビボの多くの重要なプロセス、例えば神経伝達、炎症、血小板凝集、及び胃腸及び血管の平滑筋の調節等の制御において化学的メッセンジャーとして作用する。ＮＯはヘモグロビンに結合するＯ２と直接反応してメトヘモグロビン及びニトレートを形成する。ヘム鉄及びＮＯの両方が結合酸素原子により酸化され、そして、ＮＯによるＯ２の置き換えが観察されないほど急速に反応が起こる（例えば特許文献１参照）。
ＮＯは連続的に生産され消費されるため、インビボではＮＯは天然にターンオーバーされる。無細胞ヘモグロビンを投与すると、ＮＯの生産と消費の均衡は無細胞ヘモグロビンとの反応により改変される。ＮＯとヘモグロビンに結合しているＯ２との間の酸化反応は不可逆であり、ＮＯ、Ｏ２及びヘモグロビンの分解をもたらす。Ｏ２結合非存在下のヘモグロビンへのＮＯの結合は、ニトロシルヘモグロビンの解離半減期が５〜６時間であることから、生理学的な時間枠においては実効的に不可逆であり、従って無細胞Ｏ２担体としてのヘモグロビンを実効的に不活性化してしまう。
ＮＯ分子がヘモグロビンと反応すると、それはシグナル分子のプールからは排除され、これにより特定の有害状態がもたらされる。例えば、ヘモグロビンへのＮＯの結合（Ｏ２結合の存在下又は非存在下）は血管の弛緩を防止することができ、そして潜在的には低血圧をもたらし、これは特定の細胞外ヘモグロビン溶液の投与後に観察される場合がある。
ＮＯは又、特定の炎症応答を媒介するためにも必要である。例えば内皮により生産されたＮＯは血小板凝集を抑制する。その結果、ＮＯが無細胞ヘモグロビンにより結合されるに従って（Ｏ２結合の存在下又は非存在下）、血小板凝集も増大する場合がある。血小板が凝集するに従って、それらはトロンボキサンチンＡ２及びセロトニンのような強力な血管収縮化合物を放出する。これらの化合物はヘモグロビン枯渇により生じた低減されたＮＯレベルと相乗作用的に作用して顕著な血管収縮をもたらす場合がある。血小板凝集を抑制することの他に、ＮＯは、結果的に細胞壁の損傷をもたらす細胞壁への好中球の結合を抑制する。内皮細胞壁損傷は特定のヘモグロビン溶液の注入によっても観察されている。
ヘモグロビン系血液代替物の別の主要な難点はその高いＯ２親和性である。この高親和性は所望の位置（例えば末梢組織）において臨床的に有用な速度で酸素を放出するヘモグロビンの能力を制限する。或いは、微小血管床に到達する前の動脈内の低親和性ヘモグロビン系血液代替物によるＯ２の放出は高酸素血管収縮応答に起因する血管収縮を誘発する場合がある（Ｗｉｎｓｌｏｗ仮説）。更に又、ヘモグロビン系血液代替物は血漿から細胞非含有ヘモグロビンを除去するヘモグロビンに対する受容体の存在に起因する血漿からの無細胞ヘモグロビンの急速なクリアランスにより妨害される。無細胞ヘモグロビンは又、恐らくは糸球体におけるＮＯの枯渇に起因して腎毒性をもたらす場合があり、これにより収縮及びその後の機能不全をもたらす。
米国特許６，４５５，６７６号明細書
Ｓｐａｈｎ，Ｄ．Ｒ．等（２００５）"Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏ２ ｃａｒｒｉｅｒｓ：ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ２００５，"Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（３１）：４０９９−４１１４
現在の血液代替物の限界及び献血血液の慢性的な不足に起因して、酸素を送達するための追加的又は代替的な療法への多大な関心及び必要性がなお存在している。特により低値のＮＯ反応性及び／又はより長い血漿中の滞留時間を有する血液代替物が望ましい。特定の臨床上又は産業上の用途に対して適切であるＯ２結合に関する解離定数又はオフ速度を有する酸素担体も必要である。Ｏ２担体が望まれる産業上の用途の例は、細胞に到達するＯ２の量により制限される場合が多い培地中の細胞の生育を包含する。
（発明の要旨）
本発明は野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白がヘモグロビンよりも遥かに低値のＮＯ反応性を有し、そしてこのため望ましいＯ２担体であることを意外にも発見したことに部分的には基づいている。所望により、Ｈ−ＮＯＸ蛋白内に変異を導入してそのＯ２及びＮＯリガンド結合を改変することによりＯ２担体としてのＨ−ＮＯＸ蛋白の使用を更に最適することができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）製薬上許容しうる量のＨ−ＮＯＸ蛋白であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である、Ｈ−ＮＯＸ蛋白、及び（ｉｉ）製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
（項目２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭである項目１記載の医薬組成物。
（項目３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約８０ｎＭ未満である項目１および２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである項目３記載の医薬組成物。
（項目５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目１〜４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目５記載の医薬組成物。
（項目７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目１〜６の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目７記載の医薬組成物。
（項目９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１である項目１〜６の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が空気中４℃で安定である項目１〜９の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目１〜１０の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目１〜１１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目１〜１２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目１〜１３の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
よりなる群から選択される項目１〜１４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目１〜１５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目１７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目１６記載の医薬組成物。
（項目１８）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目１７記載の医薬組成物。
（項目１９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目１〜１５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目２０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目１９記載の医薬組成物。
（項目２１）
酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目１〜２０の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目２２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白を含む１つ以上のリポソーム又はナノ粒子を含む項目１〜２１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目２３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目１〜２２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目２４）
（ｉ）製薬上許容しうる量のＨ−ＮＯＸ蛋白であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である、Ｈ−ＮＯＸ蛋白、及び（ｉｉ）製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
（項目２５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目２４記載の医薬組成物。
（項目２６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目２５記載の医薬組成物。
（項目２７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭである項目２５記載の医薬組成物。
（項目２８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である項目２４〜２７の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目２９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目２８記載の医薬組成物。
（項目３０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目２９記載の医薬組成物。
（項目３１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が約１．０ｓ−１未満である項目２４〜３０の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目２４〜３２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３３）
蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目２４〜３１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目３３記載の医薬組成物。
（項目３５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２４〜３４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目２４〜３５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２４〜３６の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２４〜３７の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目３９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２４〜３８の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２４〜３９の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２４〜４０の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４２）
ヘムがＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目２４〜４１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目２４〜４２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目４３記載の医薬組成物。
（項目４５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目４３及び４４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ安定性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目２４〜４５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、ＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目２４〜４６の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
よりなる群から選択される項目２４〜４７の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目４９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目２４〜４８の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目５０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目４９記載の医薬組成物。
（項目５１）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目５０記載の医薬組成物。
（項目５２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目２４〜４８の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目５３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目５２記載の医薬組成物。
（項目５４）
酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目２４〜５３の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目５５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白を含む１つ以上のリポソーム又はナノ粒子を含む項目２４〜５４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目５６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目２４〜５５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目５７）
（ｉ）製薬上許容しうる量のＨ−ＮＯＸ蛋白であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満であり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈではない、Ｈ−ＮＯＸ蛋白、及び（ｉｉ）製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物。
（項目５８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目５７記載の医薬組成物。
（項目５９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目５７及び５８記載の医薬組成物。
（項目６０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目５９記載の医薬組成物。
（項目６１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭである項目５９記載の医薬組成物。
（項目６２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である項目５７〜６１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目６３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目６２記載の医薬組成物。
（項目６４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目６３記載の医薬組成物。
（項目６５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が約１．０ｓ−１未満である項目５７〜６４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目６６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目５７〜６５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目６７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目５７〜６６の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目６８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目６７記載の医薬組成物。
（項目６９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目５７〜６８の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目５７〜６９の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目５７〜７０の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目５７〜７１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目５７〜７２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目５７〜７３の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目５７〜７４の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７６）
ヘムがＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目５７〜７５の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目５７〜７６の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目７８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目７７記載の医薬組成物。
（項目７９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目７７及び７８の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ安定性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目５７〜７９の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、ＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目５７〜８０の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 よりなる群から選択される項目５７〜８１の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目５７〜８２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目８３記載の医薬組成物。
（項目８５）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目８４記載の医薬組成物。
（項目８６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目５７〜８２の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目８６記載の医薬組成物。
（項目８８）
酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目５７〜８７の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目８９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白を含む１つ以上のリポソーム又はナノ粒子を含む項目５７〜８８の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目９０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目５７〜８９の何れか１項に記載の医薬組成物。
（項目９１）
個体に酸素の有効量を送達するために十分な量で、Ｈ−ＮＯＸ蛋白を酸素送達の必要な個体に投与することを含む個体に酸素を送達する方法であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である、方法。
（項目９２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭである項目９１記載の方法。
（項目９３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約８０ｎＭ未満である項目９１記載の方法。
（項目９４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである項目９３記載の方法。
（項目９５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目９１〜９４の何れか１項に記載の方法。
（項目９６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目９５記載の方法。
（項目９７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目９１〜９６の何れか１項に記載の方法。
（項目９８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目９７記載の方法。
（項目９９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１である項目９１〜９６の何れか１項に記載の方法。
（項目１００）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が空気中４℃で安定である項目９１〜９９の何れか１項に記載の方法。
（項目１０１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目９１〜１００の何れか１項に記載の方法。
（項目１０２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目９１〜１００の何れか１項に記載の方法。
（項目１０３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目１０２記載の方法。
（項目１０４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目１０２及び１０３の何れか１項に記載の方法。
（項目１０５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目９１〜１０４の何れか１項に記載の方法。
（項目１０６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 よりなる群から選択される項目９１〜１０５の何れか１項に記載の方法。
（項目１０７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目９１〜１０６の何れか１項に記載の方法。
（項目１０８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目１０７記載の方法。
（項目１０９）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目１０８記載の方法。
（項目１１０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目９１〜１０６の何れか１項に記載の方法。
（項目１１１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目１１０記載の方法。
（項目１１２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が個体の血液に投与される項目９１〜１１１の何れか１項に記載の方法。
（項目１１３）
個体がヒトである項目９１〜１１２の何れか１項に記載の方法。
（項目１１４）
個体が失血に罹患している、又はその危険性がある項目９１〜１１３の何れか１項に記載の方法。
（項目１１５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも２回個体に投与される項目９１〜１１４の何れか１項に記載の方法。
（項目１１６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目９１〜１１５の何れか１項に記載の方法。
（項目１１７）
個体に酸素の有効量を送達するために十分な量でＨ−ＮＯＸ蛋白を酸素送達の必要な個体に投与することを含む個体に酸素を送達する方法であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である、方法。
（項目１１８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目１１７記載の方法。
（項目１１９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目１１８記載の方法。
（項目１２０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭである項目１１８記載の方法。
（項目１２１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である項目１１７〜１２０の何れか１項に記載の方法。
（項目１２２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目１２１記載の方法。
（項目１２３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目１２２記載の方法。
（項目１２４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が約１．０ｓ−１未満である項目１１７〜１２３の何れか１項に記載の方法。
（項目１２５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目１１７〜１２３の何れか１項に記載の方法。
（項目１２６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目１１７〜１２５の何れか１項に記載の方法。
（項目１２７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目１２６記載の方法。
（項目１２８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目１１７〜１２７の何れか１項に記載の方法。
（項目１２９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目１１７〜１２８の何れか１項に記載の方法。
（項目１３０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目１１７〜１２９の何れか１項に記載の方法。
（項目１３１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目１１７〜１３０の何れか１項に記載の方法。
（項目１３２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目１１７〜１３１の何れか１項に記載の方法。
（項目１３３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目１１７〜１３２の何れか１項に記載の方法。
（項目１３４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目１１７〜１３３の何れか１項に記載の方法。
（項目１３５）
ヘムがＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目１１７〜１３４の何れか１項に記載の方法。
（項目１３６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目１１７〜１３５の何れか１項に記載の方法。
（項目１３７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目１３６記載の方法。
（項目１３８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目１３５及び１３６の何れか１項に記載の方法。
（項目１３９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、及び／又はＮＯ安定性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目１１７〜１３８の何れか１項に記載の方法。
（項目１４０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
よりなる群から選択される項目１１７〜１３９の何れか１項に記載の方法。
（項目１４１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目１１７〜１４０の何れか１項に記載の方法。
（項目１４２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目１４１記載の方法。
（項目１４３）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目１４２記載の方法。
（項目１４４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目１１７〜１４３の何れか１項に記載の方法。
（項目１４５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目１４４記載の方法。
（項目１４６）
個体にＨ−ＮＯＸ蛋白を投与する前にＨ−ＮＯＸ蛋白に酸素が結合する項目１１７〜１４５の何れか１項に記載の方法。
（項目１４７）
個体にＨ−ＮＯＸ蛋白を投与する前にＨ−ＮＯＸ蛋白に酸素が結合せず、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白が個体内の１つの箇所から個体内の別の箇所に酸素を輸送する項目１１７〜１４５の何れか１項に記載の方法。
（項目１４８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が個体の血液、低酸素組織又は低酸素臓器に投与される項目１１７〜１４７の何れか１項に記載の方法。
（項目１４９）
個体がヒトである項目１１７〜１４８の何れか１項に記載の方法。
（項目１５０）
個体が心臓血管疾患、出血性ショック、血液希釈又は失血に罹患しているかその危険性のある項目１１７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
（項目１５１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも２回個体に投与される項目１１７〜１５０の何れか１項に記載の方法。
（項目１５２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目１１７〜１５１の何れか１項に記載の方法。
（項目１５３）
個体に酸素の有効量を送達するために十分な量でＨ−ＮＯＸ蛋白を酸素送達の必要な個体に投与することを含む個体に酸素を送達する方法であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈではない、方法。
（項目１５４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目１５３記載の方法。
（項目１５５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目１５３及び１５４記載の方法。
（項目１５６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目１５５記載の方法。
（項目１５７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭである項目１５５記載の方法。
（項目１５８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である項目１５３〜１５７の何れか１項に記載の方法。
（項目１５９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目１５８記載の方法。
（項目１６０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目１５９記載の方法。
（項目１６１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が約１．０ｓ−１未満である項目１５３〜１６０の何れか１項に記載の方法。
（項目１６２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目１５３〜１６１の何れか１項に記載の方法。
（項目１６３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目１５３〜１６１の何れか１項に記載の方法。
（項目１６４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目１６３記載の方法。
（項目１６５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目１５３〜１６４の何れか１項に記載の方法。
（項目１６６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目１５３〜１６５の何れか１項に記載の方法。
（項目１６７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目１５３〜１６６の何れか１項に記載の方法。
（項目１６８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目１５３〜１６７の何れか１項に記載の方法。
（項目１６９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目１５３〜１６８の何れか１項に記載の方法。
（項目１７０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目１５３〜１６９の何れか１項に記載の方法。
（項目１７１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目１５３〜１７０の何れか１項に記載の方法。
（項目１７２）
ヘムがＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目１５３〜１７１の何れか１項に記載の方法。
（項目１７３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目１５３〜１７２の何れか１項に記載の方法。
（項目１７４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目１７３記載の方法。
（項目１７５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目１７３及び１７４の何れか１項に記載の方法。
（項目１７６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ安定性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目１５３〜１７５の何れか１項に記載の方法。
（項目１７７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型蛋白と比較してＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目１５３〜１７６の何れか１項に記載の方法。
（項目１７８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
よりなる群から選択される項目１５３〜１７７の何れか１項に記載の方法。
（項目１７９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目１５３〜１７８の何れか１項に記載の方法。
（項目１８０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目１７９記載の方法。
（項目１８１）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目１８０記載の方法。
（項目１８２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目１５３〜１７８の何れか１項に記載の方法。
（項目１８３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目１８２記載の方法。
（項目１８４）
個体にＨ−ＮＯＸ蛋白を投与する前にＨ−ＮＯＸ蛋白に酸素が結合する項目１５３〜１８３の何れか１項に記載の方法。
（項目１８５）
個体にＨ−ＮＯＸ蛋白を投与する前にＨ−ＮＯＸ蛋白に酸素が結合せず、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白が個体内の１つの箇所から個体内の別の箇所に酸素を輸送する項目１５３〜１８３の何れか１項に記載の方法。
（項目１８６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が個体の血液、低酸素組織又は低酸素臓器に投与される項目１５３〜１８５の何れか１項に記載の方法。
（項目１８７）
個体がヒトである項目１５３〜１８６の何れか１項に記載の方法。
（項目１８８）
個体が心臓血管疾患、出血性ショック、血液希釈又は失血に罹患しているかその危険性のある項目１５３〜１８７の何れか１項に記載の方法。
（項目１８９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも２回個体に投与される項目１５３〜１８８の何れか１項に記載の方法。
（項目１９０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目１５３〜１８９の何れか１項に記載の方法。
（項目１９１）
（ｉ）製薬上許容しうる量のＨ−ＮＯＸ蛋白であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である、Ｈ−ＮＯＸ蛋白、及び（ｉｉ）製薬上許容しうる担体を含むキット。
（項目１９２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭである項目１９１記載のキット。
（項目１９３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約８０ｎＭ未満である項目１９１記載のキット。
（項目１９４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである項目１９３記載のキット。
（項目１９５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目１９１〜１９５記載の何れか１項に記載のキット。
（項目１９６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目１９５記載のキット。
（項目１９７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目１９３〜１９６の何れか１項に記載のキット。
（項目１９８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目１９７記載のキット。
（項目１９９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１である項目１９１〜１９６の何れか１項に記載のキット。
（項目２００）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が空気中４℃で安定である項目１９１〜１９９の何れか１項に記載のキット。
（項目２０１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目１９１〜２００の何れか１項に記載のキット。
（項目２０２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目１９１〜２００の何れか１項に記載のキット。
（項目２０３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目２０２記載のキット。
（項目２０４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目２０２及び２０３の何れか１項に記載のキット。
（項目２０５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目１９１〜２０４の何れか１項に記載のキット。
（項目２０６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 よりなる群から選択される項目１９１〜２０５の何れか１項に記載のキット。
（項目２０７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目１９１〜２０６の何れか１項に記載のキット。
（項目２０８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目２０７記載のキット。
（項目２０９）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目２０８記載のキット。
（項目２１０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目１９１〜２０６の何れか１項に記載のキット。
（項目２１１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目２１０記載のキット。
（項目２１２）
酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目１９１〜２１１の何れか１項に記載のキット。
（項目２１３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目１９１〜２１２の何れか１項に記載のキット。
（項目２１４）
（ｉ）Ｈ−ＮＯＸ蛋白であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満であるＨ−ＮＯＸ蛋白、及び（ｉｉ）個体に酸素を送達するためのキットを使用するための説明書を含むキット。
（項目２１５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目２１４記載のキット。
（項目２１６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目２１５記載のキット。
（項目２１７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭである項目２１４記載のキット。
（項目２１８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である項目２１４〜２１７の何れか１項に記載のキット。
（項目２１９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目２１８記載のキット。
（項目２２０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目２１９記載のキット。
（項目２２１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が約１．０ｓ−１未満である項目２１４〜２２０の何れか１項に記載のキット。
（項目２２２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目２１４〜２２１の何れか１項に記載のキット。
（項目２２３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目２１４〜２２２の何れか１項に記載のキット。
（項目２２４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目２２３記載のキット。
（項目２２５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２１４〜２２４の何れか１項に記載のキット。
（項目２２６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目２１４〜２２５の何れか１項に記載のキット。
（項目２２７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２１４〜２２６の何れか１項に記載のキット。
（項目２２８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２１４〜２２７の何れか１項に記載のキット。
（項目２２９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２１４〜２２８の何れか１項に記載のキット。
（項目２３０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２１４〜２２９の何れか１項に記載のキット。
（項目２３１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２１４〜２３０の何れか１項に記載のキット。
（項目２３２）
ヘムがＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目２１４〜２３１の何れか１項に記載のキット。
（項目２３３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目２１４〜２３２の何れか１項に記載のキット。
（項目２３４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目２３３記載のキット。
（項目２３５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目２３３及び２３４の何れか１項に記載のキット。
（項目２３６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、及び／又はＮＯ安定性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目２１４〜２３５の何れか１項に記載のキット。
（項目２３７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較してＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目２１４〜２３６の何れか１項に記載のキット。
（項目２３８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337
りなる群から選択される項目２１４〜２３７の何れか１項に記載のキット。
（項目２３９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目２１４〜２３８の何れか１項に記載のキット。
（項目２４０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目２３９記載のキット。
（項目２４１）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目２４０記載のキット。
（項目２４２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目２１４〜２３８の何れか１項に記載のキット。
（項目２４３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目２４２記載のキット。
（項目２４４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白に酸素が結合する項目２１４〜２４３の何れか１項に記載のキット。
（項目２４５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目２１４〜２４４の何れか１項に記載のキット。
（項目２４６）
（ｉ）Ｈ−ＮＯＸ蛋白であって、ここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０ＨではないＨ−ＮＯＸ蛋白、及び（ｉｉ）個体に酸素を送達するためのキットを使用するための説明書を含むキット。
（項目２４７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目２４６記載のキット。
（項目２４８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目２４６及び２４７記載のキット。
（項目２４９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目２４８記載のキット。
（項目２５０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭである項目２４８記載のキット。
（項目２５１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である項目２４６〜２５０の何れか１項に記載のキット。
（項目２５２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目２５１記載のキット。
（項目２５３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目２５２記載のキット。
（項目２５４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が約１．０ｓ−１未満である項目２４６〜２５３の何れか１項に記載のキット。
（項目２５５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目２４６〜２５４の何れか１項に記載のキット。
（項目２５６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目２４６〜２５４の何れか１項に記載のキット。
（項目２５７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目２５６記載のキット。
（項目２５８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２４６〜２５７の何れか１項に記載のキット。
（項目２５９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である項目２４６〜２５８の何れか１項に記載のキット。
（項目２６０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２４６〜２５９の何れか１項に記載のキット。
（項目２６１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２４６〜２６０の何れか１項に記載のキット。
（項目２６２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２４６〜２６１の何れか１項に記載のキット。
（項目２６３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２４６〜２６２の何れか１項に記載のキット。
（項目２６４）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約１．８ｓ−１未満である項目２４６〜２６３の何れか１項に記載のキット。
（項目２６５）
ヘムがＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目２４６〜２６４の何れか１項に記載のキット。
（項目２６６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が変異体蛋白である項目２４６〜２６５の何れか１項に記載のキット。
（項目２６７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目２６６記載のキット。
（項目２６８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目２６６及び２６７の何れか１項に記載のキット。
（項目２６９）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型の蛋白と比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、及び／又はＮＯ安定性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目２４６〜２６８の何れか１項に記載のキット。
（項目２７０）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が対応する野生型蛋白と比較してＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む項目２４６〜２６９の何れか１項に記載のキット。
（項目２７１）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が
Figure 2017137337
Figure 2017137337

よりなる群から選択される項目２４６〜２７０の何れか１項に記載のキット。
（項目２７２）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白であるか、又は哺乳類蛋白由来である項目２４６〜２７１の何れか１項に記載のキット。
（項目２７３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白であるか、又はヒト蛋白由来である項目２７２記載のキット。
（項目２７４）
ヒト蛋白がβ１又はβ１由来である項目２７３記載のキット。
（項目２７５）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白又は細菌蛋白由来である項目２４６〜２７１の何れか１項に記載のキット。
（項目２７６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白又はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白由来である項目２７５記載のキット。
（項目２７７）
酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する項目２４６〜２７６の何れか１項に記載のキット。
（項目２７８）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白が項目２７９〜３９７の何れか１項に記載の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白である項目２４６〜２７７の何れか１項に記載のキット。
（項目２７９）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白と比較してＯ２解離定数又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白であって、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここで変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、又はＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙではない、単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない項目２７９記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭである項目２７９及び２８０の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目２８１記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭである項目２８２記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８４）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１５０ｎＭ〜約１μＭである項目２８３記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎμＭである項目２７９〜２８３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約８０ｎＭ未満である項目２７９〜２８３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８７）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである項目２８６記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８８）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目２７９〜２８７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２８９）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目２８８記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２７９〜２８９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１である項目２７９〜２９０の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１である項目２７９〜２９１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２７９〜２９２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９４）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目２７９〜２９３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２７９〜２９４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目２７９〜２９５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９７）
少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目２７９〜２９６の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９８）
遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目２７９〜２９７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目２９９）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５に対応する残基が何れかの他のアミノ酸で置き換えられている少なくとも１つの変異を含む項目２７９〜２９８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３００）
少なくとも１つの変異はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５に対応する残基の何れかの他のアミノ酸による置き換えである、少なくとも２つの変異を含む項目２７９〜２９９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０１）
変異がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＩ５Ａ変異、Ｉ５Ｌ変異、Ｗ９Ｆ変異、Ｙ１４０Ｈ変異、又はＦ７８ＹＹ１４０Ｆ二重変異に対応する項目２７９〜３００の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０２）
変異がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＷ９Ｙ変異、Ｗ９Ｈ変異、Ｗ９Ｎ変異、Ｎ７４Ｈ変異、Ｎ７４Ａ変異、Ｐ１１５Ａ変異、Ｒ１３５Ｑ然変異、Ｉ５ＬＰ１１５Ａ二重変異、又はＷ９ＦＮ７４Ａ二重変異に対応する項目２７９〜３０１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０３）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白である項目２７９〜３０２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０４）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白である項目３０３記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０５）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がβ１である項目３０４記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０６）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白である項目２７９〜３０２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０７）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白である項目３０６記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０８）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない項目２７９〜３０７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３０９）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目２７９〜３０８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が別の分子又は部分に共有結合している項目２７９〜３０９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がポリエチレングリコールに共有結合している項目３１０記載の単離されたＨ−ＮＯＸ。
（項目３１２）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白と比較してＯ２解離定数又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白であって、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここで変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、又はＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙではない、単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない項目３１２記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１４）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎμＭである項目３１２及び３１３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約８０ｎＭ未満である項目３１２及び３１３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである項目３１５記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１７）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目３１２〜３１６の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１８）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目３１７記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３１９）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目３１２〜３１８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目３１９記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１である項目３１２〜３１８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約５．８ｓ−１〜約１９ｓ−１である項目３１２〜３１８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が空気中４℃で安定である項目３１２〜３２２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２４）
少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目３１２〜３２３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２５）
遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目３１２〜３２４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２６）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５に対応する残基が何れかの他のアミノ酸で置き換えられている少なくとも１つの変異を含む項目３１２〜３２５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２７）
少なくとも１つの変異はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｈｅ７８、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５に対応する残基の何れかの他のアミノ酸による置き換えである、少なくとも２つの変異を含む項目３１２〜３２６の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２８）
変異がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＩ５Ａ変異、Ｉ５Ｌ変異、Ｙ１４０Ｈ変異、又はＦ７８ＹＹ１４０Ｆ二重変異に対応する項目３１２〜３２７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３２９）
変異がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＷ９Ｙ変異、Ｗ９Ｈ変異、Ｗ９Ｎ変異、Ｎ７４Ｈ変異、Ｎ７４Ａ変異、Ｐ１１５Ａ変異、Ｒ１３５Ｑ然変異、Ｉ５ＬＰ１１５Ａ二重変異、又はＷ９ＦＮ７４Ａ二重変異に対応する項目３１２〜３２８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３０）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白である項目３１２〜３２９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３１）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白である項目３３０記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３２）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がβ１である項目３３１記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３３）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白である項目３１２〜３３２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３４）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白である項目３３３記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目３１２〜３３４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が別の分子又は部分に共有結合している項目３１２〜３３５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３７）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がポリエチレングリコールに共有結合している項目３３６記載の単離されたＨ−ＮＯＸ。
（項目３３８）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白と比較して酸素に関するｋｏｆｆ又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白であって、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１であり、そしてここで変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、又はＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙではない、単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３３９）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない項目３３８記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下である項目３３８及び３３９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目３４０記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃において約１ｎＭ〜約１ｍＭである項目３３８〜３４１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃において約２ｎＭ〜約５０μＭである項目３３８〜３４２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４４）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃において約５０ｎＭ〜約１０μＭである項目３３８〜３４３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃において約１００ｎＭ〜約１．９μＭである項目３３８〜３４４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目３３８〜３４５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４７）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目３４６記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４８）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目３３８〜３４７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３４９）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目３３８〜３４８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目３３８〜３４９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目３３８〜３５０の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目３３８〜３５１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５３）
少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目３３８〜３５２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５４）
遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目３３８〜３５３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５５）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５又はβ１（１−３８５）のＩ１４５に対応する残基が何れかの他のアミノ酸で置き換えられている少なくとも１つの変異を含む項目３３８〜３５４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５６）
少なくとも１つの変異がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５又はβ１（１−３８５）のＩ１４５に対応する残基の何れかの他のアミノ酸による置き換えである、少なくとも２つの変異を含む項目３３８〜３５５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５７）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＩ５Ａ変異、Ｉ５Ｌ変異、Ｗ９Ｆ変異、Ｙ１４０−Ｆ変異、Ｙ１４０Ｈ変異、Ｗ９ＦＷ１４０Ｈ二重変異、又はＦ７８ＹＹ１４０Ｆ二重変異又はβ１のＩ１４５Ｙ変異に対応する変異を含む項目３３８〜３５６の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５８）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＷ９Ｙ変異、Ｗ９Ｈ変異、Ｗ９Ｎ変異、Ｎ７４Ｈ変異、Ｎ７４Ｅ変異、Ｎ７４Ａ変異、Ｐ１１５Ａ変異、Ｒ１３５Ｑ変異、Ｉ５ＬＰ１１５Ａ二重変異、Ｎ７４ＡＹ１４０Ｈ二重変異、又はＷ９ＦＮ７４Ａ二重変異に対応する変異を含む項目３３８〜３５７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３５９）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白である項目３３８〜３５８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６０）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白である項目３５９記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６１）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がβ１である項目３６０記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６２）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白である項目３３８〜３６１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６３）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白である項目３６２記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６４）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１８ｓ−１である項目３３８〜３６３記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない項目３３８〜３６４記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目３３８〜３６５記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６７）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が別の分子又は部分に共有結合している項目３３８〜３６６記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６８）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がポリエチレングリコールに共有結合している項目３６７記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３６９）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白と比較して酸素に関するｋｏｆｆ又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白であって、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．６５ｓ−１以下であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である、単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７０）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＨ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない項目３６９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である項目３６９及び３７０の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃において約１００ｎＭ〜約１．９μＭである項目３６９〜３７１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値である項目３６９〜３７２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７４）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である項目３７３記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７５）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目３６９〜３７４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７６）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目３６９〜３７５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７７）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である項目３６９〜３７６の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７８）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数が２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が０．７ｓ−１未満である項目３６９〜３７７の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３７９）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性が２０℃で約７００ｓ−１未満である項目３６９〜３７８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８０）
少なくとも１つの遠位ポケット変異を含む項目３６９〜３７９の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８１）
遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を含む項目３６９〜３８０の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８２）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５に対応する残基が何れかの他のアミノ酸で置き換えられている少なくとも１つの変異を含む項目３６９〜３８１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８３）
少なくとも１つの変異はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｈｅ７８、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５に対応する残基の何れかの他のアミノ酸による置き換えである、少なくとも２つの変異を含む項目３６９〜３８２の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８４）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩ５Ａ変異に対応する変異を含む項目３６９〜３８３の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８５）
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＮ７４Ｈ変異、Ｍ７４Ｅ変異、Ｎ７４Ａ変異、Ｐ１１５Ａ変異、又はＩ５Ｌ変異に対応する変異を含む項目３６９〜３８４の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８６）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が哺乳類蛋白である項目３６９〜３８５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８７）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヒト蛋白である項目３８６記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８８）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がβ１である項目３８７記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３８９）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白が細菌蛋白である項目３６９〜３８８の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９０）
対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白である項目３８９記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９１）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙではない項目３６９〜３９０の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９２）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が別の分子又は部分に共有結合している項目３６９〜３９１の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９３）
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白がポリエチレングリコールに共有結合している項目３９２記載の単離されたＨ−ＮＯＸ。
（項目３９４）
Figure 2017137337
よりなる群から選択される単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９５）
Figure 2017137337

よりなる群から選択される単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９６）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数がＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの２桁内である項目２７９〜３９５の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９７）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１０倍低値である項目２７９〜３９６の何れか１項に記載の単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白。
（項目３９８）
項目２７９〜３９７の何れか１項に記載のＨ−ＮＯＸ蛋白をコードする組み換え核酸。
（項目３９９）
項目３９８の核酸を含むベクター。
（項目４００）
項目３９８の核酸を含む細胞。
（項目４０１）
項目３９９のベクターを含む細胞。
（項目４０２）
蛋白の産生のために適する条件下において項目２７９〜３９７の何れか１項に記載ののＨ−ＮＯＸ蛋白をコードする核酸を含む細胞を培養することを含むＨ−ＮＯＸ蛋白の産生方法。
（項目４０３）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白を精製する工程を更に含む項目４０２の方法。
１つの特徴において、本発明は変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。従って、一部の実施形態においては、本発明は対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白のものと比較してＯ２解離定数又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を有する単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を提供する。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭ、２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭ、２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭ、２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、２０℃で約１５０ｎＭ〜約１μＭ、又は２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭである。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約８０ｎＭ未満、例えば２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１００倍低値、例えばヘモグロビンのものより少なくとも１０００倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満、例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、又は０．６ｓ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１、例えば約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１であり、そして、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆが２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１であり、そして、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そして、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。
一部の実施形態においては、本発明は対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白のものと比較して酸素に関するｋｏｆｆ又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を有する単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃で約０．６５ｓ−１以下（例えば２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１）の酸素に関するｋｏｆｆを有する。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白から誘導され、そして２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１８ｓ−１の酸素に関するｋｏｆｆを有する。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものよりも少なくとも１００倍低値、例えばヘモグロビンのものよりも少なくとも１０００倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満、例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、又は０．６ｓ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭ、２０℃で約２ｎＭ〜約５０μＭ、２０℃で約５０ｎＭ〜約１０μＭ、又は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭである。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。
種々の実施形態において、野生型の蛋白のものと比較して、Ｏ２解離定数又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を含む単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭである。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約８０ｎＭ未満、例えば２０℃で約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１００倍低値、例えばヘモグロビンのものより少なくとも１０００倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃で約０．６５ｓ−１以下（例えば２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１）の酸素に関するｋｏｆｆを有する。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約５．８ｓ−１〜約１９ｓ−１である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は空気中４℃で安定である。
一部の実施形態において、本発明は対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白のものと比較して酸素に関するｋｏｆｆ又はＮＯ反応性を改変する少なくとも１つの変異を有する単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．６５ｓ−１以下であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性がヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１００倍低値、例えばヘモグロビンのものより少なくとも１０００倍低値である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満、例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、又は０．６ｓ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭである。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１又は０．７未満）である。一部の実施形態においては、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満であり、そして変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１又は０．７未満）である。
種々の実施形態において、本発明は
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 よりなる群から選択される単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。一部の実施形態においては、β１又はβ２蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓのβ１又はβ２蛋白由来である。
種々の実施形態において、本発明は
Figure 2017137337
 よりなる群から選択される単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。一部の実施形態においては、β１又はβ２蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓのβ１又はβ２蛋白由来である。
単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの２桁内、例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの０．１〜１０倍又は０．５〜２倍のＯ２解離定数である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１０倍低値、例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１００倍又は１０００倍低値である。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はその誘導元のＨ−ＮＯＸ蛋白と比較して１以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０変異）を含有する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はその誘導元のＨ−ＮＯＸ蛋白と比較して２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２未満の変異を含有する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は少なくとも１つの遠位ポケット変異を有する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は遠位ポケットにはない少なくとも１つの変異を有する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５又はβ１（１−３８５）のＩ１４５に対応する残基が何れかの他のアミノ酸で置き換えられている少なくとも１つの変異を有する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は少なくとも２つの変異を有し、ここで変異の少なくとも１つがＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＩｌｅ５、Ｔｒｐ９、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１１５、又はＡｒｇ１３５又はβ１（１−３８５）のＩ１４５に対応する残基の何れかの他のアミノ酸による置き換えである。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白における変異はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＩ５Ａ変異、Ｉ５Ｌ変異、Ｗ９Ｆ変異、Ｙ１４０−Ｆ変異、Ｙ１４０Ｈ変異、Ｗ９ＦＷ１４０Ｈ二重変異、又はＦ７８ＹＹ１４０Ｆ二重変異又はβ１のＩ１４５Ｙ変異に相当する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白における変異はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＷ９Ｙ変異、Ｗ９Ｈ変異、Ｗ９Ｎ変異、Ｎ７４Ｈ変異、Ｎ７４Ｅ変異、Ｎ７４Ａ変異、Ｐ１１５Ａ変異、Ｒ１３５Ｑ変異、Ｉ５ＬＰ１１５Ａ二重変異、Ｎ７４ＡＹ１４０Ｈ二重変異、又はＷ９ＦＮ７４Ａ二重変異に対応する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＣ末端アミノ酸の少なくとも１つ（例えば少なくとも約５０連続Ｃ末端アミノ酸又は約２５〜約２００連続Ｃ末端アミノ酸）は対応する野生型蛋白と比較して除去されている。
単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は哺乳類蛋白（例えばヒト蛋白、例えばβ１）由来である。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は細菌蛋白（例えばＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ蛋白）由来である。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はポリエチレングリコールのような別の分子又は部分に共有結合している。ヘムはＨ−ＮＯＸ蛋白に結合してもしなくてもよい。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメインおよびアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）のような別の蛋白の部分又は全てを包含する融合蛋白である。
単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、又はＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）、又はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ１４０Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＨ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、自身の遺伝子名及びそれにひき続くそれらの種の略記及びゲンバンク識別子により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
Figure 2017137337
 の何れでもない（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎ等（２００３）、“Ａｎｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｈａｒｅｄ ｂｙ ａｎｉｍａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＢＭＧ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５−１３）。種の名称において使用するそれらの略記法は、Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎａｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを包含する。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、自身の生物名及びＰｆａｍデータベースアクセッション番号により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月１７日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
Figure 2017137337
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 の何れでもない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ Ｃ７８Ｓ又はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ Ｃ７８Ｅではない。単離されたＨ−ＮＯＸ蛋白の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、ヒトＨ−ＮＯＸのＴｙｒ１３５、Ｓｅｒ１３７、及びＡｒｇ１３９を包含するＹ−Ｓ−Ｒモチーフにおける変異を有さない。
１つの特徴において、本発明は本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の何れか１つ以上をコードする組み換え核酸を特徴とする。特定の実施形態においては、核酸は図２−４Ｄ又は８Ａ−８ＤＤに示す核酸の何れかの核酸配列のセグメント又は全体を包含する。一部の実施形態においては、核酸はＨ−ＮＯＸドメイン及びアルブミンのような別の蛋白の部分又は全てを包含する融合蛋白をコードする。一部の実施形態においては、核酸はＨ−ＮＯＸ核酸由来の少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又はそれより多い隣接したヌクレオチドを包含し、そしてその誘導元であるＨ−ＮＯＸ核酸と比較して１つ以上の変異（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０変異）を含有する。種々の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸はその誘導元であるＨ−ＮＯＸ核酸と比較して概ね２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２の何れかより少ない変異を含有する。本発明は又変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする何れかの核酸の編成変異体を特徴とする。
更に別の特徴において、本発明は、本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸の何れか１つ以上を包含するベクターを提供する。別の特徴において、本発明は、本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸の何れか１つ以上を包含する細胞を提供する。１つの特徴において、本発明は、本明細書に記載する何れかのベクターを包含する細胞を特徴とする。
１つの特徴において、本発明はＨ−ＮＯＸ蛋白を産生する方法を特徴とする。この方法は変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の産生に適する条件下で本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白何れか１つ以上をコードする核酸を有する細胞を培養することを包含する。一部の実施形態においては、本発明は更に変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白を精製する工程を包含する。
１つの特徴において、本発明は本明細書に記載した野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の何れかのようなＨ−ＮＯＸ蛋白１つ以上を包含する医薬組成物を特徴とする。一部の実施形態においては、医薬組成物は本明細書に記載する製薬上許容しうる量のＨ−ＮＯＸ蛋白及び製薬上許容しうる担体を包含する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約２０ｎＭ〜約２μＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化は速度が３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．０ｓ−１〜約１６．０ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。
一部の実施形態においては、本発明は製薬上許容しうる量のＨ−ＮＯＸ蛋白及び製薬上許容しうる担体を包含する医薬組成物を提供する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．０１ｓ−１〜約２００ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である。
医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの２桁内、例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの０．１〜１０倍又は０．５〜２倍のＯ２解離定数である。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１０倍低値、例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１００倍又は１０００倍低値である。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は野生型蛋白である。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は本明細書に記載した変異体蛋白である。医薬組成物の種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は対応する野生型の蛋白のものと比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性、又は上記のものの何れかの２つ以上を改変する少なくとも１つの変異を有する。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ５Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ５Ｌ−Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ−Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｙ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｎ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ｅ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ａ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＰ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＲ１３５Ｑ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＩ７５Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＩ７５Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＬ１４４Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＬ１４４Ｆ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｆ９Ｗ−Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＨ−ＮＯＸ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＨ−ＮＯＸ（７２８−８９９）、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＨ−ＮＯＸＹ１３９Ｌ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−３８５）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−１９４）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ２（１−２１７）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１７５）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１８６）、野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１９７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１８３）、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＨ−ＮＯＸＧＣＹ−３５（１−２５２）、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８６、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ４１５４、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｂ．ＴａｕｒｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；野生型Ｘ．ｌａｅｖｉｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｆ．ｒｕｂｒｉｐｅｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ａ．ｇａｍｂｉａｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｓｅｘｔａＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３２、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３３、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３４、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３５、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３６、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３７、野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＨ−ＮＯＸ、野生型Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉＨ−ＮＯＸ、及び野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸよりなる群から選択される。医薬組成物の一部の実施形態においては、医薬組成物はＨ−ＮＯＸ蛋白を包含又はカプセル化する１つ以上のリポソーム又はナノ粒子を包含する。
医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、又はＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）、又はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ１４０Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＨ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、自身の遺伝子名及びそれにひき続くそれらの種の略記及びゲンバンク識別子により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
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 の何れでもない（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎ等（２００３）、“Ａｎｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｈａｒｅｄ ｂｙ ａｎｉｍａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＢＭＧ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５−１３）。種の名称において使用するそれらの略記法は、Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎａｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを包含する。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ Ｃ７８Ｓ又はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ Ｃ７８Ｅではない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、自身の生物名及びＰｆａｍデータベースアクセッション番号により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月１７日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
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 の何れでもない。医薬組成物の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、ヒトＨ−ＮＯＸのＴｙｒ１３５、Ｓｅｒ１３７、及びＡｒｇ１３９を包含するＹ−Ｓ−Ｒモチーフにおける変異を有さない。
特段の記載が無い限り、又は文脈により推測されない限り、本明細書に記載した全ての野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白を本明細書に記載する医薬組成物の何れかにおいて使用してよい。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘム及び／又は酸素を結合状態で有していてもいなくてもよく、そしてポリエチレングリコールのような他の分子又は部分に共有結合していてもしていなくてもよい。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメインおよびアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）のような別の蛋白の部分又は全てを包含する融合蛋白である。
１つの特徴において、本発明はＨ−ＮＯＸ蛋白を用いながら個体（例えば哺乳類、例えば霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコ）に酸素を送達する方法を提供する。一部の実施形態においては、個体は心臓血管疾患、神経学的疾患、腫瘍低酸素、失血、又は創傷に罹患しているかその危険性を有する。例示される心臓血管の適応症は心筋梗塞（例えばＳＴ部分上昇心筋梗塞）、心臓麻痺、鎌状赤血球貧血、周術期の虚血、末梢血管閉塞、及び血管形成を包含する。例示される神経学的適応症は虚血性卒中、外傷性脳傷害、及び脊髄傷害を包含する。腫瘍低酸素の治療のためには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は例えば固形腫瘍（例えば不良な転移前予後を有する個体）における放射線療法アジュバントとして、又は、表面腫瘍（例えば結腸、肺、又は皮膚癌、又は他の接触可能な表面又は位置における癌）におけるＰＤＴ療法アジュバントとして使用できる。輸血代替物としてのＨ−ＮＯＸ蛋白の適用は、外傷（例えば戦地、災害救援、又は事故）、外科処置（例えば腹部動脈瘤手術、整形外科的手術、例えば腰骨置換手術、又は大量の失血をもたらす何れかの他の手術）、出血、出血性ショック、血液希釈、及び血液延長使用（例えば補給自己献血）を包含する。創傷修復用途の例は、放射線後の創傷の修復（例えば高圧酸素作用）、術後修復、糖尿病性潰瘍修復、及び熱傷を包含する。
従って、一部の実施形態においては、本発明は個体（例えばヒト）に酸素の有効量を送達するために十分な量のＨ−ＮＯＸ蛋白を酸素送達の必要な個体に投与することによる個体に酸素を送達する方法を提供する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてここでＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である。
方法の一部の実施形態においては、個体へのＨ−ＮＯＸ蛋白の投与の前に酸素がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する。方法の一部の実施形態においては、個体へのＨ−ＮＯＸ蛋白の投与の前には酸素はＨ−ＮＯＸ蛋白に結合せず、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白は個体内の１つの箇所から個体内の別の箇所に酸素を輸送する。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は個体の血液に投与される。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は個体の血液、創傷、腫瘍、低酸素組織、又は低酸素臓器に投与される。方法の一部の実施形態においては、個体は失血に罹患しているか、その危険性を有する。方法のｌ一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は少なくとも２回個体に投与される。
方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの２桁内、例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものの０．１〜１０倍又は０．５〜２倍のＯ２解離定数である。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１０倍低値、例えばＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビンアルファのものより少なくとも１００倍又は１０００倍低値である。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は野生型蛋白である。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は本明細書に記載した変異体蛋白である。方法の種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は対応する野生型の蛋白のものと比較して、Ｏ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、又は上記のものの何れかの２つ以上を改変する少なくとも１つの変異を有する。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ５Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ５Ｌ−Ｐ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ−Ｎ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｙ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｎ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ｅ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＮ７４Ａ−Ｙ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＰ１１５Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＲ１３５Ｑ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ａ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＩ７５Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＩ７５Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＬ１４４Ｆ−Ｈｉｓ６、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＬ１４４Ｆ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｆ９Ｗ−Ｆ１４２Ｙ、野生型Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＨ−ＮＯＸ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＨ−ＮＯＸ（７２８−８９９）、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＨ−ＮＯＸＹ１３９Ｌ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−３８５）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−１９４）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ２（１−２１７）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｈ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）Ｌ９Ｗ−Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）Ｉ１４２Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１７５）、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１８６）、野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１９７）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸ（１−１８３）、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＨ−ＮＯＸＧＣＹ−３５（１−２５２）、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８６、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ４１５４、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｂ．ＴａｕｒｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；野生型Ｘ．ｌａｅｖｉｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｆ．ｒｕｂｒｉｐｅｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ａ．ｇａｍｂｉａｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｍ．ｓｅｘｔａＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３２、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３３、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３４、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３５、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３６、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓｇｃｙ−３７、野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＨ−ＮＯＸ、野生型Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉＨ−ＮＯＸ、及び野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸよりなる群から選択される。方法の一部の実施形態においては、１つ以上のリポソーム又はナノ粒子がＨ−ＮＯＸ蛋白を包含又はカプセル化する。
方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、又はＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ２（１−２１７）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−１９４）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）、又はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙではない。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＩ１４０Ｈ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４０Ｙ、又はＨ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＦ７８Ｙ／Ｙ１４０Ｌ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＷ９Ｆ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｆ、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸＦ１４２Ｙ、野生型Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ２Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４０Ｙ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｉ１４５Ｙ、野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＨ−ＮＯＸ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸ（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｇ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＨ１０５Ｆ、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｓＧＣβ１Ｈ−ＮＯＸＩ１４５Ｙ、野生型Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５Ｈ−ＮＯＸ、野生型Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸ、野生型Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓＨ−ＮＯＸ、野生型Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ又は野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、自身の遺伝子名及びそれにひき続くそれらの種の略記及びゲンバンク識別子により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
Figure 2017137337
 の何れでもない（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎ等（２００３）、“Ａｎｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｈａｒｅｄ ｂｙ ａｎｉｍａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＢＭＧ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５−１３）。種の名称において使用するそれらの略記法は、Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ Ｓｐ；Ｃｅｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ
ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎａｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを包含する。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、自身の生物名及びＰｆａｍデータベースアクセッション番号により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月１７日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 ではない。方法の一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、ヒトＨ−ＮＯＸのＴｙｒ１３５、Ｓｅｒ１３７、及びＡｒｇ１３９を包含するＹ−Ｓ−Ｒモチーフにおける変異を有さない。
特段の記載が無い限り、又は文脈により推測されない限り、本明細書に記載した全ての野生型及び変異体の蛋白及び全ての医薬組成物は本明細書に記載する酸素を送達する方法の何れかにおいて使用してよい。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘム及び／又は酸素を結合状態で有していてもいなくてもよく、そしてポリエチレングリコールのような他の分子又は部分に共有結合していてもしていなくてもよい。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメインおよびアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）のような別の蛋白の部分又は全てを包含する融合蛋白である。
１つの特徴において、本発明はＨ−ＮＯＸ蛋白１つ以上を包含するキットを特徴とする。一部の実施形態においては、本発明はＨ−ＮＯＸ蛋白及び個体に酸素を送達するためにキットを使用するための説明書を包含するキットを提供する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数はヘモグロビンのものの２桁内であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性はヘモグロビンのものより少なくとも１０倍低値である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭであり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈではない。特段の記載が無い限り、又は文脈により推測されない限り、本明細書に記載した全ての野生型及び変異体の蛋白及び全ての医薬組成物は本明細書に記載するキットの何れかにおいて使用してよい。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘム及び／又は酸素を結合状態で有していてもいなくてもよく、そしてポリエチレングリコールのような他の分子又は部分に共有結合していてもしていなくてもよい。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメインおよびアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）のような別の蛋白の部分又は全てを包含する融合蛋白である。
１つの特徴において、本発明は医薬として使用するためのＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば本明細書に記載した野生型又は変異体の蛋白の何れか）を特徴とする。一部の実施形態においては、本発明は個体に酸素を送達する方法において使用するためのＨ−ＮＯＸ蛋白を特徴とする。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＯ２の送達が有利である何れかの状態、例えば心臓血管疾患、神経学的疾患、腫瘍低酸素、失血又は創傷を治療するために使用される。
一部の実施形態においては本発明は個体に酸素を送達するための医薬のような医薬の産生のためのＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば本明細書に記載した野生型又は変異体の蛋白の何れか）の使用を特徴とする。一部の実施形態においては、本発明は個体に酸素を送達するためのＨ−ＮＯＸ蛋白の使用を特徴とする。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＯ２の送達が有利である何れかの状態、例えば心臓血管疾患、神経学的疾患、腫瘍低酸素、失血又は創傷を治療するために使用される。
図１ＡはＮＯ結合及びＯ２結合Ｈ−ＮＯＸ蛋白の遠位ポケット残基の三次元構造の写真である（ヘム上）。ＮＯ結合及びＯ２結合Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム配位残基も示す（ヘム下）。図１ＡはＰｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．等（２００４年８月３１日）、“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３５）：１２８５４−１２８５９により報告されたＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ蛋白の三次元構造に基づいている。 図１ＢはＨ−ＮＯＸ蛋白の構造的特徴を示すＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸの三次元構造の立体側面図である。蛋白の折り畳みはリボンダイヤグラムで示す。ヘム、２酸素リガンド、及び近位のヒスチジンはボールアンドスティックモデルとして示す。α−へリックスは図５Ｂに示す命名法に従ってＡ−Ｇ標記する。β鎖は１−４標示する。図１ＢはＰｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．等（２００４年８月３１日）、“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３５）：１２８５４−１２８５９によるものである。 図１ＣはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ中の例示される遠位ポケット残基を示すＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸの三次元構造の図である。図１Ｃ〜１Ｈに示す以下の残基がＨ−ＮＯＸ遠位ポケットを含む主要な残基、即ち：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、及びＬｅｕ１４４であり、これらはヘリックスＡ、Ｄ、Ｅ及びＧ内に含有される。図１Ｃ〜１ＨはＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬＬＰ）を用いて作成した。 図２はＯ２及びＮＯに結合するか、結合することが予測される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１）；Ｃｅ．ｇｃｙ−３１（配列番号２）；Ｃｅ．ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃｅ．ｇｃｙ−３５（配列番号４）；Ｄｍ．ＣＧ１４８８５ＨＮＯＸ（配列番号５）；Ｄｍ．ＣＧ４１５４ＨＮＯＸ（配列番号６）；Ｍｓ．Ｂｅｔａ３ＨＮＯＸ（配列番号７）：ＴｔＨＮＯＸ（配列番号８）；及びＣａＨＮＯＸ（配列番号９）である。これらのＨ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＹ１４０に相当する位置においてチロシンを有することから、Ｏ２及びＮＯに結合すると予測される。図２中で使用するアミノ酸のナンバリングは残基番号１としてＨ−ＮＯＸドメイン又は完全長蛋白中の第１のアミノ酸から開始する。このアライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図２中で使用した略記法は図４Ａ〜４Ｄに関して以下に記載する通りである。 図３Ａ〜３ＤはＯ２及びＮＯに結合するか、結合することが予測される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；及びＳｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図３Ａ〜３Ｄ中で使用した略記法は図４に関して以下に記載する通りである。 図３Ａ〜３ＤはＯ２及びＮＯに結合するか、結合することが予測される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；及びＳｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図３Ａ〜３Ｄ中で使用した略記法は図４に関して以下に記載する通りである。 図３Ａ〜３ＤはＯ２及びＮＯに結合するか、結合することが予測される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；及びＳｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図３Ａ〜３Ｄ中で使用した略記法は図４に関して以下に記載する通りである。 図３Ａ〜３ＤはＯ２及びＮＯに結合するか、結合することが予測される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１５）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９（配列番号１９）；Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２（配列番号２０）；Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号２１）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１（配列番号２４）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；及びＳｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋（配列番号２６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図３Ａ〜３Ｄ中で使用した略記法は図４に関して以下に記載する通りである。 図４Ａ〜４Ｄは図２及び３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ｓＧＣベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ．ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ベータ１ＨＤ様（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白（配列番号７）：ＣＧ１４８８５（配列番号５）；及びＤｍ．ｓＧＣ短鎖変異体（配列番号６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図２〜４Ｄ中、「Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｓＧＣベータ１蛋白」とはＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ベータ２蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ２Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様」とはＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」とはＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」とはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」とはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」とはＯｒｙｚｉａｓ ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」とはＯｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」とはＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋」とはＳｕｓ ｓｃｒｏｆａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３１ａ」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３１ａＨ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３３」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３５」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」とはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔ．ベータ１ＨＤ様」とはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸを指し；「Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白」とはＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａβ３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ＣＧ１４８８５」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短鎖変異体」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＧｃｙ−８８−Ｅ−ＳＨ−ＮＯＸを指し；そして「Ｄｍ．ＣＧ４１５４ＨＮＯＸ」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ４１５４Ｈ−ＮＯＸを指す。 図４Ａ〜４Ｄは図２及び３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ｓＧＣベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ．ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ベータ１ＨＤ様（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白（配列番号７）：ＣＧ１４８８５（配列番号５）；及びＤｍ．ｓＧＣ短鎖変異体（配列番号６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図２〜４Ｄ中、「Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｓＧＣベータ１蛋白」とはＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ベータ２蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ２Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様」とはＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」とはＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」とはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」とはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」とはＯｒｙｚｉａｓ ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」とはＯｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」とはＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋」とはＳｕｓ ｓｃｒｏｆａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３１ａ」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３１ａＨ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３３」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３５」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」とはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔ．ベータ１ＨＤ様」とはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸを指し；「Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白」とはＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａβ３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ＣＧ１４８８５」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短鎖変異体」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＧｃｙ−８８−Ｅ−ＳＨ−ＮＯＸを指し；そして「Ｄｍ．ＣＧ４１５４ＨＮＯＸ」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ４１５４Ｈ−ＮＯＸを指す。 図４Ａ〜４Ｄは図２及び３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ｓＧＣベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ．ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ベータ１ＨＤ様（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白（配列番号７）：ＣＧ１４８８５（配列番号５）；及びＤｍ．ｓＧＣ短鎖変異体（配列番号６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図２〜４Ｄ中、「Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｓＧＣベータ１蛋白」とはＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ベータ２蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ２Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様」とはＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」とはＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」とはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」とはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」とはＯｒｙｚｉａｓ ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」とはＯｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」とはＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋」とはＳｕｓ ｓｃｒｏｆａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３１ａ」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３１ａＨ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３３」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３５」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」とはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔ．ベータ１ＨＤ様」とはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸを指し；「Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白」とはＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａβ３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ＣＧ１４８８５」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短鎖変異体」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＧｃｙ−８８−Ｅ−ＳＨ−ＮＯＸを指し；そして「Ｄｍ．ＣＧ４１５４ＨＮＯＸ」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ４１５４Ｈ−ＮＯＸを指す。 図４Ａ〜４Ｄは図２及び３Ａ〜３ＤのＨ−ＮＯＸ蛋白の配列アライメント、即ち：主要部（配列番号１０）；Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１１）；ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１２）；ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１３）；ｈｓ．ベータ２蛋白（配列番号１４）；Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１６）；Ｎｐ．ｓＧＣベータ１ＨＤ様（配列番号１７）；Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白（配列番号１８）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２（配列番号２２）；Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６（配列番号２３）；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ（配列番号２５）；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２（配列番号２６）；ｇｃｙ−３１（配列番号２）；ｇｃｙ−３３（配列番号３）；Ｃａ．ＨＮＯＸ（配列番号９）；Ｔ．ベータ１ＨＤ様（配列番号８）；Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白（配列番号７）：ＣＧ１４８８５（配列番号５）；及びＤｍ．ｓＧＣ短鎖変異体（配列番号６）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ中のデフォルトパラメーターを用いて形成した。図２〜４Ｄ中、「Ｄｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｓＧＣベータ１蛋白」とはＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｈｓ．ベータ２蛋白」とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ２Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｍｍ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｎｐ．ベータ１ＨＤ様」とはＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔｒ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＴａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ＿ｇａｍｂｉａｅ｜ＸＰ＿３１０９１９」とはＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ａｐｉｓ＿ｍｅｌｌｉｆｅｒａ｜ＮＰ＿００１０１１６３２」とはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｂｔ．ｓＧＣベータ１蛋白」とはＢｏｓ ｔａｕｒｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ＿ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ｜ＡＡＲ０２」とはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ｜ＢＡＣ９８３９６」とはＯｒｙｚｉａｓ ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｏｒｙｚｉａｓ＿ｌａｔｉｐｅｓ｜ＢＡＡ７６６９１」とはＯｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ＿ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ｜Ｘ」とはＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａベータ１｜ＮＰ＿００１０１８０４２＋」とはＳｕｓ ｓｃｒｏｆａβ１Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３１ａ」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３１ａＨ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３３」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ｇｃｙ−３５」とはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧｃｙ−３５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｃａ．ＨＮＯＸ」とはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＨ−ＮＯＸを指し；「Ｔ．ベータ１ＨＤ様」とはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸを指し；「Ｍｓ．ｓＧｃベータ３蛋白」とはＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａβ３Ｈ−ＮＯＸを指し；「ＣＧ１４８８５」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５Ｈ−ＮＯＸを指し；「Ｄｍ．ｓＧＣ短鎖変異体」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＧｃｙ−８８−Ｅ−ＳＨ−ＮＯＸを指し；そして「Ｄｍ．ＣＧ４１５４ＨＮＯＸ」とはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ４１５４Ｈ−ＮＯＸを指す。 図５ＡはＨ−ＮＯＸファミリーのメンバーの配列アライメントである。配列のナンバリングはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのものである。非変異の残基は「Ｖ」で示し、極めて高度に保存された残基は「ｓ」で示す。Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＹ１４０は「Ｈ」で示す。他のＨ−ＮＯＸ蛋白におけるＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を安定化させる場合がある予測される遠位ポケットチロシン残基は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓに従ってナンバリングすれば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５については７０位；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡについては１４０位；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５については１３８位；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍに関しては１４０位である。アクセッション番号は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ１［ｇｉ：２７４６０８３］（配列番号２８）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１［ｇｉ：２７１２７３１８］（配列番号２９）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒβ１［ｇｉ：８６１２０３］（配列番号３０）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８−ＰＡ［ｇｉ：２３１７１４７６］（配列番号３１）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５［ｇｉ：５２７８２８０６］（配列番号３２）、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ［ｇｉ：２３１２９６０６］（配列番号３３）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ［ｇｉ：１６１２７２２２］（配列番号３４）、Ｓｈｅｗａｎａｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２４３７３７０２］（配列番号３５）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ（ＯＲＦ２）［ＣＵＣＧＣ＿２７２６２４］（配列番号３６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ［ｇｉ：１５８９６４８８］（配列番号３７）、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２０８０７１６９］（配列番号３８）である。アライメントはプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，ＤＮＡ Ｓｔａｒを用いて形成した（ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｅｇａｌｉｇｎ．ｐｈｐ参照）。 図５Ｂは例示されるＨ−ＮＯＸドメインの配列アライメントである。二次構造のアノテーション及びアライメント上端上のナンバリングはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに相当する。αへリックスはらせんにより、そしてβ鎖は矢印で示す。遠位ポケットはαへリックス、αＡ、αＤ、αＥ及びαＧにより定義される。Ｐｕｂｍｅｄ／ＮＣＢＩアクセッション番号は以下の通り、即ち：Ｔｈｅｒ＿ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ ｇｉ｜２０８０７１６９｜（配列番号３９）、Ｃｌｏｓ＿ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ｇｉ｜１５８９６４８８｜（配列番号４０）、Ｃｌｏｓ＿ｔｅｔａｎｉＧＩ：７５５４３２６６（配列番号４１）、Ｄｅｓｕ＿ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ｇｉ｜２３４７５９１９｜（配列番号４２｜、Ｖｉｂｒ＿ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｇｉ｜２７３６１７３４｜（配列番号４３）、Ｃａｕｌ＿ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ｇｉ｜１６１２７２２２｜（配列番号４４）、Ｍｉｃｒ＿ｄｅｇｒａｄａｎｓ ｇｉ｜２３０２７５２１｜（配列番号４５）、Ｖｉｂｒ＿ｃｈｏｌｅｒａｅ ｇｉ｜１５６０１４７６｜（配列番号４６）、Ｓｈｅｗ＿ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ ｇｉ｜２４３７３７０２｜（配列番号４７）、Ｒａｔ＿ベータ１＿ｓＧＣ ｇｉ｜２７１２７３１８｜（配列番号４８）、Ｒａｔ＿ベータ２＿ｓＧＣ ｇｉ｜２１９５６６３５｜（配列番号４９）、Ｎｏｓｔ＿ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ｇｉ｜２３１２９６０６｜（配列番号５０）、及びＮｏｓｔ＿ｓｐ．ｇｉ｜１７２２９７７０｜（配列番号５１）である。コンセンサス配列は図５Ｂの下に示す（配列番号５２）。アライメントはプログラムＭＵＬＴＡＬＩＮ（Ｃｏｒｐｅｔ，Ｆ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−１０９８０）を用いて形成し、そして図５ＢはプログラムＥＳＰＲＩＰＴ（Ｇｏｕｅｔ，Ｐ．等（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１５：３０５−３０８）を用いて作成した。 図６Ａ及び６ＢはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸドメインのヘム環境の三次元構造の図である。図６Ａ及び６ＢはＰｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．等（２００４年８月３１日）、“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３５）：１２８５４−１２８５９による。 図７Ａ〜７ＦはＴｔＨ−ＮＯＸ（図７Ａ）、ＴｔＹ１４０Ｌ（図７Ｂ）、ＴｔＷ９Ｆ−Ｙ１４０Ｌ（図７Ｃ）、ＴｔＦ７８Ｙ−Ｙ１４０Ｌ（図７Ｄ）、Ｌ２Ｈ−ＮＯＸ及びＬ２Ｆ１４２Ｙ（図７Ｅ）、及びβ１（１−３８５）及びβ１（１−３８５）Ｉ１４５Ｙ（図７Ｆ）に関する空気への曝露の前後（ＦｅＩＩ−Ｏ２複合体；各グラフの下端の線）の嫌気的還元後（ＦｅＩＩ未ライゲーション複合体；各グラフの上端の線）のＨ−ＮＯＸ蛋白のＵＶ可視光スペクトル測定のグラフである。Ｌ２Ｆ１４２Ｙ及びβ１（１−３８５）Ｉ１４５ＹのＦｅＩＩ及びＦｅＩＩ−Ｏ２複合体の他に、還元及び空気への曝露後の野生型Ｌ２Ｈ−ＮＯＸ及びβ１−（１−３８５）Ｈ−ＮＯＸのスペクトルをそれぞれ図７Ｅ及び７Ｆの中央の線に示すことにより、これらの蛋白が遠位ポケットチロシンの添加前にはＯ２に結合しないことを明らかにしている。各パネルの上左端に記載した２又は３つの数字はグラフ中の線のピークに関する波長を示す。数は相当する線がグラフ中に垂直に現れる順序で垂直に記載している。例えば、図７Ａにおける４３０ｎｍの値はグラフにおける上端線（ＦｅＩＩ未ライゲーション複合体を示す）に対する波長のピークを示し、そして図７Ａにおける４１６ｎｍの値はグラフにおける下端線（ＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を示す）に対する波長のピークを示す。空気の存在下における波長のシフトは蛋白がＯ２に結合することを示す。空気存在下における５００〜６００ｎｍの二重ピークの形成もまたＯ２結合を示す。図７Ａ〜７ＦはＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９による。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。 図８Ａ〜８ＤＤには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする例示的な核酸のポリヌクレオチド配列と、対応するＨ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列を含めた（配列番号５３〜１６２）。
（発明の詳細な説明）
Ｈ−ＮＯＸ蛋白がヘモグロビンよりもはるかに低値のＮＯ反応性を有するという意外な発見に部分的には基づいている。この固有の低ＮＯ反応性（及び高いＮＯ安定性）は、内因性ＮＯによるＨ−ＮＯＸ蛋白の不活性化の確率がより低値であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白による内因性ＮＯの捕獲の確率がより低値であるという理由から、野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白を血液代替物として望ましいものにしている。重要な点は、一部のＨ−ＮＯＸ蛋白における遠位ポケットチロシンの存在（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．等（２００４年８月３１日）、“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（３５）：１２８５４−１２８５９）は望ましくない高値のＮＯ反応性を示唆しており、血液代替物としての使用を禁忌としている。例えば類推すれば、構造的に類似の遠位ポケットチロシンを有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのヘモグロビン蛋白はＮＯと極めて急速に反応し、そして感染宿主により生成された防御性ＮＯを効果的に捕獲してこれを回避するためにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより使用される（Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｈ．等（２００２年４月３０日）、“Ｔｒａｎｃａｔｅｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＨｂＮ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｏｖｉｓ Ｆｒｏｍ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（９）：５９０２−５９０７）。しかしながら、本発明者等は意外にも、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は実際には、血液代替物としてのその使用を可能にするような、ヘモグロビンのものよりも遙かに低値のＮＯ反応性を有することを発見した。
更に又ＮＯには結合するがＯ２には結合しないＨ−ＮＯＸ蛋白が単一のアミノ酸変異の導入によりＮＯとＯ２の両方に結合するＨ−ＮＯＸ蛋白に変換され得ることを意外にも発見した。即ち、Ｏ２とＮＯに対するＨ−ＮＯＸ蛋白の親和性及びＯ２とＮＯリガンドの間で判別を行うＨ−ＮＯＸ蛋白の能力はアミノ酸変異１つ以上の導入により改変することができ、これによりＨ−ＮＯＸ蛋白を所望の親和性でＯ２とＮＯに結合するように適応させることができる。Ｏ２及び／又はＮＯに対する親和性をさらに改変するために追加的な変異を導入できる。従ってＨ−ＮＯＸ蛋白ファミリーはＯ２送達のために向上した、又は最適な速度論的及び熱力学的な特性を示すように操作することができる。例えば、種々の臨床的及び工業的な用途に対するＨ−ＮＯＸ蛋白の有用性を向上させるようにＯ２結合に関する解離定数及び／又はオフ速度が改変された変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白が形成されている。Ｏ２に結合してこれを送達するＨ−ＮＯＸ蛋白の能力は、現在のＯ２担体の中心的な難点に着目してこれを克服する治療の道筋である。従って、本発明は酸素の送達のための蛋白、組成物、キット及び方法を提供する。
Ｏ２送達のためにＨ−ＮＯＸ蛋白を使用することの利点は多い。外傷及び手術の後の輸血の基本的役割はＯ２の送達である。理想的な血液代替物は従来の血液の課題であるウィルス汚染、血液型分類の必要性、限定されたシェルフライフ、及び限定された利用性を回避する。ヘモグロビン系の血液代替物の主要な制約事項はＯ２に対する高い親和性及びそれらのＮＯとの反応傾向である。上記した通り極めて低レベルのＮＯの破壊であっても血管及び臓器の緊張静止状態に対して重篤な作用をもたらす場合があり、高血圧及び胃腸窮迫をもたらす。更に又、ＮＯとの反応のプロセスにおいて、ヘモグロビンは臨床的に該当する時間枠においてＯ２を送達するその能力を喪失する。分子内又は分子間交差結合を包含する第１世代のヘモグロビン系酸素担体（ＨＢＯＣ）の毒性を最小限にするための種々の試みがなされてきた（“Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，”Ｒ．Ｗｉｎｓｌｏｗ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００６）。これらの修飾はヘモグロビンの浸出に関連する高度な毒性の問題点の一部を克服しているが、高いＮＯ反応性に起因する酸素結合の破壊はなお残っている。これらの第２世代のＨＢＯＣは低減された酸素親和性を示し、ｐ５０値は赤血球のｐ５０値に接近しているが、なお、臨床治験においては功を奏していない。Ｗｉｎｓｌｏｗ等により提案された別の仮説は、適切な粘度及びコロイド状の浸透圧を有する低ｐ５０ＨＢＯＣは高ｐ５０ＨＢＯＣよりも無細胞酸素送達のためにより適切であるとしている（Ｔｓａｉ，Ａ．Ｇ．等（２００３）、“Ｔａｒｈｅｔｅｄ Ｏ２ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｌｏｗ−Ｐ５０ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：Ａ Ｎｅｗ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｏ２ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５：Ｈ１４１１−Ｈ１４１９；Ｗｉｎｓｌｏｗ（２００７），“Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，”Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ４４：５１−５９）。そのようなＨＢＯＣのＮＯ反応性が臨床治験において問題となるかどうかは今後判明する。最小限のＮＯ反応性でＯ２に結合してこれを送達するようにＨ−ＮＯＸ蛋白を操作することは、Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＮＯを捕獲することなく、そしてＮＯによりＯ２担体として不活性化されることなくＯ２を送達する血液代替物において使用するための新しい血液ガスＯ２担体を提供するものである。このようなＨ−ＮＯＸ蛋白、組成物、キット及び方法を本明細書において更に記載する。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白
Ｈ−ＮＯＸ蛋白ファミリーの概説
特段の記載が無い限り、何れの野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白も本明細書に記載する組成物、キット及び方法において使用できる。本明細書においては、「Ｈ−ＮＯＸ蛋白」とはＨ−ＮＯＸドメインを有する蛋白を意味する（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ及びＯＸｙｇｅｎ結合ドメインにちなんで命名）。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメイン以外に他のドメイン１つ以上を含有してもしなくてもよい。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘモ蛋白の高度に保存された十分特性化されたファミリーのメンバーである（Ｉｙｅｒ，Ｌ．Ｍ．等（２００３年２月３日）、“Ａｎｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｈａｒｅｄ ｂｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅｓ Ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＢＭＧ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４（１）：５；Ｋａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．等（２００４年８月１０日）、“Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ Ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（３１）：１０２０３−１０２１１；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５年１０月）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈ−ＮＯＸ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｈｅｍｅ Ｓｅｎｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈ−ＮＯＸ Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ ｓＧＣ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＮＯ Ｓｅｎｓｏｒｓ，”Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２））。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は又、Ｐｆａｍ０７７００蛋白又はＨＮＯＢ蛋白とも称される（Ｐｆａｍ−蛋白ドメインファミリーアライメント及びＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌのデータベース、Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（Ｃ）１９９６−２００６Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵＬＧＰＬ Ｆｒｅｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，５９Ｔｅｍｐｌｅ Ｐｌａｃｅ−Ｓｕｉｔｅ３３０，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ０２１１１−１３０７、ＵＳＡ）。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は６つのアルファへリックスとそれに続く２つのベータ鎖、それに続く１つのアルファへリックス、それに続く２つのベータ鎖を包含する二次構造を有する、又は有すると推測されている。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘム結合によりヘム又はホロ蛋白と結合することができるアポ蛋白であることができる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘム基に共有結合的又は非共有結合的に結合できる。一部のＨ−ＮＯＸ蛋白はＮＯには結合するがＯ２には結合せず、他のものはＮＯとＯ２の両方に結合する。単離されている通性の好気性菌はＮＯには結合するがＯ２には結合しない。偏性好気性原核生物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ及びＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するＨ−ＮＯＸ蛋白はＮＯとＯ２に結合する。哺乳類は２つのＨ−ＮＯＸ蛋白：β１及びβ２を有する。マウス、ラット、ウシ及びヒトのＨ−ＮＯＸ配列のアライメントによれば、これらの種は＞９９％の同一性を共有していることがわかる。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＨ−ＮＯＸドメイン又は前Ｈ−ＮＯＸ蛋白は天然に存在するＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ蛋白又は天然に存在するｓＧＣ蛋白（例えば天然に存在するｓＧＣβ１蛋白）の相当する領域のものに対して少なくとも概ね１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９又は９９．５％何れかにおいて同一である。本明細書において更に考察する通り、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は場合により相当する天然に存在するＨ−ＮＯＸ蛋白と相対比較して変異１つ以上を含有してよい。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメインの他にドメイン１つ以上を包含する。特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は別の蛋白由来の１つ以上のドメイン又は全配列を包含する。例えばＨ−ＮＯＸ蛋白はＨ−ＮＯＸドメインおよびアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）のような別の蛋白の部分又は全てを包含する融合蛋白であってよい。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸドメインのみが存在する。
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来の原核生物Ｏ２結合Ｈ−ＮＯＸの結晶構造（“Ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ＮＯ Ｓｅｎｓｏｔ Ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６（５７０１）：１５５０−１５５３；Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．等（２００４年８月３１日）、“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（３５）：１２８５４−１２８５９）はチロシン側鎖ヒドロキシル基が臨界水素結合をＦｅＩＩ−Ｏ２部分とすることを示している。主にＹ１４０を含むこの遠位ポケット水素結合ネットワークがＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を安定化させている（図６Ｂ）。このチロシンは、Ｏ２とは区別してＮＯのみに結合するＨ−ＮＯＸ蛋白中には存在しない。例えば、この水素結合ネットワークはｓＧＣおよび好気性原核生物由来のＨ−ＮＯＸ蛋白には非存在であることが推測されており、これは、このようなヘム蛋白により提示されるＯ２を区別する顕著なリガンド選択制における重要な分子因子として示唆されている。図７Ａ〜７Ｇは、ＮＯには結合するがＯ２には結合しない野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白の遠位ポケットにおけるチロシンの付加は、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白をＯ２結合可能とすることができることを明確に示している。即ち、Ｈ−ＮＯＸヘム折り畳み部の遠位ヘムポケットにおけるチロシンはＯ２結合のオンオフの切り替えスイッチとして作用している。
図６Ａ及び６Ｂに示す通り、ポルフィリンの構造は高度に歪んでいる。図６Ａに示す通り、保存されたＹ−Ｓ−Ｒモチーフはヘム基のプロピオン酸側鎖との水素結合相互作用を生じさせている。図６Ｂでは保存されたＨ１０２がヘムに対する近位のリガンドである（図６Ｂ）。
本明細書においては、「蛋白」とは、天然の原料から単離されているか、組み換え手法により産生されているか、又は化学合成されているかに関わらず、蛋白及び蛋白フラグメントを包含する。蛋白は１つ以上の修飾、例えば翻訳語の修飾（例えばグリコシル化）又は何れかの他の修飾（例えばＰＥＧ化等）を有してよい。蛋白は１つ以上の非天然存在のアミノ酸（例えば側鎖修飾を有するアミノ酸）を含有してよい。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は少なくとも約５０、１００、１５０、１８１、２００、２５０、３００、３５０、４００又はそれより多いアミノ酸を有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は約５０〜約６００アミノ酸、例えば約１００〜約５００アミノ酸、約１５０〜約４００アミノ酸、約１５０〜約３００アミノ酸、又は約１７５〜約２００アミノ酸を包含してよい。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の原料
何れかの属又は種に由来するＨ−ＮＯＸ蛋白を本明細書に記載する組成物、キット及び方法において使用できる。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は哺乳類（例えば霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコ）、昆虫、酵母、又は細菌由来の蛋白であるか、又はそのような蛋白由来である。例示される哺乳類Ｈ−ＮＯＸ蛋白は野生型のヒト又はラットの可溶性グアニレートサイクラーゼ（例えばβ１サブユニット）を包含する。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例は野生型哺乳類Ｈ−ＮＯＸ蛋白、例えばＨ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ及びＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；及び野生型非哺乳類脊椎動物Ｈ−ＮＯＸ蛋白、例えばＸ．ｌａｅｖｉｓ、Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓ、Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓ及びＦ．ｒｕｂｒｉｐｅｓを包含する。非哺乳類野生型ＮＯ結合Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例はＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ａ．ｇａｍｂｉａｅ及びＭ．ｓｅｘｔａの野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白を包含し；非哺乳類野生型Ｏ２結合Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例はＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｇｃｙ−３１、ｇｃｙ−３２、ｇｃｙ−３３、ｇｃｙ−３４、ｇｃｙ−３５、ｇｃｙ−３６、及びｇｃｙ−３７；Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５、ＣＧ１４８８６、及びＣＧ４１５４；及びＭ．ｓｅｘｔａベータ３の野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白を包含し；原核生物野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ１、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ２、及びＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍを包含する。
例示されるＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＣＢＩアクセッション番号は以下、即ちＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ１［ｇｉ：２７４６０８３］、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１［ｇｉ：２７１２７３１８］、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒβ１［ｇｉ：８６１２０３］、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＣＧ１４８８５−ＰＡ［ｇｉ：２３１７１４７６］、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓＧＣＹ−３５［ｇｉ：５２７８２８０６］、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ［ｇｉ：２３１２９６０６］、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ［ｇｉ：１６１２７２２２］、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２４３７３７０２］、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（ＯＲＦ２）［ＣＵＣＧＣ＿２７２６２４］、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ［ｇｉ：１５８９６４８８］、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２０８０７１６９］を包含する。
例示されるＨ−ＮＯＸ蛋白は又、自身の遺伝子名及びそれにひき続くそれらの種の略記及びゲンバンク識別子により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
Figure 2017137337
 を包含する（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎ等（２００３）、“Ａｎｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｈａｒｅｄ ｂｙ ａｎｉｍａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｕａｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＢＭＧ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５−１３）。種の名称において使用するそれらの略記法は、Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎａｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを包含する。
その他の例示されるＨ−ＮＯＸ蛋白は、自身の生物名及びＰｆａｍデータベースアクセッション番号により列挙される以下のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月１７日；２００７年５月２１日；又は２００７年５月２２日のものとして入手可能な以下の蛋白配列）：
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 を包含する。配列は本明細書に記載する通りＰｆａｍデータベースを用いてＨ−ＮＯＸ蛋白ファミリーに帰属するものとしたこれらの蛋白の識別に基づいてＨ−ＮＯＸ蛋白をコードしていると予測される。
本明細書に記載する医薬組成物及び方法における使用に適する場合があるその他のＨ−ＮＯＸ蛋白及び核酸は標準的な方法を用いて発見することができる。例えば、標準的な配列アライメント及び／又は構造の予測のプログラムを使用することにより、別のＨ−ＮＯＸ蛋白及び核酸を、それらの一次及び／又は予測蛋白二次構造の既知Ｈ−ＮＯＸ蛋白及び核酸のものとの同様性に基づいて、識別することができる。例えばＰｆａｍデータベースは定義されたアライメントアルゴリズム及びＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（例えばＰｆａｍ２１．０）を用いることにより蛋白をファミリー、例えばＨ−ＮＯＸ蛋白ファミリーにカテゴリ化している（Ｐｆａｍ−蛋白ドメインファミリーアライメント及びＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌのデータベース、Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（Ｃ）１９９６−２００６ Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵＬＧＰＬ Ｆｒｅｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，５９Ｔｅｍｐｌｅ Ｐｌａｃｅ−Ｓｕｉｔｅ３３０，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ０２１１１−１３０７、ＵＳＡ）。標準的なデータベース、例えばｓｗｉｓｓｐｏｒｔ−ｔｒｅｍｂｌデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ，Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｏｒｔ ｇｒｏｕｐ ＣＭＵ−１ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ｓｅｒｖｅｔ ＣＨ−１２１１ Ｇｅｎｅｖａ４，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）もまたＨ−ＮＯＸ蛋白ファミリーのメンバーを発見するために使用できる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の二次及び／又は三次構造は標準的な構造予測プログラム、例えばＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０Ｗｅｓｔ，１６８ Ｓｔｒｅｅｔ，ＢＢ２１７，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００３２，ＵＳＡ）のデフォルトセッティングを用いながら予測することができる。或いは、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の実際の二次及び／又は三次構造を標準的方法を用いて決定できる。
一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸにおける以下の遠位ポケット残基、即ちＴｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、及びＬｅｕ１４４の何れかと同じ対応位置におけるアミノ酸を有する。一部の実施形態においては、そのアミノ酸配列の配列アライメントに基づけば、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのそれぞれＰｒｏ１１５又はＡｒｇ１３５に対応する位置にプロリン又はアルギニンを有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓβ１Ｈ−ＮＯＸのＨｉｓ１０５に相当するヒスチジンを有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は６つのアルファへリックスとそれに続く２つのベータ鎖、それに続く１つのアルファへリックス、それに続く２つのベータ鎖を包含する二次構造を有する、又は有すると推測されている。この二次構造はＨ−ＮＯＸ蛋白に関して報告されている。
所望により、新たに発見されたＨ−ＮＯＸ蛋白を、それがヘムに結合するかどうかを調べるために、標準的な方法を用いて試験することができる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＯ２担体として機能する能力は本明細書に記載したもののような標準的な方法を用いてＨ−ＮＯＸ蛋白がＯ２に結合するかどうかを測定することにより試験できる。所望により、本明細書に記載した変異１つ以上をＨ−ＮＯＸ蛋白に導入することによりＯ２担体としてのその特性を最適化することができる。例えば１つ以上の変異は、そのＯ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせを改変するために導入できる。本明細書に記載したもののような標準的な手法を用いてこれらのパラメーターを測定できる。
本明細書において考察する通り、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白（例えば後述するようなクラスＩ及びクラスＩＩの変異体）はこれら又は他の天然の野生型原料配列（例えば図２〜４Ｄ又は８Ａ〜８ＤＤに記載する配列、又は本明細書に記載した他の配列）からの変異誘発により誘導してよい。本明細書においては、「〜から誘導する」とは変異１つ以上を導入する蛋白の原料をさす。例えば「哺乳類蛋白から誘導された」蛋白とは、野生型の哺乳類蛋白の配列（即ち天然に存在する配列）内への変異１つ以上の導入に起因する目的の蛋白を指す。
変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白
本明細書において考察する通り、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は対応する野生型蛋白と比較してそのＯ２解離定数、酸素に関するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせ改変する変異のような変異１つ以上を含有してよい。操作されたＨ−ＮＯＸ蛋白のパネルは、本明細書に記載した、及び追加的には当該分野で知られた手法を用いて本明細書の教示を鑑みながら、ランダム変異誘発、その後、必要な、又は望ましい解離定数、解離速度、ＮＯ反応性、安定性、生理学的適合性、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせに関して実験的にスクリーニングすることにより、形成してよい。或いは、変異誘発は、特定の領域、又はＨ−ＮＯＸ蛋白の実験的に決定された、又は予測された三次元構造から明らかになる遠位ポケット残基のような残基（本明細書の図１Ａ；及び例えば、特に野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：５３−５９を参照できる）又は配列アライメントから識別される進化的に保存されている残基（本明細書の図２〜４；及び例えば、特に野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：５３−５９を参照できる）に対して選択的にターゲティングできる。
本明細書においては、「変異体蛋白」とは、天然に存在する蛋白と比較して変異１つ以上を有する蛋白を意味する。１つの実施形態において、変異体蛋白は天然に存在するすべての蛋白のものとは異なる配列を有する。種々の実施形態において、変異体蛋白のアミノ酸配列は天然に存在する蛋白の相当する領域のものに対して少なくとも概ね１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９又は９９．５％の何れかにおいて同一である。一部の実施形態においては、変異体蛋白は完全長蛋白の少なくとも概ね２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、又は４００の何れかの隣接アミノ酸を含有する蛋白フラグメントである。配列同一性は例えば配列分析ソフトウエア（例えばウイスコンシン大学（１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７０５）バイオテクノロジーセンターの遺伝子コンピューターグループの配列分析ソフトウエアパッケージ）を使用しながら、そこに特定されているデフォルトパラメーターを用いて求めることができる。このソフトウエアプログラムは種々のアミノ酸の置き換え、欠失及び他の修飾に対して相同性の程度を割りつけることにより、同様の配列をマッチさせる。
本明細書においては、「変異」とは天然に存在するレファレンス核酸又はアミノ酸の配列における改変を意味する。例示される核酸変異は挿入、欠失、フレームシフト変異、サイレント変異、ナンセンス変異、又はミスセンス変異を包含する。一部の実施形態においては、核酸変異はサイレント変異ではない。例示される蛋白変異は１つ以上のアミノ酸の挿入（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸の挿入）、１つ以上のアミノ酸の欠失（例えばＮ末端、Ｃ末端、及び／又は内部の残基の欠失、例えば少なくとも概ね５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００の何れか、又はそれより多いアミノ酸の欠失、又は、概ね５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、又は４００の何れかのアミノ酸の欠失）、１つ以上のアミノ酸の置き換え（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸の置き換え）又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせを包含する。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例示される機能的トランケーションはβ１配列の残基１〜３８５を包含する。一部の実施形態においては、変異体の蛋白は天然に存在する蛋白と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。一部の実施形態においては、変異体核酸配列は天然に存在する蛋白と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有する蛋白をコードする。一部の実施形態においては、核酸は、天然に存在する蛋白と同一のアミノ酸配列を有する蛋白をコードする天然に存在する核酸の変性型ではない。特定のアミノ酸変異に言及する場合に使用する命名法は、先ず野生型アミノ酸、次いで残基番号、そして最後に置換アミノ酸を特定する。例えばＹ１４０Ｌとは、残基番号１４０においてロイシンによりチロシンが置き換えられていることを意味する。
「進化的に保存された変異」とはある蛋白におけるアミノ酸の、同じ蛋白ファミリーにおける別の蛋白の相当する位置におけるアミノ酸による置き換えである。例示される進化的に保存された変異（クラスＩ変異とも称する）は表１Ａに示す通りである。表１Ａにおいて、変異はヒトβ１Ｈ−ＮＯＸの配列に従ってナンバリング／アノテーションしているが、全てのＨ−ＮＯＸ配列に関して類似している。即ち、何れかの他のＨ−ＮＯＸ蛋白における相当する位置は、指定した残基に変異することができる。例えば、ヒトβ１Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ４は、他のＨ−ＮＯＸ蛋白がこの位置にチロシンを有するため、チロシンに変異させることができる。相当するフェニルアラニン残基は何れかの他のＨ−ＮＯＸ蛋白におけるチロシンに変異できる。特定の実施形態においては、変異１つ以上は進化的に保存された残基に制約される。一部の実施形態においては、変異１つ以上は少なくとも１つの進化的に保存された変異及び少なくとも１つの非進化的保存変変異を包含してよい。所望により、これらの変異Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、本明細書の教示を鑑みながら、ＮＯ／Ｏ２解離定数、ＮＯ反応性、安定性、及び生理学的低合成に関して実験的なスクリーニングに付される。
表１Ａ．進化的に保存された残基をターゲティングする例示されるクラスＩのＨ−ＮＯＸ変異
Figure 2017137337
 一部の実施形態においては、変異はアルファへリックスＡ、Ｄ、Ｅ、又はＧにおける残基の変異のような遠位ポケット変異である（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ，Ｐ．等（２００４年８月３１日）、“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（３５）：１２８５４−１２８５９）。例示される遠位ポケット変異（クラスＩＩ変異とも称する）は表１Ｂに示す通りである。表１Ｂにおいて、変異はヒトβ１Ｈ−ＮＯＸの配列に従ってナンバリング／アノテーションしているが、全てのＨ−ＮＯＸ配列に関して類似している。数種の置換は列挙された各残基において活動性の変異をもたらすため、各指定位置における残基は何れかの他の天然に存在する又は非天然存在のアミノ酸（「Ｘ」と示す）に変更することができる。そのような変異は種々の所望の親和性、安定性、及び反応性の特性を有するＨ−ＮＯＸ蛋白を産生することができる。
表１Ｂ．遠位ポケット残基をターゲティングする例示されるクラスＩＩのＨ−ＮＯＸ変異
Figure 2017137337
 特定の実施形態において、変異はヘム遠位ポケット変異である。本明細書に記載する通り、Ｈ−ＮＯＸファミリーのＮＯ結合メンバーにおけるＯ２結合を防止する重要な分子決定要因はヘムの遠位ポケットにＨ結合ドナーが欠如していることである。従って、一部の実施形態においては、変異はＨ−ＮＯＸドメインと遠位ポケット内のリガンドとの間のＨ結合を改変する。一部の実施形態においては、変異は遠位ポケットのＨ結合ドナーを破壊及び／又は対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと相対比較して低減されたＯ２リガンド結合を与える。例示される遠位ポケット残基はＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＴｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、及びＬｅｕ１４４、及びいずれかの他のＨ−ＮＯＸ蛋白における対応する残基を包含する。
遠位ポケット内にはない残基もまたヘム基の三次元構造に影響する場合があり；この構造が次にヘム基内の鉄へのＯ２及びＮＯの結合に影響する。従って一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は遠位ポケット外にも変異１つ以上を有する。変異することができるが遠位ポケット内にはない残基の例は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５及びＡｒｇ１３５を包含する。一部の実施形態においては、ヘム鉄にライゲーションする残基としてＨｉｓ１０５を包含する近位のポケット内に変異がある。
２つ以上の変異が存在する一部の実施形態においては；少なくとも１つの変異は遠位ポケットにあり、そして少なくとも１つの変異は遠位ポケット外にある（例えば近位ポケット内の変異）。一部の実施形態においては、全ての変異は遠位ポケット内にある。
一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列は自然界の生物により産生される蛋白の配列と同一ではない。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列は２００６年５月２１日又は２００６年５月２２日の何れかのデータベース中に存在する配列（例えばＨ−ＮＯＸの核酸又はアミノ酸配列であることが予測又は知られている全ての既知配列）と同一ではない。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のアミノ酸配列は２００７年５月２１日又は２００７年５月２２日の何れかのデータベース中に存在する配列（例えばＨ−ＮＯＸの核酸又はアミノ酸配列であることが予測又は知られている全ての既知配列）と同一ではない。
ヒト以外の原料から誘導されたＨ−ＮＯＸ蛋白の免疫原性を低減するためには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白中のアミノ酸をヒトＨ−ＮＯＸ中の相当するアミノ酸に変異させることができる。例えば、非ヒトＨ−ＮＯＸ蛋白の三次構造の表面上のアミノ酸１つ以上をヒトＨ−ＮＯＸ蛋白中の相当するアミノ酸に変異させることができる。一部の変異においては、表面アミノ酸１つ以上の変異は遠位ポケット残基１つ以上の変異、遠位ポケット外の残基１つ以上の変異（例えば近位ポケット内の変異）又は上記の２つ以上の組み合わせと組み合わせてよい。
例示される変異は表２に示す通りである。更に又表２に記載する残基の何れかを何れかの他のアミノ酸に変異させることもできる。本発明は又、２重、３重、又はより高い多重度の変異のような本明細書に記載した変異の何れかの組み合わせに関する。例えば、本明細書に記載した変異の何れかの組み合わせは同じＨ−ＮＯＸ蛋白内で行うことができる。他の哺乳類又は非哺乳類のＨ−ＮＯＸ蛋白における等しい位置の変異も又、本発明の範囲に包含されるものとする。所望により表２において言及したもの以外の残基も変異させることができる。例示される変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は対応する野生型のＨ−ＮＯＸドメインと相対比較して改変されたＯ２又はＮＯリガンド結合を付与する変異１つ以上を含み、そして、生理学的に適合した哺乳類Ｏ２血液ガス担体として作動可能である。
表２及び全てのその後の表において、変異に関する残基番号は記載している特定のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列における位置を示す。例えばＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＩ５ＡはＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸの５番目の位置におけるアラニンによるイソロイシンの置き換えを指す。同じイソロイシンからアラニンへの変異は、何れかの他のＨ−ＮＯＸ蛋白における対応する残基において行うこともできる（この残基は他のＨ−ＮＯＸ蛋白の配列における５番目の残基であってもなくてもよい）。哺乳類β１Ｈ−ＮＯＸ止めのアミノ酸配列は最大でも２つのアミノ酸の分だけ異なるため、野生型ラットβ１Ｈ−ＮＯＸ蛋白内に導入した場合に所望の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白を生成する変異は又、ヒトのような他の哺乳類に由来する野生型β１Ｈ−ＮＯＸ蛋白内に導入した場合も所望の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白を生成することが予測される。
Figure 2017137337
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 Ｈ−ＮＯＸ蛋白への修飾
野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の何れかを標準的な方法を用いて修飾及び／又は製剤化することにより、治療上又は産業情の用途を拡張することができる。例えば、そして特に非相同操作Ｈ−ＮＯＸ蛋白に適用される場合、交差結合、ＰＥＧ化、炭水化物デコレーション等を包含する免疫サーベイランスからそのような物質を絶縁するための種々の方法（例えばＲｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．等（１９９８年５月１５日）、“Ａｒｔｅｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２０）：１２１２８−１２１３４；Ｍｉｇｉｔａ，Ｒ．等（１９９７年６月）、“Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｎｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｉｎｄｅｘ ｉｎ Ｒａｔｓ Ａｆｔｅｒ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ，”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２（６）：１９９５−２００２；Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．等（２００４年８月１５日）、“Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＮＯ ａｎｄ Ｏ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８２（Ｐｔ１）：１８３−１８９、これらは各々、特に蛋白の修飾に関して参照により全体が本明細書に組み込まれる）が当該分野で知られており、他の手法も当業者が知る通りである。ヒト血清アルブミンのようなヒト蛋白にＨ−ＮＯＸ蛋白を融合させることは、血清中の半減期、粘度、及びコロイド浸透圧を増大させることができる。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はその合成の最中又は後に修飾することによりその免疫原性を低下及び／又はその血漿中保持時間を延長することができる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は又カプセル化することもできる（リポソーム又はナノ粒子内へのカプセル化等）。
野生型及び変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の特性
本明細書に記載する通り、広範なＮＯ及びＯ２解離定数、Ｏ２に関するｋｏｆｆ、ＮＯ反応性及び安定性を提供する多数の多様なＨ−ＮＯＸ変異体蛋白が形成されている。作動可能な血液ガス担体を提供するために、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘモグロビンのような内因性Ｏ２担体を機能的に置き換えるか、補充するために使用してよい。従って、一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘモグロビンのような内因性Ｏ２担体と比較して、同様の、又は向上したＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に関する解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自動酸化速度、血漿中保持時間、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせを有する。
本明細書においては、「ヘモグロビン」とは赤血球中の鉄含有Ｏ２輸送金属蛋白であるヘモグロビンの十分特性化されたファミリーに由来する蛋白又はその変異体を意味する。精製された支質非含有のヒトヘモグロビンは約２００〜５００ｎＭのＯ２に対する速度論的ＫＤを有する。この値はサブユニット依存性である。
本明細書においては、「ｋｏｆｆ」とは蛋白からのＯ２又はＮＯの放出の速度のような、解離速度を意味する。より小さい数字の低値のｋｏｆｆは解離のより緩徐な速度を示す。種々の実施形態においてＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１、例えば約０．１〜約２００ｓ−１、約０．１〜約１００ｓ−１、約１．０〜約１６．０ｓ−１、約１．３５〜約２３．４ｓ−１、約１．３４〜約１８ｓ−１、約１．３５〜約１４．５ｓ−１、約０．２１〜約２３．４ｓ−１、約１．３５約２．９ｓ−１、約２〜約３ｓ−１、約５〜約１５ｓ−１、又は約０．１〜約１ｓ−１である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃において約０．６５−１以下（例えば２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１）の酸素に関するｋｏｆｆ値を有する。
「ｋｏｎ」とはＯ２又はＮＯの蛋白への結合の速度のような会合速度を意味する。より小さい数字の低値のｋｏｎは会合のより緩徐な速度を示す。種々の実施形態においてＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２に関するｋｏｎは２０℃で約０．１４〜約６０μＭ−１ｓ−１、例えば約６〜約６０μＭ−１ｓ−１、約６〜約１２μＭ−１ｓ−１、約１５〜約６０μＭ−１ｓ−１、約５〜約１８μＭ−１ｓ−１、又は約６〜約１５μＭ−１ｓ−１である。
「解離定数」とは「速度論的解離定数」又は「計算された解離定数」を意味する。「速度論的解離定数」又は「ＫＤ」とは速度論的オフ速度（ｋｏｆｆ）の速度論的オン速度（ｋｏｎ）の比、例えば当該分野で知られた及び／又は本明細書に記載した方法を包含する標準的な方法（例えば標準的なスペクトル分析、ストップドフロー、又はフラッシュフォトリシス法）を用いて絶対値として求められるＫＤ値を意味する。「計算された解離定数」又は「計算されたＫＤ」とは測定されたｋｏｆｆに基づいた速度論的解離定数の近似値を指す。ｋｏｎに関する値は本明細書に記載した速度論的ＫＤ及びｋｏｆｆの間の相関を介して誘導される。
種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白によるＯ２結合に関する速度論的又は計算されたＫＤは２０℃において約１ｎＭ〜１ｍＭ、例えば２ｎＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約９μＭ〜約５０μＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１０μＭ、約２ｎＭ〜５０μＭ、約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、約１５０ｎＭ〜約１μＭ、又は約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２μＭ、２０ｎＭ〜約７５ｎＭ、約１μＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約１０μＭ、約２μＭ〜約９μＭ、又は約１００ｎＭ〜５００ｎＭである。一部の実施形態においては、Ｏ２結合に関する速度論的又は計算されたＫＤは２０℃において概ね１００ｎＭ、８０ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、又は１０ｎＭの何れか未満である。
種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白によるＯ２結合に関する速度論的又は計算されたＫＤは同じ条件下（例えば２０℃）におけるヘモグロビンのものの約０．０１〜約１００倍以内、例えば同じ条件下（例えば２０℃）におけるヘモグロビンのものの約０．１〜約１０倍、又は約０．５〜約２倍である。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白によるＮＯ結合に関する速度論的又は計算されたＫＤは同じ条件下（例えば２０℃）におけるヘモグロビンのものの約０．０１〜約１００倍以内、例えば同じ条件下（例えば２０℃）におけるヘモグロビンのものの約０．１〜約１０倍、又は約０．５〜約２倍である。
本明細書においては、「酸素親和性」とは蛋白のヘム部分に結合する酸素の強度を指す定性的用語である。この親和性は酸素に関するｋｏｆｆ及びｋｏｎの両方により影響される。数値的により低値の酸素ＫＤ値はより高値の親和性を意味する。「ＮＯ親和性」とは蛋白に結合（例えばヘム基への、又は蛋白に会合しているヘム基に結合した酸素への結合）するＮＯの強度を指す定性的用語である。この親和性はＮＯに関するｋｏｆｆ及びｋｏｎの両方により影響される。数値的により低値のＮＯＫＤ値がより高値の親和性を意味する。
本明細書においては、「ＮＯ安定性」とは酸素の存在下におけるＮＯによる酸化に対する蛋白の安定性又は耐性を指す。例えば、酸素の存在下にＮＯに結合した場合に蛋白が参加されない能力は、蛋白のＮＯ安定性の指標である。一部の実施形態においてはＨ−ＮＯＸ蛋白の概ね５０、４０、３０、２０、１０又は５％の何れか未満が２０℃において約１、２、４、６、８、１０、１５、又は２０時間の何れかのインキュベーションの後に酸化される。
本明細書においては、「ＮＯ反応性」とはヘム結合蛋白のヘム中の鉄が２μＭ蛋白の濃度において酸素存在下にＮＯにより酸化される速度を指す。ｓ−１の単位におけるＮＯ反応性に関するより低い数値がより低いＮＯ反応性を指す。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃において約７００ｓ−１未満、例えば２０℃において約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、又は０．６ｓ−１未満である。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約０．１〜約６００ｓ−１、例えば２０℃で約０．５〜約４００ｓ−１、約０．５〜約１００ｓ−１、約０．５〜約５０ｓ−１、約０．５〜約１０ｓ−１、約１〜約５ｓ−１、又は約０．５〜約２．１ｓ−１である。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の反応性は同じ条件下、例えば２０℃において、ヘモグロビンのものの少なくとも約１０、１００、１０００又は１００００倍低値である。
本明細書においては、「自動酸化速度」とは、ヘム結合蛋白のヘム中の鉄が自動酸化する速度を指す。ｓ−１の単位におけるより低い数値の自動酸化速度がより低い自動酸化速度を指す。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度は、３７℃で約１．０ｈ−１未満、例えば３７℃で約０．９ｈ−１、０．８ｈ−１、０．７ｈ−１、０．６ｈ−１、０．５ｈ−１、０．４ｈ−１、０．３ｈ−１、０．２ｈ−１、０．１ｈ−１、又は０．０５ｈ−１の何れか未満である。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化の速度は、３７℃で約０．００６〜約５．０ｈ−１、例えば３７℃において約０．００６〜約１．０ｈ−１、０．００６〜約０．９ｈ−１、又は約０．０６〜約０．５ｈ−１である。
種々の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は（ａ）ヘモグロビンのものの２桁内のＯ２又はＮＯ解離定数、会合速度（Ｏ２又はＮＯに関するｋｏｎ）、又は解離速度（Ｏ２又はＮＯに関するｋｏｆｆ）、（ｂ）それぞれｓＧＣβ１のものより弱い（例えば少なくとも約１０倍、１００倍、又は１０００倍弱い）ＮＯ親和性、（ｃ）ヘモグロビンのものより少なくとも１０００倍低値の結合Ｏ２に対するＮＯ反応性、（ｄ）ヘモグロビンのものより少なくとも２、１０、１００又は１０００倍高値のインビボ血漿中保持時間、又は（ｅ）これらの２つ以上の何れかの組み合わせを有する。
例示される適当なＯ２担体は、ヘモグロビンのものの２桁内、即ちヘモグロビンのものの約０．０１〜１００倍、例えば約０．１〜１０倍、又は約０．５〜２倍の解離定数を与える。本明細書に記載した手法のような種々の確立された手法（Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５年１０月）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈ−ＮＯＸ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｈｅｍｅ Ｓｅｎｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈ−ＮＯＸ Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ ｓＧＣ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＮＯ Ｓｅｎｓｏｒｓ，”Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．等（２００４年８月１５日）、“Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＮＯ ａｎｄ Ｏ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８２（Ｐｔ１）：１８３−１８９、これらはおのおの、特に解離定数の測定に関して、参照により全体が本明細書に組み込まれる）並びに当該分野で知られたものを用いて解離定数を定量してよい。例示されるＯ２担体は結合Ｏ２とのＨ−ＮＯＸ蛋白の低い、又は最低限のＮＯ反応性、例えばヘモグロビンより低値のＮＯ反応性を与える。一部の実施形態においてはＮＯ反応性は遙かに低値、例えばヘモグロビンのものの少なくとも約１０、１００、１０００又は１００００倍低値となる。ＮＯ反応性の定量のためには種々の確立された方法（Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５年１０月）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈ−ＮＯＸ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｈｅｍｅ Ｓｅｎｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈ−ＮＯＸ Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ ｓＧＣ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＮＯ Ｓｅｎｓｏｒｓ，”Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．等（２００４年８月１５日）、“Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＮＯ ａｎｄ Ｏ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８２（Ｐｔ１）：１８３−１８９、これらは各々、特に解離定数の測定に関して、参照により全体が本明細書に組み込まれる）並びに当該分野で知られたものを使用してよい。野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ蛋白はこのように低値のＮＯ反応性を有しているため、他の野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白及び変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白も同様に低値のＮＯ反応性を有する場合がある。例えばＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸＹ１４０Ｈは野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸのものと同様のＮＯ反応性を有する。
更に又、安定なＯ２担体は高い、又は最大限とされた安定性、特にインビボの安定性を与える。種々の安定性の尺度、例えば酸化安定性（例えば自動酸化又はＮＯによる酸化に対する安定性）、温度安定性、及びインビボの安定性を使用してよい。本明細書に記載した手法のような種々の確立された手法（Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５３−５９；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５年１０月）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈ−ＮＯＸ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｈｅｍｅ Ｓｅｎｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（５）：４４１−４４６；Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｌｉｇａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈ−ＮＯＸ Ｄｏｍａｉｎｓ：Ｆｒｏｍ ｓＧＣ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＮＯ Ｓｅｎｓｏｒｓ，”Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（４）：８９２−９０２））並びに当該分野で知られたものを用いて安定性を定量してよい。血漿、血液、又は組織中のインビボの安定性に関しては、例示される安定性尺度は保持時間、クリアランス速度、及び半減期を包含する。好熱性生物由来のＨ−ＮＯＸ蛋白は高温で安定であることが期待される。種々の実施形態において、血漿中保持時間はヘモグロビンのものの少なくとも約２、１０、１００又は１０００倍高値である（例えばＢｏｂｏｆｃｈａｋ，Ｋ．Ｍ．等（２００３年８月）、“Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｗｉｔｈ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａ， Ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｏ２ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５（２）：Ｈ５４９−Ｈ５６１）。当業者の知る通り、ヘモグロビン系の血液代替物は、血漿から無細胞ヘモグロビンを除去するヘモグロビンに対する受容体の存在のために、血漿からの無細胞ヘモグロビンの急速なクリアランスにより制限されている。血漿中にはＨ−ＮＯＸ蛋白に対する受容体が無いため、野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白はヘモグロビンのものよりも長い血漿中保持時間を有すると期待される。所望により、血漿中保持時間はＨ−ＮＯＸ蛋白をＰＥＧ化又は交差結合するか、又はＨ−ＮＯＸ蛋白を他の蛋白と融合させることにより、標準的な方法（例えば本明細書に記載したもの及び当該分野で知られたもの）を用いて増大させることができる。
種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭのＯ２解離定数、及び同じ条件下でヘモグロビンのものよりも少なくとも約１０倍低値のＮＯ反応性を有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃で約１ｎＭ〜約１ｍＭのＯ２解離定数、及び２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）のＮＯ反応性を有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はヘモグロビンのものの２桁内のＯ２解離定数、及び同じ条件下、例えば２０℃においてヘモグロビンのものよりも少なくとも約１０倍低値のＮＯ反応性を有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１の酸素に関するｋｏｆｆ、及び同じ条件下、例えば２０℃においてヘモグロビンのものよりも少なくとも約１０倍低値のＮＯ反応性を有する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は２０℃で約０．６５ｓ−１未満の酸素に関するｋｏｆｆ（例えば２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６４ｓ−１）、及び同じ条件下、例えば２０℃においてヘモグロビンのものよりも少なくとも約１０倍低値のＮＯ反応性を有する。特定の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約２ｎＭ〜約５０μＭ、約５０ｎＭ〜約１０μＭ、約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、約１５０ｎＭ〜約１μＭ、又は約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭである。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃において約８０ｎＭ未満、例えば２０℃において約２０ｎＭ〜約７５ｎＭである。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は同じ条件下、例えば２０℃においてヘモグロビンのものよりも少なくとも約１００倍低値、又は約１０００倍低値である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満、例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１、又は０．６ｓ−１未満である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約０．０１〜約２００ｓ−１、例えば約０．１〜約２００ｓ−１、約０．１〜１００ｓ−１、約１．３５〜約２３．４ｓ−１、約１．３４〜約１８ｓ−１、約１．３５〜約１４．５ｓ−１、約０．２１〜約２３．４ｓ−１、約２〜約３ｓ−１、約５〜約１５ｓ−１、又は約０．１〜約１ｓ−１である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２解離定数は２０℃で約１００ｎＭ〜約１．９μＭであり、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化速度は３７℃で約１ｈ−１未満、例えば０．９ｈ−１、０．８ｈ−１、０．７ｈ−１、０．６ｈ−１、０．５ｈ−１、０．４ｈ−１、０．３ｈ−１、０．２ｈ−１、又は０．１ｈ−１である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１であり、そして、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化速度は３７℃で約１ｈ−１未満である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素に関するｋｏｆｆは２０℃で約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のヘム自動酸化速度は３７℃で約１ｈ−１未満であり、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白のＮＯ反応性は２０℃で約７００ｓ−１未満（例えば２０℃で約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１、又は１．８ｓ−１未満）である。
一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白溶液の粘度は１〜４センチポアズ（ｃＰ）である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白溶液のコロイド浸透圧は２０〜５０ｍｍＨｇである。
表３は野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白に関する例示される大きさ、酸素親和性、自動酸化安定性、ＮＯ反応速度、及び修飾を示す。表３において、ビヒクルの大きさは修飾された（例えばＰＥＧ化された）又は未修飾のＨ−ＮＯＸ蛋白の分子量を指す。
表３．Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例示される実施形態
Figure 2017137337
 特定の変異体に関する例示されるデータを表４〜１２に示す。表４〜１２において、β１及びＢ２はラットＨ−ＮＯＸ蛋白から誘導された蛋白を指す。哺乳類β１Ｈ−ＮＯＸドメインのアミノ酸配列は最大でも２アミノ酸の分だけ異なっているため、同様の結果が他の哺乳類のβ１Ｈ−ＮＯＸ蛋白、例えばヒトβ１における相当する変異に関して期待される。表４に示す通り、野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白内への変異１つ以上の導入により、自動酸化速度及びＯ２解離速度が改変できる。所望により、表４に示す一重又は二重の変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、自動酸化速度又はＯ２解離速度を更に改変できる。
表４．自動酸化に対する安定性、Ｏ２結合特性（例えばＯ２解離速度）及び遠位ポケットＨ結合残基を野生型及びクラスＩＩ変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白に関して記載する。
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 ａ：構築物は酸化（自動酸化速度、３７℃におけるｋｏｘ［ｈ−１］により評価）及び／又はヘム損失に対して安定である。ｂ：Ｏ２結合活性は２０℃におけるヘムからのＯ２解離速度により評価した（ｓ−１）。ｃ：３７℃２４時間の後、自動酸化の兆候はなお存在しない。ｄ：蛋白の僅かな部分のみがＯ２と複合体を形成し、報告された速度はこの集団に関する速度論的特徴を表している。ｅ：蛋白はＯ２に結合するが、ｋｏｆｆは測定しなかった。ｆ：相対的には安定であるが、この蛋白は酸化するに従って沈殿し、ｋｏｘの測定は困難であった。ｇ：不安定性又は急速な酸化のため、適用不能。ｈ：「安定ではない構築物」とは試験条件下で即座に蛋白が酸化することを意味する。ｉ：「僅かにより安定」とは蛋白が数分〜数時間の期間に渡って酸化するが、試験条件下で２４時間を超えて安定のまま残存することはないことを意味する。
表５は変異１つ以上の導入によるＨ−ＮＯＸ蛋白におけるＯ２会合速度（ｋｏｎ）、Ｏ２解離速度（ｋｏｆｆ）、Ｏ２解離定数（ｋＤ）、及び自動酸化速度（ｋｏｘ）の改変を示す。一部の実施形態においては、表５に示す一重又は二重の変異の何れかを別の変異（例えば表５の他の変異又は本明細書に記載する他の変異）と組み合わせることにより、Ｏ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２解離定数、自動酸化速度、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせが更に改変される。
表５．ヒスチジルライゲーションＦｅＩＩヘム蛋白に関するＯ２結合速度定数、（１）蛋白
Figure 2017137337
 ａ：２０℃における解離定数（ｎＭ）；ｂ：２０℃におけるヘムへのＯ２会合の速度（μＭ−１ｓ−１）；ｃ：２０℃におけるヘムからのＯ２解離の速度（ｓ−１）；ｄ：３７℃におけるヘム自動酸化の速度［ｈ−１］；ｅ：３７℃２４時間の後、自動酸化の兆候はなお存在しない。ｆ：蛋白の僅かな部分のみがＯ２と複合体を形成したが、この集団に関する速度論的特徴は測定できなかった。ｉ：Ｂｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５年６月）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１（１）：５３−５９；ｊ：未公表データ；ｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ａ．等（１９９４）、“Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｋｅｙ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ｉｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ａｍｏｎｇ Ｙｏｕｔｈ，”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９４：６９９−７１４；ｌ：Ｇｉｌｌｅｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ等（１９９４）、“Ｈｅｍｅ−Ｂａｓｅｄ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙｔｈｅ Ｋｉｎａｓｅ ＦｉｘＩ．，ａｒｅ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｈｅｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：８０６７−８０７７；ｍ：Ａｏｎｏ，Ｓ．等（２００２）“Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｒａｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｘｙｇｅｎ−Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｅｍＡＴ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｌｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３５２８−１３５３８，ｎ：Ａｎｔｏｎｉｎｉ，Ｅ．等（１９７１）、“Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｉｇａｎｄｓ，”Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。
表６はＨ−ＮＯＸ蛋白のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２、自動酸化速度、ＮＯ反応性、及びＦｅＩＩＯ２複合体の安定性が変異１つ以上の導入により改変される場合があることを示している。一部の実施形態においては、表６に示す一重又は二重の変異の何れかを別の変異（例えば表６の他の変異又は本明細書に記載する他の変異）と組み合わせることにより、Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２、自動酸化速度、ＮＯ反応性、又はＦｅＩＩＯ２複合体の安定性が更に改変される。当業者の知る通り、本明細書に記載するもののような追加的変異１つ以上の導入を用いてこれらの数値を更に改変してよい。
表６．Ｈ−ＮＯＸ蛋白のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２、自動酸化速度、ＮＯ反応性、及びＦｅＩＩＯ２複合体の安定性
Figure 2017137337
ａ：２０℃におけるヘムへのＯ２会合の速度（μＭ−１ｓ−１）；ｂ：２０℃におけるヘムからのＯ２解離の速度（ｓ−１）；ｃ：３７℃におけるヘム自動酸化の速度（ｈ−１）；ｄ：ＮＯ反応性の測定用：２０℃において、精製蛋白（ＴｔＷＴＨＮＯＸ、ＴｔＹ１４０ＨＨＮＯＸ、Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビン（ＨｓＨｂ））は２μＭにおいて緩衝液Ａ中に生成し、そして酸化窒素（ＮＯ）は２００μＭにおいて緩衝液Ａ中に生成した（緩衝液Ａ：５０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ）。ストップドフロースペクトル分析を用いながら、蛋白を急速にＮＯと１：１の比で混合し、組み込み時間は０．００１２５秒とした。最大変化の波長を片指数にフィットさせ、ＮＯによる酸化の律速段階を本質的に測定した。反応の最終生成物はＨＮＯＸ蛋白については第２鉄ＮＯ化物、ＨｓＨｂについては第２鉄の水和物であった。ｅ：ＨｓＨｂについては、ＮＯとの蛋白の反応は実験のデッドタイム内に反応が終了するほど高速であった（０．００１秒）。ヘモグロビンに関するＮＯ反応性はＥｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．等（１９９６）“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＮＯ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：６９７６−６９８３に基づけば２０℃において約７，０００ｓ−１である。
表７はＨ−ＮＯＸ蛋白における残基１つ以上を変異させることによりＯ２結合に関する解離定数を有意に変化させることができることを示している。これらの例示されるＨ−ＮＯＸ蛋白の速度論的ＫＤ値は２０℃で２１．２０ｎＭ〜１００００００．００ｎＭの範囲である。所望により、表７に示す一重又は二重の変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、Ｏ２結合に関する解離定数を更に改変できる。
表７．Ｏ２結合に関する解離定数の値により配置させた野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白及びレファレンス蛋白
Figure 2017137337
 表８はＨ−ＮＯＸ蛋白における残基１つ以上を変異させることによりＯ２結合に関する解離速度を有意に変化させることができることを示している。これらの例示されるＨ−ＮＯＸ蛋白に関する解離速度は２０℃で０．２１ｓ−１〜２３．４ｓ−１の範囲である。所望により、表８に示す一重又は二重の変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、Ｏ２結合に関する解離速度を更に改変できる。
表８．Ｏ２結合に関する解離速度の値により配置させた野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白及びレファレンス蛋白
Figure 2017137337
 表９はＨ−ＮＯＸ蛋白における残基１つ以上を変異させることによりＯ２結合に関する会合速度を有意に変化させることができることを示している。これらの例示されるＨ−ＮＯＸ蛋白に関する会合速度は２０℃で６０μＭ−１ｓ−１〜０．１４μＭ−１ｓ−１の範囲である。所望により、表９に示す一重又は二重の変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、Ｏ２結合に関する会合速度を更に改変できる。
表９．Ｏ２結合に関する会合速度の値により配置させた野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白及びレファレンス蛋白
Figure 2017137337
 ａ：「極めて緩徐」とはヘモグロビンより緩徐、例えばヘモグロビンより約１〜２桁緩徐であることを意味する。
表１０はＯ２及びＮＯ結合に対する例示されるＨ−ＮＯＸ変異の作用を示している。Ｆｅ未ライゲーション型に関して表１０に列挙した各数は単一のピークに関するものである（これはβとαのコラムの間に記載）。Ｏ２又はＮＯが結合する場合、この単一のピークは２つのピークβ及びαに分割する（これはそれぞれβ及びαのコラムの下部に示す）。所望により、表１０に示す一重又は二重の変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、Ｏ２又はＮＯ結合を更に改変できる。
表１０．一部のヒスチジルライゲーションＦｅＩＩヘム蛋白複合体に関するＵＶ可視光ピーク位置
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 表１１は一部のＦｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＯ、及びＦｅ（ＩＩ）−Ｏ２複合体に関するＵＶ可視光ピーク位置を含む。ヘモグロビン又はＨ−ＮＯＸ蛋白が嫌気的である場合、それは〜４３１ｎｍにおいてソレーピークを有し、そしてそれは未ライゲーション状態である。Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＯ２に結合しなければ、ソレーピークはＯ２を添加しても変化しない。Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＯ２に結合すれば、ソレーピークはＯ２を添加時に４１４ｎｍ〜４１８ｎｍにシフトし、これは、ヘムに結合したＯ２を示すヘモグロビンにおいて生じるシフトと同じである。酸化されたＨ−ＮＯＸ（Ｆｅ（ＩＩＩ））又はＨ−ＮＯＸがＮＯに６配位状態で結合したものに対するソレーピークは保存又は使用ののちのＨ−ＮＯＸ蛋白の状態に該当すると考えられる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＮＯに結合しなければ、ソレーピークはＮＯを添加しても変化しない。Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＮＯに結合し、６配位の第１鉄−ニトロシル複合体を形成すれば、ソレーピークはＮＯ添加時に４２０ｎｍ〜４２４ｎｍにシフトする。Ｈ−ＮＯＸ蛋白がＮＯに結合して５配位の第１鉄−ニトロシル複合体を形成すれば、ソレーピークは〜３９９ｎｍにシフトする。所望により、表１１に示す一重又は二重の変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、Ｏ２又はＮＯ結合を更に改変できる。
表１１．一部のＦｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＯ、及びＦｅ（ＩＩ）−Ｏ２複合体に関するＵＶ可視光ピーク位置
Figure 2017137337
Figure 2017137337
 表１２は例示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓＨ−ＮＯＸ蛋白に関する自動酸化速度を含む。所望により、表１２に示す変異の何れかを組み合わせることにより、又は、本明細書に記載した通りＨ−ＮＯＸ蛋白内に追加的変異１つ以上を導入することにより、自動酸化速度を更に改変できる。表１２中段における２ｎｍ及び３ｎｍの値は観察期間に渡って２〜３ｎｍＵＶ−Ｖｉｓソレーピークのシフトを指し；この極めて小さな変化は自動酸化に起因する可能性がある。
表１２．Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ（Ｔｔ）Ｈ−ＮＯＸ蛋白に関する自動酸化速度
Figure 2017137337
 ａ「安定」とは少なくとも２４時間後にヘム酸化が無いことを指す。「ＲＴ」が室温を指す。
Ｈ−ＮＯＸ核酸
本発明は更に本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の何れかをコードする核酸を特徴とする。本明細書においては、「核酸」とは、１本鎖又は２本鎖の何れかの形態における２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指し、そして特段の記載が無い限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の態様において核酸にハイブリダイズする天然に存在するヌクレオチドの既知類縁体を包含する。一部の実施形態においては核酸は組み換え核酸である。「組み換え核酸」とは、目的の核酸の由来元の生物の天然に存在するゲノム内において目的の核酸にフランキングしている核酸（例えば遺伝子）１つ以上を含まない目的の核酸を意味する。一部の実施形態においてＨ−ＮＯＸ核酸は、組み換え核酸がＨ−ＮＯＸ蛋白（例えばＨ−ＮＯＸ蛋白に由来する別のドメインを有するか有さないＨ−ＮＯＸドメイン）及びヒト血清アルブミンのような別の蛋白の全て又は部分を包含する融合蛋白をコードするように別の蛋白の全て又は一部分をコードする別の核酸に作動可能に連結している。従って用語は、例えばベクター内に、自律複製プラスミド又はウィルス内に、又は原核生物又は親核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた、又は他の配列から独立して別個の分子（例えばＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化により作成されたｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡフラグメント、又はｃＤＮＡフラグメント）として存在する組み換えＤＮＡを包含する。
本発明は更に本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の何れかをコードする核酸１つ以上を有するベクターを特徴とする。本明細書においては、「ベクター」とは、宿主細胞内に目的の核酸１つ以上を送達し、そして場合により発現することができる構築物を意味する。ベクターの例は限定しないがプラスミド、ウィルスベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、コスミド、及びファージベクターを包含する。一部の実施形態においてはベクターは発現制御配列の制御下にある核酸を含有する。「発現制御配列」とは、目的の核酸の転写を指向する核酸配列を意味する。発現制御配列はプロモーター、例えば構成又は誘導プロモーター、又はエンハンサーであることができる。発現制御配列は転写すべき核酸セグメントに作動可能に連結している。
特定の実施形態においては、核酸は図２〜４Ｄ又は８Ａ〜８ＤＤに示す核酸の何れかの核酸配列のセグメント又は全体を包含する。一部の実施形態においては、核酸はＨ−ＮＯＸ核酸の少なくとも約（５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又はそれより多い）隣接ヌクレオチドを包含し、そしてその誘導元のＨ−ＮＯＸ核酸と比較して変異１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０変異）を含有する。種々の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸はその誘導元のＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、約２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２つ未満の変異を含有する。本発明は又、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする何れかの核酸の変性変異体を特徴とする。
本発明は更に本明細書に記載する変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする核酸少なくとも１つを含有する細胞又は細胞集団を包含する。例示される細胞は、昆虫、植物、酵母、細菌、及び哺乳類細胞を包含する。これらの細胞は本明細書に記載する物のような標準的な方法を用いた変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の産生のために有用である。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の製剤
本明細書に記載する野生型又は変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は医薬組成物又は非医薬組成物の製剤のために使用してよい。後に考察する通りこれらの製剤は種々の治療及び産業上の用途において有用である。
一部の実施形態においては、医薬組成物は１つ以上の野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白（例えば本明細書に記載するＨ−ＮＯＸの野生型又は変異体の蛋白の何れか）及び製薬上許容しうる担体を包含する。種々の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は単離又は精製された蛋白である。「製薬上許容しうる担体」とは、活性成分と組み合わされた場合に、専門家の見地から、その成分が生物学的に活性を保持し、そして許容できない免疫応答（例えば重度のアレルギー又はアナフィラキシーショック）を誘発しない何れかの物質を指す。例としては、限定しないが、いずれかの標準的な薬学的担体、例えばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば水中油エマルジョン、及び種々の型の水和剤を包含する。エアロゾル又は非経腸投与用の例示される希釈剤は、リン酸塩緩衝食塩水又は規定度（０．９％）の食塩水である。そのような担体を含む組成物はよく知られた従来の方法により製剤される（例えば特に製剤に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照）。

当該分野で知られた何れかの適当な担体を本発明の医薬組成物において使用してよいが、担体の型は投与の様式により変動することになる。組成物は例えば静脈内、動脈内、膀胱内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内、又は経皮投与を包含する何れかの適切な投与方法のために製剤できる。皮下注射のような非経腸投与のためには、担体は例えば水、食塩水、アルコール、油脂、ワックス、又は緩衝液を包含してよい。経口投与のためには上記した担体の何れか、又は固体担体、例えばマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、又は炭酸マグネシウムを使用してよい。生体分解性の微小球（例えばポリラクテートポリグリコレート）もまた担体として使用してよい。
一部の実施形態においては、医薬組成物又は非医薬組成物は緩衝液（例えば中性緩衝食塩水、リン酸塩緩衝食塩水等）、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン等）、抗酸化剤、キレート形成剤（例えばＥＤＴＡ、グルタチオン等）、保存料、酸素の結合及び／又は輸送のために有用なその他の化合物、不活性成分（例えば安定化剤、充填剤等）、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせを包含する。一部の実施形態においては、組成物は凍結乾燥物として製剤される。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は又良く知られた技術を用いてリポソーム又はナノ粒子内にカプセル化してよい。Ｈ−ＮＯＸ蛋白のために使用できる他の例示される製剤は例えば特に蛋白の製剤に関して参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，９７４，７９５及び６，４３２，９１８に記載されている。
本明細書に記載した組成物は除放性製剤の部分として投与してよい（例えば投与後に化合物の緩徐な放出をもたらすカプセル又はスポンジのような製剤）。そのような製剤は一般的に良く知られた技術を用いて製造してよく、そして例えば経口、直腸、又は皮下移植により、又は所望の標的部位への移植により投与してよい。除放性製剤は担体マトリックス内に分散及び／又は速度制御膜により包囲されたリザーバ内に収容されたＨ−ＮＯＸ蛋白を含有してよい。そのような製剤内において使用するための担体は生体適合性であり、そして生体分解性であってもよい。一部の実施形態においては、製剤は比較的一定のレベルのＨ−ＮＯＸ蛋白の放出をもたらす。除放性製剤内に含有されるＨ−ＮＯＸ蛋白の量は移植部位、放出の速度及び予測される持続時間、及び治療又は防止すべき状態の性質に応じたものとなる。
一部の実施形態においては、医薬組成物は野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の有効量を含有する。「有効量」という用語は薬効及び毒性のそのパラメーターとの組み合わせにおいて専門家の見地から所定の治療形態において有効であるべき量を意図している。当該分野で知られる通り、有効量は１つ以上の用量であることができる。臨床分野において理解されている通り、医薬組成物の有効用量は別の薬剤、化合物、又は医薬組成物と組み合わせて達成されてもよく、されなくてもよい。即ち、有効量は治療薬１つ以上を投与するという文脈において考えることができ、そして、単一の薬剤は、１つ以上の多剤と組み合わせれば所望又は有利な結果が達成される場合には、有効量で与えられていると考えることができる。
血液代替物としてのヘモグロビンの例示される用量は、患者体重キログラム当たり細胞外ヘモグロビン約１０ｍｇ〜約５グラム以上である。即ち、一部の実施形態においては、ヒトへの投与のためのＨ−ＮＯＸ蛋白の有効量は数グラムから約３５０グラム超である。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の他の例示される用量は、例えば約０．５ｍｌ／分のような適切な注入速度において約４．４、５、１０、又は１３Ｇ／ＤＬ（Ｇ／ＤＬは循環系中への注入の前のＨ−ＮＯＸ蛋白溶液の濃度である）のいずれかを包含する（例えばＷｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｃｈａｐｔｅｒ１２，Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ参照）。当然ながら、必要な有効量は複数の投与の複合的作用により達成できるものであるから、各剤型の個々の用量中に含有される活性成分の単位含有量はそれ自体が有効量を構成しなくてもよい。医薬組成物に包含させるＨ−ＮＯＸ蛋白の量の選択は使用する剤型、治療すべき状態、及び当業者の決定に従って達成すべき特定の目的に応じたものとなる。
例示される組成物は遺伝子的に操作された組み換えＨ−ＮＯＸ蛋白を包含し、これは単離又は精製されてよく、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白と相対比較して改変されたＯ２又はＮＯリガンド結合を包括的に付与する１つ以上の変異を含み、そして生理学的に適合性のある哺乳類血液ガス担体として作動可能っであってよい。例えば、変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は本明細書に記載する物である。
本発明は又野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白１つ以上を含むか、これより本質的になる血液代替物を提供する。血液代替物を製剤するための適当な緩衝剤および他の成分は当業者の知る通りである。
医薬組成物を投与されるヒト対象における免疫応答を低減又は防止するためには、ヒトＨ−ＮＯＸ蛋白（野生型ヒト蛋白又は変異１つ以上が導入されているヒト蛋白）又は他の非抗原性Ｈ−ＮＯＸ蛋白（例えば哺乳類Ｈ−ＮＯＸ蛋白）を使用できる。ヒト以外の原料から誘導されたＨ−ＮＯＸ蛋白の免疫原性を低減又は排除するためには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白内のアミノ酸をヒトＨ−ＮＯＸ内の相当するアミノ酸に変異させることができる。例えば、非ヒトＨ−ＮＯＸ蛋白の３次構造の表面上のアミノ酸１つ以上をヒトＨ−ＮＯＸ蛋白内の相当するアミノ酸に変異させることができる。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の治療用途
本明細書に記載する野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の何れか（例えば単離又は精製されたＨ−ＮＯＸ蛋白）又は医薬組成物を治療用途に使用してよい。このような用途のために、特定のＨ−ＮＯＸ蛋白を、治療すべき特定の適応症に対して所望のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に関する解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自動酸化速度、血漿中保持時間、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせに基づいて選択することができる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は心臓血管疾患、神経学的疾患、腫瘍低酸素、失血、又は創傷を治療するために使用できる。例えばＯ２結合Ｈ−ＮＯＸ蛋白は赤血球又は血漿エキスパンダーが現在使用されている大部分の状況において使用できる。特定すれば、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は外傷（例えば戦地、災害救援、又は事故）、出血、出血性ショック、外科処置（例えば腹部動脈瘤手術、整形外科的手術、例えば腰骨置換手術、又は大量の失血をもたらす何れかの他の手術）、血液希釈、及び血液延長使用（例えば補給自己献血）、及び血液のぼる量が損失しているか、Ｏ２運搬能力が低減している何れかの他の状況の治療のために赤血球代替物として使用できる。創傷修復用途の例は、放射線後の創傷の修復（例えば高圧酸素作用）、術後修復、糖尿病性潰瘍修復、及び熱傷を包含する。
酸素結合Ｈ−ＮＯＸはまた、個体へ自己由来血液を戻す前の自己由来血液の事前献血の最中又は後にＯ２送達を一時的に強化するために（例えば個体の血液を摘出し、手術終了時又は回復中に再注入するために温存しておく外科的処置中に取り出される血液の置き換えとして）使用できる。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は大型のＨ−ＮＯＸ蛋白分子の存在に起因するコロイド浸透圧を与える単純な体積膨張剤としても機能する。
細胞外Ｈ−ＮＯＸ蛋白の欠陥における分布は赤血球の大きさにより制限されないため、補のＨ−ＮＯＸ蛋白は赤血球が進入できない区域にまでＯ２を送達するために使用できる。これらの区域は赤血球の流動に対する閉塞部の下流に位置する何れかの組織の区域、例えば１つ以上の血栓、鎌状赤血球閉塞部、動脈閉塞部、末梢血管閉塞部、血管形成術用バルーン、外科的器具、酸素飢餓にり患しているか、低酸素である組織等の下流のエリアを包含できる。更に又、組織虚血の全ての型をＨ−ＮＯＸ蛋白で治療できる。そのような組織虚血は、例えば手術前後の虚血、卒中、顕現性卒中、一過性虚血発作、心筋の撹乱及び休止、急性又は不安定狭心症、顕現性狭心症、及び心筋梗塞（例えばＳＴ部分上昇心筋梗塞）を包含する。Ｈ−ＮＯＸ蛋白を用いて治療できる他の例示される心臓血管の適応症は心臓麻痺及び鎌状赤血球貧血を包含する。例示される標的適応症は機能的ヘモグロビン不全の状態、例えば失血、低酸素等を包含する血液代替物又はＯ２担体の適応症とされる場合を包含する。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白は又、癌の治療のための放射線又は化学療法への補助として使用できる。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は固形腫瘍における放射線療法の補助として（例えば不良な転移前予後を有する個体）、又は表面腫瘍におけるＰＤＴ療法の補助として（例えば結腸、肺、又は皮膚の癌、又は他の接触可能な表面の位置の癌）使用される。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白は貧血に罹患している患者において追加的酸素担持能力を提供することにより貧血を治療するために使用できる。例示される神経学的適応症は虚血発作、外傷性脳傷害、及び脊髄傷害を包含する。方法及び組成物は急性（組織又は特定部位への急速な酸素供給、例えば急性心筋梗塞、急性局所又は全身組織酸素付与、又は輸血）及び慢性の状況（例えば心筋梗塞からの急性期の回復の後）の両方に対して適用される。
種々の実施形態において、本発明は個体（例えば哺乳類、例えば霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコ）にＯ２を送達するために十分な量の野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白を、それを必要とする個体に投与することによる、個体にＯ２を送達する方法を特徴とする。一部の実施形態においては、本発明はＨ−ＮＯＸ組成物１つ以上を個体（例えば哺乳類）の血液に送達する工程（例えば輸血など）を含む哺乳類のような個体に血液ガスを担持又は送達する方法を提供する。Ｏ２担体を血液又は組織（例えば哺乳類の血液又は組織）に送達するための方法は当該分野で知られている。種々の実施形態においてＨ−ＮＯＸ蛋白はヘムを結合できるアポ蛋白であるか、又は結合ヘムを有するホロ蛋白である。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は個体へのＨ−ＮＯＸ蛋白の投与の前に結合ヘムを有していてもいなくてもよい。一部の実施形態においては、Ｏ２はそれが個体に送達される前にＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する。他の実施形態において、Ｏ２は個体へのＨ−ＮＯＸ蛋白の投与前には蛋白に結合せず、そして、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は個体のある位置から個体の別の位置にＯ２を輸送する。
本発明の方法は何れかの個体を治療するために使用できる。本明細書における使用のためには、明確に特段の記載が無い限り、「個体」とは、本明細書においては、哺乳類、例えば限定しないが霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコを意図している。即ち、本発明は人間の医薬品及び農業用の動物及び家庭用愛玩動物における使用を包含する獣医科の範囲の両方において使用される。個体は心臓血管疾患、神経学的疾患、低酸素症（例えば腫瘍低酸素）、失血、又は創傷のような適応症を有するか、有することが疑われるか、又は発症の危険があると診断されていてよい。個体は適応症に関連する症状１つ以上を呈してよい。個体は遺伝子的に、又は別様にそのような状態を発症する素因を有することができる。
本明細書においては、「〜の必要のある」とは、状態又は疾患（例えば心臓血管疾患、神経学的疾患、低酸素症、例えば腫瘍低酸素、失血、又は創傷）を有するか、状態又は疾患の「危険性がある」個体を包含する。本明細書においては、「危険性がある」とは、神経学的疾患、低酸素症（例えば腫瘍低酸素）、失血、又は創傷のような状態を発症する危険性がある個体である。「危険性がある」個体は検出可能な疾患又は状態を有していてもいなくてもよく、そして本明細書に記載した治療方法よりも前に検出可能な疾患を呈していてもいなくてもよい。「危険性がある」とは、疾患又は状態の発症と相関し、そして当該分野で知られた測定可能なパラメーターであるいわゆる危険因子１つ以上を個体が有することを指す。これらの危険因子１つ以上を有する個体はこれらの危険因子を有さない個体よりも疾患又は状態を発症するより高値の確率を有している。これらの危険因子は、限定しないが、年齢、性別、人種、食餌、病歴、前駆疾患の存在、遺伝子的（即ち遺伝的）な問題、及び環境への曝露を包含する。手術、軍事又は戦争の地域内又は近傍における存在、又は個体を失血し易くする状態（例えば血友病）が例示される失血危険因子である。
これらの方法はＯ２の送達が有利であるいずれかの状態を治療又は遅延させるために使用できる。「治療」又は「治療する」とは、臨床的結果を包含する有利又は所望の結果を得るための方策を意味する。本発明の目的のためには、有利又は所望の結果とは、限定しないが、状態（例えば限定しないが心臓血管疾患、神経学的疾患、低酸素症、例えば腫瘍低酸素、失血、又は創傷）に関連する症状の軽減、状態に関連する症状の範囲の減衰、又は状態に関連する症状の悪化の防止を包含する。一部の実施形態においては、本明細書に開示した蛋白１つ以上を用いた治療の副作用は全く無いか、又は現在使用できる治療法に伴うものよりも少ない。
本明細書においては、疾患又は状態の発症を「遅延させる」とは、心臓血管疾患、神経学的疾患、低酸素症（例えば腫瘍低酸素）、失血、又は創傷のような疾患又は状態の発症を変化、遮蔽、緩徐化、遅延、安定化及び／又は延期させることを意味する。この遅延は治療すべき疾患及び／又は個体の履歴に応じて、種々の長さの時間であることができる。当該分野で知られる通り、十分又は顕著な遅延都は、実際には個体が疾患又は状態を発症しない場合である防止も包含する。例えば、方法は方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠における疾患の発症の確率を低減及び／又は所定の時間枠における疾患の範囲を低減してよい。一部の実施形態においては、そのような比較は統計学的に有意な数の対象を用いた臨床試験に基づく。疾患の発症は標準的な臨床手法を用いて検出できる。発症は又、初期には検出不可能である場合がある疾患の進行も指してよく、そして、存在、再発、及び発現を包含する。
相対的に低値のＯ２に対するＫＤ（例えば約８０ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満）を有する野生型又は変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白は、低酸素張力を有する組織（例えば腫瘍、一部の創傷、又は酸素張力が極めて低値、例えば１ｍｍＨｇ未満のｐ５０であるような他の区域）を治療するために特に有用であることが期待される。Ｏ２に対するそのようなＨ−ＮＯＸ蛋白の高い親和性は、Ｏ２がＨ−ＮＯＸ蛋白に結合した状態で残存する時間の長さを増大させ、それにより、治療すべき組織にＨ−ＮＯＸ蛋白が到達する前に放出されるＯ２の良を低減する。
特定の理論に制約されないが、無細胞赤血球代替物の蘇生液としての利用はＯ２担体のｐ５０の影響を受けると考えられる。例えばＭＰ４と称されるＰＥＧ化ヘモグロビン系Ｏ２担体は一部の低親和性ヘモグロビン系Ｏ２担体よりも効率的に微小血管にＯ２を送達すると考えられる。ＭＰ４は〜５ｍｍＨｇ（おそらくは１００〜２００ｎｍＫＤ）のｐ５０を有すると報告されており、そして、支質非含有のヘモグロビンｐ５０は１４ｍｍＨｇ（〜４００ｎｍＫＤ）である。ＭＰ４は組織中の酸素送達が可能であるため（ＰＯ２〜５から１０ｍｍＨｇ）、ビヒクルが低酸素組織にＯ２を送達するための適切なＯ２親和性は約５ｍｍＨｇ未満、そして恐らくは約２ｍｍＨｇ未満であり、これは約８０ｎｍ未満のＫＤに相当する。これらの値はＭＰ４がネイティブのヘモグロビンよりも高値のＯ２親和性（低値のｐ５０）で操作されていることを示している。平衡の見地から、このことは高親和性Ｏ２結合蛋白は末梢血管のような低いＯ２張力の区域に対してより良好にＯ２を送達することを示唆している。
身体内の特定部位（例えば組織、臓器、創傷、又は腫瘍）への結合Ｏ２を有するＨ−ＮＯＸ蛋白の直接の送達に関する一部の実施形態においては、Ｏ２は既に蛋白に結合しており（ｋｏｎの重要性を低下させる）、そして酸素は身体内の特定の部位又はその近傍において放出される必要があるため、Ｏ２のｋｏｆｆはＫＤ値より重要である。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白が循環系中の赤血球の存在下にある場合にもｋｏｆｆが重要となるが、この場合、それらは赤血球からのＯ２の拡散を促進し、そして恐らくは血管中のより遠い地点までＯ２を輸送する希釈赤血球の能力を延長させると考えられる。
個体の血流中を循環するＨ−ＮＯＸ蛋白の送達に関する一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は肺内のＯ２に結合し、そして身体内の別の部位１つ以上においてＯ２を放出する。これらの用途の一部については、Ｏ２結合がほぼ平衡となっているためｋｏｆｆよりもＫＤ値が重要である。極端な血液希釈に関する一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はそれが循環系を通過して移動する際に連続的にＯ２に結合し、それを放出することになるため、Ｈ−ＮＯＸ蛋白が主要なＯ２担体である場合にはＫＤ値はｋｏｆｆより重要となる。ヘモグロビンは１４ｍｍＨｇのｐ５０を有しているため、赤血球（キャパシタのように作用する）は〜３０ｍｍＨｇのｐ５０を融資、そしてＨＢＯＣは５ｍｍＨｇ〜９０ｍｍＨｇの範囲のものが開発されており、従ってＨ−ＮＯＸ蛋白の最適ＫＤ範囲は一部の用途においては〜２ｍｍＨｇから〜１００ｍｍＨｇとなる場合がある。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白は又、画像化にも使用できる。特に光画像化（例えば光学的コヒーレンス断層撮影；例えば特に光学的コヒーレンス断層撮影に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＶｉｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．（２００２）“Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｂｌｏｏｄ
Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｒｉｎｅ Ｒｉｇｈｔ Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５：１８４３−１８４９参照）は赤血球により陰影化される。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は赤血球よりはるかに小さいため、Ｈ−ＮＯＸ溶液を用いた灌流により循環系及び血管壁のより鮮明な画像が得られる。
本発明のＨ−ＮＯＸ蛋白及び医薬組成物は何れかの従来の手段、例えば経口、眼内、髄腔内、肺内、気管内、又はエアロゾル投与により；経皮又は粘膜吸着により；又は注射（例えば皮下、静脈内、動脈内、膀胱内、又は筋肉内注射）により個体に投与できる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は又、血液代替物としての使用のための大量の非経腸溶液中に包含させることができる。例示される実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は血液（例えば静脈、動脈、又は毛細血管のような血管への投与）、創傷、腫瘍、低酸素組織、又は低酸素臓器に投与される。
一部の実施形態においては、組成物の除放性持続放出製剤を使用する。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の投与は例えば投与の目的に応じて数秒〜数時間の期間において行うことができる。例えば、血液送達ビヒクルとして、投与の例示される時間経過は可能な限り急速である。他の例示される時間経過は約１０、２０、３０、４０、６０、９０、又は１２０分のいずれかを包含する。血液代替物としてのＨ−ＮＯＸ溶液の例示される注入速度は約３０ｍＬ／時間〜約１３，２６０ｍＬ／時間、例えば約１００ｍＬ／時間〜約３，０００ｍＬ／時間である。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の例示される総用量は１３，２６０ｍＬ／時間において２０分間に渡り投与される約９００ｍｇ／ｋｇである。ブタに対するＨ−ＮＯＸ蛋白の例示される総用量は約１８．９グラムである。
例示される投薬頻度は、限定しないが一週間に少なくとも１、２、３、４、５、６、又は７回（即ち毎日）を包含する。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は一日に少なくとも２、３、４又は６回投与する。Ｈ−ＮＯＸ蛋白は例えば数日間又は数週間の期間に渡って投与できる。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はより長期間、例えば数カ月又は数年間投与される。組成物の投薬頻度は担当医の判断に基づいて治療の過程に渡って調節される。
上記した通りＨ−ＮＯＸ蛋白の投薬量の選択は、利用する剤型、投与の頻度及び回数、治療すべき状態、及び当業者の判断による達成すべき特定の目的に応じたものとなる。一部の実施形態においては、ヒトへの投与のためのＨ−ＮＯＸ蛋白の有効量は数グラム〜３５０グラム超となる。
一部の実施形態においては、２種以上の異なるＨ−ＮＯＸ蛋白を同時、逐次的、又は併用的に投与する。一部の実施形態においては、Ｏ２の送達のために有用な別の化合物又は治療薬をＨ−ＮＯＸ蛋白１つ以上の投与と同時、逐次的、又は併用的に投与する。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白を使用できる１つの例示される治療用途は、例えば特にＯ２担体の治療用途に関して参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，９７４，７９５及び６，４３２，９１８に記載されている。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の産業上の用途
本明細書に記載したＨ−ＮＯＸ蛋白及び組成物は又、多くのインビトロ又は産業上の用途のために使用できる（特にインビトロ又は産業上の用途に関して参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，４５５，６７６参照）。このような用途に対して、特定のＨ−ＮＯＸ蛋白は、上記した用途のために望ましいＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に関する解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自動酸化速度、半減期、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせに基づいて選択することができる。産業上の用途の種々の実施形態においてＨ−ＮＯＸ蛋白はヘムに結合できるアポ蛋白、又は結合したヘムを有するホロ蛋白である。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白は例えばレファレンス標準物質として、そのようなレファレンス標準物質を必要とする分析用計器類のために使用できる。Ｈ−ＮＯＸ蛋白によるＯ２の送達はインビトロにおけるＯ２レベルを維持または上昇させることにより、細胞培養物中の細胞の生育を増強させるために使用できる。これらの用途のためには、Ｈ−ＮＯＸ蛋白は培地に（そして培地中の細胞に）Ｏ２を送達するために細胞培養用培地に添加することができる。一部の実施形態においては、Ｏ２はそれが細胞培養用培地に添加される前にＨ−ＮＯＸ蛋白に結合する。別の実施形態においては、Ｏ２はそれが細胞培養用培地に添加される前にはＨ−ＮＯＸ蛋白に結合せず、そしてＨ−ＮＯＸ蛋白は培地中のある位置から培地中の別の位置にＯ２を輸送する。
或いは、細胞を遺伝子的に修飾することによりＨ−ＮＯＸ蛋白をコードさせ、これにより、細胞により得られるＯ２の量を増大させることができる。例えば目的の化合物（例えば医薬品用途において有用な小分子又は蛋白）を発現する細胞を遺伝子的に修飾することにより、特に低Ｏ２条件下で細胞の生育を促進するＨ−ＮＯＸ蛋白を生産することもできる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ等（２００６）、“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈｉｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｖｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：１３７４−８７；Ｆｒｅｙ等（２００１）、“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃａｒｂｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ ｂｙ １３Ｃ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｆｌｕｘ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，”Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ６７（２）：６８０−６８７）。更に又、Ｈ−ＮＯＸ蛋白はＯ２の除去を必要とする溶液からのＯ２を除去するために使用できる。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白を有するキット
本明細書に記載したＨ−ＮＯＸ蛋白の何れか及び適当なパッケージを包含する製造物品及びキットも提供される。一部の実施形態においては、本発明は（ｉ）Ｈ−ＮＯＸ蛋白（例えば本明細書に記載した野生型又は変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白又は本明細書に記載したその製剤）及び（ｉｉ）個体にＯ２を送達するためにキットを使用するための説明書を伴ったキットを包含する。種々の実施形態において、本発明は（ｉ）Ｈ−ＮＯＸ蛋白（例えば本明細書に記載した野生型又は変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白又は本明細書に記載したその製剤）及び（ｉｉ）本明細書に記載した産業上の使用の何れかのためにキットを使用する（例えばレファレンス標準物質としてのそのようなレファレンス標準物質を必要とする分析用計器類のためのＨ−ＮＯＸ蛋白の使用、インビトロにおけるＯ２レベルを維持または上昇させることによる細胞培養物中の細胞生育の増強、溶液へのＯ２の添加、又は溶液からのＯ２の除去）ための説明書を伴ったキットを特徴とする。
本明細書に記載した組成物のための適当なパッケージは当該分野で知られており、そして例えばバイアル（例えば密封バイアル）、チューブ、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージ（例えば密封Ｍｙｌａｒ又はプラスチックバッグ）等を包含する。これらの製造物品は更に滅菌及び／又は密封してよい。本明細書に記載した組成物を含む単位剤型も提供される。これらの単位剤型は、単一又は多数の単位投薬として適当なパッケージ中に保存することができ、そしてやはり更に滅菌及び密封してよい。本発明のキットにおいて供給される説明書は典型的にはラベル又はパッケージインサート（例えばキットに包含される用紙）上の書面による説明書であるが、機械読み取り式の説明書（例えば磁気又は光学的保存ディスク上に保持されている説明書）も許容される。Ｈ−ＮＯＸ蛋白の使用に関する説明書は一般的に、意図する治療のため、又は産業上の使用のための用量、投薬日程、及び投与経路に関する情報を包含する。キットは更に治療に適する個体を選択することに関する説明も含んでよい。
容器は又単位用量、バルクパッケージ（例えば多用量パッケージ）又はサブ単位用量であってよい。例えば、キットは１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月又はそれより長期の長期間に個体に対して有効な治療をもたらすための本明細書に開示したＨ−ＮＯＸ蛋白の十分な量を含有する物として提供してよい。キットは又Ｈ−ＮＯＸ蛋白の多重単位用量及び使用のための説明書を包含し、そして、薬局、例えば病院薬局及び調剤薬局における保存及び使用のために十分な量でパッケージしてよい。一部の実施形態においては、キットは、再建、再懸濁、又は水和させることにより一般的にＨ−ＮＯＸ蛋白の安定な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば凍結乾燥）組成物を包含する。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の産生のための例示される方法
本発明は又本明細書に記載した変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の何れかの産生のための方法を提供する。一部の実施形態においては、方法は変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の産生に適する条件下に変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白をコードする核酸を有する細胞を培養することを包含する。種々の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸはまた精製される（例えば細胞又は培養用培地からのＨ−ＮＯＸ蛋白の精製）。
上記した通り、数種の野生型Ｈ−ＮＯＸ蛋白及び核酸の配列は知られており、そして本発明の変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白及び核酸を形成するために使用できる。組み換えＨ−ＮＯＸ蛋白の変異、発現、及び精製のための手法は、例えば特に組み換えＨ−ＮＯＸ蛋白の変異、発現、及び精製に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：５３−５９及びＫａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．等（２００４年８月１０日）、“Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ Ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（３１）：１０２０３−１０２１１により記載されている。これらの手法及び他の標準的手法を何れかの変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の形成のために使用することができる。
特に、本明細書に記載した変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白は当該分野で知られており、多くの方法により形成できる。変異はアミノ酸の化学修飾によりアミノ酸レベルにおいて、又は、所定のアミノ酸に対してコードするヌクレオチド配列の改変によりコドンレベルにおいて、生じることができる。蛋白中の何れかの所定位置におけるアミノ酸の置換はそのアミノ酸に対してコードするコドンを改変することにより達成することができる。これは例えば（ｉ）Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．等（１９８５年１２月２０日）、“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｅｐａｒｅ Ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（２４）：８４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．等（１９８５年１２月２０日）、“Ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（２４）：８７６５−８７８５；Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．Ｌ．等（１９８６年１２月２２日）、“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＮｃｉＩ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ Ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（２４）：９６７９−９６９８；及びＤｅｎｔｅ等（１９８５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．７９１−８０２の方法に基づいたＡｍｅｒｓｈａｍの手法（Ａｍｅｒｓｈａｍ変異誘発キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、（ｉｉ）Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、又は（ｉｉｉ）Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５年１月）、“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２（２）：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８７）、“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｋｕｎｋｅｌ米国特許４，８７３，１９２の方法に基づいたＢｉｏｒａｄキット（Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）を用いた部位指向性変異誘発により達成でき、これらの各々は特に蛋白の変異誘発に関して参照により全体が本明細書に組み込まれる。変異誘発は又、他の市販の、又は非市販の手段、例えば変異体オリゴヌクレオチドとともに部位指向性変異誘発を利用するものによっても達成できる。
部位指向性変異誘発は又、特に蛋白の変異誘発に関して各々が参照により全体が本明細書に組み込まれるＺｅｎｇｂｉｎ等（１９９２）、ｐ．２０５−２０７、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｈ．等（１９９０年２月）“Ａ Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎｄ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｉｒｃｌｅｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ８（２）：１７８−１８３；Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｈ．等（１９９１年１月）、“Ａ Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｆｉｃｉｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｐｌａｃｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄｓ ｏｎ ＤＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０（１）：６２−６６に記載されているようなＰＣＲ系変異誘発を用いて達成することもできる。部位指向性変異誘発は又当該分野で知られた手法とともにカセット変異誘発を用いながら達成することもできる。
変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸は標準的な手法を用いて発現ベクターのようなベクター内に取り込むことができる。例えば制限酵素を使用することにより変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸とベクターを切断することができる。次に、切断した変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸と切断したベクターの適合する末端をライゲーションすることができる。形成したベクターはコードされたＨ−ＮＯＸ蛋白の発現のための標準的な手法（例えばエレクトロポレーション）を用いて細胞（例えば昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）内に挿入できる。
特に、非相同蛋白は昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、及び細菌細胞のような多くの生物発現系において発現されている。即ち、何れかの適当な生物蛋白発現系を利用することにより大量の組み換えＨ−ＮＯＸ蛋白を産生できる。一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白（例えば変異体又は野生型のＨ−ＮＯＸ蛋白）は単離された蛋白である。本明細書においては、「単離された蛋白」とは、例えば核酸、脂質、及び他の蛋白を包含する自然界において蛋白が天然に会合している化合物１つ以上から分離されている蛋白を意味する。単離された蛋白とは又、例えば異なる蛋白２、５、１０、２０、５０又はそれより多くのライブラリのような蛋白のライブラリ中には存在しない。単離された蛋白は例えば蛋白をコードする組み換え核酸の発現により、又は、蛋白の化学合成により、得ることができる。
所望によりＨ−ＮＯＸ蛋白は標準的な手法を用いて精製することができる。本明細書においては、「精製された蛋白」とは、蛋白が生成された時点において存在する化合物１つ以上から分離されている蛋白（例えば変異体又は野生型のＨ−ＮＯＸ蛋白）を意味する。一部の実施形態においては、蛋白は蛋白が生成された時点に存在する他の成分を少なくとも約６０重量％含有しない。種々の実施形態において、蛋白は少なくとも約７５重量％、９０重量％、又は９９重量％純粋である。精製された蛋白は例えば天然原料、組み換え発現系、又は化学合成用の反応混合物からの精製（例えば抽出）により得ることができる。精製の例示される方法は免疫沈降、カラムクロマトグラフィー、例えば免疫アフィニティークロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫アフィニティー精製、及びプレート結合抗体を用いたパニング、並びに当該分野で知られた他の手法を包含する。純度は何れかの適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析により試験できる。一部の実施形態においては、精製された蛋白は本発明の医薬組成物に配合されるか、又は本発明の方法において使用される。本発明の医薬組成物は精製された蛋白の外に添加剤、担体、又は他の成分を有してよい。
本発明の純粋な例示であることを意図し、本発明を如何様にも限定するものとみなしてはならない実施例も又、上記考察した本発明の特徴及び実施形態を説明及び詳述する。実施例は後述する実験が実施した実験の全て又はこれらに限定されることを示す意図はない。特段の記載が無い限り、温度は摂氏で示し、圧力は概ね大気圧である。
実施例１：野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白の産生
野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白は本質的に、特にＨ−ＮＯＸ蛋白の変異誘発、発現、及び精製に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：５３−５９、及びＫａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．等（２００４年８月１０日）、“Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ Ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（３１）：１０２０３−１０２１１により記載される通り、標準的な方法を用いて産生、発現、及び精製した。変異誘発はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より入手したＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）プロトコルをもちいて実施した。細胞培養物中の蛋白の発現及びその後の蛋白の精製はＫａｒｏｗ，Ｄ．Ｓ．等（２００４年８月１０日）、“Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ｌｉｋｅ Ｈｅｍｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ Ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（３１）：１０２０３−１０２１１により記載される通り実施した。
実施例２：変異体Ｈ−ＮＯＸ蛋白の酸素送達ビヒクルとしての特性化
速度論的ＫＤ：ｋｏｆｆのｋｏｎに対する比
速度論的ＫＤ値は本質的に、特にＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に関する解離定数、自動酸化速度、及びＮＯ解離速度に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＢｏｏｎ，Ｅ．Ｍ．等（２００５）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ Ｆｏｒ ＮＯ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕａｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１：５３−５９による記載の通り野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白に関して測定した。
ｋｏｎ（Ｏ２会合速度）
ヘムへのＯ２会合は２０℃においてフラッシュフォトリシスを用いて測定した。極めて高速の重複組み換え動態の結果としてＦｅＩＩＯ２複合体をフラッシュオフすることは不可能であり；即ちＦｅＩＩＯ２複合体を５６０ｎｍにおけるレーザー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いたフラッシュフォトリシスに付すことにより、５−配位のＦｅＩＩ中間体を生成し、これに分子状Ｏ２の結合を種々の波長において行った。蛋白試料は１０ｍＭジチオナイトを用いた嫌気的還元、その後のＰＤ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上の脱塩により行った。次に試料をサイズ１００μＬ〜１ｍＬ及びパス長１ｃｍの制御大気圧石英キュベット中５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中で２０μＭヘムまで希釈した。ＣＯガスを１０分間このキュベットのヘッドスペース上に流すことによりＦｅＩＩＣＯ複合体を形成し、その形成はＵＶ可視光スペクトル分析（ソレー最大４２３ｎｍ）により確認した。次にこの試料は、なおＣＯガス１気圧下にある時点でフラッシュフォトリシス後にＣＯ再結合動態を測定するために使用するか、又は、開封して空気中３０分間攪拌することにより緩衝液に完全に酸素付与した後にフラッシュフォトリシスを行うことによりＯ２再結合事象を観察した。ヘムへのＯ２会合は時間に対して多数の波長においてモニタリングした。これらの軌跡をＩｇｏｒ Ｐｒｏソフトウエア（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｓｗｅｇｏ，ＯＲ；最新２００５バージョン）を用いて片指数にフィットさせた。この速度は観察波長とは独立していたが、Ｏ２濃度には依存しており、ＵＶ可視光スペクトル分析を常時使用することにより全ての複合体及び中間体を確認した（Ｃａｒｙ ３Ｋ，Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。一過性吸収データを特に計器類に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＤｍｏｃｈｏｗｓｋｉ，Ｉ．Ｊ．等（２０００年８月３１日）、“Ｅｎａｎｔｉｏｉｍｅｒｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｕ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｃａｍ，”Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１（３）：２２１−２２８に記載の機材を用いて収集した。機器は応答時間２０ｎｓであり、データは２００メガサンプルｓ−１においてデジタル化した。
ｋｏｆｆ（Ｏ２解離速度）
ｋｏｆｆを測定するために、嫌気的５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中に希釈した蛋白のＦｅＩＩＯ２複合体（５μＭヘム）を種々の濃度のジチオナイト及び／又は飽和ＣＯガスを含有する同じ緩衝液（嫌気的）等容量と急速に混合した。データは２０℃にセットしたＮｅｓｌａｂ ＲＴＥ−１００恒温槽を装着したＨＩ−ＴＥＣＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＦ−６１ストップドフロー分光光度計上で獲得した（ＴＧＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＤ．，Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｏｎ Ａｖｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。ヘムからのＯ２の解離は４３７ｎｍ、即ちＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−Ｏ２差スペクトル、又は４２５ｎｍ、即ちＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−ＣＯ差スペクトルにおける吸光度の増分としてモニタリングした。最終軌跡を機器の一部であるソフトウエアを用いながら片指数にフィットさせた。各実験は最低６回実施し、得られた速度を平均した。測定した解離速度はジチオナイト濃度（１００、５０、２５、１０及び２．５ｍＭジチオナイトを試験した）から独立しており、そして１０ｍＭジチオナイト存在下及び非存在下の両方において還元された物質種のためのトラップとしての飽和ＣＯからも独立していた。
速度論的ＫＤ
速度論的ＫＤは上記したｋｏｆｆおよびｋｏｎの測定を用いてｋｏｎに対するｋｏｆｆの比を計算することにより求める。
計算されたＫＤ
計算されたＫＤを求めるために、上記の通り得られたｋｏｆｆ及び速度論的ＫＤの値をグラフ化した。ｋｏｆｆ及び速度論的ＫＤの間の直線関係は等式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）により定義した。次にｋｏｆｆ値を直線に外挿し、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いながら計算されたＫＤを誘導した。測定されたｋｏｆｆがない場合は、この外挿はＫＤにｋｏｆｆを関連付ける方法を与える。
自動酸化速度
自動酸化速度を測定するために、蛋白試料を嫌気的に還元し、次に好気的な５０ｍＭＴＥＡ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中５μＭヘムとなるまで希釈した。次にこれらの試料を３７℃にセットしたＮｅｓｌａｂＲＴＥ−１００恒温槽を装着したＣａｒｙ３Ｅ分光光度計中でインキュベートし、周期的にスキャンした（Ｃａｒｙ ３Ｅ、Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。自動酸化速度は時間に対してプロットし、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いながらフィットさせたＦｅＩＩＩ−ＦｅＩＩ差スペクトルにおける最大と最小の間及びの差から求めた。
ＮＯとの反応の速度
ＮＯ反応性は緩衝液Ａ中に２μＭに産生された精製蛋白（ＴｔＷＴＨＮＯＸ、ＴｔＹ１４０ＨＨＮＯＸ及びＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビン（ＨｓＨｂ））及びＢｕｆｆｅｒＡ（ＢｕｆｆｅｒＡ：５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中２００μＭに産生されたＮＯを用いて測定した。データは２０℃にセットしたＮｅｓｌａｂＲＴＥ−１００恒温槽を装着したＨＩ−ＴＥＣＨＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳＦ−６１ストップドフロー分光光度計上で獲得した（ＴＧＫＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＤ．，Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｏｎ Ａｖｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。蛋白は迅速にＮＯと１：１比で混合し、その組み込み時間は０．００１２５秒とした。最大変化の波長を分光光度計の部分であるソフトウエアを用いて片指数にフィットさせ、ＮＯによる酸化の律速段階を本質的に測定した。反応の最終生成物はＨＮＯＸ蛋白については第２鉄−ＮＯであり、ＨｓＨｂについては第２鉄水和物であった
ｐ５０測定
所望により変異体又は野生型のＨ−ＮＯＸ蛋白のｐ５０値を、特にｐ５０値測定に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＧｕａｒｎｏｎｅ，Ｒ．等（１９９５年９月／１０月）“Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ”、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ８０（５）：４２６−４３０の記載の通り測定することができる。ｐ５０値はＨｅｍＯｘ分析器を用いて求める。測定チャンバーは０％酸素において指導させ、そして緩徐に１００％酸素となるまで漸次上昇させる。チャンバー内の酸素プローブが酸素飽和％を測定する。第２のプローブ（ＵＶ−Ｖｉｓ光）はヘモ蛋白（例えばヘムと複合体化しているＨ−ＮＯＸのような蛋白）のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのアルファ及びベータピークに調節してある吸収の２波長を測定する。これらの吸収ピークはヘモ蛋白が酸素と結合するに従って直線的に増大する。次に未結合から１００％結合までのパーセント変化を％酸素値に対してプロットすることにより曲線を作成する。ｐ５０はヘモグロビンの５０％が酸素に結合する曲線上の点である。
特記すれば、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ，ＰＡ）は血液又はヘモ蛋白５０μＬを酸素の漸増分圧に曝露し、そして窒素ガスによりそれを脱酸素化することによりオキシヘモ蛋白解離曲線（ＯＤＣ）を求める。Ｃｌａｒｋ酸素電極が酸素張力の変化を検出し、これはｘ−ｙレコーダーのｘ軸上に記録される。生じた酸化ヘモ蛋白画分の増分は５６０ｎｍ及び５７６ｎｍにおいて二波長分光光度計により同時にモニタリングされ、ｙ軸上に表示される。血液試料は前中静脈から採取し、ヘパリンで抗凝固処理し、そして試験時まで湿潤氷上４℃に維持する。全血５０μＬを７．４±０．０１の値に溶液のｐＨを維持する製造元提供の緩衝液であるＨｅｍｏｘ溶液５μＬ中に希釈する。試料緩衝液をＨｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒの部分であるキュベット内に導入し、混合物の温度を平衡化させ、３７℃とし；次に試料を空気で１００％まで酸素付与する。ｐＯ２値を調節した後、試料を窒素で脱酸素化し；脱酸素化のプロセス中は曲線をグラフ紙上に記録する。Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒの部分であるソフトウエアを用いながらＯ２飽和が５０％となる点としてｘ軸上にｐ５０値を外挿する。記録を終了するために必要な時間は約３０分である。
Ｈ−ＮＯＸ蛋白の何れかに関するｐ５０値は、Ｏ２に対するＨ−ＮＯＸ蛋白のヘモグロビンと比較した場合の相対的親和性の指標としてのヘモグロビンに関するその値と比較することができる。表１３はヘモグロビンに関する以前に報告されているｐ５０値を示す。
表１３．ヘモグロビンの変異体及びその報告された酸素親和性
Figure 2017137337
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 粘度の測定
所望により、剪断速度２００／ｓでＣＰＥ−４０コーンスピンドルとともにコーン／プレートレオメーター（ＤＶ−ＩＩＩ型、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ；Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）を用いながらＨ−ＮＯＸ溶液の粘度を測定することができる。血液希釈酸素送達実験において投与した１〜４センチポアズ（ｃＰ）の粘度を有する溶液は安全であることが報告されている（特に粘度の測定に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＷｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．等（２００４年１０月）、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＰＥＧ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｎｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｈｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ，”Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７（４）：１５２７−１５３４、米国特許６，９７４，７９５及び６，４３２，９１８）。従って、一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白溶液の年度は１〜４ｃＰである。
コロイド浸透圧測定
所望により、コロイド浸透圧をコロイド浸透圧計を用いながら製造元の説明書に従って測定することができる（４４２０型、Ｗｅｓｃｏｒ店Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）。コロイド浸透圧を測定するための例示される方法は特にコロイド浸透圧の測定に関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＶａｎｄｅｇｒｉｆｆ，Ｋ．Ｄ．等（１９９７年１１月）、“Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｖｅｒｓｅｓ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，”Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．６９（１）：２３−３０、ｗｗｗ：ａｎａｅｓｈｅｓｉａｍｃｑ．ｃｏｍ／ＦｌｕｉｄＢｏｏｋ／ｆｌ２＿４．ｐｈｐ；米国特許６，９７４，７９５及び６，４３２，９１８に記載されている。血液希釈酸素送達実験において投与された２０〜５０ｍｍＨｇのコロイド浸透圧を有する溶液は安全であることが報告されている（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．等（２００４年１０月）、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＰＥＧ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｎｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｈｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ，”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７（４）：１５２７−１５３４）。従って、一部の実施形態においては、Ｈ−ＮＯＸ蛋白溶液のコロイド浸透圧は２０〜５０ｍｍＨｇである。
実施例３：Ｏ２担体Ｈ−ＮＯＸ変異体に関する外科処置モデル：ラット極限的血液希釈におけるＯ２担体Ｈ−ＮＯＸ変異体のパネルとＨ−ＮＯＸの比較
Ｈ−ＮＯＸ変異が外科処置モデルにおいてＯ２を輸送する能力を評価するために、確立されたプロトコル（特に外科処置モデルに関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＷｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．等（２００４年１０月）、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＰＥＧ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｌｂｕｍｉｎ Ａｎｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｈｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ，”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７（４）：１５２７−１５３４）の適合をラットにおける連続交換輸血を用いながら実施することができる。
馴化させた雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）、アセプロマジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）の混合物を含有するげっ歯類カクテルの筋肉内注射により麻酔する。ポリエチレンチューブ製のカテーテル（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ ＰＥ−５０及びＰＥ−１０）を両方の大腿動脈及び片方の大腿静脈内に移植する。カテーテルを尾部の基部において外在化させ、保護と将来の接触のために尾部シースにより被覆する。手術創を閉鎖した後、動物を自身のケージに戻し、覚醒させ、２４時間回復させた後に実験を開始する。動物には回復中は飼料及び水を自由摂取させる。血液力学的測定のために、大腿動脈カテーテルをストップコック及び２３ゲージ針を介して圧力トランスデューサーに連結し、動脈圧を１００Ｈｚにおいて連続的にサンプリングする。
動脈ｐＨ、ＰＣＯ２、及びＰＯ２を血液の１００μｌヘパリン処理試料を用いながらＢａｙｅｒ２４８型血液ガス分析機において測定する。乳酸はＹＳＩラクテート分析機（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を用いながら大腿動脈血液において測定する。総ＣＯ２、標準重炭酸（ＨＣＯ）、及び塩基過剰（ＢＥ）をＰＣＯ２、ｐＨ、及びＨｂ濃度から計算する。
完全覚醒動物（各投与群につきｎ＝５）をプレクシガラス拘束器中に入れる。動脈及び静脈カニューレをそれぞれ２００及び１００μｌのヘパリン加食塩水（１００Ｕ／ｍｌ）でフラッシュする。動脈及び静脈カテーテルを注入ポンプ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ４２６２０００型、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）に連結し、交換輸血を１００分間０．５ｍｌ／フンの速度で実施する。即ち、交換される溶液の総容量は５０ｍｌ又は２．５血液容量とする。被験物質の注入と厳密に同じ速度で血液が除去されるように蠕動ポンプを作動させる。被験溶液は、注入前にウォーターバスで３７℃まで加温し、注入の間は加熱パッドにより温かい状態を維持する。１００分の交換期間の終了時に、生存動物は更に７０分間モニタリングした後に安楽死させる。血液試料（０．３ｍｌ）を１０分ごとに採取して血液学的及び血液ガス分析に付する。
投与群はＮＯ又はＯ２の解離定数、ＮＯ反応性、安定性、生理学的適合性、又はこれらの２つ以上の何れかの組み合わせに関してあらかじめ試験されているＨ−ＮＯＸ蛋白１つ以上を投与される動物を包含する。赤血球Ｈ−ＮＯＸ及びペンタスターチ投与群をそれぞれ陽性及び陰性対照群として設ける。
客観的終点は生存及び酸−塩基の混乱及び乳酸の蓄積を合図とする嫌気的代謝の開始を包含する。対照群と比較した場合に生存率を上昇させる（例えば生存率の統計学的に有意な上昇をもたらす）Ｈ−ＮＯＸ蛋白は、極限的血液希釈において組織に酸素付与するために有用である。そのようなＨ−ＮＯＸ蛋白はＯ２の送達が有利である他の適応症を治療するためにも有用であることが期待される。
実施例４：Ｏ２担体Ｈ−ＮＯＸ変異体に対する外傷モデル：出血性ショックのラットモデルにおける血圧、腸血流、及び腸酸素付与に対するＯ２担体Ｈ−ＮＯＸ変異体及び組み換えヘモグロビン溶液の作用の比較
外傷モデルにおいてＯ２を輸送するＨ−ＮＯＸ蛋白の能力を評価するために、確立されたプロトコル（特に外傷の動物モデルに関して参照により全体が本明細書に組み込まれるＲａａｔ，Ｎ．Ｊ．等（２００５年１月）、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒＨｂ２．０ ａｎｄ ｒＨｂ１．１ ｏｎ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ，Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ，Ａｎｄ Ｇｕｔ Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｓｈｏｃｋ，”Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１４５（１）：２１−３２）の適合を出血性ショック及び蘇生の固定圧力（４０ｍｍＨｇ）ラットモデルにおいて実施することができる。
Ｗｉｓｔａｒラットを９０ｍｇ／ｋｇケタミン、０．５ｍｇ／ｋｇメデトミジン、及び０．００５ｍｇ／ｋｇアトロピンスルフェートの混合物の腹腔内注射により麻酔する。各ラットの体温はラットの直腸に設置した温度プローブにより温度制御される加熱パッドの使用により３６．５℃〜３７．５℃に維持する。更に又、ラット上方４０〜５０ｃｍに配置したセラミック加熱ランプの使用により熱損失を補償する。機械的換気のために、気管切開を実施し、気管内０．５ｃｍに長さ３．５ｃｍの６Ｆポリ塩化ビニルチューブを設置し、縫合固定する。改造した小児用換気装置を用いて動物を換気する。換気による体液の損失を最小限にするために、換気チューブの前に湿度フィルターを設置する。このフィルターの側方ポートを使用してカプノグラフを使用しながら呼吸終期のＣＯ２をモニタリングする。ベースライン血液試料を採取することにより確認した場合に外科処置中は３５〜４５ｍｍＨｇの動脈ＰＣＯ２値が維持されるように呼吸相（０．２５〜０．３５）及び呼吸速度（５０〜７５呼吸／分）のような換気パラメーターを調節する。実験終了時までそれ以外の調節は行わない。
血管は０．５ｘ０．９ｍｍのポリエチレン静脈カテーテルを用いながら挿管する。カテーテルにはヘパリン２５ＩＵを添加した０．９％ＮａＣｌ溶液を充填する。右頸動脈カテーテルは２０ｃｍまで短縮化し、平均動脈圧（ＭＡＰ）及び心拍数の連続モニタリングのために圧力トランスデューサーに連結する。ＭＡＰは以下の式、即ち：（収縮期血圧−拡張期血圧）／３＋拡張期血圧を用いて計算する。更に又、１５ｍＬ／ｋｇ／時のリンゲルラクテート及び５ｍＬ／ｋｇ／時の維持麻酔剤（リンゲルラクテート中ケタミン５０ｍｇ／ｋｇ／時）で補助的輸液を行うために頸静脈に挿管する。大腿動脈は血液撤去及び動脈血試料採取のために挿管する。大腿静脈は蘇生液の注入及び静脈血ガス試料採取のために挿管する。
腹部正中切開を各ラットにつき実施し；腹部をサランラップ（登録商標）で被覆することにより体液の蒸発を防止する。サランラップ（登録商標）を穿刺して小孔を開け、微小循環ＰＯ２測定のための光ファイバーが接触できるようにする。腸間膜静脈血試料採取のために回盲静脈も０．８ｍｍのポリエチレンカテーテルで挿管する。
腸の微小血管ＰＯ２はパラジウム−ポルフィリンりん光の酸素依存性クエンチングの以前に記載された手法を用いて測定する。２．５〜３時間の外科処置の後、ＨＳＡ溶液にカップリングしたパラジウム（ＩＩ）メソ−テトラ（４−カルボキシフェニル）ポルフィン（４％アルブミン溶液１０ｍＬ中５０ｍｇ、４ミリモル／Ｌパラジウム−ポルフィリン溶液、ｐＨはＨＣｌで７．４に調整）を１５分間９．６ｍＬ／ｋｇ／時の速度で１２ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注入する。
光パルスによるパラジウム−ポルフィリンの励起により時間崩壊を伴ったりん光の発射が起こり、これは酸素濃度と定量的に関連している（Ｖａｎｄｅｒｋｏｏｉ，Ｊ．Ｍ．等（１９８７年４月２５日）、“Ａｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｏｘｙｇｅｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ Ｕｐｏｎ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１２）：５４７６−５４８２）。微小血管ＰＯ２測定は回腸の近位部分の上方に位置させた光ファイバーを用いて行う。パラジウム−ポルフィリンの注入の前にフラッシュランプを記録し、逆重畳アルゴリズムを用いて酸素濃度を計算する。パラジウム−ポルフィリン用液の注入及び４５分間の安定化の後、ベースラインの血液試料（０．２ｍＬ／試料）を大腿動脈、大腿静脈、及び腸間膜静脈から採取し、血液ガス測定に付す。血液試料は血液ガス分析器及びヘモキシメーターで測定する。
ＭＡＰがほぼ４０ｍｍＨｇとなるまで数分間約１ｍＬ／分の速度でヘパリンを含有する（２５ＩＵ／ｍＬ血液）３ｍＬシリンジ中に大腿動脈から血液を採取することにより出血性ショックを誘導する。ＭＡＰは４５分間、更に採血又は輸血することによりこのレベルに維持する。蘇生直前、血液試料（０．２ｍＬ／試料）を大腿動脈、大腿静脈、及び腸間膜静脈から採取し、血液ガス測定に付し、同量のラット血液（出血性ショックの間に収集したもの）を再注入する。ショック期間後、動物達はランダムに８つの異なる蘇生グループの１つに割り当てられる。蘇生は野生型及び変異体のＨ−ＮＯＸ蛋白を用いるか、又は別のＯ２担体、例えば組み換えヘモグロビン溶液ｒＨｂ１．１（Ｂａｘｔｅｒ）、ｒＨｂ２．０（Ｂａｘｔｅｒ）、血清非含有ヘモグロビン（標準溶液）、ＭＰ４（Ｓａｎｇａｒｔ）、ヘモピュア（Ｂｉｏｐｕｒｅ）、又はポリヘム（Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ Ｌａｂｓ）（Ｒａａｔ，Ｎ．Ｊ．等（２００５年１月）、Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．１４５（１）：２１−３２；保存溶液濃度１００ｍｇ／ｍＬ）を用い、全て２０ｍＬ／ｋｇ（２ｇ／ｋｇ）の用量において、６０ｍＬ／ｋｇ／時の速度で注入する。同じ用量（２０ｍＬ／ｋｇ）及び速度で注入するＨＳＡ（１３．４％アルブミン溶液）を蘇生中の圧力及び流動に対する容量の作用に関する対照として使用する。蘇生完了時、０．２ｍＬの血液試料を３０、６０、９０及び１２０分後に大腿動脈、大腿静脈、及び腸間膜静脈から採取し、各時点において同量のラット血液を戻す。
別のＯ２担体（例えばｒＨｂ１．１、ｒＨｂ２．０、血清非含有ヘモグロビン、ＭＰ４、ヘモスパン、又はポリヘム）により、又はコロイド浸透圧的に適合したＨＡＳにより誘発されるものと比較して同じか低値の（例えば実質的に、又は有意に低値の）全身血管収縮、同じか低値のＭＡＰ上昇、又は同じか低値の腸間膜血管抵抗（ＭＶＲ）増大を蘇生後に誘発するＨ−ＮＯＸは、出血性ショックを治療するために有用である。そのようなＨ−ＮＯＸ蛋白はＯ２送達が有利である他の適応症を治療するためにも有用であることが期待される。
上記した例及び詳細な説明は例示によるものであり、限定するものではない。本明細書において引用した全ての公開物、特許出願及び特許はそれらの公開物、特許出願又は特許が特定的及び個別に参照により組み込まれるがごとく、参照により本明細書に組み込まれる。上記した発明は例示により、そして例えば理解の明確化の目的のために一部詳細に説明したが、本発明の教示に鑑みれば特定の変更又は改変を添付請求項の精神又は範囲から外れることなく行えることは当業者の知る通りである。
特段の記載が無い限り、本明細書において使用した全ての技術的及び科学的な用語の意味は本出願属する分野の当業者が共通して理解するものである。当業者の知る通り、当然ながら、本明細書に記載したものと同様又は等価である何れの方法及び材料も本発明の実施又は試験のための使用できる。
本明細書において使用する場合、特段の明確な記載が無い限り、単数表記は複数も意味する。
数値又はパラメーターに「約」と言及する場合は本明細書においてはその数値又はパラメーター自身を指向する実施形態を包含（そして説明）する。例えば、「約Ｘ」と言及している記載は、「Ｘ」の記載を包含する。
本明細書に記載する本発明の特徴及び実施形態は、特徴及び実施形態を「含む」、「これよりなる」、そして「本質的にこれよりなる」ことを包含する。

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  1. 本願図面に記載の発明。
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