CN104689300A - 用于氧输送的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于氧输送的组合物及方法。H-NOX蛋白被突变为显示出改善的或优化的血液气体O2输送动力学和热力学性质。工程H-NOX蛋白包含突变，所述突变相对于对应的野生型H-NOX结构域赋予改变的O2或NO配体-结合，并可作为生理相容的哺乳动物血液O2气体载体起作用。本发明也提供了药物组合物、试剂盒及方法，它们使用野生型或突变H-NOX蛋白，用于治疗输送O2对其有益的任何病症。

Description

用于氧输送的组合物及方法
本申请是申请日为2007年5月21日、申请号为200780027798.7、题为“用于氧输送的组合物及方法”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年5月22日由Michael A.Marletta、Stephen P.L.Cary、Elizabeth M.Boon和Jonathan A.Winger提交的题目为“Engineering H-NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery”的美国临时申请序列号60/921,505(美国案件号B06-084)的权益。该美国临时申请于2007年5月1日从2006年5月22日提交的美国实用申请序列号11/440,588转化为临时申请，其公开内容通过引用被各自由此并入。
关于联邦资助研究或开发的声明
本研究由资金号DE-AC03-76SF资助。美国政府在授予本申请的任何专利中可能具有权利。
技术领域
本申请涉及H-NOX蛋白和使用它们输送氧的方法。H-NOX蛋白提供了一种新的治疗工具，用于向人类输送O2，并用于兽医的目的向动物输送O2。
发明背景
当前的血库系统具有内在的风险和严重的局限性。血液分型错误、免疫原性、细菌试剂的传播、和诸如HIV-1和肝炎的病毒感染将威胁生命的危险摆在输血患者的面前。此外，受限的供血者可用性、对特殊血型的需求、红细胞短暂的保存期、和对冷冻的需要都限制了患者输血的可达性。稳定的血液代用品的开发能消除目前血库系统的风险，并在大多数情况下提高患者输血的可用性。因此，向器官和组织输送氧气(O2)以缓解由于失血或缺氧引起的症状是主要的治疗目标。
在美国，没有基于血红蛋白的疗法被批准用于人类。潜在的疗法包括多种人工O2载体(由Spahn,D.R.等人(2005)，“Artificial O2carriers:status in 2005,” Curr.Pharm.Des.11(31):4099-4114综述)，例如工程改造的血红蛋白(例如，美国专利号6,022,849)。然而，一些潜在的血液代用品，如基于血红蛋白的血液代用品，由于它们与一氧化氮(NO)的反应性而受限。具体而言，NO在体内多种重要过程的调控中作为化学信使发挥作用，包括神经传导、炎症、血小板凝集和胃肠及血管平滑肌紧张度的调节。NO直接与结合到血红蛋白的O2反应，形成高铁血红 蛋白和硝酸盐。血红素铁和NO都通过结合的氧原子被氧化，并且反应发生地如此迅速以至于没有观察到O2被NO代替(参见，例如美国专利号6,455,676)。
由于NO被持续地产生并消耗，体内有天然的NO周转(turnover)。当给予无细胞的血红蛋白时，NO产生与消耗之间的平衡通过与无细胞的血红蛋白的反应而被改变。NO与结合到血红蛋白的O2之间的氧化反应是不可逆的，导致NO、O2和血红蛋白的破坏。因为亚硝酰血红蛋白解离的半衰期是5-6小时，NO结合到没有O2结合的血红蛋白在生理时标中是有效不可逆的，由此有效失活作为无细胞O2载体的血红蛋白。
一旦NO分子与血红蛋白反应，它被从信号分子库中消除，由此引起某些不利状况。例如，NO与血红蛋白(有或没有O2结合)的结合可以阻止血管舒张并潜在地导致高血压，这有时在某些细胞外血红蛋白溶液给药后被观察到。
介导某些炎症反应也需要NO。例如，由内皮产生的NO抑制血小板凝集。结果，由于NO被无细胞的血红蛋白(具有或没有O2结合)结合，血小板凝集可能增加。随着血小板凝集，它们释放有效的血管收缩化合物，如血栓烷A2和血清素。这些化合物可与由血红蛋白清除引起的降低的NO水平协同起作用，以产生显著的血管收缩。除了抑制血小板凝集，NO也抑制中性粒细胞(neutrophil)附着于细胞壁，该附着反过来可导致细胞壁损伤。内皮细胞壁损伤已经在某些血红细胞溶液输注中观察到。
基于血红蛋白的血液代用品的另一个主要缺点是它们对O2的高亲和性。该高亲和性限制了血红蛋白在期望的位置(如外周组织)以临床有用的速率释放氧气的能力。可选地，在到达微血管床之前由主动脉中较低亲和性的基于血红蛋白的血液代用品引起的O2释放可能由于高氧性血管收缩反应而引起血管收缩(Winslow假设)。此外，基于血红蛋白的血液代用品受到无细胞的血红蛋白从血浆中快速清除的限制，所述清除是由于从血浆中清除无细胞的血红蛋白的血红蛋白受体的存在所致。无细胞的血红蛋白也可能引起肾脏中毒，可能是由于肾小球中的NO耗尽，引起收缩和后续的机能障碍。
由于目前血液代用品的局限性和捐献血液的长期缺乏，仍对其它或替代性的用于输送氧的疗法存在显著的兴趣和需要。具体而言，具有较低NO反应性和/或较长的血浆保留时间的血液代用品是期望的。也需要O2结合解离常数或解离速率(off rate)适合于具体临床或工业应用的氧载体。其中O2载体是期望的示例性工业应用包括细胞在培养基中的生长，这通常被到达细胞的O2量限制。
发明概述
本发明部分基于这样惊人的发现：野生型和突变H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得多的NO反应性，并因此是理想的O2载体。如果希望，突变可以被引入H-NOX蛋白，以改变它们对O2和NO配体的结合，以进一步优化H-NOX蛋 白作为O2载体的应用。
一方面，本发明以突变H-NOX蛋白为特征。因此，在一些实施方式中，本发明提供了具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白，与相应野生型H-NOX蛋白的O2解离常数或NO反应性比较，所述突变改变了O2解离常数或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约2nM到约50μM之间，在20℃下在约50nM到约10μM之间，在20℃下在约20nM到约2μM之间，在20℃下在约100nM到约1.9μM之间，在20℃下在约150nM到约1μM之间，或者在20℃下在约100nM到约255nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下小于约80nM，例如在20℃下在约20nM到约75nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如，比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1，例如，在20℃下小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的koff(k解离)在20℃下在约0.01到约200s-1之间，例如在约1.0s-1到约16.0s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃下在约100nM到约1.9μM之间，并且突变H-NOX蛋白对氧的koff在20℃下在约1.35s-1到约14.5s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的koff在20℃下在约1.35s-1到约14.5s-1之间，并且突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的koff在20℃下在约1.35s-1到约14.5s-1之间，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1(例如，在20℃下小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1h-1，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃下小于约700s-1(例如，在20℃下小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。
在一些实施方式中，本发明的特征在于具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白，与相应野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对氧的koff或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的koff在20℃在约0.01s-1到约200s-1之间，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白在20℃具有小于或等于约0.65s-1(例如，在20℃在约0.21s-1到约0.65s-1之间)的对氧的koff。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白由腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)蛋白衍生并在20℃具有约1.35 s-1到约18s-1的对氧koff。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如，比血红蛋白低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1，例如在20℃小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约1nM到约1mM之间，在20℃在约2nM到约50μM之间，在20℃在约50nM到约10μM之间，或在20℃在约100nM到约1.9μM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约1.9μM之间，并且突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约1.9μM之间，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。
在多种实施方式中，本发明的特征在于具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白，与相应的野生型H-NOX蛋白的O2解离常数或NO反应性相比，所述突变改变O2解离常数或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约255nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃小于80nM，例如在20℃在约20nM到约75nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如比血红蛋白低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白在20℃具有小于或等于约0.65s-1(例如，在20℃在约0.21s-1到约0.65s-1之间)的对氧koff。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.35s-1到约2.9s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约5.8s-1到约19s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白在4℃下在空气中是稳定的。
在一些实施方式中，本发明的特征在于具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白，与相应的野生型H-NOX蛋白相比，所述突变改变对氧的koff或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧的koff在20℃小于或等于约0.65s-1，且突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约0.21s-1到约0.65s-1之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应 性低至少100倍，例如比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1，例如在20℃小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约1.9μM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约1.9μM之间，并且突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约1.9μM之间，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1、1.8s-1或0.7)。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1，并且突变H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1、1.8s-1或0.7)。
在多种实施方式中，本发明的特征在于分离的H-NOX蛋白，所述蛋白选自腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、L2F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、β1(1-385)、β1(1-385)I145Y、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌(C.botulinum)H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)和线虫(C.elegans)H-NOX GCY-35(1-252)。在一些实施方式中，β1或β2蛋白衍生自褐鼠(R.norvegicus)或智人(H.sapiens)β1或β2蛋白。
在多种实施方式中，本发明的特征在于分离的H-NOX蛋白，所述蛋白选自腾冲厌氧嗜热菌H-NOX I5A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX I5L、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX I5L-P115A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9F-N74A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX  W9Y、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9N、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX W9H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX N74E、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX N74A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOXN74H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX P115A、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX R135Q、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX Y140H、腾冲厌氧嗜热菌H-NOX Y140A、腾冲厌氧嗜热菌I75F-His6、腾冲厌氧嗜热菌I75F、腾冲厌氧嗜热菌L144F-His6、腾冲厌氧嗜热菌L144F、嗜肺军团菌(L.pneumophilia)2F9W-F142Y、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、β1(1-385)I145H、β1(1-194)、β1(1-194)I145Y、β1(1-194)L9W-I145Y、β2(1-217)、β2(1-217)I142Y、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)和线虫H-NOX GCY-35(1-252)。在一些实施方式中，β1或β2蛋白衍生自褐鼠或智人β1或β2蛋白。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在智人(Homo sapiens)血红蛋白α的O2解离常数的2个数量级之内，例如O2解离常数在智人血红蛋白α的O2解离常数的0.1到10倍之间，或在0.5到2倍之间。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，例如比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1000倍。在分离的H-NOX的一些实施方式中，与其从中衍生的H-NOX蛋白比较，所述H-NOX蛋白包含一个或多个突变(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在分离的H-NOX蛋白的多个实施方式中，与其从中衍生的H-NOX蛋白相比，所述H-NOX蛋白包含少于20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少一个远侧袋突变(distal pocket mutation)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个不在远侧袋中的突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少一个突变，其中对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115或Arg135或β1(1-385)的I145的残基被任何其它氨基酸代替。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白具有至少两个突变，其中至少一个突变是对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Ile5、Trp9、Asn74、Pro115或Arg135或β1(1-385)的I145的残基被任何其它氨基酸代替。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的I5A突变、I5L突变、W9F突变、Y140F突变、Y140H突变、W9F Y140H双突变或F78Y Y140F双突变，或β1的I145Y突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白中的突变对应于腾冲嗜热厌氧菌的W9Y突变、W9H突变、W9N突变、N74H突变、N74E突变、N74A突变、P115A突变、R135Q突变、I5L P115A双突变、N74A Y140H双突变或W9F N74A双突变。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，与相应的野生型蛋白相比，所述H-NOX 蛋白中的至少一个C-末端氨基酸(例如至少约50个连续的C-末端氨基酸或约25个到约200个连续的C-末端氨基酸)已经被移除。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白衍生自哺乳动物蛋白(如人类蛋白，如β1)。在分离的H-NOX蛋白的各种实施方式中，所述H-NOX蛋白衍生自细菌蛋白(如腾冲嗜热厌氧菌蛋白)。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白被共价结合到另一个分子或部分，例如聚乙二醇。血红素可以结合或可以不结合到H-NOX蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，氧被结合至H-NOX蛋白。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白的部分或全部，如白蛋白(如人血清白蛋白)。
在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX或嗜肺军团菌2H-NOX F142Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)或褐鼠β1(1-385)I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F或智人β1H-NOX(1-385)I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1I140Y或智人β1I145Y。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOXY140F、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇(D.melangaster)β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻(N.punctiforme)H-NOX、野生型新月柄杆菌(C.crescentus)H-NOX、野生型沙雷氏菌(S.oneidensis)H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、智人Β1I145Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐家鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是下列蛋 白的任何一种，所述蛋白按其基因名称、接着是它们的物种缩写和Genbank标识符加以列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可获得的以下蛋白序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy-32_Ce_13539160,gcy-36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或GYCα-99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan等人(2003)，“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins,”BMG Genomics 4:5-13)。这些名称中使用的物种缩写包括：Ana–鱼腥藻(Anabaena Sp)；Ccr–新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac–丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde–脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp–趋磁细菌某种(Magnetococcus sp.)；Mde–Microbulbifer degradans；Npu–点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp–球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone–沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte–腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce–线虫(Caenorhabditis elegans)；Dm–黑腹果蝇；Hpul–马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs–智人。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一种，所述蛋白按照它们的生物体名称和Pfam数据库登录号列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可获得的以下蛋白序列)：线虫种(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、线虫(Caenorhabditis elegans)GCY37_CAEEL、线虫GCY31_CAEEL、线虫GCY36_CAEEL、线虫GCY32_CAEEL、线虫GCY35_CAEEL、线虫GCY34_CAEEL、线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5_TETNG、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人 GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobateslar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE、小鼠GCYB1_MOUSE、小鼠Q3UTI4_MOUSE、小鼠Q3UH83_MOUSE、小鼠Q6XE41_MOUSE、小鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、西藏黄牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、意大利蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、意大利蜂Q5FAN0_APIME、意大利蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚疟蚊str PEST(Anophelesgambiae str PEST)Q7PYK9_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚疟蚊Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、海蜗牛(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌BBFL7(Flavobacteria bacterium BBFL7)Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC700755Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)JF-5Q2DG60_ACICY、球形红细菌Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、嗜冷细菌(Colwellia psychrerythraea)Q47Y43_COLP3、Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans  Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费氏弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光细菌(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺旋菌某种(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE和拜氏梭菌NCIMB 8052(Clostridium beijerincki NCIMB 8052)Q2WVN0_CLOBE。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠sGCβ1H-NOX C78S或褐鼠sGCβ1H-NOX C78E。在分离的H-NOX蛋白的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
一方面，本发明以编码本文所述的任何一种或多种突变H-NOX蛋白的重组核酸为特征。在特定的实施方式中，所述核酸包括图2-4D或8A-8DD中所示任何核酸的片段或完整核酸序列。在一些实施方式中，所述核酸编码融合蛋白，该融合蛋白包括H-NOX结构域和另一蛋白的部分或全部，例如白蛋白(如人血清白蛋白)。在一些实施方式中，所述核酸包括至少约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多个连续的来自H-NOX核酸的核苷酸，并且与其所衍生的H-NOX核酸相比，含有一个或多个突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在多种实施方式中，与其从中衍生的H-NOX核酸相比，突变H-NOX核酸含有少于下列任一数目的突变：约20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个。本发明也以编码突变H-NOX蛋白的任何核酸的简并变体(degenerate variant)为特征。
而在另一方面，本发明提供了包含任何一种或多种本文所述突变H-NOX核酸的载体。另一方面，本发明以包含任何一种或多种本文所述突变H-NOX核酸的细胞为特征。一方面，本发明以包含本文所述的任何载体的细胞为特征。
一方面，本发明以产生H-NOX蛋白的方法为特征。该方法包括在适合突变H-NOX蛋白产生的条件下培养具有编码任何一种或多种本文所述的突变H-NOX蛋白的核酸的细胞。在一些实施方式中，本发明进一步包括纯化突变H-NOX蛋白的步骤。
一方面，本发明以药物组合物为特征，所述药物组合物包括一种或多种H-NOX蛋白，例如本文所述的任何野生型或突变H-NOX蛋白。在一些实施方式中，药物组合物包括药学上可接受量的本文所述的H-NOX蛋白和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约1nM和约1mM之间，并且该H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约20nM到约2μM之间，并且该H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.0s-1到约16.0s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约20nM到约2μM之间，并且该H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约20nM到约2μM之间，并且该H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.0s-1到约16.0s-1之间，并且X蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.0s-1到约16.0s-1之间，并且该H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。
在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包含药学上可接受量的H-NOX蛋白和药学上可接受载体。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约0.01到约200s-1之间，其中H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。
在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在智人血红蛋白α的O2解离常数的2个数量级之内，例如O2解离常数在智人血红蛋白α的O2解离常数的0.1到10倍或0.5到2倍之间。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，例如，比智人血红蛋白α的NO反应性低至少100倍或1000倍。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白是如本文所述的突变蛋白。在药物组合物的各种实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个突变，与相应野生型蛋白相比，所述突变改变O2解离常数、对氧koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述任何两种或多种。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX  W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、嗜肺军团菌2F9W-F142Y、野生型脱硫脱硫弧菌H-NOX、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1H-NOX、智人β1I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1H-NOX H105G、智人β1H-NOX H105F、野生型褐鼠β1H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOX H105G、褐鼠β1H-NOX H105F、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型线虫GCY-35H-NOX、线虫H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA、野生型黑腹果蝇CG14886、野生型黑腹果蝇CG4154；野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、野生型红鳍东方鲀H-NOX、野生型冈比亚按蚊H-NOX、野生型烟草天蛾H-NOX；野生型线虫gcy-31、线虫gcy-32、野生型线虫gcy-33、野生型线虫gcy-34、野生型线虫gcy-35、野生型线虫gcy-36、野生型线虫gcy-37；野生型霍乱弧菌H-NOX、野生型费氏弧菌H-NOX和野生型点形念珠藻H-NOX。在药物组合物的一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种脂质体或纳米颗粒，其包含或封装了H-NOX蛋白。
在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX或嗜肺军团菌2H-NOX F142Y。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)或褐鼠β1(1-385)I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F或智人β1H-NOX(1-385)I145Y。在一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1I140Y或智人β1 I145Y。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、智人Β1I145Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在药物组合物的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是下列H-NOX蛋白的任何一种，所述蛋白按它们的基因名称、接着是它们的物种缩写和Genbank标识符加以列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可获得的以下蛋白序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy-32_Ce_13539160,gcy-36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或GYCα-99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan et al.(2003)“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins,”BMG Genomics 4:5-13)。这些名称中使用的物种缩写包括：Ana–鱼腥藻(Anabaena Sp)；Ccr–新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac–丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde–脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp–趋磁细菌某种(Magnetococcus sp.)；Mde–Microbulbifer degradans；Npu–点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp–球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)； Sone–沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte–腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce–线虫；Dm–黑腹果蝇；Hpul–马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs–智人。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是褐鼠sGCβ1H-NOXC78S或褐鼠sGCβ1H-NOX C78E。在药物组合物的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一种，所述蛋白质按照它们的生物体名称和Pfam数据库登录号列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可获得的以下蛋白序列)：线虫种(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、线虫(Caenorhabditis elegans)GCY37_CAEEL、线虫GCY31_CAEEL、线虫GCY36_CAEEL、线虫GCY32_CAEEL、线虫GCY35_CAEEL、线虫GCY34_CAEEL、线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5_TETNG、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE、小鼠GCYB1_MOUSE、小鼠Q3UTI4_MOUSE、小鼠Q3UH83_MOUSE、小鼠Q6XE41_MOUSE、小鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、西藏黄牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、意大利蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、意大利蜂Q5FAN0_APIME、意大利蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚疟蚊str PEST(Anopheles gambiae str PEST)Q7PYK9_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚疟蚊Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果 蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、海蜗牛(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌BBFL7(Flavobacteria bacterium BBFL7)Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755 Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌JF-5(Acidiphilium cryptum JF-5)Q2DG60_ACICY、球形红细菌Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、嗜冷细菌(Colwellia psychrerythraea)Q47Y43_COLP3、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌某种(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费氏弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光菌某种(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺旋菌某种(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE和拜氏梭菌NCIMB 8052Q2WVN0_CLOBE。在一些药物组合物的实施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
除非上下文另外明确说明或规定，本文所述的所有野生型和突变H-NOX蛋白可被用于本文所述的任何药物组合物中。H-NOX蛋白可具有或可不 具有血红素和/或结合氧，并且可共价结合或可不共价结合于另一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。
一方面，本发明提供了使用H-NOX蛋白向个体(例如，哺乳动物，如灵长类(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、狗或猫)输送氧的方法。在一些实施方式中，个体患有心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或受伤或者处于心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或受伤的风险。示例性的心血管指征包括心肌梗死(如ST段抬高型心肌梗死)、心脏麻痹、镰状细胞性贫血、围术期缺血(perioperative ischemia)、外周血管阻塞和血管成形术。示例性的神经指征包括缺血性中风、脑外伤和脊髓伤。对于肿瘤缺氧的治疗，H-NOX蛋白可以被用作例如实体瘤(如，具有不良转移前预后的个体)的放射治疗佐剂，或作为表面肿瘤(如直肠癌、肺癌或皮肤癌，或在其它可接近表面或位置中的癌症)的PDT治疗佐剂。H-NOX蛋白作为输血替代选择的应用包括外伤(如战场、灾难救援或事故)、手术(例如腹部动脉瘤手术、整形外科手术如髋关节置换手术、或产生高失血的任何其它手术)、出血、出血性休克、血液稀释和血液延伸用途(blood extension use)(如补充自体供应(supplementing auto-donation))。创伤修复应用的实例包括辐射后创伤修复(如高压氧效应)、术后恢复修复、糖尿病溃疡修复和烧伤。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了向个体(如人)输送氧的方法，其通过以足以向个体输送有效量的氧的量，给予需要它的个体H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约1nM到约1mM之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。
在该方法的一些实施方式中，氧在给予个体H-NOX蛋白之前被结合到H-NOX蛋白。在该方法的一些实施方式中，氧在在给予个体H-NOX蛋白之前没有被结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将氧从该个体中的一个位置运输到该个体中的另一个位置。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白被给予到个体的血液。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白被给予到个体的血液、伤口、肿瘤、缺氧组织或缺氧器官。在该方法的一些实施方式中，个体遭受失血或处于失血的风险。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白被给予个体至少两次。
在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在智人血红蛋白α的O2解离常数的2个数量级之内，例如O2解离常数是智人血红蛋白α的O2解离常数的0.1到10倍或0.5到2倍。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性比智人血红蛋白α的NO反应性低至少10倍，例如，比智人血红 蛋白α的NO反应性低至少100倍或1000倍。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白是野生型蛋白。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白是本文所述的突变蛋白。在该方法的多种实施方式中，H-NOX蛋白具有至少一个突变，与相应的野生型蛋白相比，所述突变改变O2解离常数、对氧koff、血红素自氧化速率、NO反应性或前述的任何两种或多种。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白选自野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX I5L-P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F-N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9Y、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9N、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74E、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX N74A-Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y-Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX P115A、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX R135Q、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140A、腾冲嗜热厌氧菌I75F-His6、腾冲嗜热厌氧菌I75F、腾冲嗜热厌氧菌L144F-His6、腾冲嗜热厌氧菌L144F、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌1H-NOX、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、嗜肺军团菌2F9W-F142Y、野生型脱硫脱硫弧菌H-NOX、脱硫脱硫弧菌H-NOX(728-899)、脱硫脱硫弧菌H-NOX Y139L、野生型智人β1H-NOX、智人β1I145Y、智人β1(1-385)、智人β1(1-385)I145Y、智人β1(1-385)I145H、智人β1(1-194)、智人β1(1-194)I145Y、智人β1(1-194)L9W-I145Y、智人β2(1-217)、智人β2(1-217)I142Y、智人β1H-NOX H105G、智人β1H-NOX H105F、野生型褐鼠β1H-NOX、褐鼠β1(1-385)、褐鼠β1(1-385)I145Y、褐鼠β1(1-385)I145H、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-194)I145Y、褐鼠β1(1-194)L9W-I145Y、褐鼠β2(1-217)、褐鼠β2(1-217)I142Y、褐鼠β1H-NOX H105G、褐鼠β1H-NOX H105F、肉毒梭菌H-NOX(1-175)、肉毒梭菌H-NOX(1-186)、野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-197)、丙酮丁醇梭菌H-NOX(1-183)、野生型线虫GCY-35H-NOX、线虫H-NOX GCY-35(1-252)、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA、野生型黑腹果蝇CG14886、野生型黑腹果蝇CG4154；野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX、野生型小鼠H-NOX、野生型家犬H-NOX、野生型家牛H-NOX、野生型褐鼠；野生型非洲爪蟾H-NOX、野生型青鳉H-NOX、野生型O.curivatus H-NOX、野生型红鳍东方鲀H-NOX、野生型冈比亚按蚊H-NOX、野生型烟草天蛾H-NOX；野生型线虫gcy-31、线虫gcy-32、野生型线虫gcy-33、野生型线虫gcy-34、野生型线虫gcy-35、野生型线虫gcy-36、野生型线虫gcy-37；野生型霍乱弧菌H-NOX、野生型费氏弧菌H-NOX和野生型点形念珠藻H-NOX。在该方法的一些实施方式中，一种或多 种脂质体或纳米颗粒包含或封装H-NOX蛋白。
在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX或嗜肺军团菌2H-NOX F142Y。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠β2(1-217)、褐鼠β1(1-194)、褐鼠β1(1-385)或褐鼠β1(1-385)I145Y。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F或智人β1H-NOX(1-385)I145Y。在一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H、智人β1I140Y或智人β1I145Y。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在所述方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y40L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX F78Y/Y140L、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX W9F、腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140F、野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX、嗜肺军团菌2H-NOX F142Y、野生型嗜肺军团菌2H-NOX、智人β1H-NOX I140Y、智人Β1I145Y、野生型智人β1H-NOX、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)、褐鼠sGCβ1H-NOX(1-385)I145Y、褐鼠sGCβ1H-NOX H105G、褐鼠sGCβ1H-NOX H105F、褐鼠sGCβ1H-NOX I145Y、野生型褐鼠β1H-NOX、野生型黑腹果蝇β1H-NOX、野生型黑腹果蝇CG14885-PA H-NOX、野生型线虫GCY-35H-NOX、野生型点形念珠藻H-NOX、野生型新月柄杆菌H-NOX、野生型沙雷氏菌H-NOX或野生型丙酮丁醇梭菌H-NOX。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一种，所述蛋白以它们的基因名称、接着是它们的物种缩写和Genbank标识符加以列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可用的以下蛋白序列)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy-32_Ce_13539160,gcy-36_Ce_17568391(gi:32566352、 gi:86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或GYCα-99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan et al.(2003)“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins,”BMG Genomics 4:5-13)。这些名称中使用的物种缩写包括：Ana–鱼腥藻(Anabaena Sp)；Ccr–新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac–丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde–脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp–趋磁细菌某种(Magnetococcus sp.)；Mde–Microbulbifer degradans；Npu–点形念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp–球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone–沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte–腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce–线虫；Dm–黑腹果蝇；Hpul–马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs–智人。在该方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一种，所述H-NOX蛋白按照它们的生物体名称和Pfam数据库登录号列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、2007年5月22日起可用的以下蛋白序列)：线虫种(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、线虫(Caenorhabditis elegans)GCY37_CAEEL、线虫GCY31_CAEEL、线虫GCY36_CAEEL、线虫GCY32_CAEEL、线虫GCY35_CAEEL、线虫GCY34_CAEEL、线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5_TETNG、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE、小鼠GCYB1_MOUSE、小鼠Q3UTI4_MOUSE、小鼠Q3UH83_MOUSE、小鼠Q6XE41_MOUSE、小鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、西藏黄牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑 蟋(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、意大利蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、意大利蜂Q5FAN0_APIME、意大利蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚疟蚊str PEST(Anopheles gambiae str PEST)Q7PYK9_ANOGA、冈比亚疟蚊str PESTQ7Q9W6_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚疟蚊str PESTQ7PS01_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚疟蚊Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、海蜗牛(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌BBFL7(Flavobacteria bacterium BBFL7)Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌JF-5(Acidiphilium cryptum JF-5)Q2DG60_ACICY、球形红细菌Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、嗜冷细菌(Colwellia psychrerythraea)Q47Y43_COLP3、Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibriovulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费氏弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光细菌(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺旋菌某种(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor  saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE和拜氏梭菌NCIMB 8052(Clostridium beijerincki NCIMB 8052)Q2WVN0_CLOBE。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠sGCβ1H-NOX C78S或褐鼠sGCβ1H-NOX C78E。在该方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyr135、Ser137和Arg139。
除非上下文另外明确说明或规定，本文所述的所有野生型和突变蛋白及所有药物组合物可被用在本文所述的输送氧的任何方法中。H-NOX蛋白可具有或可不具有血红素和/或结合氧，并且可共价结合于或可不共价结合于另一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域域和另一蛋白如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。
一方面，本发明以包括一种或多种H-NOX蛋白的试剂盒为特征。在一些实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包括H-NOX蛋白和使用该试剂盒向个体输送氧的说明书。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约1nM到约1mM之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于700s-1(如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级以内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约1nM到约1mM之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于700s-1(如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H。除非上下文另外明确说明或规定，本文所述的所有野生型和突变蛋白及所有药物组合物可被用在本文所述的任何试剂盒中。H-NOX蛋白可具有或可不具有血红素和/或结合氧，并且可共价结合于或可不共价结合于另一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白如白蛋白(如人血清白蛋白)的部分或全部。
一方面，本发明的特征在于用作药物的H-NOX蛋白(例如本文所述的任何野生型或突变蛋白)。在一些实施方式中，本发明的特征在于在向个体输送氧的方法中使用的H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用于治疗任何输送O2对其有益的症状，例如心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或受伤。
在一些实施方式中，本发明的特征在于H-NOX蛋白(例如本文所述的任何野生型或突变蛋白)在药物——例如向个体输送氧的药物——的制备中的用途。在一些实施方式中，本发明以H-NOX蛋白在向个体输送氧中的用途为特征。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用于治疗任何输送O2对其有益的症状，例如心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或受伤。
附图简述
图1A是NO结合H-NOX蛋白和O2结合H-NOX蛋白的远侧袋残基三维结构图(血红素之上)。NO结合H-NOX蛋白和O2结合H-NOX蛋白的血红素配位残基也被显示(血红素之下)。图1A是基于由Pellicena,P.等人(2004年8月31日)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859报道的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构。
图1B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX三维结构的立体侧视图，显示了H-NOX结构域的结构特征。该蛋白折叠由带状图(ribbon diagram)表示。血红素、双氧配体和近端组氨酸以球棒模型显示。α-螺旋根据图5B所示的命名法被标记为A-G。β-折叠被标记为1-4。图1B来自Pellicena,P.et al.(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859。
图1C-1H是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构图，显示了腾冲嗜热厌氧菌H-NOX中的示例性远侧袋残基。图1C-1H中所示的以下残基是组成H-NOX远侧袋的主要残基：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140和Leu144，它们被包含在螺旋A、D、E和G中。图1C-1H使用PYMOL(DeLano Scientific,LLP)创建。
图2是结合或被预测结合O2和NO的下列H-NOX蛋白的序列对比：多数(Majority)(SEQ ID NO:1)、Ce.gcy-31(SEQ ID NO:2)、Ce.gcy-33(SEQ ID NO:3)、Ce.gcy-35(SEQ ID NO:4)、Dm.CG14885HNOX(SEQ ID NO:5)、Dm.CG4154HNOX(SEQ ID NO:6)、Ms.Beta3HNOX(SEQ ID NO:7)、Tt HNOX(SEQ ID NO:8)和Ca HNOX(SEQ ID NO:9)。预测这些H-NOX蛋白结合O2以及NO，因为它们在对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140的位置上具有酪氨酸。图2中使用的氨基酸编号以H-NOX结构域或全长蛋白中的第一个氨基酸起始，作为第1个残基。在MegAlign程序中使用默认参数产生该对比。图2中使用的缩写在下文关于图4A-4D进行描述。
图3A-3D是结合或被预测结合NO而非O2的下列H-NOX蛋白的序列对比：多数(Majority)(SEQ ID NO:10)、Dm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:11)、sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:12)、hs.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:13)、hs.β2蛋白(SEQ ID NO:14)、Ms.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:15)、Mm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:16)、Np.β1HD样(SEQ ID NO:17)、Tr.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:18)、冈比亚按蚊(Anopheles_gambiae)|XP_310919(SEQ ID NO:19)、蜜蜂(Apis_mellifera)|NP_001011632(SEQ ID NO:20)、Bt.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:21)、莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO:22)、弓背青鳉 (Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO:23)、中华青鳉(Oryzias_latipes)|BAA76691(SEQ ID NO:24)、紫球海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO:25)和野猪(Sus scrofa)β1|NP_001018042+(SEQ ID NO:26)。该对比使用MegAlign程序中的默认参数产生。图3A-3D中使用的缩写在下文中关于图4进行描述。
图4A-4D是来自图2和图3A-3D的H-NOX蛋白的序列对比：多数(Majority)(SEQ ID NO:27)、Dm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:11)、sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:12)、hs.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:13)、hs.β2蛋白(SEQ ID NO:14)、Mm.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:16)、Np.β1HD样(SEQ ID NO:17)、Tr.sGCβ1蛋白(SEQ ID NO:18)、莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID NO:22)、弓背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396(SEQ ID NO:23)、紫球海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID NO:25)、野猪(Sus scrofa)β1|NP_001018042(SEQ ID NO:26)、gcy-31a(SEQ ID NO:2)、gcy-33(SEQ ID NO:3)、Ca.HNOX(SEQ ID NO:9)、T.β1HD样(SEQ ID NO:8)、Ms.sGcβ3蛋白(SEQ ID NO:7)、CG14885(SEQ ID NO:5)和Dm.sGC短变体(SEQ ID NO:6)。该对比使用MegAlign程序中的默认参数产生。对于图2-4D，“Dm.sGCβ1蛋白”表示黑腹果蝇β1H-NOX；“sGCβ1蛋白”表示褐鼠β1H-NOX；“hs.sGCβ1蛋白”表示智人β1H-NOX；“hs.β2蛋白”表示智人β2H-NOX；“Mm.sGCβ1蛋白”表示小鼠β1H-NOX；“Np.β1HD样”表示球形念珠藻H-NOX；“Tr.sGCβ1蛋白”表示红鳍东方魨β1H-NOX；“冈比亚按蚊(Anopheles_gambiae)|XP_310919”表示冈比亚按蚊β1H-NOX；“蜜蜂(Apis_mellifera)|NP_001011632”表示蜜蜂β1H-NOX；“Bt.sGCβ1蛋白”表示西藏黄牛β1H-NOX；“莱茵衣藻(Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02”表示莱茵衣藻β1H-NOX；“弓背青鳉(Oryzias_curvinotus)|BAC98396表示弓背青鳉β1H-NOX；“青鳉(Oryzias_latipes)|BAA76691”表示中华青鳉β1H-NOX；“紫球海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)|X”表示紫球海胆β1H-NOX；“野猪(Sus scrofa)β1|NP_001018042+”表示野猪β1H-NOX；“gcy-31a”表示线虫Gcy-31a H-NOX；“gcy-33”表示线虫Gcy-33H-NOX；“gcy-35”表示线虫Gcy-35H-NOX；“Ca.HNOX”表示丙酮丁醇梭菌H-NOX；“T.β1HD样”表示腾冲嗜热厌氧菌H-NOX；“Ms.sGcβ3蛋白”表示烟草天蛾β3H-NOX；“CG14885”表示黑腹果蝇CG14885H-NOX；“Dm.sGC短变体”表示黑腹果蝇Gcy-88-E-S H-NOX并且“Dm.CG4154HNOX”表示黑腹果蝇CG4154H-NOX。
图5A是H-NOX家族成员的序列对比。序列编号为腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的编号。突变残基由“V”示出，极高保守残基由“s”示出。腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140由“H”示出。在其它H-NOX蛋白中可稳定FeII-O2复合体的预测的远侧袋酪氨酸残基：对于线虫GCY-35是位置70；在黑腹果蝇CG14885-PA中是位置140；线虫GCY-35的位置138；丙酮丁醇梭菌的位置140；根据腾冲嗜热厌 氧菌编号。登录号为：智人β1[gi:2746083](SEQ ID NO:28)、褐鼠β1[gi:27127318](SEQ ID NO:29)、黑腹果蝇β1[gi:861203](SEQ ID NO:30)、黑腹果蝇CG14885-PA[gi:23171476](SEQ ID NO:31)、线虫GCY-35[gi:52782806](SEQ ID NO:32)、点形念珠藻[gi:23129606](SEQ ID NO:33)、新月柄杆菌[gi:16127222](SEQ ID NO:34)、沙雷氏菌[gi:24373702](SEQ ID NO:35)、嗜肺军团菌(ORF 2)[CUCGC_272624](SEQ ID NO:36)、丙酮丁醇梭菌[gi:15896488](SEQ ID NO:37)和腾冲嗜热厌氧菌[gi:20807169](SEQ ID NO:38)。使用程序MegAlign,Lasergene,DNA Star(参见万维网“dnastar.com/products/megalign.php”)产生对比。Clustal-W默认参数被使用。
图5B是示例性H-NOX结构域的序列对比。该对比顶部的二级结构注释和编号对应于腾冲嗜热厌氧菌的H-NOX结构域。α-螺旋由螺旋表示，而β-折叠由箭头表示。远侧袋由α-螺旋αA、αD、αE和αG界定。Pubmed/NCBI登录号如下：Ther_tengcongensis gi(SEQ ID NO:39)、Clos_acetobutylicum gi(SEQ ID NO:40)、Clos_tetani GI:(SEQ ID NO:41)、Desu_desulfuricans gi 23475919.(SEQ ID NO:42)、Vibr_vulnificus gi(SEQ ID NO:43)、Caul_crescentus gi(SEQ ID NO:44)、Micr_degradans gi(SEQ ID NO:45)、Vibr_cholerae gi(SEQ ID NO:46)、Shew_oneidensis gi(SEQ ID NO:47)、Rat_beta1_sGC gi(SEQ ID NO:48)、Rat_beta2_sGC gi(SEQ ID NO:49)、Nost_punctiforme gi(SEQ ID NO:50)和Nost_sp.gi(SEQ ID NO:51)。共有序列显示在图5B的底部(SEQ ID NO:52)。对比使用程序MULTALIN(Corpet,F.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881–10890)产生，并且图5B使用程序ESPRIPT(Gouet,P.et al.(1999)Bioinformatics 15:305–308)制作。
图6A和6B是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX结构域的血红素环境的三维结构图。图6A和6B来自Pellicena,P.等人(2004年8月31日)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859。
图7A-7F是对于Tt H-NOX(图7A)、Tt Y140L(图7B)、Tt W9F-Y140L(图7C)、Tt F78Y-Y140L(图7D)、L2H-NOX和L2F142Y(图7E)以及β1(1-385)和β1(1-385)I145Y(图7F)，在暴露于空气(FeII-O2复合物；每个图的底部图线)之前和之后，在厌氧还原作用(FeII未连接复合物；每个图的顶部图线)后H-NOX蛋白的UV-可见光光谱图。除了L2F142Y和β1(1-385)I145Y的FeII和FeII-O2复合物之外，野生型L2H-NOX和β1-(1-385)H-NOX在还原反应和暴露于空气之后的光谱分别显示在图7E和7F中的中间图线，显示出这些蛋白在加入远侧袋酪氨酸之前不结合O2。在每个图左上角书写的两个或三个数字代表图中图线峰的波长。这些数字以其中相应的图线在图中垂直出现的顺序进行垂直书写。例如，图7A中的430nm值表示该图中顶部图线的波长的峰(其代表FeII未连接复合物)，而图7A 中416nm值表示该图中底部图线的波长的峰(其代表FeII-O2复合物)。在空气存在的情况下，波长的偏移表示该蛋白质结合O2。在空气存在的情况下，500到600nm间双峰的形成也表示O2结合。图7A-7F来自Boon,E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chem.Biol.1:53-59。
图8A-8DD包括编码H-NOX蛋白的示例性核酸的多核苷酸序列和相应H-NOX蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NOS:53-162)。
发明详述
本发明部分基于这样惊人的发现：H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得多的NO反应性。由于通过内源性NO使H-NOX蛋白失活的较低可能性，和通过H-NOX蛋白清除内源性NO的较低可能性，这一内在的低NO反应性(和高NO稳定性)使得野生型和突变H-NOX蛋白成为理想的血液替代物。重要地，远侧袋酪氨酸在一些H-NOX蛋白中的存在(Pellicena,P.等人(August 31,2004)，“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859)暗示了不理想的、高NO反应性，表明用作血液替代物不可取。例如，通过类推，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)血红蛋白，带有结构上类似的远侧袋酪氨酸，与NO反应极其迅速，并被分支杆菌(Mycobacterium)用于有效清除和避免由感染的宿主产生的防御性NO(Ouellet,H.等人(2002年4月30日)，“Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A99(9):5902-5907)。然而，我们吃惊地发现，H-NOX蛋白实际上具有比血红蛋白低得多的NO反应性，使它们用作血液替代物成为可能。
此外，令人吃惊地发现，结合NO而不结合O2的H-NOX蛋白可以通过单个氨基酸突变的引入被转化为结合NO和O2的H-NOX蛋白。因此，H-NOX蛋白对O2和NO的亲和性以及H-NOX蛋白分辨O2和NO配体的能力可以通过一个或多个氨基酸突变的引入而被改变，允许H-NOX蛋白被修改成以期望亲和力结合O2或NO。其它突变可以被引入，以进一步改变对O2和/或NO的亲和性。H-NOX蛋白家族可以因此被操纵，以显示出改善的或优化的O2输送动力学和热力学特征。例如，突变H-NOX蛋白已经被产生，其带有改变的对O2结合的解离常数和/或解离速率，这改善了H-NOX蛋白对多种临床和工业应用的有用性。调整H-NOX蛋白结合和输送O2的能力是解决和克服当前O2载体主要缺点的治疗途径。因此，本发明提供了用于氧输送的蛋白质、组合物、试剂盒及方法。
使用H-NOX蛋白进行O2输送有很多益处。外伤和手术后输血的主要作用是输送O2。理想的血液替代物避免了传统血液的挑战：病毒污染、配型要求、有限的使用期和有限的可用性。血红蛋白基血液替代物的主要限制是它们对O2的高亲和性和它们与NO反应的倾向性。如上文提到，即使低水平的NO破坏也可对 血管和器官的紧张性静止状态(tonic resting state)产生严重的影响，并导致高血压和胃肠不良应激。此外，在与NO反应的过程中，血红蛋白在临床相关时帧(clinically relevant timeframe)内失去其输送O2的能力。已经进行了多种尝试，以将第一代血红蛋白基氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers,HBOC)的毒性减到最小，包括分子内和分子间交联(“Blood Substitutes,”R.Winslow ed.Academic Press,2006)。尽管这些修饰克服了一些与血红蛋白外渗相关的严重毒性问题，但是由于高NO反应性，氧结合的破坏仍存在。这些第二代HBOC显示出降低的氧亲和性，具有接近红细胞p50值的p50值，但它们已经在临床试验中失败。由Winslow和同事提出了一种替代假设：具有合适粘度和胶体渗透压的低p50HBOC比高p50HBOC更适合用于无细胞氧输送(Tsai,A.G.等人(2003)，“Targeted O2Delivery by low-P50hemoglobin:A New Basis for O2Therapeutics,”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285:H1411-H1419；Winslow(2007).“Red Cell Substitutes,”Seminars in Hematology 44:51-59)。这类HBOC的NO反应性是否成为临床试验中的问题仍有待观察。工程改造H-NOX蛋白以在最小的NO反应性下结合并输送O2，提供了用于血液替代物中的新的血液气态O2载体，其中H-NOX蛋白输送O2而不清除NO，或通过NO被钝化为O2载体。这些H-NOX蛋白、组合物、试剂盒和方法在本文中进一步描述。
H-NOX蛋白
H-NOX蛋白家族概览
除非另有说明，任何野生型或突变H-NOX蛋白可以被用在本文所述的组合物、试剂盒及方法中。如本文所使用，“H-NOX蛋白”是指具有H-NOX结构域(命名为血红素-一氧化氮和氧(Heme-Nitric oxide and OXygen)结合结构域)的蛋白质。除H-NOX结构域之外，H-NOX蛋白可以含有或可以不含有一个或多个其它结构域。H-NOX蛋白是高度保守的、良好表征的血红素蛋白家族的成员(Iyer,L.M.等人(2003年2月3日)“Ancient Conserved Domains Shared by Animal Soluble Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins,”BMC Genomics 4(1):5；Karow,D.S..等人(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis,”Biochemistry 43(31):10203-10211；Boon,E.M..等人(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,E.M..等人(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins,”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M..等人(2005).“Ligand Specificity of H-NOX Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors,”J.Inorg.Biochem.99(4):892-902)。H-NOX蛋白也被称为Pfam 07700蛋白或HNOB蛋白(Pfam–蛋白结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型(Hidden Markov Models)的数据库，Copyright(C)1996-2006 The Pfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation,Inc.,59Temple Place-Suite 330,Boston,MA 02111-1307,USA)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有，或被预测具有包含6个α-螺旋、接着是2个β-折叠、接着是1个α-螺旋、接着是2个β-折叠的二级结构。H-NOX蛋白可以是能够结合血红素的脱辅基蛋白质或带有血红素结合的全蛋白质。H-NOX蛋白可以共价地或非共价地结合血红素基团。一些H-NOX蛋白结合NO而非O2，但其它结合NO和O2。来自已经被分离的兼性需氧微生物的H-NOX结构域结合NO而非O2。来自专性需氧原核生物、线虫和黑腹果蝇的H-NOX蛋白结合NO和O2。哺乳动物具有两种H-NOX蛋白：β1和β2。小鼠、大鼠、牛和人的H-NOX序列对比显示出这些物种享有>99％的同一性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的H-NOX结构域或整个H-NOX蛋白与天然存在的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白或天然存在的sGC蛋白(例如，天然存在的sGCβ1蛋白)的相应区域具有至少约下列任何一种的同一性：10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％。如本文进一步讨论，相对于相应的天然存在的H-NOX蛋白，H-NOX蛋白可任选地包含一个或多个突变。在一些实施方式中，H-NOX蛋白包括除H-NOX结构域以外的一个或多个结构域。在具体的实施方式中，H-NOX蛋白包括一个或多个结构域，或来自另一蛋白质的整个序列。例如，H-NOX蛋白可以是融合蛋白，其包括H-NOX结构域和另一蛋白的部分或全部，如白蛋白(诸如人血清白蛋白)。在一些实施方式中，只有H-NOX结构域存在。
来自腾冲嗜热厌氧菌的原核O2-结合H-NOX的晶体结构(Nioche,P..等人(2004年11月26日)“Femtomolar Sensitivity of a NO Sensor From Clostridium Botulinum,”Science 306(5701):1550-1553；Pellicena,P..等人(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859)表明，酪氨酸侧链羟基基团形成到FeII-O2部分的关键H键。该远侧袋氢键网络——主要包括Y140，稳定FeII-O2复合体(图6B)。该酪氨酸不存在于排斥O2并只结合NO的H-NOX蛋白中。例如，该氢键网络被预测不存在于来自sGC和需氧原核生物的H-NOX蛋白中，表明这在由这些血红素蛋白显示出的针对O2的显著配体选择性中是关键的分子因素。图7A-7G清楚地表明，在结合NO但不结合O2的野生型H-NOX蛋白的远侧袋中酪氨酸的添加可以使突变H-NOX蛋白能够结合O2。因此，在H-NOX血红素折叠的远侧血红素袋中的酪氨酸发挥开关一样的作用，以打开或关闭O2结合。
如图6A和6B所示，卟啉的结构被高度扭曲。如图6A所示，保守的Y-S-R基序使氢键合与血红素基团的丙酸侧链相互作用。图6B，保守的H102是血红素的近侧配体(图6B)。
如本文所使用，“蛋白质”包括无论从天然来源分离、由重组技术产生或化学合成的蛋白质和蛋白质片段。蛋白质可具有一种或多种修饰，例如翻译后 修饰(如糖基化等)或任何其它修饰(如聚乙二醇化等)。蛋白质可包含一个或多个非天然存在的氨基酸(例如，如带有侧链修饰的氨基酸)。在各种实施方式中，H-NOX蛋白具有至少约50、100、150、181、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白可包括约50到约600个氨基酸，例如约100到约500个氨基酸、约150到约400个氨基酸、约150到约300个氨基酸、或约175到约200个氨基酸。
H-NOX蛋白的来源
来自任何属或种的H-NOX蛋白可以被用在本文所述的组合物、试剂盒和方法中。在各种实施方式中，H-NOX蛋白是来自哺乳动物(例如，灵长类(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科或猫科)、昆虫、酵母或细菌的蛋白质，或衍生自这类蛋白质。示例性的哺乳动物H-NOX蛋白包括野生型人和大鼠可溶性鸟苷酸环化酶(如β1亚基)。H-NOX蛋白的实例包括野生型哺乳动物H-NOX蛋白，如智人、小鼠、家犬、西藏黄牛和褐鼠H-NOX蛋白，和野生型非哺乳动物的脊椎动物H-NOX蛋白，例如非洲爪蟾、中华青鳉、O.curivatus和红鳍东方鲀。非哺乳动物野生型NO-结合H-NOX蛋白的实例包括黑腹果蝇、冈比亚按蚊和烟草天蛾的野生型H-NOX蛋白；非哺乳动物野生型O2-结合H-NOX蛋白的实例包括线虫gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36和gcy-37；黑腹果蝇CG14885、CG14886和CG4154；以及烟草天蛾β-3的野生型H-NOX蛋白；原核野生型H-NOX蛋白的实例包括腾冲嗜热厌氧菌、霍乱弧菌、费氏弧菌、点形念珠藻、脱硫脱硫弧菌、嗜肺军团菌1、嗜肺军团菌2和丙酮丁醇梭菌的野生型H-NOX蛋白。
示例性H-NOX蛋白的NCBI登录号包括以下：智人β1[gi:2746083]、褐鼠β1[gi:27127318]、黑腹果蝇β1[gi:861203]、黑腹果蝇CG14885-PA[gi:23171476]、线虫GCY-35[gi:52782806]、点形念珠藻[gi:23129606]、新月柄杆菌[gi:16127222]、沙雷氏菌[gi:24373702]、嗜肺军团菌(ORF 2)[CUCGC_272624]、丙酮丁醇梭菌[gi:15896488]和腾冲嗜热厌氧菌[gi:20807169]。
示例性的H-NOX蛋白也包括以下H-NOX蛋白，其按照它们的基因名、接着是它们的种属缩写和Genbank识别码加以列出(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日或2007年5月22日起可用的以下蛋白序列，它们各自通过引用由此并入其全部内容)：Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、 Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy-32_Ce_13539160、gcy-36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2-Hs_899477或GYCα-99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan et al.(2003).“Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins,”BMG Genomics 4:5-13)。这些名称中使用的物种缩写包括：Ana–鱼腥藻(Anabaena Sp)；Ccr–新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；Cac–丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)；Dde–脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)；Mcsp–趋磁细菌某种(Magnetococcus sp.)；Mde–Microbulbifer degradans；Npu–念珠藻(Nostoc punctiforme)；Rhsp–球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；Sone–沙雷氏菌(Shewanella oneidensis)；Tte–腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；Vch–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；Ce–线虫；Dm–黑腹果蝇；Hpul–马粪海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)；Hs–智人。
其它示例性的H-NOX蛋白包括以下H-NOX蛋白，它们按照它们的生物体名称和Pfam数据库登录号排列(例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日或2007年5月22日起可用的以下蛋白序列，它们各自通过引用由此并入其全部内容)：线虫种(Caenorhabditis briggsae)Q622M5_CAEBR、线虫种Q61P44_CAEBR、线虫种Q61R54_CAEBR、线虫种Q61V90_CAEBR、线虫种Q61A94_CAEBR、线虫种Q60TP4_CAEBR、线虫种Q60M10_CAEBR、线虫(Caenorhabditis elegans)GCY37_CAEEL、线虫GCY31_CAEEL、线虫GCY36_CAEEL、线虫GCY32_CAEEL、线虫GCY35_CAEEL、线虫GCY34_CAEEL、线虫GCY33_CAEEL、弓背青鳉(Oryzias curvinotus)Q7T040_ORYCU、弓背青鳉Q75WF0_ORYCU、青鳉(Oryzias latipes)P79998_ORYLA、青鳉Q7ZSZ5_ORYLA、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚Q4S6K5_TETNG、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾(Xenopus laevis)Q6INK9_XENLA、智人Q5T8J7_HUMAN、智人GCYA2_HUMAN、智人GCYB2_HUMAN、智人GCYB1_HUMAN、大猩猩(Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、猩猩(Pongo pygmaeus)Q5RAN8_PONPY、黑猩猩(Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴(Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长臂猿(Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠(Mus musculus)Q8BXH3_MOUSE、小鼠GCYB1_MOUSE、小鼠Q3UTI4_MOUSE、小鼠Q3UH83_MOUSE、小鼠Q6XE41_MOUSE、小鼠Q80YP4_MOUSE、褐鼠Q80WX7_RAT、褐鼠Q80WX8_RAT、褐鼠Q920Q1_RAT、褐鼠Q54A43_RAT、褐鼠Q80WY0_RAT、褐鼠Q80WY4_RAT、褐鼠Q8CH85_RAT、褐鼠Q80WY5_RAT、褐鼠GCYB1_RAT、 褐鼠Q8CH90_RAT、褐鼠Q91XJ7_RAT、褐鼠Q80WX9_RAT、褐鼠GCYB2_RAT、褐鼠GCYA2_RAT、家犬(Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、西藏黄牛(Bos taurus)GCYB1_BOVIN、野猪(Sus scrofa)Q4ZHR7_PIG、双斑蟋(Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾(Manduca sexta)O77106_MANSE、烟草天蛾O76340_MANSE、意大利蜂(Apis mellifera)Q5UAF0_APIME、意大利蜂Q5FAN0_APIME、意大利蜂Q6L5L6_APIME、冈比亚疟蚊str PEST(Anopheles gambiae str PEST)Q7PYK9_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7Q9W6_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7QF31_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PS01_ANOGA、冈比亚疟蚊str PEST Q7PFY2_ANOGA、冈比亚疟蚊Q7KQ93_ANOGA、黑腹果蝇Q24086_DROME、黑腹果蝇GCYH_DROME、黑腹果蝇GCY8E_DROME、黑腹果蝇GCYDA_DROME、黑腹果蝇GCYDB_DROME、黑腹果蝇Q9VA09_DROME、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)Q29CE1_DROPS、拟暗果蝇Q296C7_DROPS、拟暗果蝇Q296C8_DROPS、拟暗果蝇Q29BU7_DROPS、海蜗牛(Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻Q8YUQ7_ANASP、黄杆菌BBFL7(Flavobacteria bacterium BBFL7)Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC700755Q1VQE5_9FLAO、海洋γ蛋白菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋γ蛋白菌HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌Q9A451_CAUCR、隐藏嗜酸菌JF-5(Acidiphilium cryptum JF-5)Q2DG60_ACICY、球形红细菌Q3J0U9_RHOS4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILPO、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)PD1222Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040Q3QNY2_9RHOB、Jannaschia sp Q28ML8_JANSC、Magnetococcus sp MC-1Q3XT27_9PROT、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌Q5X2R2_LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种(Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种Q5ZSQ8_LEGPH、嗜冷细菌(Colwellia psychrerythraea)Q47Y43_COLP3、Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌Q8EF49_SHEON、Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)12G01Q1VCP6_VIBAL、弧菌(Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)Q87NJ1_VIBPA、费氏弧菌(Vibrio fischeri)Q5E1F5_VIBF1、创伤弧菌Q7MJS8_VIBVY、发光细菌(Photobacterium sp)SKA34Q2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺旋菌某种(Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌某种(Oceanobacter sp)RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans) Q310U7_DESDG、奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌Q8RBX6_THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭菌Q97E73_CLOAB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CLOT、破伤风梭菌(Clostridium tetani)Q899J9_CLOTE和拜氏梭菌NCIMB8052(Clostridium beijerincki NCIMB 8052)Q2WVN0_CLOBE。使用本文所述的Pfam数据库，基于属于H-NOX蛋白家族的这些蛋白质的标识，预测这些序列编码H-NOX蛋白。
可适合用于本文所述的药物组合物和方法的另外的H-NOX蛋白和核酸可以使用标准方法进行鉴定。例如，基于它们的一级结构和/或预测的蛋白质二级结构与已知H-NOX蛋白和核酸的相似性，标准序列对比和/或结构预测程序可以被用于识别另外的H-NOX蛋白和核酸。例如，Pfam数据库使用定义的对比算法(defined alignment algorithms)和隐蔽马尔科夫模型(例如Pfam 21.0)将蛋白质分类为家族，如H-NOX蛋白家族(Pfam–蛋白结构域家族对比和隐蔽马尔科夫模型的数据库，Copyright(C)1996-2006The Pfam Consortium；GNU LGPL Free Software Foundation,Inc.,59Temple Place-Suite 330,Boston,MA 02111-1307,USA)。标准数据库，例如swissprot-trembl数据库(万维网地址为“expasy.org”,Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1rue Michel Servet CH-1211Geneva 4,Switzerland)，也可以被用于鉴定H-NOX蛋白家族的成员。H-NOX蛋白的二级和/或三级结构可以使用标准结构预测程序的默认参数进行预测，例如PredictProtein(630West,168Street,BB217,New York,N.Y.10032,USA)。可选地，H-NOX蛋白的实际二级和/或三级结构可以使用标准方法确定。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白在相应的位置上具有与腾冲嗜热厌氧菌H-NOX中以下远侧袋残基的任何一个相同的氨基酸：Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、Leu144或前述两个或多个的任何组合。在一些实施方式中，基于它们氨基酸序列的序列对比，H-NOX蛋白在与腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115或Arg135相应的位置上分别具有脯氨酸或精氨酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有对应于褐鼠β1H-NOX的His105的组氨酸。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有，或被预测具有包含6个α-螺旋、接着是2个β-折叠、接着是1个α-螺旋、接着是2个β-折叠的二级结构。该二级结构对于H-NOX蛋白已经被报道。
如果希望，新鉴定的H-NOX蛋白可以使用标准方法进行检测，以确定其是否结合血红素。H-NOX蛋白作为O2载体起作用的能力可以通过使用标准方法——例如本文所述的那些——确定H-NOX蛋白是否结合O2加以检测。如果希望，本文所述突变的一个或多个可以被引入H-NOX蛋白以优化其作为O2载体的特性。例如，一个或多个突变可以被引入，以改变其O2解离常数、对氧koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两个或多个的任何组合。标准 技术，例如本文所述的那些，可以被用于测量这些参数。
如本文所讨论，突变H-NOX蛋白(如下文讨论的I类和II类突变)可从这些或其它天然野生型来源序列(例如，图2-4D或8A-8DD所列的序列或本文所述的任何其它序列)通过诱变进行衍生。如本文所使用，“从……衍生(或衍生自)”涉及一个或多个突变被引入其中的蛋白质的来源。例如，“从哺乳动物蛋白质衍生的”蛋白质指的是将一个或多个突变引入野生型(即，天然存在的序列)哺乳动物蛋白序列产生的目标蛋白质。
突变H-NOX蛋白
如本文进一步讨论，H-NOX蛋白可包含一个或多个突变，例如与相应野生型蛋白的那些相比，改变O2解离常数、对氧koff、血红素自氧化速率、NO反应性、NO稳定性或前述两种或多种的任何组合的突变。由于本文提供的教导，使用本文所述且普通技术人员已知的技术，可通过随机诱变，接着经验筛选需要的或期望的解离常数、解离速率、NO反应性、稳定性、生理相容性或前述两种或多种的任何组合，来产生工程化的H-NOX蛋白组。可选地，诱变可以选择性地靶向特定区域或残基，例如H-NOX蛋白的实验确定或预测的三维结构中明显的远侧袋残基(本文图1A；并参见，例如，Boon,E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chemical Biology 1:53-59，其通过引用由此并入其全部内容，特别是涉及野生型和突变H-NOX蛋白的序列)或通过序列对比鉴定的进化上保守的残基(本文图2-4；并参见，例如，Boon E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chemical Biology 1:53-59，其通过引用由此并入其全部内容，特别是涉及野生型和突变H-NOX蛋白的序列)。
如本文所使用，“突变蛋白”意指与天然存在的蛋白质相比，具有一个或多个突变的蛋白质。在一种实施方式中，突变蛋白具有与所有天然存在的蛋白质的序列不同的序列。在各种实施方式中，突变蛋白的氨基酸序列与天然发生的蛋白的相应区域的序列具有至少约下列任一同一性：10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99或99.5％。在一些实施方式中，突变蛋白是含有来自全长蛋白的至少约下列任何个数的连续氨基酸的蛋白片段：25、50、75、100、150、200、300或400个。例如，可以使用带有其中指定的默认参数的序列分析软件(例如Genetics Computer Group的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package),University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,WI 53705)测量序列同一性。该软件程序通过对各种氨基酸置换、删除和其它修饰赋予同源性程度来匹配相似序列。
如本文所使用，“突变”意指在天然发生的参考核酸或氨基酸序列中的改变。示例性的核酸突变包括插入、缺失、移码突变、沉默突变、无义突变或错 义突变。在一些实施方式中，核酸突变不是沉默突变。示例性的蛋白突变包括一个或多个氨基酸的插入(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的插入)、一个或多个氨基酸的缺失(如N-末端、C-末端和/或内部残基的缺失，例如至少约下列任何个数的氨基酸的缺失：5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或更多个，或者大约下列任何个数的氨基酸的缺失：5、10、15、25、50、75、100、150、200、300或400个)、一个或多个氨基酸的置换(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的置换)、或前述两种或多种的组合。H-NOX蛋白的示例性功能截短包括β1序列的残基1-385。在一些实施方式中，与天然发生的蛋白质相比，突变蛋白具有至少一个氨基酸改变。在一些实施方式中，突变核酸序列编码与天然发生的蛋白质相比具有至少一个氨基酸改变的蛋白质。在一些实施方式中，核酸不是天然发生的核酸的简并版本，所述天然发生的核酸编码与天然发生的蛋白质具有相同的氨基酸序列的蛋白质。在提到特定氨基酸突变中使用的命名法首先确定野生型氨基酸，接着是残基编号，而最后是取代氨基酸。例如，Y140L表示在残基编号140上的酪氨酸被亮氨酸置换。
“进化上保守的突变”是一种蛋白质中的氨基酸被同一蛋白质家族中另一种蛋白质相应位置上的氨基酸置换。示例性的进化上保守的突变(也表示为I类突变)列于表1A。在表1A中，突变根据人β1H-NOX的序列进行编号/注释，但对有所有H-NOX序列都是类似的。因此，任何其它H-NOX蛋白中的对应位置可以被突变为指出的残基。例如，人β1H-NOX的Phe4可以被突变为酪氨酸，由于其它H-NOX蛋白在该位置具有酪氨酸。对应的苯丙氨酸残基可以被突变为其它任何H-NOX蛋白中的酪氨酸。在具体实施方式中，一个或多个突变被限定为进化上保守的残基。在一些实施方式中，一个或多个突变可包括至少一个进化上保守的突变和至少一个非进化上保守的突变。如果希望，鉴于本文提供的教导，这些突变H-NOX蛋白经受对NO/O2解离常数、NO反应性、稳定性和生理相容性的经验筛选。
表1A.示例性的靶向进化上保守的残基的I类H-NOX突变
在一些实施方式中，所述突变为远侧袋突变，例如α-螺旋A、D、E或G中残基的突变(Pellicena,P.等人(2004年8月31日).“Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases,”Proc Natl.Acad Sci USA 101(35):12854-12859)。示例性的远侧袋突变(也表示为II类突变)列于表1B。在表1B中，突变根据人β1H-NOX的序列进行编号/注释，但对于所有H-NOX序列都是类似的。因为若干取代在每个所描述的残基处提供了可行的突变，在每个指出位置的残基可以被改变为任何其它天然或非天然存在的氨基酸(表示为“X”)。这类突变可以产生具有各种期望亲和力、稳定性和反应性特征的H-NOX蛋白。
表1B.示例性的靶向远侧袋残疾的II类H-NOX突变
V8X   M73X I145X
L9X   F77X  I149X 
F70X  C78X
在具体实施方式中，所述突变为血红素远侧袋突变。如本文所述，在H-NOX家族的NO-结合成员中阻止O2结合的关键分子决定因素是血红素的远侧袋中氢键供体的缺乏。因此，在一些实施方式中，所述突变改变H-NOX结构域和远侧袋内配体之间的氢键结合。在一些实施方式中，所述突变破坏远侧袋的氢键供体和/或相对于对应的野生型H-NOX结构域赋予降低的O2配体结合。示例性的远侧袋残基包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的hr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140和Leu144以及任何其它H-NOX蛋白中对应的残基。
不在远侧袋中的残基也可影响血红素基团的三维结构；该结构再影响O2和NO与血红素基团中铁的结合。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白在远侧袋之外具有一个或多个突变。可以被突变但不在远侧袋中的残基的实例包括腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Pro115和Arg135。在一些实施方式中，所述突变在近侧袋(proximal pocket)中，所述近侧袋包括His105，其作为连接到血红素铁的残基。
在一些实施方式中，当存在两个或多个突变时，至少一个突变在远侧袋之中，并且至少一个突变在远侧袋之外(例如，在近侧袋中的突变)。在一些实施方式中，所有的突变都在远侧袋中。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与由自然界中生物体产生的蛋白质的序列不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2006年5月21日或2006年5月22日于任何数据库中发现的序列(例如预测为或已知为H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的氨基酸序列与在2007年5月21日或2007年5月22日于任何数据库中发现的序列(例如预测为或已知为H-NOX核酸或氨基酸序列的所有已知序列)不相同。
为了降低从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四 级结构表面上的一个或多个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。在一些变异中，一个或多个表面氨基酸的突变可与两个或多个远侧袋残基的突变、远侧袋外的一个或多个残基的突变(如，近侧袋中的突变)或前述两种或多种的组合进行组合。
示例性的突变显示于表2。此外，表2中所列残基的任何一个可以被突变为任何其它氨基酸。本发明也涉及本文所述突变的任何组合，例如双突变、三突变或更高的多突变。例如，本文所述突变的任何一种的组合可以在同一H-NOX蛋白中进行。注意，在其它哺乳动物或非哺乳动物H-NOX蛋白的等价位置上的突变也被本发明包括。如果希望，除表2中提到的残基以外的残基也可以被突变。示例性的突变H-NOX蛋白包含一个或多个突变，其相对于对应的野生型H-NOX结构域赋予改变的O2或NO配体-结合，并可作为生理相容的哺乳动物O2血液气体载体起作用。
在表2和所有随后的表格中，突变的残基编号表示在被描述的特定H-NOX蛋白的序列中的位置。例如，腾冲嗜热厌氧菌I5A指的是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX第五个位置上的异亮氨酸被丙氨酸置换。相同的异亮氨酸到丙氨酸的突变可以在任何其它H-NOX蛋白的相应残基中进行(该残基可以是或可以不是其它H-NOX蛋白序列中的第五个残基)。由于哺乳动物β1H-NOX结构域的氨基酸序列最多有两个氨基酸不同，所以，当被引入野生型大鼠β1H-NOX蛋白时产生期望突变H-NOX蛋白的突变也被预期当在被引入来自其它哺乳动物如人的野生型β1H-NOX蛋白中时产生期望的突变H-NOX蛋白。
表2.来自腾冲嗜热厌氧菌(Tt)、嗜肺军团菌(Lp)、脱硫脱硫弧菌(Dd)、霍乱弧菌(Vc)、点形念珠藻(Np)、肉毒杆菌(Cb)、丙酮丁醇梭菌(Ca)、大鼠、人、线虫(Ce)的示例性H-NOX突变
H-NOX蛋白的修饰
野生型或突变H-NOX蛋白的任何一种都可以使用标准方法进行修饰和/或配制，以增强治疗或工业应用。例如并且尤其是应用到异源工程H-NOX蛋白时，本领域内已知各种方法用于将这样的试剂与免疫监视隔离，包括交联、聚乙二醇化、糖修饰等(例如，Rohlfs,R.J.等人(1998年5月15日)“Arterial Blood Pressure Responses to Cell-Free Hemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric  Oxide,”J.Biol.Chem.273(20):12128-12134；Migita,R.等人(1997年6月)，“Blood Volume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion With Hemoglobin-Based Oxygen Carriers,”J.Appl.Physiol.82(6):1995-2002；Vandegriff,K.D.et al.(2004年8月15日)“Kinetics of NO and O2Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin,”Biochem J.382(Pt1):183-189，它们各自通过引用由此并入其全部内容，尤其是关于蛋白质的修饰)，以及普通技术人员已知的其它技术。将H-NOX蛋白与诸如人血清白蛋白的人蛋白融合可以提高血清半衰期、粘度和胶体渗透压(colloidal oncotic pressure)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在其合成过程之中或之后被修饰，以降低其免疫原性和/或提高其血浆保留时间。H-NOX蛋白也可以被包封(例如在脂质体或纳米颗粒中包封)。
野生型和突变H-NOX蛋白的特征
如本文所述，提供NO和O2解离常数范围、O2koff范围、NO反应性范围、和稳定性范围的大量不同的H-NOX突变蛋白已经被产生。为了提供有效的血液气体载体，H-NOX蛋白可被用于在功能上代替或补充内源性O2载体，例如血红蛋白。因此，在一些实施方式中，与诸如血红蛋白的内源性O2载体相比，H-NOX蛋白具有相似或提高的O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、NO稳定性、NO反应性、自氧化速率、血浆保留时间或前述两种或多种的任何组合。
如本文所使用，“血红蛋白”表示来自被良好表征的血红蛋白家族的蛋白或其突变体，它们是红细胞中含铁的O2输送金属蛋白。纯化的、无基质人血红蛋白具有约200-500nM的对O2动力学KD。该值是亚基依赖性的。
如本文所使用，“koff”表示解离速率，例如O2或NO从蛋白质释放的速率。较低数值的低koff表示较低的解离速率。在各种实施方式中，H-NOX蛋白的对O2koff在20℃在约0.01到约200s-1之间，例如，约0.1到约200s-1、约0.1到100s-1、约1.0到约16.0s-1、约1.35到约23.4s-1、约1.34到约18s-1、约1.35到约14.5s-1、约0.21到约23.4s-1、约1.35到约2.9s-1、约2到约3s-1、约5到约15s-1或约0.1到约1s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在20℃具有小于或等于约0.65s-1的对氧koff(例如，在20℃在约0.21s-1到约0.65s-1之间)。
“kon”表示结合速率，例如O2或NO与蛋白质的结合速率。较低数值的低kon表示较低的结合速率。在各种实施方式中，H-NOX蛋白的对O2kon在20℃在约0.14到约60μM-1s-1之间，例如，约6到约60μM-1s-1、约6到12μM-1s-1、约15到约60μM-1s-1、约5到约18μM-1s-1或约6到约15μM-1s-1。
“解离常数”表示“动力学解离常数”或“计算的解离常数”。“动力学解离常数”或“KD”表示动力学解离速率(koff)与动力学结合速率(kon)的比率，例如使用标准方法(例如，标准光谱法、停流法或闪光光解法)——包括普通技术人 员已知的和/或本文所述的方法——被测定为绝对值的KD值。“计算的解离常数”或“计算KD”指的是基于测量的koff的动力学解离常数的近似值。kon的值通过动力学KD和koff之间的相关性导出，如本文所述。
在各种实施方式中，H-NOX蛋白结合O2的动力学或计算的KD在约1nM到1mM之间，例如，在20℃约2nM到约2μM、约2μM到约1mM、约100nM到约1μM、约9μM到约50μM、约100μM到约1mM、约50nM到约10μM、约2nM到约50μM、约100nM到约1.9μM、约150nM到约1μM，或约100nM到约255nM、约20nM到约2μM、20nM到约75nM、约1μM到约2μM、约2μM到约10μM、约2μM到约9μM或约100nM到500nM。在一些实施方式中，O2结合的动力学或计算的KD在20℃小于约下列值的任何一个：100nM、80nM、50nM、30nM、25nM、20nM或10nM。
在各种实施方式中，H-NOX蛋白结合O2的动力学或计算的KD是相同条件下(例如，在20℃)血红蛋白的约0.01到约100倍，例如在相同条件下(例如，在20℃)血红蛋白的约0.1到约10倍，或约0.5到约2倍。在多种实施方式中，H-NOX蛋白结合NO的动力学或计算的KD是相同条件下(例如，在20℃)血红蛋白的约0.01到约100倍，例如在相同条件下(例如，在20℃)血红蛋白的约0.1到约10倍，或约0.5到约2倍。
如本文所使用，“氧亲和性”是一个定性术语，其指氧结合到蛋白质的血红素部分的强度。所述亲和性受对氧koff和kon两者的影响。数值上较低的氧KD值表示较高的亲和力。“NO亲和性”是一个定性术语，其指NO结合到蛋白质(例如，结合血红素基团或结合氧，所述氧结合到与蛋白质结合的血红素基团)的强度。所述亲和性受对NO koff和kon两者的影响。数值上较低的NO KD值表示较高的亲和性。
如本文所使用，“NO稳定性”指的是蛋白质在氧存在的情况下对NO氧化的稳定性或抗性。例如，蛋白质在氧存在下结合到NO时不被氧化的能力是蛋白质的NO稳定性的指示。在一些实施方式中，在20℃下温育约1、2、4、6、8、10、15或20小时的任何一段时间后，小于约50、40、30、10或5％中的任何一个百分比的H-NOX蛋白被氧化。
如本文所使用，“NO反应性”指的是在2μM蛋白质的浓度下，在氧存在的情况下，在血红素结合蛋白的血红素中的铁被NO氧化的速率。单位为s-1的较低数值的NO反应性表示较低的NO反应性。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1，例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃在约0.1到约600s-1之间，例如，在20℃在约0.5到约400s-1、约0.5到约100s-1、约0.5到约50s-1、约0.5到约10s-1、约1到约5s-1或约 0.5到约2.1s-1之间。在多种实施方式中，在相同条件下，如在20℃，H-NOX蛋白的反应性比血红蛋白的反应性至少低约10、100、1,000或10,000倍。
如本文所使用，“自氧化速率”指的是在血红素结合蛋白的血红素中铁被自氧化的速率。单位为s-1的较低数值的自氧化速率表示较低的自氧化速率。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1.0h-1，例如在37℃小于约下列值的任何一个：0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1、0.1h-1或0.05h-1。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃，在约0.006到约5.0h-1之间，例如在37℃，约0.006到约1.0h-1、约0.006到约0.9h-1或约0.06到约0.5h-1。
在多种实施方式中，突变H-NOX蛋白具有(a)在血红蛋白的2个数量级之内的O2或NO解离常数、结合速率(对O2或NO的kon)或解离速率(对O2或NO的koff)，(b)分别具有比sGCβ1弱(例如，至少弱约10倍、100倍或1000倍)的NO亲和力，(c)比血红蛋白低至少1000倍的与结合O2的NO反应性，(d)比血红蛋白高至少2、10、100或1000倍的体内血浆保留时间，或(e)前述两种或多种的任何组合。
示例性的适当O2载体提供了在血红蛋白的两个数量级之内的解离常数，即在约0.01到100倍之间，例如在血红蛋白的解离常数的约0.1到10倍之间，或约0.5到2倍之间。各种已建立的技术可被用于量化解离常数，例如本文所述的技术(Boon,E.M.等人(2005)，“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.等人(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins,”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.等人(2005).“Ligand Specificity of H-NOX Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors,”J.Inorg.Biochem.99(4):892-902),Vandegriff,K.D.等人(August 15,2004)“Kinetics of NO and O2Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated Human Haemoglobin,”Biochem J.382(Pt 1):183-189，它们的每个都在此被完整引入作为参考，尤其是涉及解离常数的测量)，以及普通技术人员已知的那些技术。示例性的O2载体为带有结合O2的H-NOX蛋白提供了低的或最小的NO反应性，例如比血红蛋白低的NO反应性。在一些实施方式中，NO反应性比血红蛋白的NO反应性低得多，例如低至少约10、100、1,000或10,000倍。多种已建立的技术可被用于量化NO反应性(Boon,E.M.等人(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.等人(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins,”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.等人(2005).“Ligand Specificity of H-NOX Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors,”J.Inorg.Biochem.99(4):892-902),Vandegriff,K.D.等人(2004年8月15日)“Kinetics of NO and O2Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)-Conjugated  Human Haemoglobin,”Biochem J.382(Pt 1):183-189，它们的每个都在此被完整引入作为参考，尤其是涉及NO反应性的测量)，以及普通技术人员已知的那些技术。因为野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX具有这样的低NO反应性，所以其它野生型H-NOX蛋白和突变H-NOX蛋白可具有相似的低NO反应性。例如，腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H具有与野生型腾冲嗜热厌氧菌H-NOX相似的NO反应性。
此外，适当的O2载体提供了高的或最大的稳定性，特别是体内稳定性。多种稳定性量度可以被使用，例如氧化稳定性(如，对自氧化或NO氧化的稳定性)、温度稳定性和体内稳定性。多种已建立的技术可被用于量化稳定性，例如本文所述的技术(Boon,E.M.等人(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chem.Biol.1:53-59；Boon,E.M.等人(2005年10月).“Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H-NOX Family of Heme Sensor Proteins,”Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441-446；Boon,E.M.等人(2005).“Ligand Specificity of H-NOX Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors,”J.Inorg.Biochem.99(4):892-902)，以及普通技术人员已知的那些技术。对于血浆、血液或组织中的体内稳定性，示例性的稳定性量度包括保留时间、清除速率和半衰期。来自嗜热生物体的H-NOX蛋白被预期在高温下稳定。在多种实施方式中，血浆保留时间比血红蛋白的血浆保留时间高至少约2、10、100或1000倍(例如，Bobofchak,K.M.等人(2003年8月).“A Recombinant Polymeric Hemoglobin With Conformational,Functional,And Physiological characteristics of an in vivo O2transporter,”Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285(2):H549-H561)。普通技术人员将认识到，基于血红蛋白的血液代用品受到来自血浆的无细胞血红蛋白的快速清除的限制，该快速清除的原因在于存在将无细胞血红蛋白从血浆中除去的血红蛋白受体。由于血浆中没有H-NOX蛋白的受体，野生型和突变H-NOX蛋白被预期具有比血红蛋白更长的保留时间。如果希望，血浆保留时间可以通过聚乙二醇化或交联H-NOX蛋白，或使用标准方法(如本文所述的那些和普通技术人员已知的那些)将H-NOX蛋白与另一蛋白融合而提高。
在多种实施方式中，H-NOX蛋白在20℃具有约1nM到约1mM之间的O2解离常数，并且在相同条件下，如在20℃，具有比血红蛋白的NO反应性低至少约10倍的NO反应性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在20℃具有在约1nM到约1mM之间的O2解离常数，和在20℃小于约700s-1(例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)的NO反应性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白具有在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内的O2解离常数，并且在相同条件下，如在20℃，具有比血红蛋白的NO反应性低至少约10倍的NO反应性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在20℃具有约0.01到约200s-1之间的对氧koff，以及在相同条件下，如在20℃，比血红蛋白的NO反应性低至少约10倍的NO反应性。在一些实施方式中，H-NOX蛋白在20℃具有小于约0.65s-1(例如，在20℃ 在约0.21s-1到约0.64s-1之间)的对氧koff，以及在相同条件下，如在20℃，比血红蛋白的NO反应性低至少约10倍的NO反应性。在具体实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃，在约2nM到约50μM、约50nM到约10μM、约100nM到约1.9μM、约150nM到约1μM或约100nM到约255nM之间。在多种实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃小于约80nM，例如在20℃，在约20nM到约75nM之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在相同条件下——例如在20℃下——比血红蛋白的NO反应性至少低约100倍或低约1000倍。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1，例如在20℃小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、5s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1或0.6s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在0.01到200s-1之间，例如约0.1到约200s-1、约0.1到约100s-1、约1.35到约23.4s-1、约1.34到约18s-1、约1.35到约14.5s-1、约0.21到约23.4s-1、约2到约3s-1、约5到约15s-1、约0.1到约1s-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约1.9μM之间，并且H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.35s-1到约14.5s-1之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1，例如小于约下列值的任何一个：0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1或0.1h-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.35s-1到约14.5s-1之间，并且H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.35s-1到约14.5s-1之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如，在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白的血红素自氧化速率在37℃小于约1h-1，并且H-NOX蛋白的NO反应性在20℃小于约700s-1(例如在20℃小于约600s-1、500s-1、100s-1、20s-1或1.8s-1)。
在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1到4厘泊(cP)之间。在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的胶体渗透压在20到50mmHg之间。
表3列出了野生型和突变H-NOX蛋白的示例性大小、氧亲和度、自氧化稳定性、NO反应速率和修饰。在表3中，载体大小指的是修饰的(如，聚乙二醇化)或未修饰的H-NOX蛋白的分子量。
表3：H-NOX蛋白的示例性实施方式
对于特定突变体的示例性数据被报告于表4-12。在表4-12中，β1和β2指的是从大鼠H-NOX蛋白衍生的蛋白。由于哺乳动物β1H-NOX结构域的氨基酸序列中最多两个氨基酸不同，所以，对于其它哺乳动物β1H-NOX蛋白如人β1H-NOX中相应突变预期得到相似的结果。如表4所示，将一个或多个突变引入野生型H-NOX蛋白允许自氧化速率和O2解离速率被改变。如果希望，自氧化速率或O2解离速率可以通过组合表4中所列单突变或双突变的任何一种，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白而被进一步改变，如本文所述。
表4.野生型和II类突变H-NOX蛋白的自氧化稳定性、O2结合性质(例如O2解离的速率)和远侧袋氢键合残基被列出
表5显示了通过引入一个或多个突变，H-NOX蛋白中O2结合速率(kon)、O2解离速率(koff)、O2解离常数(KD)和自氧化速率(kox)的改变。在一些实施方式中，表5中所列的单或双突变的任何一种与另一突变(例如表5中的另一突变或本文所述的任何其它突变)组合，以进一步改变O2结合速率、O2解离速率、O2解离常数、自氧化速率或前述两种或多种的组合。
表5.组胺酰-连接的FeII血红素蛋白的O2结合动力学常数
表6显示了H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性和FeII-O2复合体的稳定性可通过引入一个或多个突变加以改变。在一些实施方式中，表6中所列的单或双突变的任何一种与另一突变(例如 表6中的另一突变或本文所述的任何其它突变)组合，以进一步改变H-NOX蛋白的O2结合速率、O2解离速率、O2、自氧化速率、NO反应性或FeII-O2复合体的稳定性。普通技术人员将理解，引入一个或多个另外的突变，如本文所述的那些突变，可被用于进一步改变这些值。
表6.H-NOX蛋白中的O2结合速率、O2解离速率、O2自氧化速率、NO反应性和FeII-O2复合体的稳定性
表7显示了O2结合的解离常数可以通过突变H-NOX蛋白中一个或多个残基而被显著改变。这些示例性H-NOX蛋白的动力学KD值在20℃在21.20nM到1000000.00nM的范围内。如果希望，O2结合的解离常数可以通过组合表7中所列单或双突变的任何一种，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白而被进一步改变，如本文所述。
表7.按O2结合的解离常数值排列的野生型和突变H-NOX蛋白以及参考蛋白 
蛋白质 动力学KD(nM) ± 计算的KD(nM)
Tt P115A 21.2 2.1  
Tt N74H     27
Tt I5L-P115A     30
Tt N74A     32
Tt I5A     80
Tt F78Y-Y140L     80
Tt H-NOX His6     89
Tt H-NOX 89.7 6.2  
Tt wt     90
Tt F78Y-Y140F     150
Tt W9Y     218
Tt R135Q His6     252
Hs Hbβ     267
Tt W9F 305 31  
Tt W9H     456
Tt Y140H     500
Hs Hbα     560
Tt W9N     573
Tt I75F-His6     713-773
HemAT-B     720
Sw Mb     880
Tt I5L     1000
Tt L144F-His6     1092-1185
Tt Y140L     2000
Tt W9F-Y140H     2500
L2F142Y 9200 3000  
Bj FixL     140000
Tt W9F-N74A     1000000
Dd H-NOX     1000000
β1(1-385)I145Y     1000000
[0098] 表8显示了O2结合的解离速率可以通过突变H-NOX蛋白中一个或多个残基而被明显改变。这些示例性H-NOX蛋白的解离速率在20℃下在0.21s-1到23.4s-1的范围内。如果希望，O2结合的解离速率可以通过组合表8中所列单或双突变的任何一种，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白而被进一步改变，如本文所述。
表8.按O2结合的解离速率值排列的野生型和突变H-NOX蛋白以及参考蛋白 
蛋白质 koff(s-1) ±
Tt N74A 0.21 0.004
Tt P115A 0.22 0.01
Tt I5L-P115A 0.28 0.03
Tt N74E 0.38 0.01
Tt N74H 0.44 0.01
Tt I5A 0.82 0.03
Tt F78Y-Y140L 0.83 0.17
Tt H-NOX His6 1.2 0.02
Tt H-NOX 1.22 0.09
Tt F78Y-Y140F 1.48 0.33
L1F142Y 1.73  
Tt W9F 1.84 0.17
β1(1-385)I145Y 2.69 0.61
Tt W9Y 3.07 0.1
Tt R135Q His6 3.56 0.08
L2F142Y 3.68 0.71
Tt Y140H 5.03 0.69
Tt W9H 6.42 0.11
Dd H-NOX 7.13 0.45
Tt W9N 8.09 0.14
Tt I5L 9.5 0.64
Tt I75F-His6 10.48 0.12
Sw Mb 15  
Tt Y140F 15.7 9.8
Hs Hbβ 16  
Tt L144F-His6 16.06 0.21
Bj FixL 20  
Tt Y140L 20.1 2
HemAT-B 23  
Tt W9F-Y140H 23.4 3.7
Hs Hbα 28  
表9显示了O2结合的结合速率可以通过突变H-NOX蛋白中一个或多个残基而被明显改变。这些示例性H-NOX蛋白的结合速率在20℃下在60μM-1s-1到0.14μM-1s-1的范围内。如果希望，O2结合的结合速率可以通过组合表9中所列 单或双突变的任何一种，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白中而被进一步改变，如本文所述。
表9.按O2结合的结合速率值排列的野生型和突变H-NOX蛋白以及参考蛋白
表10显示了示例性H-NOX突变对O2和NO结合的影响。表10中所列的Fe-未连接形式的每个数字是用于单峰(其被列在β和α列之间)。当O2或NO结合时，该单峰分成两个峰，β和α(其被分别列于β和α列下方)。如果希望，O2或NO结合可以通过组合表10中所列单或双突变的任何一种，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白中而被进一步改变，如本文所述。
表10：一些组胺酰-连接的FeII血红素蛋白复合体的UV-可见光峰的位置a
表11包含一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-O2复合体的UV-可见光峰的位置。当血红蛋白或H-NOX蛋白厌氧时，其在～431nm处具有一个Soret(索雷)峰，并且其处于未连接的状态。如果H-NOX蛋白未结合O2，那么当O2 被加入时，该Soret峰不改变。如果H-NOX确实结合了O2，那么当O2被加入时，其Soret峰将移动到414nm和418nm之间，这与血红蛋白中发生的移动相同，表明O2结合到血红素。氧化的H-NOX(Fe(III))或以6配位态结合NO的H-NOX的Soret峰可能与储存或使用后H-NOX蛋白的状态相关。如果H-NOX蛋白未结合NO，那么当NO被加入时，该Soret峰不改变。如果H-NOX蛋白结合了NO并形成6配位的亚铁-亚硝酰基(ferrous-nitrosyl)复合体，那么当NO被加入时，其Soret峰将移动到420nm和424nm之间。如果H-NOX蛋白结合了NO并形成5配位的亚铁-亚硝酰基复合体，则Soret峰将移动到～399nm。如果希望，O2或NO结合可以通过组合表11中所列单或双突变的任何一种，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白中而被进一步改变，如本文所述。
表11.一些Fe(II)、Fe(III)、Fe(II)-NO和Fe(II)-O2复合体的UV-可见光峰的位置 
复合体 蛋白质 Soret β α
Fe(II) Tt wt 430 563  
  Tt W9Y 430 569  
  Tt N74A 433 558  
  Tt N74H 431 561  
  Tt N74A-Y140H 430 567  
  Tt W9H 431 563  
  Tt N74E 433 559  
  Tt W9N 431 569  
  Tt wt His6 430 565  
         
复合体 蛋白质 Soret βa α
Fe(III) Tt wt 413 550 585
  Tt W9Y 409 N.A.  
  Tt N74A 416 554 586
  Tt N74H 408 N.A.  
  Tt N74A-Y140H 407 N.A.  
  Tt W9H 407 N.A.  
  Tt N74E 408 N.A.  
  Tt W9N 408 N.A.  
  Tt wt His6 413 550 586
a“N.A.”表示由于在较长波长下的低信号，不可指定的α和β谱带。 
复合体 蛋白质 Soret β α
 
Fe(II)–NO Tt wt 420 550 578
  Tt W9Y 420 552 576
  Tt N74A 421 572  
  Tt N74H 424 562  
  Tt N74A-Y140H 421 549 576
  Tt W9H 420 548 575
  Tt N74E 422 544 571
  Tt W9N 421 541 576
  Tt wt His6 420 547 576
         
复合体 蛋白质 Soret β α
Fe(II)-O2 Tt wt 416 556 591
  Tt W9Y 416 555 590
  Tt N74A 418 553 589
  Tt N74H 418 553 589
  Tt N74A-Y140H 414 555 584
  Tt W9H 418 556 589
  Tt N74E 417 555 587
  Tt W9N 416 588 553
  Tt wt His6 416 556 591
表12包含示例性腾冲嗜热厌氧菌H-NOX蛋白的自氧化速率。如果希望，自氧化速率可以通过组合表12中所列任何突变，或通过引入一个或多个另外的突变到H-NOX蛋白中而被进一步改变，如本文所述。在表12中的2nm和3nm值是指UV-可见光Soret峰在观察的时间段内偏移2到3nm；这样极小的改变可能是由于自氧化。
表12.腾冲嗜热厌氧菌(Tt)H-NOX蛋白的自氧化速率
a“稳定”表示在至少24小时后，血红素氧化的缺乏
“RT”表示室温。
H-NOX核酸
本发明也以编码本文所述的任何突变H-NOX蛋白的核酸为特征。如本文所使用，“核酸”指的是单链或双链形式的两个或多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且除非另有限制，包含天然发生核苷酸的类似物，其以与天然发生的核苷酸相似的方式与核酸杂交。在一些实施方式中，所述核酸为重组核酸。“重组核酸”表示一种目标核酸，其不含一个或多个在所述目标核酸从中衍生的生物体的天然发生的基因组中位于所述目标核酸侧翼的核酸(如基因)。在一些实施方式中，H-NOX核酸被可操作地连接到另一核酸，所述另一核酸编码另一蛋白的全部或部分，以便该重组核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包括H-NOX蛋白(如，具有或不具有来自H-NOX蛋白另一结构域的H-NOX结构域)，以及诸如人血清白蛋白的另一蛋白的全部或部分。该术语因此包括，例如被掺入载体、掺入自主复制质粒或病毒、或掺入原核生物或真核生物基因组DNA的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子(如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA片段)存在的重组DNA。
本发明也以含有一个或多个编码本文所述的任何突变H-NOX蛋白的核酸的载体为特征。如本文所使用，“载体”表示能够输送，并任选地在宿主细胞中表达一个或多个目标核酸的构建体(construct)。载体的实例包括，但不限于，质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，载体包含在表达调控序列调控下的核酸。“表达调控序列”表示指导目标核酸转录的核酸序列。表达调控序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或者增强子。该表达控制序列被可操作地连接到待转录的核酸片段。
在具体实施方式中，所述核酸包括图2-4D或8A-8DD中所示的任何核酸的片段或完整核酸序列。在一些实施方式中，所述核酸包括至少约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多个连续的来自H-NOX核酸的核苷酸，并且与其所衍生的H-NOX核酸相比包含一个或多个突变(例如，1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在多种实施方式中，与其从中衍生的H-NOX核酸相比，突变H-NOX核酸包含少于约任何20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变。本发明也以编码突变H-NOX蛋白的任何核酸的简并变体(degenerate variant)为特征。
本发明也包括含有至少一种编码本文所述突变H-NOX蛋白的核酸的细胞或细胞群。示例性的细胞包括昆虫、植物、酵母、细菌和哺乳动物细胞。这些细胞可用于使用标准方法——如本文所述的那些方法——生产突变H-NOX蛋白。
H-NOX蛋白的制剂
本文所述的任何野生型或突变H-NOX蛋白可被用于药物组合物或非药物组合物的配制。如下文进一步讨论，这些制剂在多种治疗应用和工业应用中有用。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白(例如本文所述的任何H-NOX野生型或突变蛋白)和药学上可接受的载体。在多种实施方式中，H-NOX蛋白是分离的或纯化的蛋白质。“药学上可接受的载体”是表示任何这样的物质——当与活性成分结合时，基于普通技术人员的知识，其允许所述成分保持生物活性并且不引起不可接受的免疫反应(如严重的过敏或过敏性休克)。实例包括，但不限于，任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、和各种类型的润湿剂。用于气雾剂或肠胃外给药的示例性的稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含这类载体的组合物通过已知的传统方法(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000，它们在此被完整引入作为参考，尤其是涉及制剂的部分)进行配制。
尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体可被用于本发明的药物组合物，载体的类型将根据给药方式而改变。组合物可以被配制，用于任何合适的给药方式，包括，例如静脉内、动脉内、囊内(intravesicular)、吸入、腹膜内、肺内、肌肉内、皮下、气管内、经粘膜、眼内、鞘内或经皮给药。对于肠胃外给药，例如皮下注射，载体可包括，例如水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于经口给药，可利用上述载体的任何一种，或者固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖或碳酸镁。生物可降解微球(例如，聚乳酸、聚甘醇酸(polylactate polyglycolate))也可被用作载体。
在一些实施方式中，所述药物组合物或非药物组合物包括缓冲液(如中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水等)、糖(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精等)、抗氧化剂、螯合剂(如EDTA、谷胱甘肽等)、防腐剂、对于结合和/或运输氧有用的 另一种化合物、非活性成分(如稳定剂、填料等)或前述两种或多种的组合。在一些实施方式中，所述组合物被配制为冻干物。H-NOX蛋白也可能使用公知的技术包封入脂质体或纳米颗粒中。可以被用于H-NOX蛋白的其它示例性制剂由例如美国专利号6,974,795和6,432,918进行了描述，其在此被完整引入作为参考，尤其是关于蛋白质制剂的部分。
本文所述的组合物可作为持续释放制剂(例如，诸如胶囊或海绵的制剂，其在给药后产生化合物的缓慢释放)的一部分进行给药。这样的制剂通常可使用公知的技术加以制备，并通过例如经口、直肠、皮下植入进行给药，或通过在期望的目标部位植入进行给药。持续释放制剂可含有分散于载体基质中和/或包含于被速率控制膜包围的储库(reservoir)中的H-NOX蛋白。这类制剂中使用的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些实施方式中，所述制剂提供了相对恒定水平的H-NOX蛋白释放。包含在持续释放制剂中的H-NOX蛋白的量取决于植入部位、释放速率和期望的释放持续时间、以及待治疗或预防的病症的本质。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的野生型或突变H-NOX蛋白。术语“有效量”意思是本文所述一种或多种蛋白的这样的量——基于执业专门医师的知识，与其功效和毒性的参数结合，其在给定的治疗形式中应该有效。如本领域所知，有效量可以是一个或多个剂量。如临床中所理解，与另一种药物、化合物或药物组合物一起，药物组合物的有效剂量可能达到或可能不会达到。因此，有效量可以在给予一种或多种治疗试剂的背景下加以考虑，并且如果与一种或多种其它试剂结合，期望或有益的结果可以或已经达到，则单一药剂可以被认为以有效量给药。
血红蛋白作为血液替代物的示例性剂量为每千克患者体重约10mg到约5克或更高的胞外血红蛋白。因此，在一些实施方式中，给予人的有效量的H-NOX蛋白在数克到超过约350克之间。H-NOX蛋白的其它示例性剂量包括在适当的输注速率——例如约0.5ml/min(参见，例如Winslow,R.Chapter 12In Blood  Substitutes)下大约4.4、5、10或13G/DL(其中G/DL是H-NOX蛋白溶液在输注进入循环系统之前的浓度)的任何一个。可以理解，每种剂型的各个剂量中包含的活性成分的单位含量本身不需要构成有效量，因为必要的有效量可通过多次给药的组合效果达到。包含在药物组合物中H-NOX蛋白量的选择取决于使用的剂型、治疗的病症、以及根据本领域普通技术人员确定的要达到的具体目的。
示例性的组合物包括遗传工程改造的重组H-NOX蛋白，其可被分离或纯化，所述重组H-NOX蛋白质包含一个或多个突变，所述突变相对于对应野生型H-NOX蛋白整体上赋予改变的O2或NO配体结合，并作为生理上相容的哺乳动物血液气体载体起作用。例如，本文所述的突变H-NOX蛋白。
本发明也提供了包含一种或多种野生型或突变H-NOX蛋白或主要由 其组成的血液代用品。用于配制血液代用品的合适的缓冲剂和其它成分在本领域内是已知的。
为了减轻或防止被给予药物组合物的人类对象的免疫反应，人H-NOX蛋白(野生型人蛋白质或一个或多个突变已经被引入其中的人蛋白质)或其它非抗原性H-NOX蛋白(如，哺乳动物H-NOX蛋白)可以被使用。为了降低或消除从人以外来源衍生的H-NOX蛋白的免疫原性，H-NOX蛋白中的氨基酸可以被突变为人H-NOX中的对应氨基酸。例如，非人H-NOX蛋白四级结构表面上的一个或多个氨基酸可以被突变为人H-NOX蛋白中的相应氨基酸。
H-NOX蛋白的治疗应用
本文所述的任何野生型或突变H-NOX蛋白(如，分离或纯化的H-NOX蛋白)或药物组合物可被用于治疗应用。对于待治疗的具体适应征，基于期望的O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、NO稳定性、NO反应性、自氧化速率、血浆保留时间或前述两种或多种的任何组合，可以选择具体的H-NOX蛋白，用于这类应用。H-NOX蛋白可以被用于治疗心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或创伤。例如，O2-结合H-NOX蛋白可以被用在其中红细胞或血浆膨胀药目前被使用的大多数情况。具体而言，H-NOX蛋白可以被用作红细胞替代物，用于外伤(如，战场、灾难救援或事故)、出血、出血性休克、手术(如，腹腔动脉瘤手术、诸如髋关节置换术的整形外科手术、或产生高失血的任何其它手术)、血液稀释、血液延长使用(blood extension use)(如，补充自体供应(auto-donation))及其中血容量损失或O2携带能力降低的任何其它情况的治疗。创伤修复应用的实例包括辐射后创伤修复(如高压氧效果)、手术后创伤修复、糖尿病性溃疡修复和烧伤。
氧结合H-NOX也可以在自体血液输回个体之前，在自体血液预供应期间或之后被用于临时增加O2输送(例如，血液的替代，所述血液在其中个体血液被除去并被保存的手术过程中被除去，用于在手术结束时或恢复期内再输注)。在一些实施方式中，由于大H-NOX蛋白分子的存在，H-NOX蛋白也作为提供渗透压的简单体积扩张剂(simple volume expander)起作用。
因为细胞外H-NOX蛋白在血管中的分布不受红细胞大小限制，本发明的H-NOX蛋白可以被用于向红细胞不能穿透的区域输送O2。这些区域可以包括位于红细胞流闭塞下游的任何组织区域，例如一个或多个血栓、镰状细胞性闭塞、动脉闭塞、外周血管闭塞、血管成形术球囊、手术器械、遭受氧不足或缺氧的组织等的下游区域。此外，所有类型的组织缺血可以使用H-NOX蛋白治疗。这样的组织缺血包括，例如，围手术期缺血、中风、中风前兆(emerging stroke)、短暂性缺血发作、心肌顿抑和冬眠、急性或不稳定心绞痛、心绞痛前兆(emerging angina)和心肌梗死(如ST段抬高心肌梗死)。可以使用H-NOX蛋白治疗的其它 示例性的心血管指征包括心脏停搏和镰状细胞性贫血。示例性的靶指征包括功能性血红蛋白缺乏的病症，例如其中需要血液替代物或O2载体的病症，包括失血、缺氧等。
H-NOX蛋白也可以被用作治疗癌症的放射疗法或化学疗法的辅助物。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用作实体瘤(如，具有较差转移前预后的个体)的放疗佐剂，或作为表面肿瘤(如直肠癌、肺癌或皮肤癌，或在另一种可及表面或位置中的癌症)的PDT疗法佐剂。H-NOX蛋白通过在患有贫血的患者中提供额外的氧携带能力可以被用于治疗贫血。示例性的神经性指征包括缺血性中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤。该方法和组合物适用于急性(向组织或特定部位提供快速氧，如急性心肌梗死、急性局部或全身组织氧和、或输血)和慢性(如从心肌梗死急性恢复后)状况。
在多种实施方式中，本发明以向个体(例如，哺乳动物，如灵长类(如人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科或猫科)输送O2的方法为特征，该方法通过给予需要它的个体足以向该个体输送O2的量的野生型或突变H-NOX蛋白进行。在一些实施方式中，本发明提供了携带或向诸如哺乳动物的个体输送血液气体的方法，其包括向该个体(如，哺乳动物)的血液输送(如输血等)一种或多种H-NOX组合物的步骤。用于向血液或组织(如，哺乳动物血液或组织)输送O2载体的方法在本领域内是已知的。在多种实施方式中，所述H-NOX蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白或是具有血红素结合的全蛋白质。在向个体施用H-NOX蛋白之前，H-NOX蛋白可具有或可不具有结合的血红素。在一些实施方式中，O2在其被输送到个体之前结合到H-NOX蛋白。在其它实施方式中，在给予所述个体所述蛋白之前，氧未被结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将O2从该个体中的一个位置运输到该个体中的另一个位置。
本发明的方法可以被用于治疗任何个体。对于本文的应用，除非另外清楚指出，如本文所使用，“个体”意思是哺乳动物，包括但不限于，灵长类(如，人、猴、大猩猩、猿、狐猴等)、牛、马、猪、犬科和猫科。因此，本发明可用于人类药物和兽医环境，包括在农业牲畜和家养宠物中的用途。所述个体可已经被诊断患有、被怀疑患有或处于发展某种指征的风险，例如心血管疾病、神经疾病、缺氧(如，肿瘤缺氧)、失血或创伤。该个体可显示出一种或多种与该指征相关的症状。该个体可以是遗传上易于发展这类病症或以其它方式易于发展这类病症。
如本文所使用，“需要它的(in need thereof)”包括患有病症或疾病(例如，心血管疾病、神经疾病、诸如肿瘤缺氧的缺氧、失血或创伤)或对该病症或疾病“有风险”的个体。如本文所使用，“有风险的”个体是有发展诸如心血管疾病、神经疾病、缺氧(如，肿瘤缺氧)、失血或创伤的病症风险的个体。“有风险的”个体可能患有或可能未患有可检测的疾病或病症，并且在本文所述的治疗方法之前，可能显示出或可能未显示出可检测的疾病。“有风险的”表示个体具有一个或多个所 谓的风险因素，它们是与疾病或病症的发展相关的并且是本领域已知的可测量参数。具有一个或多个这些风险因素的个体比没有这些风险因素的个体发展所述疾病或病症的概率更高。这些风险因素包括，但不限于年龄、性别、种族、饮食、先前的疾病史、前体疾病(precursor disease)的存在、基因的(genetic)(即遗传的(hereditary))考虑因素和环境暴露。在军事区或战场中或附近存在的手术，或使个体易于失血(如，血友病)的病症是失血的示例性风险因素。
这些方法可以被用于治疗或延迟O2输送对其有益的任何病症。“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”表示用于获得有益或期望结果——包括临床结果——的方法。出于本发明的目的，有益或期望的结果包括，但不限于与病症(例如，但不限于心血管疾病、神经疾病、诸如肿瘤缺氧的缺氧、失血或创伤)相关的症状的缓解、与病症相关的症状程度的减弱、或与病症相关的症状恶化的预防。在一些实施方式中，比起与当前可用的疗法相关的副作用，使用一种或多种本文公开的蛋白质进行的治疗未伴随有副作用或伴随有更少的副作用。
如本文所使用，“延迟”疾病或病症的发展表示延迟、阻碍、减缓、阻止、稳定和/或推迟诸如心血管疾病、神经疾病、缺氧(如，肿瘤缺氧)、失血或创伤的疾病或病症的发展。延迟可以具有各种时间长度，取决于所述疾病的历史和/或正治疗的个体。如本领域普通技术人员所知，实际上，足够或明显的延迟可以包括预防，因为个体不发展所述疾病或病症。例如，当与不使用所述方法比较时，所述方法可降低在给定时帧中疾病发展的概率和/或减轻所述疾病在给定时帧中的程度。在一些实施方式中，这样的比较基于使用统计上显著个数的对象进行的临床研究。疾病发展可以是使用标准临床技术可检测的。发展也可指初始不可检测的疾病的发展，并包括发生、复发和发病。
具有相对低的对O2KD(例如小于约80nM或小于约50nM)的野生型和突变H-NOX蛋白被预期对治疗具有低氧张力的组织(例如肿瘤、一些创伤、或者其中氧张力非常低——如p50低于1mmHg——的其它区域)特别有用。这类H-NOX蛋白对O2的高亲和性可提高O2保持与H-NOX蛋白结合的时间长度，由此降低H-NOX蛋白到达待治疗组织之前释放的O2量。
尽管不意图受限于具体理论，无细胞的红细胞替代物作为复苏液(resuscitation fluid)的用途被认为受O2载体的p50影响。例如，被称为MP4的聚乙二醇化血红蛋白基O2载体似乎比一些较低亲和性的血红蛋白基O2载体更有效地向微血管输送O2。MP4被报告具有～50mmHG的p50(大约100到200nm KD)，并且无基质血红蛋白的p50为14mm Hg(～400nm KD)。由于MP4能够在组织中输送氧(PO2～5到10mmHg)，可能的是，适于向缺氧组织输送O2的对载体的O2亲和性小于约5mmHg，并且可能小于约2mmHg，其大致对应于小于约80nm的KD。这些值表明MP4已经被工程改造为具有比天然血红蛋白高的O2亲和性(低p50)。从平衡的观点来看，这表明高亲和性O2结合蛋白在输送O2到低O2张力的 区域如外周血管中可能更成功。
在一些直接输送带有结合O2的H-NOX蛋白到身体中特定部位(如组织、器官、创伤或肿瘤)的实施方式中，对O2koff比KD值重要，因为O2已经结合到所述蛋白质(使得kon较不重要)并且氧需要在身体中特定部位处或附近处被释放(以受koff影响的速率释放)。在一些实施方式中，当H-NOX蛋白在红细胞存在的情况下存在于循环中时，koff也是重要的，其中它们促进O2从红细胞的扩散，并且可能延长稀释的红细胞向血管中进一步的点运输O2的能力。
在输送在个体血流中循环的H-NOX蛋白的一些实施方式中，H-NOX蛋白在肺中结合O2并在身体的一个或多个其它位置释放O2。对于这些应用中的一些，KD值比koff更重要，因为O2结合处于平衡或接近平衡。在极端血液稀释的一些实施方式中，当H-NOX蛋白是主要的O2载体时，KD比koff更重要，因为随着其在循环系统中运动，H-NOX蛋白将不断地结合并释放O2。由于血红蛋白具有14mmHg的p50，红细胞(其像电容器一样起作用)具有～30mmHg的p50，并且HBOCs已经发展到在5mmHg到90mmHg的范围内，H-NOX蛋白的最优KD范围可因此对一些应用来说在～2mmHg到～100mmHg之间。
H-NOX蛋白也可以被用于成像(imaging)。具体而言，光成像(例如，光学相干断层扫描(optical coherence tomography)；参见，例如Villard,J.W.(2002)“Use of a Blood Substitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickening with Optical Coherence Tomography,”Circulation 105:1843-1849，其在此被完整引入作为参考，尤其是关于光学相干断层扫描)被红细胞变模糊。用H-NOX溶液灌注使得循环系统和血管壁的图像更清晰，因为H-NOX蛋白比红细胞小得多。
本发明的H-NOX蛋白和药物组合物可以通过任何常规手段给予个体，例如通过经口、局部、眼内、鞘内、肺内、气管内或气溶胶给药；通过经皮或粘膜吸收；或通过注射(如，皮下、静脉内、动脉内、囊泡内或肌内注射)。H-NOX蛋白也可以被包含在大体积肠胃外溶液中，用作血液代用品。在示例性的实施方式中，H-NOX蛋白被施用至个体的血液(例如，施用至血管，如静脉、动脉或毛细血管)、创伤、肿瘤、缺氧组织或缺氧器官。
在一些实施方式中，所述组合物的持续连续释放制剂被使用。H-NOX蛋白的给药可以进行例如数秒到数小时的时间期间，这取决于给药目的。例如，作为血液输送载体，示例性的给药时程是尽可能迅速。其它示例性的时程包括大约10、20、30、40、60、90或120分钟的任何一个。H-NOX溶液作为血液替代物的示例性输注速率为从约30mL/小时到约13,260mL/小时，例如约100mL/小时到约3,000mL/小时。H-NOX蛋白的示例性总剂量为约900mg/kg，在20分钟内以13,260mL/小时加以施用。对于猪，H-NOX蛋白的示例性总剂量约为18.9克。
示例性的给药频率包括，但不限于，每周至少1、2、3、4、5、6或7 次(即每天一次)。在一些实施方式中，H-NOX蛋白每天至少给药2、3、4或6次。H-NOX蛋白可以在例如数天或数周的时间段内给药。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被给药更长的时间段，例如数月或数年。基于给药医师的判断，所述组合物的给药频率可以在疗程内加以调整。
如上文所述，H-NOX蛋白剂量的选择取决于使用的剂型、给药的频率和次数、治疗的病症和根据本领域普通技术人员确定的所要达到的具体目的。在一些实施方式中，给予人的H-NOX蛋白的有效量在数克到超过约350克之间。
在一些实施方式中，两种或多种不同的H-NOX蛋白被同时、顺序或共同给药。在一些实施方式中，用于O2输送的另一种化合物或疗法与一种或多种H-NOX蛋白的给药同时、顺序、或共同给予。
H-NOX蛋白可以被使用的其它示例性治疗应用由例如美国专利号6,974,795和6,432,918描述，其在此被完整引入作为参考，特别是关于O2载体的治疗应用。
H-NOX蛋白的工业应用
本文所述的H-NOX蛋白和组合物也可以被用于多种体外或工业应用(参见，例如美国专利号6,455,676，其在此被完整引入作为参考，特别是关于体外或工业应用)。对于特定的应用，基于期望的O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、NO稳定性、NO反应性、自氧化速率、半衰期或前述两种或多种的任何组合，可以选择特定的H-NOX蛋白用于这类应用。在工业应用的多种实施方式中，H-NOX蛋白是能够结合血红素的脱辅基蛋白或带有血红素结合的全蛋白质。
H-NOX蛋白可以被用作，例如，分析仪器的参考标准，所述分析仪器需要这类参考标准。通过H-NOX蛋白进行的O2输送可以被用于通过维持或提高体外O2水平，在细胞培养中增强细胞生长。对于这些应用，H-NOX蛋白可以被加入细胞培养基中，以向所述培养基(和向培养基中的细胞)输送O2。在一些实施方式中，O2在其被加入到细胞培养基之前被结合到H-NOX蛋白。在其它实施方式中，O2在被加入到细胞培养基之前没有被结合到H-NOX蛋白，并且H-NOX蛋白将O2从培养基中的一个位置运输到培养基中的另一个位置。
可选地，细胞可以被遗传修饰来编码H-NOX蛋白，以提高由细胞获得的O2量。例如，表达目标化合物(例如，用在药物应用中的小分子或蛋白质)的细胞可以被遗传修饰，使其尤其是在低O2条件下也产生促进细胞生长的H-NOX蛋白(Sullivan et al.(2006).“Targeted Oxygen Delivery within Hepatic Hollow Fiber Bioreactors via Supplementation of Hemoglobin-Based Oxygen Carriers,”Biotechnol.Prog.22:1374-87；Frey et al.(2001).“Dissection of Central Carbon Metabolism of Hemoglobin-Expressing Escherichia Coli by 13C Nuclear Magnetic Resonance Flux Distribution Analysis in Microaerobic Bioprocesses,”Applied and Environmental  Biology 67(2):680-687)。而且，H-NOX蛋白可被用于从需要O2去除的溶液中除去O2。
含有H-NOX蛋白的试剂盒
也提供了包含本文所述任何H-NOX蛋白及适当包装的制品和试剂盒。在一些实施方式中，本发明包括试剂盒，其具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文所述的它们的制剂)和(ii)使用该试剂盒向个体输送O2的说明。在多种实施方式中，本发明以试剂盒为特征，所述试剂盒具有(i)H-NOX蛋白(例如，本文所述的野生型或突变H-NOX蛋白或本文所述的它们的制剂)和(ii)将该试剂盒用于本文所述的任何工业应用(例如，H-NOX蛋白作为分析仪器的参考标准的应用，所述分析仪器需要这样参考标准；通过保持或提高体外O2水平而增强细胞培养物中的细胞生长；向溶液中加入O2；或从溶液中除去O2)的说明。
用于本文所述组合物的适当包装在本领域内是已知的，并且包括，例如，小瓶(如，密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、软包装(如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。这些制品可进一步被灭菌和/或密封。也提供了包含本文所述组合物的单位剂型。这些单位剂型能够以单或多单位剂量被储存在适当的包装中，并也可被进一步灭菌和密封。本发明的试剂盒中提供的说明通常是在标签或包装内页(例如，该试剂盒中包含的纸张)上的书面说明，但是机器可读的说明书(例如，磁盘或光盘上携带的说明书)也是可接受的。涉及H-NOX蛋白应用的说明通常包括关于目的治疗或工业应用的剂量、给药方案和给药途径。试剂盒可进一步包括选择适于治疗的个体的描述。
容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，含有足够剂量本文所公开的H-NOX蛋白的试剂盒也可被提供，以向个体提供延长时间段的有效治疗，例如，约下列值的任何一个：一周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。试剂盒也可包括多单位剂量的H-NOX蛋白和使用说明，并以足以用于药房——例如医院药房和配药药房(compounding pharmacies)——存储和使用的量进行包装。在一些实施方式，试剂盒包括干燥(例如，冻干)组合物，其能够被重构、重悬浮或再水化，通常形成稳定的H-NOX蛋白水混悬液。
产生H-NOX蛋白的示例性方法
本发明也提供了产生本文所述任何突变H-NOX蛋白的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在适合突变H-NOX蛋白产生的条件下培养具有编码突变H-NOX蛋白的核酸的细胞。在多种实施方式中，突变H-NOX也被纯化(例如，从细胞或培养基中纯化H-NOX蛋白)。
如上文所述，数个野生型H-NOX蛋白和核酸的序列是已知的并且可以被用于产生本发明所述的突变H-NOX蛋白和核酸。用于重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化的技术由例如Boon,E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chemical Biology 1:53-59和Karow,D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis,”Biochemistry 43(31):10203-10211中描述，其在此被完整引入作为参考，特别是关于重组H-NOX蛋白的突变、表达和纯化。这些技术或其它标准技术可以被用于产生任何突变H-NOX蛋白。
具体而言，本文所述的突变H-NOX蛋白可以通过本领域已知的多种方法产生。突变可以通过氨基酸的化学修饰发生在氨基酸水平，或通过编码给定氨基酸的核苷酸序列的改变发生在密码子水平。在蛋白质的任何给定位置处的氨基酸取代可以通过改变编码该氨基酸的密码子而实现。这可以通过定点诱变，使用下列进行，例如：(i)Amersham技术(Amersham mutagenesis kit,Amersham,Inc.,Cleveland,Ohio)，其基于Taylor,J.W.et al.(1985年12月20日)“The Use of Phosphorothioate-Modified DNA in Restriction Enzyme Reactions to Prepare Nicked DNA,”Nucleic Acids Res.13(24):8749-8764；Taylor,J.W.et al.(1985年12月20日)“The Rapid Generation of Oligonucleotide-Directed Mutations at High Frequency Using Phosphorothioate-Modified DNA,”Nucleic Acids Res.13(24):8765-8785；Nakamaye,K.L.et al.(1986年12月22日)“Inhibition of Restriction Endonuclease Nci I Cleavage by Phosphorothioate Groups and its Application to Oligonucleotide-Directed Mutagenesis,”Nucleic Acids Res.14(24):9679-9698；和Dente et al.(1985).在DNA Cloning,Glover,Ed.,IRL Press,pages 791-802中的方法；(ii)Promega试剂盒(Promega Inc.,Madison,Wis.)；或(iii)Biorad试剂盒(Biorad Inc.,Richmond,Calif.)，其基于Kunkel,T.A.(1985年1月)“Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(2):488-492；Kunkel,T.A.(1987).“Rapid And Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection,”Methods Enzymol.154:367-382；Kunkel,美国专利4,873,192，它们的每一个都在此被引入作为参考，特别是关于蛋白质诱变。诱变也可以通过其它商业可得的或非商业手段进行，例如使用带有突变核苷酸的定点诱变的那些手段。
定点诱变也可以使用基于PCR的诱变进行，例如在Zhengbin et al.(1992).PCR Methods and Applications,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中205-207页；Jones,D.H.et al.(1990年2月).“A Rapid Method For Site-Specific Mutagenesis And Directional Subcloning by Using the Polymerase Chain Reaction to Generate Recombinant Circles,”Biotechniques 8(2):178-183；Jones,D.H.et al.(1991年1月).“A Rapid Method For Recombination And Site-Specific  Mutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction,”Biotechniques 10(1):62-66中描述的那些，它们中的每一个都在此被引入作为参考，特别是关于蛋白质诱变。定点诱变也可以使用盒式诱变，利用本领域普通技术人员已知的技术进行。
突变H-NOX核酸可以使用标准技术被掺入载体，例如表达载体。例如，限制性酶可以被用于切割突变H-NOX核酸和载体。接着，被切割的突变H-NOX核酸和被切割的载体的匹配末端可以被连接。产生的载体可以使用标准技术(例如，电穿孔)被插入细胞(例如，昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或细菌细胞)，用于编码的H-NOX蛋白的表达。
具体而言，异源蛋白质已经被表达在许多生物表达系统中，例如昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。因此，合适的生物蛋白表达系统可以被用于产生大量重组H-NOX蛋白。在一些实施方式中，所述H-NOX蛋白(如，突变或野生型H-NOX蛋白)是分离的蛋白质。如本文所使用，“分离的蛋白质”表示从一种或多种组分分离的蛋白，所述蛋白质与所述组分天然相关，所述组分包括，例如核酸、脂质和其它蛋白质。分离的蛋白质也不存在于蛋白质文库中，例如具有2、5、10、20、50或更多种不同蛋白质的文库。分离的蛋白质也可以通过，例如编码该蛋白质的核酸的表达或通过该蛋白质的化学合成而获得。
如果希望，H-NOX蛋白可以使用标准技术进行纯化。如本文所使用，“纯化的蛋白质”表示，已经从在产生蛋白质时存在的一种或多种组分中分离的蛋白质(例如，突变或野生型H-NOX蛋白)。在一些实施方式中，所述蛋白质至少不含按重量计约60％的当产生所述蛋白质时存在的其它组分。在多种实施方式中，所述蛋白质按重量计至少约75％、90％或99％纯。纯化的蛋白质可以通过，例如从天然来源、重组表达系统或化学合成的反应混合物进行纯化(如，提取)而获得。示例性的纯化方法包括免疫沉淀、柱层析例如免疫亲和层析、磁珠免疫亲和纯化、和使用板结合抗体淘选、以及普通技术人员已知的其它技术。纯度可以通过任何适当的方法进行测定，例如，通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。在一些实施方式中，纯化的蛋白质被掺入本发明所述的药物组合物或被用于本发明所述的方法。本发明所述的药物组合物可具有添加剂、载体或除纯化的蛋白质以外的其它组分。
实施例
实施例——其旨在纯粹是本发明的示例并因此不应该被认为以任何方式限制本发明——还描述并详述了上面讨论的本发明的方面和实施方式。这些实施例并不旨在表示以下实验是所进行的全部的或唯一的实验。除非另外说明，温度以摄氏度表示并且压力等于或接近大气压。
实施例1：野生型和突变H-NOX蛋白的产生
使用标准方法产生、表达和纯化野生型和突变H-NOX蛋白，基本上如Boon,E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chemical Biology 1:53-59和Karow,D.S.et al.(August 10,2004)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis,”Biochemistry 43(31):10203-10211中所描述，它们在此都被完整引入作为参考，特别是关于重组H-NOX蛋白的诱变、表达和纯化。使用来自Strategene(La Jolla,CA)的方案进行诱变。蛋白质在细胞培养中的表达及后续的蛋白质纯化根据Karow,D.S.et al.(2004年8月10日)“Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase-Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis,”Biochemistry 43(31):10203-10211所述进行。
实施例2：突变H-NOX蛋白作为氧输送载体的表征
动力学KD：koff与kon的比率
测定野生型和突变H-NOX蛋白的动力学KD值，基本上如Boon,E.M.et al.(2005).“Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase,”Nature Chemical Biology 1:53-59所述进行，其在此被完整引入作为参考，特别是涉及O2结合速率、O2解离速率、O2结合的解离常数、自氧化速率和NO解离速率。kon(O2结合速率)
使用闪光光解法在20℃下测量O2对血红素的结合。由于非常快的成对重组动力学(geminate recombination kinetics)，不可能闪蒸出(flash off)FeII-O2复合体；因此，FeII-CO复合体用560nm的激光(Hewlett-Packard,Palo Alto,CA)进行闪光光解，产生5-配位的FeII中间体，在不同波长下追踪分子O2与该FeII中间体的结合。通过用10mM连二亚硫酸盐进行厌氧还原，接着在PD-10柱(Millipore,Inc.,Billerica,MA)上进行脱盐而制备蛋白质样品。该样品随后在受控气氛的石英小池(quartz cuvette)中在50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中被稀释到20μM的血红素，石英小池的尺寸为100μL到1mL并且径长为1cm。CO气体在该小池的顶部空间流动10分钟，以形成FeII-CO复合物，该复合物的形成通过UV-可见光谱(Soret最大值为423nm)加以确认。该样品随后被用于测量闪光光解后但仍在1大气压的CO气体下的CO-再结合动力学，或在闪光光解之前，它被打开并在空气中搅拌30分钟，充分对缓冲液充氧，以观察O2-再结合事件。在多个波长对时间下，观察O2与血红素的结合。使用Igor Pro软件(Wavemetrics,Inc.,Oswego,OR；最新2005版)将这些迹线以单指数拟合。该速率独立于观测波长，但依赖于O2浓度。UV-可见光光谱从头到尾被使用，以确认所有的复合物和中间体(Cary 3K, Varian,Inc.Palo Alto,CA)。瞬时吸收数据使用Dmochowski,I.J.et al.(2000年8月31日)“Enantiomeric Discrimination of Ru-Substrates by Cytochrome P450cam,”J  Inorg Biochem.81(3):221-228所述的仪器进行采集，其在此被完整引入作为参考，特别是关于仪器操作。该仪器具有20ns的反应时间，并且数据以200兆样每秒(megasample s-1)的速率被数字化。
koff(O2解离速率)
为了测量koff，蛋白质(5μM血红素)的FeII-O2复合物，在无氧的50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中稀释，与等体积含有各种浓度连二亚硫酸盐和/或饱和CO气体的相同缓冲液(无氧)迅速混合。在装备有设置为20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度计上获取数据(TGK Scientific LTD.,Bradford On Avon,United Kingdom)。O2从血红素的解离被监控为在437nm——FeII-FeII-O2差示光谱中的最大值——或425nm——FeII-FeII-CO差示光谱中的最大值——处吸光度的增加。最终的迹线使用软件拟合成单指数，该软件是所述仪器的一部分。每个实验进行最少6次，并且得到的速率被平均。测量的解离速率独立于连二亚硫酸盐浓度(测试了100、50、25、10、5和2.5mM连二亚硫酸盐)且独立于作为被还原物质的阱(trap)的饱和CO，两者都在10mM连二亚硫酸盐存在和不存在的情况下。
动力学KD
通过使用上述koff与kon的测量结果计算koff与kon的比率，确定动力学KD。
计算的KD
为测量计算的KD，对如上所述获得的koff值和动力学KD值进行绘图。koff与动力学KD之间的线性关系通过方程(y＝mx+b)加以定义。然后，koff值沿图线插入，以使用Excel:MAC 2004(Microsoft,Redmond,WA)得到计算的KD。在没有测量的kon的情况下，该插值提供了使koff与KD相关的方法。
自氧化速率
为测量自氧化速率，蛋白质样品被无氧还原，随后在有氧的50mM TEA、50mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中被稀释到5μM血红素。然后，这些样品在装备有设置到37℃的Neslab RTE-100恒温浴的Cary 3E分光光度计中温育，并定期扫描(Cary 3E,Varian,Inc.,Palo Alto,CA)。通过在对时间绘制的并使用Excel:MAC 2004(Microsoft,Redmond,WA)以单指数拟合的FeIII-FeII差示光谱中的最大值与最小值之间的差确定自氧化速率。
与NO反应的速率
使用在缓冲液A中以2μM浓度制备的纯化蛋白(Tt WT HNOX、Tt Y140H HNOX和智人血红蛋白(Hs Hb))和在缓冲液A中以200μM制备的NO测量NO反应性(缓冲液A：50mM Hepes,pH 7.5、50mM NaCl)。在装备有设置为20℃的Neslab RTE-100恒温浴的HI-TECH Scientific SF-61停流分光光度计上获取数据(TGK Scientific LTD.,Bradford On Avon，英国)。所述蛋白质与NO以1:1的比例迅速混合，混合时间0.00125秒。使用软件将最大变化的波长拟合成单指数，该软件是光度计的一部分，主要测量NO氧化的限速步骤。该反应的终产物对于H-NOX蛋白是三价铁-NO，而对于Hs Hb为三价铁-水合物。
p50测量
如果希望，突变或野生型H-NOX蛋白的p50值可以如Guarnone,R.et al.(1995年9月/10月).“Performance Characteristics of Hemox-Analyzer For Assessment of The Hemoglobin Dissociation Curve,”Haematologica 80(5):426-430所述加以测量，其在此被完整引入作为参考，特别是关于p50值的测量。使用血氧分析仪(HemOx-Analyzer)测定p50值。测量室起始于0％氧并缓慢上升，递增至100％氧。该室中的氧探针测量氧饱和百分比。第二探针(UV-可见光)测量两个吸收波长，调谐至血红素蛋白(如，诸如与血红素复合的H-NOX的蛋白质)的UV-可见光光谱的α和β峰。这些吸收峰随着血红素蛋白结合氧而线性升高。然后，绘制从未结合至100％结合的百分数变化对氧百分数值的图，以产生曲线。p50是该曲线上的点，在该点50％血红素蛋白结合氧。
具体而言，血氧-分析仪(Hemox-Analyzer)(TCS Scientific Corporation,New Hope,PA)通过将50μL血液或血红素蛋白暴露于提高的氧气分压并用氮气使其去氧，来确定氧血红素蛋白(oxyhemoprotein)解离曲线(oxyhemoprotein dissociation curve,ODC)。Clark氧电极检测氧张力的变化，该变化被记录在x-y坐标记录仪的x轴上。所产生的氧血红素蛋白分数的增长通过双波长分光光度法在560nm和576nm同时监测，并显示在y轴上。从前中静脉(antemedial vein)取血样，用肝素抗凝，并在湿冰上保持在4℃，直到测定。在5μL的Hemox溶液中稀释50μL全血，该溶液是制造商提供的缓冲液，其保持溶液的pH值在7.4±0.01。该样品-缓冲液被吸入作为血氧-分析仪的一部分的小池，并且混合物的温度被平衡并带到37℃；该样品随后用空气充氧到100％。调整pO2值之后，该样品用氮气去氧；在去氧的过程中，曲线被记录在图纸上。p50值使用作为血氧-分析仪一部分的软件在x轴上外推为这样的点，在该点上O2饱和度为50％。完成记录所需的时间约为30分钟。
任何H-NOX蛋白的p50值可以与血红蛋白的p50值比较，作为H-NOX蛋白相比于血红蛋白对O2的相对亲和性的指示。表13列出了先前报告的血红蛋 白的p50值。
表13.血红蛋白突变体及其报告的氧亲和性
粘度测量
如果希望，H-NOX溶液的粘度可以使用带有的CPE-40圆锥轴(cone spindle)的锥板式流变计(型号DV-III,Brookfield；Middleboro,MA)以200/s的剪切速率进行测量。在血液稀释氧输送实验中给予的粘度在1到4厘泊(cP)之间的溶液被报告为安全(Winslow,R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat,”J Appl  Physiol.97(4):1527-1534，美国专利号6,974,795和6,432,918，它们中的每一个都在此被完整引入作为参考，特别是关于粘度测量)。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的粘度在1和4cP之间。
胶体渗透压测量
如果希望，胶体渗透压可以使用胶体渗透压计(型号4420,Wescor；Logan,UT)，根据制造商的说明进行测量。测量胶体渗透压的示例性方法在Vandegriff,K.D.et al.(1997年11月).“Colloid Osmotic Properties of Modified Hemoglobins:Chemically Cross-Linked Versus Polyethylene Glycol Surface-Conjugated,”Biophys.Chem.69(1):23-30，万维网地址为“anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php”；美国专利号6,974,795和6,432,918中进行描述，它们中的每个都在此被完整引入作为参考，特别是关于测量胶体渗透压。在血液稀释氧输送实验中给予的、胶体渗透压在20到50mmHg之间的溶液被报告 为安全(Winslow,R.M.et al.(2004年10月).“Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat,”J.Appl.Physiol.97(4):1527-1534)。因此，在一些实施方式中，H-NOX蛋白溶液的胶体渗透压在20和50mm Hg之间。
实施例3：O2载体H-NOX突变体的手术模型：一组O2载体H-NOX突变体和在大鼠中极端血液稀释情况下的H-NOX的比较
为评估H-NOX突变体在手术模型中运输O2的能力，对已建立的方法(Winslow,R.M.et al.(October 2004).“Comparison of PEG-Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat,”J.Appl.Physiol.97(4):1527-1534，其在此被完整引入作为参考，特别是关于手术模型)的改编可以使用连续交换输血(continuous exchange transfusion)在大鼠中进行。
驯化的雄性Sprague-Dawley大鼠通过肌肉内注射含有氯胺酮(ketamine)(40mg/kg)、乙酰丙嗪(acepromazine)(0.75mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(3mg/kg)的混合物的啮齿类动物混合物(rodent cocktail)进行麻醉。由聚乙烯管制成的导管被植入两根股骨动脉和一根股骨静脉。该导管在尾基部被表面化并被尾鞘覆盖，用于保护和将来进入。手术创口闭合后，动物回到它们的笼中，并在实验开始前使它们醒来并恢复24h。在恢复期，动物可以自由获取食物和水。对于血液动力学的测量，股动脉导管通过活塞和23号针连接到压力传感器，并且以100Hz连续采样动脉压。
在Bayer型号248血气分析仪(blood-gas analyzer)中，使用100-μl肝素化的血液样品测量动脉pH、PCO2和PO2。使用YSI乳酸盐分析仪(Yellow Springs Institute,Yellow Springs,OH)，在股动脉血中测量乳酸。总CO2、标准碳酸氢盐(HCO)和过剩碱(BE)从PCO2、pH和Hb浓度进行计算。
完全清醒的动物(对于每个治疗组n＝5)被置于Plexiglas限制器中。动脉和静脉导管分别用200和100μl的肝素化盐水(100U/ml)冲洗。动脉和静脉导管被连接到输注泵(Labconco型号4262000,Kansas City,MO)，并且交换输血以0.5ml/min的速率进行100分钟。因此，被交换溶液的总体积为50ml或2.5个血容量。操作蠕动泵，以便血液以与输注测试物完全相同的速率被除去。测试溶液在输入前在水浴中被加热到37℃并在输注过程中通过加热垫保温。在100分钟交换期的结束时，存活的动物在安乐死之前被观察额外的70分钟。每10分钟采集血样(0.3ml)，用于血液学和血-气分析。
治疗组包括被给予一种或多种H-NOX蛋白的动物，所述H-NOX蛋白先前已经被测试了NO或O2解离常数、NO-反应性、稳定性、生理相容性或前述两种或多种的组合。红细胞H-NOX和喷他淀粉(pentastarch)治疗组分别提供了阳性和阴性对照。
客观终末点(Objective end point)包括存活和厌氧代谢的起始，以酸碱紊乱和乳酸积累为信号。与对照组相比存活率提高(例如，产生统计学上显著增加的存活率)的H-NOX蛋白可用于在极端血液稀释的条件下氧和组织。这类H-NOX蛋白被预期也可用于治疗其它输送O2对其有益的指征。
实施例4：O2载体H-NOX突变体的外伤模型：比较O2载体H-NOX突变体和重组血红蛋白溶液对出血性休克大鼠模型中血压、肠血流和肠充氧(Gut Oxygenation)的效果
为评估H-NOX突变体在外伤模型中运输O2的能力，对已建立的方法(Winslow,R.M.et al.(January 2005).“Effects of Recombinant-Hemoglobin Solutions rHb2.0and rHb1.1on Blood Pressure,Intestinal Blood Flow,And Gut Oxygenation in a Rat Model of Hemorrhagic Shock,”J Lab Clin Med.145(1):21-32，其在此被完整引入作为参考，特别是关于外伤的动物模型)可以在固定压力(40mmHg)、出血性休克并复苏的大鼠模型中进行。
利用腹膜内注射90mg/kg氯胺酮、0.5mg/kg美托咪定(medetomidine)和0.005mg/kg硫酸阿托品的混合物，麻醉Wistar大鼠。使用由置于大鼠直肠内的温度探针热控制的加热垫，保持每只大鼠的体温在36.5℃和37.5℃之间。此外，使用置于大鼠上方40到50cm处的陶瓷加热灯补偿热量损失。对于机械换气，进行了气管切开术并且将3.5-cm长的6F聚氯乙烯管置入气管内0.5cm并用缝合线固定。改造的婴儿呼吸机被用于给动物通气。为使通气液(ventilatory fluid)损失最小，湿气过滤器被置于通气管之前。该过滤器的侧口被用于利用二氧化碳分析仪(capnograph)监控呼气末(end-tidal)的CO2。调节诸如吸气相(0.25–0.35)和呼吸率(50–75次呼吸/分钟)的通气参数，以在手术期间保持动脉PCO2值在35和45mmHg之间，如通过采集基线血液样品所检测到的。直到实验结束，没有进行进一步的调节。
使用0.5x 0.9-mm聚乙烯静脉导管对血管进行插管。所述导管充满含有25IU肝素的0.9％NaCl溶液。右侧颈动脉导管被截短到20cm并安装到压力传感器，用于平均动脉压(MAP)和心率的连续监控。使用下式计算MAP：(收缩压–舒张压)/3+舒张压。此外，颈静脉被插入导管，以利用15mL/kg/h Ringer’s乳酸盐和5mL/kg/h维持麻醉液(maintenance anesthesia)(在Ringer’s乳酸盐中的50mg/kg/h氯胺酮)进行流体支持(fluid support)。股动脉被插入导管，以进行抽血和动脉血-气取样。股静脉被插入导管，用于复苏液的输入和静脉血-气采样。
对每只大鼠进行正中线剖腹术(midline laparotomy)：腹部用莎伦包装膜(Saran wrap)覆盖，防止体液的挥发。在保鲜膜上刺出小孔，以允许光纤进入，用于微循环PO2测量。回盲肠静脉(ileocecal vein)也用0.8-mm聚乙烯导管进行插管，用于肠系膜静脉血采样。
使用先前描述的氧依赖性钯-卟啉荧光猝灭技术测量肠道微血管PO2。2.5到3小时的手术后，与HSA溶液(50mg，在10mL 4％的白蛋白溶液、4mmol/L钯-卟啉溶液中，用HCl调整pH到7.4)偶联(coupled)的钯(II)中位-四(4-羧基-苯基)卟啉以12mg/kg体重的剂量、9.6mL/kg/hr的速率输注15分钟。
用光脉冲激发钯-卟啉引起具有及时衰变(decay in time)的磷光发射，所述磷光发射与氧浓度在数量上相关(Vanderkooi,J.M.et al.(April 25,1987)“An Optical Method for Measurement of Dioxygen Concentration Based Upon Quenching of Phosphorescence,”J.Biol.Chem.262(12):5476-5482)。使用置于回肠近侧部上方的光纤进行微血管PO2测量。闪光灯在输入钯-卟啉之前被记录，并且反卷积算法(deconvolution algorithm)被用于计算氧浓度。在输注钯-卟啉溶液和45分钟稳定之后，从股动脉、股静脉和肠系膜静脉中取出基线血液样品(0.2mL/样品)，用于血-气测定。在血-气分析仪和血氧分析仪中分析血液样品。
通过在含肝素(25IU/mL血液)的3-mL注射器中以约1mL/min的速率从股动脉中抽取血液若干分钟，直到MAP为大约40mmHg，诱导出血性休克。使用进一步的血液抽取或血液输入，保持MAP在这一水平45分钟。正好在复苏之前，从股动脉、股静脉和肠系膜静脉抽取血液样品(0.2mL/样品)，用于血-气测定，并且相似量的大鼠血液(出血性休克期间采集的)被再输注。该休克期之后，动物被随机分配到8个不同的复苏组之一。使用野生型或突变H-NOX蛋白或使用另一种O2载体，例如重组血红蛋白溶液rHb1.1(Baxter)、rHb2.0(Baxter)、无血清血红蛋白(标准溶液)、MP4(Sangart)、hemopure(一种携氧药)(Biopure)或多聚体血红蛋白(polyheme)_(Northfield Labs)(Raat,N.J.et al.(January 2005).J Lab Clin  Med.145(1):21-32；储液浓度100mg/mL)进行复苏，所有都以20mL/kg(2g/kg)的剂量、60mL/kg/h的速率进行输注。以相同剂量(20mL/kg)和速率输注的HSA(13.4％白蛋白溶液)被用作复苏期间对压力和流动的体积效应的对照。当复苏完成时，在30、60、90和120分钟后从股动脉、股静脉和肠系膜静脉中抽取0.2-mL血液样品，并且每次输回相似量的大鼠血液。
与由另一种O2载体(例如rHb1.1、rHb2.0、无血清血红蛋白、MP4、hemospan或多聚体血红蛋白)引起的或由渗透上(oncotically)匹配的HAS引起的相比，复苏后引起相同或较小的(例如实质性或明显较小的)全身血管收缩、相同或较小的MAP升高、或相同或较小的肠系膜血管阻力(MVR)升高的H-NOX被用于治疗出血性休克。这些H-NOX蛋白被预期也可用于治疗其它输送O2对其有益的指征。
前述实施例和详细描述通过阐述的方式而非通过限制的方式给出。本说明书中引用的所有出版物、专利申请和专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或专利被具体地并各自地被指出通过引用而并入。尽管出于清楚理解的目的，前述发明已经通过举例说明和实施例的方式以一些细节进行了 描述，但考虑根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言非常明显的是，可以对本发明进行某些变化和修改而不背离所附权利要求书的精神或范围。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域普通技术人员通常理解的那些。本领域普通技术人员也将理解，与本文所描述的那些相似或等价的任何方法及材料也可以用于实施或测试本发明。
对于本文中的使用，除非另外明确指出，术语“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”及类似表达的使用指的是一个(种)或多个(种)。
提到“大约”，本文的值或参数包括(并描述了)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提到“大约X”的描述包括“X”的描述。
应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包含(comprising)”、“由……组成(consisting)”和“主要由……组成(consisting essentially of)”的方面和实施方式。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其包含(i)药学上可接受量的H-NOX蛋白，其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍，和(ii)药学上可接受的载体。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约100nM到约255nM之间。
3.权利要求1和2任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃小于约80nM。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的O2解离常数在20℃在约20nM到约75nM之间。
5.权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍。
6.权利要求5中所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少1,000倍。
7.权利要求1-6任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的对氧koff在20℃小于或等于约0.65s-1。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约0.21s-1到约0.65s-1之间。
9.权利要求1-6任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白的对氧koff在20℃在约1.35s-1到约2.9s-1之间。
10.权利要求1-9任一项所述的药物组合物，其中所述H-NOX蛋白在4℃下在空气中是稳定的。
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