JP2015007108A - 一酸化窒素の送達のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、「Engineering H−NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery」(UC Case No.B06−084)という表題の、Michael A.Marletta,Stephen P.L.Cary,Elizabeth M.Boonによる、2006年5月22日に出願された米国仮特許出願第__号の利益を請求する。この仮特許は、2006年5月22日に出願された米国特許出願第11/440,588号から、2007年5月1日における仮特許出願に変更され、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本研究は、助成金番号DE−AC03−76SFに支援された。米国政府は、本出願にかかる任意の特許に権利を有し得る。
本出願は、H−NOXタンパク質、および一酸化窒素(NO)を送達するためにそれらを使用する方法に関する。H−NOXタンパク質は、ヒトにNOを送達するため、および動物についての獣医学的目的のための新規の治療用ツールを提供する。
NOは、インビボでは、多くの重要なプロセスの制御において化学的メッセンジャーとしての役割を担っており、これには、血管拡張、神経伝達、炎症、血小板の凝集、ならびに消化管と血管の平滑筋の緊張の調節を含む。1867年のDrs.Lauder BruntonおよびWilliams Murrellによる、ニトログリセリン(GTN)が狭心症のような心疾患の症状を治療できることの発見から、有機硝酸塩は、血管収縮の急性の症例を治療するために広く使用されている。最近の数十年の間に、血管拡張の機構が明らかになってきた。内皮細胞の中で合成されるNOは平滑筋細胞に拡散し、可溶性のグアニル酸シクラーゼ(sGC)を活性化させてサイクリックGMPを生じさせ、それにより拡張を誘導する。その結果、有機硝酸塩の臨床的な作用機構には、NOへのそれらの生体内変換と、それに続くsGCの活性化が必要されると推定される。しかし、有機硝酸塩は、耐性と呼ばれる表現形が原因で、24〜48時間後に、患者において効果がなくなる。したがって、高血圧の慢性的な症例の治療については、β−ブロッカー、およびACE阻害剤のような化合物が使用される。しかし、これらには多くの制限と副作用がある。したがって、ニトロ系血管拡張剤が、狭心症および心筋梗塞のような、症状を緩和するために迅速な血管拡張が必要な急性の症状の治療には最も有用である。有機硝酸塩の長期にわたる投与によっては、効力の低下が生じ、血管系は無反応になる。この耐性は、慢性および急性のいずれの症例においても、それらをさらに使用することを妨げる。したがって、急性治療については、非継続的なニトロ系血管拡張剤の使用が使用され、これによっては、限られた効果がもたらされる。血管収縮の慢性的な症例については、他の治療方法が使用され、通常は、有機硝酸塩とNO依存性血圧薬物治療の混合レジュメが使用され、これにより成果の混合がもたらされる。
本発明は、野生型および変異H−NOXタンパク質がヘモグロビンよりもはるかに低いNO反応性を有しており、したがって、NO担体として所望されることの驚くべき発見に一部基づく。所望される場合には、NO担体としてのH−NOXタンパク質の使用をさらに最適化させるために、NOおよびO2リガンドへのそれらの結合を変化させるための変異がH−NOXタンパク質に導入され得る。いくつかの実施形態においては、NO担体としてのH−NOXタンパク質の使用によっては、有機硝酸塩のような現在の血管拡張剤の使用によって生じる耐性よりも少ない耐性が生じる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
(i)薬学的に許容される量のH−NOXタンパク質であって、前記H−NOXタンパク質のNO解離定数がヘモグロビンのNO解離定数の大きさの2桁以内であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性の少なくとも10分の1未満である薬学的に許容される量のH−NOXタンパク質と、(ii)薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
(項目2)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.1倍〜10倍の間である、項目1に記載の薬学的組成物。
(項目3)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.5倍〜2倍の間である、項目2に記載の薬学的組成物。
(項目4)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも100分の1未満である、項目1〜3のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目5)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも1,000分の1未満である、項目4に記載の薬学的組成物。
(項目6)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目1〜5のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目7)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間である、項目1〜6のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目8)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目7に記載の薬学的組成物。
(項目9)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目8に記載の薬学的組成物。
(項目10)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目1〜9のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目11)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目10に記載の薬学的組成物。
(項目12)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目11に記載の薬学的組成物。
(項目13)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目1〜12のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目14)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目1〜13のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目15)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目1〜14のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目16)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目1〜15のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目17)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目1〜16のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目18)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目1〜17のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目19)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目1〜18のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目20)
ヘムがH−NOXタンパク質に結合している、項目1〜19のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目21)
前記H−NOXタンパク質が変異タンパク質である、項目1〜20のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目22)
前記H−NOXタンパク質が、少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目21に記載の薬学的組成物。
(項目23)
前記H−NOXタンパク質が、前記遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目20および21のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目24)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、NOに対するk1、NOに対するk2、O2解離定数、NO安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも1つの変異を含む、項目1〜23のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目25)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、項目1〜24のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目26)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目1〜25のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目27)
前記H−NOXタンパク質が、L.pneumophila 8 H−NOXのPhe148に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目1〜26のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目28)
前記変異H−NOXタンパク質中の少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目1〜27のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目29)
前記変異H−NOXタンパク質中の少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目28に記載の薬学的組成物。
(項目30)
前記変異H−NOXタンパク質中の約25個〜約200個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目28および29のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目31)
前記H−NOXタンパク質が以下:
からなる群より選択される、項目1〜30のいずれか1項に記載の記載の薬学的組成物。
(項目32)
前記H−NOXタンパク質が以下からなる群より選択される、項目31に記載の薬学的組成物:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus
β1(1−385)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。
(項目33)
前記H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、項目1〜32のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目34)
前記H−NOXタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、項目33に記載の薬学的組成物。
(項目35)
前記ヒトタンパク質がβ1であるか、またはβ1由来である、項目34に記載の薬学的組成物。
(項目36)
前記H−NOXタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、項目1〜32のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目37)
前記H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質であるか、またはT.tengcongensisタンパク質由来である、項目36に記載の薬学的組成物。
(項目38)
NOがH−NOXタンパク質に結合している、項目1〜37のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目39)
前記H−NOXタンパク質を含む1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、項目1〜38のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目40)
前記H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目1〜38のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目41)
前記H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目40に記載の薬学的組成物。
(項目42)
前記H−NOXタンパク質が、項目245〜314のいずれか1項に記載の変異H−NOXタンパク質である、項目1〜41のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目43)
(i)薬学的に許容される量のH−NOXタンパク質であって、前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、薬学的に許容される量のH−NOXタンパク質と、(ii)薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
(項目44)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目43に記載の薬学的組成物。(項目45)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目44に記載の薬学的組成物。
(項目46)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目43〜45のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目47)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目46に記載の薬学的組成物。
(項目48)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目43〜47のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目49)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目43〜48のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目50)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目43〜49のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目51)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目43〜50のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目52)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目43〜51のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目53)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目43〜52のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目54)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目43〜53のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目55)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目43〜54のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目56)
ヘムがH−NOXタンパク質に結合している、項目43〜55のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目57)
前記H−NOXタンパク質が変異タンパク質である、項目43〜56のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目58)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目57に記載の薬学的組成物。
(項目59)
前記H−NOXタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目57および58のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目60)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、NOに対するk1、NOに対するk2、O2解離定数、NO安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも1つの変異を含む、項目43〜59のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目61)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、項目43〜60のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目62)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えらる少なくとも1つの変異を含む、項目43〜61のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目63)
前記H−NOXタンパク質が、L.pneumophila 8 H−NOXのPhe148に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目43〜62のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目64)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目43〜63のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目65)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目64に記載の薬学的組成物。
(項目66)
変異H−NOXタンパク質中の約25個〜約200個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目64および65のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目67)
前記H−NOXタンパク質が以下:
からなる群より選択される、項目43〜66のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目68)
前記H−NOXタンパク質が以下からなる群より選択される、項目67に記載の薬学的組成物:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus
β1(1−385)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。
(項目69)
前記H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、項目43〜68のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目70)
前記H−NOXタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、項目69に記載の薬学的組成物。
(項目71)
前記ヒトタンパク質がβ1であるか、またはβ1由来である、項目70に記載の薬学的組成物。
(項目72)
前記H−NOXタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、項目43〜68のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目73)
前記H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質であるか、またはT.tengcongensisタンパク質由来である、項目72に記載の薬学的組成物。
(項目74)
NOがH−NOXタンパク質に結合している、項目43〜73のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目75)
前記H−NOXタンパク質を含む1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、項目43〜74のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目76)
前記H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目43〜75のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目77)
前記H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目76に記載の薬学的組成物。
(項目78)
前記H−NOXタンパク質が、項目245〜314のいずれか1項に記載の変異H−NOXタンパク質である、項目43〜77のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
(項目79)
個体へNOを送達する方法であって、前記方法は、前記送達を必要とする個体へ有効量のNOを送達するために十分な量のH−NOXタンパク質を前記個体へ投与する工程を含み、前記H−NOXタンパク質のNO解離定数はヘモグロビンのNO解離定数の大きさの2桁以内であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性の少なくとも10分の1未満である、方法。
(項目80)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.1倍〜10倍の間である、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.5倍〜2倍の間である、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも100分の1未満である、項目79〜81のいずれか1項に記載の方法。
(項目83)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも1,000分の1未満である、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目79〜83のいずれか1項に記載の方法。
(項目85)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間である、項目79〜84のいずれか1項に記載の方法。
(項目86)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目79〜87のいずれか1項に記載の方法。
(項目89)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目88に記載の方法。
(項目90)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目79〜90のいずれか1項に記載の方法。
(項目92)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目79〜91のいずれか1項に記載の方法。
(項目93)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目79〜92のいずれか1項に記載の方法。
(項目94)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目79〜93のいずれか1項に記載の方法。
(項目95)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目79〜94のいずれか1項に記載の方法。
(項目96)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目79〜95のいずれか1項に記載の方法。
(項目97)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目79〜96のいずれか1項に記載の方法。
(項目98)
ヘムがH−NOXタンパク質に結合している、項目79〜97のいずれか1項に記載の方法。
(項目99)
前記H−NOXタンパク質が変異タンパク質である、項目79〜98のいずれか1項に記載の方法。
(項目100)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記H−NOXタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目99および100のいずれか1項に記載の方法。
(項目102)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、NOに対するk1、NOに対するk2、O2解離定数、NO安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも1つの変異を含む、項目79〜101のいずれか1項に記載の方法。
(項目103)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型H−NOXタンパク質と比較して、NO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、項目79〜102のいずれか1項に記載の方法。
(項目104)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異が含む、項目79〜103のいずれか1項に記載の方法。
(項目105)
前記H−NOXタンパク質が、L.pneumophila 10 H−NOXのPhe1410に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目79〜104のいずれか1項に記載の方法。
(項目106)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目79〜105のいずれか1項に記載の方法。
(項目107)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目106に記載の方法。
(項目108)
変異H−NOXタンパク質中の約25個〜約200個のC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目106および107のいずれか1項に記載の方法。
(項目109)
前記H−NOXタンパク質が以下
からなる群より選択される、項目79〜108のいずれか1項に記載の方法。
(項目110)
前記H−NOXタンパク質が以下からなる群より選択される、項目109に記載の方法:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus β1(1−3105)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−1104)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。
(項目111)
前記H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、項目79〜110のいずれか1項に記載の方法。
(項目112)
前記H−NOXタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記ヒトタンパク質がβ1であるか、またはβ1由来である、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記H−NOXタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、項目79〜110のいずれか1項に記載の方法。
(項目115)
前記H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質であるか、またはT.tengcongensisタンパク質由来である、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記H−NOXタンパク質を含む1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、項目79〜115のいずれか1項に記載の方法。
(項目117)
前記H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目79〜116のいずれか1項に記載の方法。
(項目118)
前記H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目117に記載の方法。
(項目119)
NOが、前記個体へのH−NOXタンパク質の投与の前に、前記H−NOXタンパク質に結合する、項目79〜118のいずれか1項に記載の方法。
(項目120)
NOが、前記個体へのH−NOXタンパク質の投与の前に、前記H−NOXタンパク質に結合せず、前記H−NOXタンパク質は、個体中の1つの位置から個体中の別の位置にNOを輸送する、項目79〜118のいずれか1項に記載の方法。
(項目121)
前記H−NOXタンパク質が、経口投与、直腸投与、または個体の血液に投与される、項目79〜120のいずれか1項に記載の方法。
(項目122)
前記個体がヒトである、項目79〜121のいずれか1項に記載の方法。
(項目123)
前記個体が、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状、またはNO機能不全に罹患しているか、あるいはそれらの危険性がある、項目79〜122のいずれか1項に記載の方法。
(項目124)
前記高血圧によって悪化した症状が、心不全、腎不全、または脳卒中である、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも2回個体に投与される、項目79〜124のいずれか1項に記載の方法。
(項目126)
前記H−NOXタンパク質が、項目245〜314のいずれか1項に記載の変異H−NOXタンパク質である、項目79〜125のいずれか1項に記載の方法。
(項目127)
個体へNOを送達する方法であって、前記方法は、前記送達を必要とする個体へ有効量のNOを送達するために十分な量のH−NOXタンパク質を前記個体へ投与する工程を含み、前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、方法。
(項目128)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目127に記載の方法。
(項目129)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目128に記載の方法。
(項目130)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目127〜129のいずれか1項に記載の方法。
(項目131)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目130に記載の方法。
(項目132)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目127〜131のいずれか1項に記載の方法。
(項目133)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目127〜132のいずれか1項に記載の方法。
(項目134)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目127〜133のいずれか1項に記載の方法。
(項目135)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目127〜134のいずれか1項に記載の方法。
(項目136)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目127〜135のいずれか1項に記載の方法。
(項目137)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目127〜136のいずれか1項に記載の方法。
(項目138)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目127〜137のいずれか1項に記載の方法。
(項目139)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目127〜138のいずれか1項に記載の方法。
(項目140)
ヘムがH−NOXタンパク質に結合している、項目127〜139のいずれか1項に記載の方法。
(項目141)
前記H−NOXタンパク質が変異タンパク質である、項目127〜140のいずれか1項に記載の方法。
(項目142)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目141に記載の方法。
(項目143)
前記H−NOXタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目141および142のいずれか1項に記載の方法。
(項目144)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、NOに対するk1、NOに対するk2、O2解離定数、NO安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも1つの変異を含む、項目127〜143のいずれか1項に記載の方法。
(項目145)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較してNO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、項目127〜144のいずれか1項に記載の方法。
(項目146)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目127〜145のいずれか1項に記載の方法。
(項目147)
前記H−NOXタンパク質が、L.pneumophila 10 H−NOXのPhe1410に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目127〜146のいずれか1項に記載の方法。
(項目148)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目127〜147のいずれか1項に記載の方法。
(項目149)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目148に記載の方法。
(項目150)
変異H−NOXタンパク質中の約25個〜約200個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目148および149のいずれか1項に記載の方法。
(項目151)
前記H−NOXタンパク質が以下:
からなる群より選択される、項目127〜150のいずれか1項に記載の方法。
(項目152)
前記H−NOXタンパク質が以下からなる群より選択される、項目151に記載の方法:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus β1(1−3105)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−1104)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。
(項目153)
前記H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、項目127〜152のいずれか1項に記載の方法。
(項目154)
前記H−NOXタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、項目153に記載の方法。
(項目155)
前記ヒトタンパク質がβ1であるか、またはβ1由来である、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記H−NOXタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、項目127〜152のいずれか1項に記載の方法。
(項目157)
前記H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質であるか、またはT.tengcongensisタンパク質由来である、項目156に記載の方法。
(項目158)
1つ以上のリポソームまたはナノ粒子が前記H−NOXタンパク質を含む、項目127〜157のいずれか1項に記載の方法。
(項目159)
前記H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目127〜158のいずれか1項に記載の方法。
(項目160)
前記H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目159に記載の方法。
(項目161)
NOが、前記個体へのH−NOXタンパク質の投与の前に、前記H−NOXタンパク質に結合する、項目127〜160のいずれか1項に記載の方法。
(項目162)
NOが、前記個体へのH−NOXタンパク質の投与の前に、前記H−NOXタンパク質に結合せず、前記H−NOXタンパク質は、個体中の1つの位置から個体中の別の位置にNOを輸送する、項目127〜160のいずれか1項に記載の方法。
(項目163)
前記H−NOXタンパク質が、経口投与、直腸投与、または個体の血液に投与される、項目127〜162のいずれか1項に記載の方法。
(項目164)
前記個体がヒトである、項目127〜163のいずれか1項に記載の方法。
(項目165)
前記個体が、心臓血管の症状、高血圧、高血圧によって悪化した症状、血管収縮の症状、脳卒中、またはNO機能不全に罹患しているか、あるいはそれらの危険性がある、項目127〜164のいずれか1項に記載の方法。
(項目166)
前記高血圧によって悪化した症状が、心不全、腎不全、または脳卒中である、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも2回個体に投与される、項目127〜166のいずれか1項に記載の方法。
(項目168)
前記H−NOXタンパク質が、項目245〜314のいずれか1項に記載の変異H−NOXタンパク質である、項目127〜167のいずれか1項に記載の方法。
(項目169)
(i)薬学的に許容される量のH−NOXタンパク質であって、前記H−NOXタンパク質のNO解離定数がヘモグロビンのNO解離定数の大きさの2桁以内であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性の少なくとも10分の1未満である薬学的に許容される量のH−NOXタンパク質と、(ii)薬学的に許容される担体を含む、キット。
(項目170)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.1倍〜10倍の間である、項目169に記載のキット。
(項目171)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.5倍〜2倍の間である、項目170に記載のキット。
(項目172)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも100分の1未満である、項目169〜171のいずれか1項に記載のキット。
(項目173)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも1,000分の1未満である、項目172に記載のキット。
(項目174)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目169〜173のいずれか1項に記載のキット。
(項目175)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間である、項目169〜174のいずれか1項に記載のキット。
(項目176)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目175に記載のキット。
(項目177)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目176に記載のキット。
(項目178)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目169〜177のいずれか1項に記載のキット。
(項目179)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目178に記載のキット。
(項目180)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目179に記載のキット。
(項目181)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目169〜180のいずれか1項に記載のキット。
(項目182)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目169〜181のいずれか1項に記載のキット。
(項目183)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目169〜182のいずれか1項に記載のキット。
(項目184)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目169〜183のいずれか1項に記載のキット。
(項目185)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目169〜184のいずれか1項に記載のキット。
(項目186)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目169〜185のいずれか1項に記載のキット。
(項目187)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目169〜186のいずれか1項に記載のキット。
(項目188)
ヘムがH−NOXタンパク質に結合している、項目169〜187のいずれか1項に記載のキット。
(項目189)
前記H−NOXタンパク質が変異タンパク質である、項目169〜188のいずれか1項に記載のキット。
(項目190)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目189に記載のキット。
(項目191)
前記H−NOXタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目189および190のいずれか1項に記載のキット。
(項目192)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、NOに対するk1、NOに対するk2、O2解離定数、NO安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも1つの変異を含む、項目169〜191のいずれか1項に記載のキット。
(項目193)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、項目169〜192のいずれか1項に記載のキット。
(項目194)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目169〜193のいずれか1項に記載のキット。
(項目195)
前記H−NOXタンパク質が、L.pneumophila 9 H−NOXのPhe149に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目169〜194のいずれか1項に記載のキット。
(項目196)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目169〜195のいずれか1項に記載のキット。
(項目197)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸、または約25個〜約200個のC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目196に記載のキット。
(項目198)
前記H−NOXタンパク質が以下:
(項目199)
前記H−NOXタンパク質が以下からなる群より選択される、項目198に記載のキット:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus β1(1−395)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。
(項目200)
前記H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、項目169〜199のいずれか1項に記載のキット。
(項目201)
前記H−NOXタンパク質がヒトタンパク質であるか、ヒトタンパク質由来であるか、ヒトβ1であるか、またはβ1由来である、項目200に記載のキット。
(項目202)
前記H−NOXタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、項目169〜199のいずれか1項に記載のキット。
(項目203)
前記H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質であるか、またはT.tengcongensisタンパク質由来である、項目202に記載のキット。
(項目204)
NOがH−NOXタンパク質に結合している、項目169〜203のいずれか1項に記載のキット
(項目205)
前記H−NOXタンパク質を含む1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、項目169〜204のいずれか1項に記載のキット。
(項目206)
前記H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目169〜205のいずれか1項に記載のキット。
(項目207)
前記H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目206に記載のキット。
(項目208)
前記H−NOXタンパク質が、項目245〜314のいずれか1項に記載の変異H−NOXタンパク質である、項目169〜207のいずれか1項に記載のキット。
(項目209)
(i)H−NOXタンパク質であって、前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであるH−NOXタンパク質と、(ii)個体にNOを送達するためのキットの使用についての説明書を含む、キット。
(項目210)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目209に記載のキット。
(項目211)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目210に記載のキット。
(項目212)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目209〜211のいずれか1項に記載のキット。
(項目213)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目212に記載のキット。
(項目214)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目209〜213のいずれか1項に記載のキット。
(項目215)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目209〜214のいずれか1項に記載のキット。
(項目216)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目209〜215のいずれか1項に記載のキット。
(項目217)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目209〜216のいずれか1項に記載のキット。
(項目218)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目209〜217のいずれか1項に記載のキット。
(項目219)
前記H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目209〜218のいずれか1項に記載のキット。
(項目220)
前記H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目209〜219のいずれか1項に記載のキット。
(項目221)
前記H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目209〜220のいずれか1項に記載のキット。
(項目222)
ヘムがH−NOXタンパク質に結合している、項目209〜221のいずれか1項に記載のキット。
(項目223)
前記H−NOXタンパク質が変異タンパク質である、項目209〜222のいずれか1項に記載のキット。
(項目224)
前記H−NOXタンパク質が少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目223に記載のキット。
(項目225)
前記H−NOXタンパク質が、遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目223および224のいずれか1項に記載のキット。
(項目226)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、NOに対するk1、NOに対するk2、O2解離定数、NO安定性、ヘム自動酸化速度、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる、少なくとも1つの変異を含む、項目209〜225のいずれか1項に記載のキット。
(項目227)
前記H−NOXタンパク質が、対応する野生型タンパク質と比較してNO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、項目209〜226のいずれか1項に記載のキット。
(項目228)
前記H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する1つの残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目209〜227のいずれか1項に記載のキット。
(項目229)
前記H−NOXタンパク質が、L.pneumophila 9 H−NOXのPhe149に対応する1つの残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目209〜228のいずれか1項に記載のキット。
(項目230)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目209〜229のいずれか1項に記載のキット。
(項目231)
変異H−NOXタンパク質中の少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目230に記載のキット。
(項目232)
変異H−NOXタンパク質中の約25個〜約200個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目230および231のいずれか1項に記載のキット。
(項目233)
前記H−NOXタンパク質が以下:
からなる群より選択される、項目209〜232のいずれか1項に記載のキット。
(項目234)
前記H−NOXタンパク質が以下からなる群より選択される、項目233に記載のキット:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus β1(1−395)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。
(項目235)
前記H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質であるか、または哺乳動物タンパク質由来である、項目209〜234のいずれか1項に記載のキット。
(項目236)
前記H−NOXタンパク質がヒトタンパク質であるか、またはヒトタンパク質由来である、項目235に記載のキット。
(項目237)
前記ヒトタンパク質がβ1であるか、またはβ1由来である、項目236に記載のキット。
(項目238)
前記H−NOXタンパク質が細菌タンパク質であるか、または細菌タンパク質由来である、項目209〜234のいずれか1項に記載のキット。
(項目239)
前記H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質であるか、またはT.tengcongensisタンパク質由来である、項目238に記載のキット。
(項目240)
NOがH−NOXタンパク質に結合している、項目209〜239のいずれか1項に記載のキット。
(項目241)
前記H−NOXタンパク質を含む1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む、項目209〜240のいずれか1項に記載のキット。
(項目242)
前記H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目209〜241のいずれか1項に記載のキット。
(項目243)
前記H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目242に記載のキット。
(項目244)
前記H−NOXタンパク質が、項目245〜314のいずれか1項に記載の変異H−NOXタンパク質である、項目209〜243のいずれか1項に記載のキット。
(項目245)
対応する野生型H−NOXタンパク質と比較して、NO解離定数またはNO反応性を変化させる少なくとも1つの変異を含む、単離されたH−NOXタンパク質であって、前記変異H−NOXタンパク質のNO解離定数は、ヘモグロビンのNO解離定数の大きさの2桁以内であり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性は、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも10分の1未満であり、前記変異H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y40L、野生型T.tengcongensis H−NOX、野生型R.norvegicus sGC、またはL.pneumophilia 2 H−NOX F142Yではない、単離されたH−NOXタンパク質。
(項目246)
前記変異H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140Lではない、項目245に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目247)
前記変異H−NOXタンパク質が以下ではない、項目245および246のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質:野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、野生型H.sapiens β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、野生型R.norvegicus β1
H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans
GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOX。
(項目248)
前記変異H−NOXタンパク質が以下ではない、項目245〜247のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質:T.tengcongensis H−NOX
W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、R.norvegicus β1(1−385)I145Y、R.norvegicus sGC β1
H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、またはR.norvegicus sGC β1 H−NOX C78E。
(項目249)
前記変異H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOX Y140HまたはH.sapiens β1 I140Yではない、項目245〜248のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目250)
前記変異H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.1倍〜10倍の間である、項目245〜249のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目251)
前記変異H−NOXタンパク質のNO解離定数が、ヘモグロビンのNO解離定数の0.5倍〜2倍の間である、項目250に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目252)
前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも100分の1未満である、項目245〜251のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目253)
前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、ヘモグロビンのNO反応性の少なくとも1,000分の1未満である、項目252に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目254)
前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目245〜253のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目255)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間である、項目245〜254のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目256)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目245〜255のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目257)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目245〜256のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目258)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目245〜257のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目259)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目245〜258のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目260)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目259に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目261)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目245〜260のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目262)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目245〜261のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目263)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目245〜262のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目264)
前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目245〜263のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目265)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目245〜264のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目266)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目245〜265のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目267)
前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目245〜266のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目268)
少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目245〜267のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目269)
遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目245〜268のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目270)
T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目245〜269のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目271)
L.pneumophila 2 H−NOXのPhe142に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目245〜270のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目272)
少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目245〜271のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目273)
少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目272に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目274)
約25個〜約200個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目272および273のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目275)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質である、項目245〜274のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目276)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質がヒトタンパク質である、項目275に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目277)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質がβ1である、項目276に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目278)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質が細菌タンパク質である、項目245〜274のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目279)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質である、項目278に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目280)
前記変異H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目245〜279のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目281)
前記変異H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目280に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目282)
対応する野生型H−NOXタンパク質と比較して、NOに対するkoff、k1、またはk2を変化させるか、あるいはO2解離定数を変化させる少なくとも1つの変異を含む、単離されたH−NOXタンパク質であって、前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2は、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記変異H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y40L、野生型T.tengcongensis H−NOX、野生型R.norvegicus sGC、またはL.pneumophilia 2 H−NOX F142Yではない、単離されたH−NOXタンパク質。
(項目283)
前記変異H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140Lではない、項目282に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目284)
前記変異H−NOXタンパク質が以下ではない、項目282および283のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質:野生型L.pneumophilia 2
H−NOX、野生型H.sapiens β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、野生型R.norvegicus β1
H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans
GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOX。
(項目285)
前記変異H−NOXタンパク質が以下ではない、項目282〜284のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質:T.tengcongensis H−NOX
W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、R.norvegicus β1(1−385)I145Y、R.norvegicus sGC β1
H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、R.norvegicus
sGC β1 H−NOX C78E、またはH.sapiens β1 H−NOX(1−385)I145Y。
(項目286)
前記変異H−NOXタンパク質が、T.tengcongensis H−NOX Y140HまたはH.sapiens β1 I140Yではない、項目282〜285のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目287)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約0.012s−1の間である、項目282〜286のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目288)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約1×10−3s−1の間である、項目287に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目289)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約10μMである、項目282〜288のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目290)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約50μMである、項目289に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目291)
前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目282〜290のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目292)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMである、項目282〜291のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目293)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目282〜292のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目294)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目282〜293のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目295)
前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目282〜294のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目296)
前記変異H−NOXタンパク質のNOに対するkoff、k1、またはk2が、37℃で約1×10−4s−1〜約10s−1の間であり、前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目282〜295のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目297)
前記変異H−NOXタンパク質のO2解離定数が、37℃で少なくとも約1μMであり、前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満である、項目282〜296のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目298)
前記変異H−NOXタンパク質のヘム自動酸化速度が、37℃で約1h−1未満であり、前記変異H−NOXタンパク質のNO反応性が、約700s−1未満である、項目282〜297のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目299)
少なくとも1つの遠位ポケット変異を含む、項目282〜298のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目300)
遠位ポケット中にない少なくとも1つの変異を含む、項目282〜299のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目301)
T.tengcongensis H−NOXのTyr140に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目282〜300のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目302)
L.pneumophila 2 H−NOXのPhe142に対応する残基が任意の他のアミノ酸によって置き換えられる少なくとも1つの変異を含む、項目282〜301のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目303)
少なくとも1つのC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目282〜302のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目304)
少なくとも約50個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目303に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目305)
約25個〜約200個の連続するC末端アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して除去されている、項目303および304のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目306)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質が哺乳動物タンパク質である、項目282〜305のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目307)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質がヒトタンパク質である、項目306に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目308)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質がβ1である、項目307に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目309)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質が細菌タンパク質である、項目282〜305のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目310)
前記対応する野生型H−NOXタンパク質がT.tengcongensisタンパク質である、項目309に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目311)
前記変異H−NOXタンパク質が別の分子または部分に共有結合している、項目282〜310のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目312)
前記変異H−NOXタンパク質がポリエチレングリコールに共有結合している、項目311に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目313)
前記H−NOXタンパク質のNO解離定数が、Homo sapiensヘモグロビンαのNO解離定数の大きさの2桁以内である、項目279〜395のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目314)
前記H−NOXタンパク質のNO反応性が、Homo sapiensヘモグロビンαのNO反応性の少なくとも10分の1未満である、項目279〜396のいずれか1項に記載の単離されたH−NOXタンパク質。
(項目315)
項目245〜314のいずれか1項に記載のH−NOXタンパク質をコードする組換え型核酸。
(項目316)
項目315に記載の核酸を含むベクター。
(項目317)
項目315に記載の核酸を含む細胞。
(項目318)
項目316に記載のベクターを含む細胞。
(項目319)
タンパク質の生産に適している条件下で、項目245〜314のいずれか1項に記載のH−NOXタンパク質をコードする核酸を含む細胞を培養する工程を含む、H−NOXタンパク質の生産方法。
(項目320)
H−NOXタンパク質を精製する工程をさらに含む、項目319に記載の方法。
I5A、T.tengcongensis H−NOX I5L、T.tengcongensis H−NOX I5L−P115A、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX W9F−Y140L、T.tengcongensis H−NOX W9F−Y140H、T.tengcongensis H−NOX W9F−N74A、T.tengcongensis H−NOX W9Y、T.tengcongensis H−NOX W9N、T.tengcongensis H−NOX W9H、T.tengcongensis H−NOX N74E、T.tengcongensis H−NOX N74A、T.tengcongensis H−NOX N74H、T.tengcongensis H−NOX N74A−Y140H、T.tengcongensis H−NOX F78Y−Y140F、T.tengcongensis H−NOX P115A、T.tengcongensis H−NOX R135Q、T.tengcongensis
H−NOX Y140F、T.tengcongensis H−NOX Y140H、T.tengcongensis H−NOX Y140A、T.tengcongensis I75F−His6、T.tengcongensis I75F、T.tengcongensis L144F−His6、T.tengcongensis L144F、L2 F9W−F142Y、D.desulfuricans H−NOX(728−899)、D.desulfuricans H−NOX Y139L、β1(1−385)、β1(1−385)I145Y、β1(1−385)I145H、β1(1−194)、β1(1−194)I145Y、β1(1−194)L9W−I145Y、β2(1−217)、β2(1−217)I142Y、C.botulinum H−NOX(1−175)、C.botulinum H−NOX(1−186)、C.acetobutylicum H−NOX(1−197)、C.acetobutylicum H−NOX(1−183)、およびC.elegans H−NOX GCY−35(1−252)。いくつかの実施形態においては、β1またはβ2タンパク質は、R.norvegicusまたはH.sapiensのβ1あるいはβ2タンパク質に由来する。
I5A、T.tengcongensis H−NOX I5L、T.tengcongensis H−NOX I5L−P115A、T.tengcongensis H−NOX W9F−Y140L、T.tengcongensis H−NOX W9F−Y140H、T.tengcongensis H−NOX W9F−N74A、T.tengcongensis H−NOX W9Y、T.tengcongensis H−NOX W9N、T.tengcongensis H−NOX W9H、T.tengcongensis H−NOX N74E、T.tengcongensis H−NOX N74A、T.tengcongensis H−NOX N74H、T.tengcongensis H−NOX N74A−Y140H、T.tengcongensis H−NOX F78Y−Y140F、T.tengcongensis H−NOX P115A、T.tengcongensis H−NOX R135Q、T.tengcongensis H−NOX Y140H、T.tengcongensis H−NOX Y140A、T.tengcongensis I75F−His6、T.tengcongensis I75F、T.tengcongensis L144F−His6、T.tengcongensis L144F、L.pneumophilia 2 F9W−F142Y、D.desulfuricans H−NOX(728−899)、D.desulfuricans H−NOX Y139L、β1(1−385)I145H、β1(1−194)、β1(1−194)I145Y、β1(1−194)L9W−I145Y、β2(1−217)、β2(1−217)I142Y、C.botulinum H−NOX(1−175)、C.botulinum H−NOX(1−186)、C.acetobutylicum H−NOX(1−197)、C.acetobutylicum H−NOX(1−183)、およびC.elegans H−NOX GCY−35(1−252)。いくつかの実施形態においては、β1またはβ2タンパク質は、R.norvegicusまたはH.sapiens β1もしくはβ2タンパク質に由来する。
β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、野生型R.norvegicus β1 H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOX。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は以下ではない:T.tengcongensis H−NOX
W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、またはR.norvegicus sGC β1 H−NOX C78E。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、R.norvegicus β2(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、R.norvegicus β1(1−385)、またはR.norvegicus β1(1−385)I145Yではない。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、またはH.sapiens β1 H−NOX(1−385)I145Yではない。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y140H、H.sapiens β1 I140Y、またはH.sapiens β1 I145Yではない。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y40L、T.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140L、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型T.tengcongensis H−NOX、L.pneumophilia 2 H−NOX F142Y、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、H.sapiens β1 H−NOX I140Y、H.sapiens B1 I145Y、野生型H.sapiens β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、野生型R.norvegicus β1
H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOXではない。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、それらの種の省略形とGenbank識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のH−NOXタンパク質のいずれでもない(例えば、2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、または2007年5月22日に入手した以下のタンパク質配列):Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy−31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS−beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy−32_Ce_13539160、gcy−36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy−35_Ce−17507861(gi:71990146)、gcy−37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2−Hs_899477、またはGYCα−99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayanら、(2003)、「Ancient
conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins」、BMG Genomics 4:5−13)。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む:Ana−Anabaena Sp;Ccr−Caulobacter crescentus;Cac−Clostridium acetobutylicum;Dde−Desulfovibrio desulfuricans;Mcsp−Magnetococcus sp.;Mde−Microbulbifer degradans;Npu−Nostoc punctiforme;Rhsp−Rhodobacter sphaeroides;Sone−Shewanella oneidensis;Tte−Thermoanaerobacter tengcongensis;Vch−Vibrio cholerae;Ce−Caenorhabditis elegans;Dm−Drosophila melanogaster;Hpul−Hemicentrotus pulcherrimus;Hs−Homo sapiens。単離されたH−NOXタンパク質のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、それらの生物名とPfamデータベース登録番号によって列挙される以下のH−NOXタンパク質のいずれでもない(例えば、2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月17日、2007年5月21日、または2007年5月22日に入手した以下のタンパク質配列):
H−NOX Y140A、T.tengcongensis I75F−His6、T.tengcongensis I75F、T.tengcongensis L144F−His6、T.tengcongensis L144F、L.pneumophilia 2 H−NOX F142Y、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneuophilia 2 H−NOX、L.pneuophilia 2 F9W−F142Y、野生型D.desulfuricans H−NOX、D.desulfuricans H−NOX(728−899)、D.desulfuricans H−NOX Y139L、野生型H.sapiens β1 H−NOX、H.sapiens β1 I140Y、H.sapiens β1 I145Y、H.sapiens β1(1−385)、H.sapiens β1(1−385)I145Y、H.sapiens β1(1−385)I145H、H.sapiens β1(1−194)、H.sapiens β1(1−194)I145Y、H.sapiens β1(1−194)L9W−I145Y、H.sapiens β2(1−217)、H.sapiens β2(1−217)I142Y、H.sapiens β1 H−NOX H105G、H.sapiens β1 H−NOX H105F、H.sapiens β1 H−NOX C78S、H.sapiens β1 H−NOX C78E、野生型R.norvegicus β1 H−NOX、R.norvegicus β1(1−385)、R.norvegicus β1(1−385)I145Y、R.norvegicus β1(1−385)I145H、R.norvegicus β1(1−194)、R.norvegicus β1(1−194)I145Y、R.norvegicus β1(1−194)L9W−I145Y、R.norvegicus β2(1−217)、R.norvegicus β2(1−217)I142Y、R.norvegicus β1 H−NOX H105G、R.norvegicus β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78E、C.botulinum H−NOX(1−175)、C.botulinum H−NOX(1−186)、野生型C.acetobutylicum H−NOX、C.acetobutylicum H−NOX(1−197)、C.acetobutylicum H−NOX(1−183)、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、C.elegans H−NOX GCY−35(1−252)、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA、野生型D.melangaster CG14886、野生型D.melangaster CG4154;野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、野生型M.musculus H−NOX、野生型C.familiaris H−NOX、野生型B.taurus H−NOX、野生型R.norvegicus;野生型X.laevis H−NOX、野生型O.latipes H−NOX、野生型O.curivatus H−NOX、野生型F.rubripes H−NOX、野生型A.gambiae H−NOX、野生型M.sexta H−NOX;野生型C.elegans gcy−31、C.elegans gcy−32、野生型C.elegans gcy−33、野生型C.elegans gcy−34、野生型C.elegans gcy−35、野生型C.elegans gcy−36、野生型C.elegans gcy−37、野生型V.cholera H−NOX、野生型V.fischerii H−NOX、および野生型N.punctiforme H−NOX。薬学的組成物の特定の実施形態においては、H−NOXタンパク質は、以下からなる群より選択される:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus β1(1−385)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、薬学的組成物は、H−NOXタンパク質を含むかもしくはH−NOXタンパク質をカプセル化する、1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む。
H−NOX,野生型R.norvegicus sGC、またはL.pneumophilia 2 H−NOX F142Yではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質はT.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140Lではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、野生型H.sapiens β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、野生型R.norvegicus β1 H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOXではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、またはR.norvegicus sGC β1 H−NOX C78Eではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、R.norvegicus β2(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、R.norvegicus β1(1−385)、またはR.norvegicus β1(1−385)I145Yではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、またはH.sapiens β1 H−NOX(1−385)I145Yではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y140H、H.sapiens β1 I140Y、またはH.sapiens β1 I145Yではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y40L、T.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140L、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型T.tengcongensis H−NOX、L.pneumophilia 2 H−NOX F142Y、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、H.sapiens
β1 H−NOX I140Y、H.sapiens B1 I145Y、野生型H.sapiens β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、野生型R.norvegicus β1 H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOXではない。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、それらの種の省略形とGenbank識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のH−NOXタンパク質のいずれでもない(例えば、2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、または2007年5月22日に入手した以下のタンパク質配列):Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy−31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS−beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy−32_Ce_13539160、gcy−36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy−35_Ce−17507861(gi:71990146)、gcy−37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2−Hs_899477、またはGYCα−99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayanら、(2003)、「Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins」、BMG Genomics 4:5−13)。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む:Ana−Anabaena Sp;Ccr−Caulobacter crescentus;Cac−Clostridium acetobutylicum;Dde−Desulfovibrio desulfuricans;Mcsp−Magnetococcus sp.;Mde−Microbulbifer degradans;Npu−Nostoc punctiforme;Rhsp−Rhodobacter sphaeroides;Sone−Shewanella oneidensis;Tte−Thermoanaerobacter tengcongensis;Vch−Vibrio cholerae;Ce−Caenorhabditis elegans;Dm−Drosophila melanogaster;Hpul−Hemicentrotus pulcherrimus;Hs−Homo sapiens。薬学的組成物のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、それらの生物名とPfamデータベース登録番号によって列挙される以下のH−NOXタンパク質のいずれでもない(例えば、2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月17日、2007年5月21日、または2007年5月22日に入手した以下のタンパク質配列):
H−NOX W9F−N74A、T.tengcongensis H−NOX W9Y、T.tengcongensis H−NOX W9N、T.tengcongensis H−NOX W9H、T.tengcongensis H−NOX N74E、T.tengcongensis H−NOX N74A、T.tengcongensis H−NOX N74H、T.tengcongensis H−NOX N74A−Y140H、T.tengcongensis H−NOX F78Y−Y140F、T.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140L、T.tengcongensis H−NOX P115A、T.tengcongensis H−NOX R135Q、T.tengcongensis H−NOX Y140F、T.tengcongensis H−NOX Y40L、T.tengcongensis
H−NOX Y140H、T.tengcongensis H−NOX Y140A、T.tengcongensis I75F−His6、T.tengcongensis I75F、T.tengcongensis L144F−His6、T.tengcongensis L144F、L.pneumophilia 2 H−NOX F142Y、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneuophilia 2 H−NOX、L.pneuophilia 2 F9W−F142Y、野生型D.desulfuricans H−NOX、D.desulfuricans H−NOX(728−899)、D.desulfuricans H−NOX Y139L、野生型H.sapiens β1 H−NOX、H.sapiens β1
I140Y、H.sapiens β1 I145Y、H.sapiens β1(1−385)、H.sapiens β1(1−385)I145Y、H.sapiens
β1(1−385)I145H、H.sapiens β1(1−194)、H.sapiens β1(1−194)I145Y、H.sapiens β1(1−194)L9W−I145Y、H.sapiens β2(1−217)、H.sapiens β2(1−217)I142Y、H.sapiens β1 H−NOX H105G、H.sapiens β1 H−NOX H105F、H.sapiens β1 H−NOX C78S、H.sapiens β1 H−NOX C78E、野生型R.norvegicus β1 H−NOX、R.norvegicus β1(1−385)、R.norvegicus β1(1−385)I145Y、R.norvegicus β1(1−385)I145H、R.norvegicus β1(1−194)、R.norvegicus β1(1−194)I145Y、R.norvegicus
β1(1−194)L9W−I145Y,R.norvegicus β2(1−217)、R.norvegicus β2(1−217)I142Y、R.norvegicus β1 H−NOX H105G、R.norvegicus β1 H−NOX
H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78E、C.botulinum
H−NOX(1−175)、C.botulinum H−NOX(1−186)、野生型C.acetobutylicum H−NOX、C.acetobutylicum H−NOX(1−197)、C.acetobutylicum H−NOX(1−183)、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、C.elegans H−NOX GCY−35(1−252)、野生型D.melanogaster β1 H−NOX、野生型D.melanogaster CG14885−PA、野生型D.melanogaster CG14886、野生型D.melanogaster
CG4154;野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、野生型M.musculus H−NOX、野生型C.familiaris H−NOX、野生型B.taurus H−NOX、野生型R.norvegicus;野生型X.laevis H−NOX、野生型O.latipes H−NOX、野生型O.curivatus H−NOX、野生型F.rubripes H−NOX、野生型A.gambiae H−NOX、野生型M.sexta H−NOX;野生型C.elegans gcy−31、C.elegans gcy−32、野生型C.elegans gcy−33、野生型C.elegans gcy−34、野生型C.elegans gcy−35、野生型C.elegans gcy−36、野生型C.elegans gcy−37、野生型V.cholera H−NOX、野生型V.fischerii H−NOX、および野生型N.punctiforme H−NOX。この方法の特定の実施形態においては、H−NOXタンパク質は、以下からなる群より選択される:野生型R.norvegicus sGC、野生型R.norvegicus β1(1−385)、R.norvegicus β1(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、野生型T.tengcongensis H−NOX、T.tengcongensis H−NOX Y140L、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型L.pneuophilia 1 H−NOX、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、およびL.pneumophilia 2 H−NOX F142Y。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質を含むかまたはH−NOXタンパク質をカプセル化する、1つ以上のリポソームまたはナノ粒子を含む。
H−NOX、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOXではない。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105G、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX C78S、またはR.norvegicus sGC β1 H−NOX C78Eではない。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、R.norvegicus β2(1−217)、R.norvegicus β1(1−194)、R.norvegicus β1(1−385)、またはR.norvegicus β1(1−385)I145Yではない。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、またはH.sapiens β1 H−NOX(1−385)I145Yではない。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y140H、H.sapiens β1 I140Y、またはH.sapiens β1 I145Yではない。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、T.tengcongensis H−NOX Y40L、T.tengcongensis H−NOX F78Y/Y140L、T.tengcongensis H−NOX W9F、T.tengcongensis H−NOX Y140F、野生型T.tengcongensis H−NOX、L.pneumophilia 2 H−NOX F142Y、野生型L.pneumophilia 2 H−NOX、H.sapiens β1 H−NOX I140Y、H.sapiens B1 I145Y、野生型H.sapiens β1 H−NOX、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)、R.norvegicus sGC β1 H−NOX(1−385)I145Y、R.norvegicus sGC β1 H−NOX H105G、R.norvegicus sGC
β1 H−NOX H105F、R.norvegicus sGC β1 H−NOX I145Y、野生型R.norvegicus β1 H−NOX、野生型D.melangaster β1 H−NOX、野生型D.melangaster CG14885−PA H−NOX、野生型C.elegans GCY−35 H−NOX、野生型N.punctiforme H−NOX、野生型C.crescentus H−NOX、野生型S.oneidensis H−NOX、または野生型C.acetobutylicum H−NOXではない。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、それらの種の省略形とGenbank識別番号にしたがってそれらの遺伝子名によって列挙される以下のH−NOXタンパク質のいずれでもない(例えば、2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、または2007年5月22日に入手した以下のタンパク質配列):Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy−31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS−beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy−32_Ce_13539160、gcy−36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy−35_Ce−17507861(gi:71990146)、gcy−37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1α3_Hs_20535603、GCY1α2−Hs_899477、またはGYCα−99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayanら、(2003)、「Ancient conserved domains shared
by animal soluble guanylyl cyclases and
bacterial signaling proteins」、BMG Genomics 4:5−13)。これらの名称の中で使用される種の省略形には以下を含む:Ana−Anabaena Sp;Ccr−Caulobacter crescentus;Cac−Clostridium acetobutylicum;Dde−Desulfovibrio desulfuricans;Mcsp−Magnetococcus sp.;Mde−Microbulbifer degradans;Npu−Nostoc punctiforme;Rhsp−Rhodobacter sphaeroides;Sone−Shewanella oneidensis;Tte−Thermoanaerobacter tengcongensis;Vch−Vibrio cholerae;Ce−Caenorhabditis elegans;Dm−Drosophila melanogaster;Hpul−Hemicentrotus pulcherrimus;Hs−Homo sapiens。この方法のいくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、それらの生物名とPfamデータベース登録番号によって列挙される以下のH−NOXタンパク質のいずれでもない(例えば、2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月17日、2007年5月21日、または2007年5月22日に入手した以下のタンパク質配列):
本発明は、H−NOXタンパク質がヘモグロビンよりもはるかに低いNO反応性を有していることの驚くべき発見に一部基づく。この固有の低いNO反応性(および高いNO安定性)は、野生型および変異H−NOXタンパク質を望ましいNO担体とする。なぜなら、H−NOXタンパク質は、O2の存在下でNOによって不活化される可能性が低いからである。重要なことは、いくつかのH−NOXタンパク質中に遠位ポケットチロシンが存在することである(Pellicena,P.ら、(2004年8月31日))。「Crystal Structure of An Oxygen−Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101(35):12854−12859は、望ましくない高いNO反応性を示唆しており、これによりNO担体としての使用が禁止されている。例えば、構造的に類似する遠位ポケットチロシンから類推すると、Mycobacterium tuberculosisヘモグロビンタンパク質はNOと極めて迅速に反応し、感染した宿主によって生産されるNOを効率よく除去し、防御性のNOを回避するために、Mycobacteriumuによって使用される(Ouellet,H.ら、(2002年4月30日)。「Truncated Hemoglobin HbN Protects Mycobacterium Bovis From Nitric Oxide」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99(9):5902−5907)。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、H−NOXタンパク質が、実際には、ヘモグロビンよりもはるかに低いNO反応性を有しており、それによってNO担体としてそれらを使用することが可能となることを発見した。
H−NOXタンパク質ファミリーの概要
他で明記されない限りは、全ての野生型H−NOXタンパク質または変異H−NOXタンパク質を、本明細書中に記載される組成物、キット、および方法において使用することができる。本明細書中で使用される場合は、「H−NOXタンパク質」は、H−NOXドメイン(ヘム−酸化窒素および酸素結合ドメイン(Heme−Nitric oxide
and OXygen binding domain)について命名された)を有しているタンパク質を意味する。H−NOXタンパク質は、H−NOXドメインに加えて、1つ以上の他のドメインを含む場合も、また含まない場合もある。H−NOXタンパク質は、高度に保存されており、十分に特性決定されているヘムタンパク質のファミリーのメンバーである(Iyer,L.M.ら、(2003年2月3日)「Ancient Conserved Domains Shared by Animal Soluble
Guanylyl Cyclases And Bacterial Signaling Proteins」,BMC Genomics 4(1):5;Karow,D.S.ら、(2004年8月10日)「Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase−Like Heme Domains From Vibrio Cholerae
And Thermoanaerobacter Tengcongensis」,Biochemistry 43(31):10203−10211;Boon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature
Chem.Biol.1:53−59;Boon,E.M.ら、(2005年10月)「Ligand Discrimination in Soluble Guanylate Cyclase and the H−NOX Family of Heme
Sensor Proteins」,Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441−446;Boon,E.M.ら、(2005)「Ligand Specificity of H−NOX Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors」,J.Inorg.Biochem.99(4):892−902)。H−NOXタンパク質はまた、Pfam 07700タンパク質またはHNOBタンパク質とも呼ばれる(Pfam−タンパク質ドメインファミリーのアラインメントのAデータベース、およびHidden Markov Models,Copyright(C)1996−2006 The Pfam Consortium;GNU LGPL Free Software Foundation,Inc.,59 Temple Place−Suite 330,Boston,MA 02111−1307,USA)。いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、6個のαヘリックス、それに続く2つのβ鎖、続く1つのαヘリックス、続く2つのβ鎖が含まれている二次構造を有するか、あるいはそれらを有すると予想される。H−NOXタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質であっても、また、ヘムが結合したホロタンパク質であってもよい。H−NOXタンパク質は、ヘム基に共有結合することができ、また共有結合以外で結合することもできる。いくつかのH−NOXタンパク質はNOに結合するがO2には結合せず、他のH−NOXタンパク質はNOとO2の両方に結合する。単離されている通性好気性菌に由来するH−NOXドメインはNOに結合するが、O2には結合しない。偏性好気性原核生物、C.elegans、およびD.melanogasterに由来するH−NOXタンパク質はNOにも、O2にも結合する。哺乳動物は2つのH−NOXタンパク質:β1とβ2を有している。マウス、ラット、ウシ、およびヒトのH−NOX配列のアラインメントは、これらの種が>99%の同一性を共有していることを示している。いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質のH−NOXドメイン、または完全なH−NOXタンパク質は、自然界に存在しているThermoanaerobacter tengcongensis H−NOXタンパク質または自然界に存在しているsGCタンパク質(例えば、自然界に存在しているsGC β1タンパク質)の対応する領域に対して、少なくとも約10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99、または99.5%同一である。本明細書中にさらに議論されるように、H−NOXタンパク質は、状況に応じて、対応する自然界に存在しているH−NOXタンパク質と比較して1つ以上の変異を含む場合がある。いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、H−NOXドメインに加えて、1つ以上のドメインを含む。特定の実施形態においては、H−NOXタンパク質は、別のタンパク質に由来する1つ以上のドメイン、または別のタンパク質の完全な配列を含む。例えば、H−NOXタンパク質は、H−NOXドメインと、別のタンパク質(例えば、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン))の一部または全体が含まれている融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態においては、H−NOXドメインだけが存在する。
From Clostridium Botulinum」,Science 306(5701):1550−1553;Pellicena,P.ら、(2004年8月31日)「Crystal Structure of An Oxygen−Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclase」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101(35):12854−12859)は、チロシン側鎖のヒドロキシル基が、FeII−O2部分に対して重要な意味を持つH−結合を形成することを示している。この遠位ポケットの水素結合ネットワーク(主にY140が関与している)は、FeII−O2複合体を安定化させる(図6B)。このチロシンは、O2を識別し、NOにしか結合しないH−NOXタンパク質中には存在しない。例えば、この水素結合ネットワークは、sGCおよび好気性原核生物に由来するH−NOXタンパク質中には存在しないと予想され、このことは、これが、これらのヘムタンパク質によって提示されるO2に対する顕著なリガンド選択性における極めて重要な分子因子であることを示唆している。図7A〜7Gは、NOに結合するが、O2には結合しない野生型H−NOXタンパク質の遠位ポケット中へのチロシンの付加により、変異H−NOXタンパク質をO2に結合させることができることを明らかに示している。したがって、折り畳まれたH−NOXヘムの遠位ヘムポケットの中のチロシンは、O2結合をオンまたはオフに切り替えるためのスイッチのような役割を担う。
任意の属または種に由来するH−NOXタンパク質を、本明細書中に記載される組成物、キット、および方法において使用することができる。様々な実施形態においては、H−NOXタンパク質は、哺乳動物(例えば、霊長類(例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど)、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、もしくはネコ)、昆虫、酵母、または細菌に由来するタンパク質であるか、あるいは、そのようなタンパク質から誘導される。例示的な哺乳動物のH−NOXタンパク質としては、野生型のヒトおよびラットの可溶性グアニル酸シクラーゼ(例えば、β1サブユニット)が挙げられる。H−NOXタンパク質の例としては、野生型の哺乳動物H−NOXタンパク質(例えば、H,sapiens、M.nusculus、C.familiaris、B.taurus、およびR.norvegicus);および野生型の哺乳動物以外の脊椎動物のH−NOXタンパク質(例えば、X.laevis、O.latipes、O.curivatus、およびF.rubripes)が挙げられる。哺乳動物以外の野生型のNO結合H−NOXタンパク質の例としては、D.melanogaster、A,gambiae、およびM.sextaの野生型H−NOXタンパク質が挙げられる。哺乳動物以外の野生型のO2結合H−NOXタンパク質の例としては、C.elegans gcy−31、gcy−32、gcy−33、gcy−34、gcy−35、gcy−36、およびgcy−37;D.melanogaster CG14885、CG14886、およびCG4154;ならびにM.sexta beta−3の野生型H−NOXタンパク質が挙げられる:原核生物の野生型H−NOXタンパク質の例としては、T.tengcongensis、V.cholera、V.fischerii、N.punctiforme、D.desulfuricans、L.pneumophila 1、L.pneumophila
2、およびC.acetobacteriumが挙げられる。
CH−1211 Geneva 4,Switzerland)もまた、H−NOXタンパク質ファミリーのメンバーを同定するために使用することができる。H−NOXタンパク質の二次構造および/または三次構造は、標準的な構造予測プログラム(例えば、PredictProtein(630 West,168 Street,BB217,New York,N.Y.10032,USA)のデフォルト設定を使用して予測することができる。あるいは、H−NOXタンパク質の実際の二次構造および/または三次構造は、標準的な方法を使用して決定することができる。
本明細書中でさらに議論されるように、H−NOXタンパク質は1つ以上の変異(例えば、対応する野生型タンパク質のものと比較して、NO解離定数、NOに対するkoff、O2解離定数、O2に対するkoff、ヘム自動酸化速度、NO反応性、NO安定性、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを変化させる変異)を含む場合がある。操作されたH−NOXタンパク質のパネルは、本明細書中に記載され、加えて、当業者に公知の技術を使用して本明細書中に提供される教示を参照して、ランダムな突然変異誘発、それに続く必要な、もしくは所望される解離定数、解離速度、NO反応性、安定性、生理適合性、または上記の2つ以上の任意の組み合わせについての経験的スクリーニングによって作成することができる。あるいは、突然変異誘発は、H−NOXタンパク質の実験によって決定された三次元構造または予測された三次元構造から明らかである遠位ポケット残基(本明細書中の図1A;および例えば、Boon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59(これは、特に野生型および変異H−NOXタンパク質の配列に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)、あるいは、配列アラインメントから同定された進化的に保存されている残基(本明細書中の図2〜4D;および例えば、Boon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59(これは、特に野生型および変異H−NOXタンパク質の配列に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)のような、特定の領域または残基に対して選択的に標的化させることができる。
野生型H−NOXまたは変異H−NOXタンパク質のうちの任意のものを、治療への応用または産業への応用を促進するために、標準的な方法を使用して修飾するおよび/または処方することができる。例えば、そして特に、非相同に操作されたH−NOXタンパク質に応用される場合には、免疫学的監視によるそのような薬剤の隔離(架橋、PEG化、糖質の装飾などを含む)のための様々な方法(例えば、Rohlfs,R.J.ら、(1998年5月15日)「Arterial Blood Pressure Responses to Cell−Free Hemoglobin Solutions And The Reaction With Nitric Oxide」,J.Biol.Chem.273(20):12128−12134;Migita,R.ら、(1997年7月)「Blood Volume And Cardiac Index in Rats After Exchange Transfusion With Hemoglobin−Based Oxygen Carriers」,J.Appl.Physiol.82(6):1995−2002;Vandegriff,K.D.ら、(2004年8月15日)「Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)−Conjugated Human Haemoglobin」,Biochem J.382(Pt 1):183−189(これらはそれぞれが、特にタンパク質の修飾に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる))、ならびに当業者に公知の他の技術は当該分野で公知である。H−NOXタンパク質のヒトタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)との融合により、血清半減期、粘性、およびコロイド浸透圧を増大させることができる。いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、その免疫原性を低下させるため、および/またはその血漿保持時間を増大させるために、その合成の間あるいは後に修飾される。H−NOXタンパク質はまた、カプセル化させることもできる(例えば、リポソームまたはナノ粒子の中へのカプセル化)。
本明細書中に記載されるように、様々なNO解離定数、O2解離定数、NO koff、O2 koff、NO反応性、および安定性を提供する多くの多様なH−NOX変異タンパク質が作成されている。いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質は、NOを送達するために現在使用されている任意の化合物(例えば、NOへの生体内変換のための任意の有機硝酸塩)と比較して、類似するか、あるいは改善されたNO解離定数、O2解離定数、NO koff、O2 koff、NO反応性、自動酸化速度、血漿保持時間、または上記の2つ以上の任意の組み合わせを有する。
β1 H0NOX Domain」,J.Biol.Chem.281(31):21892−21902(これは、特に、6−配位FeIINO複合体を含むH−NOXタンパク質試料の割合と5−配位FeIINO複合体を含むH−NOXタンパク質試料の割合の決定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように、およそ416〜422nmでUV−Vis Soretピークを生じる6−配位第一鉄ニトロシルを意味する。
β1 H0NOX Domain」,J.Biol.Chem.281(31):21892−21902(これは、特に、6−配位FeIINO複合体を含むH−NOXタンパク質試料の割合と5−配位FeIINO複合体を含むH−NOXタンパク質試料の割合の決定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように、およそ397〜400nmでUV−Vis Soretピークを生じる5−配位第一鉄ニトロシルを意味する。
Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain」,J.Biol.Chem.281(31):21892−21902、およびBoon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59(これらはそれぞれ、特に、H−NOXタンパク質のNO koffの計算に関してその全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように計算される。5−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質について、NOに対するkoffは、Winger,J.A.ら、(2007年1月)「Dissociation of
Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme−Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs」,J.Biol.Chem.282(2):897−907(これは、特に、H−NOXタンパク質のNO koff、NO k1、およびNO k2の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように、NOに対するk1およびNOに対するk2によって記載される。5−配位FeII−NO複合体と6−配位FeII−NO複合体の混合物が含まれているH−NOXタンパク質については、NOに対するkoffは、Winger,J.A.ら、(2007年1月)「Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme−Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs」,J.Biol.Chem.282(2):897−907(これは、特に、H−NOXタンパク質のNO koff、NO k1、およびNO k2の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように、NOに対するk1およびNOに対するk2によって記載される。
である。様々な実施形態においては、H−NOXタンパク質のO2に対するkoffは、37℃では約1〜約1,000s−1の間であり、例えば、37℃で、約1〜約50s−1、約50〜約100s−1、約100〜約250s−1、約250〜約500s−1、約500〜約750s−1、または約750〜約1,000s−1である。
Sensors),J.Inorg.Biochem.99(4):892−902)、Vandegriff,K.D.ら、(2004年8月15日)「Kinetics of NO and O2 Binding to a Maleimide Poly(ethylene glycol)−Conjugated Human Haemoglobin」,Biochem J.382(Pt 1):183−189(これらはそれぞれが、特にNO反応性の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる))ならびに当業者に公知の技術を、NO反応性を定量化するために使用することができる。野生型T.tengcongensis H−NOXはそのような低いNO反応性を有しているので、他の野生型H−NOXタンパク質および変異H−NOXタンパク質は同様の低いNO反応性を有し得る。例えば、T.tengcongensis H−NOX Y140Hは、野生型T.tengcongensis H−NOXのNO反応性と同様のNO反応性を有する。
and the H−NOX Family of Heme Sensor Proteins」,Curr.Opin.Chem.Biol.9(5):441−446;Boon,E.M.ら、(2005)「Ligand Specificity of H−NOX Domains:From sGC to Bacterial NO Sensors」,J.Inorg.Biochem.99(4):892−902)、ならびに、当業者に公知の技術のような様々な確立されている技術を、安定性を定量化するために使用することができる。血漿、血液、または組織中でのインビボ安定性についての、例示的な安定性の数的指標としては、保持時間、クリアランス速度、および半減期が挙げられる。好熱性生物に由来するH−NOXタンパク質は、高温で安定であると予想される。様々な実施形態においては、血漿保持時間は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも少なくとも約2倍、10倍、100倍、または1000倍大きい(例えば、Bobofchak,K.M.ら、(2003年8月)「A Recombinant Polymeric Hemoglobin With Conformational,Functional,And Physiological characteristics of an in vivo O2 transporter」,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.285(2):H549−H561)。当業者に明らかなように、ヘモグロビンをベースとする担体は、血漿に由来する細胞を含まないヘモグロビンを除去するヘモグロビン受容体の存在が原因で、血漿からの細胞を含まないヘモグロビンの迅速なクリアランスによって制限される。血漿中にはH−NOXタンパク質に対する受容体が存在しないので、野生型H−NOXタンパク質および変異H−NOXタンパク質は、ヘモグロビンよりも長い血漿保持時間を有すると予想される。所望される場合には、血漿保持時間は、標準的な方法(例えば、本明細書中に記載される方法、および当業者に公知の方法)を使用して、PEG化、またはH−NOXタンパク質の架橋、または別のタンパク質とH−NOXタンパク質との融合によって増大させることができる。
H0NOX Domain」,J.Biol.Chem.281(31):21892−21902。
Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme−Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs」,J.Biol.Chem.282(2):897−907;bBoon,E.M.ら、(2006年8月)「Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain」,J.Biol.Chem.281(31):21892−21902;cMorris、ら、(1980)「The role of diffusion in limiting the rate of ligand binding to hemoglobin」,J.Biol.Chem.255:8050−8053;dMoore,ら、(1976)「Cooperativity in the dissociation of nitric oxide from hemoglobin」,J.Biol.Chem.251:2788−2794;eMaes,ら、(2004)「Role of Binding Site Loops in Controlling
Nitrix Oxide Release:Structure and Kinetics of Mutant Forms of Nitrophorin 4」,Biochemistry 43(21):6679−90;fArtz,J.D.ら、(1998)「NO Release from No Doners and Nittovasodilators:Comparisons between Oxyhemoglobin and Potentiometric Assays」,Chem.Res.Toxicol.11(12):1393−1397;gBoon,E.M.ら、(2006)「Sensitive and Selective Detection of Nitric Oxide Using an H−NOX Domain」,JACS 128:10022−10023。
16 h「安定ではない構築物」は、タンパク質が試験した条件下ですぐに酸化されることを意味する。i「やや高く安定」は、タンパク質が、試験した条件下では数分間から数時間かけて酸化されるが、24時間を越えては安定なままであることはないことを意味する。
Autoxidation」,Biochemistry 33:8067−8073。mAono,S.ら、(2002)「Resonance Raman and Ligand Binding Studies of the Oxygen−Sensing Signal Transducer Protein HemAT from Bacillus Subtilis」,J.Biol.Chem.277:13528−13538。nAntonini,E.ら、(1971)「Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands」,North−Holland Publ.,Amsterdam。
Myoglobin and Hemoglobin」,Biochemistry 35:6976−6983に基づくと、20℃ではおよそ7,000s−1である。
「RT」は室温を示す。
本発明はまた、本明細書中に記載される変異H−NOXタンパク質のうちの任意のものをコードする核酸を特徴とする。本明細書中で使用される場合は、「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、2つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび/またはリボヌクレオチドを意味し、これは、他の場所に明記されない限りは、自然界に存在しているヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする、自然界に存在しているヌクレオチドの公知のアナログを含む。いくつかの実施形態においては、核酸は組み換え体核酸である。「組み換え体核酸」によっては、目的の核酸が由来する生物体の自然界に存在しているゲノムの中で目的の核酸に隣接している1つ以上の核酸(例えば、遺伝子)が含まれていない目的の核酸を意味する。いくつかの実施形態においては、H−NOX核酸は、組み換え体核酸がH−NOXタンパク質(例えば、H−NOXタンパク質に由来する別のドメインを含むかまたはそれを含まないH−NOXドメイン)と、別のタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)の全体または一部が含まれている融合タンパク質をコードするように、別のタンパク質の全体または一部をコードする別の核酸に対して動作可能であるように連結される。したがって、この用語は、例えば、ベクターの中に、自律複製するプラスミドもしくはウイルスの中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAの中に組み込まれたか、あるいは、別の分子(例えば、cDNA、ゲノムDNA断片、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生産されたcDNA断片)として存在する、組み換え体DNAを含む。
本明細書中に記載される任意の野生型H−NOXタンパク質または変異H−NOXタンパク質は、薬学的組成物または非薬学的組成物の処方に使用することができる。以下でさらに議論されるように、これらの処方物は、様々な治療への応用および産業的応用に有用である。
Sciences、第18版、A.Gennaro,編,Mack Publishing Co.,Easton PA,,1990;およびRemington,The Science and Practice of Pharmacy 第20版,Mack Publishing,2000(これらはそれぞれが、特に処方物に関してその全体が参照として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)。
本明細書中に記載される任意の野生型H−NOXタンパク質または変異H−NOXタンパク質(例えば、単離または精製されたH−NOXタンパク質)あるいは薬学的組成物は、治療的応用において使用することができる。
Substitute to Determine Instantaneous Murine Right Ventricular Thickening with Optical Coherence Tomography」,Circulation 105:1843−1849(これが、特に光コヒーレンス・トモグラフィーに関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)が、赤血球によって曖昧にされる。H−NOX溶液での潅流により、循環および血管壁の鮮明な画像が可能となる。なぜなら、H−NOXタンパク質は赤血球よりもはるかに小さいからである。
本明細書中に記載されるH−NOXタンパク質および組成物はまた、多くのインビトロでの応用または産業的応用にも使用することができる(例えば、米国特許第6,455,676号(これは、特に、インビトロでの応用または産業的応用に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)。特定のH−NOXタンパク質は、特定の応用についての所望されるNO解離定数、O2解離定数、NO koff、O2 koff、NO反応性、NO安定性、自動酸化速度、血漿保持時間、半減期、または上記の2つ以上の任意の組み合わせに基づいて、そのような応用のために選択することができる。産業的応用の様々な実施形態においては、H−NOXタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質であっても、また、ヘムが結合したホロタンパク質であってもよい。
本明細書中に記載される任意のH−NOXタンパク質と適切なパッケージングが含まれている製品およびキットもまた提供される。いくつかの実施形態においては、本発明は、(i)H−NOXタンパク質(例えば、本明細書中に記載される野生型H−NOXタンパク質もしくは変異H−NOXタンパク質、または本明細書中に記載されているようなその処方物)と、(ii)個体にNOを送達するためのキットの使用についての説明書が含まれているキットを含む。様々な実施形態においては、本発明は、(i)H−NOXタンパク質(例えば、本明細書中に記載されている野生型H−NOXもしくは変異H−NOX、または本明細書中に記載されているようなその処方物)と、(ii)本明細書中に記載される任意の産業的な用途(例えば、溶液へのNOの添加、または溶液からのNOの除去)についてのキットの使用のための説明書が含まれているキットを特徴とする。
本発明によってはまた、本明細書中に記載される任意の変異H−NOXタンパク質の生産のための方法も提供される。いくつかの実施形態においては、この方法は、変異H−NOXタンパク質の生産に適している条件下で、変異H−NOXタンパク質をコードする核酸を有している細胞を培養する工程を含む。様々な実施形態においては、変異H−NOXはまた、精製(例えば、細胞または培養培地からのH−NOXタンパク質の精製)される。
Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59、およびKarow,D.S.ら、(2004年8月10日)「Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate Cyclase−Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis」,Biochemistry 43(31):10203−10211(これは、特に、組み換え体H−NOXタンパク質の変異、発現、および精製に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されている。これらの技術または他の標準的な技術を使用して、任意の変異H−NOXタンパク質を作成することができる。
Cleavage by Phosphorothioate Groups and
its Application to Oligonucleotide−Directed Mutagenesis」,Nucleic Acids Res.14(24):9679−9698;およびDenteら、(1985)DNA Cloning,Glover,編,IRL Press,791−802頁、(ii)Promegaキット(Promega Inc.,Madison,Wis.)、または(iii)Kunkel,T.A.(1985年1月)の方法に基づくBioradキット(Biorad Inc.,Richmond Calif.)「Rapid And Efficient Site−Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82(2):488−492;Kunkel,T.A.(1987)「Rapid And Efficient Site−Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection」,Methods Enzymol.154:367−382;Kunkel,米国特許第4,873,192号(これらはそれぞれ、特に、タンパク質の突然変異誘発に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)。突然変異誘発はまた、変異体オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を利用する手段のような、他の市販されている手段によって、または市販されていない手段によって行うこともできる。
Laboratory Press,New Yorkの205〜207頁、;Jones,D.H.ら、(1990年2月)「A Rapid Methods For Site−Specific Mutagenesis And Directional
Subcloning by Using the Polymerase Chain Reaction to Generate Recombinant Circles」,Biotechniques 8(2):178−183;Jones,D.H.ら、(1991年1月)「A Rapid Method For Recombination And Site−Specific Mutagenesis by Placing Homologous Ends on DNA Using Polymerase Chain Reaction」,Biotechniques 10(1):62−66(これらはそれぞれ、特に、タンパク質の突然変異誘発に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)。部位特異的突然変異誘発はまた、当業者に公知の技術を用いるカセット突然変異誘発を使用して行うこともできる。
野生型H−NOXタンパク質および変異H−NOXタンパク質の生産
野生型H−NOXタンパク質および変異H−NOXタンパク質を、原則として、Boon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59、およびKarow,D.S.ら、(2004年8月10日)「Spectroscopic Characterization of The Soluble Guanylate Cyclase−Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis」,Biochemistry 43(31):10203−10211(これらはいずれも、特に、H−NOXタンパク質の突然変異誘発、発現、および精製に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているとおりに、標準的な方法を使用して生産させ、発現させ、そして精製した。突然変異誘発は、Stratagene(La Jolla,CA)によるQuickChange(登録商標)プロトコルを使用して行った。細胞培養物中でのタンパク質の発現、およびその後のタンパク質の精製は、Karow,D.S.ら、(2004年8月10日)「Spectroscopic Characterization of the Soluble Guanylate
Cyclase−Like Heme Domains From Vibrio Cholerae And Thermoanaerobacter Tengcongensis」,Biochemistry 43(31):10203−10211に記載されているとおりに行った。
変異H−NOXタンパク質の特性決定
計算したNOに対するKD:konに対するkoffの比
計算したNOに対するKDを決定するために、H−NOXタンパク質についてのNOに対するkonの値を710μM−1s−1と仮定し、NOに対する解離速度(6−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質についてのkoff、または5−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質についてのk1もしくはk2)を、以下に記載するように決定した。
6−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質についてのkoff値
6−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質について、NOに対するkoffを、Boon,E.M.ら、(2006年8月)「Nitric Oxide Binding to Prokaryotic Homologs of the
Solube Guanylate Cyclase β1 H0NOX Domain」,J.Biol.Chem.281(31):21892−21902、およびBoon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59(これらはそれぞれ、特に、H−NOXタンパク質についてのNo koffの計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているとおりに計算した。簡単に説明すると、嫌気性の50mMのトリエタノールアミン、50mMのNaCl(pH7.5)緩衝液の中に稀釈したH−NOXタンパク質のFeII−NO複合体(5μMのヘム最終濃度)を、飽和させた一酸化炭素、および同じ緩衝液(嫌気性)の30mM(最終濃度)の亜ジチオン酸塩トラップ(Na2S2O4)と迅速に混合した(Kharitonov,V.G.ら、(1997)Biochemistry 36:6814−6818、およびMoore,E.G.ら、(1976)J.Biol.Chem.251:2788−2794(これらはそれぞれ、特に、NO解離速度の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)。CO結合がこれらの実験の律速段階ではないことは、以前に明らかにされている(Kharitonov,V.G.ら、(1997)Biochemistry 36:6814−6818)。これを、トラップとしてのCOを用いないで、30mMのNa2S2O4だけを使用した実験において確認した。データを、100μL〜1mLの大きさで、1cmの路長の石英キュベットを使用して、様々な温度(0〜70℃)に設定したNeslab RTE−100定温浴が備えられているCary
3E分光光度計(Cary 3E,Varian Inc.,Palo Alto,CA)上で、定期的にスキャンすることによって獲得した。ヘムからのNOの解離を、FeII−CO複合体の形成として、423nmでモニターした。スペクトルの差を、それぞれのその後のスキャンから最初のスキャンを減算することによって計算した。NO解離速度は、時間に対する423nmでの吸光度の増大と、Kaleidagraph 3.×(Synergy Software,Reading,PA)を使用したf(x)=A×(1−e−kx)の形の単一指数関数との適合によって決定した。具体的には、ヘム−COの濃度の単一指数関数的増大(NOトラップによるCOの結合が原因である)は、以下の方程式1によって記載することができる:
ΔAt=ΔAT(1−e−k1t) (方程式1)
式中、ΔAtは、時間tでの単一の振幅の変化であり;ΔATは、単一振幅の変化の合計であり、そしてk1は、観察された反応速度定数である。それぞれの実験は、最大6回行い、得られた速度を平均した。測定した解離速度はCOおよび亜ジチオン酸塩濃度(3mM、30mM、および300mMの亜ジチオン酸塩を試験した)とは無関係であった。
5−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質について、NOに対するkoffは、Winger,J.A.ら、(2007年1月)「Dissociation of Nitric Oxide from Soluble Guanylate Cyclase and Heme−Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs」,J.Biol.Chem.282(2):897−907(これは、特に、H−NOXタンパク質のNO koff、NO k1、およびNO k2の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように、NOに対するk1およびNOに対するk2によって記載される。簡単に説明すると、5−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質のヘムからのNOの解離を、以前に記載されているCO/亜ジチオン酸塩トラップ方法(Cray,S.P.L.ら、(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,102:13064−13069、およびKharitonov,V.G.ら、(1997)Biochemistry 36:6814−6818(これらはそれぞれ、特に、NO解離速度の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる))を使用して、37℃および10℃で測定した。トラップ溶液は以下のように調製した:50mMのHEPES(pH7.4)、50mMのNaCl中の亜ジチオン酸ナトリウム(Na2S2O4)の溶液を、嫌気性チャンバー(Coy Laboratory Products)を使用して、Teflon−sealed Reacti−Vial(Pierce)の中で調製した。溶液を嫌気性バイオチャンバーから取り出し、溶液全体に10分間気体を泡立たせることによって、COで飽和させた。H−NOXタンパク質−NO複合体を、50mMのHEPES(pH7.4)、50mMのNaCl中で25℃で10分間、過剰のDEA/NO(10mMのNaOH中)とともにインキュベーションすることによって形成させた。ニトロシル種への完全な変換を、Soret最大の431nm〜399nmへのシフトを追うことによって確認した。H−NOXタンパク質を、隔壁で密閉された嫌気性キュベット(100μL〜1mLの大きさの、1cmの路長を有している石英キュベット)に入れ、酸素を除去したガスプラント(oxygen−scavenged gas train)を使用して酸素除去した。少量のDEA/NO(3等量まで)を、ニトロシル種を維持するために酸素除去の直前に添加した(残りは全て、その後、トラップ溶液中の大過剰量のNa2S2O4によって崩壊された)。嫌気性キュベットの頭部の空間をCOで置き換え、キュベットとトラップ溶液をアッセイ温度で1分間平衡化させた。反応は、Hamilton gas−tight注射器での嫌気性キュベットへのCO/亜ジチオン酸塩溶液の添加と、混合によって開始させた。反応混合物中のNa2-S2O4の最終濃度は30mMであった。最終的なタンパク質濃度は
、β1(1−194)、β1(1−385)、およびβ2(1−217)については1.9〜2.5μM、sGCについては0.88〜2.5μMであった。データの収集は、トラップの添加の10秒後に開始した。反応を、Neslab RTE−100温度制御装置が取り付けられているCary 3E分光光度計(Cary 3E,Varian Inc.,Palo Alto,CA)を使用して、電気的吸収分光によってモニターした。データは、1.5nmのデータ点の間隔を用いて、380〜450nmの範囲全体について収集した。スペクトルは、全部で3時間の間あるいは反応が完了するまで、5分間は18秒おきに、10分間は1分おきに、そしてその後は2分おきに記録した。緩衝液のベースラインを、それぞれのスペクトルから減算し、スペクトルを、410nmでの等吸収点に対する正規化によって、ベースラインのそれについて補正した。スペクトルの差は、全てのその後のスペクトルからの0時スペクトルの減算によって得た。423nm(ΔA423;β1(1−194)およびβ1(1−385))または424nm(ΔA424;sGCおよびβ2(1−217))での吸光度の変化についての値をスペクトルの差から抽出し、それぞれの実験についての解離の経時変化を得るために時間に対してプロットした。解離の経時変化は、2連または3連で得、それぞれの実験を、数日間かけて2〜5回繰り返した。一般的には、多量の精製したsGCを得ることは比較的困難であるので、全長のsGCについてのΔA424の値(これらは、実験のタンパク質濃度と比例する)は、ヘムドメイン構築物よりも小さかった。
3.X(Synergy Software Reading,PA)を使用して行った。個々の解離実験によるデータを、観察した速度定数を得るために、以下の方程式2に示すような二重指数関数にフィットさせた。具体的には、方程式2は、ヘム−COの濃度の二重指数関数的増大(NOトラップによるCOの結合が原因である)を記載する:
ΔAt=ΔA1(1−e−k1t)+ΔA2(1−e−k2t) (方程式2)
式中、ΔAtは、時間tでの単一の振幅の変化であり;ΔA1およびΔA2は、単一振幅の変化の合計に対するそれぞれの指数プロセスの寄与であり、そしてk1およびk2は、それぞれのプロセスについて観察された反応速度定数である。
5−配位FeII−NO複合体と6−配位FeII−NO複合体の混合物が含まれているH−NOXタンパク質については、NOに対するkoffは、NOに対するk1とNOに対するk2によって記載される。NOに対するk1とk2は、Winger,J.A.ら、(2007年1月)「Dissociation of Nitric Oxide
from Soluble Guanylate Cyclase and Heme−Nitric Oxide/Oxygen Binding Domain Constructs」,J.Biol.Chem.282(2):897−907(これは、特に、H−NOXタンパク質のNO koff、NO k1、およびNO k2の計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように、5−配位FeII−NO複合体を有しているH−NOXタンパク質について上記に記載したように測定した。
計算したNOに対するKDのために、H−NOXタンパク質についてのNOに対するkonの値を710μM−1s−1と仮定した。これは、4℃で測定されたβ1(1−385)についての報告されたkonであり、37℃でも有意には増大しない(Zhao,ら、(1999)「A Molecular Basis for Nitric Oxide Sensing by Soluble Guanylate Cyclase」,PNAS.96:14753−14758(これは、特に、H−NOXタンパク質についてのNO konの計算に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)。したがって、計算されたO2に対するKDを、kon(710μM−1s−1と仮定した)に対するkoff、k1、またはk2のいずれかの比(上記のように測定した)を計算することによって決定した。
O2についての動力学的KD値を、原則として、Boon,E.M.ら、(2005)「Molecular Basis For NO Selectivity in Soluble Guanylate Cyclase」,Nature Chemical Biology 1:53−59(これは、特に、O2会合速度、O2解離速度、O2結合についての解離定数、自動酸化速度、およびNO解離速度の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているとおりに、野生型H−NOXタンパク質および変異H−NOXタンパク質について決定した。
ヘムに対するO2-の会合を、20℃での閃光光分解を使用して測定した。非常に速い
対再結合速度論の結果として、FeII−O2複合体をフラッシュオフ(flash off)させることは不可能であった;したがって、FeII−CO複合体について、560nmのレーザー光線での閃光光分解を行い(Hewlett−Packard,Palo Alto,CA)、5−配位FeII中間体を生じさせ、続いて、それに対する分子O2の結合を様々な波長で行った。タンパク質試料を、10mMの亜ジチオン酸塩での嫌気性還元、その後のPD−10カラム(Millipore,Inc.,Billerica,MA)上での脱塩によって作成した。その後、試料を、100μL〜1mLの大きさの、1cmの路長を有している人工空気石英キュベットの中の50mMのTEA、50mMのNaCl(pH7.5)緩衝液中に20μMのヘムとなるように希釈した。COガスをこのキュベットの頭部の空間全体に流して、FeII−CO複合体を形成させ、この形成を、UV−可視スペクトル分析(Soret最大423nm)によって確認した。この試料を、その後、なお1気圧のCOガス下での閃光光分解後のCO−再結合速度論を測定するために使用したか、またはこれを開き、O2−再結合事象を観察するために閃光光分解前に緩衝液を完全に酸化させるために30分間、空気中で攪拌するかのいずれかを行った。ヘムに対するO2の会合を、時間に対して複数の波長でモニターした。これらの記録を、Igor Proソフトウェア(Wavemetrics,Inc.,Oswego,OR;最新の2005年バージョン)を使用して単一指数とフィットさせた。この速度は、観察波長とは無関係であったが、O2濃度に依存していた。UV可視スペクトルを全体を通じて使用して、複合体と中間体の全てを確認した(Cary 3K,Varian,Inc.Palo Alto,CA)。一時的な吸光度のデータは、Dmochowski,I.J.ら、(2000年8月31日)「Enantiometric Discrimination of Ru−Substrate by Cytochrome P450cam」,J Inorg Biochem.81(3):221−228(これは、特に、機器に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されている機器を使用して収集した。機器は、20nsの反応時間を有しており、データを200メガ試料(megasample)s−1でデジタル化した。
koffを測定するために、嫌気性50mMのTEA、50mMのNACl(pH7.5)緩衝液中に希釈したタンパク質(5μMのヘム)のFeII−O2複合体を、様々な濃度の亜ジチオン酸塩を含む、および/またはCOガスで飽和されている等量の同じ緩衝液(嫌気性)と迅速に混合した。データを、20℃に設定したNeslab RTE−100定温浴が取り付けられているHI−TECH Scientific SF−61 ストップトフロー分光光度計(TGK Sientific LTD.,Bradford On Avon,United Kingdom)上で獲得した。ヘムからのO2の解離は、437nm(FeII−FeII−O2差スペクトルの最大)での吸光度、または425nm(FeII−FeII−CO差スペクトルの最大)の増大としてモニターした。最終的な記録を、機器の一部であるソフトウェアを使用して、単一指数関数にフィットさせた。それぞれの実験は、少なくとも6回行い、得られた速度を平均した。測定した解離定数は亜ジチオン酸塩濃度(100、50、25、10、5、および2.5mMの亜ジチオン酸塩を試験した)とは無関係であり、還元された種についてのトラップとしての飽和CO(10mMの亜ジチオン酸塩が存在する場合、およびそれが存在しない場合の両方)とも無関係であった。
O2についての動力学的KDを、上記のkoffおよびkonの測定を使用して、konに対するkoffの比を計算することによって決定した。
計算したKDを測定するために、上記のようにして得たkoffと動力学的KDの値をグラフにした。koffと動力学的KDの間での直線的関係は、方程式(y=mx+b)によって定義した。その後、koff値を線に沿って外挿し、Excel:MAC 2004(Microsoft,Redmond,WA)を使用して計算したKDを導いた。測定したkonがない場合には、この外挿により、KDに対してkoffを関係付ける方法が提供される。
自動酸化速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元させ、その後、嫌気性の50mMのTEA、50mMのNaCl(pH7.5)緩衝液中に5μMのヘムとなるように希釈した。これらの試料を、その後、37℃に設定したNeslab RTE−100定温浴が取り付けられているCary 3E分光光度計の中でインキュベートし、これを定期的にスキャンした(Cary 3E,Varian Inc.,Palo Alto,CA)。自動酸化速度は、時間に対してプロットしたFeIII−FeII差スペクトルの最大と最小の間の差と、Excel:MAC 2004(Microsoft,Redmond,WA)を使用した単一指数関数とのフィットから決定した。
NO反応性を、緩衝液Aの中に2μMで調製した精製したタンパク質(Tt WT HNOX、Tt Y140H HNOX、およびHomo sapiensヘモグロビン(Hs Hb))、ならびに緩衝液A中に200μMで調製したNOを使用して測定した(緩衝液A:50mMのHepes(pH7.5)、50mMのNaCl)。データは、20℃に設定したNeslab RTE−100定温浴が取り付けられているHI−TECH Scientific SF−61 ストップトフロー分光光度計(TGK Sientific LTD.,Bradford On Avon,United Kingdom)上で獲得した。タンパク質を、0.00125秒の積分時間で、1:1の割合でNOと迅速に混合した。最大変化の波長を、原則として、NOによる酸化の律速工程を測定することにより、分光光度計の一部であるソフトウェアを使用して単一指数関数にフィットさせた。反応の最終産物は、HNOXタンパク質についてはferric−NOであり、Hs Hbについてはferric−aquoであった。
所望される場合には、変異H−NOXタンパク質または野生型H−NOXタンパク質についてのp50値を、Guarnone,R.ら、(1995年9月/10月)「Performance Characteristics of Hemox−Analyzer For Assessment of The Hemoglobin Dissociation Curve」,Haematologica 80(5):426−430(これは、特に、p50値の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されているように測定することができる。p50値は、HemOx分析計を私用して決定した。測定チャンバーは0%の酸素で開始し、100%の酸素に向かって緩やかに徐々に上昇させた。チャンバーの中の酸素プローブにより、酸素飽和%を測定した。第2のプローブ(UV−Visスペクトル)により、2つの波長での吸光度を測定し、ヘムタンパク質(例えば、ヘムと錯体形成したH−NOXのようなタンパク質)のUV−Visスペクトルのαピークとβピークに波長を合わせた。これらの吸光度のピークは、ヘムタンパク質が酸素に結合するのに伴い、直線的に増大した。その後、非結合から100%の結合までの変化の割合を酸素率の値(%)に対してプロットした、曲線を作成した。p50は、ヘムタンパク質の50%が酸素に結合した、曲線上の点である。
所望される場合には、H−NOX溶液の粘性を、200/sの剪断速度で、CPE−40垂形支軸を有しているコーン/プレート血流計(モデルDV−III、Brookfiekd;Middleboro,MA)を使用して測定することができる。血液稀釈酸素送達実験において投与した1〜4センチポアズ(cP)の間の粘性を有している溶液が、安全であると報告されている(Winslow,R.M.ら、(2004年10月)「Comparison of PEG−Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat」,J Appl Physiol.97(4):1527−1534、米国特許第6,974,795号および同第6,432,918号(これらはそれぞれ、特に、粘性の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる))。したがって、いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質溶液の粘性は、1〜4cPの間である。
所望される場合には、コロイド浸透圧を、製造業者の説明書(モデル4420、Wescor;Logan,UT)にしたがってコロイド浸透圧計を使用して測定することができる。コロイド浸透圧を測定するための例示的な方法は、Vandegriff,F.D.ら、(1997年11月)「Colloid Osmotic Properties
of Modified Hemoglobins:Chemically Cross−Linked Versus Polyethylene Glycol Surface−Conjugated」,Biophys.Chem.69(1):23−30、「anaesthesiamcq.com/FluidBook/fl2_4.php;」にてworld−wide webの中、米国特許第6,974,795号および同第6,432,918号(これらはそれぞれ、特に、コロイド浸透圧の測定に関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)に記載されている。血液稀釈酸素送達実験において投与した20〜50mmHgの間のコロイド浸透圧を有している溶液が、安全であると報告されている(Winslow,R.M.ら、(2004年10月)「Comparison of PEG−Modified Albumin And Hemoglobin in Extreme Hemodilution in the Rat」,J Appl.Physiol.97(4):1527−1534)。したがって、いくつかの実施形態においては、H−NOXタンパク質溶液のコロイド浸透圧は、20〜50mmHgの間である。
NO担体H−NOX変異体についての心疾患モデル
2つの動物モデルを使用して、標準的な硝酸塩での治療に対して、NO担体としてのH−NOXタンパク質の効力を比較することができる。慢性心臓血管疾患のラットモデルにおいて、硝酸イソソルビド(ISDN)を用いた信頼できるNOの送達とH−NOXタンパク質の効果と比較するために、確立されているプロトコル(Shimamura,S.ら、(2006)、J Vet Med Sci Vol.68(3):213−7(これは、特に、心臓血管疾患のモデルに関して、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる)の適応は、雄のWistarラットを使用して行うことができる。心臓血管の肥大を刺激するために、腹部大動脈開腹術と、挿入した21ゲージ針の上での収縮点の適用(これはその後、均一な血管の収縮を可能にするために除去した)によって、腹部大動脈を収縮させた(腹部大動脈の収縮または「AC」モデル)。擬似手術を行ったラットには同様の外科手術を受けさせたが、ACは作成しなかった。外科手術後、ラットを1つのグループあたり14匹の動物(薬物について7匹、プラセボについて7匹)の処置グループに無作為に分け、7日間回復させた。グループについての処置(対照のグループを、プラセボとしてそれぞれの試験例において対にした)は以下である:(1)経口でsr−ISDNまたはプラセボを投与したACラット;(2)本明細書中に記載した1つ以上の野生型H−NOXタンパク質もしくは変異H−NOXタンパク質、またはプラセボ(例えば、不活化したH−NOXタンパク質)をIV投与したACラット;(3)および(4)それぞれ、(1)または(2)と同様に処置した擬似処置を行ったラット。処置は、12週間、1日に1回行い、その後、動物を屠殺し、心臓を、心筋細胞の形態、線維症、コラーゲンの沈着、心室径、大動脈の形態の決定のための標準的な組織病理学的分析のために、および疾患の進行もしくは予防を評価するための他の標準的な分析のために、取り出した。
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