KR20180123034A - 뇌졸중과 관련된 저산소증의 조절 - Google Patents

뇌졸중과 관련된 저산소증의 조절 Download PDF

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KR20180123034A
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아나 커톨리카
필베르타 륭
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옴니옥스, 인크.
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Abstract

본 발명은 뇌졸중 후 저산소성 조직에 산소를 전달하기 위한 H-NOX 단백질을 제공한다. H-NOX 단백질은 뇌졸중과 관련된 저산소성 반음영부위내로 유출되고 뇌졸중 관련된 저산소증의 부작용을 개선시키기 위하여 저산소성 조직에 지속적인 산소 전달을 위해 우선적으로 축적된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화 H-NOX 및 비-페길화 H-NOX를 포함한다.

Description

뇌졸중과 관련된 저산소증의 조절
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2016년 2월 16일에 출원된 미국 가특허 출원 62/296,009호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 상의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 상의 하기 제출물의 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다: 컴퓨터 판독가능한 형태(CRF)의 서열 목록(파일명: 627042001040SeqList.txt, 데이터 기록일: 2017년 2월 16일, 크기: 9 KB).
연방정부에 의해 지원된 연구 또는 개발에 관한 진술
본 연구는 1R43NS076272-01A1에 의해 지원되었다. 미국 정부는 본 출원에 대한 모든 특허 등록에서 권리를 갖는다.
기술 분야
본 출원은 H-NOX 단백질을 이용하여 장기 손상과 관련된 저산소증을 조절하는 방법에 관한 것이다.
H-NOX 단백질(헴-산화질소(Heme-Nitric oxide) 및 산소 결합 도메인에 대해 명명됨)은 고도로 보존되고 잘 규명된 헴단백질 패밀리의 구성원이다(Iyer, LM et al. (2003) BMC Genomics 4(1):5; Karow, DS et al. (2004) Biochemistry 43(31): 10203-10211; Boon, EM et al. (2005) Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, EM et al. (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, EM et al. (2005) J. Inorg. Biochem . 99(4):892-902; Cary, SP et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(37):13064-9; Karow DS et al. (2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SP et al. (2006) Trends Biochem Sci 31(4):231-9; Boon, EM et al. (2006) J Biol Chem 281(31):21892-902; Winger, JA et al. (2007) J Biol Chem. 282(2):897-907). H-NOX 단백질은 이전의 헤모글로빈계 산소 운반자와 달리, 산화질소-중성(nitric-oxide-neutral)이고, H-NOX는 순환하는 산화질소를 소거하지 않으며, 따라서 고혈압 또는 신장 부작용과 관련되지 않는다. 고유의 낮은 NO 반응성(및 높은 NO 안정성)은, 내인성 NO에 의한 H-NOX 단백질의 불활성화의 낮은 확률 및 H-NOX 단백질에 의한 내인성 NO의 낮은 소거 확률때문에, 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질이 바람직한 혈액 대체제가 되도록 한다. 중요하게는, 일부 H-NOX 단백질에서 말단 포켓 티로신의 존재(Pellicena, P. et al. (2004) Proc Natl. Acad Sci USA 101(35):12854-12859)는 바람직하지 못한, 높은 NO 반응성을 제안하여, 혈액 대체제로서의 사용을 금한다. 예를 들어, 유추에 의해, 구조적으로 유사한 말단 포켓 티로신을 가진, 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 헤모글로빈 단백질은 매우 신속하게 NO와 반응하며, 감염된 숙주에 의해 생산된 방어적 NO를 효과적으로 소거하고 피하기 위해 마이코박테리움에 의해 사용된다(Ouellet, H. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99(9):5902-5907). 하지만, H-NOX 단백질이 사실상 헤모글로빈의 NO 반응성보다 훨씬 더 낮은 NO 반응성을 가져서 그들이 혈액 대체재로서 사용가능하도록 한다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
NO에 결합하지만 O2에 결합하지 않는 H-NOX 단백질이 단일 아미노산 돌연변이의 도입에 의해 NO와 O2 둘 모두에 결합하는 H-NOX 단백질로 전환될 수 있음이 발견되었다(WO 2007/139791호 및 WO 2007/139767호 참조). 따라서, 02 및 NO에 대한 H-NOX 단백질의 친화성 및 O2와 NO 리간드 사이에서 구별하는 H-NOX 단백질의 능력이 하나 이상의 아미노산 돌연변이의 도입에 의해 변경되어, H-NOX 단백질이 원하는 친화성으로 O2 또는 NO에 결합하도록 조정되게 할 수 있다. 추가적인 돌연변이는 O2 및/또는 NO에 대한 친화성을 더 변경하기 위하여 도입될 수 있다. 따라서, H-NOX 단백질 패밀리는 O2 전달을 위한 개량된 또는 최적의 운동 및 열역학적 특성을 나타내기 위하여 조작될 수 있다. 예를 들어, 다양한 임상 및 산업적 응용을 위한 H-NOX 단백질의 유용성을 개선하는, O2 결합에 대한 변경된 해리 상수 및/또는 오프 레잇(off rate)을 가진 돌연변이체 H-NOX 단백질이 생성되었다. 상이한 "조정된" 산소 친화성을 가진 H-NOX 산소 결합 단백질은 암 및 뇌졸중과 같은 광범위한 특정 저산소성/허혈 병태에 허용가능한 특성을 가진 H-NOX 산소 운반자 패널의 제작을 가능하게 하였다. H-NOX 단백질이 O2에 결합하여 전달하도록 조정하는 능력은 현재의 O2 운반자의 중요한 단점을 해결하고 극복하는 치료 방안이다. 중합체 H-NOX 단백질 및 중합체 H-NOX 단백질을 이용하는 방법은 WO 2014/107171호 및 US 20150273024A1호에 의해 제공된다.
혈관 폐색 후, 두 가지 주요 손상 구역이 있다: 신속하게 사망하는 경색 코어(infarct core) 및 저산소성이고 경색 위험이 있는 주변 반음영부위(surrounding penumbra). 예를 들어, 반음영부위가 경색되는 것을 방지하기 위해 혈관 재개통(즉, 혈관내 +/- IV tPA)에 의해 혈류를 회복하는 것은 구조가능한 조직을 제시하는 급성 허혈성 뇌졸중 환자를 위한 관리의 새로운 표준이 되었다. 하지만, 모든 환자가 재개통으로 효과를 얻는 것은 아니며, 반음영부위는 재개통이 발생할 수 있기 전에 여전히 경색을 일으킨다. 성공적이거나 부분적인 재관류에 관계없이, 구조된 반음영부위 내에서의 이차적 저산소성 이벤트는 적절하지 못한 임상적 회복의 이유가 될 수 있는 선택적 신경 소실(SNL)을 야기할 수 있다. H-NOX 단백질은 저산소성 조직에서 특이적으로 산소를 방출하고, 재관류된 반음영부위 내에서 원치않는 결과를 방지하기 위하여 저산소증을 감소시키도록 조정될 수 있다. 일부 치료 용도를 위해 필요한 것은 O2를 전달하기 위하여 장기 손상(예를 들어, 뇌 손상)과 관련된 저산소성 반음영부위를 침투하고 장기(예를 들어, 뇌)의 기능 및 장기 손상을 가진 개체의 전체적인 웰빙을 개선할 수 있는 H-NOX이다.
특허 출원 및 간행물을 비롯한, 본원에서 인용된 모든 문헌은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 뇌졸중 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중이다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 일과성 허혈 발작을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 일과성 허혈 발작 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 저산소 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 저산소 뇌 손상 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다.
상기 양태의 일부 실시형태에서, H-NOX는 뇌졸중과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 일과성 허혈 발작과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영에 O2를 전달한다. 일부 실시형태에서, H-NOX의 투여는 저산소성 반음영부위에서 염증을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 개체는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상의 결과로서 뇌의 지속적인 저관류를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 폐색 부위 또는 반음영부위에서의 성상세포, 소교세포 및/또는 대식세포의 활성화를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작과 관련된 감각운동 결함을 감소시킨다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX와 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비는 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9이다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 조성물 내에 있다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 방법의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 동시에 또는 순차적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 동시에 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 순차적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 또는 약 24 시간 초과에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 결합된 H-NOX는 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 1 시간, 1 일, 2 일 또는 3 일 중 하나 이상에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 결합된 H-NOX는 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 1 일, 및 약 2 일에 투여된다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 방법의 개체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 방법의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 동일한 H-NOX 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 상이한 H-NOX 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스(T. tengcongensis) H-NOX, 엘. 뉴모필리아(L. pneumophilia) 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스(H. sapiens) β1, 알. 노르베지쿠스(R. norvegicus) β1, 씨. 루푸스(C. lupus) H-NOX, 디. 멜란가스터(D. melangaster) β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스(C. elegans) GCY-35, 엔. 펑티포르메(N. punctiforme) H-NOX, 씨. 크레센투스(C. crescentus) H-NOX, 에스. 오네이덴시스(S. oneidensis) H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰(C. acetobutylicum) H-NOX이다.
일부 실시형태에서, 본 방법의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 방법의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인은 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온(foldon) 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴드온 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 삼량체의 1, 2, 또는 3 개 단량체 모두가 서열 번호 8에 개시된 서열을 포함하는, 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합된다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배(two orders of magnitude) 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 100배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 1000배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.65 s-1 이하이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화(autoxidation)의 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX가 다른 치료법과 조합되어 투여되는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 다른 치료법은 조직 플라스미노겐 활성인자 및/또는 재개통 또는 신경보호제를 이용한 치료이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 투여는 다른 치료 이전, 치료 동안 또는 치료 후이다.
일부 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 H-NOX를 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비는 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9이다.
일부 실시형태에서, 본 조성물의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 동일한 H-NOX 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 상이한 H-NOX 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 H-NOX, 엘. 뉴모필리아 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베지쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스터 β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 펑티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰 H-NOX이다.
일부 실시형태에서, 본 조성물의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인은 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴드온 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 삼량체의 1, 2, 또는 3 개 단량체 모두가 서열 번호 8에 개시된 서열을 포함하는, 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합된다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 100배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 1000배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.65 s-1 이하이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화의 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 H-NOX를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 H-NOX를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 이때 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 H-NOX를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공하며, 이때 조성물은 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 의약의 제조에서 H-NOX를 포함하는 조성물의 용도를 제공하며, 이때 조성물은 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX의 치료적 유효량 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 치료적 유효량을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비는 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9이다. 일부 실시형태에서, 키트는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상 후 개체에게 산소를 전달하기 위한 방법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상을 치료하기 위한 방법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달한다. 일부 실시형태에서, 개체는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상의 결과로서 뇌의 지속적인 저관류를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 폐색 부위 또는 반음영부위에서의 성상세포, 소교세포 및/또는 대식세포의 활성화를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작과 관련된 감각운동 결함을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX와 투여된다.
일부 실시형태에서, 키트의 H-NOX는 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비로 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 조성물 내에 있다.
일부 실시형태에서, 키트의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 동시에 또는 순차적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 동시에 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 순차적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 또는 약 24 시간 초과에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 결합된 H-NOX는 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 1 시간, 1 일, 2 일 또는 3 일 중 하나 이상에 투여된다. 일부 실시형태에서, PEG에 결합된 H-NOX는 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 1 일, 및 약 2 일에 투여된다.
일부 실시형태에서, 키트는 개체에서의 사용을 위한 것이며, 이때 개체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
일부 실시형태에서, 키트의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 동일한 H-NOX 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 상이한 H-NOX 단백질로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 H-NOX, 엘. 뉴모필리아 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베지쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스터 β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 펑티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰 H-NOX이다.
일부 실시형태에서, 본 키트의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 키트의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인은 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴드온 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, PEG에 공유 결합된 H-NOX 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX는 삼량체의 1, 2 또는 3 개 단량체 모두가 서열 번호 8에 개시된 서열을 포함하는, 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합된다.
상기 양태 및 실시형태의 일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 100배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 1000배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.65 s-1 이하이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화의 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 조직 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 저산소성 스트레스 하에 있는 개체에서 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 조직 저산소증의 결과를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 저산소성 스트레스의 결과는 세포 기능의 상실 및/또는 세포 사멸이다. 일부 실시형태에서, 세포 기능의 상실 및/또는 세포 사멸은 장기(예를 들어, 뇌) 및/또는 신체 기능장애를 유도한다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 10 mg/kg 내지 약 400 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 10 ml 내지 약 1 L의 부피로 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 30분 미만의 기간에 걸쳐 볼루스(bolus)로서 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 30 분 내지 약 7 일의 기간에 걸쳐 주입에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 저산소성 조직에 직접적으로 투여되거나 또는 전신성으로(예를 들어, 정맥내로) 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스에 의해 개체에게 투여되고, 이어서 약 30 분 내지 약 7 일의 기간에 걸쳐 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 약 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일보다 긴 기간에 걸쳐 주입에 의해 개체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 저산소성 조직은 저관류를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 저산소성 조직은 혈관 폐색 또는 출혈과 관련된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 장기 손상(예를 들어, 뇌 손상) 또는 사지 손상과 관련된 저산소성 반음영부위에서의 저산소증을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기(예를 들어, 뇌) 또는 사지에서의 저산소증의 결과를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기 또는 사지에서의 저산소증과 관련된 세포 사멸 및 기능장애를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 저산소성 조직의 염증을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기 또는 사지와 관련된 저산소성 반음영부위의 염증을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기 및/또는 손상된 장기 또는 사지와 관련된 저산소성 반음영부위에서의 염증성 세포의 활성화를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 염증성 세포는 대식세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 호중구, 단핵구, 호산구, 호염기구 및/또는 소교세포이다.
일부 실시형태에서, 장기는 근골격계, 호흡기관, 소화기관, 비뇨기관, 순환기관, 생식계, 신경계의 장기이거나, 또는 피부 또는 내분비선이다. 일부 실시형태에서, 장기는 뇌, 심장, 간, 신장, 비장 또는 폐이다. 일부 실시형태에서, 저산소성 조직은 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 신생(emerging) 뇌졸중, 또는 일과성 허혈 발작의 결과이다.
일부 실시형태에서, 개체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 애완동물, 실험 연구 동물, 또는 가축이다. 일부 실시형태에서, 애완동물, 연구 동물, 또는 가축은 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니피그, 햄스터, 돼지, 또는 소이다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 H-NOX, 엘. 뉴모필리아 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베지쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스터 β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 펑티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인은 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴드온 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 100배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 1000배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.65 s-1 이하이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화의 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 약학 조성물 내에 있다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 방법에 따라 개체에서 장기(예를 들어, 뇌)로의 저산소성 손상의 치료를 위한 H-NOX 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 방법에 따라 개체에서 장기(예를 들어, 뇌)로의 저산소성 손상의 치료를 위한 H-NOX 단백질을 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 단백질을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 이때 H-NOX 단백질은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체의 뇌에서 조직 저산소증을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다른 치료법과 함께 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법의 이전에, 그동안에, 또는 그 후에 전달된다. 일부 실시형태에서, 저산소성 조직은 개체에서 뇌졸중과 관련된다. 일부 실시형태에서, 다른 치료법은 폐색된 혈관의 화학적 또는 기계적 재개통이다. 일부 실시형태에서, 다른 치료법은 조직 플라스미노겐 활성인자의 투여이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 H-NOX 단백질의 볼루스를 투여한 후 개체에게 H-NOX를 주입하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일보다 긴 기간에 걸쳐 주입에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, 주입은 개체에게 H-NOX의 볼루스가 투여된 후 즉시 또는 투여된 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간에 시작된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법과 함께 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법 이전에, 그동안에 또는 그 후에, 볼루스 및/또는 주입에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, 다른 치료법은 조직 플라스미노겐 활성인자의 투여 또는 기계 장치를 이용한 폐색 혈관의 재개통이다. 일부 실시형태에서, 다른 치료법은 조직 플라스미노겐 활성인자의 투여이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 전신성으로(예를 들어, 정맥내로, 근육내로, 피하로) 폐색 부위에(예를 들어, 두개내), 뇌에, 또는 CSF에 전달된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX의 치료적 유효량을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중 후 반음영부위에 O2를 전달하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 저산소 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 저산소 뇌 손상을 가진 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 일과성 허혈 발작을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 일과성 허혈 발작 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 뇌졸중 후 개체에서 혈관 폐색 또는 출혈과 관련된 저산소성 반음영부위에서의 염증을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개체는 뇌졸중, 저산소 뇌 손상, 일과성 허혈 발작, 뇌혈관 연축 또는 뇌동맥류 회복의 결과로서 지속적인 뇌의 저관류를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 반음영부위에서의 성상세포, 소교세포, 대식세포의 활성화 및 신경 손상/사멸을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 경색 용적을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 뇌졸중, 저산소 뇌 손상, 일과성 허혈 발작, 뇌혈관 연축, 또는 뇌동맥류 회복과 관련된 감각운동 결함을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 뇌에서의 저산소성 조직의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 뇌에서 저산소성 조직이 발생할 위험이 있는 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 뇌에서 저산소성 조직을 가질 위험이 있는 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뇌에서 저산소성 조직을 가질 위험이 있는 개체는 뇌졸중의 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 뇌졸중을 가질 위험이 있는 개체는 일과성 허혈 발작 또는 뇌혈관 연축, 또는 뇌동맥류 회복을 가졌다.
일부 실시형태에서, 개체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 애완동물, 실험 연구 동물, 또는 가축이다. 일부 실시형태에서, 애완동물, 연구 동물, 또는 가축은 개, 고양이, 말, 원숭이, 토끼, 래트, 마우스, 기니피그, 햄스터, 돼지, 또는 소이다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 H-NOX, 엘. 뉴모필리아 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베지쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스터 β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 펑티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX이다. 일부 실시형태에서, 위치 144에서의 아미노산 치환은 L144F 치환이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하며, 단량체는 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인은 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 삼량체화 도메인은 폴드온 도메인이다. 일부 실시형태에서, 폴드온 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 02 해리 상수는 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 100배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성 보다 적어도 1000배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.65 s-1 이하이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화의 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 약학 조성물 내에 있다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 뇌에서의 저산소증을 치료하기 위한 방법 중 임의의 방법에 따라 개체의 뇌에서의 저산소증을 치료하기 위한 H-NOX 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 방법에 따라 개체의 뇌에서의 저산소증의 치료를 위한 H-NOX 단백질을 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 단백질을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 이때 H-NOX 단백질은 본 명세서에 개시된 뇌에서의 저산소증을 치료하기 위한 방법 중 임의의 방법에서의 사용을 위한 것이다.
도 1a는 MCA에 가깝게 ET1의 두개내 주사 후 rCBF에서의 변화의 대표적 예를 보여준다. 비침습성 VP5 프로브를 이용하여 마취된 동물에서 레이저 도플러 유량계(Laser Doppler flowmetry)를 수행하고 ~ 7 시간 동안 측정한다.
도 1b는 어린(3 개월) 또는 나이든(7-10 개월) 래트에서 비히클 또는 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F)를 투여하기 전에 ET1 주사 후 rCBF 측정값을 보여준다. ET1 주사는 기준선 값에 비하여 평균 ~ 60% rCBF 감소를 야기하였다. 평균 ± SEM, n=15-25/그룹, *** 언페어드 t-테스트(unpaired t-test)에 의해 p<0.001.
도 2a는 피모니다졸 염색을 이용하는 래트 ET1-유도 tMCAO 모델에서의 저산소성 조직 발달의 검출을 보여준다. 조건 당 n = 3-4 래트.
도 2b 및 2g는 tMCAO 후 저산소증 및 경색 형성의 발달을 보여준다. tMCAO 후 1 시간 내지 7 일에 동물을 희생시키고 항-피모니다졸 항체(저산소증 용적) 또는 크레실 바이올렛 염색(경색 용적)을 이용하여 조직학(도 2b) 또는 ELISA(도 2c)를 위해 뇌를 처리하였다. 크레실 바이올렛-음성 및 피모니다졸-양성 영역을 매 1 mm 마다 9 좌표(coordinate) 수준에 걸친 섹션에서 정량하였다. 평균 ± SEM, 조직학을 위해서는 n=5/그룹; ELISA를 위해서는 n=10/그룹.
도 2c-2f는 ET1 tMCAO 모델에서 신경 사멸 및 신경아교증의 발달을 보여준다. tMCAO 후 1-7 일에 동물을 희생시켰다. NeuN(뉴런), 플루오로제이드(FluoroJade)(FJ; 신경퇴행), ED1(활성화된 소교세포/대식세포) 및 GFAP(성상세포)를 이용하여 뇌 섹션을 염색하였다. NeuN+(도 2c), FJ+(도 2d) 및 ED1+(도 2e) 세포의 수를 세고 GFAP 시그널(도 2f)에 의해 덮인 영역의 퍼센트를 경색 주변(peri-infarct) 영역에 위치한 피질의 2 비-중복 영역에서 8 섹션/좌표 수준에서 측정하였다. 평균 ± SEM. n=6-10/그룹.
도 3은 5-파라미터 피팅 모델을 이용하여 ELISA에 의해 정량된 대로, 래트에서 정맥내 주사 후 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F) 및 H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)의 혈장 수준을 보여준다.
도 4a 및 4b는 래트에서 ET1-유도된 tMCAO 후 파괴된 혈관구조를 통해 뇌 실질내로의 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F) 및 H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)의 유출을 보여준다. tMCAO 개시 후 1h에 단일 투여량의 H-NOX 또는 H-NOXP(400 mg/kg)를 투여하고, 폐색 후 2 시간(도 4a) 내지 24 시간(도 4b)에 동물을 안락사시켰다. 섹션을 항-H-NOX 및 CD31(내피 세포) 항체로 염색하였다. 개시 후 2h에 H-NOX가 혈관구조 밖으로 누출되었다. H-NOXP는 tMCAO 후 적어도 1d 동안 반음영부위에 축적되어, 누출성 BBB를 통과하여 유출되고 1d까지 지속되었다(경색 주변 패널). 대조적으로, H-NOXP는 정상 뇌 조직에서는 본래의 혈관구조에 남아 있었다(정상 뇌 패널).
도 5는 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F)(좌측 패널) 또는 H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)(우측 패널)의 투여 후 저산소성 조직 내 산소의 검출을 보여준다. 종양 용적이 ~ 400-600 mm3에 도달할 때(종양 세포 피하 이식 후 ~ 10-18 일), H460 피하 이종이식편 종양을 보유한 마우스를 사용하였다. 끝부분에서 직경이 230 ㎛인 중합체 매트릭스에서 유지된 루테늄 클로라이드 염료로 이루어진 4-채널 광섬유 산소-감지 장치(옥시라이트(OxyLite)TM, 영국 소재의 옥스포드 옵트로닉스(Oxford Optronix))를 이용하여 H460 종양에서 pO2를 측정하였다. 프로브 이식 후, H-NOX 또는 페길화된 H-NOX L144F를 정맥내 또는 종양 내로 주사하고 형광 켄칭을 시간의 함수로서 기록하였다.
도 6은 비히클(Veh) 또는 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F) + H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)의 1:1 혼합물을 투여한 후 6 시간에 래트 ET1 tMCAO 및 영구적 MCAO 모델(상부 패널) 및 양 심근 저산소증 모델(하부 패널)에서 피모니다졸 ELISA에 의해 정량된 저산소증 수준의 결과를 보여준다. 양을 위한 피모니다졸의 면역조직화학적 염색의 대표적 사진이 하부 패널상에 나타난다.
도 7a 및 7b는 ET1-유도된 tMCAO 후 저산소성 조직 소실의 방지를 보여준다. H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)(240 mg/kg) 또는 비히클(Veh)을 폐색 후 1 h에 투여하고 3일 동안 24 시간 마다 반복하였다. tMCAO 후 1-7 일에 경색 용적을 크레실 바이올렛 염색을 이용한 조직학에 의해 정량하였다(도 7a). 각 섹션에 대해 각 반구의 총 면적 및 경색 면적을 이미지제이(ImageJ)를 이용하여 측정하고, 경색 용적을 부종에 대해 교정하였다. 평균 ± SEM. n=8-10, 7 일에 언페어드 t-테스트에 의해 p=0.05. tMCAO 후 1-7 일에 경색 및 저산소성 조직 용적을 크레실 바이올렛 및 피모니다졸 염색에 의해 정량하였다(도 7b). 평균 ± SEM. Veh=12/그룹; H-NOXP=6/그룹. 제7일: Veh vs H-NOXP, 언페어드 t-테스트에 의해 p=0.05.
도 8a-8c는 ET1-유도된 tMCAO 후 6 시간에 저산소증 및 세포 사멸에 대한 H-NOX의 효과를 보여준다. H-NOX(삼량체 H-NOX L144F) + H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)의 1:1 혼합물(120 mg/kg 또는 240 mg/kg) 또는 비히클(Veh)을 tMCAO 후 30 분에 투여하였다. 래트를 ELISA에 의해 피모니다졸에 대해(도 8a) 또는 루미노미트리(luminometry) 분석(프로메가(Promega))에 의해 카스파제 9 활성에 대해(도 8b) 분석하였다. Veh: n=20; 120 mg/kg: n=10; 240 mg/kg: n=8. 평균 ± SEM. 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 및 스튜던츠 t 테스트(Student's t test)에 의해 ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05. H-NOXP 단독(240 mg/kg)을 tMCAO 후 1 시간에 투여하고 폐색 후 6 시간에 뇌를 수집하여 ELISA에 의해 피모니다졸 수준에 대해 분석하였다(도 8c). 평균 ± SEM. n=6-7/그룹.
도 9는 ET1-유도된 tMCAO 후 7 일에 염증의 H-NOX-매개된 감소를 보여준다. 비히클(Veh) 또는 H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)(240 mg/kg)를 폐색 후 1 h에 투여하고 3d 동안 24h 마다 투여를 반복하였다. 래트를 tMCAO 후 7 일에 희생시켰다. 섹션을 항-GFAP(성상세포) 및 항-ED1(활성화된 미세아교세포 및 대식세포)에 대해 염색하였다. ED1+ 세포를 세고 섹션에 걸쳐서 영역의 GFAP 퍼센트를 측정하였다. 평균 ± SEM. n=6-7/그룹. 스튜던츠 t-테스트에 의해 *p<0.05.
도 10은 tMCAO 후 1 시간에 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F)(400 mg/kg) 또는 비히클 대조군(Veh)으로 투여되고 3 일 동안 24 시간 마다 투여가 반복된 나이든 래트에서 MCAO 후 29 일에 경색 주변 영역에서의 NeuN 및 GFAP에 대한 면역조직화학적 염색을 보여준다. GFAP 시그널이 있는 경색 주변 영역에 위치한 피질의 2 비-중복 영역 내의 8 좌표/수준(1 mm 마다)에 걸친 섹션에서 신경 밀도(NeuN+ 세포에 의해 나타냄)를 정량하였다. 평균 ± SEM. n=6-7/그룹. 스튜던츠 t-테스트에 의해 *p<0.05.
도 11은 tMCAO 후 1 시간에 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F)(400 mg/kg) 또는 비히클(Veh)로 투여되고 3 일 동안 24 시간 마다 투여가 반복된 나이든 래트에서 감각 및 운동 기능을 조사하는 접착제 제거 분석의 결과를 보여준다. tMCAO 후 제1일, 제6일, 제13일 및 제29일에 감지 지연(latency)을 기록하였다. 이원반복분산분석(two way repeated measures ANOVA)에 의해 *p<0.05. Bsl = 기준선. 본페로니 테스트후 분석(Bonferroni post-test analysis)은 제6일과 제13일에 H-NOX 및 비히클 그룹이 유의하게 상이함을 보여주었다. 운동 기능 성능은 tMCAO 후 13일에 75초 이내에 성공적으로 테이프를 제거한 래트의 비율에 의해 평가하였다. 모든 포함된 래트가 손상되지 않은 발에서 테이프를 성공적으로 제거하였다(도시 안함). Veh(n=12), H-NOX(n=9). 평균 ± SEM. 양측 가설을 이용한 피셔 정확 검정(Fisher's exact test with two-sided hypothesis)에 의해 *p<0.05. 가짜(sham) 동물은 유의한 감각-운동 결함을 제시하지 않았다(도시 안함).
도 12는 tMCAO 후 2 시간에 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F)(240 mg/kg) 또는 비히클 대조군(Veh)으로 투여되고 3 일 동안 24 시간 마다 투여가 반복된 나이든 래트에서 운동 기능을 조사하는 접착제 제거 분석의 결과를 보여준다. tMCAO 후 제1일, 제3일, 제10일, 제24일 및 제28일에 제거 지연(sec)을 기록하였다. 이원반복분산분석에 의해 *p<0.05. 운동 기능 성능은 또한 tMCAO 후 20일에 60초 이내에 성공적으로 테이프를 제거한 래트의 비율에 의해 평가하였다. 모든 포함된 래트가 손상되지 않은 발에서 테이프를 성공적으로 제거하였다(도시 안함). 비히클(n=15), H-NOX(n=21). 평균 ± SEM. 이원반복분산분석(제거 지연)에 의해 *p<0.05 및 양측 가설을 이용한 피셔 정확 검정에 의해 *p<0.05(제거 성공). 가짜-작업된 동물은 어떤 유의한 감각-운동 결함도 제시하지 않았다(도시 안함).
도 13a 및 13b는 자발적 재관류동안 tMCAO 후 6 시간에 자유 라디칼에 대한 H-NOX의 효과를 보여준다. H-NOX(삼량체 H-NOX L144F) + H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)의 1:1 혼합물(400 mg/kg)을 tMCAO 후 1 시간에 투여하고 ELISA(옥시셀렉트(OxiSelect)TM)에 의해 단백질 카르보닐 함량에 대해(도 13a) 그리고 TBARs 분석(케이맨(Cayman))을 이용하여 지질 과산화에 대해(도 13b) tMCAO 후 6 시간에 뇌를 분석하였으며, 이들 두 마커는 산화 스트레스의 지표로서 널리 인정된다. 평균 ± SEM, n=6-8 래트/그룹, ns: 스튜던츠 t 테스트에 의해 유의하지 않음. C: 대측, I: 동측.
도 14는 비히클 대조군(Veh) 또는 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F) + H-NOXP(페길화된 삼량체 H-NOX L144F)의 1:1 혼합물 과량(tPA 양의 100배)을 이용한 시험관내 tPA 활성 분석을 보여준다.
도 15는 뇌졸중과 관련된 뇌에서의 저산소증을 치료하기 위한 H-NOX의 가능성을 입증하는 도식을 보여준다.
도 16a 및 16b는 영구적 MCAO(pMCAO) 모델에서 경색 용적과 저산소증을 보여준다. 경색 용적은 TTC 염색(도 16a)에 의해 분석하였으며, 저산소증은 피모니다졸 염색(도 16b)에 의해 측정하였다. 각각의 TTC-염색된 섹션에 대해(2 mm 마다 6 섹션), 각 반구의 총 면적 및 경색 면적을 이미지제이를 이용하여 측정하였다. 부종에 대해 교정된 경색 용적을 계산하였다. 평균 +/- SEM(n=4). 피모니다졸(60 mg/kg)을 희생시키기 전 2 시간에 정맥내 주사하였으며 뇌 섹션을 항-피모니다졸 항체로 염색하거나 조직을 ELISA에 의해 분석하였다.
도 17a 및 17b는 pMCAO 모델에서 H-NOX(삼량체 H-NOX L144F)의 투여에 대한 결과를 보여준다. H-NOX(240 mg/kg)를 폐색 후 1 시간에 투여하였다. 동물을 pMCAO 후 2 시간에 안락사시키고 뇌 섹션을 항-H-NOX 및 항-CD31 항체로 염색하거나(도 17a), 또는 pMCAO 후 6 시간에 안락사시키고 뇌를 수집하여 ELISA에 의해 피모니다졸에 대해 그리고 루미노미트리에 의해 카스파제 9 활성에 대해 분석하였다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 일과성 허혈 발작을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 저산소 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 저산소 뇌 손상은 저산소 뇌 손상, 혈관 폐색 및 뇌의 출혈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이론에 구애되지 않고, PEG에 결합되지 않은 H-NOX는 허혈 손상 후 저산소증의 부위에 O2의 신속한 전달을 제공하는 반면, PEG에 결합된 H-NOX는 저산소성 조직에서 축적되고 저산소성 조직의 경색을 감소시키기 위하여 O2의 더 장기적인 전달을 제공한다. 놀랍게도 페길화된 H-NOX와 비-페길화된 H-NOX의 혼합물은 뇌에서 반응성 산소종(ROS)을 증가시키지 않는다. 뇌졸중 후 뇌에 O2를 전달하기 위한 이전의 시도들은 재관류 세팅에서 ROS를 증가시키는 것으로 나타났다(Thom, SR, 1985, J Appl Physiol. 106(3):988-995).
일부 양태에서, 본 발명은 뇌졸중 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 일과성 허혈 발작 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 저산소 뇌 손상 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하며, 이때 H-NOX는 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함한다.
본 발명은 H-NOX 단백질이 뇌 혈액 장벽을 통해 유출되어 저산소성 조직에 우선적으로 축적되어 장기 손상(예를 들어, 뇌 손상)과 관련된 저산소성 조직에 산소를 공급하는 방법을 제공한다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 대부분의 작용제가 혈액 뇌 장벽을 통과하지 못하기 때문에 이것은 놀랍다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기(예를 들어, 뇌)로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 저산소 스트레스 하에 있는 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기(예를 들어, 뇌)로의 손상과 관련된 저산소증의 결과를 감소시키는 방법을 제공한다(예를 들어, 감각운동 결함, 보행 결함, 인지 결함, 언어능력 결함 등). 일부 실시형태에서, 본 발명은 다른 치료법과 함께 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX 단백질의 볼루스를 투여한 후 이어서 개체에게 H-NOX를 주입하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 장기(예를 들어, 뇌)로의 손상과 관련된 저산소증 후 산소를 전달하는 단백질, 조성물, 키트 및 방법을 제공한다.
정의
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어의 의미는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미이다. 당업자는 또한 본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법과 재료가 또한 본 발명을 실시하거나 시험하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서의 사용을 위해, 달리 명확하게 나타내지 않으면, 용어 "a", "an" 등의 사용은 하나 이상을 말한다.
본 출원에서, 명백하게 개시되거나 당업자에 의해 이해되지 않으면 "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 다중종속 청구항의 맥락에서, "또는"의 사용은 하나보다 많은 이전의 독립항 또는 종속항을 인용한다.
본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시형태를 포함한다(그리고 개시한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본 명세서에 개시된 발명의 양태 및 실시형태는 양태 및 실시형태를 "포함"하고, "이루어지고", 그리고 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위하여 상호교환되어 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 그러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 삼량체 및 아미노산 잔기의 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전장(full-length) 단백질 및 그 단편 둘 모두가 이 정의에 의해 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 당화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위하여, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한은, 천연 서열에 대한 결실, 부가 및 치환(일반적으로 특성이 보존적)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 말한다. 이들 변형은 부위-지시된 돌연변이유발을 통해서처럼, 의도적일 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 에러를 통해서와 같이, 우연한 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 단백질은 공유적으로 또는 비-공유적으로 관련된 둘 이상의 서브유닛을 포함할 수 있으며; 예를 들어, 단백질은 둘 이상의 관련된 단량체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산 분자", "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환되어 사용될 수 있으며, 뉴클레오티드의 중합체를 말한다. 그러한 뉴클레오티드의 중합체는 천연 및/또는 비-천연 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, DNA, RNA, 및 PNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "핵산 서열"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 선형 서열을 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, "H-NOX 단백질"은 H-NOX 도메인(헴-질산 및 산소 결합 도메인에 대해 명명됨)을 가진 단백질을 의미한다. H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인에 더하여 하나 이상의 다른 도메인을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 일부 예에서, H-NOX 단백질은 구아닐일 사이클라제 도메인을 포함하지 않는다. H-NOX 단백질은 중합 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "중합체 H-NOX 단백질"은 둘 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 H-NOX 단백질이다. H-NOX 도메인은 공유적으로 또는 비-공유적으로 관련될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "H-NOX 도메인"은 헴에 의해 질산 및/또는 산소에 결합하는 단백질의 전부 또는 일부이다. H-NOX 도메인은 헴을 포함하거나 헴에 결합할 수 있는 아포프로단백질로서 발견될 수 있다. 일부 예에서, H-NOX 도메인은 6개 알파-헬릭스, 이어서 2개 베타-쇄, 이어서 하나의 알파-헬릭스, 이어서 2개 베타 쇄를 포함한다. 일부 예에서, H-NOX 도메인은 서열 번호 2에 개시된 써모언에어로박터 텡콘젠시스(Thermoanaerobacter tengcongensis) H-NOX의 H-NOX 도메인에 해당한다. 예를 들어, H-NOX 도메인은 서열 번호 2에 개시된 써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX의 H-NOX 도메인에 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 서열 번호 2에 개시된 써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX의 H-NOX 도메인에 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "중합 도메인"은 중합체 구조를 형성하기 위한 단량체 모이어티의 관련을 촉진하는 도메인(예를 들어, 폴리펩티드 도메인)이다. 예를 들어, 중합 도메인은 중합체 H-NOX 단백질을 생성하기 위하여 단량체 H-NOX 도메인의 관련을 촉진할 수 있다. 예시적인 중합 도메인은 T4 박테리오파아지의 폴드온 도메인이며, 이것은 삼량체 폴리펩티드의 형성을 촉진한다. 중합 도메인의 다른 예는 Arc, POZ, 감긴 코일(coiled coil) 도메인(GCN4, 류신 지퍼, 벨크로(Velcro) 포함), 유테로글로빈(uteroglobin), 콜라겐, 3-쇄 감긴 코일(마트리린(matrilin)-1), 트롬보스포린, TRPVl-C, P53, Mnt, 아바딘, 스트렙타비딘, Bcr-Abl, COMP, 베로톡신(verotoxin) 서브유닛 B, CamKII, RCK, 및 N 에틸말레이미드-민감성 융합 단백질로부터의 도메인, STM3548, KaiC, TyrR, Hcpl, CcmK4, GP41, 탄저병 보호성 항원, 에어로리신(aerolysin), a-헤모리신, C4b-결합 단백질, Mi-CK, 아릴설파타제 A, 및 바이러스 캡시드 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용될 때, "아미노산 링커 서열" 또는 "아미노산 스페이서 서열"은 단백질의 두 도메인을 연결하기 위하여 이용될 수 있는 짧은 폴리펩티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10보다 많은 아미노산 길이이다. 예시적인 아미노산 링커 서열은 Gly-Ser-Gly 서열 및 Arg-Gly-Ser 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용될 때, "His6 태그(tag)"는 폴리펩티드에 부착된 6개 His 잔기를 포함하는 펩티드를 말한다. His6 태그는 예를 들어, His6 태그에 대해 특이적인 크로마토그래피를 이용하여, 단백질 정제를 촉진하기 위하여 이용될 수 있다. 정제 후, His6 태그는 엑소펩티다제를 이용하여 절단될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 둘 이상의 값 사이의 차이가 상기 값에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도로 둘 이상의 수치 값 사이에 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 실질적으로 유사한 값은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 50% 중 어느 하나 이하만큼 상이하다.
본 명세서에서 사용될 때, 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 두 값 사이의 차이가 상기 값에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 통계적으로 유의한 것으로 간주할 정도로 두 수치 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 상이한 두 수치 값은 약 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 중 임의의 하나 보다 크게 상이하다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 상이한 두 수치 값은 약 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% 또는 100% 중 임의의 하나만큼 상이하다.
"천연(native) 서열" 폴리펩티드는 자연에서 발견된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 유기체로부터의 자연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 분리되거나 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 구체적으로 폴리펩티드의 자연 발생 절단 또는 분비 형태(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 자연 발생 변이체 형태(예를 들어, 교번적으로 스플라이싱된 형태) 및 폴리펩티드의 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
폴리펩티드 "변이체"는 서열을 배열하고 최대 서열 동일성 %를 이루기 위하여 필요하면 갭을 도입하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 변이체는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80%, 90% 또는 95% 중 임의의 하나의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 약 80%-90%, 90%-95% 또는 95%-99% 아미노산 서열 동일성 중 어느 하나를 가질 것이다.
본 명세서에서 사용될 때, "돌연변이체 단백질"은 자연에서 발생하는 단백질에 비교할 때 하나 이상의 돌연변이를 가진 단백질을 의미한다. 일 실시형태에서, 돌연변이체 단백질은 자연에서 발생하는 모든 단백질의 서열과 상이한 서열을 가진다. 다양한 실시형태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 자연에서 발생하는 단백질의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99, 또는 99.5% 중 임의의 것만큼 동일하다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 자연에서 발생하는 단백질의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-95%, 95%-99% 또는 100% 중 임의의 것만큼 동일하다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 적어도 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 또는 400개 인접 아미노산 중 임의의 것을 함유하는 단백질 단편이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 약 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300, 또는 300-400개 인접 아미노산 중 임의의 것을 함유하는 단백질 단편이다. 서열 동일성은 예를 들어, 그안에 특정된 디폴트 파라미터를 가진 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 미국 WI 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 소재의 위스콘신 대학 바이오테크놀로지 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center)의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 이용하여 측정할 수 있다. 이 소프트웨어 프로그램은 다양한 아미노산 치환, 결실 및 다른 변형에 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매치한다.
본 명세서에서 사용될 때, "돌연변이"는 자연에서 발생하는 기준 핵산 또는 아미노산 서열에서의 변화를 의미한다. 예시적인 핵산 돌연변이는 삽입, 결실, 프레임쉬프트 돌연변이, 침묵 돌연변이, 넌센스 돌연변이 또는 미스센스 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 돌연변이는 침묵 돌연변이가 아니다. 예시적인단백질 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 삽입(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산의 삽입), 하나 이상의 아미노산의 결실(예를 들어, N-말단, C-말단, 및/또는 내부 잔기의 결실, 예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개, 또는 더 많은 아미노산 중 임의의 것의 결실 또는 약 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300, 또는 300-400개 아미노산 중 임의의 것의 결실), 하나 이상의 아미노산의 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산의 치환), 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합을 포함한다. 구체적 아미노산 돌연변이를 지칭할 때 사용되는 명명법은 먼저 야생형 아미노산을 식별하고, 이어서 잔기 번호 및 마지막으로 치환 아미노산을 식별한다. 예를 들어, Y140L은 잔기 번호 140에서 티로신이 류신에 의해 치환되었음을 의미한다. 유사하게, 변이체 H-NOX 단백질은 H-NOX 단백질의 아미노산 변이에 의해 지칭될 수 있다. 예를 들어, 티. 텡콘젠시스 Y140L H-NOX 단백질은 위치 번호 140의 티로신 잔기가 류신 잔기에 의해 치환된 티. 텡콘젠시스 H-NOX 단백질을 말하며 티. 텡콘젠시스 W9F/Y140L H-NOX 단백질은 위치 9의 트립토판 잔기가 페닐알라닌 잔기에 의해 치환되고 위치 번호 140의 티로신 잔기가 류신 잔기에 의해 치환된 티. 텡콘젠시스 H-NOX 단백질을 말한다.
"진화적으로 보존된 돌연변이"는 한 단백질에서의 아미노산이 동일한 단백질 계통 내의 다른 단백질의 상응하는 위치에서의 아미노산에 의해 치환되는 것이다.
본 명세서에서 사용될 때, "로부터 유래된"은 하나 이상의 돌연변이가 도입되는 단백질의 공급원을 말한다. 예를 들어, "포유동물 단백질로부터 유래된" 단백질은 야생형(즉, 자연에서 발생하는 서열) 포유동물 단백질의 서열내로 하나 이상의 돌연변이를 도입하여 생겨나는 관심 단백질을 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은 서열을 배열하고 최대 서열 동일성 퍼센트를 이루기 위하여 필요하면 갭을 도입하고 서열 동일성의 일부로서 어떤 보존적 치환도 고려하지 않은 후, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정할 목적을 위한 배열은 당업계의 기술 내의 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐서 최대 배열을 이루기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 배열을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "koff"는 단백질로부터 O2 또는 NO의 방출 속도와 같은 해리도(dissociation rate)를 말한다. 더 낮은 수치의 koff는 더 느린 해리도를 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, "kon"은 단백질로의 O2 또는 NO의 결합 속도와 같은 결합도를 말한다. 더 낮은 수치의 kon은 더 느린 결합도를 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, "해리 상수"는 "동적 해리 상수(kinetic dissociation constant)" 또는 "계산된 해리 상수(calculated dissociation constant)"를 말한다. "동적 해리 상수" 또는 "KD"는 당업자에게 알려지고/지거나 본 명세서에 개시된 방법을 비롯한 표준 방법(예를 들어, 표준 분광법, 유동 정지법(stopped-flow method) 또는 섬광 광분해 방법)을 이용하여 절대값으로서 결정된 KD 값과 같은, 동적 오프-레잇(kinetic off-rate)(koff) 대 동적 온-레잇(kinetic on-rate)(kon)의 비이다. "계산된 해리 상수" 또는 "계산된 KD"는 측정된 koff에 기초한 동적 해리 상수의 근사치를 말한다. kon을 위한 값은 본 명세서에 개시된 동적 KD와 koff 사이의 상관성을 통해 유도된다.
본 명세서에서 사용될 때, "산소 친화성"은 단백질의 헴 모이어티로의 산소 결합의 강도를 말하는 정성적 용어이다. 이 친화성은 산소에 대한 koff 및 kon 둘 모두에 의해 영향을 받는다. 수치적으로 더 낮은 산소 KD 값은 더 높은 친화성을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, "NO 친화성"은 단백질로의 NO 결합(예를 들어, 헴 기로의 또는 단백질과 관련된 헴 기에 결합된 산소로의 결합)의 강도를 말하는 정성적 용어이다. 이 친화성은 NO에 대한 koff 및 kon 둘 모두에 의해 영향을 받는다. 수치적으로 더 낮은 NO KD 값은 더 높은 친화성을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, "NO 안정성"은 산소의 존재 하에서 NO에 의한 산화에 대한 단백질의 안정성 또는 저항성을 말한다. 예를 들어, 산소의 존재 하에서 NO에 결합될 때 단백질이 산화되지 않는 능력이 단백질의 NO 안정성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 약 50, 40, 30, 10, 또는 5% 중 임의의 것 미만이 20℃에서 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 또는 20 시간 중 임의의 시간 동안 항온처리 후 산화된다.
본 명세서에서 사용될 때, "NO 반응성"은 헴-결합 단백질의 헴 내의 철이 산소의 존재 하에서 NO에 의해 산화되는 속도를 말한다. s-1 단위의 NO 반응성을 위한 더 낮은 수치 값은 더 낮은 NO 반응성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, "자동산화 속도"는 헴-결합 단백질의 헴 내의 철이 자동산화되는 속도를 말한다. s-1 단위의 더 낮은 수치의 자동산화 속도는 더 낮은 자동산화 속도를 나타낸다.
용어 "벡터"는 클로닝된 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 조작될 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 숙주 세포에서 증식될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 설명하기 위하여 이용된다. 벡터는 하기 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 복제 오리진, 관심 폴리펩티드의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서), 및/또는 하나 이상의 선택성 마커 유전자(예를 들어, 항생제 내성 유전자 및 비색 분석에서 사용될 수 있는 유전자, 예를 들어, β-갈락토시다제). 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 관심 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 벡터를 말한다.
"숙주 세포"는 벡터 또는 분리된 폴리뉴클레오티드의 수용체일 수 있거나 수용체였던 세포를 말한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 영장류 또는 비-영장류 동물 세포; 진균 세포, 예를 들어, 효모; 식물 세포; 및 곤충 세포를 포함한다. 예시적인 원핵 세포는 세균 세포; 예를 들어, 대장균(E. coli) 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "분리된"은 분자가 자연에서 전형적으로 함께 발견되거나 생산되는 성분중 적어도 일부로부터 분리된 분자를 말한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드가 생산된 세포의 성분 중 적어도 일부로부터 폴리펩티드가 분리될 경우 "분리된" 것으로 지칭된다. 폴리펩티드가 발현 후 세포에 의해 분비될 경우, 폴리펩티드를 생산한 세포로부터 폴리펩티드를 함유한 상등액을 물리적으로 분리하는 것은 폴리펩티드를 "분리"하는 것으로 간주된다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는 그것이 전형적으로 자연에서 발견되는 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 폴리뉴클레오티드의 경우에는 게놈 DNA 또는 미토콘드리아 DNA)의 일부가 아니거나 또는 예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드의 경우에는 그것이 생산된 세포의 성분 중 적어도 일부로부터 분리된 경우 "분리된" 것으로 지칭한다. 따라서, 숙주 세포 내의 벡터에 함유된 DNA 폴리뉴클레오티드는 "분리된" 것으로 지칭될 수 있다.
용어 "개체" 또는 "대상"은 동물, 예를 들어, 포유동물을 지칭하기 위하여 본 명세서에서 상호교환되어 사용된다. 일부 실시형태에서, 인간, 설치류, 유인원, 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 포유류 실험 동물, 포유류 가축, 포유류 스포츠 동물, 및 포유류 애완동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물의 치료 방법이 제공된다. 일부 예에서, "개체" 또는 "대상"은 질환 또는 장애를 위한 치료를 필요로 하는 개체 또는 대상을 말한다.
본 명세서에서 사용될 때 "질환" 또는 "장애"는 치료가 필요한 병태를 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "저산소성 반음영부위"는 혈류 및 따라서 산소 수송이 국소적으로 감소되어, 원래의 상해 위치 근처의 세포의 저산소증을 유도하는 손상 주위 영역을 말한다. 이러한 산소 부족은 저산소성 세포 사멸(경색)을 유도하고 손상으로부터 원래의 상해를 증폭시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "저관류"는 장기 또는 심장에서 먼 부위(예를 들어, 뇌)로의 혈액의 부적절한 공급을 말한다. 만일 저관류가 지속되면, 저산소증을 야기할 수 있으며 조직에게서 필요한 영양소, 산소 및 폐기물처리를 박탈할 수 있다. 일부 예에서 저관류는 뇌 조직 사멸 및 장기적 신경 기능장애를 야기할 수 있다.
용어 "암"은 제어되지 않는 세포 증식, 억제되지 않는 세포 성장 및 어팝토시스를 통한 세포 사멸 감소와 관련된 악성 증식성 장애를 말한다.
용어 "종양"은 비정상적으로 높은 수준의 증식과 성장을 나타내는 세포 그룹을 지칭하기 위하여 본 명세서에서 사용된다. 종양은 양성, 전암상태, 또는 악성일 수 있으며; 악성 종양 세포는 암성이다. 종양 세포는 고형 종양 세포 또는 백혈병 종양 세포일 수 있다. 용어 "종양 성장"은 종양의 크기에서의 상응하는 증가를 유도하는 종양을 포함하는 세포 또는 세포들에 의한 증식 또는 성장을 지칭하기 위하여 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용될 때, "치료"는 유익한 또는 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 명세서에서 사용될 때 "치료"는 인간을 비롯한 포유동물에서 질환을 위한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포괄한다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익하거나 원하는 임상 결과는 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 하나 이상의 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 확산의 방지 또는 지연(예를 들어, 장기 손상과 관련된 저산소성 반음영부위에서의 경색 감소), 질환 재발의 방지 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 완화, 질환 또는 질환 진행의 억제, 질환 또는 그의 진행의 억제 또는 늦춤, 질환 발생의 정지, 및 경감(부분적 또는 전체적). 증식성 질환의 병리학적 결과(예를 들어, 조직의 지속적인 저관류의 병리학적 결과)의 감소 또한 "치료"에 의해 포함된다. 본 발명의 방법은 치료의 이들 양태 중 어느 하나 이상을 고려한다.
용어 "억제" 또는 "억제하다"는 임의의 표현형적 특징의 감소 또는 중단 또는 그 특징의 발생, 정도 또는 가능성의 감소 또는 중단을 말한다. "감소" 또는 "억제"하는 것은 기준에 비교할 때 활성, 기능, 및/또는 양을 감소, 축소 또는 정지하는 것이다. 일부 실시형태에서, "감소" 또는 "억제"는 20% 이상의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 다른 실시형태에서, "감소" 또는 "억제"는 50% 이상의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 또 다른 실시형태에서, "감소" 또는 "억제"는 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, "질환의 발생의 지연"은 질환 또는 장애(예를 들어, 조직 저산소증 관련 질환 및 장애)의 발생을 연기, 방해, 늦춤, 지연, 안정화, 억제 및/또는 보류하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라, 시간의 길이가 변할 수 있다. 당업자에게 명백한 것처럼, 충분한 또는 유의한 지연은 개체가 그 질환을 일으키지 않는다는 점에서, 사실상 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이의 발생과 같은, 후기 단계 암이 지연될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "기준"은 비교 목적을 위해 사용되는 임의의 샘플, 표준, 또는 수준을 말한다. 기준은 건강한 및/또는 질환에 걸리지 않은 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 기준은 미처리 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 기준은 대상 개체의 미처리 샘플 상의 질환에 걸리지 않은 샘플로부터 수득된다. 일부 예에서, 기준은 대상 또는 환자가 아닌 하나 이상의 건강한 개체로부터 수득된다.
본 명세서에서 사용될 때, "방지"는 질환에 취약할 수 있지만 아직 질환으로 진단되지 않은 대상에서 질환의 발생 또는 재발에 대하여 예방을 제공하는 것을 포함한다.
작용제의 "유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 이루기 위하여, 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 동안, 효과적인 양을 말한다.
본 발명의 물질/분자, 아고니스트 또는 안타고니스트의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 물질/분자, 아고니스트 또는 안타고니스트가 개체에서 원하는 반응을 유발하는 능력과 같은 인자들에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 물질/분자, 아고니스트 또는 안타고니스트의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 양이다. 치료적 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다.
"예방적 유효량"은 원하는 예방 결과를 이루기 위하여, 필요한 투여량에서 그리고 필요한 기간 동안 효과적인 양을 말한다. 전형적으로 그러나 반드시는 아니지만, 예방적 용량은 질환 이전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되며, 예방적 유효량은 치료적 유효량 보다 적을 것이다.
용어 "약학 제형" 및 "약학 조성물"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이며, 제형이 투여되는 대상에게 허용할수 없도록 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다. 그러한 제형은 멸균되고 본질적으로 내독소가 없을 수 있다.
"약학적 허용 담체"는 대상에게 투여하기 위한 "약학 조성물"을 함께 구성하는 치료제와 사용하기 위한 본 기술분야에서 통상적인 비독성 고체, 반고체, 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 제형 보조제 또는 담체를 말한다. 약학적 허용 담체는 이용되는 투여량과 농도에서 수용체에게 비독성이며 제형의 다른 성분과 양립가능하다. 약학적 허용 담체는 이용되는 제형을 위해 적절하다.
"멸균" 제형은 무균성이거나 살아있는 미생물 및 그들의 포자가 본질적으로 없다.
하나 이상의 추가의 치료제와 "조합된" 투여는 동시(함께) 및 임의의 순서의 연속 또는 순차적 투여를 포함한다.
용어 "함께" 또는 "동시에"는 둘 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 사용되며, 이때 투여의 적어도 일부는 시간에서 중복되거나 또는 하나의 치료제의 투여가 다른 치료제의 투여에 대하여 짧은 시간 이내에 속한다. 예를 들어, 둘 이상의 치료제가 약 1 일 이하, 예를 들어, 약 60, 30, 15, 10, 5, 또는 1 분 중 임의의 시간 이하의 시간 간격으로 투여된다.
용어 "순차적으로"는 하나 이상의 작용제(들)의 투여가 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여의 중단 후 계속되는, 둘 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위하여 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 둘 이상의 치료제의 투여는 약 15 분 초과, 예를 들어, 약 20, 30, 40, 50, 또는 60 분, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 1 개월 중 임의의 시간의 시간 간격으로 투여된다.
본 명세서에서 사용될 때, "~와 함께"는 다른 치료 양식에 더하여 하나의 치료 양식을 투여하는 것을 말한다. 따라서, "~와 함께"는 개체에게 다른 치료 양식의 투여 이전, 투여 동안 또는 투여 후에 하나의 치료 양식을 투여하는 것을 말한다.
용어 "패키지 삽입물(package insert)"은 치료 제품의 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 치료법, 사용금지사유 및/또는 사용과 관련한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 패키지내에 관례적으로 포함된 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
"제조 물품(article of manufacture)"은 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 질환 또는 장애(예를 들어, 저산소증 관련 질환 또는 장애)의 치료를 위한 의약, 또는 본 명세서에 개시된 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품(예를 들어, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 일부 실시형태에서, 제조품 또는 키트는 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 홍보되거나, 배포되거나 판매된다.
H-NOX 단백질
H-NOX 단백질 패밀리의 개요
달리 나타내지 않으면, 임의의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질이 본 명세서에 개시된 조성물, 키트 및 방법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, "H-NOX 단백질"은 H-NOX 도메인(헴-질산 및 산소 결합 도메인에 대해 명명됨)을 가진 단백질을 의미한다. H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인에 더하여 하나 이상의 다른 도메인을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. H-NOX 단백질은 고도로 보존되고 잘 규명된 헴단백질 패밀리의 구성원이다(Iyer, L. M. et al. (February 3, 2003). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem . Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr . Opin . Chem . Biol . 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902). H-NOX 단백질은 또한 Pfam 07700 단백질 또는 HNOB 단백질로도 불린다(Pfam - 단백질 도메인 패밀리 배열 및 은닉 마르코프 모델(Hidden Markov Models)의 데이터베이스, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; 미국 MA 02111-1307 보스톤 59 템플 플레이스-스윗 330 소재의 GNU LGPL 프리 소프트웨어 파운데이션, 인크.(Free Software Foundation, Inc.)). 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 6개 알파-헬릭스, 이어서 2개 베타-쇄, 이어서 1개 알파-헬릭스, 이어서 2개 베타-쇄를 포함하는 이차 구조를 갖거나 또는 갖는 것으로 예상된다. H-NOX 단백질은 헴 또는 결합된 헴을 가진 홀로단백질(holoprotein)에 결합할 수 있는 아포단백질일 수 있다. H-NOX 단백질은 헴 기에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합할 수 있다. 일부 H-NOX 단백질은 NO에 결합하지만 02에는 결합하지 않으며, 다른 것들은 NO와 O2 둘 모두에 결합한다. 분리된 통성 호기균으로부터의 H-NOX 도메인은 NO에 결합하지만 O2에 결합하지 않는다. 편성 호기성 원핵생물, 씨. 엘레간스(C. elegans), 및 디. 멜라노가스터(D. melanogaster)로부터의 H-NOX 단백질은 NO와 O2에 결합한다. 포유동물은 2 가지 H-NOX 단백질을 가진다: β1 및 β2. 마우스, 래트, 소 및 인간 H-NOX 서열의 배열은 이들 종이 >99% 동일성을 보유함을 보여준다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 또는 전체 H-NOX 단백질은 자연 발생 써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX 단백질(예를 들어, 서열 번호 2) 또는 자연 발생 sGC 단백질(예를 들어, 자연 발생 sGC β1 단백질)의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99, 또는 99.5% 중 임의의 것만큼 동일하다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 또는 전체 H-NOX 단백질은 자연 발생 써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX 단백질(예를 들어, 서열 번호 2) 또는 자연 발생 sGC 단백질(예를 들어, 자연 발생 sGC β1 단백질)의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99, 또는 99-99.9% 중 임의의 것만큼 동일하다. 본 명세서에서 추가로 토의되는 바와 같이, H-NOX 단백질은 상응하는 자연 발생 H-NOX 단백질에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 선택적으로 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인에 더하여 하나 이상의 도메인을 포함한다. 구체적 실시형태에서, H-NOX 단백질은 다른 단백질로부터의 하나 이상의 도메인 또는 전체 서열을 포함한다. 예를 들어, H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 및 다른 단백질, 예를 들어, 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서는, H-NOX 도메인만이 존재한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 구아닐일 사이클라제 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 태그; 예를 들어, His6 태그를 포함한다.
중합체 H-NOX 단백질
일부 양태에서, 본 발명은 둘 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질을 제공한다. 둘 이상의 H-NOX 도메인은 공유적으로 연결되거나 비-공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체 형태이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 상동성 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 이종성 H-NOX 도메인을 포함하며; 예를 들어, H-NOX 도메인은 H-NOX 도메인의 특정 종의 아미노산 변이체를 포함하거나 또는 상이한 종으로부터의 H-NOX 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 중 적어도 하나는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 해당하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 적어도 하나의 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 도메인은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 둘 이상의 관련된 단량체를 포함한다. 단량체는 공유적으로 연결되거나 비공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 단량체 서브유닛은 단량체 서브유닛이 시험관내 또는 생체내에서 관련하여 중합체 H-NOX 단백질을 형성할 경우에 생산된다. 일부 실시형태에서, 단량체는 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합 도메인은 H-NOX 도메인에 공유적으로 연결되며; 예를 들어, H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 공유적으로 연결된다. 다른 실시형태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 스페이서가 H-NOX 도메인과 중합 도메인 사이에서 공유적으로 연결된다. "아미노산 스페이서" 및 "아미노산 링커"는 본 명세서에서 상호교환되어 사용된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질의 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 해당하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 삼량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질의 단량체는 H-NOX 도메인 및 T4 박테리오파아지의 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질의 단량체는 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질의 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 세 개의 단량체를 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 아미노산 링커, 예를 들어, Gly-Ser-Gly 링커를 가지고 폴드온 도메인에 연결된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 H-NOX 도메인은 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 H-NOX 도메인은 His6 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, His6 태그는 아미노산 링커, 예를 들어, Arg-Gly-Ser 링커를 가지고 폴드온 도메인에 연결된다. 일부 실시형태에서, 모든 H-NOX 도메인은 His6 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
티. 텡콘젠시스로부터의 예시적인 H-NOX 도메인은 대략 26.7 kDal이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 약 50 kDal, 75 kDal, 100 kDal, 125 kDal 중 임의의 것 초과 내지 약 150 kDal의 원자질량을 가진다.
본 발명은 개체에게 H-NOX 단백질의 투여 후에 단일 H-NOX 도메인을 포함하는 상응하는 단량체 H-NOX 단백질에 비교할 때 개체에서 하나 이상의 조직에서 더 큰 축적을 보여주는 중합체 H-NOX 단백질을 제공한다. 상응하는 H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 H-NOX 단백질의 단량체 형태를 말한다. 우선적인 중합체 H-NOX 축적의 조직은 손상된 혈관구조를 가진 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 개체에게 H-NOX 단백질의 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 6, 12 또는 24 시간 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 일 동안 포유동물에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 개체에게 H-NOX 단백질의 투여 후 약 1-2, 2-3, 3-4, 4-6, 6-12 또는 12-24 시간 또는 1-2 일, 2-4 일, 4-8 일, 8-10 일동안 또는 10일 보다 오랫동안 포유동물에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX의 약 10% 미만이 개체에게 H-NOX 단백질의 투여 후 약 1 시간, 2 시간 또는 3 시간 중 임의의 시간보다 짧은 시간 이내에 신장에 의해 포유동물로부터 소거된다.
H-NOX 단백질 및 H-NOX 도메인의 공급원
임의의 속 또는 종으로부터의 H-NOX 단백질 및 H-NOX 도메인이 본 명세서에 개시된 조성물, 키트 및 방법에서 사용될 수 있다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인은 포유동물(예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간, 원숭이, 고릴라, 유인원, 여우원숭이 등), 소, 말, 돼지, 개 또는 고양이), 곤충, 효모 또는 세균으로부터의 단백질 또는 도메인이거나 또는 그러한 단백질로부터 유래된다. 예시적인 포유동물 H-NOX 단백질은 야생형 인간 및 래트 가용성 구아닐레이트 사이클라제(예를 들어, β1 서브유닛)을 포함한다. H-NOX 단백질의 예는 야생형 포유동물 H-NOX 단백질, 예를 들어, 에이치. 사피엔스, 엠. 무스쿠루스(M. musculus), 씨. 파미리아리스(C. familiaris), 비. 타우루스(B. Taurus), 씨. 루푸스 및 알. 노르베지쿠스; 및 야생형 비-포유동물 척추동물 H-NOX 단백질, 예를 들어, 엑스. 래비스(X. laevis), 오. 라티페스(O. latipes), 오. 쿠리바투스(O. curivatus), 및 에프. 루브리페스(F. rubripes)를 포함한다. 비-포유동물 야생형 N0-결합 H-NOX 단백질의 예는 디. 멜라노가스터, 에이. 감비애(A. gambiae), 및 엠. 섹스타(M. sexta)의 야생형 H-NOX 단백질을 포함하며; 비-포유동물 야생형 O2-결합 H-NOX 단백질의 예는 씨. 엘레간스 gcy-31, gcy-32, gcy-33, gcy-34, gcy-35, gcy-36, 및 gcy-37; 디. 멜라노가스터 CG14885, CG14886, 및 CG4154; 및 엠. 섹스타 베타-3의 야생형 H-NOX 단백질을 포함하고; 원핵 야생형 H-NOX 단백질의 예는 티. 텡콘젠시스, 브이. 콜레라(V. cholera), 브이. 피쉐리(V. fischerii), 엔. 펑티포르메, 디. 데설푸리칸스(D. desulfuricans), 엘. 뉴모필라(L. pneumophila) 1, 엘. 뉴모필라 2, 및 씨. 아세토부티리쿰을 포함한다.
예시적인 H-NOX 단백질을 위한 NCBI 기탁 번호는 하기를 포함한다: 호모 사피엔스 β1[gi:2746083], 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus) β1 [gi:27127318], 드로소필라 멜란가스터(Drosophila melangaster) β1[gi:861203], 드로소필라 멜란가스터 CG14885-PA[gi:23171476], 캐노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) GCY-35[gi:52782806], 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme)[gi:23129606], 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus)[gi: 16127222], 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis)[gi:24373702], 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)(ORF 2)[CUCGC_272624], 클로스트리듐 아세토부티리쿰 (Clostridium acetobutylicum)[gi:15896488], 및 써모언에어로박터 텡콘 젠시스[gi:20807169]. 캐니스 루푸스(Canis lupus) H-NOX는 젠뱅크 기탁(GenBank accession) DQ008576에 의해 제공된다. 예시적인 H-NOX 단백질 및 도메인의 핵산 및 아미노산 서열이 도 37에 제공된다.
예시적인 H-NOX 단백질은 또한 그들의 유전자 명칭 및 이어서 그들의 종 약어 및 젠뱅크 식별자에 의해 열거되는 하기의 H-NOX 단백질을 포함한다(예를 들어, 2006년 5월 21일; 2006년 5월 22일; 2007년 5월 21일; 또는 2007년 5월 22일 현재 이용가능한 하기 단백질 서열, 이들은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨): Npun5905_Npu_23129606, alr2278_Ana_17229770, SO2144_Sone_24373702, Mdegl343_Mde_23027521, VCA0720_Vch_15601476,CC2992_Ccr_16127222, Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757), Mmc10739_Mcsp_22999020, Tar4_Tte_20807169, Ddes2822_Dde_23475919, CAC3243_Cac_15896488, gcy- 31_Ce_17568389, CG14885_Dm_24647455, GUCY1B3_Hs_4504215, HpGCS- beta1_Hpul_14245738, Gycbeta100B_Dm_24651577, CG4154_Dm_24646993 (gi:NP_650424.2, gi:62484298), gcy-32_Ce_13539160, gcy-36_Ce_17568391 (gi:32566352, gi:86564713), gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146), gcy-37_Ce_17540904(gi:71985505), GCY1a3_Hs_20535603, GCY1a2-Hs_899477, 또는 GYCa-99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayan et al. (2003). BMG Genomics 4:5-13). 이들 명칭에서 사용된 종 약어는 Ana - 아나배나(Anabaena) 종; Ccr - 카울로박터 크레센투스; Cac - 클로스트리듐 아세토부티리쿰; Dde - 데설포비브리오 데설푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans); Mcsp - 마그네토코커스(Magnetococcus) 종; Mde - 마이크로불비퍼 데그라단스(Microbulbifer degradans); Npu - 노스톡 펑티포르메; Rhsp - 로도박터 스패로이즈(Rhodobacter sphaeroides); Sone - 쉬와넬라 오네이덴시스; Tte - 써모언에어로박터 텡콘젠시스; Vch - 비브리오 콜레래; Ce - 캐노르합디티스 엘레간스; Dm - 드로소필라 멜라노가스터; Hpul - 헤미센트로투스 풀체리무스(Hemicentrotus pulcherrimus); Hs - 호모 사피엔스를 포함한다.
다른 예시적인 H-NOX 단백질은 그들의 유기체 명칭 및 Pfam 데이터베이스 기탁 번호에 의해 열거된 하기의 H-NOX 단백질을 포함한다(예를 들어, 2006년 5월 21일; 2006년 5월 22일; 2007년 5월 17일; 2007년 5월 21일; 또는 2007년 5월 22일 현재 이용가능한 하기 단백질 서열, 이들은 그 전체가 참고로 본원에 포함됨): 캐노르합디티스 브리그새(Caenorhabditis briggsae) Q622M5_CAEBR, 캐노르합디티스 브리그새 Q61P44_CAEBR, 캐노르합디티스 브리그새 Q61R54_CAEBR, 캐노르합디티스 브리그새 Q61V90_CAEBR, 캐노르합디티스 브리그새 Q61A94_CAEBR, 캐노르합디티스 브리그새 Q60TP4_CAEBR, 캐노르합디티스 브리그새 Q60M10_CAEBR, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY37_CAEEL, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY31_CAEEL, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY36_CAEEL, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY32_CAEEL, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY35_CAEEL, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY34_CAEEL, 캐노르합디티스 엘레간스 GCY33_CAEEL, 오리지아스 쿠르비노투스(Oryzias curvinotus) Q7T040_ORYCU, 오리지아스 쿠르비노투스 Q75WF0_ORYCU, 오리지아스 라티페스(Oryzias latipes) P79998_ORYLA, 오리지아스 라티페스 Q7ZSZ5_ORYLA, 테트라오돈 니그로비리디스(Tetraodon nigroviridis) Q4SW38_TETNG, 테트라오돈 니그로비리디스 Q4RZ94_TETNG, 테트라오돈 니그로비리디스 Q4S6K5_TETNG, 푸구 루브리페스(Fugu rubripes) Q90VY5_FUGRU, 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) Q6INK9_XENLA, 호모 사피엔스 Q5T8J7_HUMAN, 호모 사피엔스 GCYA2_HUMAN, 호모 사피엔스 GCYB2_HUMAN, 호모 사피엔스 GCYB1_HUMAN, 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla) Q9N193_9PRIM, 폰고 피그매우스(Pongo pygmaeus) Q5RAN8_PONPY, 팬 트로그로디테스(Pan troglodytes) Q9N192_PANTR, 마카카 무라타(Macaca mulatta) Q9N194_MACMU, 히로바테스 라르(Hylobates lar) Q9N191_HYLLA, 무스 무스쿨루스 Q8BXH3_MOUSE, 무스 무스쿨루스 GCYB1_MOUSE, 무스 무스쿨루스 Q3UTI4_MOUSE, 무스 무스쿨루스 Q3UH83_MOUSE, 무스 무스쿨루스 Q6XE41_MOUSE, 무스 무스쿨루스 Q80YP4_MOUSE, 래투스 노르베지쿠스 Q80WX7_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q80WX8_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q920Q1_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q54A43_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q80WY0_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q80WY4_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q8CH85_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q80WY5_RAT, 래투스 노르베지쿠스 GCYB1_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q8CH90_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q91XJ7_RAT, 래투스 노르베지쿠스 Q80WX9_RAT, 래투스 노르베지쿠스 GCYB2_RAT, 래투스 노르베지쿠스 GCYA2_RAT, 캐니스 파미리아리스(Canis familiaris) Q4ZHR9_CANFA, 보스 타우루스(Bos taurus) GCYB1_B0VIN, 수스 스크로파(Sus scrofa) Q4ZHR7_PIG, 그릴루스 비마쿠라투스(Gryllus bimaculatus) Q59HN5_GRYBI, 만두카 섹스타(Manduca sexta) O77106_MANSE, 만두카 섹스타 O76340_MANSE, 아피스 멜리페라(Apis mellifera) Q5UAF0_APIME, 아피스 멜리페라 Q5FAN0_APIME, 아피스 멜리페라 Q6L5L6_APIME, 아노펠레스 감비애(Anopheles gambiae) str PEST Q7PYK9_ANOGA, 아노펠레스 감비애 str PEST Q7Q9W6_ANOGA, 아노펠레스 감비애 str PEST Q7QF31_AN0GA, 아노펠레스 감비애 str PEST Q7PS01_ANOGA, 아노펠레스 감비애 str PEST Q7PFY2_ANOGA, 아노펠레스 감비애 Q7KQ93_ANOGA, 드로소필라 멜라노가스터 Q24086_DROME, 드로소필라 멜라노가스터 GCYH_DROME, 드로소필라 멜라노가스터 GCY8E_DR0ME, 드로소필라 멜라노가스터 GCYDA_DROME, 드로소필라 멜라노가스터 GCYDB_DROME, 드로소필라 멜라노가스터 Q9VA09_DROME, 드로소필라 슈도옵스쿠라(Drosophila pseudoobscura) Q29CE1_DR0PS, 드로소필라 슈도옵스쿠라 Q296C7_DROPS, 드로소필라 슈도옵스쿠라 Q296C8_DROPS, 드로소필라 슈도옵스쿠라 Q29BU7_DROPS, 아플리시아 칼리포르니카(Aplysia californica) Q7YWK7_APLCA, 헤미센트로투스 풀체리무스(Hemicentrotus pulcherrimus) Q95NK5_HEMPU, 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), Q5YLC2_CHLRE, 아나배나 종 Q8YUQ7_ANASP, 플라보박테리아 박테리움(Flavobacteria bacterium) BBFL7 Q26GR8_9BACT, 사이크로플렉서스 토르퀴스(Psychroflexus torquis) ATCC 700755 Q1VQE5_9FLA0, 해양 감마 프로테오박테리움(marine gamma proteobacterium) HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM, 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2207 Q1YTK4_9GAMM, 카울로박터 크레센투스 Q9A451_CAUCR, 애시디필리움 크립툼(Acidiphilium cryptum) JF-5 Q2DG60_ACICY, 로도박터 스패로이즈 Q3J0U9_RHOS4, 실리시박터 포메로이(Silicibacter pomeroyi) Q5LPV1_SILP0, 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) PD1222, Q3PC67_PARDE, 실리시박터 종 TM1040 Q3QNY2_9RHOB, 잔나스키아(Jannaschia) 종 Q28ML8_JANSC, 마그네토코커스(Magnetococcus) 종 MC-1 Q3XT27_9PROT, 레지오넬라 뉴모필라 Q5WXP0_LEGPL, 레지오넬라 뉴모필라 Q5WTZ5_LEGPL, 레지오넬라 뉴모필라 Q5X268_LEGPA, 레지오넬라 뉴모필라 Q5X2R2_LEGPA, 레지오넬라 뉴모필라 아종 뉴모필라 Q5ZWM9_LEGPH, 레지오넬라 뉴모필라 아종 뉴모필라 Q5ZSQ8_LEGPH, 콜웰리아 사이크레리트래(Colwellia psychrerythraea) Q47Y43_COLP3, 슈도알테로모나스 아틀란티카(Pseudoalteromonas atlantica) T6c Q3CSZ5_ALTAT, 쉬와넬라 오네이덴시스 Q8EF49_SHEON, 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) Q21E20_SACD2, 사카로파거스 데그라단스 Q21ER7_SACD2, 비브리오 앤거스툼(Vibrio angustum) S14 Q1ZWE5_9VIBR, 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) Q8DAE2_VIBVU, 비브리오 알지노리티쿠스(Vibrio alginolyticus) 12G01 Q1VCP6_VIBAL, 비브리오 종 DAT722 Q2FA22_9VIBR, 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) Q87NJ1_VIBPA, 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) Q5E1F5_VIBF1, 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) Q7MJS8_VIBVY, 포토박테리움(Photobacterium) 종 SKA34 Q2C6Z5_9GAMM, 하헬라 체주엔시스(Hahella chejuensis) Q2SFY7_HAHCH, 오세아노스피릴룸(Oceanospirillum) 종 MED92 Q2BKV0_9GAMM, 오세아노박터(Oceanobacter) 종 RED65 Q1N035_9GAMM, 데설포비브리오 데설푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans) Q310U7_DESDG, 할로써모트릭 스 오레니(Halothermothrix orenii) H 168 Q2AIW5_9FIRM, 써모언에어로박터 텡콘젠시스 Q8RBX6_THETN, 칼디셀루로시럽토르 사카로리티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) DSM 8903 Q2ZH17_CALSA, 클로스트리듐 아세토부티리쿰 Q97E73_CLOAB, 알카리피루스 메탈리레디제네스(Alkaliphilus metalliredigenes) QYMF Q3C763_9CLOT, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani) Q899J9_CLOTE, 및 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerincki) NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE. 이들 서열은 본 명세서에 개시된 Pfam 데이터베이스를 이용하여 H-NOX 단백질 패밀리에 속하는 것으로 이들 단백질이 확인된 것에 기초하여 H-NOX 단백질을 인코딩하는 것으로 예상된다.
본 명세서에 개시된 약학 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합할 수 있는 추가의 H-NOX 단백질, 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인, 및 핵산은 표준 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 표준 서열 배열 및/또는 구조 예측 프로그램이, 공지의 H-NOX 단백질 및 핵산의 것과의 그들의 일차 및/또는 예측된 단백질 이차 구조의 유사성에 기초하여 추가의 H-NOX 단백질 및 핵산을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Pfam 데이터베이스는 단백질을 H-NOX 단백질 패밀리와 같은 패밀리로 분류하기 위하여 규정된 배열 알고리즘 및 은닉 마르코프 모델(예를 들어, Pfam 21.0)을 이용한다(Pfam - 단백질 도메인 패밀리 배열 및 은닉 마르코프 모델의 데이터베이스, Copyright (C) 1996-2006 The Pfam Consortium; 미국 MA 02111-1307 보스톤 59 템플 플레이스-스윗 330 소재의 GNU LGPL 프리 소프트웨어 파운데이션, 인크.). swissprot-trembl 데이터베이스("expasy.org"의 월드 와이드 웹, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics) 스위스-프롯 그룹(Swiss-Prot group) CMU - 스위스 제네바 4 CH-1211 미쉘 세르베 1가)와 같은 표준 데이터베이스가 또한 H-NOX 단백질 패밀리의 구성원을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. H-NOX 단백질의 이차 및/또는 삼차 구조는 프리딕트프로테인(PredictProtein)(미국 NY 10032 뉴욕 BB217 168 스트리트 웨스트 630)과 같은 표준 구조 예측 프로그램의 디폴트 세팅을 이용하여 예측될 수 있다. 대안적으로, H-NOX 단백질의 실제 이차 및/또는 삼차 구조는 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 티. 텡콘젠시스 H-NOX에서 하기 말단 포켓 잔기 중 임의의 잔기에 상응하는 위치에서 동일한 아미노산을 가진다: Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140, Leu144, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 그들의 아미노산 서열의 서열 배열에 기초하여, 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 Pro115 또는 Arg135의 위치에 해당하는 위치에서 각각 프롤린 또는 아르기닌을 가진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 알. 노르베지쿠스 β1 H-NOX의 His105에 해당하는 히스티딘을 가진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 6개 알파-헬릭스, 이어서 2개 베타-쇄, 이어서 1개 알파-헬릭스, 이어서 2개 베타-쇄를 포함하는 이차 구조를 갖거나 또는 갖는 것으로 예상된다. 이 이차 구조는 H-NOX 단백질에 대해 보고되었다.
원한다면, 새로 확인된 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인은 표준 방법을 이용하여 그것이 헴에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여 시험될 수 있다. H-NOX 도메인이 O2 운반자로서 기능하는 능력은 본 명세서에 개시된 것과 같은 표준 방법을 이용하여 H-NOX 도메인이 O2에 결합하는지를 결정함으로써 시험될 수 있다. 원한다면, O2 운반자로서의 H-NOX 도메인의 특징을 최적화하기 위하여 본 명세서에 개시된 돌연변이 중 하나 이상이 H-NOX 도메인내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 그것의 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자동산화 속도, NO 반응성, NO 안정성 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 변경하기 위하여 하나 이상의 돌연변이가 도입될 수 있다. 본 명세서에 개시된 것과 같은 표준 기술이 이들 파라미터를 측정하기 위하여 이용될 수 있다.
돌연변이체 H-NOX 단백질
본 명세서에서 추가로 토의되는 바처럼, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인은 상응하는 야생형 단백질에 비하여 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자동산화 속도, NO 반응성, NO 안정성 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 변경하는 돌연변이와 같은 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 상응하는 야생형 단백질에 비하여 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자동산화 속도, NO 반응성, NO 안정성 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 변경하는 돌연변이와 같은 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있는 하나 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질을 제공한다. 조작된 H-NOX 도메인의 패널은, 무작위 돌연변이유발에 이어, 본 명세서에 개시되며 부가적으로 당업자에게 알려진 기술을 이용하여 본 발명에서 제공되는 교시에 비추어 요구되는 또는 원하는 해리 상수, 해리도, NO-반응성, 안정성, 생리학적-양립성(physio- compatibility) 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합에 대한 실험적 스크리닝에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이유발은 H-NOX 단백질의 실험적으로 결정되거나 예측된 삼차 구조로부터 명백한 말단 포켓 잔기(예를 들어, Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59를 참고하며, 이 문헌은 특히 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질의 서열에 대하여, 그 전체가 참고로 본원에 포함됨) 또는 서열 배열로부터 확인된 진화적으로 보존된 잔기(예를 들어, Boon E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59를 참고하며, 이 문헌은 특히 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질의 서열에 대하여, 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)와 같은 특정 영역 또는 잔기에 선택적으로 표적화될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 돌연변이체 H-NOX 도메인은 자연에서 발생하는 모든 H-NOX 단백질 또는 도메인의 서열과 상이한 서열을 가진다. 다양한 실시형태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 자연에서 발생하는 H-NOX 단백질의 상응하는 영역의 서열과 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99, 또는 99.5% 중 임의의 것만큼 동일하다. 다양한 실시형태에서, 돌연변이체 단백질의 아미노산 서열은 자연에서 발생하는 H-NOX 단백질의 상응하는 영역의 서열과 약 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-99%, 또는 99.5% 동일하다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 적어도 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 또는 400개 인접 아미노산 중 임의의 것을 함유하는 단백질 단편이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 단백질은 전장 단백질로부터의 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300, 또는 300-400개 인접 아미노산을 함유하는 단백질 단편이다. 서열 동일성은 예를 들어, 그안에 명시된 디폴트 파라미터를 가진 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 미국 WI 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 소재의 위스콘신 대학 바이오테크놀로지 센터의 제네틱스 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 이용하여 측정될 수 있다. 이 소프트웨어 프로그램은 다양한 아미노산 치환, 결실 및 다른 변형에 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매치한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 돌연변이체 H-NOX 도메인은 하나 이상의 아미노산의 삽입(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산의 삽입)을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 하나 이상의 아미노산의 결실(예를 들어, N-말단, C-말단 및/또는 내부 잔기의 결실, 예를 들어, 적어도 약 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300개, 또는 더 많은 아미노산 중 임의의 것의 결실 또는 5-10, 10-15, 15-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-300, 또는 300-400개 아미노산의 결실)을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 하나 이상의 아미노산의 치환(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산의 치환) 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 단백질은 자연에서 발생하는 단백질에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변경을 가진다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 핵산 서열은 자연에서 발생하는 단백질에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변경을 가지는 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 자연에서 발생하는 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 인코딩하는 자연에서 발생하는 핵산의 축퇴성 버젼이 아니다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인에서의 돌연변이는 진화적으로 보존된 돌연변이(클래스 I 돌연변이로도 표시됨)이다. 클래스 I 돌연변이의 예는 표 1A에 열거된다. 표 1A에서, 돌연변이는 인간 β1 H-NOX의 서열에 따라 넘버링/주석첨가되지만, 모든 H-NOX 서열에 대해 유사하다. 따라서, 임의의 다른 H-NOX 단백질에서의 상응하는 위치가 표시된 잔기로 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 인간 β1 H-NOX의 Phe4는, 다른 H-NOX 단백질이 이 위치에서 티로신을 가지므로, 티로신으로 돌연변이될 수 있다. 상응하는 페닐알라닌 잔기는 임의의 다른 H-NOX 단백질에서 티로신으로 돌연변이될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 하나 이상의 돌연변이는 진화적으로 보존된 잔기에 한정된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 돌연변이는 적어도 하나의 진화적으로 보존된 돌연변이와 적어도 하나의 비-진화적으로 보존된 돌연변이를 포함할 수 있다. 원한다면, 이들 돌연변이체 H-NOX 단백질은 본 발명에서 제공되는 교시에 비추어 NO/02 해리 상수, NO-반응성, 안정성 및 생리학적-양립성에 대해 실험적 스크리닝을 거친다.
[표 1A] 진화적으로 보존된 잔기를 표적화하는 예시적인 클래스 I H-NOX 돌연변이
Figure pct00001
일부 실시형태에서, 돌연변이는 알파-헬릭스 A, D, E, 또는 G 내의 잔기의 돌연변이와 같은, 말단 포켓 돌연변이다(Pellicena, P. et al. (August 31, 2004). Proc Natl . Acad Sci USA 101(35):12854-12859). 예시적인 말단 포켓 돌연변이(클래스 II 돌연변이로도 표시됨)는 표 1B에 열거된다. 표 1B에서, 돌연변이는 인간 β1 H-NOX의 서열에 따라 넘버링/주석첨가되지만, 모든 H-NOX 서열에 대해 유사하다. 여러 치환이 각각의 언급된 잔기에서 생존가능한 돌연변이를 제공하므로, 각각의 표시된 위치에서의 잔기는 임의의 다른 자연 또는 비-자연 발생 아미노산("X"로 표시됨)으로 변화될 수 있다. 그러한 돌연변이는 다양한 원하는 친화성, 안정성 및 반응성 특성을 가진 H-NOX 단백질을 생산할 수 있다.
[표 1B] 말단 포켓 잔기를 표적화하는 예시적인 클래스 II H-NOX 돌연변이
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구체적 실시형태에서, 돌연변이는 헴 말단 포켓 돌연변이이다. 본 명세서에 개시된 대로, H-NOX 패밀리의 NO-결합 구성원에서 O2 결합을 방지하는 중요한 분자 결정인자는 헴의 말단 포켓에서 H-결합 공여체의 결핍이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 돌연변이는 H-NOX 도메인과 말단 포켓 내의 리간드 사이의 H-결합을 변화시킨다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 말단 포켓의 H-결합 공여체를 파괴하고/하거나 상응하는 야생형 H-NOX 도메인에 비하여 감소된 O2 리간드-결합을 부여한다. 예시적인 말단 포켓 잔기는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 Thr4, Ile5, Thr8, Trp9, Trp67, Asn74, Ile75, Phe78, Phe82, Tyr140 및 Leu144 및 임의의 다른 H-NOX 단백질내의 상응하는 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인은 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 보다 많은 말단 포켓 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 해당한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144F 돌연변이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인은 두 개의 말단 포켓 돌연변이를 포함한다.
말단 포켓 내에 있지 않은 잔기 또한 헴 기의 삼차 구조에 영향을 줄 수 있으며; 이 구조는 다시 헴 기 내의 철로의 O2 및 NO의 결합에 영향을 준다. 따라서, 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질 또는 중합체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인은 말단 포켓 바깥에 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 돌연변이될 수 있지만 말단 포켓 내에 있지 않은 잔기의 예는 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 Pro115 및 Arg135를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 헴 철에 결찰되는 잔기로서 His105를 포함하는 근위 포켓 내에 있다.
일부 실시형태에서, 둘 이상의 돌연변이가 존재할 경우, 적어도 하나의 돌연변이는 말단 포켓에 있으며, 적어도 하나의 돌연변이는 말단 포켓의 바깥에 있다(예를 들어, 근위 포켓 내의 돌연변이). 일부 실시형태에서, 모든 돌연변이는 말단 포켓 내에 있다.
인간 외의 공급원으로부터 유래된 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인의 면역원성을 감소시키기 위하여, H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인 내의 아미노산은 인간 H-NOX 내의 상응하는 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인의 삼차 구조의 표면 상의 하나 이상의 아미노산은 인간 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인 내의 상응하는 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.일부 변형에서, 하나 이상의 표면 아미노산의 돌연변이는 둘 이상의 말단 포켓 잔기의 돌연변이, 말단 포켓 바깥의 하나 이상의 잔기의 돌연변이(예를 들어, 근위 포켓 내의 돌연변이) 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합과 결합될 수 있다.
본 발명은 또한 이중, 삼중 또는 더 다중의 돌연변이와 같은, 본 명세서에 개시된 돌연변이의 임의의 조합에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 돌연변이 중 임의의 것의 조합이 동일한 H-NOX 단백질에서 만들어질 수 있다. 다른 포유동물 또는 비-포유동물 H-NOX 단백질 내의 등가의 위치에서의 돌연변이가 또한 본 발명에 의해 포함됨을 주목한다. 예시적인 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인은 상응하는 야생형 H-NOX 도메인에 비하여 변경된 O2 또는 NO 리간드-결합을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하며 생리학적으로 양립하는 포유동물 O2 혈액 가스 운반자로서 작동한다.
돌연변이를 위한 잔기 번호는 개시되고 있는 구체적 H-NOX 단백질의 서열에서의 위치를 나타낸다. 예를 들어, 티. 텡콘젠시스 I5A는 티. 텡콘젠시스 H-NOX에서 5번째 위치에서 이소류신이 알라닌에 의해 치환된 것을 말한다. 동일한 이소류신에서 알라닌으로의 돌연변이가 임의의 다른 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인 내의 상응하는 잔기에서 만들어질 수 있다(이 잔기는 다른 H-NOX 단백질의 서열에서 5번째 잔기이거나 아닐 수 있다). 포유동물 β1 H-NOX 도메인의 아미노산 서열이 최대 2개 아미노산만큼 상이하므로, 야생형 래트 β1 H-NOX 단백질내로 도입될 경우 바람직한 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을 생성하는 돌연변이는 또한 인간과 같은 다른 포유동물로부터의 야생형 β1 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인내로 도입될 경우 바람직한 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을 생성할 것으로 예상된다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체이다. 일부 실시형태에서, H- NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 야생형 H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체이다.
H-NOX 단백질로의 변형
중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 임의의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질이 치료적 또는 산업적 응용을 향상시키기 위하여 표준 방법을 이용하여 변형되고/되거나 제형화될 수 있다. 예를 들어, 그리고 특히 이종성의 조작된 H-NOX 단백질에 적용될 경우, 당업자에게 알려진 다른 기술 뿐만 아니라, 가교, 페길화, 탄수화물 수식 등을 비롯한, 다양한 방법이 면역 감시로부터 그러한 작용제를 보호하기 위하여 본 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, Rohlfs, R. J. et al. (May 15, 1998). J. Biol . Chem . 273(20):ㄴ12128-12134; Migita, R. et al. (June 1997). J. Appl . Physiol . 82(6):1995-2002; Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1): 183-189, 각각은 특히 단백질의 변형과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함됨). 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질을 인간 혈청 알부민과 같은 인간 단백질과 융합시키면 혈청 반감기, 점도, 및 콜로이드 삼투압(colloidal oncotic pressure)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 그것의 면역원성을 감소시키고/시키거나 그것의 혈장 체류 시간을 증가시키기 위하여 그것의 합성 동안 또는 합성 후 변형된다. H-NOX 단백질은 또한 (리포좀 또는 나노입자 내로의 캡슐화와 같이) 캡슐화될 수 있다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된다. 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 H-NOX 단백질은 페길화된 것으로 불릴 수 있다(본 명세서에서는 "H-NOXP"로 불림). 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질은 비-페길화된 것으로 불릴 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOXP 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체이다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOXP 단백질의 적어도 하나의 단량체는 페길화된다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOXP 단백질의 각 단량체가 페길화된다. 일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX는 3개의 PEG 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX는 9개의 PEG 분자(각 단량체를 위하여 3개)를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG는 5000의 분자량을 가진다.
일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX 둘 모두가 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 및 저산소 뇌 손상을 치료하기 위하여 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 페길화 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 조성물 내에 있다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 비로 조성물 내에 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 페길화 삼량체 H-NOX 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 비-페길화 삼량체 H-NOX 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 페길화 삼량체 H-NOX 단백질 및 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 3개의 폴드온 도메인을 포함하는 비-페길화 삼량체 H-NOX 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 예를 들어, H-NOX 단백질의 정제를 돕기 위하여 하나 이상의 태그를 포함한다. 태그의 예는 His6, FLAG, GST, 및 MBP를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 하나 이상의 His6 태그를 포함한다. 하나 이상의 His6 태그는 예를 들어, 엑소펩티다제를 이용한 처리에 의해, 중합체 H-NOX 단백질의 사용 이전에 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인, 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 3개의 티. 텡콘젠시스 야생형 H-NOX 도메인, 3개의 폴드온 도메인 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체이다.
중합 도메인
일부 양태에서, 본 발명은 둘 이상의 H-NOX 도메인 및 하나 이상의 중합 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질을 제공한다. 중합 도메인은 중합체 H-NOX 단백질을 형성하기 위하여 둘 이상의 H-NOX 도메인을 연결하기 위하여 이용된다. 하나 이상의 중합 도메인이 H-NOX 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등을 생성하기 위하여 이용될 수 있다. 중합 도메인은 본 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, T4 박테리오파아지 피브리틴의 폴드온, Arc, POZ, 감긴 코일 도메인(GCN4, 류신 지퍼, 벨크로 포함), 유테로글로빈, 콜라겐, 3-쇄의 감긴 코일(매트리린-1), 트롬보스포린, TRPV1-C, P53, Mnt, 아바딘, 스트렙타비딘, Bcr-Abl, COMP, 베로톡신 서브유닛 B, CamKII, RCK, 및 N 에틸말레이미드-민감성 융합 단백질로부터의 도메인, STM3548, KaiC, TyrR, Hcp1, CcmK4, GP41, 탄저병 보호성 항원, 에어로리신, a-헤모리신, C4b-결합 단백질, Mi-CK, 아릴설파타제 A, 및 바이러스 캡시드 단백질이 있다. 중합 도메인은 H-NOX 도메인에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합 도메인은 H-NOX 도메인에 연결되어 단량체 서브유닛을 형성하여, 다수의 단량체 서브유닛으로부터의 중합 도메인이 관련하여 중합체 H-NOX 도메인을 형성하도록 한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 다른 실시형태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다.
링커는 중합 도메인을 H-NOX 도메인에 연결하기 위해 이용될 수 있으며, 예를 들어, 아미노산 링커가 있다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 더 많은 아미노산 중 어느 하나를 포함하는 링커는 중합 도메인과 H-NOX 도메인 사이에 위치될 수 있다. 예시적인 링커는 Gly-Ser-Gly 및 Arg-Gly-Ser 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
박테리오파아지 T4 피브리틴 삼량체화 도메인
예시적인 중합 도메인은 박테리오파아지 T4의 폴드온 도메인이다. 박테리오파아지 T4로부터의 wac 유전자는 C-말단 삼량체화 도메인(잔기 457-483)을 가진 486개 아미노산 단백질인 피브리틴 단백질을 인코딩한다(Efimov, V. P. et al. (1994) J Mol Biol 242:470-486). 이 도메인은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 피브리틴을 삼량체화할 수 있다(Boudko, S. P. et al. (2002) Eur J Biochem 269:833-841; Letarov, A. V., et al, (1999) Biochemistry(Mosc) 64:817-823; Tao, Y., et al, (1997) Structure 5:789-798). 종종 "폴드온 도메인"으로도 불리는, 분리된 27 잔기 삼량체화 도메인은 많은 상이한 단백질에서 키메라 삼량체를 제작하기 위하여 이용되었다(HIV 외피 당단백질(Yang, X. et al., (2002) J Virol 76:4634-4642), 아데노바이러스 부착분자(Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K. et al. (2004) J Mol Biol 342:219-227), 콜라겐(Zhang, C, et al. (2009) Biotechnol Prog 25:1660-1668), 파아지 P22 gp26(Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485), 및 광견병 바이러스 당단백질(Sissoeff, L., et al. (2005) J Gen Virol 86:2543-2552) 포함). 폴드온 도메인의 예시적인 서열은 도 1에 나타나며 서열 번호 4에 의해 제공된다.
분리된 폴드온 도메인은 단일 β-헤어핀 구조로 접히고 3개의 헤어핀에 관련된 β-프로펠러 구조로 삼량체화한다(Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915). 폴드온 도메인 단독의 구조는 NMR에 의해 결정되었으며(Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915) 폴드온 도메인으로 삼량체화된 여러 단백질의 구조는 X-선 결정학에 의해 확인되었다(Papanikolopoulou, K., et al., (2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Stetefeld, J. et al. (2003) Structure 11:339-346; Yokoi, N. et al. (2010) Small 6:1873-1879). 도메인은 신속하게 접히고 삼량체화하여 잘못 접힌 중간체 또는 경로를 벗어난(off-pathway) 올리고머화 생성물의 기회를 감소시킨다(Guthe, S. et al. (2004) J Mol Biol 337:905-915). 폴드온 도메인은 매우 안정하여, >10% SDS, 6.0M 구아니딘 하이드로클로라이드, 또는 80℃에서 삼차 구조 및 올리고머화를 유지할 수 있으며(Bhardwaj, A., et al. (2008) Protein Sci 17:1475-1485; Bhardwaj, A., et al. (2007) J Mol Biol 371:374-387) 폴드온 도메인에 융합된 서열의 안정성을 개선할 수 있다(Du, C. et al. (2008) Appl Microbiol Biotechnol 79:195-202).
일부 실시형태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 N-말단에 연결된다. 다른 실시형태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 폴드온 도메인의 N-말단에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인의 N-말단은 폴드온 도메인의 C-말단에 연결된다.
일부 실시형태에서, 링커는 폴드온 도메인을 H-NOX 도메인에 연결하기 위하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 더 많은 아미노산 중 어느 하나를 포함하는 링커가 중합 도메인과 H-NOX 도메인 사이에 위치될 수 있다. 예시적인 링커는 Gly-Ser-Gly 및 Arg-Gly-Ser 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly- Ser-Gly 아미노산 링커 및 폴드온 도메인을 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 아미노산 링커, 및 His6 태그를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인은 L144F 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인은 야생형 H-NOX 도메인이다.
단량체 H-NOX 도메인 서브유닛
일 양태에서, 본 발명은 중합체 H-NOX 단백질을 형성하기 위하여 관련할 수 있는 재조합 단량체 H-NOX 단백질(즉, 중합체 H-NOX 단백질의 단량체 H-NOX 서브유닛)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 H-NOX 단백질을 제공한다. H-NOX 도메인 및 중합 도메인은 공유적으로 연결되거나 비공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 다른 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 N-말단에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 C-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질의 H-NOX 도메인의 N-말단은 중합 도메인의 C-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질은 구아닐일 사이클라제 도메인을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX 단백질은 야생형 H-NOX 도메인을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 돌연변이는 상응하는 야생형 H-NOX 도메인의 것에 비하여 O2 해리 상수, 산소에 대한 koff, 헴 자동산화의 속도, NO 반응성, NO 안정성 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 변화시킨다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 말단 포켓 돌연변이다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 말단 포켓에 있지 않은 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 말단 포켓 돌연변이는 티. 텡콘젠시스의 L144 돌연변이(예를 들어, L144F 돌연변이)에 해당한다.
일부 양태에서, 본 발명은 관련하여 삼량체 H-NOX 단백질을 형성하는 재조합 단량체 H-NOX 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 H-NOX 단백질은 H-NOX 도메인 및 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체화 도메인은 본 명세서에서 토의된 폴드온 도메인이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인의 C-말단은 폴드온 도메인의 C-말단에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 티. 텡콘젠시스 도메인은 L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, 티. 텡콘젠시스 도메인은 야생형 H-NOX 도메인이다.
일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 아미노산 링커 서열을 이용하여 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 더 많은 아미노산 길이이다. 예시적인 아미노산 링커 서열은 Gly-Ser-Gly 서열 및 Arg-Gly-Ser 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 3개의 H-NOX 도메인 및 3개의 삼량체화 서열을 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질이며, 이때 H-NOX 도메인은 아미노산 링커 서열을 통해 삼량체화 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 하기를 포함한다: 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열 및 폴드온 도메인. 일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 하기를 포함한다: 야생형 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열 및 폴드온 도메인.
일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질은 태그, 예를 들어, His6, FLAG, GST, 또는 MBP 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질은 His6 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질은 태그를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 태그(예를 들어, His6 태그)는 아미노산 스페이서 서열을 이용하여 중합 도메인에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 더 많은 아미노산 길이이다. 예시적인 아미노산 링커 서열은 Gly-Ser-Gly 서열 및 Arg-Gly-Ser 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 3개의 H-NOX 도메인, 3개의 삼량체화 서열 및 3개의 His6 태그를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질이며, 이때 H-NOX 도메인은 아미노산 링커 서열을 통해 삼량체화 도메인에 공유적으로 연결되고 삼량체화 도메인은 아미노산 링커 서열을 통해 His6 태그에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 하기를 포함한다: L144F 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열 및 His6 태그. 일부 실시형태에서, 단량체 H-NOX 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 하기를 포함한다: 야생형 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열 및 His6 태그.
일부 실시형태에서, 재조합 단량체 H-NOX 단백질은 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질의 특징
본 명세서에 개시된 바처럼, 광범위한 NO 및 O2 해리 상수, O2 koff, NO 반응성 및 안정성을 제공하는, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 많은 다양한 H-NOX 돌연변이체 단백질이 생성되었다. 작동성 혈액 가스 운반자를 제공하기 위하여, H-NOX 단백질은 헤모글로빈과 같은 내인성 O2 운반자를 기능적으로 대체하거나 보충하기 위하여 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질과 같은 H-NOX 단백질은 저산소성 조직(예를 들어, 저산소성 반음영부위)에 O2를 전달하기 위하여 이용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 헤모글로빈과 같은 내인성 O2 운반자에 비하여 유사하거나 개선된 O2 결합도, O2 해리도, O2 결합에 대한 해리 상수, NO 안정성, NO 반응성, 자동산화 속도, 혈장 체류 시간 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 갖는다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질이며, 각각의 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질이며, 각각의 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질을 위한 O2에 대한 koff는 20℃에서 약 0.01 내지 약 200 s-1, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 200 s-1, 약 0.1 내지 100 s-1, 약 1.0 내지 약 16.0 s-1, 약 1.35 내지 약 23.4 s-1, 약 1.34 내지 약 18 s-1, 약 1.35 내지 약 14.5 s-1, 약 0.21 내지 약 23.4 s-1, 약 1.35 내지 약 2.9 s-1, 약 2 내지 약 3 s-1, 약 5 내지 약 15 s-1 또는 약 0.1 내지 약 1 s-1이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 0.65 s-1 이하인(예를 들어, 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s-1) 산소에 대한 koff를 갖는다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질을 위한 O2에 대한 kon은 20℃에서 약 0.14 내지 약 60 μM-1s-1, 예를 들어, 약 6 내지 약 60 μM-1s-1, 약 6 내지 12 μM-1s-1, 약 15 내지 약 60 μM-1s-1, 약 5 내지 약 18 μM-1s-1, 또는 약 6 내지 약 15 μM-1s-1이다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질에 의한 O2 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 약 1 nM 내지 1 mM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 실시형태에서, O2 결합에 대한 계산된 KD는 20℃에서 약 2 nM 내지 약 2 μM, 약 2μM 내지 약 1 mM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 9 μM 내지 약 50 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 약 50 nM 내지 약 10 μM, 약 2 nM 내지 약 50 μM, 약 100 nM 내지 약 1.9 μM, 약 150 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 255 nM, 약 20 nM 내지 약 2 μM, 20 nM 내지 약 75 nM, 약 1 μM 내지 약 2 μM, 약 2 μM 내지 약 10 μM, 약 2 μM 내지 약 9 μM, 또는 약 100 nM 내지 500 nM 중 임의의 하나이다. 일부 실시형태에서, O2 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 20℃에서 약 100 nM, 80 nM, 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 또는 10 nM 중 임의의 것 미만이다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질에 의한 O2 결합에 대한 동적 또는 계산된 KD는 동일한 조건 하에서(예를 들어, 20℃에서) 헤모글로빈의 동적 또는 계산된 KD의 약 0.01 내지 약 100-배 이내, 예를 들어, 동일한 조건 하에서(예를 들어, 20℃에서) 헤모글로빈의 동적 또는 계산된 KD의 약 0.1 내지 약 10-배 또는 약 0.5 내지 약 2-배이다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질에 의한 NO 결합을 위한 동적 또는 계산된 KD는 동일한 조건 하에서(예를 들어, 20℃에서) 헤모글로빈의 동적 또는 계산된 KD의 약 0.01 내지 약 100-배 이내, 예를 들어, 동일한 조건 하에서(예를 들어, 20℃에서) 헤모글로빈의 동적 또는 계산된 KD의 약 0.1 내지 약 10-배 또는 약 0.5 내지 약 2-배이다.
일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질의 약 50, 40, 30, 10, 또는 5% 중 임의의 것 미만이 20℃에서 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 또는 20 시간 중 임의의 시간 동안 항온처리 후 산화된다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만, 예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1.8 s-1, 1.5 s-1, 1.2 s-1, 1.0 s-1, 0.8 s-1, 0.7 s-1, 또는 0.6 s-1 미만이다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 0.1 내지 약 600 s-1, 예를 들어, 20℃에서 약 0.5 내지 약 400 s-1, 약 0.5 내지 약 100 s-1, 약 0.5 내지 약 50 s-1, 약 0.5 내지 약 10 s-1, 약 1 내지 약 5 s-1, 또는 약 0.5 내지 약 2.1 s-1이다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질의 반응성은 20℃에서와 같은 동일한 조건 하에서 헤모글로빈의 반응성보다 적어도 약 10, 100, 1,000, 또는 10,000배 더 낮다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질의 헴 자동산화 속도는 37℃에서 약 1.0 h-1 미만, 예를 들어, 37℃에서 약 0.9 h-1, 0.8 h-1, 0.7 h-1, 0.6 h-1, 0.5 h-1, 0.4 h-1, 0.3 h-1, 0.2 h-1, 0.1 h-1, 또는 0.05 h-1 중 임의의 것 미만이다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화 속도는 37℃에서 약 0.006 내지 약 5.0 h-1, 예를 들어, 37℃에서 약 0.006 내지 약 1.0 h-1, 0.006 내지 약 0.9 h-1, 또는 약 0.06 내지 약 0.5 h-1이다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 돌연변이체 H-NOX 단백질은 (a) 헤모글로빈의 값의 100배 이내의 02 또는 NO 해리 상수, 결합도(02 또는 NO를 위한 kon), 또는 해리도(02 또는 NO를 위한 koff), (b) sGC β1의 NO 친화성보다 약한(예를 들어, 적어도 약 10-배, 100-배 또는 1000-배 약한) NO 친화성, (c) 헤모글로빈보다 적어도 1000-배 더 적은 결합된 O2와의 NO 반응성, (d) 헤모글로빈의 생체내 혈장 체류 시간보다 적어도 2, 10, 100, 또는 1000-배 더 높은 생체내 혈장 체류 시간, 또는 (e) 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 가진다.
예시적인 적합한 O2 운반자는 헤모글로빈의 해리 상수의 100배 이내, 즉, 약 0.01 내지 100-배, 예를 들어, 헤모글로빈의 해리 상수의 약 0.1 내지 10-배, 또는 약 0.5 내지 2-배인 해리 상수를 제공한다. 당업자에게 알려진 기술 뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 기술(Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1): 183-189, 이들 각각은 특히 해리 상수의 측정과 관련하여 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)과 같은 다양한 확립된 기술이 해리 상수를 정량하기 위하여 사용될 수 있다. 예시적인 02 운반자는 결합된 O2를 가진 H-NOX 단백질의 낮은 또는 최소화된 NO 반응성, 예를 들어, 헤모글로빈의 NO 반응성보다 낮은 NO 반응성을 제공한다. 일부 실시형태에서, NO 반응성은 헤모글로빈의 NO 반응성보다 훨씬 낮으며, 예를 들어, 적어도 약 10, 100, 1,000, 또는 10,000-배 더 낮다. 당업자에게 알려진 기술 뿐만 아니라, 다양한 확립된 기술이(Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D. et al. (August 15, 2004). Biochem J. 382(Pt 1): 183-189, 이들 각각은 특히 NO 반응성의 측정과 관련하여 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) NO 반응성을 정량하기 위하여 사용될 수 있다. 야생형 티. 텡콘젠시스 H-NOX가 그러한 낮은 NO 반응성을 가지므로, 다른 야생형 H-NOX 단백질 및 돌연변이체 H-NOX 단백질은 유사한 낮은 NO 반응성을 가질 수 있다. 예를 들어, 티. 텡콘젠시스 H-NOX Y140H는 야생형 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 NO 반응성과 유사한 NO 반응성을 가진다.
또한, 적합한 O2 운반자는 높은 또는 최대화된 안정성, 특히 생체내 안정성을 제공한다. 다양한 안정성 메트릭스, 예를 들어, 산화성 안정성(예를 들어, 자동산화 또는 NO에 의한 산화에 대한 안정성), 온도 안정성 및 생체내 안정성이 이용될 수 있다. 당업자에게 알려진 기술 뿐만 아니라, 본 명세서에 개시된 기술(Boon, E. M. et al. (2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M. et al. (October 2005). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M. et al. (2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902)과 같은 다양한 확립된 기술이 안정성을 정량하기 위하여 사용될 수 있다. 혈장, 혈액 또는 조직에서의 생체내 안정성을 위하여, 예시적인 안정성 메트릭스는 체류 시간, 소거 속도 및 반감기를 포함한다. 호열성 유기체로부터의 H-NOX 단백질은 고온에서 안정할 것으로 예상된다. 다양한 실시형태에서, 혈장 체류 시간은 헤모글로빈의 혈장 체류 시간보다 적어도 약 2-, 10-, 100-, 또는 1000-배 더 크다(예를 들어, Bobofchak, K. M. et al. (August 2003). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2):H549-H561). 당업자가 이해할 것처럼, 헤모글로빈계 혈액 대체재는 혈장으로부터 무세포 헤모글로빈을 제거하는 헤모글로빈에 대한 수용체의 존재로 인한 혈장으로부터 무세포 헤모글로빈의 신속한 소거에 의해 제한된다. 혈장 내에 H-NOX 단백질에 대한 수용체가 없으므로, 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질은 헤모글로빈의 체류 시간 보다 긴 혈장 체류 시간을 가질 것으로 예상된다. 원한다면, 혈장 체류 시간은 표준 방법(예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법 및 당업자에게 알려진 방법)을 이용하여 H-NOX 단백질을 페길화하거나 가교하거나 다른 단백질과 H-NOX 단백질을 융합시킴으로써 증가될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질은 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1 mM의 O2 해리 상수 및 20℃와 같은 동일한 조건 하에서 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 약 10-배 더 낮은 NO 반응성을 가진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1 mM의 O2 해리 상수 및 20℃에서 약 700 s-1 보다 적은 NO 반응성(예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 또는 1.8 s-1 미만)을 가진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내인 O2 해리 상수 및 20℃와 같은 동일한 조건 하에서 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 약 10-배 더 낮은 NO 반응성을 가진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 0.01 내지 약 200 s-1의 산소에 대한 koff 및 20℃와 같은 동일한 조건 하에서 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 약 10-배 더 낮은 NO 반응성을 가진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 20℃에서 약 0.65 s-1 미만(예를 들어, 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.64 s-1)인 산소에 대한 koff 및 20℃와 같은 동일한 조건 하에서 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 약 10-배 더 낮은 NO 반응성을 가진다. 본 발명의 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 약 1 nM 내지 약 1 μM (1000 nM), 약 1 μM 내지 약 10 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM이다. 구체적 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는20℃에서 약 2 nM 내지 약 50 μM, 약 50 nM 내지 약 10 μM, 약 100 nM 내지 약 1.9 μM, 약 150 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 255 nM이다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 80 nM 미만, 예를 들어, 20℃에서 약 20 nM 내지 약 75 nM이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서와 같은 동일한 조건 하에서, 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 약 100-배 더 낮거나 또는 약 1,000 배 더 낮다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만, 예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 400 s-1, 300 s-1, 200 s-1, 100 s-1, 75 s-1, 50 s-1, 25 s-1, 20 s-1, 10 s-1, 50 s-1, 3 s-1, 2 s-1, 1.8 s-1, 1.5 s-1, 1.2 s-1, 1.0 s-1, 0.8 s-1, 0.7 s-1, 또는 0.6 s-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 0.01 내지 200 s-1, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 200 s-1, 약 0.1 내지 100 s-1, 약 1.35 내지 약 23.4 s-1, 약 1.34 내지 약 18 s-1, 약 1.35 내지 약 14.5 s-1, 약 0.21 내지 약 23.4 s-1, 약 2 내지 약 3 s-1, 약 5 내지 약 15 s-1, 또는 약 0.1 내지 약 1 s-1 이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 O2 해리 상수는 20℃에서 약 100 nM 내지 약 1.9 μM이며, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 14.5 s-1이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만, 예를 들어, 약 0.9 h-1, 0.8 h-1, 0.7 h-1, 0.6 h-1, 0.5 h-1, 0.4 h-1, 0.3 h-1, 0.2 h-1, 또는 0.1 h-1 중 임의의 것 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 14.5 s-1이고, H-NOX 단백질의 헴 자동산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff는 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 14.5 s-1이고, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만(예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 또는 1.8 s-1 미만)이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 헴 자동산화 속도는 37℃에서 약 1 h-1 미만이고, H-NOX 단백질의 NO 반응성은 20℃에서 약 700 s-1 미만(예를 들어, 20℃에서 약 600 s-1, 500 s-1, 100 s-1, 20 s-1, 또는 1.8 s-1 미만)이다.
일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질 용액을 비롯한 H-NOX 단백질 용액의 점도는 1 내지 4 센티포즈(cP)이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질 용액의 콜로이드 삼투압은 20 내지 50 mm Hg이다.
0 2 및/또는 NO 결합의 측정
당업자는 본 기술 분야에 알려진 방법에 의해 그리고 하기에 개시된 비제한적인 예시적인 방법에 의해 삼량체 H-NOX 단백질과 같은 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 임의의 H-NOX 단백질의 산소 및 산화질소 결합 특징을 쉽게 결정할 수 있다.
동적 KD: k off 대 k on 의 비
동적 KD 값은 본질적으로 Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59에 개시된 대로, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질에 대해 결정되며, 상기 문헌은 특히 O2 결합도, O2 해리도, O2 결합에 대한 해리 상수, 자동산화 속도 및 NO 해리도의 측정에 대하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
k on (O 2 결합도)
헴으로의 O2 결합은 20 ℃에서 섬광 광분해를 이용하여 측정된다. 매우 신속한 제짝 재결합 동역학(geminate recombination kinetics)의 결과로서 FeII-02 복합체를 플래시 오프(flash off)하는 것이 가능하지 않으므로, FeII-CO 복합체가 560 nm에서의 레이저광을 이용한 섬광 광분해(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 휴렛 패커드(Hewlett-Packard))에 처하게 되어, 5-배위 FeII 중간체를 생성하고, 다양한 파장에서 여기로의 분자 O2의 결합이 뒤따른다. 10 mM 디티오나이트를 이용한 혐기성 환원 및 이어서 PD-10 컬럼(매사추세츠주 빌레리카 소재의 밀리포어, 인크.(Millipore, Inc.))에서의 탈염에 의해 단백질 샘플이 만들어진다. 그 후 샘플은 100 μL 내지 1 mL의 크기와 1-cm의 경로-길이를 가진, 제어된 분위기의 석영 큐벳 내의 50 mM TEA, 50 mM NaCl, pH 7.5 버퍼에서 20 μM 헴으로 희석된다. CO 가스는 10분 동안 이 큐벳의 상부 공간에서 유동하여 FeII-CO 복합체를 형성하며, 복합체의 형성은 UV-가시광 분광학(소렛(Soret) 최대 423 nm)에 의해 확인된다. 그 후 이 샘플은 1 기압의 CO 가스하에서 정지된 동안 섬광 광분해 후 CO-재결합 동력학을 측정하기 위해 이용되거나, 또는 샘플은 O2-재결합 사건을 보기 위한 섬광 광분해 전에 버퍼를 완전히 산소화시키기 위하여 개방되고 30분 동안 공기중에서 교반된다. 헴으로의 O2 결합은 다수의 파장 대 시간에서 모니터된다. 이들 기록은 이고르 프로(Igor Pro) 소프트웨어(오레곤주 오스웨고 소재의 웨이브메트릭스, 인크.(Wavemetrics, Inc.); 최근 2005 버젼)를 이용하여 단일 지수로 피팅된다. 이 속도는 관찰 파장과는 무관하지만 O2 농도에 의존한다. UV-가시광 분광학은 모든 복합체와 중간체를 확인하기 위하여 내내 사용된다(캐리(Cary) 3K, 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 배리언, 인크.(Varian, Inc.)). 일시적 흡수 데이터는 Dmochowski, I. J. et al. (August 31, 2000). J Inorg Biochem. 81(3):221-228에 개시된 장비를 이용하여 수집되며, 상기 문헌은 특히 계측과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 장비는 20 ns의 반응 시간을 가지며, 데이터는 200 메가샘플 s-1에서 수치화된다.
k off (O 2 해리도)
koff를 측정하기 위하여, 단백질의 FeII-02 복합체(5 μM 헴)를 혐기성 50 mM TEA, 50 mM NaCl, pH 7.5 버퍼에서 희석하고, 다양한 농도의 디티오나이트 및/또는 포화 CO 가스를 함유한 동일한 부피의 동일한 버퍼(혐기성)와 신속하게 혼합한다. 20℃에 설정된 네스랩(Neslab) RTE-100 항온조를 구비한 하이텍 사이언티픽(HI-TECH Scientific) SF-61 유동정지(stopped-flow) 분광광도계(영국 브래드포드 온 에이본 소재의 티지케이 사이언티픽 엘티디.(TGK Scientific LTD.))에서 데이터를 획득한다. 헴으로부터 O2의 해리는 FeII-FeII-02 차이 스펙트럼에서 최대치인 437 nm 또는 FeII-FeII-C0 차이 스펙트럼에서 최대치인 425 nm에서의 흡광도에서의 증가로서 모니터된다. 최종 기록은 장비의 일부인 소프트웨어를 이용하여 단일 지수에 피팅된다. 각 실험은 최소 6회 실시되며, 생성된 해리도는 평균된다. 측정된 해리도는 디티오나이트 농도에 무관하며 환원된 종을 위한 트랩으로서의 포화 CO에 무관하며, 둘 모두 10 mM 디티오나이트가 존재하거나 존재하지 않는다.
동적 K D
동적 KD는 상술한 koff 및 kon의 측정을 이용하여 koff 대 kon의 비를 계산함으로써 결정된다.
계산된 K D
계산된 KD를 측정하기 위하여, 상술한 대로 수득된 koff 및 동적 KD를 위한 값이 그래프로 그려진다. koff와 동적 KD 사이의 선형 관계는 식 (y=mx+b)에 의해 정의된다. koff 값은 그 후 Excel: MAC 2004 (워싱턴주 레드몬드 소재의 마이크로소프트(Microsoft))를 이용하여 계산된 KD를 유도하기 위하여 선을 따라 보간되었다. 측정된 kon의 부재 하에서, 이 보간은 koff를 KD에 관련시키기 위한 방법을 제공한다.
자동산화의 속도
자동산화의 속도를 측정하기 위하여, 단백질 샘플은 혐기적으로 환원되고, 그 후 호기성 50 mM TEA, 50 mM NaCl, pH 7.5 버퍼에서 5 μM 헴으로 희석된다. 이들 샘플은 이어서 37℃에 설정된 네스랩 RTE-100 항온조를 구비한 캐리 3E 분광광도계에서 항온처리되고 주기적으로 스캐닝된다(캐리 3E, 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 배리언, 인크.). 자동산화의 속도는 시간에 대해 그려진 FeIII-FeII 차이 스펙트럼에서 최대와 최소 사이의 차이로부터 결정되고 Excel: MAC 2004(워싱턴주 레드몬드 소재의 마이크로소프트)를 이용하여 단일 지수로 피팅된다.
NO와의 반응의 속도
NO 반응성은 버퍼 A 중에 2 μM로 제조된 정제 단백질(H-NOX, 중합체 H-NOX, 호모 사피엔스 헤모글로빈(Hs Hb) 등) 및 버퍼 A중에 200 μM로 제조된 NO를 이용하여 측정된다(버퍼 A: 50 mM Hepes, pH 7.5, 50 mM NaCl). 20℃에 설정된 네스랩 RTE-100 항온조를 구비한 하이텍 사이언티픽 SF-61 유동정지 분광광도계(영국 브래드포드 온 에이본 소재의 티지케이 사이언티픽 엘티디.)에서 데이터를 획득한다. 단백질은 0.00125 초의 통합 시간으로 1:1 비로 NO와 신속하게 혼합된다. 최대 변화의 파장은 본질적으로 NO에 의한 산화의 속도-제한 단계를 측정하는, 분광계의 일부인 소프트웨어를 이용하여 단일 지수에 피팅된다. 반응의 최종 산물은 HNOX 단백질을 위해서는 제2철-NO이고 Hs Hb를 위해서는 제2철-아쿠오(ferric-aquo)이다.
p50 측정
원한다면, 돌연변이체 또는 야생형 H-NOX 단백질을 위한 p50 값은 Guarnone, R. et al. (September/October 1995). Haematologica 80(5):426-430에 의해 개시된 대로 측정될 수 있으며, 이 문헌은 특히 p50 값의 측정과 관련하여, 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. p50 값은 헤목스(HemOx) 분석기를 이용하여 결정된다. 측정 챔버는 0% 산소에서 시작하고 천천히 점진적으로 100% 산소를 향해 상승된다. 챔버 내의 산소 프로브는 산소 포화%를 측정한다. 두번째 프로브(UV-Vis 광)는 헴단백질(예를 들어, 헴과 복합된 H-NOX와 같은 단백질)의 UV-Vis 스펙트럼의 알파 및 베타 피크에 맞춰진, 두 흡수 파장을 측정한다. 이들 흡수 피크는 헴단백질이 산소에 결합할 때 선형으로 증가한다. 그 후 미결합으로부터 100% 결합까지 퍼센트 변화가 % 산소 값에 대해 그려져서 곡선을 생성한다. p50은 헴단백질의 50%가 산소에 결합되는 곡선 상의 지점이다.
구체적으로, 헤목스-분석기(펜실베니아주 뉴호프 소재의 TCS 사이언티픽 코포레이션(Scientific Corporation))는 증가하는 산소 분압에 50 μL의 혈액 또는 헴단백질을 노출시키고 그것을 질소 가스로 산소제거함으로써 옥시헴단백질 해리 곡선(ODC)을 결정한다. 클라크(Clark) 산소 전극은 산소 분압에서의 변화를 검출하고, 이것은 x-y 기록기의 x-축상에 기록된다. 옥시헴단백질 분획에서의 결과적인 증가는 560 nm 및 576 nm에서의 이중-파장 분광광도법에 의해 동시에 모니터되고 y-축 상에 나타내진다. 혈액 샘플은 머리에 가까이 위치한 정맥(antemedial vein)으로부터 채취되고, 헤파린으로 항응고되고, 분석까지 젖은 얼음에서 4℃에서 보관된다. 50 μL의 전혈을, 7.4 ± 0.01의 값에서 용액의 pH를 유지하는 제조사-제공 버퍼인 헤목스-용액 5 μL에서 희석시킨다. 샘플-버퍼를 헤목스-분석기의 일부인 큐벳 내로 옮기고 혼합물의 온도를 평형화시키고 37℃로 만든 후, 샘플을 공기로 100%로 산소화시킨다. pO2 값의 조정 후 샘플이 질소로 산소제거되고; 산소제거 과정 동안 곡선이 그래프 종이에 기록된다. 헤목스-분석기의 일부인 소프트웨어를 이용하여 O2 포화가 50%인 지점으로서 P50 값이 x-축 상에 외삽된다. 완전한 기록에 요구되는 시간은 대략 30분이다.
H-NOX 핵산
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 돌연변이체 H-NOX 단백질, 중합체 H-NOX, 또는 재조합 단량체 H-NOX 단백질 서브유닛 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 특징으로 한다.
구체적 실시형태에서, 핵산은 H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인을 인코딩하는 핵산 중 임의의 핵산의 전체 핵산 서열 또는 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 H-NOX 핵산으로부터의 적어도 약 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800개, 또는 더 많은 인접한 뉴클레오티드를 포함하며 그것이 유래된 H-NOX 핵산에 비교할 때 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 돌연변이)를 함유한다. 다양한 실시형태에서, 돌연변이체 H-NOX 핵산은 그것이 유래된 H-NOX 핵산에 비교할 때 약 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 미만 돌연변이를 함유한다. 본 발명은 또한 돌연변이체 H-NOX 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산의 축퇴 변이체를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 핵산은 둘 이상의 H-NOX 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 H-NOX 도메인을 포함하는 핵산은 중합체 H-NOX 단백질이 핵산으로부터 발현되도록 연결된다. 추가 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 중합 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 H-NOX 도메인 및 하나 이상의 중합 도메인을 포함하는 핵산이 중합체 H-NOX 단백질이 그 핵산으로부터 발현되도록 연결된다.
일부 실시형태에서, 핵산은 중합 도메인을 인코딩하는 임의의 핵산의 분절 또는 전체 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인을 인코딩하는 핵산 및 중합 도메인을 인코딩하는 핵산은 생산된 폴리펩티드가 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함하는 융합 단백질이도록 연결된다.
일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 His6 태그를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 H-NOX 도메인, 중합 도메인 및/또는 His6 태그를 인코딩하는 핵산들 사이에 위치되는 링커 서열을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모언에어로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 야생형 티. 써모언에어로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모언에어로박터 L144F H-NOX 도메인이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 5'에서 3'으로 인코딩하는 핵산을 제공한다: L144F 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인. 일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 5'에서 3'으로 인코딩하는 핵산을 제공한다: 야생형 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 및 폴드온 도메인.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 5'에서 3'으로 인코딩하는 핵산을 제공한다: L144F 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열 및 His6 태그. 일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 5'에서 3'으로 인코딩하는 핵산을 제공한다: 야생형 티. 텡콘젠시스 H-NOX 도메인, Gly-Ser-Gly 아미노산 링커 서열, 폴드온 도메인, Arg-Gly-Ser 링커 서열 및 His6 태그.
일부 실시형태에서, 핵산은 서열 번호 1, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 개시된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 돌연변이체 H-NOX 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 함유하는 세포 또는 세포 집단을 포함한다. 예시적인 세포는 곤충, 식물, 효모, 세균 및 포유동물 세포를 포함한다. 이들 세포는 본 명세서에 개시된 것과 같은 표준 방법을 이용한 돌연변이체 H-NOX 단백질의 생산을 위해 유용하다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모언에어로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 야생형 티. 써모언에어로박터 H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 티. 써모언에어로박터 L144F H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 개시된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
H-NOX 단백질의 제형
본 명세서에 개시된, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 임의의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질은 약학 또는 비-약학 조성물의 제형을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 단량체 H-NOX 단백질이 시험관내 또는 생체내에서 관련하여 중합체 H-NOX 단백질을 생산하도록 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 단량체 H-NOX 단백질을 포함한다. 하기에 추가로 토의된 바처럼, 이들 제형은 다양한 치료 및 산업적 응용에서 유용하다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질 및 약학적 허용 담체 또는 부형제를 포함한다. 약학적 허용 담체 또는 부형제의 예는 포스페이트 완충된 염수 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어, 오일/물 에멀젼, 및 다양한 타입의 습윤제와 같은 표준 약학 담체 또는 부형제 중 임의의 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 예시적인 희석제는 포스페이트 완충된 염수 또는 생리식염수(0.9%)이다. 그러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 종래의 방법(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000을 참고하며, 이들 각각은 특히 제형과 관련하여, 그 전체가 참고로 본원에 포함된다)에 의해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 제형은 멸균성이다. 일부 실시형태에서, 제형은 내독소가 본질적으로 없다.
당업자에게 알려진 임의의 적합한 담체가 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 한편, 담체의 타입은 투여 방식에 따라 변할 것이다. 조성물은 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 소낭내, 흡입, 복강내, 폐내, 근육내, 피하, 기관내, 점막내, 안내, 척추강내, 두개내, CSF로의 투여 또는 경피 투여를 비롯한 임의의 적절한 투여 방식을 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달은 혈관 폐색 부위에 직접적으로 또는 저산소성 조직에 직접적으로 이루어질 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체는 예를 들어, 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스, 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스 또는 마그네슘 카보네이트와 같은 상기 담체 또는 고형 담체 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 생분해성 미소구체(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 또한 담체로서 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학 또는 비-약학 조성물은 버퍼(예를 들어, 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등), 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스, 덱스트란 등), 산화방지제, 킬레이팅제(예를 들어, EDTA, 글루타치온 등), 방부제, 산소의 결합 및/또는 수송을 위해 유용한 다른 화합물, 비활성 성분(예를 들어, 안정화제, 충전제 등), 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 동결건조물로서 제형화된다. H-NOX 단백질은 또한 잘 알려진 기술을 이용하여 리포좀 또는 나노입자 내에 캡슐화될 수 있다. H-NOX 단백질을 위해 사용될 수 있는 다른 예시적인 제형은 예를 들어, 미국 특허 6,974,795호 및 6,432,918호에 개시되며, 이들 각각은 특히 단백질의 제형과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
본 명세서에 개시된 조성물은 서방성 제형(예를 들어, 투여 후 화합물의 느린 방출을 생성하는 캡슐 또는 스폰지와 같은 제형)의 일부로서 투여될 수 있다. 그러한 제형은 일반적으로 잘 알려진 기술을 이용하여 제조되고 예를 들어, 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해 또는 원하는 표적 부위에서의 이식에 의해 투여될 수 있다. 서방성 제형은 담체 매트릭스내에 분산된 및/또는 속도 제어 막에 의해 둘러싸인 저장소 내에 함유된 H-NOX 단백질을 함유할 수 있다. 그러한 제형내에서 사용하기 위한 담체는 생체적합성이며, 또한 생분해성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형은 상대적으로 일정한 수준의 H-NOX 단백질 방출을 제공한다. 서방성 제형내에 함유된 H-NOX 단백질의 양은 이식 부위, 방출의 속도 및 예상되는 지속기간, 및 치료되거나 예방될 병태의 특성에 의존한다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은 유효량의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 둘 이상의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질의 유효량을 함유한다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 단량체 H-NOX 단백질의 유효량을 함유한다. 일부 실시형태에서, 제형은 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형은 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다.
혈액 대체제로서 헤모글로빈의 예시적인 투여량은 환자 체중 kg 당 약 10 mg 내지 약 5 g 또는 그 이상의 세포외 헤모글로빈이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 인간에게의 투여를 위한 H-NOX 단백질의 유효량은 수 그램 내지 약 350 그램 이상이다. H-NOX 단백질의 다른 예시적인 투여량은 약 0.5 ml/분과 같은 적절한 주입 속도에서 약 4.4, 5, 10, 또는 13 G/DL 중 임의의 것(G/DL은 순환계내로의 주입 이전에 H-NOX 단백질 용액의 농도임)을 포함한다(예를 들어, Winslow, R. Chapter 12 In Blood Substitutes 참고). 각 투약 형태의 개별 투여량 내에 함유된 활성 성분의 단위 함량은 그 자체가 유효량을 구성할 필요는 없으며, 그 이유는 필요한 유효량이 다수의 투여의 조합된 효과에 의해 도달될 수 있기 때문임이 이해될 것이다. 약학 조성물에 포함될 H-NOX 단백질의 양의 선택은 이용되는 투약 형태, 치료되는 병태, 및 당업자의 결정에 따라 이루어져야 할 구체적 목적에 의존한다.
예시적인 조성물은 상응하는 야생형 H-NOX 단백질에 비하여 변경된 O2 또는 NO 리간드-결합을 종합적으로 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 분리되거나 정제될 수 있으며, 생리학적으로 양립성인 포유동물 혈액 가스 운반자로서 작동할 수 있는, 유전적으로 조작된 재조합 H-NOX 단백질을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 H-NOX 단백질이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 H-NOX 단백질은 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 단량체 H-NOX 단백질이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다.
약학 조성물이 투여되는 인간 대상에서 면역 반응을 감소시키거나 방지하기 위하여, 인간 H-NOX 단백질 또는 도메인(야생형 인간 단백질 또는 하나 이상의 돌연변이가 도입된 인간 단백질) 또는 다른 비-항원성 H-NOX 단백질 또는 도메인(예를 들어, 포유동물 H-NOX 단백질)이 사용될 수 있다. 인간 외의 공급원으로부터 유래된 H-NOX 단백질의 면역원성을 감소시키거나 제거하기 위하여, H-NOX 단백질 또는 H-NOX 도메인 내의 아미노산은 인간 H-NOX 내의 상응하는 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 H-NOX 단백질의 삼차 구조의 표면 상의 하나 이상의 아미노산은 인간 H-NOX 단백질 내의 상응하는 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시형태에서, H-NOX의 제형은 페길화 및 비-페길화 H-NOX 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형 내의 페길화 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, H-NOX의 제형은 페길화 및 비-페길화 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형 내의 페길화 대 비-페길화 삼량체 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다.
H-NOX 단백질의 치료적 응용
본 명세서에 개시된 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한, 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질, 또는 약학 조성물 중 임의의 것은 치료적 응용에서 사용될 수 있다. 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 구체적 H-NOX 단백질은 치료되는 구체적 적응증을 위한 원하는 O2 결합도, O2 해리도, O2 결합에 대한 해리 상수, NO 안정성, NO 반응성, 자동산화 속도, 혈장 체류 시간, 또는 전술한 것 중 둘 이상의 임의의 조합에 기초하여 그러한 응용을 위해 선택될 수 있다.
세포외 H-NOX 단백질의 혈관구조에서의 분포는 적혈구의 크기에 의해 제한되지 않으므로, 본 발명의 중합체 H-NOX 단백질은 적혈구가 침투할 수 없는 영역에 O2를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들 영역은 적혈구 유동에 대한 차단의 다운스트림에 위치한 임의의 조직 영역, 예를 들어, 하나 이상의 혈전, 동맥 폐색, 말초 혈관 폐색, 풍선혈관성형, 수술 장비, 산소 궁핍을 앓고 있거나 저산소성인 조직 등의 다운스트림 영역을 포함할 수 있다. 부가적으로, 모든 타입의 조직 허혈이 H-NOX 단백질을 이용하여 치료될 수 있다. 그러한 조직 허혈은 예를 들어, 수술기주위 허혈(perioperative ischemia), 뇌졸중(예를 들어, 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중), 신생 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심근 기절(myocardial stunning) 및 동면 심근(hibernation), 급성 또는 불안정 협심증, 신생 협심증(emerging angina), 및 심근경색(예를 들어, ST-분절 상승 심근 경색(segment elevation myocardial infarction))을 포함한다. 다른 실시형태에서, H-NOX는 저산소 뇌 손상, 혈관 폐색, 및 뇌 출혈을 포함하지만 이에 제한되지 않는 저산소 뇌 손상을 치료하기 위해 이용된다. 다른 실시형태에서, H-NOX는 뇌혈관 연축을 치료하기 위하여 또는 동맥류 재건술(aneurysm repair)을 위해 이용된다. H-NOX 단백질을 이용하여 치료될 수 있는 다른 예시적인 심혈관 적응증은 심장마비 및 겸상 적혈구 빈혈증을 포함한다. 예시적인 표적 적응증은 실혈, 저산소증 등을 비롯한, 혈액 대체제 또는 O2 운반자가 권고된 것과 같은, 기능성 헤모글로빈 결핍의 병태를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 뇌에서의 저산소증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX를 투여함으로써 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX를 투여함으로써 뇌졸중 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된(페길화) H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은(비-페길화) H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 페길화 H-NOX 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 조성물 내에 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화 티. 텡콘젠시스 L144F 삼량체 H-NOX 및 비-페길화 티. 텡콘젠시스 L144F 삼량체 H-NOX를 포함하며 이때 페길화 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX를 투여함으로써 개체에서 일과성 허혈 발작을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX를 투여함으로써 일과성 허혈 발작 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된(페길화) H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은(비-페길화) H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 페길화 H-NOX 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 조성물 내에 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX를 투여함으로써 개체에서 저산소 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX를 투여함으로써 저산소 뇌 손상 후 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된(페길화) H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은(비-페길화) H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 페길화 H-NOX 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99: 1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 조성물 내에 있다.
일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX 및 비-페길화 H-NOX는 개체에서 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상을 치료하기 위하여 동시에 또는 순차적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX는 비-페길화 H-NOX 이전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX는 비-페길화 H-NOX 후에 전달된다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX는 비-페길화 H-NOX의 투여 후 약 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 24 시간, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 2주, 약 3 주, 약 4 주 또는 약 1 개월 초과 중 임의의 때에 전달된다.
일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX 및/또는 비-페길화 H-NOX는 여러번 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX 및/또는 비-페길화 H-NOX는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 10회 또는 10회 초과 중 임의의 횟수로 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 허혈 뇌 손상 후 뇌의 저산소성 영역이 본질적으로 제거될 때까지 여러번 투여된다. 일부 실시형태에서, 비-페길화 H-NOX는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상을 앓고 있는 개체에게 투여되며, 이어서 페길화 H-NOX가 여러번 투여된다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX는 비-페길화 H-NOX의 투여 후 1 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 또는 10 일 중 하나 이상에서 투여된다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 H-NOX 단백질이 다른 치료법과 함께 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 페길화 H-NOX 및/또는 비-페길화 H-NOX가 다른 치료법과 함께 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 폐색된 혈관의 기계적 또는 화학적 재개통과 조합되어 투여된다. 기계적 재개통의 예는 풍선 혈관성형술과 같은 혈관성형술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 화학적 재개통의 예는 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 헤파린 또는 와파린(쿠마딘(Coumadin))과 같은 항-응혈제와 조합되어 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 신경보호제와 조합되어 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법을 이용한 치료 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여된다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX 단백질 볼루스를 투여한 후 이어서 개체에게 H-NOX를 주입하는 것을 포함하는, 개체의 뇌에서 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 H-NOX 단백질 볼루스를 투여한 후 이어서 개체에게 H-NOX를 주입하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 피하 주사에 의해 H-NOX 단백질 볼루스를 투여한 후 이어서 개체에게 H-NOX를 주입하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 피하 주사에 의해 H-NOX 단백질 볼루스를 투여한 후 이어서 개체에게 H-NOX를 주입하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하며, 이때 H-NOX는 페길화 H-NOX 및/또는 비-페길화 H-NOX를 포함한다. 예를 들어, H-NOX의 볼루스는 현장에서 투여되고, 이어서 병원에서 H-NOX의 주입이 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-페길화 H-NOX는 볼루스로서 전달된 후 페길화 H-NOX의 주입이 이어진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간보다 긴 시간에 걸친 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스로서 개체에게 투여되고, 이어서 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간보다 긴 시간에 걸친 주입이 이어진다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스에 의한 H-NOX 단백질의 투여 후 즉시 또는 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간보다 긴 시간에 주입에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 전신적으로 그리고 이어서 주입에 의해 전신적으로 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 뇌 내의 폐색 부위에 볼루스에 의해 그리고 이어서 주입에 의해 전신적으로 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 뇌 내의 폐색 부위에 볼루스에 의해 그리고 이어서 뇌 내의 폐색 부위에 또는 뇌에서의 폐색과 관련된 저산소성 반음영부위로의 주입에 의해 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 전신적으로 그리고 이어서 뇌 내의 폐색 부위에 또는 뇌에서의 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위로의 주입에 의해 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 및/또는 주입에 의해 뇌 내로 직접적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 및/또는 주입에 의해 뇌 척수액(CSF)에 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 근육내로 또는 피하로 전달된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 뇌졸중 후 반음영부위에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 뇌졸중과 관련된 저산소성 반음영부위로의 O2의 전달은 반음영부위에서 경색 수준을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 저산소 뇌 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 저산소 뇌 손상은 예를 들어, 혈전증 또는 색전증의 결과로서, 국소 뇌 허혈(focal cerebral ischemia)이다. 다른 양태에서, 저산소 뇌 손상은 예를 들어, 심장 마비 결과로서, 전뇌 허혈이다. 일부 실시형태에서, 저산소 뇌 손상은 선천성 장애의 결과이며, 예를 들어, 겸상적혈구 빈혈 또는 부적절한 동맥 형성의 결과이다. 일부 실시형태에서, 저산소 뇌 손상은 플라크 형성 또는 혈관의 압착의 결과이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 일과성 허혈 발작을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 일과성 허혈 발작과 관련된 저산소증을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 일과성 허혈 발작과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 많은 경우에, 일과성 허혈 발작은 뇌졸중이 이어진다. H-NOX를 이용한 일과성 허혈 발작의 치료는 개체에서 뇌졸중의 가능성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, H-NOX로 치료될 개체는 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 결과로서 지속적인 뇌의 저관류를 나타낸다. 뇌의 저관류는 저산소성 반음영부위를 야기할 수 있고 이것은 다시 반음영부위와 관련된 조직의 경색을 야기할 수 있다. 저관류 부위로의 O2의 전달은 저관류부터 야기되는 해로운 결과를 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 (예를 들어, 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 저산소 뇌 손상, 등 후) 개체의 뇌에서의 혈관 폐색과 관련된 저산소성 반음영부위에서의 염증을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위에서의 성상세포, 대식세포, T 세포, 호중구, 단핵구, 호산구, 호염기구 및/또는 소교세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 침윤성 염증 세포의 활성화를 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 폐색 부위와 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작과 관련된 감각운동 결핍을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 폐색 부위 또는 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달은 실어증, 구음장애(신경 손상으로부터 야기된 운동 구어 장애), 실행증(변형된 자발적 운동), 기억, 변형된 보행 또는 변형된 조정력을 포함하지만 이에 제한되지 않는 뇌에서의 저산소성 병태의 결과를 감소시킨다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 뇌졸중을 가질 위험이 있는 개체에게 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 뇌졸중의 부정적인 결과를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 뇌졸중을 가질 위험이 있는 개체에게 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 뇌졸중을 가질 위험이 있는 개체에게 산소를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 볼루스로서 및/또는 주입에 의해 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뇌졸중을 가질 위험이 있는 개체는 일과성 허혈 발작을 가지고 있다. 일부 실시형태에서, 뇌졸중의 위험이 있는 개체는 하기 병태 중 하나 이상을 나타낸다: 안면 마비(face drooping) ; 팔 마비(arm weakness); 언어 장애(speech difficulties); 얼굴, 팔 또는 다리, 특히 신체의 일 측에서의 갑작스러운 마비 또는 약함; 갑작스러운 착란상태(sudden confusion); 갑작스러운 언어 이해 곤란; 한쪽 또는 양쪽 눈의 갑작스러운 시각 장애; 갑작스러운 통증(sudden trouble); 갑작스러운 보행 장애, 어지러움, 균형 또는 조정력 상실; 및 원인을 알지 못하는 갑작스러운 심각한 두통. 뇌졸중의 불리한 결과는 감각운동 결함, 인지 결함, 실어증, 구음장애, 실행증, 기억력, 변형된 보행 또는 변형된 조정력을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기에 개시된 치료 방법의 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 H-NOX 단백질은 중합체 H-NOX 단백질(예를 들어, 삼량체 H-NOX 단백질)이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144F 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 도메인은 인간 H-NOX 도메인이다. 일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기 또는 사지로의 손상과 관련된 저산소성 조직을 치료하는 방법을 제공한다. 저산소증은 장기로의 손상과 직접적으로 관련될 수 있거나, 손상과 간접적으로 관련될 수 있다. 일부 실시형태에서, 저산소증은 손상의 일차 치료의 결과일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 조직을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 반음영부위를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 반음영부위의 정도를 감소시키는 방법을 제공한다. 저산소성 반음영부위의 정도의 감소는 공간적인 감소 및/또는 시간적인 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직에서의 저산소증 수준의 감소는 장기 및/또는 신체 기능장애를 야기할 수 있는 세포 기능 상실 및/또는 세포 사멸을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 장기 또는 조직은 근골격계, 호흡기관, 소화기관, 비뇨기관, 순환기관, 생식계, 신경계의 일부이거나, 또는 피부 또는 내분비선이다. 일부 실시형태에서, 장기는 뇌, 심장, 간, 신장, 폐, 비장, 장, 또는 췌장이다. 일부 실시형태에서, 조직은 근육이다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소성 반음영부위의 정도를 감소시키기 위하여 장기로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 저산소성 반음영부위의 정도의 감소는 공간적 감소 및/또는 시간적 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 장기는 뇌, 심장, 간, 신장, 폐이다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증 반음영부위를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소성 반음영부위의 정도를 감소시키는 방법을 제공한다. 저산소성 반음영부위의 정도의 감소는 공간적 감소 및/또는 시간적 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 사지는 팔, 손, 손가락, 다리, 무릎, 발, 또는 발가락이다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소성 반음영부위의 정도를 감소시키기 위하여 사지로의 손상과 관련된 저산소성 조직에 O2를 전달하는 방법을 제공한다. 저산소성 반음영부위의 정도의 감소는 공간적 감소 및/또는 시간적 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 사지는 팔, 손, 손가락, 다리, 무릎, 발, 또는 발가락이다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 사지로의 손상과 관련된 저산소증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 장기로의 손상은 혈관 폐색의 결과이다. 예를 들어, 손상은 관상 혈관의 폐색, 뇌의 혈관(예를 들어, 대뇌 혈관 또는 소뇌 혈관 등), 간(예를 들어, 문맥 혈관), 신장(예를 들어, 신장 혈관) 또는 폐(예를 들어, 폐 혈관)과 같은 장기에 공급되는 혈관의 폐색으로 인한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 장기 손상은 허혈의 결과이다. 일부 실시형태에서, 장기 손상은 장기로의 외상의 결과이다. 일부 실시형태에서, 장기로의 손상은 손상된 장기의 조직 또는 손상된 장기와 관련된 조직의 저관류를 야기한다. 일부 실시형태에서, 장기로의 손상은 손상된 장기의 조직 또는 손상된 장기와 관련된 조직의 지속적인 저관류를 야기한다. 일부 실시형태에서, 장기로의 손상은 손상된 장기의 조직 또는 손상된 장기와 관련된 조직의 저관류를 공간적으로 또는 기능적으로 야기한다. 일부 실시형태에서, 장기로의 손상은 손상된 장기 또는 그 근처에서 저산소성 반음영부위의 발생을 야기한다.
일부 실시형태에서, 사지로의 손상은 혈관 폐색의 결과이다. 예를 들어, 손상은 말초 혈관 폐색일 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈관 폐색은 허혈의 결과이다. 일부 실시형태에서, 사지 손상은 사지로의 외상의 결과이다. 일부 실시형태에서, 사지로의 손상은 사지의 조직 또는 사지와 관련된 조직의 저관류를 야기한다. 일부 실시형태에서, 사지로의 손상은 사지의 조직 또는 사지와 관련된 조직의 지속적인 저관류를 야기한다. 일부 실시형태에서, 사지로의 손상은 사지의 조직 또는 사지와 관련된 조직의 저관류를 공간적으로 또는 기능적으로 야기한다. 일부 실시형태에서, 사지로의 손상은 손상된 사지 또는 그 근처에서 저산소성 반음영부위의 발생을 야기한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소증의 결과를 감소시키는 방법을 제공한다. 장기로의 손상과 관련된 저산소증의 결과의 예는 감각운동 결함, 보행운동 결함, 인지 결함, 언어 장애, 감정적 문제(불안, 무관심, 정신병, 우울) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기의 염증을 감소시키고/시키거나 손상된 장기와 관련된 저산소성 반음영부위의 염증을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기 및/또는 손상된 장기와 관련된 저산소성 반음영부위에서 대식세포의 활성화를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질의 투여는 손상된 장기 및/또는 손상된 장기와 관련된 저산소성 반음영부위의 세포의 어팝토시스를 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 저산소성 반음영부위는 장기 손상과 관련된 저관류의 결과이다. 저관류는 장기 또는 뇌 또는 손과 같은 심장에서 먼 부위로의 혈액의 부적절한 공급을 말한다. 저관류가 지속되면, 산소 부족을 야기할 수 있으며, 조직으로부터 필요한 영양소 및 폐기물 처리를 박탈시킬 수 있다. 종종 저관류는 조직 사멸을 유도한다. 저관류의 증상은 위치에 따라 변한다. 심장과 같은 장기의 저관류는 기능 문제를 생성할 수 있는 한편, 뇌에서의 저관류는 인지 결함, 불분명한 발음 및/또는 착란상태를 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 장기 또는 사지로의 손상 또는 외상과 관련된 저산소증을 일으킬 위험이 있는 개체에게 투여된다. H-NOX 단백질은 저산소증이 발생할 위험이 있는 의료 개입을 겪고 있는 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, H-NOX 단백질은 수술-관련 저산소증의 가능성을 감소시키기 위하여 수술 전, 수술 동안 또는 수술 후에 개체에게 투여될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 O2를 전달하기 위해 충분한 양의, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질을 이를 필요로 하는 개체에게 투여함으로써, 개체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간, 원숭이, 고릴라, 유인원, 여우원숭이 등), 소, 말, 돼지, 개 또는 고양이)에게 O2를 전달하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 개체(예를 들어, 포유동물)의 혈액에 하나 이상의 H-NOX 조성물을 전달하는(예를 들어, 주입 등) 단계를 포함하는, 포유동물과 같은 개체에게 혈액 가스를 운반하거나 전달하는 방법을 제공한다. 혈액 또는 조직(예를 들어, 포유동물 혈액 또는 조직)에 O2 운반자를 전달하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. 다양한 실시형태에서, H-NOX 단백질은 헴에 결합할 수 있는 아포단백질이거나 헴에 결합된 홀로단백질이다. H-NOX 단백질은 개체에게 H-NOX 단백질이 투여되기 전에 결합된 헴을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 02는 H-NOX 단백질이 개체에게 전달되기 전에 H-NOX 단백질에 결합된다. 다른 실시형태에서, 02는 개체에게 H-NOX 단백질의 투여 전에 H-NOX 단백질에 결합되지 않으며, H-NOX 단백질은 개체 내의 한 위치로부터 개체 내의 다른 위치로 O2를 수송한다.
O2에 대해 상대적으로 낮은 KD(예를 들어, 약 80 nM 미만 또는 약 50 nM 미만)를 가진, 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 야생형 및 돌연변이체 H-NOX 단백질은 낮은 산소 분압을 가진 조직(예를 들어, 종양, 일부 상처, 또는 산소 분압이 1 mmHg 미만의 p50과 같이 매우 낮은 다른 영역)을 치료하기 위해 특히 유용할 것으로 예상된다. O2에 대한 그러한 H-NOX 단백질의 높은 친화성은 O2가 H-NOX 단백질에 결합된 채 남아 있는 시간의 길이를 증가시켜서, H-NOX 단백질이 치료될 조직에 도달하기 전에 방출되는 O2의 양을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 신체내 특정 부위(예를 들어, 장기 손상 부위)에 O2가 결합된 H-NOX 단백질을 직접 전달할 경우, O2에 대한 koff는 KD 값보다 더 중요하며, 그 이유는 O2가 이미 단백질에 결합되어 있으며(kon을 덜 중요하게 만듦) 산소가 신체내 특정 부위 또는 그 근처에서 (koff에 의해 영향을 받는 속도로) 방출되는 것이 필요하기 때문이다. 일부 실시형태에서, koff는 또한 H-NOX 단백질이 순환계 내의 적혈구의 존재 하에 있을 때 중요할 수 있으며, 여기서 H-NOX 단백질은 적혈구로부터 O2의 확산을 촉진하며, 아마도 O2를 혈관구조 내의 추가 지점으로 수송하는 희석된 적혈구의 능력을 연장시킨다.
일부 실시형태에서, 개체의 혈류에서 순환하는 H-NOX 단백질의 전달의 경우, H-NOX 단백질은 폐에서 02에 결합하고 신체내 하나 이상의 다른 부위에서 O2를 방출한다. 이들 응용 중 일부의 경우, KD 값은 koff 보다 더 중요하며, 그 이유는 O2 결합이 평형 또는 평형 근처에 있기 때문이다. 일부 실시형태에서, 극심한 혈액희석의 경우, H-NOX 단백질이 주요 O2 운반자일 경우, KD가 koff 보다 더 중요하며, 그 이유는 H-NOX 단백질이 순환계를 통해 이동하면서 O2를 계속하여 결합하고 방출할 것이기 때문이다. 헤모글로빈은 14 mm Hg의 p50을 가지고, 적혈구(커패시터처럼 작용함)는 ~ 30 mmHg의 p50을 가지며, 5 mm Hg 내지 90 mm Hg 범위를 갖는 HB0C가 개발되었으므로, H-NOX 단백질을 위한 최적의 KD 범위는 따라서 일부 응용의 경우 ~2 mm Hg 내지 ~100 mm Hg일 수 있다.
중합체 H-NOX 단백질은 또한 영상화를 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 광 영상화는(예를 들어, 광 간섭 단층촬영, 예를 들어, Villard, J. W. (2002). Circulation 105:1843-1849를 참고하며, 이 문헌은 특히 광 간섭 단층촬영과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함됨) 적혈구에 의해 판단하기 어려워진다. H-NOX 용액을 이용한 관류는, H-NOX 단백질이 적혈구보다 훨씬 작기 때문에 순환계 및 혈관벽의 더 선명한 영상을 가능하게 한다.
본 발명의 중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 H-NOX 단백질 및 약학 조성물은 경구, 국소, 안내, 척추강내, 폐내, 기관내, 또는 에어로졸 투여에 의해서; 경피 또는 점막 흡착에 의해; 또는 주사(예를 들어, 피하, 정맥내, 동맥내, 소낭내, 또는 근육내 주사)에 의해서와 같은 임의의 종래 수단에 의해 개체에게 투여될 수 있다. H-NOX 단백질은 또한 혈액 대체제로서 사용하기 위한 큰 용적의 비경구 용액 내에 포함될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, H-NOX 단백질은 개체의 혈액(예를 들어, 정맥, 동맥 또는 모세관과 같은 혈관으로의 투여), 상처, 종양, 저산소성 조직, 또는 저산소성 장기에 투여된다.
일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스로서 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 주입에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화되지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화 및 비-페길화 H-NOX를 포함한다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간보다 긴 시간에 걸친 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 손상된 장기로의 주입에 의해 또는 전신 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스에 의해 개체에게 투여되며 이어서 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스로서 그리고 이어서 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간 보다 긴 시간에 걸친 주입에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 볼루스에 의한 H-NOX 단백질의 투여 후 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간 보다 긴 시간에서의 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 전신적으로 그리고 이어서 주입에 의해 전신적으로 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 손상된 장기에 그리고 이어서 주입에 의해 전신적으로 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 손상된 장기에 그리고 이어서 손상된 장기에 또는 손상된 장기와 관련된 저산소성 반음영부위로의 주입에 의해 개체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 볼루스에 의해 전신적으로 그리고 이어서 손상된 장기에 또는 손상된 장기와 관련된 저산소성 반음영부위로의 주입에 의해 개체에게 전달된다.
일부 실시형태에서, H-NOX는 약 10 mg/kg 내지 약 300 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 100 mg/kg 내지 약 150 mg/kg, 약 150 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 200 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 또는 약 250 mg/kg 내지 약 300 mg/kg 중 임의의 것의 범위의 투여량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 10 ml 내지 약 1 L의 용적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 10 ml 내지 약 25 ml, 약 25 ml 내지 약 50 ml, 약 50 ml 내지 약 100 ml, 약 100 ml 내지 약 200 ml, 약 200 ml 내지 약 300 ml, 약 300 ml 내지 약 400 ml, 약 400 ml 내지 약 500 ml, 약 500 ml 내지 약 600 ml, 약 600 ml 내지 약 700 ml, 약 700 ml 내지 약 800 ml, 약 800 ml 내지 약 900 ml, 또는 약 900 ml 내지 약 1 L의 용적으로 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 또는 약 30 분 중 임의의 시간보다 적은 기간에 걸쳐 볼루스로서 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 30 분 내지 약 7 일의 기간에 걸쳐서 주입에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 약 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 또는 7 일 중 임의의 시간보다 긴 시간에 걸쳐서 주입에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 약 30 분 내지 1 시간, 약 1 시간 내지 약 2 시간, 약 2 시간 내지 약 3 시간, 약 3 시간 내지 약 4 시간, 약 4 시간 내지 약 5 시간, 약 5 시간 내지 약 6 시간, 약 6 시간 내지 약 7 시간, 약 7 시간 내지 약 8 시간, 약 8 시간 내지 약 9 시간, 약 9 시간 내지 약 10 시간, 약 10 시간 내지 약 11 시간, 약 11 시간 내지 약 12 시간, 약 12 시간 내지 약 16 시간, 약 16 시간 내지 약 18 시간, 약 18 시간 내지 약 1 일, 약 1 일 내지 약 2 일, 약 2 일 내지 약 3 일, 약 3 일 내지 약 4 일, 약 4 일 내지 약 5 일, 약 5 일 내지 약 6 일, 또는 약 6 일 내지 약 7 일 중 임의의 시간 보다 긴 주입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화되지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화 및 비-페길화 H-NOX를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간으로의 투여를 위한 H-NOX 단백질의 유효량은 몇 그램 내지 약 350 그램 이상이다. H-NOX 단백질의 다른 예시적인 투여량은 약 0.5 ml/분과 같은 적절한 주입 속도에서 약 4.4, 5, 10, 또는 13 G/DL(여기서 G/DL은 순환계내로의 주입 이전에 H-NOX 단백질 용액의 농도임) 중 임의의 값을 포함한다(예를 들어, Winslow, R. Chapter 12 In Blood Substitutes 참고). 각 투약 형태의 개별 투여량 내에 함유된 활성 성분의 단위 함량은 그 자체가 유효량을 구성할 필요는 없으며, 그 이유는 필요한 유효량이 다수의 투여의 조합된 효과에 의해 도달될 수 있기 때문이다. 약학 조성물 내에 포함될 H-NOX 단백질의 양의 선택은 이용되는 투약 형태, 치료되는 병태, 및 당업자의 결정에 따라 이루어져야 할 구체적 목적에 의존한다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화되지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 페길화 및 비-페길화 H-NOX를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물의 지속적인 연속 방출 제형이 이용된다. H-NOX 단백질의 투여는 예를 들어, 투여 목적에 따라 수 초 내지 시간의 기간 동안 발생할 수 있다. 예를 들어, 혈액 전달 비히클로서, 투여의 예시적인 시간 과정은 가능한 신속하다. 다른 예시적인 시간 과정은 약 10, 20, 30, 40, 60, 90, 또는 120 분 중 임의의 시간을 포함한다. 혈액 대체물로서 H-NOX 용액을 위한 예시적인 주입 속도는 약 30 mL/시간 내지 약 13,260 mL/시간, 예를 들어, 약 100 mL/시간 내지 약 3,000 mL/시간이다. H-NOX 단백질의 예시적인 총 투여량은 13,260 mL/시간으로 20 분에 걸쳐서 투여되는 약 900 mg/kg이다. 돼지를 위한 H-NOX 단백질의 예시적인 총 투여량은 약 18.9 그램이다.
예시적인 투약 빈도는 1 주에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 회(즉, 매일)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 하루에 적어도 2, 3, 4, 또는 6 회 투여된다. H-NOX 단백질은 예를 들어, 수 일 또는 수 주 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질은 수 개월 또는 수 년과 같은 더 긴 기간 동안 투여된다. 조성물의 투약 빈도는 투여하는 의사의 판단에 기초하여 치료 과정에 걸쳐 조정될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질(예를 들어, 중합체 H-NOX 단백질)은 다른 치료법과 조합되어 또는 함께 사용된다. 예를 들어, 뇌졸중 또는 뇌졸중과 관련된 저산소증의 치료의 경우. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법의 투여 전 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 또는 24 시간 중 임의의 시간에 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법의 투여와 동시에 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, H-NOX는 다른 치료법의 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 또는 24 시간 중 임의의 시간에 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX는 다른 치료법과 조합되어 투여된다. 일부 실시형태에서, 비-페길화 H-NOX는 다른 치료법과 조합되어 투여된다. 일부 실시형태에서, 페길화 및 비-페길화 H-NOX는 다른 치료법과 조합되어 개체에게 투여된다.
상기에 개시된 대로, H-NOX 단백질을 위한 투여량의 선택은 이용되는 투약 형태, 투여의 빈도와 횟수, 치료되는 병태 및 당업자의 결정에 따라 이루어야 하는 구체적 목적에 의존한다. 일부 실시형태에서, 인간으로의 투여를 위한 H-NOX 단백질의 유효량은 수 그램 내지 350 그램 이상이다.
일부 실시형태에서, 둘 이상의 상이한 H-NOX 단백질이 동시에, 순차적으로 또는 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, O2의 전달을 위해 유용한 다른 화합물 또는 치료법이 하나 이상의 H-NOX 단백질의 투여와 동시에, 순차적으로, 또는 함께 투여된다.
H-NOX 단백질이 사용될 수 있는 다른 예시적인 치료적 응용은 예를 들어, 미국 특허 6,974,795호 및 6,432,918호에 의해 개시되며, 그 각각은 특히 O2 운반자를 위한 치료적 응용과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
H-NOX 단백질을 가진 키트
중합체 H-NOX 단백질을 비롯한 본 명세서에 개시된 H-NOX 단백질 중 임의의 것 및 적합한 패키징을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) H-NOX 단백질(예를 들어, 본 명세서에 개시된 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 단백질 또는 본 명세서에 개시된 그의 제형) 및 (ii) 개체에게 O2를 전달하기 위하여 키트를 이용하기 위한 설명서를 가진 키트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상의 결과를 감소시키는데(예를 들어, 뇌졸중과 관련된 감각운동 결함의 감소) 사용하기 위하여 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상 후 저산소성 조직(예를 들어, 저산소성 반음영부위)으로의 O2의 전달에서 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소증의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 장기로의 손상 후 저산소성 조직(예를 들어, 저산소성 반음영부위)으로의 O2의 전달에서의 사용을 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 개체에서 장기로의 손상과 관련된 저산소증의 결과를 감소시키는데 있어서의 사용을 위해 제공된다.
일부 실시형태에서, 키트는 페길화 및 비-페길화 H-NOX 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트 내의 페길화 H-NOX 및 비-페길화 H-NOX는 조성물 내에 있다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 페길화 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다.
일부 실시형태에서, 키트는 중합체 H-NOX 단백질(예를 들어, 페길화 중합체 H-NOX 단백질 및/또는 비-페길화 H-NOX 단백질)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 둘 이상의 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질의 유효량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 개시된 야생형 또는 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 재조합 단량체 H-NOX 단백질의 유효량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 돌연변이에 해당하는 돌연변이 및 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 인간 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼량체 H-NOX 단백질은 개 H-NOX 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 3개의 단량체를 포함하는 삼량체 H-NOX 단백질을 포함하며, 각 단량체는 티. 텡콘젠시스 L144F H-NOX 도메인 및 폴드온 도메인을 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물을 위한 적합한 패키징은 본 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 바이알(예를 들어, 밀봉된 바이알), 그릇(vessel), 앰퓰, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 미라르(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이들 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 단위 투약 형태가 제공된다. 이들 단위 투약 형태는 단일 또는 다중 단위 투여량으로 적합한 패키징에 저장될 수 있으며, 또한 추가로 멸균되고 밀봉될 수 있다. 본 발명의 키트에서 공급되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 설명서(예를 들어, 키트에 포함된 인쇄지)이지만, 기계-판독성 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 설명) 또한 허용가능하다. H-NOX 단백질의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료 또는 산업적 용도를 위한 투여량, 투약 스케쥴 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 키트는 치료를 위해 적합한 개체의 선택에 대한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 및/또는 저산소 뇌 손상의 치료를 위한 설명서를 포함한다.
용기는 단위 투여량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-투여량 패키지) 또는 서브-단위 투여량일 수 있다. 예를 들어, 약 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 또는 더 긴 기간 중 임의의 기간과 같은 연장된 기간 동안 개체를 위한 효과적인 치료를 제공하기 위해 충분한 투여량의 본 명세서에 개시된 H-NOX 단백질을 함유하는 키트가 또한 제공될 수 있다. 키트는 또한 H-NOX 단백질의 다수의 단위 투여량 및 사용 설명서를 포함할 수 있으며 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제전문 약국(compounding pharmacies)에서의 저장 및 사용을 위해 충분한 양으로 포장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 일반적으로 H-NOX 단백질의 안정한 수성 현탁액을 형성하기 위해 재구성, 재현탁 또는 재수화될 수 있는 건조(예를 들어, 동결건조된) 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 페길화 및/또는 비-페길화 H-NOX를 함유하는 제조 물품을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 페길화 및 비-페길화 H-NOX의 혼합물을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제조 물품은 그릇, 바이알, 단지, 앰퓰, 캡슐, 시린지 또는 백이다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 약 95:5, 약 90:10, 약 80:20, 약 75:25, 약 70:30, 약 60:40, 약 50:50, 약 40:60, 약 30:70, 약 25:75, 약 20:80, 약 10:90, 약 5:95, 또는 약 1:99 중 임의의 것이다. 일부 실시형태에서, 페길화 H-NOX는 장벽에 의해 비-페길화 H-NOX로부터 격리된다. 일부 실시형태에서, 장벽은 페길화 H-NOX와 비-페길화 H-NOX가 혼합되도록 하기 위해 사용 전에 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 페길화 및 비-페길화 H-NOX의 혼합물을 함유한 시린지를 제공한다.
H-NOX 단백질의 생산을 위한 예시적인 방법
본 발명은 또한 페길화 및 비-페길화 H-NOX 단백질을 포함하는 조성물의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 페길화 H-NOX를 비-페길화 H-NOX와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물 내의 페길화 대 비-페길화 H-NOX의 비는 약 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40; 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85; 10:90; 5:95; 1:99 또는 그 사이의 임의의 비 중 어느 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 H-NOX 단백질(예를 들어, 중합체 H-NOX 단백질) 중 임의의 것을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 중합체 H-NOX 단백질을 인코딩하는 핵산을 가진 세포를 중합체 H-NOX 단백질의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 중합체 H-NOX는 또한 정제된다(예를 들어, 세포 또는 배양 배지로부터 H-NOX 단백질의 정제). 일부 실시형태에서, 본 방법은 H-NOX 도메인 및 중합 도메인을 포함하는 단량체 H-NOX 단백질을 인코딩하는 핵산을 가진 세포를 배양하는 것을 포함한다. 그 후 단량체는 생체내 또는 시험관내에서 관련하여 중합체 H-NOX 단백질을 형성한다. 이종성 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질은 원하는 H-NOX 도메인을 가진 단량체 H-NOX 단백질을 인코딩하는 둘 이상의 핵산을 공동-도입함으로써 생성될 수 있으며 이때 둘 이상의 단량체 H-NOX 단백질은 동일한 중합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종성 H-NOX 도메인을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질은 원하는 H-NOX 도메인과 공통의 중합 도메인을 포함하는 상동성 단량체 H-NOX 서브유닛을 포함하는 중합체 H-NOX 단백질을 별도로 제조함으로써 제조된다. 상이한 상동성 H-NOX 단백질은 이종성 H-NOX 서브유닛의 원하는 비로 혼합되고, 상동성 중합체 H-NOX 단백질은 (예를 들어, 열, 변성제, 고염 등에 의해) 해리되고, 그 후 관련하여 이종성 중합체 H-NOX 단백질을 형성한다. 이종성 중합체 H-NOX 단백질의 혼합물은 원하는 비의 원하는 서브유닛의 존재에 대해 선별함으로써 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, 각각의 상이한 H-NOX 단량체는 이종성 중합체 H-NOX 단백질의 정제 및 이종성 서브유닛의 확인과 정량을 돕기 위하여 구별되는 태그를 가질 수 있다.
상기에 개시된 바처럼, 몇몇 야생형 H-NOX 단백질 및 핵산의 서열이 알려져 있으며, 본 발명의 돌연변이체 H-NOX 도메인 및 핵산을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 재조합 H-NOX 단백질의 돌연변이, 발현 및 정제를 위한 기술은 예를 들어, Boon, E.M. et al. (2005). Nature Chemical Biology 1:53-59 및 Karow, D. S. et al. (August 10, 2004). Biochemistry 43(31):10203-10211에 의해 개시되었으며, 이들은 특히 재조합 H-NOX 단백질의 돌연변이, 발현 및 정제와 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 이들 기술 또는 다른 표준 기술이 임의의 돌연변이체 H-NOX 단백질을 생성하기 위하여 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에 개시된 돌연변이체 H-NOX 단백질은 본 기술분야에 알려진 많은 방법에 의해 생성될 수 있다. 돌연변이는 아미노산의 화학적 변형에 의해 아미노산 수준에서 또는 주어진 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변형에 의해 코돈 수준에서 발생할 수 있다. 단백질 내의 임의의 주어진 위치에서의 아미노산의 치환은 그 아미노산을 코딩하는 코돈을 변화시킴으로써 이루어질 수 있다. 이것은 예를 들어, (i) Taylor, J.W. et al. (December 20, 1985). Nucleic Acids Res. 13(24):8749-8764; Taylor, J.W. et al. (December 20, 1985). Nucleic Acids Res. 13(24):8765-8785; Nakamaye, K. L. et al. (December 22, 1986). Nucleic Acids Res. 14(24):9679-9698; 및 Dente et al. (1985). in DNA Cloning, Glover, Ed., IRL Press, pages 791-802의 방법에 기초한 아머샴(Amersham) 기술(아머샴 돌연변이유발 키트, 오하이오주 클리브랜드 소재의 아머샴, 인크.), (ii) 프로메가(Promega) 키트(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 인크.), 또는 (iii) 특히 단백질의 돌연변이유발과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함되는 Kunkel, T. A. (January 1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(2):488-492; Kunkel, T. A. (1987). Methods Enzymol . 154:367-382; Kunkel, 미국 특허 4,873,192호의 방법에 기초한 바이오라드(Biorad) 키트(캘리포니아주 리치몬드 소재의 바이오라드 인크.)를 이용한 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다. 돌연변이유발은 또한 돌연변이체 올리고뉴클레오티드를 이용한 부위-지시된 돌연변이유발을 이용하는 것과 같은, 다른 상업적으로 이용가능한 또는 비상업적 수단에 의해 이루어질 수 있다.
부위-지시된 돌연변이유발은 또한 Zhengbin et al. (1992). pages 205-207 in PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Jones, D. H. et al. (February 1990). Biotechniques 8(2):178-183; Jones, D. H. et al. (January 1991). Biotechniques 10(1):62-66에 개시된 것과 같은 PCR-기반 돌연변이유발을 이용하여 이루어 수 있으며, 이들 문헌은 특히 단백질의 돌연변이유발과 관련하여 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 부위-지시된 돌연변이유발은 또한 당업자에게 알려진 기술을 이용한 카세트 돌연변이유발을 이용하여 이루어질 수 있다.
돌연변이체 H-NOX 핵산 및/또는 중합 도메인은 표준 기술을 이용하여 발현 벡터와 같은 벡터 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 제한 효소가 돌연변이체 H-NOX 핵산 및 벡터를 절단하기 위하여 사용될 수 있다. 그 후, 절단된 돌연변이체 H-NOX 핵산과 절단된 벡터의 양립성 말단이 결찰될 수 있다. 생성된 벡터는 인코딩된 H-NOX 단백질의 발현을 위하여 표준 기술(예를 들어, 전기천공)을 이용하여 세포(예를 들어, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 세균 세포) 내로 삽입될 수 있다.
특히, 이종성 단백질은 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 세균 세포와 같은 많은 생물학적 발현 시스템에서 발현되었다. 따라서, 임의의 적합한 생물학적 단백질 발현 시스템이 다량의 재조합 H-NOX 단백질을 생산하기 위하여 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, H-NOX 단백질(예를 들어, 돌연변이체 또는 야생형 H-NOX 단백질)은 분리된 단백질이다.
원한다면, H-NOX 단백질은 표준 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 그 단백질이 생산될 때 존재하는 다른 성분들이 적어도 약 60 중량% 없다. 다양한 실시형태에서, 단백질은 적어도 중량 기준으로 약 75%, 90%, 또는 99% 순수하다. 정제된 단백질은 예를 들어, 천연 공급원, 재조합 발현 시스템 또는 화학 합성을 위한 반응 혼합물로부터의 정제(예를 들어, 추출)에 의해 수득될 수 있다. 예시적인 정제 방법은 면역침전, 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피, 자기 비드 면역친화성 정제, 및 플레이트-결합 항체를 이용한 패닝(panning), 및 당업자에게 알려진 다른 기술을 포함한다. 순도는 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정제된 단백질은 본 발명의 약학 조성물 내로 통합되거나 본 발명의 방법에서 사용된다. 본 발명의 약학 조성물은 정제된 단백질에 더하여 첨가제, 담체, 또는 다른 성분을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체 H-NOX 단백질은 하나 이상의 His6 태그를 포함한다. 적어도 하나의 His6 태그를 포함하는 H-NOX 단백질은 크로마토그래피를 이용하여, 예를 들어, Ni2+-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 정제 후, His6 태그는 예를 들어, 엑소펩티다제를 이용하여 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 중합체 H-NOX 단백질을 제공하며, 이때 중합체 H-NOX 단백질은 His6 태그의 사용을 통해 정제되었다. 일부 실시형태에서, 정제된 H-NOX 단백질은 His6 태그를 제거하기 위하여 엑소펩티다제로 처리된다.
실시예
순수하게 본 발명의 예시를 목적으로 하며 따라서 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안되는 실시예는 또한 상기에 토의된 본 발명의 양태와 실시형태를 개시하고 상세히 설명한다. 실시예는 하기의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내고자 하는 것이 아니다. 달리 나타내지 않으면, 온도는 섭씨 단위이며 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1. 저산소증의 동물모델
양에서 심근 저산소증
신생아 양을 케타민 하이드로클로라이드(~1 mg/kg)로 마취시키고, 4.5-mm OD 기관내관으로 기관내삽관하고, 헬스다인(Healthdyne) 소아과용 시간-사이클을 가지며, 압력이 제한된 인공호흡기(조지아주 매리에타 소재의 헬스다인)로 기계적으로 인공호흡시켰다. 석시닐콜린 클로라이드(2 mg/kg)를 근육 이완을 위해 간헐적으로 제공하였다. 21% 산소를 이용한 인공호흡은 전신 동맥 PCO2를 35 내지 45 Torr에서 유지하기 위하여 조정되었다. 정중흉골절개(mid-sternotomy incision)를 통해, 전신, 폐, 우 및 좌 동맥 압력을 측정하기 위하여 폴리비닐 카테터를 위치시켰다. 압력-용적 루프 분석을 위해 우 및 좌 심실에 어드미턴스(admittance) 카테터를 위치시키고, 혈류를 측정하기 위하여 좌 폐 동맥에 유동 프로브를 위치시켰다. 그 후 흉골을 타월 클램프(towel clamp)로 닫았다. 안정한 인공호흡으로 45분의 회복기 후, 혈류역학 변수, 전신 동맥 혈액 가스, 및 pH를 측정하였다(기준선 산소정상상태). 그 후 가스 혼합물에 질소를 첨가하여 25 내지 35 Torr의 PO2를 가진 전신 동맥 혈액 가스를 생산함으로써 노르모카르빅(Normocarbic) 저산소증(10% 02)을 유도하였다. 15-30 분의 정상 상태 폐 고혈압 후, 모든 변수를 측정하였다(저산소증).
영구적 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 모델
약간 변형된, 실리콘-팁을 가진 강내 쓰레드 폐색법(silicone-tipped intraluminal thread occlusion method)을 이용하여, 8주령 수컷 스프라그 다우리(Sprague Dawley) 래트(290-310 g)(찰스 리버(Charles River))에서 MCA의 폐색에 의해 영구적 국소 대뇌 허혈을 생성하였다. 자발적 환기를 이용하여 3% 이소플루레인의 흡입에 의해 마취를 유도하고 수술동안 2-2.5%에서 유지하였다. 복측 목 영역을 클로렉시드린 및 알코올로 소독하고 수술 중간선절개를 하여 좌측 총 내 및 외 경동맥을 노출시켰다. 외경동맥(ECA)을 결찰시키고, 총경동맥(CCA) 및 내경동맥(ICA)을 미세 혈관 클립으로 일시적으로 닫았다. ECA내에 작은 절개를 만들고 실리콘-코팅된 모노필라멘트 봉합선(도콜 코포레이션(Doccol Corporation))을 ECA를 통해 ICA내에 삽입하였다. 필라멘트를 25 mm 더 진전시켜 MCA의 오리진을 폐쇄하였다. 영구적 폐색은 ICA내에 폐색 쓰레드를 남겨둠으로써 이루어졌다. 미세 혈관 클립을 조심스럽게 제거하고 그 후 상처를 닫고 소독하였다. 가짜 수술의 경우, 수술 기간 동안 모든 동맥을 노출시켰지만 필라멘트를 삽입하지 않았다.
엔도테린(Endothelin)-1(ET1) 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 뇌졸중 모델
찰스 리버로부터 구매한 성체 수컷 스프라그-다우리(SD) 래트(3-4 개월령: 280-320 g; 6-10 개월령: 500-800 g)에서 일시적 MCAO(tMCAO)를 유도하였다. 래트에게 진통제(부프레노르핀(buprenorphine); 0.05 mg kg-1 s.c)를 투여하고, 02와 4% 이소플루레인의 혼합물로 마취시킨 후 코프(Kopf) 입체 프레임(stereotaxic frame)에 두었다. 프레임에 부착된 노즈 콘(nose cone)을 통해 전달된 O2와 2% 이소플루레인의 혼합물을 이용하여 수술 동안 마취를 유지하였다. 두개골을 노출시키고, 우반구에 후방측 머리뼈에 작은 구멍을 뚫었다. 26 게이지 바늘을 이용하여, 혈관작용성 펩티드 ET1 240 μM을 하기의 입체 좌표로 1㎕/분의 속도로 우측 MCA에 인접하게 주입하였다: 브레그마(bregma)에 대해 1.6 mm 전방, 5.2 mm 측면 및 8.7 mm 배쪽. 주사 후 3분까지 바늘을 그 자리에 남겨둔 후 제거하였다. 체온은 직장 프로브를 이용하여 폐색 전 및 후에 모니터하였으며 열조절 가열 패드로 37.0 ± 0.2℃에서 유지하였다. MCAO 수술 동안, 활력 징후는 캐프노그래프(capnograph) 및 펄스 옥시미터(pulse oximeter)를 이용하여 계속 모니터하였다. 국소 뇌 혈류량(rCBF)은 허혈 전, MCAO 동안, 및 재관류동안 두개골의 등쪽 표면의 우측에 부착된 레이저 도플러(Laser Doppler) 유동 프로브(VP5 프로브, 무어 인스트루먼츠(Moor Instruments))를 이용하여 측정하였다(도 1a 및 1b). 수술 후 래트에게 부드러운 음식을 제공하여 체중 감소를 최소화하였다. 레이저-도플러 유량계(LDF)로부터의 유동 신호는 국소 뇌 혈류의 신속하고 연속적인 기록 및 혈류에서의 일시적 변화의 검출을 가능하게 하였다. 적어도 60%의 CBF 감소를 나타내지 않은 동물 및 허혈 유도 후 사망한 동물은 실험 그룹으로부터 제외시켰다.
ET1-유도된 tMCAO 모델에서 저산소성 위험이 있는 반음영부위를 저산소증 마커 피모니다졸(피모(pimo), 희생 전 1-2 시간에 60 mg/kg으로 투여됨)로 조직학적으로 가시화하였으며, 이 마커는 급성 저산소증 하의 생존 조직을 라벨링하지만 죽은 조직으로부터는 배제된다(도 2a). tMCAO 후 1일과 7일 사이에 희생된 동물을 피모 염색에 의해 저산소증 용적에 대해 그리고 크레실 바이올렛 염색에 의해 경색 용적에 대해(도 2b; n = 5/그룹), NeuN/플루오로제이드(FluoroJade)(FJ) 염색에 의해 신경 세포 사멸에 대해(도 2c 및 2d; n = 5/그룹), ED1 염색에 의해 소교세포/대식세포 침윤에 대해(도 2e; n = 5/그룹), 그리고 GFAP 염색에 의해 성상교세포종(astrogliosis)의 동력학에 대해(도 2f; n = 5/그룹) 조직학적으로 처리하였다. 두정 뇌 섹션(Coronal brain section)(15 ㎛ 두께)을 브레그마 +4 내지 -4로부터 1 mm 마다 9 좌표 수준에 걸쳐 수득하고 면역조직화학을 위해 처리하였다. 섹션을 -20℃에서 20 분 동안 100% 메탄올로 고정한 후, 실온에서 1-2 h 동안 5% BSA, 5% 염소 혈청 및 0.1% Tween 20으로 차단하고 투과성으로 만들었다. 그 후 섹션을 항-피모니다졸(하이폭시프로브(Hypoxyprobe), 1:100), 항-NeuN(앱캠(Abcam)), 항-GFAP(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)), 또는 항-ED1(AbD 세로텍(Serotec)) 항체와 4℃에서 밤새 항온처리하고, 이어서 실온에서 2 h 동안 항-토끼 또는 항-래트 이차 항체(1:1000, 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories))와 항온처리하였다. 신경 손상을 가시화하기 위하여, 그 후 뇌 섹션을 개시된 대로(Nguemeni et al. 2015 J Neurosci Methods. 2015 Mar 15;242:72-6) 플루오로-제이드 C(FJC, 미국 아칸사주 소재의 히스토-켐 인크.(Histo-Chem Inc.))로 염색하였다. 섹션을 슬로우페이드(SlowFade) DAPI(인비트로겐(Invitrogen)) 상에 올려놓고 CCD 디지털 카메라를 구비한 HD 악시오이미저(AxioImager) 자이스(Zeiss) 현미경을 이용하여 세포 분석을 위한 UCSF 실험실에서 영상화하였다. 뉴런을 NeuN 또는 플루오로-제이드(FJ; 신경퇴행)로 라벨링하고 염증 세포를 ED1(활성화된 소교세포/대식세포) 또는 GFAP(성상세포)로 검출하였다. NeuN+, FJ+ 및 ED1+ 세포의 수를 세고 GFAP 신호에 의해 덮인 영역의 퍼센트를 경색 주변 영역에 위치한 피질의 2 비-중복 영역에서 좌표 수준 당 8개 섹션에서 측정하였다.
tMCAO 후 1 시간 내지 1 일 사이에 희생된 동물(n = 10/그룹)을 피모니다졸에 대해 ELISA에 의해 처리하여 저산소성 조직이 경색된 조직 내로 발달하는 것을 따라갔다. 희생시키기 전 2 h에 외인성 저산소증 마커 피모니다졸을 정맥내로 래트에게 주사하였다(60 mg/kg, 매사추세츠주 벌링턴 소재의 하이폭시프로브). 그 후 뇌 단백질을 추출하고 이전에 개시된 대로(Kleither et al 2006 Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys) 경쟁적 피모니다졸 ELISA를 위해 처리하였다. 요약하면, 샘플을 수집하고 항-프로테아제로 보충된 추출 버퍼(앱캠 키트 # ab117996)에서 균질화하였다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 분석을 이용하여 각 샘플에서 정량하였다. 옴니옥스(Omniox)에 의해 개발된 경쟁적 ELISA 분석을 이용하여 피모니다졸(하이폭시프로브-1) 양에 대해 샘플을 분석하였다. 피모니다졸 신호의 감소는 반음영부위의 경색 조직 내로의 발달을 나타낸다(도 2g). IC50 값의 정량화는 피모니다졸 ELISA를 위한 표준 곡선의 5-파라미터 피트를 이용하여 수행하였다. 각 샘플 내의 단백질 농도에 대하여 값을 정규화한 후 비히클 대조군에 대하여 정규화하였다.
실시예 2. H-NOX의 약동학 및 분포
삼량체 H-NOX L144F 및 페길화 삼량체 H-NOX L144F를 대장균에서 발현시키고 3-단계 크로마토그래피 및 버퍼 교환 프로토콜을 통해 정제하여 내독소 수준 <0.01 EU/mg인 >99% 순수 생성물을 수득하였다. 래트에게 100 mg/kg의 삼량체 H-NOX L144F 또는 50 mg/kg의 페길화 삼량체 H-NOX L144F를 정맥내로 주사하고 혈장 샘플을 표시된 대로 주사 후 5분 내지 96 시간에 수집하였다(도 3). 삼량체 H-NOX L144F의 혈장 수준은 H-NOX 단백질에 대해 특이적인 ELISA 분석을 이용하여 정량하였으며, 정상 상태 분포 용적(Vss)을 결정하였다(표 2). 순환 반감기는 5 파라미터 비선형 피트 모델을 이용하여 데이터 포인트를 피팅함으로써 계산하여, 삼량체 H-NOX L144F를 위해 1 시간의 순환 반감기 및 페길화 삼량체 H-NOX L144F를 위해 20 시간의 유의하게 더 긴 반감기를 수득하였다. 페길화 삼량체 H-NOX L144F의 정상 조직 내로의 제한된 분포는 래트를 위한 정상 상태에서의 작은 분포 용적(~ 41 ml/kg)에 의해 입증되었으며, 이것은 래트에서 혈장 용적의 분포 용적보다 약간 더 큰 것이다(31.2 mL/kg; Davis, B. & Morris, T, 1993, Pharmaceutical Res 10, 1093). 처리된 래트에서 어떤 부작용도 주목되지 않았으며 삼량체 H-NOX L144F는 혈액 화학 또는 혈액학 파라미터에서 유의한 변화를 유도하지 않아, 삼량체 H-NOX L144F가 잘 용인됨을 나타낸다(데이터는 도시 안함).
[표 2] H-NOX 약동학
Figure pct00003
삼량체 H-NOX L144F 또는 페길화 삼량체 H-NOX L144F(400 mg/kg)를 ET1-유도된 tMCAO 후 1h에 래트에서 정맥내로 투여하였다. 폐색 후 2 시간 내지 24 시간에 동물을 희생시켰다. 뇌를 절단하고 항-H-NOX 및 항-CD31 항체로 염색하였다. CD31은 혈관구조를 가시화하기 위해 이용되는 내피 세포를 위한 마커이다. 두 단백질 모두 누출 혈관구조 밖으로 확산되어 뇌 사이질 조직 내로 깊이 침투하였다(도 4a 및 4b). 삼량체 H-NOX L144F가 투여 후 1h에 허혈 병변 내의 혈관구조 바깥에서 검출되어, 뇌 실질 이내에서의 삼량체 H-NOX L144F의 조기 분포를 입증하였다(도 4a). 그것의 긴 순환 반감기로 인하여, 페길화 삼량체 H-NOX L144F는 경색 및 경색 주변 영역에서 뇌 실질에서 적어도 24h 동안 보유되었으며, 비허혈 반대편 측상의 혈관 내강에 남아 있었다(도 4b). 경색된 뇌 체류 시간에 기초하여, 페길화 삼량체 H-NOX L144F를 추가 시험을 위해 선택하였다.
실시예 3. 저산소성 조직으로의 산소의 기능성 H- NOX -매개 전달
저산소성 조직에서 산소의 실시간 검출(옥시라이트 프로브)
7 내지 8주령의 Nu/Nu 암컷 마우스에 3 x 106의 H460 인간 폐암 세포를 피하로 이식하고 종양이 ~ 600 mm3 의 평균 크기에 도달할 때까지(종양 세포의 이식 후 9-18일) 모니터하였다. 500-700 mm3 이종이식편 H460 종양을 보유한 마우스를 20%의 산소에서 혼합된 이소플루오레인으로 마취시키고 옥시라이트TM 산소-감지 나노섬유 장치(영국 소재의 옥스포드 옵트로닉스)를 미세조작기를 이용하여 H460 피하 이종이식편 종양 내로 이식하였다. 옥시라이트TM는 끝에 직경이 230 ㎛인 중합체 매트릭스 내에 유지된 루테늄 클로라이드 염료로 이루어진다. ~ 20-30 분 동안의 평형화 후, 광학 형광 센서 및 4-패널 유닛을 이용하여 p02를 측정하였다. 낮은 출발 p02는 이웃 혈관(~ 0.2-1 mmHg)으로부터 떨어져 있는 저산소성 조직으로의 진입을 확인하였다. 프로브 이식 후, pO2 측정을 안정화시키기 위하여 프로브를 ~30분 동안 두었다. 50-100 ul의 제형 버퍼(50 mM 석시네이트, 50 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 pH 7의 10 mM 환원된 글루타치온) 내의 10 mg의 삼량체 H-NOX L144F 또는 페길화 삼량체 H-NOX L144F를 마우스에게 정맥내로 또는 종양 내로 주사하였으며 형광 켄칭을 실시간으로 기록하였다(도 5). 삼량체 H-NOX L144F는 주사 후 약 15 분에 최고 산소 전달을 야기하였으며, 조직은 주사 후 약 50 분까지 정상산소농도 수준으로 돌아간 한편, 페길화 삼량체 H-NOX L144F는 보다 점진적이고 연장된 산소 방출을 야기하여, 저산소성 조직이 정상산소농도 수준으로 돌아가는 것은 주사 후 약 200 분으로부터 주사 후 적어도 450 분으로 연장되었다.
실시예 4. H-NOX는 허혈 병변을 개선시킨다
저산소성 위험이 있는 반음영부위를 저산소증 마커 피모니다졸(피모)을 이용하여 조직학적으로 가시화하였으며, 이 마커는 급성 저산소증 하에 있는 생존 조직을 라벨링하지만 사멸 조직으로부터 배제된다. 피모니다졸을 희생 전 1-2 h에 60 mg/kg(래트) 또는 100 mg/kg(양)으로 투여하였다. 동물을 H-NOX/비히클 투여 후 6h에 희생시켰다. 장기를 동결시키고 경쟁적 피모니다졸 ELISA를 위해 처리하였다(도 6). 피모니다졸 염색에 의해 측정한 저산소증 수준은 ET1 MCAO 설치류 뇌졸중 모델 및 심근 저산소증 양 모델 둘 모두에서 비히클에 비하여 삼량체 H-NOX L144F 투여 후 유의하게 더 낮았다. 대안적으로, 절단 및 항-피모니다졸 항체(하이드록시프로브)를 이용한 염색을 위해 양에서 샘플을 수집하였으며, 대표적인 사진이 하부 패널에 나타난다.
경색 크기에 대한 삼량체 H-NOX L144F의 효과를 조사하기 위하여, 페길화 삼량체 H-NOX L144F(240 mg/kg) 또는 비히클을 tMCAO 후 1 시간에 전신적으로 투여하였으며, 3일 동안 24시간마다 투여를 반복하였다. 1일과 7일 사이에 동물을 희생시켰으며, 크레실 바이올렛 염색을 이용한 조직학에 의해 경색 용적을 정량하였다(도 7a). 다른 실험에서는, 동물을 제1일 또는 제7일에 희생시키고, 경색 및 저산소성 조직 용적을 이전에 개시된 대로 각각 크레실 바이올렛 및 피모니다졸 염색을 이용하여 조직학에 의해 정량하였다(도 7b). tMCAO 후 1일에 비히클-처리된 래트에서 나타난 산소-박탈 저산소성 조직(도 7b, 백색 막대)은 7일까지 천천히 사멸하여, ~25%만큼 경색이 확장되었다. 대조적으로, 페길화 삼량체 H-NOX L144F는 산소-박탈 저산소성 조직이 경색된 조직 내로 진행하는 것을 ~ 90% 방지하여, 페길화 삼량체 H-NOX L144F가 대부분의 저산소성 조직을 구하였음을 나타낸다(도 7b).
혈관 폐색 후, 산소-박탈 반음영부위내에 위치한 많은 신경 세포가 개시 후 수 시간 내지 수 일 동안 어팝토시스를 일으킨다. 따라서, 본 발명자들은 삼량체 H-NOX L144F 및 삼량체 H-NOX L144F + 페길화 삼량체 H-NOX L144F의 1:1 혼합물이 매우 낮은 O2 농도를 가진 조직 영역에 도달하면 산소를 전달함으로써 저산소증 및 세포 사멸을 감소시키는지 여부를 조사하였다. 저산소증 수준을 피모니다졸에 대한 ELISA 분석으로 측정하였으며, 피모니다졸은 심각한 저산소증 하의 생존 조직을 라벨링하며(도 8a), 카스파제 9 활성은 생물발광 분석을 이용하여 측정하였다(도 8b). 카스파제-9의 활성은 제조사의 설명서에 따라 카스파제-글로(Caspase-Glo)® 9 분석 시스템(프로메가(Promega))으로 측정하였다. 요약하면, 뇌 단백질을 천연 용해 버퍼(앱캠)로 추출하고 25 μL의 단백질 추출물을 카스파제 9 억제제 Ac-LEHD-CHO(엔조 라이프사이언시즈(Enzo Lifesciences))의 존재 또는 부재 하에서 25 μL의 카스파제-글로® 9 시약과 항온처리하였다. 각 샘플의 발광을 빅토르(Victor) 3 루미노미터(luminometer)(펄킨 엘머(Perkin Elmer))로 1 시간 동안 37℃에서 90초 마다 측정하였다. 발광 신호 곡선 하의 면적을 각 샘플에 대하여 계산하여 그래프를 그렸다. tMCAO 후 30분에 투여된 삼량체 H-NOX L144F + 페길화 삼량체 H-NOX L144F의 1:1 혼합물의 단일 투여량(120 mg/kg 또는 240 mg/kg)은 투여량-의존 방식으로 개시 후 6 시간에 비히클에 비하여 저산소증 수준 및 카스파제 9 활성을 ~ 50%만큼 유의하게 감소시켰다. 페길화 삼량체 H-NOX L144F 단독(240 mg/kg) 또는 비히클이 tMCAO 후 1 시간에 투여된 경우, 개시 후 6 시간에 저산소증 수준에서 차이가 관찰되지 않았다.
ET1-매개 혈관 폐색으로 인한 심각한 산소 고갈은 염증 과정을 촉발하여 신경혈관 손상에 기여하는 소교세포, 대식세포 및 성상세포 활성화를 유도한다. 삼량체 H-NOX L144F에 의한 심각한 저산소증의 감소가 신경아교증을 감소시키는지를 조사하기 위하여, ET1-유도된 tMCAO를 가진 래트에게 폐색 후 1 시간에 페길화 삼량체 H-NOX L144F(240 mg/kg)를 투여하고 3 일 동안 24 시간마다 투여를 반복하였다. tMCAO 후 제7일에 래트를 희생시키고, 뇌를 절단하고 GFAP(성상세포) 및 ED1(활성화된 소교세포 및 대식세포)에 대한 면역조직화학에 의해 처리하였다. 페길화 삼량체 H-NOX L144F-처리된 동물은 tMCAO 후 7 일에 활성화된 소교세포 및 대식세포의 존재 하에서 ~ 50-80% 유의한 감소를 나타냈다(도 9).
비-인간 영장류 및 인간 또한 뇌졸중 후 저산소성 반음영부위를 발생시키므로, 본 설치류 데이터는 영장류에서의 뇌졸중을 위한 우수한 모델을 제공하며 본 결과는 인간을 비롯한 영장류에게 적용가능하다.
실시예 5. H-NOX는 나이든 래트에서 허혈 기능적 결함을 감소시킨다
나이는 뇌졸중에 대한 주요 위험 인자이며, 나이든 래트에서 장기적인 조직학적 및 기능적 결과의 평가의 중요성을 강조한다. tMCAO 후 1 시간에 투여될 경우, 페길화 삼량체 H-NOX L144F-처리된 나이든 래트는 tMCAO 후 29 일에 경색 주변 뉴런의 수에서 유의한 증가를 나타냈다(도 10). 래트의 뇌를 상기에 개시된 대로 준비하고 NeuN 및 GFAP로 염색하였다. NeuN+ 세포의 수를 세고 GFAP 신호에 의해 덮인 영역의 퍼센트를 경색 주변 영역 내에 위치한 피질의 2 비-중복 영역에서 8 좌표/수준(1 mm 마다)에 걸친 섹션에서 측정하였다. 페길화 삼량체 H-NOX L144F로 처리된 래트는 비히클-처리된 대조군보다 경색 주변 영역에서 유의하게 더 많은 뉴런을 가졌다.
감소된 선택적 뉴런 소실과 일관되게, 페길화 삼량체 H-NOX L144F는 tMCAO 후 1 시간에 투여될 때 접착 테이프 제거 작업에서 대조군에 비하여 tMCAO 후 13 일에 감각 기능을 ~ 80%만큼 그리고 운동 기능을 ~ 180%만큼 개선하였다(도 11). tMCAO 후 2 시간에 투여될 경우, 페길화 삼량체 H-NOX L144F로 처리된 나이든 래트는 tMCAO 후 20 일에 대조군에 비하여 ~ 80% 만큼의 운동 기능의 유의한 개선을 나타냈다(도 12). 작업은 각 앞 발에 접착 테이프 스트립(8x8 mm)을 적용하고 래트의 수행을 측정하는 것으로 이루어진다. 4회 측정치를 기록하였다: 1 및 2 (감지) : 래트가 그 앞다리를 흔들고/흔들거나 그 앞다리를 그 입으로 직접적으로 가져갈 때 각 앞다리가 스트립의 존재에 반응하는데 걸리는 시간, 및 3 및 4(제거) : 동물이 동측(손상되지 않은 측) 또는 반대측(병변 측) 발로부터 테이프 스트립을 입으로 제거하는데 걸리는 시간. 만일 래트가 120초 후에 성공하지 못하면, 작업을 중단시켰다. 접촉하기 위한 시간(time-to-contact) 및 제거하기 위한 시간(time-to-remove)은 운동 결함으로부터 감각을 분리한다. 일측 뇌 손상을 가진 래트는 동측 발로부터 접착제와 접촉하고 접착제를 먼저 제거하는 것 둘 모두에 대해 편향을 발생시킨다. 개체간 차이를 감소시키기 위하여, 수술 전 5 일 동안 동물을 훈련시켰다(하루에 4회 시험). 모든 래트가 훈련 마지막에 최적의 수행에 도달하여, 우측과 좌측 사이에 불균형없이 오른발과 왼발 사이에서 접착 테이프와 접촉하기 위한 시간 및 제거하기 위한 시간에서 유사한 수행 및 매우 짧은 지연속도를 나타내었다. 접착제 제거 시험은 비히클 또는 페길화 및 비페길화 삼량체 H-NOX L144F로 처리된 나이든 래트(8-9개월령)에서 뇌졸중 후 1 개월 동안 매주 ~ 2-3회 수행되었다. 결과는 삼량체 H-NOX L144F 처리의 결과로서 개선된 감각 및 운동 기능을 나타낸다.
비-인간 영장류 및 인간도 뇌졸중 후 저산소성 반음영부위가 발생하므로, 본 설치류 데이터는 영장류에서 뇌졸중을 위한 우수한 모델을 제공하며 본 결과는 인간을 비롯한 영장류에 적용가능하다.
실시예 6. tPA 치료와 조합된 H-NOX 안전성
자유 라디칼 분석
재관류는 자유 라디칼의 과다생산을 생성할 수 있으므로, 산소 운반자의 한 가지 안전성 문제는 그들이 자유 라디칼 생산을 증가시켜 단백질, 지질 및 DNA에 대한 이차 산화성 손상을 유도할 가능성이다. 삼량체 H-NOX L144F + 페길화 삼량체 H-NOX L144F의 1:1 혼합물(400 mg/kg)을 tMCAO 후 1 시간에 투여하고, 뇌를 ELISA(옥시셀렉트TM)에 의해 단백질 카르보닐 함량(도 13a)에 대해 그리고 TBAR 분석(케이맨)으로 지질 과산화(도 13b)에 대해 tMCAO 후 6 시간에 분석하였으며, 두 마커는 산화성 스트레스의 지표로서 널리 받아들여진다. 허혈/재관류 손상은 tMCAO 래트의 동측 편에서 단백질 카르보닐화의 증가를 유도하였다. 하지만, 삼량체 H-NOX L144F 투여는 지질 과산화를 위한 마커인 말론디알데하이드나 단백질 산화의 마커인 단백질 카르보닐의 축적을 증가시키지 않았다.
생체내 tPA 분석
중대뇌동맥 폐색(MCAO) 모델을 위한 표준 절차를 7-8주령 스프라그 다우리 래트에서 수행하였다. 래트를 산소 및 산화질소(30:70)에서 혼합된 4% 이소플루레인으로 페이스마스크에 의해 마취시켰다. 중간선 목 절개를 하여 좌 총경동맥을 노출시켰다. 외경동맥 및 약돌구개 동맥을 4-0 실크로 결찰시켰다. 외 및 내 경동맥의 분기점(bifurcation point)에 가까운 외 경동맥의 벽내에 절개를 만들었다. 그 후 4-0 열-둔화된(heat-blunted) 나일론 봉합사(에티콘(Ethicon))를 삽입하고 분기점으로부터 내경동맥 내로 약 17.5 mm 진전시켜, 60 분 동안 중대뇌동맥의 소공(ostium)을 차단하였다. 소정의 폐색 기간 후, 나일론 봉합사를 경동맥으로부터 제거하여 MCA 내로의 혈류의 재관류를 허용하였다. 재관류 후 tPA를 10 mg/ml로 주사하고 페길화 삼량체 H-NOX L144F를 tPA 후 30 분에 100 mg/ml로 주사하였다. 24 시간 후, 래트를 헤파린화된 염수로 관류시키고, 뇌를 2mm 섹션으로 절단하고 실질내 출혈(PH), 출혈 경색(HI) 및 점 또는 점상 출혈(HPT)에 대해 시각적으로 검사하였다. 일단 처리되고 디지털 사진을 찍으면, 모든 섹션을 4도에서 4% PFA에서 고정시켰다. 연구는 STAIR 및 RIGOR 기준에 따라 무작위화되고 맹검으로 수행되었다. 모든 실험을 위하여, 래트는 수술/뇌졸중 절차 전에 처리 그룹으로 무작위로 할당되었으며, 독립 당사자(independent party)를 이용함으로써 무작위화의 은폐가 보장되었다. 무작위화 순서는 사후 분석이 완료될 때까지 밝혀지지 않았다. 표 3에 나타난 대로, 사망률, 질병률, 또는 출혈 발생률에 대해 대조군과 H-NOX-처리된 동물 간에 차이는 없었다.
[표 3]
Figure pct00004
시험관내 tPA 분석
색원체 기질을 이용한 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA, 제넨테크 액티바제(Genentech Activase)) 활성에 대한 분석을 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 요약하면, 1 ㎕의 tPA 용액(5 ng/웰) 및 177 ㎕의 시약 1(30 mM Tris-HCl, 30 mM 이미다졸 및 130 mM NaCl)을 39℃에서 사전항온처리하였다. 10 ㎕의 색원체 기질 용액(4 mM; 최종 농도 0.212 mM)을 첨가하여 반응을 시작하였다. 39℃에서 유지된 가열된 스펙트라맥스(SpectraMax) M2 분광광도계(캘리포니아주 서니베일 소재의 몰에큘러 디바이스(Molecular Devices))를 이용하여 반응을 측정하였다. 405 nm의 OD를 이용한 흡광도의 변화를 측정하였다(△A/분 또는 △A/5 분). 상기에 개시된 절차를 이용하여 확립된 분석을 이용하여, 본 발명자들은 2 ㎕의 페길화 삼량체 H-NOX L144F(최종 농도: 0.01-1000X 분석 웰 내의 tPA의 양)를 이용하였으며, 이것을 1 ㎕의 tPA 및 175 ㎕의 상기에 개시한 시약 1과 예비항온처리하였다. △A/분을 1 분 간격으로 5 분에 걸쳐 측정하였다. 억제제의 효과를 제어하기 위하여, 본 발명자들은 2 ㎕의 PAI-1(최종 농도: 0.247 μM)를 이용하였으며, 이것을 1 ㎕의 tPA 및 175 ㎕의 상기에 개시한 시약 1과 예비항온처리하였다. △A/분을 1 분 간격으로 5 분에 걸쳐 측정하였다(도시 안함). 도 14에 나타난 대로, tPA 양의 100X인 페길화 삼량체 H-NOX L144F의 농도를 이용할 경우, tPA 활성에서 유의한 차이가 없었다.
실시예 7. 래트 영구적 MCAO (pMCAO) 모델에서 H-NOX
ET1 모델에서 관찰된 것보다 더 큰 피질 및 피질하 구조 내의 일관된 경색을 생성하는 근위 pMCAO 모델에서(도 16a) 삼량체 H-NOX L144F를 평가하였다. 경색 용적은 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색을 이용하여 측정하였다. 각 TTC-염색된 섹션을 위하여(2 mm 마다 6개 섹션), 각 반구의 총 면적 및 경색 면적을 이미지제이를 이용하여 측정하였다. 부종에 대해 교정된 경색 용적을 계산하였다(도 16a). 하지만, pMCAO 모델에서 폐색 후 6 시간에 반음영부위 용적은 피모니다졸 라벨링에 의해 측정된 ET1 모델에 비하여 더 작고/작거나 더 빨리 사라진다(도 16b). 피모니다졸(60 mg/kg)을 희생 전 2 시간에 정맥내로 주사하고 섹션을 항-피모니다졸 항체로 염색하거나 조직을 상술한 대로 ELISA에 의해 분석하였다.
삼량체 H-NOX L144F 국소화를 평가하기 위하여, 단일 투여량의 삼량체 H-NOX L144F(240 mg/kg)를 pMCAO 후 1 시간에 투여하고, 동물을 pMCAO 후 2 시간에 안락사시키고, 뇌를 절단하고 항-H-NOX 및 항-CD31 항체로 염색하였다. pMCAO 후 1 시간에 투여될 경우, 삼량체 H-NOX L144F는 pMCAO 후 2 시간만큼 빨리 경색 주변 뇌 실질에서 국소화되었다(도 17a). 정상 뇌 조직(대측)에서, 삼량체 H-NOX L144F는 혈관에 제한되었다. 그 후 허혈 병변에 대한 삼량체 H-NOX L144F의 효과를 시험하였다. 폐색 후 1 시간에 단일 투여량의 삼량체 H-NOX L144F(240 mg/kg)를 동물에게 투여하고 pMCAO 후 6 시간에 뇌를 수집하여 이전에 개시된 대로 피모니다졸에 대한 ELISA에 의해 저산소증에 대해 그리고 루미노미트리에 의해 카스파제 9 활성에 대해 분석하였다. 도 17b에 나타난 대로, 삼량체 H-NOX L144F 투여는 pMCAO 후 6 시간에 저산소증 및 카스파제 9 활성을 감소시켜, 삼량체 H-NOX L144F가 뇌졸중 치료를 위한 전도있는 작용제임을 나타냈다.
서열
핵산 서열은 5'에서 3'으로 제시된다.
아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제시된다.
써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX-야생형
핵산
Figure pct00005
아미노산
Figure pct00006
폴드온 도메인
핵산
Figure pct00007
아미노산
Figure pct00008
써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX-L144F
핵산
Figure pct00009
아미노산
Figure pct00010
써모언에어로박터 텡콘젠시스 H-NOX-L144F-폴드온
Figure pct00011
아미노산
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> LE MOAN, Natacha KRTOLICA, Ana LEONG, Kevin G. CARY, Stephen P. L. <120> MODULATION OF HYPOXIC STRESS BY PROTEIN 02 CARRIERS <130> 627042001040 <140> Not Yet Assigned <141> Concurently Herewith <150> 62/296,009 <151> 2016-02-16 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 555 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 1 atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60 gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120 gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180 aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240 tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300 gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360 cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420 tttttagggc ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480 gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540 cccgtttttg agtga 555 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 2 Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu 20 25 30 Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn 50 55 60 Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu 65 70 75 80 Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met 85 90 95 Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu 115 120 125 Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Leu 130 135 140 Ile Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Ser Val Glu Glu 145 150 155 160 Val Glu Arg Gly Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile 165 170 175 Lys Phe Lys Asn Pro Val Phe Glu 180 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 3 ggttatattc ctgaagctcc aagagatggg caagcttacg ttcgtaaaga tggcgaatgg 60 gtattacttt ctaccttttt a 81 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 4 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Pro Leu 20 25 <210> 5 <211> 555 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 5 atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60 gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120 gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180 aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240 tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300 gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360 cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420 tttttagggt ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480 gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540 cccgtttttg agtga 555 <210> 6 <211> 184 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 6 Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu 20 25 30 Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn 50 55 60 Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu 65 70 75 80 Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met 85 90 95 Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu 115 120 125 Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Phe 130 135 140 Ile Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Ser Val Glu Glu 145 150 155 160 Val Glu Arg Gly Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile 165 170 175 Lys Phe Lys Asn Pro Val Phe Glu 180 <210> 7 <211> 663 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 7 atgaagggga caatcgtcgg gacatggata aagaccctga gggaccttta cgggaatgat 60 gtggttgatg aatctttaaa aagtgtgggt tgggaaccag atagggtaat tacacctctg 120 gaggatattg atgacgatga ggttaggaga atttttgcta aggtgagtga aaaaactggt 180 aaaaatgtca acgaaatatg gagagaggta ggaaggcaga acataaaaac tttcagcgaa 240 tggtttccct cctattttgc agggagaagg ctagtgaatt ttttaatgat gatggatgag 300 gtacacctac agcttaccaa gatgataaaa ggagccactc ctccaaggct tattgcaaag 360 cctgttgcaa aagatgccat tgaaatggag tacgtttcta aaagaaagat gtacgattac 420 tttttagggt ttatagaggg tagttctaaa tttttcaagg aagaaatttc agtggaagag 480 gtcgaaagag gcgaaaaaga tggcttttca aggctaaaag tcaggataaa atttaaaaac 540 cccgtttttg agtataagaa aaatctcgag ggcagcggcg gttatattcc tgaagctcca 600 agagatgggc aggcttacgt tcgtaaagat ggcgaatggg tattactttc taccttttta 660 tga 663 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter tengcongensis <400> 8 Met Lys Gly Thr Ile Val Gly Thr Trp Ile Lys Thr Leu Arg Asp Leu 1 5 10 15 Tyr Gly Asn Asp Val Val Asp Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Trp Glu 20 25 30 Pro Asp Arg Val Ile Thr Pro Leu Glu Asp Ile Asp Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Arg Ile Phe Ala Lys Val Ser Glu Lys Thr Gly Lys Asn Val Asn 50 55 60 Glu Ile Trp Arg Glu Val Gly Arg Gln Asn Ile Lys Thr Phe Ser Glu 65 70 75 80 Trp Phe Pro Ser Tyr Phe Ala Gly Arg Arg Leu Val Asn Phe Leu Met 85 90 95 Met Met Asp Glu Val His Leu Gln Leu Thr Lys Met Ile Lys Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Pro Arg Leu Ile Ala Lys Pro Val Ala Lys Asp Ala Ile Glu 115 120 125 Met Glu Tyr Val Ser Lys Arg Lys Met Tyr Asp Tyr Phe Leu Gly Leu 130 135 140 Ile Glu Gly Ser Ser Lys Phe Phe Lys Glu Glu Ile Ser Val Glu Glu 145 150 155 160 Val Glu Arg Gly Glu Lys Asp Gly Phe Ser Arg Leu Lys Val Arg Ile 165 170 175 Lys Phe Lys Asn Pro Val Phe Glu Tyr Lys Lys Asn Leu Glu Gly Ser 180 185 190 Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg 195 200 205 Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Pro Leu 210 215 220

Claims (145)

  1. 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하되, H-NOX가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는, 개체에서 뇌졸중을 치료하는 방법.
  2. 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하되, H-NOX가 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는, 뇌졸중 후 개체에게 산소를 전달하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    뇌졸중이 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중인 방법.
  4. 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하되, H-NOX가 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는, 개체에서 일과성 허혈 발작을 치료하는 방법.
  5. 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하되, H-NOX가 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는, 일과성 허혈 발작 후 개체에게 산소를 전달하는 방법.
  6. 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하되, H-NOX가 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는, 개체에서 저산소 뇌 손상을 치료하는 방법.
  7. 개체에게 치료적 유효량의 H-NOX를 투여하는 것을 포함하되, H-NOX가 PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는, 저산소 뇌 손상 후 개체에게 산소를 전달하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX가 뇌졸중과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달하는 방법.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    H-NOX가 일과성 허혈 발작과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달하는 방법.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    H-NOX가 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달하는 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX의 투여가 저산소성 반음영부위에서 염증을 감소시키는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상의 결과로서 지속적인 뇌의 저관류를 나타내는 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달이 폐색 부위 또는 반음영부위에서의 성상세포, 소교세포 및/또는 대식세포의 활성화를 감소시키는 방법.
  14. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달이 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작과 관련된 감각운동 결함을 감소시키는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX와 투여되는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비가 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 조성물 내에 있는 방법.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 동시에 또는 순차적으로 전달되는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 동시에 전달되는 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 순차적으로 전달되는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 전에 투여되는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후에 투여되는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 또는 약 24 시간 초과에 투여되는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    PEG에 결합된 H-NOX가 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 1 시간, 1 일, 2 일 또는 3 일 중 하나 이상에 투여되는 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    PEG에 결합된 H-NOX가 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 1 일, 및 약 2 일에 투여되는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 포유동물인 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    포유동물이 인간인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 동일한 H-NOX 단백질로부터 유래되는 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 상이한 H-NOX 단백질로부터 유래되는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 티. 텡콘젠시스(T. tengcongensis) H-NOX, 엘. 뉴모필리아(L. pneumophilia) 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스(H. sapiens) β1, 알. 노르베지쿠스(R. norvegicus) β1, 씨. 루푸스(C. lupus) H-NOX, 디. 멜란가스터(D. melangaster) β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스(C. elegans) GCY-35, 엔. 펑티포르메(N. punctiforme) H-NOX, 씨. 크레센투스(C. crescentus) H-NOX, 에스. 오네이덴시스(S. oneidensis) H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰(C. acetobutylicum) H-NOX인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    말단 포켓 돌연변이가 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    H-NOX가 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX인 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    위치 144에서의 아미노산 치환이 L144F 치환인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 중합체 H-NOX 단백질인 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질이 단량체를 포함하며, 단량체가 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    H-NOX 도메인이 중합 도메인에 공유적으로 연결되는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질이 삼량체 H-NOX 단백질인 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    삼량체 H-NOX 단백질이 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    삼량체 H-NOX 단백질이 3개의 단량체를 포함하며, 단량체가 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인이 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    삼량체화 도메인이 폴드온(foldon) 도메인인 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    폴드온 도메인이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질이 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합되는 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수가 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 02 해리 상수가 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 20℃에서 약 700 s-1 미만인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 100배 더 낮은 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 1000배 더 낮은 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.65 s-1 이하인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s- 1 인 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s- 1 인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 헴 자동산화(autoxidation)의 속도가 37℃에서 약 1 h-1 미만인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX가 다른 치료법과 조합되어 투여되는 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    다른 치료법이 조직 플라스미노겐 활성인자 및/또는 재개통 또는 신경보호제를 이용한 치료인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서,
    H-NOX 투여가 다른 치료 이전, 다른 치료 동안 또는 다른 치료 후인 방법.
  59. 치료적 유효량의 H-NOX를 포함하되, H-NOX가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX를 포함하는 조성물.
  60. 제59항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비가 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9인 조성물.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 동일한 H-NOX 단백질로부터 유래되는 조성물.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 상이한 H-NOX 단백질로부터 유래되는 조성물.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 티. 텡콘젠시스 H-NOX, 엘. 뉴모필리아 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베지쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스터 β1, 디. 멜란가스터 CG14885-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 펑티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스. 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰 H-NOX인 조성물.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함하는 조성물.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함하는 조성물.
  66. 제65항에 있어서,
    말단 포켓 돌연변이가 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환인 조성물.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서,
    H-NOX가 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX인 조성물.
  68. 제67항에 있어서,
    위치 144에서의 아미노산 치환이 L144F 치환인 조성물.
  69. 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 중합체 H-NOX 단백질인 조성물.
  70. 제69항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질이 단량체를 포함하며, 단량체가 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함하는 조성물.
  71. 제70항에 있어서,
    H-NOX 도메인이 중합 도메인에 공유적으로 연결되는 조성물.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질이 삼량체 H-NOX 단백질인 조성물.
  73. 제72항에 있어서,
    삼량체 H-NOX 단백질이 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함하는 조성물.
  74. 제73항에 있어서,
    삼량체 H-NOX 단백질이 3개의 단량체를 포함하며, 단량체가 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인은 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인인 조성물.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서,
    삼량체화 도메인이 폴드온 도메인인 조성물.
  76. 제75항에 있어서,
    폴드온 도메인이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  77. 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질이 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합되는 조성물.
  78. 제59항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 조성물.
  79. 제59항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수가 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM인 조성물.
  80. 제59항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM인 조성물.
  81. 제59항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 02 해리 상수가 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM인 조성물.
  82. 제59항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 20℃에서 약 700 s-1 미만인 조성물.
  83. 제59항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 100배 더 낮은 조성물.
  84. 제83항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 1000배 더 낮은 조성물.
  85. 제59항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.65 s-1 이하인 조성물.
  86. 제59항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s- 1 인 조성물.
  87. 제59항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s- 1 인 조성물.
  88. 제59항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 헴 자동산화의 속도가 37℃에서 약 1 h-1 미만인 조성물.
  89. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법에 따라 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 H-NOX를 포함하는 약학 조성물.
  90. 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 H-NOX를 포함하는 약학 조성물로서, 제59항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  91. 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 H-NOX를 포함하는 약학 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 제59항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학 조성물의 용도.
  92. 개체에서 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작의 치료를 위한 의약의 제조에서 H-NOX를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 제59항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 조성물의 용도.
  93. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유 결합된 H-NOX의 치료적 유효량 및 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 치료적 유효량을 포함하는 키트.
  94. 제93항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비가 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9인 키트.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서,
    뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상 후 개체에게 산소를 전달하기 위한 방법에서 사용되는 키트.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에서 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상을 치료하기 위한 방법에서 사용되는 키트.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서,
    H-NOX가 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위에 O2를 전달하는 키트.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상의 결과로서 뇌의 지속적인 저관류를 나타내는 키트.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달이 폐색 부위 또는 반음영부위에서의 성상세포, 소교세포 및/또는 대식세포의 활성화를 감소시키는 키트.
  100. 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐색 부위 또는 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상과 관련된 저산소성 반음영부위로의 H-NOX의 전달이 뇌졸중, 저산소 뇌 손상 또는 일과성 허혈 발작과 관련된 감각운동 결함을 감소시키는 키트.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX와 투여되는 키트.
  102. 제101항에 있어서,
    H-NOX가 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9의 PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비로 전달되는 키트.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 조성물 내에 있는 키트.
  104. 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 동시에 또는 순차적으로 전달되는 키트.
  105. 제104항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 동시에 전달되는 키트.
  106. 제104항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX가 순차적으로 전달되는 키트.
  107. 제106항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 전에 투여되는 키트.
  108. 제106항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후에 투여되는 키트.
  109. 제108항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX가 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 또는 약 24 시간 초과에 투여되는 키트.
  110. 제108항에 있어서,
    PEG에 결합된 H-NOX가 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 1 시간, 1 일, 2 일 또는 3 일 중 하나 이상에 투여되는 키트.
  111. 제108항에 있어서,
    PEG에 결합된 H-NOX가 PEG에 결합되지 않은 H-NOX의 투여 후 약 1 시간, 약 1 일, 및 약 2 일에 투여되는 키트.
  112. 제93항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 포유동물인 키트.
  113. 제112항에 있어서,
    포유동물이 인간인 키트.
  114. 제93항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 동일한 H-NOX 단백질로부터 유래되는 키트.
  115. 제93항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 상이한 H-NOX 단백질로부터 유래되는 키트.
  116. 제93항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 티. 텡콘젠시스 H-NOX, 엘. 뉴모필리아 2 H-NOX, 에이치. 사피엔스 β1, 알. 노르베지쿠스 β1, 씨. 루푸스 H-NOX, 디. 멜란가스터 β1, 디. 멜란가스터 CG14935-PA, 씨. 엘레간스 GCY-35, 엔. 펑티포르메 H-NOX, 씨. 크레센투스 H-NOX, 에스 . 오네이덴시스 H-NOX, 또는 씨. 아세토부티리쿰 H-NOX인 키트.
  117. 제93항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 서열 번호 2에 개시된 티. 텡콘젠시스의 H-NOX 도메인에 해당하는 H-NOX 도메인을 포함하는 키트.
  118. 제93항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 하나 이상의 말단 포켓 돌연변이를 포함하는 키트.
  119. 제118항에 있어서,
    말단 포켓 돌연변이가 티. 텡콘젠시스 H-NOX의 L144에 해당하는 부위에서의 아미노산 치환인 키트.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서,
    H-NOX가 위치 144에서 아미노산 치환을 포함하는 티. 텡콘젠시스 H-NOX인 키트.
  121. 제120항에 있어서,
    위치 144에서의 아미노산 치환이 L144F 치환인 키트.
  122. 제93항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 단백질 및/또는 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX 단백질이 중합체 H-NOX 단백질인 키트.
  123. 제122항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질이 단량체를 포함하며, 단량체가 H-NOX 도메인과 중합 도메인을 포함하는 키트.
  124. 제123항에 있어서,
    H-NOX 도메인이 중합 도메인에 공유적으로 연결되는 키트.
  125. 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질이 삼량체 H-NOX 단백질인 키트.
  126. 제125항에 있어서,
    삼량체 H-NOX 단백질이 하나 이상의 삼량체화 도메인을 포함하는 키트.
  127. 제126항에 있어서,
    삼량체 H-NOX 단백질이 3개의 단량체를 포함하며, 단량체가 H-NOX 도메인과 삼량체화 도메인을 포함하며, 삼량체화 도메인이 박테리오파아지 T4 삼량체화 도메인인 키트.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서,
    삼량체화 도메인이 폴드온 도메인인 키트.
  129. 제128항에 있어서,
    폴드온 도메인이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 키트.
  130. 제93항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질이 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합되는 키트.
  131. 제93항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 헤모글로빈의 O2 해리 상수의 100배 이내이며, H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 10배 더 낮은 키트.
  132. 제93항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    중합체 H-NOX 단백질의 02 해리 상수가 20℃에서 약 1 nM 내지 약 1000 nM인 키트.
  133. 제93항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 O2 해리 상수가 20℃에서 약 1 μM 내지 약 10 μM인 키트.
  134. 제93항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 02 해리 상수가 20℃에서 약 10 μM 내지 약 50 μM인 키트.
  135. 제93항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 20℃에서 약 700 s-1 미만인 키트.
  136. 제93항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 100배 더 낮은 키트.
  137. 제136항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 NO 반응성이 헤모글로빈의 NO 반응성보다 적어도 1000배 더 낮은 키트.
  138. 제93항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.65 s-1 이하인 키트.
  139. 제93항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 0.21 s-1 내지 약 0.65 s- 1 인 키트.
  140. 제93항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 산소에 대한 koff가 20℃에서 약 1.35 s-1 내지 약 2.9 s- 1 인 키트.
  141. 제93항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서,
    H-NOX 단백질의 헴 자동산화의 속도가 37℃에서 약 1 h-1 미만인 키트.
  142. 제93항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  143. PEG와 공유 결합된 H-NOX를 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX와 혼합하는 것을 포함하는, 뇌졸중, 일과성 허혈 발작 또는 저산소 뇌 손상을 치료하기 위한 조성물의 제조 방법.
  144. 제143항에 있어서,
    PEG에 공유 결합된 H-NOX 대 PEG에 공유 결합되지 않은 H-NOX의 비가 약 9:1, 약 8:2, 약 7:3, 약 6:4; 약 5:5; 약 4:6; 약 3:7; 약 2:8; 또는 약 1:9인 방법.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서,
    조성물이 제59항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물인 방법.
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