ES2609925T3

ES2609925T3 - Proteínas de fusión con LLO no hemolítica y métodos para utilizar las mismas

Info

Publication number: ES2609925T3
Application number: ES09798450.4T
Authority: ES
Inventors: Yvonne Paterson; Paulo Maciag
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2017-04-25
Anticipated expiration: 2029-06-22
Also published as: DK2307049T3; US10189885B2; EP2307049A4; WO2010008782A1; EP2942355B1; JP2015017096A; PT2307049T; JP2011525375A; EP2307049A1; US9499602B2; US20140248304A1; PL2942355T4; PL2942355T3; JP5597197B2; US20090081248A1; HUE042819T2; JP6114237B2; US8771702B2; ES2719832T3; EP3530669A1

Abstract

Una proteína recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO), en donde dicha proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) que se ubica en los residuos 483-493 de dicha proteína LLO como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37, en donde dicha mutación consiste en una sustitución de los residuos de aminoácidos en las posiciones 484-492 como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37 con un péptido diferente de LLO de 8-50 residuos de aminoácidos que comprenden una porción inmunogénica de un péptido antigénico, en donde dicho péptido antigénico es un antígeno E7 del virus del papiloma humano (HPV), un antígeno E6 de HPV, un antígeno NY-ESO-1, un receptor de células B (BCR), un antígeno prostático específico (PSA), antígeno de células madre prostáticas (PSCA), un antígeno de la enzima quimiotríptica del estrato córneo (SCCE), antígeno 1 del tumor de Wilms (WT-1), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), proteinasa 3, proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP2), antígeno de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), sarcoma sinovial X (SSX)-2, antígeno carcinoembrionario (CEA), MAGE-A, receptor alfa de la interleucina 13 (IL13-R alfa), anhidrasa carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 o testisina; y en donde dicha proteína recombinante muestra una reducción de más de 100 veces en la actividad hemolítica con respecto a la LLO de tipo silvestre de la sec. con núm. de ident.: 37.

Description

Proteínas de fusión con LLO no hemolítica y métodos para utilizar las mismas

Campo de la invención

La presente invención proporciona proteínas o péptidos recombinantes que comprenden una proteína listeriolisina O mutada (LLO) o un fragmento de esta, que comprende una sustitución del dominio de unión al colesterol con un péptido antigénico, proteínas o péptidos de fusión que comprenden los mismos, moléculas de nucleótidos que codifican los mismos, y vectores de vacunas que comprenden o codifican los mismos. La presente invención proporciona, además, las proteínas, péptidos, moléculas de nucleótidos, y vectores de vacunas recombinantes de la presente invención para usar en la inducción de una respuesta inmunológica al péptido antigénico.

Antecedentes de la invención

La estimulación de una respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos reconocidos como extraños por el sistema inmunológico del huésped. Los antígenos bacterianos tales como Salmonella enterica y BCG de Mycobacterium bovis permanecen en el fagosoma y estimulan las células T CD4+ por medio de la presentación de antígenos a través de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II. Por el contrario, los antígenos bacterianos tales como Listeria monocytogenes salen del fagosoma hacia el citoplasma. El escape fagolisosómico de L. monocytogenes es un mecanismo único, que facilita la presentación de antígenos de Listeria por el complejo mayor de histocompatibilidad clase I. Este escape depende de la citolisina activada por sulfidrilo, formadora de poros, la listeriolisina O (LLO).

El documento núm. WO 2008/008311 describe el uso de una proteína LLO mutada no hemolítica y una proteína antigénica de interés fusionada a la proteína LLO mutada no hemolítica, o embebida dentro de esta, para inducir una respuesta inmunológica contra la proteína antigénica de interés.

Desde hace mucho tiempo existe una necesidad de desarrollar composiciones y métodos para mejorar la inmunogenicidad de antígenos, especialmente antígenos útiles en la prevención y el tratamiento de tumores y patógenos intracelulares.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una proteína recombinante que comprende una proteína de listeriolisina O (LLO), en donde dicha proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) que se ubica en los residuos 483-493 de dicha proteína LLO como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37, en donde dicha mutación consiste en una sustitución de los residuos de aminoácidos en las posiciones 484-492 como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37 con un péptido diferente de LLO de 8-50 residuos de aminoácidos que comprende una porción inmunogénica de un péptido antigénico, en donde dicho péptido antigénico es un antígeno E7 del virus del papiloma humano (HPV), un antígeno E6 de HPV, un antígeno NY-ESO-1, un receptor de células B (BCR), un antígeno prostático específico (PSA), un antígeno de células madre prostáticas (PSCA), un antígeno de la enzima quimiotríptica del estrato córneo (SCCE), antígeno 1 del tumor de Wilms (WT-1), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), proteinasa 3, proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP2), antígeno de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), sarcoma sinovial X (SSX)-2, antígeno carcinoembrionario (CEA), MAGE-A, receptor alfa de la interleucina 13 (IL13-R alfa), anhidrasa carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 o testisina; y en donde dicha proteína recombinante muestra una reducción de más de 100 veces en su actividad hemolítica con respecto a la LLO de tipo silvestre de la sec. con núm. de ident.: 37.

En una modalidad, la proteína LLO mutada comprende una deleción de la secuencia del péptido señal de esta. En otra modalidad, la proteína LLO mutada comprende la secuencia del péptido señal de esta.

En una modalidad, el antígeno E7 de HPV es un antígeno E7 de HPV-16 o un antígeno E7 de HPV-18. En una modalidad, el péptido antigénico comprende un epítopo de E7 de HPV. En una modalidad, el antígeno E6 de HPV es un antígeno E6 de HPV-16 o un antígeno E6 de HPV-18.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende la proteína recombinante y un adyuvante. En otra modalidad, el adyuvante comprende una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), una molécula de nucleótidos que codifica una proteína GM-CSF, saponina QS21, monofosforil lípido A, o un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que codifica la proteína recombinante. En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de nucleótidos que codifica la proteína recombinante. En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende la molécula de nucleótidos. En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende la proteína o el péptido recombinantes.

La presente invención proporciona la proteína recombinante, o la molécula de nucleótidos, o el vector de vacuna recombinante, o la cepa de Listeria recombinante de la invención para usar como un medicamento.

La presente invención proporciona una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un péptido E7 de HPV o un péptido E6 de HPV, para usar en la inducción de una respuesta inmunológica al péptido antigénico E7 de HPV o E6 de HPV en un sujeto.

La presente invención proporciona una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un péptido NY-ESO-1, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia de un tumor que expresa NY-ESO-1, o la protección contra este, en un sujeto.

En otra modalidad, el tumor que expresa NY-ESO-1 es un tumor de melanoma ovárico o un tumor de cáncer de pulmón.

La presente invención proporciona una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un péptido E7 de HPV, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia de un tumor que expresa E7 de HPV, o la protección contra este, en un sujeto.

En otra modalidad, el tumor que expresa E7 de HPV se selecciona de un tumor de cáncer cervical y un tumor de cáncer de cabeza y cuello.

La presente invención proporciona una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un BCR, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia de un linfoma que expresa BCR, o la protección contra este, en un sujeto.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A-B. Estrategia de mutagénesis SOE. La disminución/reducción de la virulencia de LLO se logró mediante la mutación del 4to dominio de LLO. Este dominio contiene un sitio de unión al colesterol que le permite su unión a las membranas donde forma oligómeros para formar poros.

Figura 2. Expresión de proteínas LLO mutantes por tinción de Coomassie (A) y transferencia de Western (B).

Figura 3. Actividad hemolítica de proteínas LLO mutantes (mutLLO y ctLLO) a pH 5,5 (A) y 7,4 (B).

Figura 4. La capacidad de rLLO detox+rE7 conjugados químicamente y rLLO + rE7 mezclados entre sí para afectar el crecimiento de TC-1.

Figura 5. La capacidad de rE7 y proteína rLLO para afectar el crecimiento de TC-1.

Figura 6. La capacidad de LLOE7 detoxificada recombinante (rDTLLO-E7; secuencia completa) y rDTLLO-E7 (quimera) para afectar el crecimiento de TC-1.

Figura 7. Regresión del tumor de TC-1 después de la inmunización con rE7, rLLO, rLLO+E7 y rDTLLO-E7.

Figura 8. Regresión del tumor de TC-1 después de la inmunización con la quimera rDTLLO.

Figura 9. Regresión del tumor de TC-1 después de la inmunización con rE7, rDTLLO, rDTLLO+rE7, y rDTLLO-E7.

Figura 10. Regresión del tumor de TC-1 inmunizado con ActA-E7 y proteína E7.

Figura 11. Regresión del tumor de TC-1 inmunizado con ActA+E7 y proteína E7.

Figura 12. Regresión del tumor de TC-1 inmunizado con ActA y proteína E7.

Figura 13. DetoxLLO induce la expresión de ARNm de citocinas por los macrófagos de la médula ósea (BM). Las BMDC 8e5 del día 7 se descongelaron durante la noche a 37 °C en medio RF10. A continuación, las BMDC se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de medio RF10 fresco a 37 °C durante 1 hr. Las BMDC se trataron con 40 mcg/ml de LLOE7 y los equivalentes molares de E7 y LLO (o con PBS como control negativo o 1 mcg/ml de LPS como control positivo). Después de 2 y 24 hrs, las células se recolectaron por centrifugación y los medios se guardaron para el ensayo ELISA. El ARN se extrajo de las células y se convirtió a ADNc. El ADNc se sometió después a análisis de qPCR con los iniciadores para diferentes citocinas.

Figura 14. LLO detox induce la secreción de citocinas por los macrófagos de BM. El mismo protocolo de tratamiento que el descrito para la Figura 13, excepto que el medio se sometió al análisis de ELISA después de los tratamientos.

Figura 15. LLO detox regula positivamente los marcadores de maduración de las DC, CD86, CD40, y MHCII en los grupos de LLO, LLO+E7 y LLOE7.

Figura 16. Translocación nuclear de NF-kappaB después de la estimulación con Dt-LLO. La línea celular de macrófagos J774 se usó como sistema modelo para las células presentadoras de antígenos (APC). Se sembraron 5 x 10^5 células por pocillo (placa de 6 pocillos) en un volumen total de 1 ml. Las células se tiñeron con anti-NF-κB (P65) -FITC (fluorescencia verde) y DAPI para el núcleo (fluorescencia azul). En B, D, y F, las células se tiñeron, además, después de 24 horas con anticuerpo anti-CD11B-PE (M1/170, eBioscence). La micrografía fluorescente se muestra a un aumento de 40X. NF-kappaB se ubica en el citoplasma después del tratamiento de las células con los medios solos (sin activación) (A). Las células tratadas con los medios demuestran una débil tinción para Cd11b (B). Después de la estimulación durante la noche (24 hr) con Dt-LLO (30 mcg), NF-kappaB se movió del citoplasma hacia el núcleo (C) y existe un aumento en la tinción de CD11b (D). De manera similar, después de la estimulación durante la noche (24 hr) con LPS (10 mcg/ml, control positivo), NF-kappaB se translocó al núcleo (E), lo cual es más discernible con el halo producido por el aumento de la tinción de CD11b+ de la membrana plasmática (F).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una proteína recombinante que comprende una proteína de listeriolisina O (LLO), en donde dicha proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) que se ubica en los residuos 483-493 de dicha proteína LLO como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37, en donde dicha mutación consiste en una sustitución de los residuos de aminoácidos en las posiciones 484-492 como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37 con un péptido diferente de LLO de 8-50 residuos de aminoácidos que comprenden una porción inmunogénica de un péptido antigénico, en donde dicho péptido antigénico es un antígeno E7 del virus del papiloma humano (HPV), un antígeno E6 de HPV, un antígeno NY-ESO-1, un receptor de células B (BCR), un antígeno prostático específico (PSA), antígeno de células madre prostáticas (PSCA), un antígeno de la enzima quimiotríptica del estrato córneo (SCCE), antígeno 1 del tumor de Wilms (WT-1), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), proteinasa 3, proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP2), antígeno de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), sarcoma sinovial X (SSX)-2, antígeno carcinoembrionario (CEA), MAGE-A, receptor alfa de la interleucina 13 (IL13-R alfa), anhidrasa carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 o testisina; y en donde dicha proteína recombinante muestra una reducción de más de 100 veces en la actividad hemolítica con respecto a la LLO de tipo silvestre de la sec. con núm. de ident.: 37.

En una modalidad, el polipéptido diferente de LLO es de la misma longitud que la región mutada. En otra modalidad, el polipéptido diferente de LLO es más corto, o en otra modalidad, más largo, que la región mutada.

En una modalidad, la sustitución en la proteína LLO es una mutación inactivante con respecto a la actividad hemolítica. Un péptido recombinante de la presente invención muestra una reducción de la actividad hemolítica con relación a la LLO de tipo silvestre. En otra modalidad, el péptido recombinante no es hemolítico.

Como se describe en la presente descripción, se creó una proteína LLO mutante en donde los residuos C484, W491, y W492 de LLO se sustituyeron con residuos de alanina (Ejemplo 1). La proteína LLO mutada, mutLLO, pudo expresarse y purificarse en un sistema de expresión de E. coli (Ejemplo 3) y mostró una actividad hemolítica sustancialmente reducida con respecto a la LLO de tipo silvestre (Ejemplo 4).

Por lo tanto, la región mutada de la proteína LLO de la presente invención comprende los residuos C484, W491, y W492 de la sec. con núm. de ident.: 37.

Además, según se proporciona en la presente descripción, un fragmento del CBD, residuos 484-492, se sustituyó con una secuencia heteróloga de NY-ESO-1 (Ejemplo 2). En otra modalidad, un único péptido puede tener una deleción en la secuencia señal y una sustitución en el CBD.

La mutación por sustitución de la proteína recombinante de la presente invención, en otra modalidad, es una mutación en donde la región mutada de la proteína LLO se sustituye por un número igual de aa heterólogos. En otra modalidad, se introduce un mayor número de aa heterólogos que el tamaño de la región mutada. En otra modalidad, se introduce un menor número de aa heterólogos que el tamaño de la región mutada.

En esta invención, la longitud del péptido diferente de LLO que sustituye la región mutada de la proteína recombinante de la presente invención es de 8-50 aa. En una modalidad, la longitud es de 8-11 aa. En otra modalidad, la longitud es de 9-11 aa. En otra modalidad, la longitud es de 10-11 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-50 aa. En otra modalidad, la longitud es de 12-50 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-15 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-20 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-25 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-30 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-35 aa. En otra modalidad, la longitud es de 11-40 aa. En otra

modalidad, la longitud es de 15-20 aa. En otra modalidad, la longitud es de 15-25 aa. En otra modalidad, la longitud es de 15-30 aa. En otra modalidad, la longitud es de 15-35 aa. En otra modalidad, la longitud es de 15-40 aa. En otra modalidad, la longitud es de 20-25 aa. En otra modalidad, la longitud es de 20-30 aa. En otra modalidad, la longitud es de 20-35 aa. En otra modalidad, la longitud es de 20-40 aa. En otra modalidad, la longitud es de 30-35 aa. En otra modalidad, la longitud es de 30-40 aa.

Cuando se hace referencia a la longitud de un fragmento de LLO en la presente descripción, se incluye la secuencia señal. Por lo tanto, la numeración de la primera cisteína en el CBD es 484, y el número total de residuos de aa es

529.

Como se describe en la presente descripción, se creó una proteína LLO mutante en donde los residuos C484, W491, y W492 de LLO se sustituyeron con un epítopo de CTL del antígeno NY-ESO-1 (Ejemplo 2). La proteína LLO mutada, mutLLO, pudo expresarse y purificarse en un sistema de expresión de E. coli (Ejemplo 3) y mostró una actividad hemolítica sustancialmente reducida con respecto a la LLO de tipo silvestre (Ejemplo 4).

En otra modalidad, la proteína LLO mutada de la presente invención que comprende una deleción interna tiene la longitud completa excepto por la deleción interna. En esta invención, la deleción interna de la proteína LLO comprende los residuos C484, W491, y W492. Específicamente, en esta invención, la deleción interna consiste en los residuos 484-492 del CBD de la sec. con núm. de ident.: 37.

"Hemolítica" se refiere, en otra modalidad, a la capacidad de lisar una célula eucariota. En otra modalidad, la célula eucariota es un glóbulo rojo. En otra modalidad, la célula eucariota es cualquier otro tipo de célula eucariota conocida en la técnica. En otra modalidad, la actividad hemolítica se mide a un pH ácido. En otra modalidad, la actividad hemolítica se mide a pH fisiológico. En otra modalidad, la actividad hemolítica se mide a pH 5,5. En otra modalidad, la actividad hemolítica se mide a pH 7,4. En otra modalidad, la actividad hemolítica se mide a cualquier otro pH conocido en la técnica.

En otra modalidad, una proteína o polipéptido recombinantes de los métodos y las composiciones de la presente invención muestran una reducción de más de 100 veces en la actividad hemolítica con respecto a la LLO de tipo silvestre. En otra modalidad, la reducción es de más de 90 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 120 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 150 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 200 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 250 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 300 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 400 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 500 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 600 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 800 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 1000 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 1200 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 1500 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 2000 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 3000 veces. En otra modalidad, la reducción es de más de 5000 veces.

En otra modalidad, la reducción es de al menos 120 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 150 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 200 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 250 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 300 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 400 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 500 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 600 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 800 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 1000 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 1200 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 1500 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 2000 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 3000 veces. En otra modalidad, la reducción es de al menos 5000 veces.

Los métodos para determinar la actividad hemolítica se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en los Ejemplos de la presente descripción, y en Portnoy DA y otros (J Exp Med Vol 167:1459-1471, 1988) y Dancz CE y otros (J Bacteriol. 184: 5935-5945, 2002).

Una "mutación inactivante" con respecto a la actividad hemolítica se refiere, en otra modalidad, a una mutación que anula una actividad hemolítica detectable. En otra modalidad, el término se refiere a una mutación que anula la actividad hemolítica a pH 5,5. En otra modalidad, el término se refiere a una mutación que anula la actividad hemolítica a pH 7,4. En otra modalidad, el término se refiere a una mutación que reduce significativamente la actividad hemolítica a pH 5,5. En otra modalidad, el término se refiere a una mutación que reduce significativamente la actividad hemolítica a pH 7,4. En otra modalidad, el término se refiere a una mutación que reduce significativamente la actividad hemolítica a pH 5,5. En otra modalidad, el término se refiere a cualquier otro tipo de mutación inactivante con respecto a la actividad hemolítica.

La secuencia del dominio de LLO de unión al colesterol se expone en la sec. con núm. de ident.: 18.

En otra modalidad, la proteína LLO mutada de la presente invención comprende el péptido señal de esta. En otra modalidad, la proteína LLO mutada o fragmento de esta comprende un péptido señal de una proteína LLO de tipo silvestre. En otra modalidad, el péptido señal es una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos de longitud) que

dirige el transporte postraduccional de una proteína. En otra modalidad, los péptidos señal son, además, señales de dirección, secuencias señal, péptidos de tránsito, o señales de localización. En otra modalidad, las secuencias de aminoácidos de los péptidos señal dirigen las proteínas a determinados organelos tales como el núcleo, matriz mitocondrial, retículo endoplásmico, cloroplasto, apoplasto o peroxisoma. En otra modalidad, la proteína LLO mutada contiene una secuencia señal de una proteína LLO de tipo silvestre. En otra modalidad, la proteína LLO mutada carece de un péptido señal. En otra modalidad, la proteína LLO mutada carece de una secuencia señal. En otra modalidad, el péptido señal no se modifica con respecto a la proteína LLO de tipo silvestre a partir de la cual se originó la proteína LLO mutada o un fragmento de esta. En otra modalidad, el péptido señal está en el extremo N terminal de la proteína o el polipéptido recombinantes.

Como se describe en la presente descripción, la proteína LLO mutada de la presente invención comprende una secuencia peptídica similar a PEST. En otra modalidad, la secuencia peptídica similar a PEST es una secuencia peptídica de LLO similar a PEST. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de la secuencia peptídica similar a PEST se expone en la sec. con núm. de ident.: 63.

Las secuencias PEST son secuencias ricas en prolinas (P), ácidos glutámicos (E), serinas (S) y treoninas (T), generalmente, pero no siempre, flanqueadas por grupos que contienen varios aminoácidos cargados positivamente, con cortos tiempos de vida media intracelular (Rogers y otros, 1986, Science 234:364-369). Las secuencias PEST dirigen la proteína a la vía ubiquitina-proteosoma para la degradación (Rechsteiner y Rogers TIBS 1996 21:267271), que además es una vía usada por las células eucariotas para generar péptidos inmunogénicos que se unen al MHC clase I. Las secuencias PEST son abundantes entre las proteínas eucariotas que producen péptidos inmunogénicos (Realini y otros, FEBS Lett. 1994 348:109-113). Aunque las secuencias PEST se encuentran usualmente en proteínas eucariotas, una secuencia similar a PEST rica en los aminoácidos prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T) se identificó en el amino terminal de la proteína LLO de Listeria procariota y demostró ser esencial para la patogenicidad de L. monocytogenes (Decatur, A. L. y Portnoy, D. A. Science 2000 290:992-995). La presencia de esta secuencia similar a PEST en LLO dirige la proteína a su destrucción por la maquinaria proteolítica de la célula huésped de manera que una vez que la LLO ha cumplido su función y facilitado el escape de L. monocytogenes de la vacuola fagolisosómica, es destruida antes de que dañe las células.

La identificación de secuencias similares a PEST se conoce bien en la técnica, y se describe, por ejemplo, en Rogers S y otros (Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 1986; 234(4774):364-8) y Rechsteiner M y otros (PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996; 21(7):267-71). Una “secuencia similar a PEST” se refiere, en otra modalidad, a una región rica en residuos de prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S), y treonina (T). En otra modalidad, la secuencia similar a PEST está flanqueada por uno o más grupos que contienen varios aminoácidos cargados positivamente. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST media la degradación intracelular rápida de las proteínas que la contienen. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rogers y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rechsteiner y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST contiene uno o más sitios de fosforilación internos, y la fosforilación en estos sitios precede a la degradación de proteínas.

En una modalidad, las secuencias similares a PEST de organismos procariotas se identifican de acuerdo con métodos tales como los que se describen en, por ejemplo, Rechsteiner y Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271) para LM y en Rogers S y otros (Science 1986; 234(4774):364-8). Alternativamente, pueden identificarse además secuencias de aa similares a PEST a partir de otros organismos procariotas sobre la base de este método. Otros organismos procariotas en donde se esperarían secuencias de aa similares a PEST incluyen, pero sin limitarse a, otras especies de Listeria. En una modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rogers y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rechsteiner y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se identifica mediante el uso del programa de búsqueda de PEST.

En otra modalidad, la identificación de motivos PEST se logra mediante una exploración inicial de los aa cargados positivamente R, H, y K dentro de la secuencia especificada de la proteína. Se cuentan todos los aa entre los flancos cargados positivamente y sólo se consideran además, los motivos que contienen un número de aa igual o mayor que el parámetro de tamaño de la ventana. En otra modalidad, una secuencia similar a PEST debe contener al menos 1 P, 1 D o E, y almenos 1 So T.

En otra modalidad, la calidad de un motivo PEST se refina por medio de un parámetro de puntuación basado en el enriquecimiento local de aa críticos, así como en la hidrofobicidad del motivo. El enriquecimiento de D, E, P, S y T se expresa en porcentaje de masa (p/p) y se corrige para 1 equivalente de D o E, 1 de P y 1 de S o T. En otra modalidad, el cálculo de hidrofobicidad sigue en principio, el método de J. Kyte y R.F. Doolittle (Kyte, J y Dootlittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982). Para la simplificación de los cálculos, los índices de hidropatía de Kyte-Doolittle, que originalmente se encontraban en el intervalo de -4,5 para arginina a +4,5 para isoleucina, se convierten a números enteros positivos, mediante el uso de la siguiente transformación lineal, que produjo valores de 0 para arginina a 90 para isoleucina.

Índice de hidropatía = 10 * índice de hidropatía de Kyte-Doolittle + 45

En otra modalidad, la hidrofobicidad de un motivo PEST potencial se calcula como la suma sobre los productos del por ciento en moles y el índice de hidrofobicidad para cada especie de aa. La puntuación de PEST deseada se obtiene como la combinación del término de enriquecimiento local y el término de hidrofobicidad como se expresa por la siguiente ecuación:

Puntuación de PEST = 0,55 * DEPST -0,5 * índice de hidrofobicidad.

En otra modalidad, los términos "secuencia PEST", "secuencia similar a PEST" o "secuencia peptídica similar a PEST" se refieren a un péptido que tiene una puntuación de al menos +5, con el uso del algoritmo anterior. En otra modalidad, el término se refiere a un péptido que tiene una puntuación de al menos 6. En otra modalidad, el péptido tiene una puntuación de al menos 7. En otra modalidad, la puntuación es al menos 8. En otra modalidad, la puntuación es al menos 9. En otra modalidad, la puntuación es al menos 10. En otra modalidad, la puntuación es al menos 11. En otra modalidad, la puntuación es al menos 12. En otra modalidad, la puntuación es al menos 13. En otra modalidad, la puntuación es al menos 14. En otra modalidad, la puntuación es al menos 15. En otra modalidad, la puntuación es al menos 16. En otra modalidad, la puntuación es al menos 17. En otra modalidad, la puntuación es al menos 18. En otra modalidad, la puntuación es al menos 19. En otra modalidad, la puntuación es al menos 20. En otra modalidad, la puntuación es al menos 21. En otra modalidad, la puntuación es al menos 22. En otra modalidad, la puntuación es al menos 22. En otra modalidad, la puntuación es al menos 24. En otra modalidad, la puntuación es al menos 24. En otra modalidad, la puntuación es al menos 25. En otra modalidad, la puntuación es al menos 26. En otra modalidad, la puntuación es al menos 27. En otra modalidad, la puntuación es al menos 28. En otra modalidad, la puntuación es al menos 29. En otra modalidad, la puntuación es al menos 30. En otra modalidad, la puntuación es al menos 32. En otra modalidad, la puntuación es al menos 35. En otra modalidad, la puntuación es al menos 38. En otra modalidad, la puntuación es al menos 40. En otra modalidad, la puntuación es al menos 45.

En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se identifica mediante el uso de cualquier otro método o algoritmo conocido en la técnica, por ejemplo, el CaSPredictor (Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. Junio 2005;21 Suppl 1:i169-76). En otra modalidad, se usa el siguiente método:

Un índice de PEST se calcula para cada tramo de longitud adecuada (por ejemplo, un tramo de 30-35 aa) mediante la asignación de un valor de 1 a los aa Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn, o Gln. El valor del coeficiente

(CV) para cada uno de los residuos de PEST es 1 y para cada uno de los otros aa (diferentes de PEST) es 0.

Como se describe en la presente descripción, la respuesta inmunológica a un antígeno puede mejorarse por la fusión del antígeno a una forma truncada no hemolítica de listeriolisina O (ΔLLO). La observación de una mejor inmunidad mediada por células e inmunidad antitumoral de la proteína de fusión es el resultado de la secuencia similar a PEST presente en LLO que dirige el antígeno a su procesamiento.

En esta invención, el péptido diferente de LLO que sustituye la región mutada de la proteína o el polipéptido recombinantes comprende una porción inmunogénica del péptido antigénico de interés. En otra modalidad, el péptido antigénico es un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL). En otra modalidad, el péptido antigénico es un epítopo de células T CD4+. En otra modalidad, el péptido antigénico es cualquier otro tipo de péptido conocido en la técnica.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un adyuvante y una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención, en donde un péptido antigénico de interés sustituye la región mutada. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende la proteína o el polipéptido recombinantes.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de nucleótidos que codifica una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención, en donde un péptido antigénico de interés sustituye la región mutada.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de nucleótidos que codifica una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una molécula de nucleótidos de la presente invención y un adyuvante.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que comprende una molécula de nucleótidos de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que codifica una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que expresa una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que codifica una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende un nucleótido recombinante que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la cepa de vacuna de Listeria es la especie Listeria monocytogenes (LM).

En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector de la presente invención. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Ausubel y otros (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una molécula de nucleótidos de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende la molécula de nucleótidos.

El adyuvante utilizado en las composiciones de vacunas de la presente invención, en otra modalidad, es una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF). En otra modalidad, el adyuvante comprende una proteína GM-CSF. En otra modalidad, el adyuvante es una molécula de nucleótidos que codifica al GM-CSF. En otra modalidad, el adyuvante comprende una molécula de nucleótidos que codifica al GM-CSF. En otra modalidad, el adyuvante es saponina QS21. En otra modalidad, el adyuvante comprende saponina QS21. En otra modalidad, el adyuvante es el monofosforil lípido A. En otra modalidad, el adyuvante comprende monofosforil lípido

A. En otra modalidad, el adyuvante es SBAS2. En otra modalidad, el adyuvante comprende SBAS2. En otra modalidad, el adyuvante es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado. En otra modalidad, el adyuvante comprende un oligonucleótido que contiene CpG no metilado. En otra modalidad, el adyuvante es una citocina estimulante del sistema inmunológico. En otra modalidad, el adyuvante comprende una citocina estimulante del sistema inmunológico. En otra modalidad, el adyuvante es una molécula de nucleótidos que codifica una citocina estimulante del sistema inmunológico. En otra modalidad, el adyuvante comprende una molécula de nucleótidos que codifica una citocina estimulante del sistema inmunológico. En otra modalidad, el adyuvante es o comprende un glucósido pluma. En otra modalidad, el adyuvante es o comprende un mitógeno bacteriano. En otra modalidad, el adyuvante es o comprende una toxina bacteriana. En otra modalidad, el adyuvante es o comprende cualquier otro adyuvante conocido en la técnica.

La presente invención describe un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención, en donde la proteína o el polipéptido recombinantes contienen un péptido antigénico de interés, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra un péptido antigénico de interés.

La presente solicitud describe, además, un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un vector de vacuna recombinante de la presente invención, en donde el vector de vacuna recombinante comprende o codifica una proteína o polipéptido recombinantes que comprenden un péptido antigénico heterólogo de interés, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra el péptido antigénico de interés.

La presente solicitud describe, además, un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, en donde la cepa de Listeria recombinante comprende o codifica una proteína o polipéptido recombinantes que comprenden un péptido antigénico heterólogo de interés, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra el péptido heterólogo de interés.

Como se describe en la presente descripción, un péptido o molécula de nucleótidos de la presente invención pueden administrarse a un sujeto que tiene un linfoma, célula cancerosa, o enfermedad infecciosa que expresa un antígeno objetivo de la presente invención. En otra modalidad, el péptido o molécula de nucleótidos puede administrarse ex vivo a las células de un sujeto. En otra modalidad, el péptido puede administrarse a un donante de linfocitos; después los linfocitos del donante se administran, en otra modalidad, a un sujeto. En otra modalidad, el péptido puede administrarse a un donante de anticuerpos o linfocitos; después el antisuero o los linfocitos del donante se administran, en otra modalidad, a un sujeto.

La presente solicitud describe un método para producir una proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención que comprende la etapa de traducir dicha proteína o polipéptido recombinantes a partir de una molécula

de nucleótidos que codifica los mismos. En otra modalidad, la presente invención proporciona un producto producido por uno o más de los procesos descritos en la presente descripción.

Como se describe en la presente descripción, el péptido heterólogo de interés puede ser una proteína de longitud completa, que en una modalidad, comprende un péptido antigénico. En una modalidad, la proteína es una proteína NY-ESO-1. En otra modalidad, la proteína es una proteína E7 del virus del papiloma humano (HPV). En otra modalidad, la proteína es una proteína del receptor de células B (BCR). Como se describe en la presente descripción, el péptido heterólogo de interés es un péptido antigénico.

El péptido antigénico de interés en la presente invención es, en otra modalidad, un péptido NY-ESO-1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de nucleótidos recombinante que codifica un péptido que contiene NY-ESO-1 de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una proteína o polipéptido recombinantes, que contienen LLO mutante, de la presente invención, y un péptido NY-ESO-1. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que codifica un péptido de la presente invención que contiene NY-ESO-1. En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que codifica un péptido de la presente invención que contiene NY-ESO-1.

NY-ESO-1 es un antígeno "de cáncer de testículo" expresado en el cáncer epitelial de ovario (EOC). NY-ESO-1 se expresa en melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, que en una modalidad, es carcinoma de células escamosas esofágicas, o una combinación de estos. En una modalidad, NY-ESO-1 es uno de los antígenos de cáncer de testículo más inmunogénicos. En otra modalidad NY-ESO-1 es capaz de inducir fuertes respuestas inmunológicas humorales (anticuerpos) y celulares (células T) en pacientes con cánceres que expresan NY-ESO-1 a través de una inducción natural o espontánea por el tumor de los pacientes o después de una vacunación específica mediante el uso de epítopos peptídicos definidos. En otra modalidad, los epítopos peptídicos de NY-ESO-1 se presentan por moléculas MHC clase II. Por lo tanto, en una modalidad, las composiciones y métodos de la presente invención que comprenden NY-ESO-1 son particularmente útiles en la prevención o el tratamiento de los cánceres mencionados anteriormente.

La presente solicitud describe un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto contra una célula cancerosa que expresa NY-ESO-1, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido, proteína o polipéptido recombinantes que contienen el antígeno NY-ESO-1, o un vector de vacuna que expresa el antígeno NY-ESO-1, o una molécula de nucleótidos que codifica el antígeno NY-ESO-1, o una cepa de Listeria recombinante que expresa el antígeno NY-ESO-1, de la presente invención, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra una célula cancerosa que expresa NY-ESO-1. En otra modalidad, la célula cancerosa es una célula de melanoma ovárico. En otra modalidad, la célula cancerosa es una célula de cáncer de pulmón. En otra modalidad, la célula cancerosa es cualquier otra célula cancerosa que exprese NY-ESO-1, conocida en la técnica.

La presente invención proporciona, por lo tanto, una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un péptido NY-ESO-1, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia de un tumor que expresa NY-ESO-1, o la protección contra este, en un sujeto.

En una modalidad, el tumor es un tumor de melanoma ovárico. En otra modalidad, el tumor es un tumor de cáncer de pulmón. En otra modalidad, el tumor es cualquier otro tumor que exprese NY-ESO-1 conocido en la técnica.

La presente solicitud describe, además, un método para inducir una respuesta inmunológica contra un epítopo de NY-ESO-1, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención que contienen el antígeno NY-ESO-1, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra un epítopo de NY-ESO-1.

Como se describe en la presente descripción, la presente solicitud proporciona un método para inducir una respuesta inmunológica contra un antígeno NY-ESO-1, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención que contienen dicho antígeno NY-ESO-1, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra un epítopo de NY-ESO-1.

En una modalidad, un epítopo de NY-ESO-1 para usar en la presente invención es ASGPGGGAPR: 53-62 (A31), ARGPESRLL: 80-88 (Cw6), LAMPFATPM: 92-100 (Cw3), MPFATPMEA: 94-102 (B35, B51), TVSGNILTR: 127-136 (A68), TVSGNILT: 127-135 (Cw15), SLLMWITQC: 157-165 (A2; Ejemplo 2), u otro epítopo de NY-ESO-1 conocido en la técnica.

En la presente descripción se describe además un método para inducir una respuesta inmunológica contra una célula objetivo que expresa NY-ESO-1, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención que contienen el antígeno NY-ESO-1, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra una célula objetivo que expresa NY-ESO-1. En otra modalidad, la célula

objetivo es una célula de melanoma ovárico. En otra modalidad, la célula objetivo es una célula de cáncer de pulmón. En otra modalidad, la célula objetivo es cualquier otra célula que exprese NY-ESO-1, conocida en la técnica.

El tumor o célula cancerosa objetivo que expresan NY-ESO-1 pueden ser un tumor o célula de un cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC). En otra modalidad, la célula cancerosa que expresa NY-ESO-1 es una célula o tumor de adenocarcinoma pulmonar. En otra modalidad, la célula cancerosa que expresa NY-ESO-1 es una célula o tumor de carcinoma bronquioloalveolar (BAC). En otra modalidad, la célula cancerosa que expresa NY-ESO-1 es una célula o tumor de un adenocarcinoma con características bronquioloalveolares (AdenoBAC). En otra modalidad, la célula cancerosa o tumor que expresan NY-ESO-1 es de un carcinoma de células escamosas del pulmón.

El péptido NY-ESO-1 puede ser un péptido de una proteína NY-ESO-1, en donde la secuencia de la proteína es:

MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAA RASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARR SLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCF LPVFLAQPPSGQRR (sec. con núm. de ident.: 1; núm. de registro del GenBank NM_001327). En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es una variante de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es un isómero de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es un fragmento de un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es un fragmento de una variante de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la proteína NY-ESO-1 es un fragmento de un isómero de la sec. con núm. de ident.: 1.

En otra modalidad, el péptido NY-ESO-1 de la presente invención se origina de cualquier otra proteína NY-ESO-1 conocida en la técnica. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que tiene la secuencia: SLLMWITQC (sec. con núm. de ident.: 2). En otra modalidad, la secuencia es SLLMWITQCFL (sec. con núm. de ident.: 3). En otra modalidad, la secuencia es SLLMWITQCFLP (sec. con núm. de ident.: 4). En otra modalidad, la secuencia es SLLMWITQCFLPV (sec. con núm. de ident.: 5). En otra modalidad, la secuencia es SLLMWITQCFLPVF (sec. con núm. de ident.: 6). En otra modalidad, la secuencia es SLLMWITQCFLPVFL (sec. con núm. de ident.: 7). En otra modalidad, la secuencia es WITQCFLPVFLAQPPSGQRR (sec. con núm. de ident.: 8). En otra modalidad, la secuencia es YLAMPFATPMEAELARRSLA (sec. con núm. de ident.: 9). En otra modalidad, la secuencia es ASGPGGGAPR (sec. con núm. de ident.: 10). En otra modalidad, la secuencia es MPFATPMEA (sec. con núm. de ident.: 11). En otra modalidad, la secuencia es LAMPFATPM (sec. con núm. de ident.: 12). En otra modalidad, la secuencia es ARGPESRLL (sec. con núm. de ident.: 13). En otra modalidad, la secuencia es LLMWITQCF (sec. con núm. de ident.: 14). En otra modalidad, la secuencia es SLLMWITQV (sec. con núm. de ident.: 15). En una modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que comprende las posiciones 157-165 del péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que comprende las posiciones 53-62 del péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que comprende las posiciones 94-102 del péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que comprende las posiciones 92-100 del péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que comprende las posiciones 80-88 del péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es un péptido que comprende las posiciones 158-166 del péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno NY-ESO-1 es una variante de un péptido NY-ESO-1 de tipo silvestre. Un ejemplo de una variante es SLLMWITQV (sec. con núm. de ident.: 16).

En otra modalidad, el péptido antigénico utilizado en la presente invención es un péptido E7 del virus del papiloma humano (HPV). En otra modalidad, el péptido antigénico es una proteína E7 completa. En otra modalidad, el péptido antigénico es un fragmento de una proteína E7.

Las proteínas E6 y E7 son dos de siete proteínas tempranas no estructurales, algunas de las cuales desempeñan un papel en la replicación viral (E1, E2, E4) y/o en la maduración del virus (E4). En otra modalidad, las proteínas E6 y E7 son oncoproteínas que son críticas para la replicación viral, así como para la inmortalización y transformación de las células huésped. En una modalidad, las proteínas virales E6 y E7 no se expresan en el epitelio escamoso cervical normal. En otra modalidad, se necesita la expresión de los genes de E6 y E7 en las células madre epiteliales de la mucosa para iniciar y mantener la carcinogénesis cervical. Además y en algunas modalidades, la progresión de las lesiones preneoplásicas a cánceres cervicales invasivos se asocia con un aumento continuo de la expresión de las oncoproteínas E6 y E7. Por lo tanto, en otra modalidad, E6 y E7 se expresan en cánceres cervicales. En otra modalidad, el potencial oncogénico de E6 y E7 puede provenir de sus propiedades de unión a las proteínas de las células huésped. Por ejemplo y en una modalidad, E6 se une a la proteína supresora de tumores p53 lo que conduce a una degradación de la proteína, dependiente de ubiquitina, y, en otra modalidad, E7 se une y promueve la degradación de la proteína de retinoblastoma supresora de tumor (pRb). Por lo tanto, en una modalidad, las composiciones y usos de la presente invención que comprenden E7 de HPV son particularmente útiles en la prevención o el tratamiento de los cánceres mencionados anteriormente.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una molécula de nucleótidos recombinante que codifica un péptido que contiene E7, de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido, proteína o polipéptido recombinantes que contienen LLO mutante, de la presente invención, y un péptido E7. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que codifica un péptido que contiene E7, de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que codifica un péptido que contiene E7, de la presente invención.

En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto contra un epítopo de E7 de HPV, que comprende la etapa de administrar al sujeto el péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra un epítopo de E7 de HPV.

En una modalidad, un epítopo de E7 de HPV para usar en la presente invención es TLHEYMLDL: 7-15 (B8), YMLDLQPETT: 11-20 (A2), LLMGTLGIV: 82-90 (A2), TLGIVCPI: 86-93 (A2), u otro epítopo de E7 de HPV conocido en la técnica.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un péptido E7 de HPV, para usar en la inducción de una respuesta inmunológica al péptido antigénico E7 de HPV en un sujeto.

La presente solicitud describe, además, un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto contra una célula objetivo que expresa E7 de HPV, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención que contienen E7 de HPV, o un nucleótido o un vector de vacuna o una cepa de Listeria que codifican el péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la invención que contienen E7 de HPV, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra una célula objetivo que expresa E7 de HPV. La célula objetivo puede ser una célula de cáncer cervical, o una célula de cáncer de cabeza y cuello, o cualquier otro tipo de célula que exprese E7 de HPV, conocida en la técnica.

En una modalidad, el tumor es un tumor cervical. En otra modalidad, el tumor es un tumor de cabeza y cuello. En otra modalidad, el tumor es cualquier otro tipo de tumor que exprese E7 de HPV, conocido en la técnica.

El tumor cervical al que se dirigen las proteínas, nucleótidos, vectores de vacunas o cepas de Listeria de la presente invención, en otra modalidad, es un carcinoma de células escamosas. En otra modalidad, el cáncer cervical es un adenocarcinoma. En otra modalidad, el tumor cervical es un carcinoma adenoescamoso. En otra modalidad, el tumor cervical es un carcinoma de células pequeñas. En otra modalidad, el tumor cervical es cualquier otro tipo de tumor cervical conocido en la técnica.

En una modalidad, el tumor al que se dirigen las proteínas, nucleótidos, vectores de vacunas o cepas de Listeria de la presente invención es un carcinoma de cabeza y cuello. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma anal. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma vulvar. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma vaginal.

En una modalidad, las proteínas, nucleótidos, vectores de vacunas o cepas de Listeria proporcionados en la presente descripción pueden usarse junto con otros métodos para tratar, inhibir, o suprimir un cáncer cervical, que incluyen, entre otros, cirugía, radioterapia, quimioterapia, vigilancia, adyuvante (adicional), o una combinación de estos tratamientos.

La proteína E7 que se utiliza (ya sea completa o como la fuente de los fragmentos), en otra modalidad, tiene la secuencia

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHY NIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (sec. con núm. de ident.: 17). En otra modalidad, la proteína E7 es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 17. En otra modalidad, la proteína E7 es una variante de la sec. con núm. de ident.: 17. En otra modalidad, la proteína E7 es un isómero de la sec. con núm. de ident.: 17. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de la sec. con núm. de ident.:

17. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 17. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de una variante de la sec. con núm. de ident.: 17. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de un isómero de la sec. con núm. de ident.: 17.

En una modalidad, el dominio de LLO de unión al colesterol (ECTGLAWEWWR; sec. con núm. de ident.: 18) se sustituye con un epítopo de E7 (RAHYNIVTF; sec. con núm. de ident.: 19).

En otra modalidad, la secuencia de la proteína E7 es:

MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARR AEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ (sec. con núm. de ident.: 20). En otra modalidad, la proteína E7 es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 20. En otra modalidad, la proteína E7 es una variante de la sec. con núm. de ident.: 20. En otra modalidad, la proteína E7 es un isómero de la sec. con núm. de ident.: 20. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 20. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 20. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de una variante de la sec. con núm. de ident.:

20. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de un isómero de la sec. con núm. de ident.: 20.

En otra modalidad, la proteína E7 tiene una secuencia que se expone en una de las siguientes entradas del GenBank: M24215, NC_004500, V01116, X62843, o M14119. En otra modalidad, la proteína E7 es un homólogo de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E7 es una variante de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E7 es un isómero de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de un homólogo de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de una variante de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E7 es un fragmento de un isómero de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank.

En una modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que tiene la secuencia: TLGIVCPI (sec. con núm. de ident.: 21). En otra modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que tiene la secuencia: LLMGTLGIV (sec. con núm. de ident.: 22). En otra modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que tiene la secuencia: YMLDLQPETT (sec. con núm. de ident.: 23). En una modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que comprende las posiciones 86-93 del antígeno E7 de HPV16 de tipo silvestre. En una modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que comprende las posiciones 82-90 del antígeno E7 de HPV16 de tipo silvestre. En una modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que comprende las posiciones 11-20 del antígeno E7 de HPV16 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es un péptido que consiste en las posiciones 86-93, 82-90, u 11-20 del antígeno E7 de HPV16 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es una variante de un péptido E7 de HPV16 de tipo silvestre. En otra modalidad, el antígeno E7 de HPV16 es cualquier antígeno E7 de HPV16 descrito en Ressing y otros, J Immunol 1995 154(11):5934-43.

En otra modalidad, el péptido antigénico utilizado en la presente invención es un péptido E6 de HPV. En otra modalidad, el péptido antigénico es una proteína E6 completa. En otra modalidad, el péptido antigénico es un fragmento de una proteína E6.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una proteína recombinante, o una molécula de nucleótidos, o un vector de vacuna recombinante, o una cepa de Listeria recombinante de la invención, en donde el péptido antigénico es un péptido E6 de HPV, para usar en la inducción de una respuesta inmunológica al péptido antigénico E6 de HPV en un sujeto.

La proteína E6 que se utiliza (ya sea completa o como la fuente de los fragmentos) tiene, en otra modalidad, la secuencia

MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFA FRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCI NCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (sec. con núm. de ident.: 24). En otra modalidad, la proteína E6 es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 24. En otra modalidad, la proteína E6 es una variante de la sec. con núm. de ident.: 24. En otra modalidad, la proteína E6 es un isómero de la sec. con núm. de ident.: 24. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 24. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 24. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de una variante de la sec. con núm. de ident.:

24. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de un isómero de la sec. con núm. de ident.: 24.

En otra modalidad, la secuencia de la proteína E6 es:

MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFV VYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPL NPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV (sec. con núm. de ident.: 25). En otra modalidad, la proteína E6 es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 25. En otra modalidad, la proteína E6 es una variante de la sec. con núm. de ident.: 25. En otra modalidad, la proteína E6 es un isómero de la

sec. con núm. de ident.: 25. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de la sec. con núm. de ident.:

25. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 25. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de una variante de la sec. con núm. de ident.: 25. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de un isómero de la sec. con núm. de ident.: 25.

En otra modalidad, la proteína E6 tiene una secuencia que se expone en una de las siguientes entradas del GenBank: M24215, M14119, NC_004500, V01116, X62843, o M14119. En otra modalidad, la proteína E6 es un homólogo de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E6 es una variante de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E6 es un isómero de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de un homólogo de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de una variante de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank. En otra modalidad, la proteína E6 es un fragmento de un isómero de una secuencia de una de las entradas anteriores del GenBank.

El HPV que es la fuente del antígeno heterólogo de los métodos de la presente invención es, en otra modalidad, un HPV 16. En otra modalidad, el HPV es un HPV-18. En otra modalidad, el HPV se selecciona de HPV-16 y HPV-18. En otra modalidad, el HPV es un HPV-31. En otra modalidad, el HPV es un HPV-35. En otra modalidad, el HPV es un HPV-39. En otra modalidad, el HPV es un HPV-45. En otra modalidad, el HPV es un HPV-51. En otra modalidad, el HPV es un HPV-52. En otra modalidad, el HPV es un HPV-58. En otra modalidad, el HPV es un tipo de HPV de alto riesgo. En otra modalidad, el HPV es un tipo de HPV mucosal.

En una modalidad, un factor etiológico muy importante en la génesis del carcinoma cervical es la infección por los papilomavirus humanos (HPV), que, en una modalidad, son virus pequeños de ADN que infectan las células epiteliales de la piel o la mucosa. En una modalidad, las neoplasias malignas relacionadas con el HPV incluyen los cánceres oral, cervical, anogenital, y cervical así como papilomatosis respiratoria. En una modalidad, el HPV expresa seis o siete proteínas no estructurales y dos proteínas estructurales, cada una de las cuales puede servir como un objetivo en los enfoques inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos descritos en la presente descripción. En una modalidad, las proteínas de la cápside vírica L1 y L2 son proteínas estructurales tardías. En una modalidad, L1 es la proteína principal de la cápside, cuya secuencia de aminoácidos está muy conservada entre diferentes tipos de HPV.

En otra modalidad, el péptido antigénico de interés utilizado en la presente invención es un idiotipo de BCR.

En una modalidad, los "receptores de células B" o "BCR" son los receptores de la superficie celular de células B para un antígeno específico. En otra modalidad, el BCR está compuesto de una molécula transmembrana de inmunoglobulina asociada con las cadenas Igα e Igβ invariantes en un complejo no covalente. En otra modalidad, la señalización del receptor de células B (BCR) regula varias decisiones del destino de las células B a lo largo del desarrollo. En otra modalidad, la expresión continuada de las subunidades de señalización del BCR es necesaria para la supervivencia de las células B maduras. En otra modalidad, las alteraciones en la señalización del BCR pueden apoyar la linfomagénesis. En una modalidad, las células tienen la proteína CD20 en el exterior de la célula. En otra modalidad, las células B cancerosas portan, además, la proteína CD20. En otra modalidad, CD20 tiene un alto nivel de expresión en al menos el 95 % de los linfomas de células B. En una modalidad, el BCR se expresa en los linfomas de células B. En otra modalidad, el BCR se expresa en linfoma folicular, linfoma de células pequeñas no escindidas, linfoma de zona marginal, linfoma esplénico con linfocitos vellosos, linfoma de células de manto, linfoma de células grandes, linfoma difuso de células grandes, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de Burkitt endémico, Linfoma de Burkitt esporádico, linfoma no de Burkitt, tejido linfoide asociado a las mucosas MALT / MALToma (extranodal), linfoma monocitoide de células B (nodal), linfoma inmunoblástico, difuso, de celularidad mixta, linfoma medial primario de células B, linfoma angiocéntrico -células B pulmonares. En otra modalidad, CD20 se expresa en el BCR que se expresa en linfoma folicular, linfoma de células pequeñas no escindidas, linfoma de zona marginal, linfoma esplénico con linfocitos vellosos, linfoma de células de manto, linfoma de células grandes, linfoma difuso de células grandes, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de Burkitt endémico, Linfoma de Burkitt esporádico, linfoma no de Burkitt, tejido linfoide asociado a las mucosas MALT / MALToma (extranodal), linfoma monocitoide de células B (nodal), linfoma medial primario de células B, difuso, de celularidad mixta, linfoma angiocéntrico -células B pulmonares. Por lo tanto, en una modalidad, las composiciones y usos médicos de la presente invención que comprenden BCR son particularmente útiles en la prevención o el tratamiento de los cánceres mencionados anteriormente.

En una modalidad, estudios citogenéticos han demostrado que algunos subtipos histológicos e inmunológicos de NHL tienen anormalidades cromosómicas con translocaciones recíprocas, que implican frecuentemente genes para el receptor de células B y un oncogén. La linfomagénesis da como resultado una expansión clonal de la célula B transformada, donde cada célula hija expresa el BCR en la superficie celular así como los péptidos derivados del BCR asociados con moléculas MHC clase I y II. El BCR tiene una conformación única formada por las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera, esto se denomina como el "idiotipo", que es el mismo para cada

célula hija dentro del tumor, y no está presente en cantidades significativas de células normales. Por lo tanto, el idiotipo es un antígeno específico del tumor y un objetivo para la terapia de linfomas.

Como se describe en la presente descripción, la presente invención ha producido una proteína de fusión conformacionalmente intacta que comprende una proteína LLO y un idiotipo de BCR (sección de Detalles Experimentales en la presente descripción).

La presente solicitud describe un método para inducir una respuesta inmunológica contra un linfoma en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido, proteína o polipéptido recombinantes que contienen un idiotipo de BCR de la presente invención, o una molécula de nucleótidos, vector de vacuna o cepa de Listeria que codifican o expresan el péptido, proteína o polipéptido recombinantes que contienen el idiotipo de BCR de la presente invención, lo que induce de esta manera una respuesta inmunológica contra un linfoma.

Como se describe en la sección de Detalles Experimentales en la presente descripción, la fusión de LLO a un antígeno aumenta su inmunogenicidad. Adicionalmente, la administración de proteínas de fusión de la presente invención da como resultado la protección contra un reto tumoral.

Por otra parte, como se describe en la presente descripción, la presente invención ha producido una proteína de fusión conformacionalmente intacta que comprende una proteína LLO y un idiotipo de BCR, ha demostrado metodologías precisas y eficaces para el análisis de vacunas contra linfomas en ratón y modelos animales, y ha demostrado la eficacia de las vacunas de la presente invención en la protección contra un linfoma y su superioridad sobre las vacunas actualmente aceptadas contra los linfomas (sección de Detalles Experimentales).

En una modalidad, una vacuna de la presente invención es una composición que tras su administración estimula la producción de anticuerpos o la inmunidad celular contra un antígeno.

En una modalidad, las vacunas se administran como microorganismos muertos o atenuados, mientras en otra modalidad, las vacunas comprenden antígenos naturales o modificados genéticamente. En una modalidad, las vacunas eficaces estimulan el sistema inmunológico para promover el desarrollo de anticuerpos que pueden atacar rápida y eficazmente a las células, microorganismos o virus que producen el antígeno contra el cual se vacunó el sujeto, cuando se producen en el sujeto, lo que prevé de esta manera el desarrollo de la enfermedad.

En una modalidad, una vacuna de la presente invención es profiláctica, mientras que en otra modalidad, una vacuna de la presente invención es terapéutica. En una modalidad, una vacuna profiláctica se administra a una población que es susceptible a desarrollar o contraer una enfermedad o condición particulares, ya sea a través de exposición ambiental o predisposición genética. Tales factores de susceptibilidad dependen de la enfermedad y se conocen bien por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la población que comprende fumadores (en una modalidad, cigarrillo, cigarro, pipa, etcétera) se conoce en la técnica por ser susceptible a desarrollar cáncer de pulmón. La población que comprende una mutación en BRCA-1 y BRCA-2 se conoce en la técnica por ser susceptible a cáncer de mama y/o de ovario. La población que comprende polimorfismos de nucleótidos simples (SNP) particulares en el cromosoma 15 dentro de una región que contiene los genes para las subunidades 3 y 5 del receptor alfa de acetilcolina nicotínico, se conoce en la técnica por ser susceptible al cáncer de pulmón. En la técnica se conocen otros factores de susceptibilidad similares, y en una modalidad, se prevé que tales poblaciones susceptibles sean una población para la cual una vacuna profiláctica de la presente invención sería de gran utilidad.

Por lo tanto, las vacunas de la presente invención son eficaces en la inducción de una respuesta inmunológica contra un linfoma, así como en la prevención, tratamiento, e inducción de la remisión de este. Por lo tanto, la presente solicitud describe un método para superar una tolerancia inmunológica a un linfoma en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido de la presente invención, lo que supera de esta manera una tolerancia inmunológica a un linfoma.

La presente solicitud describe, además, un método para superar una tolerancia inmunológica a un linfoma en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una molécula de nucleótidos de la presente invención, lo que supera de esta manera una tolerancia inmunológica a un linfoma.

"Tolerancia" se refiere, en otra modalidad, a la carencia de capacidad de respuesta del huésped a un antígeno. En otra modalidad, el término se refiere a la carencia de una capacidad de respuesta detectable del huésped a un antígeno. En otra modalidad, el término se refiere a la carencia de inmunogenicidad de un antígeno en un huésped. En otra modalidad, la tolerancia se mide por la carencia de capacidad de respuesta en un ensayo de muerte de CTL in vitro. En otra modalidad, la tolerancia se mide por la carencia de capacidad de respuesta en un ensayo de hipersensibilidad de tipo tardía. En otra modalidad, la tolerancia se mide por la carencia de capacidad de respuesta

en cualquier otro ensayo adecuado conocido en la técnica. En otra modalidad, la tolerancia se determina o se mide como se describe en los Ejemplos de la presente descripción.

"Superar" se refiere, en otra modalidad, a una inversión de la tolerancia por una vacuna. En otra modalidad, el término se refiere a conferir una respuesta inmunológica detectable por una vacuna. En otra modalidad, la superación de la tolerancia inmunológica se determina o se mide como se describe en los Ejemplos de la presente descripción.

Por lo tanto, la presente solicitud describe un método para reducir una incidencia de recaída de un linfoma en un sujeto en remisión del linfoma, que comprende la etapa de administrar al sujeto un péptido o molécula de nucleótidos de la presente invención, lo que reduce de esta manera una incidencia de recaída de un linfoma en un sujeto en remisión del linfoma.

La presente solicitud describe, además, un método para suprimir una formación de un linfoma, que comprende la etapa de administrar un péptido, proteína o polipéptido recombinantes o una molécula de nucleótidos de la presente invención, lo que suprime de esta manera una formación de un linfoma. La presente solicitud describe, además, un método para inducir una remisión de una enfermedad residual de linfoma de células B, que comprende administrar un péptido o molécula de nucleótidos de la presente invención, lo que induce de esta manera una remisión de una enfermedad residual de linfoma de células B.

La presente solicitud describe, además, un método para eliminar una enfermedad mínima residual de un linfoma de células B, que comprende administrar un péptido o molécula de nucleótidos de la presente invención, lo que elimina de esta manera la enfermedad mínima residual de un linfoma de células B.

La presente solicitud describe, además, un método para reducir el tamaño o volumen de un linfoma de células B, que comprende administrar un péptido o molécula de nucleótidos de la presente invención, lo que reduce de esta manera el tamaño de un linfoma de células B.

En otra modalidad, el linfoma que es un objetivo de las proteínas, nucleótidos, vectores de vacunas o cepas de Listeria de la presente invención es un linfoma no Hodgkin. En otra modalidad, un linfoma es un linfoma de células

B. En otra modalidad, un linfoma es un linfoma de bajo grado. En otra modalidad, un linfoma es un NHL de bajo grado. En otra modalidad, un linfoma es una enfermedad residual de uno de los tipos de linfoma anteriores. En otra modalidad, el linfoma es cualquier otro tipo de linfoma conocido en la técnica. En otra modalidad, el linfoma es un linfoma de Burkitt. En otra modalidad, el linfoma es un linfoma folicular. En otra modalidad, el linfoma es un linfoma de zona marginal. En otra modalidad, el linfoma es un linfoma esplénico de zona marginal. En otra modalidad, el linfoma es un linfoma de células de manto. En otra modalidad, el linfoma es un linfoma indolente de células de manto. En otra modalidad, el linfoma es cualquier otro tipo conocido de linfoma que exprese un BCR.

En otra modalidad, las células del tumor al que se dirigen las proteínas, nucleótidos, vectores de vacunas o cepas de Listeria de la presente invención expresan un BCR. En otra modalidad, el tumor se asocia con un BCR. En otra modalidad, el BCR tiene un idiotipo que es característico del tumor. En otra modalidad, el BCR expresado por una célula tumoral es el objetivo de las respuestas inmunológicas inducidas por los métodos y composiciones de la presente invención.

En otra modalidad, el BCR expresado por la célula objetivo es necesario para un fenotipo tumoral. En otra modalidad, el BCR es necesario para la transformación de una célula tumoral. En otra modalidad, las células tumorales que pierden la expresión del BCR pierden su crecimiento incontrolado, invasividad, u otra característica de malignidad.

Las proteínas, nucleótidos, vectores de vacunas o cepas de Listeria aplican igualmente para cualquier BCR de un linfoma no Hodgkin y cualquier idiotipo de este. Las secuencias de BCR se conocen bien en la técnica, y se obtienen fácilmente a partir de muestras de linfomas.

Una secuencia ilustrativa de un precursor de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) de un BCR es:

MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYY MSWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRA EDSATYYCARDPNYYDGSYEGYFDYWAQGTTLTVSS (sec. con núm. de ident.: 26; núm. de registro del GenBank X14096).

Una secuencia ilustrativa de un precursor de una cadena ligera de Ig de un BCR es:

LLLISVTVIVSNGEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGF SPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPRGVTFG SGTKLEIKR (sec. con núm. de ident.: 27; núm. de registro del GenBank X14097).

Otra secuencia ilustrativa de un precursor de una cadena ligera de Ig de un BCR es:

GFLLISVTVILTNGEIFLTQSPAIIAASPGEKVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGSS PKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTSFSFTINSMEAEDVATYYCQQRSSYPFTFGSGT KLEIKRADAAPTVSHLP (sec. con núm. de ident.: 28; núm. de registro del GenBank X14098).

LLLISVTVIVSNGEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGF SPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPRTFGSG TKLEIKRA (sec. con núm. de ident.: 29; núm. de registro del GenBank X14099).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena pesada de Ig de un BCR es:

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEMQLVESGGGLVQPGESLKLSCAASGFSFSGSTI HWVRQASGRGLEWVGRSRSKADNFMTSYAPSIKGKFIISRDDSSNMLYLQMNNLKT EDTAVYFCTRNFTSLDSTGNSFGPWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVS (sec. con núm. de ident.: 30; cadena pesada de IgM de linfoma folicular humano; núm. de registro del GenBank X70200).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena pesada de Ig de un BCR es:

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEMQLVESGGGLVQPGESFKLSCAASGFSFSGSTI HWVRQASGRGLEWVGRSRSKADNFMTSYAPSIKGKFIISRDDSSNMMYLQMNNLKN EDTAVYFCTRNFTSLDSTGNSFGPWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVS (sec. con núm. de ident.: 31; cadena pesada de IgM de linfoma folicular humano; núm. de registro del GenBank X70199).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena pesada de Ig de un BCR es:

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARHTVRGGHCAPRHKPSLQERWGNQRQGALRS (sec. con núm. de ident.: 32; cadena pesada de IgM de linfoma folicular humano; núm. de registro del GenBank X70208).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena pesada de Ig de un BCR es:

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSA MHWVRQASGKGLEWVGHIRDKANSYATTYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSL KIEDTAVYFCTRNFTSLDSTGNSFGPW (sec. con núm. de ident.: 33; cadena pesada de IgM de linfoma folicular humano; núm. de registro del GenBank X70207).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena ligera de Ig de un BCR es:

SELTQDPVVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNR PSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNLPLFGGGTKLTVLG (sec. con núm. de ident.: 34; cadena ligera de inmunocitoma linfoplasmacítico/linfoplasmacitoide humano; núm. de registro del GenBank AAD14088).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena ligera de Ig de un BCR es:

DIQMTQSPDSLTVSLGERATINCKSSQSILYSSNDKNYLAWYQQKAGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSATDFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYSTPLTFGGGTKVEI KR (sec. con núm. de ident.: 35; cadena ligera de linfoma folicular humano; núm. de registro del GenBank Y09250).

Otra secuencia ilustrativa de una cadena ligera de Ig de un BCR es:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSL ESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFVTYYCQQYNTFSSYTFGQGTKVEIK (sec. con núm. de ident.: 36; cadena ligera de linfoma esplénico de zona marginal humano; núm. de registro del GenBank AAX93805).

Las secuencias de otras cadenas ligeras de Ig de BCR ilustrativas se encuentran en los núms. de registro del GenBank AAX93769-93802, CAA25477, AAB31509, CAE52829-CAE52832, AAF79132-79143, y otras secuencias del GenBank.

Las secuencias de otras cadenas pesadas de Ig de BCR ilustrativas se encuentran en los núms. de registro del GenBank CAA73044-73059, AAX93809-AAX93842, AAQ74129, CAC39369, AAB52590-AAB52597, y otras secuencias del GenBank.

Los métodos para determinar las regiones determinantes de complementariedad (cdr) de un BCR se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la CDR1 de la sec. con núm. de ident.: 26 consiste en los residuos 50-54; la CDR2 consiste en los residuos 66-87; el segmento D consiste en los residuos 120-130; y el segmento J consiste en los residuos 131-145. La CDR1 de la sec. con núm. de ident.: 30 consiste en los residuos 148-162; la FR2 consiste en los residuos 163-204; la CDR2 consiste en los residuos 205-261; la FR3 consiste en los residuos 262-357; la CDR3 consiste en los residuos 358-432; y la CH1 consiste en los residuos 433-473. En otra modalidad, las regiones del marco (regiones diferentes de las cdr) se determinan por homología con regiones del marco conocidas de otras moléculas de inmunoglobulinas de la misma especie.

En otra modalidad, un idiotipo se identifica mediante la determinación de la cdr de un BCR de los métodos y composiciones de la presente invención.

En otra modalidad, se incluye o utiliza un BCR completo en la presente invención. En otra modalidad, se incluye o utiliza un fragmento de un BCR. En otra modalidad, el fragmento de BCR contiene el idiotipo de este. En otra modalidad, el fragmento de BCR contiene un epítopo de célula T. En otra modalidad, el fragmento de BCR contiene un epítopo de anticuerpo. En otra modalidad, el término "antígeno" se usa en la presente descripción para referirse al BCR o fragmento de este que es el objetivo de las respuestas inmunológicas inducidas por las composiciones de la presente invención.

En otra modalidad, el fragmento de un BCR contenido en los péptidos de la presente invención es un fragmento de cadena simple de las regiones variables (scFV) del BCR. En otra modalidad, el fragmento de BCR está conformacionalmente intacto. En otra modalidad, el fragmento de BCR contiene el idiotipo del BCR. En otra modalidad, el idiotipo del BCR está conformacionalmente intacto.

"Idiotipo" se refiere, en otra modalidad, a la estructura formada por la región determinante de complementariedad (cdr) de un BCR. En otra modalidad, el término se refiere a la región única de un BCR. En otra modalidad, el término se refiere al sitio de unión del BCR al antígeno.

"Conformacionalmente intacto" se refiere, en otra modalidad, a una conformación que no se modifica significativamente con respecto a la conformación nativa. En otra modalidad, el término se refiere a la reactividad de un anticuerpo que no se modifica significativamente con respecto a la proteína nativa. En otra modalidad, el término se refiere a la reactividad de un anticuerpo que coincide sustancialmente con la proteína nativa.

En otra modalidad, un péptido utilizado en la presente invención comprende un idiotipo que es homólogo a un idiotipo expresado por células del linfoma. En otra modalidad, el péptido comprende un idiotipo que es idéntico a un idiotipo expresado por células del linfoma.

En otra modalidad, una molécula de nucleótidos utilizada en la presente invención codifica un idiotipo que es homólogo a un idiotipo expresado por células del linfoma. En otra modalidad, la molécula de nucleótidos codifica un idiotipo que es idéntico a un idiotipo expresado por células del linfoma. En otra modalidad, el antígeno tiene una alta homología con el antígeno expresado por la célula tumoral. "Altamente homólogo" se refiere, en otra modalidad, a una homología de más del 90 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 92 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 93 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 94 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 95 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 96 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 97 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 98 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología de más del 99 %. En otra modalidad, el término se refiere a una homología del 100 %.

En otra modalidad, la enfermedad residual de un linfoma de células B o enfermedad mínima residual de un linfoma de células B tratada con una proteína, nucleótido, vector de vacuna o cepa de Listeria de la presente invención es la que queda después de una terapia de citorreducción. Los métodos para la terapia de citorreducción se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Winter JN y otros (Low-grade lymphoma. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004;:203-20) y Buske C y otros (Current status and perspective of antibody therapy in follicular lymphoma. Haematologica. Enero 2006;91(1):104-12).

El péptido antigénico heterólogo utilizado en la presente invención es, en otra modalidad, una proteína antigénica. En otra modalidad, el péptido antigénico es un fragmento de una proteína antigénica. En otra modalidad, el péptido antigénico es un péptido inmunogénico que se origina de un tumor. En otra modalidad, el péptido antigénico es un péptido inmunogénico que se origina de una metástasis. En otra modalidad, el péptido antigénico es un péptido inmunogénico que se origina de células cancerosas. En otra modalidad, el péptido antigénico es un péptido inmunogénico proangiogénico.

En una modalidad, el polipéptido antigénico es un antígeno E7 del virus de papiloma humano (E7 de HPV), que en una modalidad, es de HPV16 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAD33253) y en otra modalidad, de

HPV18 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank P06788). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es HPV-E6, que en una modalidad, es de HPV16 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAD33252, AAM51854, AAM51853, o AAB67615) y en otra modalidad, de HPV18 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank P06463). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es del antígeno prostático específico (PSA) (en una modalidad, núm. de registro del GenBank CAD30844, CAD54617, AAA58802, o NP_001639). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es un antígeno de la enzima quimotríptica del estrato córneo (SCCE) (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAK69652, AAK69624, AAG33360, AAF01139, o AAC37551). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es el antígeno 1 del tumor de Wilms, que en otra modalidad es la telomerasa de WT-1 (núm. de registro del GenBank P49952, P22561, NP_659032, CAC39220.2, o EAW68222.1). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es hTERT o telomerasa (núm. de registro del GenBank NM003219 (variante 1), NM198255 (variante 2), NM 198253 (variante 3), o NM 198254 (variante 4). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es la proteinasa 3 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank M29142, M75154, M96839, X55668, NM 00277, M96628 o X56606). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es la proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP2) (en una modalidad, núm. de registro del GenBank NP_001913, ABI73976, AAP33051, o Q95119). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es el antígeno de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA) (en una modalidad, núm. de registro del GenBank NP—001888, AAI28111, o AAQ62842). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es testisina (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAF79020, AAF79019, AAG02255, AAK29360, AAD41588, o NP_659206). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es el antígeno NY-ESO-1 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank CAA05908, P78358, AAB49693, o NP_640343). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es PSCA (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAH65183, NP_005663, NP_082492, 043653, o CAB97347). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es el receptor alfa de la interleucina (IL) 13 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank NP_000631, NP_001551, NP_032382, NP_598751, NP_001003075, o NP_999506). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es la anhidrasa carbónica IX (CAIX) (en una modalidad, núm. de registro del GenBank CAI13455, CAI10985, EAW58359, NP_001207, NP_647466, o NP_001101426). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es el antígeno carcinoembrionario (CEA) (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAA66186, CAA79884, CAA66955, AAA51966, AAD15250, o AAA51970.). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es MAGE-A (en una modalidad, núm. de registro del GenBank NP_786885, NP_786884, NP_005352, NP_004979, NP_005358, o NP_005353). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es la survivina (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAC51660, AAY15202, ABF60110, NP_001003019, o NP_001082350). En otra modalidad, el polipéptido antigénico es GP100 (en una modalidad, núm. de registro del GenBank AAC60634, YP_655861, o AAB31176). En otra modalidad, el péptido antigénico de la presente invención comprende una porción inmunogénica del polipéptido antigénico.

En otras modalidades, el antígeno se origina de un virus. En otras modalidades descritas en la presente descripción, el antígeno es uno de los siguientes antígenos: los antígenos E6/E7 y HPV 16/18 asociados con cánceres cervicales, NY-ESO-1 (núm. de registro del GenBank U87459), WT-1 (núms. de registro del GenBank NM000378 (variante A), NM024424 (variante B), NM 024425 (variante C), y NM024426 (variante D)), sarcoma sinovial X (SSX)2; (núm. de registro del GenBank NP_003138, NP_783629, NP_783729, NP_066295), y enzima quimiotríptica del estrato córneo (SCCE; núm. de registro del GenBank NM_005046 y NM_139277).

En una modalidad, los métodos para evaluar la producción de una respuesta inmunológica por un sujeto a un antígeno se conocen en la técnica, y en una modalidad, se describen más abajo en la presente descripción en la sección de Ejemplos.

La proteína LLO utilizada para construir las vacunas de la presente invención, en otra modalidad, tiene la secuencia:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADE IDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQ VVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNA TKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAV NNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVN AENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSF KAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIK NNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNK SKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTT LYPKYSNKVDNPIE (núm. de registro del GenBank P13128; sec. con núm. de ident.: 37; la secuencia de ácido nucleico se expone en el núm. de registro del GenBank X15127). Los primeros 25 aa de la proproteína correspondientes a esta secuencia son la secuencia señal y se escinden de LLO cuando es secretada por la bacteria. Por lo tanto, en esta modalidad, la proteína LLO activa de longitud completa es de 504 residuos de longitud. En otra modalidad, la proteína LLO es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 37. En otra modalidad, la proteína LLO es una variante de la sec. con núm. de ident.: 37.

En otra modalidad, la proteína LLO utilizada para construir las vacunas de los métodos y composiciones de la presente invención, tiene la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 46 (Ejemplo 1 más abajo en la presente descripción). En otra modalidad, la proteína LLO es una variante de la sec. con núm. de ident.: 46.

En otra modalidad, la proteína LLO de la invención utilizada para construir vacunas como las proporcionadas en la presente descripción es una LLO detoxificada (DTLLO). En otra modalidad, la LLO se detoxifica mediante la sustitución de la región de unión al colesterol con un péptido antigénico o epítopo de este. En otra modalidad, la LLO se detoxifica mediante la sustitución de la región de unión al colesterol con el epítopo de E7. En otra modalidad, la LLO se detoxifica mediante la eliminación de la porción de la secuencia señal de LLO. En otra modalidad, DTLLO se usa en fusiones genéticas a los antígenos objetivo para aumentar la inmunogenicidad antigénica. En otra modalidad, detoxLLO se fusiona a un antígeno. En otra modalidad, DTLLO se fusiona a un péptido antigénico como se describe en la presente descripción.

La región de unión al colesterol o dominio de unión al colesterol se conoce como LLO o puede deducirse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (revisado en Alouf, Int J Med Microbiol. Oct 2000;290(4-5):351-6), que incluyen mutagénesis dirigida a un sitio seguido de un ensayo de unión al colesterol o conservación de secuencias de proteínas con funciones similares de unión al colesterol.

En esta invención, la proteína LLO es una ctLLO, que es LLO de longitud completa en la que el CBD se ha sustituido por un péptido antigénico o epítopo de este por medio de una mutación por sustitución.

Además, en la presente descripción se describen ejemplos en los cuales la proteína LLO es una mutLLO. Una mutLLO es una en la cual el CBD se ha mutado, por ejemplo la mutLLO es una en la cual los aminoácidos en el CBD se han mutado, por ejemplo por una mutación puntual, una deleción, una inversión, una sustitución, o una combinación de estas. La mutación puede ser cualquier mutación conocida en la técnica, y puede comprender cualquier combinación de deleciones, sustituciones, o mutaciones puntuales en el CBD y/o deleciones de la secuencia señal de LLO. En otra modalidad, la mutación del CBD reduce la actividad hemolítica de LLO. En otra modalidad, el CBD se sustituye por epítopos restringidos a HLA clase I conocidos por usarse como una vacuna. En otra modalidad, la LLO mutada se expresa y purifica a partir de sistemas de expresión de E. coli.

Como se describe en la presente descripción, "LLO detox" o "DTLLO" se refieren a una LLO como se describe en la presente descripción con mutaciones puntuales en el dominio de unión al colesterol.

Como se describe en la presente descripción, "fragmento de LLO" o "ΔLLO" se refiere a un fragmento de LLO que comprende el dominio similar a PEST de esta. En otra modalidad, los términos se refieren a un fragmento de LLO que comprende una secuencia PEST.

En otra modalidad, un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención comprenden además un polipéptido marcador detectable. En otra modalidad, no se incluye un polipéptido marcador detectable. En otras modalidades, el polipéptido marcador es la proteína fluorescente verde (GFP), myc, myc-piruvato quinasa (myc-PK), His6, proteína de unión a la maltosa (MBP), un polipéptido marcador de hemaglutinina del virus de influenza, un polipéptido marcador flag (FLAG), y un polipéptido marcador de glutatión-S-transferasa (GST). Sin embargo, no debe interpretarse de ninguna manera que la invención se limita a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos marcadores mencionados anteriormente. En otra modalidad, la presente invención utiliza cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido que funcione en una manera sustancialmente similar a estos polipéptidos marcadores.

En otra modalidad, el vector de vacuna recombinante de la presente invención es un plásmido. En otra modalidad, la presente invención proporciona la introducción de una molécula de nucleótidos de la presente invención en una célula. Los métodos para construir y utilizar vectores recombinantes se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Brent y otros (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York). En otra modalidad, el vector es un vector bacteriano. En otras modalidades, el vector se selecciona de Salmonella sp., Shigella sp., BCG, L. monocytogenes y S. gordonii. En otra modalidad, las proteínas de fusión se suministran mediante vectores bacterianos recombinantes modificados para escapar de la fusión fagolisosómica y vivir en el citoplasma de la célula. En otra modalidad, el vector es un vector viral. En otras modalidades, el vector se selecciona de Vaccinia, Avipox, Adenovirus, AAV, virus Vaccinia NYVAC, cepa de vaccinia modificada Ankara (MVA), virus del bosque de Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana, virus del herpes, y retrovirus. En otra modalidad, el vector es un vector de ADN desnudo. En otra modalidad, el vector es cualquier otro vector conocido en la técnica.

En otra modalidad, un nucleótido de la presente invención se une operativamente a una secuencia promotora/reguladora que conduce la expresión del péptido codificado en las células en las que se introduce el vector. Las secuencias promotoras/reguladoras útiles para conducir la expresión constitutiva de un gen en una célula procariota se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, el promotor de p60 de Listeria, el promotor de inlA (codifica internalina), el promotor de hly, y se usa el promotor de ActA. En otra modalidad, se usa cualquier otro promotor de gram positivos. Las secuencias promotoras/reguladoras útiles para dirigir la expresión constitutiva de un gen en una célula eucariota (por ejemplo para una vacuna de ADN) se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, la secuencia potenciadora inmediata del promotor temprano de citomegalovirus, el promotor temprano de SV40, y el promotor del virus del sarcoma de Rous. En otra modalidad, la expresión inducible y tejido específica del ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención se logra mediante la

introducción de un ácido nucleico que codifica al péptido bajo el control de una secuencia promotora/reguladora inducible o específica del tejido. Los ejemplos de secuencias promotoras/reguladoras específicas de tejidos o inducibles que son útiles para este propósito incluyen, pero no se limitan al promotor inducible LTR del MMTV, y al potenciador/promotor tardío de SV40. En otra modalidad, se utiliza un promotor que se induce en respuesta a agentes inductores tales como metales, glucocorticoides, y similares. Por lo tanto, se comprenderá que la invención incluye el uso de cualquier secuencia promotora/reguladora, que se conozca o no, y que sea capaz de conducir la expresión de la proteína deseada unida operativamente a ella.

En otra modalidad, un péptido de la presente invención activa una APC (por ejemplo una DC), lo que media al menos parte del aumento de su inmunogenicidad. Como se describe en la presente descripción, no es necesario que la LLO inactivada esté unida a la proteína que contiene el idiotipo para mejorar su inmunogenicidad.

Como se describe en la presente descripción, la presente solicitud proporciona un método para mejorar la inmunogenicidad de un antígeno, que comprende fusionar una proteína LLO o fragmento de esta al antígeno. Como demuestran los datos descritos en la presente descripción, fusionar una proteína LLO mutada a un antígeno mejora la inmunogenicidad del antígeno.

En otra modalidad descrita, una proteína de fusión con LLO contiene una secuencia de aa similar a PEST. Como se describe en la presente descripción, se demostró una mejor inmunidad mediada por células para las proteínas de fusión que comprenden un antígeno y LLO que contiene la secuencia de aa similar a PEST KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (sec. con núm. de ident.: 63). En otra modalidad, la fusión de un antígeno a una LLO no hemolítica que incluye la secuencia de aa similar a PEST, sec. con núm. de ident.: 1, puede mejorar la inmunidad mediada por células y antitumoral del antígeno.

En otra modalidad, la proteína LLO no hemolítica o un fragmento de esta no necesariamente son las que se exponen exactamente en las secuencias expuestas en la presente descripción, sino que pueden realizarse otras alteraciones, modificaciones, o cambios que retengan las características funcionales de una LLO fusionada a un antígeno como se expone en otra parte de la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención utiliza un análogo de una proteína LLO o un fragmento de esta de la presente invención. Los análogos difieren, en otra modalidad, de las proteínas o péptidos de origen natural por diferencias conservadoras de la secuencia de aa o por modificaciones que no afectan la secuencia, o por ambas.

La presente solicitud describe una composición o método en donde aumenta la expresión de citocinas (ver por ejemplo, Ejemplo 9). En una opción, la citocina es TNF-alfa, mientras que en otra opción, la citocina es IL-12, mientras que en otra opción, la citocina es ISG15, mientras que en otra opción, la citocina es una citocina diferente conocida en la técnica. En una opción, el aumento puede ser en la expresión de ARNm de citocinas, mientras que en otra opción, puede ser en la secreción de citocinas, mientras que en otra opción, el aumento puede ser tanto en la expresión de ARNm como en la secreción de citocinas. En otra opción, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden aumentar los marcadores de maduración de las células dendríticas, que en una opción, es CD86, en otra opción, CD40, y en otra opción MHCII, en otra opción, otro marcador de la maduración de células dendríticas conocido en la técnica, o, en otra opción, una combinación de estos (ver por ejemplo, Ejemplo 10). En otra opción, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden provocar la translocación nuclear de factores de transcripción, que en una opción, es NF-kappa-B (ver por ejemplo, Ejemplo 11),

o en otra opción, es un factor de transcripción diferente conocido en la técnica. En otra opción, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden provocar una regulación positiva de los marcadores de superficie celular, que en una opción, puede ser CD 11b, que en una opción es Integrina-alfa M (ITGAM); molécula del grupo de diferenciación 11B; receptor del complemento 3A (CR3A); o antígeno de macrófagos 1 (MAC-1)A. En otra opción, un marcador diferente de la superficie celular expresado por células inmunológicas, puede regularse positivamente, como entenderá un experto.

Debe entenderse que, en una modalidad, un componente de las composiciones de la presente invención, tal como en una modalidad, una secuencia de LLO, una secuencia de un dominio de unión al colesterol, o una secuencia de un antígeno, tal como, en una modalidad, un NY-ESO-1, una secuencia de E7, o una secuencia de BCR, puede tener homología con una secuencia específica descrita en la presente descripción. En una modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 70 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 72 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 75 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 78 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 80 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 82 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 83 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 85 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 87 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 88 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 90 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 92 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 93 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 95 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 96 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 97 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 98 %.

En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad de más del 99 %. En otra modalidad, "homología" se refiere a una identidad del 100 %.

En otra modalidad de la presente invención, los términos “ácidos nucleicos” o “nucleótido” se refieren a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azúcar-fosfato. El término incluye, en una modalidad, ADN y ARN. El término “nucleótidos” se refiere, en una modalidad, a las unidades monoméricas de polímeros de ácidos nucleicos. En una modalidad, el ARN está en la forma de un ARNt (ARN de transferencia), ARNnp (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN antisentido, ARN inhibidor pequeño (ARNip), micro ARN (miARN) y ribozimas. Se ha descrito el uso de ARNip y miARN (Caudy AA y otros, Genes & Devel 16: 2491-96 y las referencias citadas en él). En otras modalidades, el ADN puede estar en forma de ADN plasmídico, ADN viral, ADN lineal, o ADN cromosómico o derivados de estos grupos. Adicionalmente, estas formas de ADN y ARN pueden tener cadenas simples, dobles, triples, o cuádruples. El término incluye, además, en otra modalidad, ácidos nucleicos artificiales que contienen otros tipos de cadenas principales, pero las mismas bases. En una modalidad, el ácido nucleico artificial es un PNA (ácido nucleico peptídico). Los PNA contienen cadenas principales peptídicas y bases de nucleótidos y son capaces de unirse, en una modalidad, tanto a moléculas de ADN como de ARN. En otra modalidad, el nucleótido se modifica con un grupo oxetano. En otra modalidad, el nucleótido se modifica por sustitución de uno o más enlaces fosfodiéster con un enlace fosforotioato. En otra modalidad, el ácido nucleico artificial contiene cualquier otra variante de la cadena principal de fosfato de los ácidos nucleicos nativos conocidos en la técnica. El uso de ácidos nucleicos con fosfotiorato y PNA se conoce por los expertos en la técnica, y se describen en, por ejemplo, Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; y Raz NK y otros, Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. La producción y el uso de los ácidos nucleicos se conocen por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook y Russell, eds. y Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio y G. C. Fareed.

La homología de proteínas y/o péptidos para cualquier secuencia de aa mencionada en la presente descripción se determina, en una modalidad, mediante métodos bien descritos en la técnica, que incluyen análisis de inmunotransferencia, o por medio de análisis de secuencias de aa mediante algoritmos informáticos, con el uso de cualquiera de un número de paquetes informáticos disponibles, a través de métodos establecidos. Algunos de estos paquetes incluyen los paquetes FASTA, BLAST, MPsrch o Scanps, y emplean, en otras modalidades, el uso de, por ejemplo, los algoritmos de Smith y Waterman, y/o alineamientos globales/locales o BLOQUES para el análisis.

"Péptido" se refiere, en otra modalidad, a una cadena de aa conectados con enlaces peptídicos. En una modalidad, un péptido es una cadena corta de aa. En otra modalidad, el término se refiere a una variante de molécula peptídica, que contiene cualquier modificación descrita o mencionada en la presente descripción. En otra modalidad, el término se refiere a una molécula que contiene uno o más motivos introducidos por un agente de entrecruzamiento químico. En otra modalidad, el término se refiere a una molécula mimética de péptidos. En otra modalidad, el término se refiere a cualquier otro tipo de variante de una molécula peptídica conocida en la técnica.

En una modalidad, el término "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos que comprende múltiples subunidades peptídicas, que incluyen una proteína de longitud completa, oligopéptidos, y fragmentos de estos, en donde los residuos de aminoácidos se unen por enlaces peptídicos covalentes. En una modalidad, una proteína descrita en la presente invención puede ser alternativamente un polipéptido de la presente invención.

Como se usa en la presente descripción en la especificación y en la sección de Ejemplos a continuación, el término "péptido" incluye péptidos nativos (productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintetizados sintéticamente), tales como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que le dan más estabilidad a los péptidos mientras están en un cuerpo, o más capacidad de penetrar en las células bacterianas. Tales modificaciones incluyen, pero sin limitarse a modificación del N terminal, modificación del C terminal, modificación de los enlaces peptídicos, que incluyen, pero no se limitan a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal, y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). A continuación se proporcionan más detalles al respecto.

Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden sustituirse, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces tipo éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces α-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), doble enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados de péptidos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", que se presenta naturalmente en el átomo de carbono.

Estas modificaciones pueden producirse en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo.

Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tir y Fen, pueden sustituirse por ácidos no naturales sintéticos tales como TIC, naftilelanina (Nol), derivados de Fen metilados en el anillo, derivados halogenados de Fen u o-metil-Tir.

Además de lo anterior, los péptidos de la presente invención pueden incluir, además, uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo ácidos grasos, carbohidratos complejos, etcétera).

Como se usa en la presente descripción en la especificación y en la sección de reivindicaciones más abajo se entiende que el término "aminoácido" o "aminoácidos" incluye los 20 aminoácidos de origen natural; los aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero no se limitan a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye D-y L-aminoácidos.

En una modalidad, un aminoácido en las composiciones y para usar en la presente invención puede ser de los aminoácidos de origen natural o aminoácidos no convencionales o modificados, que se conocen en la técnica.

En otra modalidad, el método usado para conjugar la proteína LLO no hemolítica o un fragmento de esta al antígeno es el que se describe en el Ejemplo 11. En otra modalidad, se utiliza otro método conocido en la técnica. Los métodos para la conjugación química de péptidos entre sí se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en (Biragyn, A y Kwak, LW (2001) Mouse models for lymphoma en "Current Protocols in Immunology" 20.6.1-20.6.30) y (Collawn, J. F. y Paterson, Y. (1989) Preparation of Anti-peptide antibodies. En Current Protocols in Molecular Biology. Suplemento 6. Ed. F.M. Ausubel y otros, Greene Publishing/Wiley 11.14.1 -11.15.3).

En otra modalidad, la proteína LLO no hemolítica se une al antígeno o fragmento de este por conjugación química. En otra modalidad, la proteína LLO no hemolítica se une al péptido heterólogo por conjugación química. En otra modalidad, se usa el glutaraldehído para la conjugación. En otra modalidad, la conjugación se realiza mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Como se describe en la presente descripción, un péptido de fusión puede sintetizarse mediante el uso de técnicas estándar de síntesis química de péptidos. En otra modalidad, la molécula quimérica se sintetiza como un solo polipéptido contiguo. En otra modalidad, la proteína LLO; y el BCR o un fragmento de este se sintetizan separadamente, después se fusionan por condensación del extremo amino terminal de una molécula con el extremo carboxilo terminal de la otra molécula, lo que forma de esta manera un enlace peptídico. En otra modalidad, la proteína LLO y el antígeno cada uno se condensa con un extremo de una molécula espaciadora peptídica, lo que forma de esta manera una proteína de fusión contigua.

En otra modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se preparan mediante cualquier método adecuado, que incluye, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias adecuadas o síntesis química directa mediante los métodos analizados más abajo. En otra modalidad, se clonan subsecuencias y se escinden las subsecuencias apropiadas mediante el uso de enzimas de restricción adecuadas. Después los fragmentos se ligan, en otra modalidad, para producir la secuencia de ADN deseada. En otra modalidad, el ADN que codifica la proteína de fusión se produce mediante el uso de métodos de amplificación del ADN, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En primer lugar, los segmentos del ADN nativo a cada lado del nuevo extremo se amplifican separadamente. El extremo 5' de la secuencia amplificada codifica el enlazador del péptido, mientras que el extremo 3' de la otra secuencia amplificada también codifica al enlazador del péptido. Dado que el extremo 5' del primer fragmento es complementario con el extremo 3' del segundo fragmento, los dos fragmentos (después de una purificación parcial, por ejemplo en agarosa LMP) pueden usarse como un molde con superposición en una tercera reacción de PCR. La secuencia amplificada contendrá codones, el segmento en el lado carboxilo del sitio de abertura (que ahora forma la secuencia del amino), el enlazador, y la secuencia en el lado amino del sitio de abertura (que ahora forma la secuencia del carboxilo). El inserto se liga después a un plásmido.

En otra modalidad, un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención se sintetizan mediante el uso de técnicas estándar de síntesis química de péptidos. En otra modalidad, la molécula quimérica se sintetiza como un solo polipéptido contiguo. En otra modalidad, la proteína LLO no hemolítica o un fragmento de esta; y el antígeno se sintetizan separadamente, después se fusionan por condensación del extremo amino terminal de una molécula con el extremo carboxilo terminal de la otra molécula, lo que forma de esta manera un enlace peptídico. En otra modalidad, la proteína LLO y el antígeno cada uno se condensa con un extremo de una molécula espaciadora peptídica, lo que forma de esta manera una proteína de fusión contigua.

En otra modalidad, los péptidos y proteínas de la presente invención se preparan mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) como se describe por Stewart y otros, en Solid Phase Peptide Synthesis, 2da Edición, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; o como se describe por Bodanszky y Bodanszky (The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, Nueva York). En otra modalidad, un residuo de aa protegido adecuadamente se une a través de su grupo carboxilo a un soporte polimérico derivatizado, insoluble, tal como resina de poliamida o poliestireno reticulado. "Protegido adecuadamente" se refiere a la presencia de grupos protectores tanto en el grupo alfa-amino del aminoácido, como en cualquier grupo funcional de las cadenas laterales. Los grupos protectores de

las cadenas laterales generalmente son estables en los disolventes, los reactivos y las condiciones de reacción usados a través de la síntesis, y pueden eliminarse en condiciones que no afectarán el producto peptídico final. La síntesis por pasos del oligopéptido se lleva a cabo mediante la eliminación del grupo protector en el extremo N del aa inicial, y el acoplamiento a él del extremo carboxilo del próximo aa en la secuencia del péptido deseado. Este aa, además, se protege adecuadamente. El carboxilo del aa entrante puede activarse para reaccionar con el extremo Nterminal del aa unido al soporte mediante la formación de un grupo reactivo tal como la formación de una carbodiimida, un anhídrido de ácido simétrico o un grupo de "éster activo" tal como hidroxibenzotriazol o pentafluorofenil ésteres.

Los ejemplos de métodos de síntesis de péptidos en fase sólida incluyen el método BOC que utiliza tercbutiloxicarbonilo como el grupo protector del amino alfa, y el método FMOC que utiliza 9-fluorenilmetiloxicarbonilo para proteger el amino alfa de los residuos de aa; ambos métodos se conocen bien por los expertos en la técnica.

En otra modalidad, la incorporación de grupos bloqueadores de los extremos N y/o C se logra mediante el uso de protocolos convencionales para los métodos de síntesis de péptidos en fase sólida. Para la incorporación de grupos bloqueadores del extremo C-terminal, por ejemplo, la síntesis del péptido deseado se realiza típicamente mediante el uso de una resina de soporte como fase sólida, que se ha modificado químicamente de manera que la escisión de la resina da como resultado un péptido que tiene el grupo bloqueador deseado en el extremo C-terminal. Para proporcionar péptidos en los que el extremo C-terminal porta un grupo bloqueador amino primario, por ejemplo, la síntesis se realiza mediante el uso de una resina p-metil-benzidrilamina (MBHA) de manera que, cuando se completa la síntesis de péptidos, el tratamiento con ácido fluorhídrico libera el péptido con el grupo amida deseado en el extremo C-terminal. De manera similar, la incorporación de un grupo bloqueador N-metilamina en el extremo C-terminal se logra mediante el uso de una resina de DVB derivatizada a N-metilaminoetilo, que tras el tratamiento con HF libera un péptido que porta un extremo C-terminal N-metilamidado. El bloqueo del extremo C-terminal por esterificación puede lograrse, además, mediante el uso de procedimientos convencionales. Esto implica el uso de una combinación de resina/grupo bloqueador que permita la liberación del péptido de cadena lateral de la resina, para permitir la reacción posterior con el alcohol deseado, para formar la función de éster. El grupo protector FMOC, en combinación con la resina DVB derivatizada con alcohol metoxialcoxibenzílico o un enlazador equivalente, puede usarse para este propósito, donde la escisión del soporte se efectúa por TFA en diclorometano. La esterificación de la función carboxilo activada adecuadamente, por ejemplo con DCC, después puede proceder por adición del alcohol deseado, seguido de desprotección y aislamiento del producto peptídico esterificado.

La incorporación de grupos bloqueadores en el extremo N-terminal puede lograrse mientras el péptido sintetizado todavía está unido a la resina, por ejemplo por tratamiento con un anhídrido y nitrilo adecuados. Para incorporar un grupo bloqueador acetilo en el extremo N-terminal, por ejemplo, el péptido acoplado a la resina puede tratarse con anhídrido acético al 20 % en acetonitrilo. El producto peptídico bloqueado en N después puede escindirse de la resina, desprotegerse y posteriormente aislarse.

En otra modalidad, el análisis de la composición del péptido se realiza para verificar la identidad del péptido producido. En otra modalidad, el análisis de la composición de aa se realiza mediante el uso de espectrometría de masa de alta resolución para determinar el peso molecular del péptido. Alternativamente, o adicionalmente, el contenido de aa del péptido se confirma mediante la hidrólisis del péptido en ácido acuoso, y separación, identificación y cuantificación de los componentes de la mezcla mediante el uso de HPLC, o un analizador de aa. Los secuenciadores de proteínas, que degradan secuencialmente el péptido e identifican los aa en orden, pueden usarse además para determinar definitivamente la secuencia del péptido.

En otra modalidad, antes de su uso, el péptido se purifica para eliminar contaminantes. En otra modalidad, el péptido se purifica de manera que se cumplan los estándares establecidos por las directrices y agencias regulatorias adecuadas. Cualquiera de una serie de procedimientos de purificación convencionales puede usarse para lograr el nivel de pureza necesario, que incluye, por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa mediante el uso de una columna de sílice alquilado tal como C4-,C8-o C18-sílice. Una fase móvil con gradiente de un contenido orgánico creciente se usa generalmente para lograr la purificación, por ejemplo, acetonitrilo en un tampón acuoso, que contiene usualmente una pequeña cantidad de ácido trifluoroacético. La cromatografía de intercambio iónico también puede usarse para separar los péptidos en base a su carga.

La síntesis en fase sólida en la que el aa del extremo C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aa restantes en la secuencia se usa, en otra modalidad, para la síntesis química de los péptidos de esta invención. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield en Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2. Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield, y otros, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), y Stewart y otros, Solid Phase Peptide Synthesis, 2da ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984).

En otra modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se sintetizan mediante el uso de una metodología de ADN recombinante. En otra modalidad, el ADN que codifica la proteína de fusión de la presente invención se prepara mediante cualquier método adecuado, que incluye, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias adecuadas o la síntesis química directa mediante métodos tales como el método de fosfotriéster de

Narang y otros (1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99); el método de fosfodiéster de Brown y otros, (1979, Meth. Enzymol

68: 109-151); el método de dietilfosforamidita de Beaucage y otros (1981, Tetra. Lett., 22: 1859-1862); y el método de soporte sólido de la patente de Estados Unidos núm. 4.458.066.

En otra modalidad, los péptidos de la presente invención incorporan residuos de aa que se modifican sin afectar la actividad. En otra modalidad, los extremos terminales se derivatizan para incluir grupos bloqueadores, es decir sustituyentes químicos adecuados para proteger y/o estabilizar los extremos N y C-terminales de una "degradación no deseada", un término que pretende abarcar cualquier tipo de ruptura enzimática, química o bioquímica del compuesto en sus extremos terminales que probablemente afecte la función del compuesto, es decir una degradación secuencial del compuesto en un extremo terminal de este.

En otra modalidad, los grupos bloqueadores incluyen grupos protectores usados convencionalmente en la técnica de la química de péptidos que no afectarán negativamente las actividades in vivo del péptido. Por ejemplo, los grupos bloqueadores del extremo N-terminal adecuados pueden introducirse por alquilación o acilación del extremo Nterminal. Los ejemplos de grupos bloqueadores del extremo N-terminal adecuados incluyen grupos alquilo C1-C5 ramificados o no ramificados, grupos acilo tales como grupos formilo y acetilo, así como formas sustituidas de estos, tales como el grupo acetamidometilo (Acm). Los análogos de desamino aa también son grupos bloqueadores del extremo N-terminal útiles, y pueden acoplarse al extremo N-terminal del péptido o usarse en lugar del residuo Nterminal. Los grupos bloqueadores del extremo C-terminal adecuados, en donde el grupo carboxilo del extremo Cterminal se incorpora o no, incluyen ésteres, cetonas o amidas. Los grupos alquilo formadores de cetona o éster, particularmente los grupos alquilo inferiores tales como metilo, etilo y propilo, y los grupos amino formadores de amida tales como aminas primarias (--NH2), y grupos mono-y di-alquilamino tales como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino y similares son ejemplos de grupos bloqueadores del extremo C-terminal. Los análogos de aa descarboxilados tales como agmatina también son grupos bloqueadores del extremo C-terminal útiles y pueden acoplarse al residuo del extremo C-terminal del péptido o pueden usarse en lugar de este. En otra modalidad, los grupos amino y carboxilo libres en los extremos terminales se eliminan totalmente del péptido para producir formas desaminadas y descarboxiladas de este sin afectar la actividad del péptido.

En otra modalidad, se incorporan otras modificaciones sin afectar negativamente la actividad. En otra modalidad, tales modificaciones incluyen, pero sin limitarse a, sustitución de uno o más de los aa en la forma L-isomérica natural con aa D-isoméricos. En otra modalidad, el péptido incluye uno o más residuos de D-aminoácidos, o comprende aa que están todos en la forma D. Se contemplan además las formas retroinversas de los péptidos de conformidad con la presente invención, por ejemplo, los péptidos invertidos en los que todos los aminoácidos se sustituyen con las formas de D-aminoácidos.

En otra modalidad, las sales de adición de ácidos de los péptidos de la presente invención se utilizan como equivalentes funcionales de estos. En otra modalidad, un péptido de conformidad con la presente invención tratado con un ácido inorgánico tal como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, y similares, o un ácido orgánico tal como acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maleico, fumárico, tatárico, cítrico, benzoico, cinámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, salicílico y similares, para proporcionar una sal del péptido soluble en agua, es adecuado para usar en la invención.

En otra modalidad, las modificaciones (que no modifican normalmente la secuencia primaria) incluyen la derivatización química de los polipéptidos in vivo, o in vitro, por ejemplo, acetilación, o carboxilación. Se incluyen, además, modificaciones de glicosilación, por ejemplo, las que se producen por modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; por ejemplo, por exposición del polipéptido a enzimas que afectan la glicosilación, por ejemplo, enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamíferos. Se abarcan además secuencias que tienen residuos de aa fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina.

En otra modalidad, los polipéptidos se modifican mediante el uso de técnicas biológicas moleculares comunes para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agentes terapéuticos. Los análogos de tales polipéptidos incluyen los que contienen residuos diferentes a los L-aminoácidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos de origen no natural. Los péptidos de la invención no se limitan a los productos de cualquiera de los procesos ilustrativos específicos mencionados en la presente descripción.

En la presente descripción se describe además un kit que comprende una proteína LLO no hemolítica o un fragmento de esta, como se describe en la presente descripción, fusionada a un antígeno, un aplicador, y material de instrucción que describe el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Aunque los kits modelos se describen más abajo, los contenidos de otros kits útiles serán evidentes para el experto en la técnica a la luz de la presente descripción.

En otra modalidad, la cepa de Listeria de la presente invención es una cepa de Listeria seeligeri recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria grayi recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria ivanovii recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria

murrayi recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria welshimeri recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de cualquier otra especie de Listeria conocida en la técnica.

En otra modalidad, una cepa de Listeria recombinante de la presente invención se ha sometido a pases a través de un huésped animal. En otra modalidad, el proceso de pases maximiza la eficacia de la cepa como un vector de vacuna. En otra modalidad, el proceso de pases estabiliza la inmunogenicidad de la cepa de Listeria. En otra modalidad, el proceso de pases estabiliza la virulencia de la cepa de Listeria. En otra modalidad, el proceso de pases aumenta la inmunogenicidad de la cepa de Listeria. En otra modalidad, el proceso de pases aumenta la virulencia de la cepa de Listeria. En otra modalidad, el proceso de pases elimina subcepas inestables de la cepa de Listeria. En otra modalidad, el proceso de pases reduce la prevalencia de subcepas inestables de la cepa de Listeria. En otra modalidad, la cepa de Listeria contiene una inserción genómica del gen que codifica un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención. En otra modalidad, la cepa de Listeria porta un plásmido que comprende el gen que codifica un péptido, proteína o polipéptido recombinantes de la presente invención. Los métodos para los pases de una cepa de Listeria recombinante a través de un huésped animal se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2006/0233835. En otra modalidad, el proceso de pases se realiza mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

En otra modalidad, la cepa de Listeria recombinante utilizada en la presente invención se ha almacenado en un banco de células congeladas. En otra modalidad, la cepa de Listeria recombinante se ha almacenado en un banco de células liofilizadas. Los métodos para producir, cultivar, y preservar vectores de vacunas de listeria se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional PCT núm. WO 2007/061848.

En una modalidad, las composiciones y usos de la presente invención como se describe en la presente descripción, comprenden elementos o etapas particulares, como se describen en la presente descripción, mientras que en otra modalidad, consisten esencialmente en dichos elementos o etapas, mientras que en otra modalidad, consisten en dichos elementos o etapas. En algunas modalidades, el término "comprenden" se refiere a la inclusión del agente activo indicado, así como la inclusión de otros agentes activos, y vehículos, excipientes, emolientes, estabilizadores farmacéuticamente aceptables, etcétera, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a una composición, cuyo único ingrediente activo es el ingrediente activo indicado, sin embargo, pueden incluirse otros compuestos que son para estabilizar, preservar, etcétera, la formulación, pero no están implicados directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" puede referirse a componentes que facilitan la liberación del ingrediente activo. En algunas modalidades, el término "que consiste" se refiere a una composición, que contiene el ingrediente activo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.

En una modalidad, "tratar" se refiere a un tratamiento terapéutico o medidas preventivas o profilácticas, en donde el objetivo es prevenir o aliviar la afección o trastorno patológicos específicos como se describió anteriormente en la presente descripción. Por lo tanto, en una modalidad, tratar puede incluir afectar directamente o curar, suprimir, inhibir, prevenir, reducir la gravedad de, retrasar la aparición de, reducir los síntomas asociados con la enfermedad, el trastorno o la afección, o una combinación de estos. Por lo tanto, en una modalidad, “tratar” se refiere, entre otros, a retrasar la progresión, acelerar la remisión, inducir la remisión, aumentar la remisión, acelerar la recuperación, aumentar la eficacia de, o disminuir la resistencia a agentes terapéuticos alternativos, o una combinación de estos. En una modalidad, “prevenir” se refiere, entre otros, a retrasar la aparición de síntomas, prevenir la recaída de una enfermedad, disminuir la cantidad o frecuencia de los episodios de recaída, aumentar la latencia entre los episodios sintomáticos, o una combinación de estos. En una modalidad, “suprimir” o “inhibir”, se refiere, entre otros, a reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir la cantidad de síntomas, reducir la incidencia de los síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la latencia de los síntomas, mejorar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente, o una combinación de estos.

En una modalidad, "funcional" dentro del significado de la invención, se usa en la presente descripción para referirse a la capacidad innata de una proteína, péptido, ácido nucleico, fragmento o una variante de estos para mostrar una actividad o función biológicas. En una modalidad, tal función biológica es su propiedad de unión a una pareja de interacción, por ejemplo, un receptor asociado a la membrana, y en otra modalidad, su propiedad de trimerización. En el caso de los fragmentos funcionales y las variantes funcionales de la invención, estas funciones biológicas pueden de hecho cambiar, por ejemplo, con respecto a su especificidad o selectividad, pero con retención de la función biológica básica.

En una modalidad, "genéticamente fusionado" como se proporciona en la presente descripción pretende dar como resultado un ADN quimérico que contiene, cada uno en su propia modalidad distinta, un promotor y una secuencia codificante que no se asocian en la naturaleza.

En la medida en que los siguientes Ejemplos no se relacionan con una proteína LLO mutada en la que los aminoácidos 484-492 del CBD se han sustituido con una proteína antigénica diferente de LLO, como se reivindica, estos son Ejemplos comparativos.

Sección de detalles experimentales

Materiales y métodos experimentales

Líneas celulares

El tumor TC-1 singénico de C57BL/6 se inmortalizó con E6 y E7 de HPV-16 y se transformó con el oncogén c-Haras. TC-1 expresa bajos niveles de E6 y E7 y es altamente tumorigénica. TC-1 se cultivó en RPMI 1640, 10 % de FCS, L-glutamina a 2 mM, penicilina a 100 U/ml, estreptomicina a 100 µg/ml, aminoácidos no esenciales a 100 µM, piruvato de sodio a 1 mM, 2-ME a 50 micromolar (mcM), G418 a 400 microgramos (mcg)/ml, y 10 % de medio de cultivo 109 de la Colección Nacional de Tipos de Cultivos a 37 ° con 10 % de CO2. C3 es una célula embrionaria de ratón a partir de ratones C57BL/6, inmortalizada con el genoma completo de HPV 16 y transformada con pEJ-ras. EL-4/E7 es el timoma EL-4 transducido de manera retroviral con E7.

Cepas y propagación de L. monocytogenes

Las cepas de Listeria usadas fueron Lm-LLO-E7 (gen de fusión hly-E7 en un sistema de expresión episomal; Figura 1), Lm-E7 (casete del gen E7 de una sola copia integrado en el genoma de Listeria), Lm-LLO-NP (“DP-L2028”; gen de fusión hly-NP en un sistema de expresión episomal), y Lm-Gag (“ZY-18”; casete del gen Gag de HIV-1 de una sola copia integrado en el cromosoma). E7 se amplificó por PCR mediante el uso de los iniciadores 5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3' (sec. con núm. de ident.: 38; el sitio de XhoI está subrayado) y 5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (sec. con núm. de ident.: 39; el sitio de SpeI está subrayado) y se ligó a pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA). E7 se escindió de pCR2.1 por digestión con XhoI/ SpeI y se ligó a pGG-55. El gen de fusión hly-E7 y el factor de transcripción pluripotencial prfA se clonaron en pAM401, un plásmido lanzadera multicopias (Wirth R y otros, J Bacteriol, 165: 831, 1986), lo que generó pGG-55. El promotor de hly conduce la expresión de los primeros 441 aa del producto génico hly, (que carece del C-terminal hemolítico, referido más abajo como “ΔLLO”, y que tiene la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 17), que se une mediante el sitio de XhoI al gen E7, lo que produce un gen de fusión hly-E7 que se transcribe y se secreta como LLO-E7. La transformación de una cepa de Listeria prfA negativa, XFL-7 (proporcionada por el Dr. Hao Shen, Universidad de Pensilvania), con pGG-55 se seleccionó para la retención del plásmido in vivo (Figuras 1A-B). El promotor de hly y el fragmento génico se generaron mediante el uso de los iniciadores 5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (sec. con núm. de ident.: 40; el sitio de NheI está subrayado) y 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3' (sec. con núm. de ident.: 41; el sitio de XhoI está subrayado). El gen prfA se amplificó por PCR mediante el uso de los iniciadores 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTT T-3' (sec. con núm. de ident.: 42; el sitio de XbaI está subrayado) y 5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (sec. con núm. de ident.: 43; el sitio de SalI está subrayado). Lm-E7 se generó mediante la introducción de un casete de expresión que contiene el promotor y la secuencia señal de hly que dirige la expresión y secreción de E7 en el dominio orfZ del genoma de LM. E7 se amplificó por PCR mediante el uso de los iniciadores 5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3' (sec. con núm. de ident.: 44; el sitio de BamHI está subrayado) y 5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3' (sec. con núm. de ident.: 45; el sitio de XbaI está subrayado). Después E7 se ligó al vector lanzadera pZY-21. La cepa de LM 10403S se transformó con el plásmido resultante, pZY-21-E7, que incluye un casete de expresión insertado en el medio de una secuencia de 1.6 kb que corresponde al dominio orfX, Y, Z del genoma de LM. La dominio de homología permite la inserción del casete del gen E7 en el dominio orfZ por recombinación homóloga. Los clones se examinaron para determinar la integración del casete del gen E7 en el dominio orfZ. Las bacterias se cultivaron en medio de infusión de cerebro y corazón con cloranfenicol (20 µg/ml) (Lm-LLO-E7 y Lm-LLO-NP) o sin él (Lm-E7 y ZY-18). Las bacterias se congelaron en alícuotas a -80 °C. La expresión se verificó por transferencia tipo Western (Figura 2).

Transferencia tipo Western

Las cepas de Listeria se cultivaron en medio de Luria-Bertoni a 37 °C y se cosecharon a la misma densidad óptica medida a 600 nm. Los sobrenadantes se precipitaron con TCA y se resuspendieron en tampón de muestra 1x suplementado con NaOH 0,1 N. Cantidades idénticas de cada sedimento celular o cada sobrenadante precipitado con TCA se cargaron en geles de SDS-PAGE con 4-20 % de Tris-glicina (NOVEX, San Diego, CA). Los geles se transfirieron a difluoruro de polivinilideno y se analizaron con una sonda que consistió en un anticuerpo monoclonal (AcM) anti-E7 (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), después se incubaron con Ac secundario anti-ratón conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido), se revelaron con reactivos de detección ECL de Amersham, y se expusieron a Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech).

Medición del crecimiento tumoral

Los tumores se midieron cada dos días con calibradores que abarcaron los diámetros superficiales mínimo y máximo. La media de estas dos mediciones se representó como el diámetro tumoral promedio en milímetros contra varios puntos de tiempo. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 20 mm. Las mediciones de los tumores para cada punto de tiempo se muestran sólo para los ratones sobrevivientes.

Efectos de recombinantes de Listeria sobre el crecimiento de tumores establecidos

Los ratones C57BL/6 de seis a 8 semanas de edad (Charles River) recibieron 2 x 105 células TC-1 por vía s.c. en el flanco izquierdo. Una semana después de la inoculación del tumor, los tumores habían alcanzado un tamaño palpable de 4-5 mm de diámetro. Grupos de ocho ratones se trataron después con 0.1 LD50 i.p. Lm-LLO-E7 (107 UFC), Lm-E7 (106 UFC), Lm-LLO-NP (107 UFC), o Lm-Gag (5 x 105 UFC) en los días 7 y 14.

Ensayo de liberación de 51Cr

Los ratones C57BL/6, de 6-8 semanas de edad, se inmunizaron por vía i.p. con 0.1 LD50 de Lm-LLO-E7, Lm-E7, LmLLO-NP, o Lm-Gag. Diez días después de la inmunización, se extrajeron los bazos. Los esplenocitos se establecieron en cultivo con células TC-1 irradiadas (100:1, esplenocitos:TC-1) como células alimentadoras; se estimularon in vitro durante 5 días, después se usaron en un ensayo de liberación de 51Cr estándar, con el uso de los siguientes objetivos: EL-4, EL-4/E7, o EL-4 pulsado con péptido H-2b E7 (RAHYNIVTF) (sec. con núm. de ident.: 19). Las relaciones de las células E:T, obtenidas por triplicado, fueron 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, y 2,5:1. Después de una incubación de 4 h a 37 °C, las células se sedimentaron, y se retiraron 50 µl del sobrenadante de cada pocillo. Las muestras se analizaron con un contador de centelleo Wallac 1450 (Gaithersburg, MD). El porcentaje de lisis específica se determinó como [(conteos experimentales por minuto -conteos espontáneos por minuto)/(conteos totales por minuto -conteos espontáneos por minuto)] x 100.

Proliferación específica de TC-1

Los ratones C57BL/6 se inmunizaron con 0.1 LD50 y se reforzaron mediante inyección i.p. 20 días más tarde con 1 LD50 de Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, o Lm-Gag. Seis días después del refuerzo, se cosecharon los bazos de los ratones inmunizados y vírgenes. Los esplenocitos se establecieron en cultivo a 5 x 105/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano con 2,5 x 104, 1,25 x 104, 6 x 103, o 3 x 103 células TC-1 irradiadas/pocillo como una fuente de Ag E7, o sin células TC-1 o con 10 µg/ml de Con A. Las células se sometieron a un pulso 45 h más tarde con 0,5 µCi [3H]timidina/pocillo. Las placas se cosecharon 18 h más tarde mediante el uso de un recolector Tomtec 96 (Orange, CT), y la proliferación se evaluó con un contador de centelleo Wallac 1450. El cambio en los conteos por minuto se calculó como conteos experimentales por minuto -conteos sin Ag por minuto.

Análisis de citometría de flujo

Los ratones C57BL/6 se inmunizaron por vía intravenosa (i.v.) con 0,1 LD50 de Lm-LLO-E7 o Lm-E7 y se reforzaron 30 días más tarde. La citometría de flujo de tres colores para CD8 (53-6.7, conjugado con PE), ligando de CD62 (CD62L; MEL-14, conjugado con APC), y tetrámero H-2Db E7 se llevó a cabo mediante el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur® con el programa informático CellQuest® (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los esplenocitos cosechados 5 días después del refuerzo, se tiñeron a temperatura ambiente (ta) con los tetrámeros H2Db cargados con el péptido E7 (RAHYNIVTF; sec. con núm. de ident.: 19) o un péptido control (Gag de HIV). Los tetrámeros se usaron a una dilución de 1/200 y se proporcionaron por el Dr. Larry R. Pease (Mayo Clinic, Rochester, MN) y por el Centro de Tetrámeros del Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e Infecciosas y el Programa de Reactivos de Referencia e Investigación en SIDA de los Institutos Nacionales de Salud. Se analizaron las células tetrámero+, CD8+, CD62Lbajo.

Agotamiento de componentes inmunológicos específicos

Las células CD8+, las células CD4+ y el IFN se agotaron en los ratones portadores de TC-1 al inyectar a los ratones con 0,5 mg por ratón de AcM: 2.43, GK1.5, o xmg1.2, respectivamente, en los días 6, 7, 8, 10, 12, y 14 después del reto tumoral. Las poblaciones celulares CD4+ y CD8+ se redujeron en un 99 % (análisis de citometría de flujo). Las células CD25+ se agotaron por la inyección i.p. de 0,5 mg/ratón de AcM anti-CD25 (PC61, proporcionado por Andrew

J. Caton) en los días 4 y 6. El TGF se agotó por la inyección i.p. del AcM anti-TGF (2G7, proporcionado por H. 1. Levitsky), en ratones portadores de TC-1 en los días 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los ratones se trataron con 107 Lm-LLO-E7 o Lm-E7 en el día 7 después del reto tumoral.

Transferencia adoptiva

Los ratones C57BL/6 donantes se inmunizaron y se reforzaron 7 días más tarde con 0,1 LD50 de Lm-E7 o Lm-Gag. Los esplenocitos donantes se recolectaron y se pasaron sobre columnas de lana y nailon para enriquecerlos de células T. Las células T CD8+ se agotaron in vitro por la incubación con 0,1 µg de AcM 2.43 anti-CD8 durante 30 min a temperatura ambiente. Las células marcadas se trataron después con complemento de conejo. Los esplenocitos donantes eran >60 % de células T CD4+ (análisis de citometría de flujo). Los ratones receptores portadores de

tumores TC-1 se inmunizaron con 0,1 LD50 7 días después del reto tumoral. Los esplenocitos donantes enriquecidos con CD4+ (107) se transfirieron 9 días después del reto tumoral a los ratones receptores mediante inyección por vía

i.v.

5 Experimento de B16F0-Ova

Se inocularon 24 ratones C57BL/6 con 5 x 105 células B16F0-Ova. En los días 3, 10 y 17, los grupos de 8 ratones se inmunizaron con 0,1 LD50 de Lm-OVA (106 ufc), Lm-LLO-OVA (108 ufc) y ocho animales se dejaron sin tratamiento.

Análisis estadístico

Para la comparación de los diámetros de los tumores, se determinó la media y DE del tamaño tumoral para cada grupo, y la significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student. p ≤ 0.05 se consideró significativo.

15 Ejemplo 1: Mutagénesis dirigida a un sitio del dominio de LLO de unión al colesterol

La mutagénesis dirigida a un sitio se realizó en LLO para introducir mutaciones puntuales de inactivación en el CBD, mediante la siguiente estrategia. La proteína resultante se denomina “mutLLO”:

Subclonación de LLO en pET29b

La secuencia de aminoácidos de LLO de tipo silvestre es:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKK

25 HADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNN ADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVV KNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAF KAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQAL GVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIK NSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNEL AVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWS ENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISI WGTTLYPKYSNKVDNPIE (sec. con núm. de ident.: 46). El péptido señal y el dominio de unión al colesterol (CBD) están subrayados, con 3 residuos críticos en el CBD (C484, W491, y W492) en letras negritas y

35 cursivas.

Una etiqueta His6x (HHHHHH) se añadió a la región C-terminal de LLO. La secuencia de aminoácidos de LLO marcada con His es:

Un gen que codifica una proteína LLO marcada con His se digirió con NdeI/BamHI, y el fragmento NdeI/BamHI se subclonó en el vector de expresión pET29b, entre los sitios NdeI y BamHI. La secuencia del gen que codifica la proteína LLO es:

catatgaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccgtggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgcca atcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgc agtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaata atgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaacc agatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgc

cactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttattcaaatgtaagtgcaaaa attgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaa acttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaag accttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagt gtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaa tctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttca aatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttat acaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaa aattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatcctgaaggtaacgaaattgttca acataaaaactggagcgaaaacaataaaagcaagctagctcatttcacatcgtccatctatttgcctggtaacgcgagaaatattaatgttt acgctaaagaatgcactggtttagcttgggaatggtggagaacggtaattgatgaccggaacttaccacttgtgaaaaatagaaatatct catctggggcaccacgctttatccgaaatatagtaataaagtagataatccaatcgaacaccaccaccaccaccactaataaggatcc(sec. con núm. de ident.: 48). Las secuencias subrayadas son, a partir del comienzo de la secuencia, el sitio de NdeI, el sitio de NheI, la región que codifica al CBG, la etiqueta de His 6x, y el sitio de BamHI. Los residuos del CBD que van a mutar en la siguiente etapa están en letras negritas y cursivas.

Corte y empalme por extensión del solapamiento (SOE) PCR

Etapa 1: Las reacciones de PCR núm. 1 y núm. 2 se realizaron en el molde pET29b-LLO. La reacción de PCR núm. 1, mediante el uso de los iniciadores núm. 1 y núm. 2, amplificó el fragmento entre el sitio de NheI y el CBD, ambos inclusive, lo que introdujo una mutación en el CBD. La reacción de PCR núm. 2, mediante el uso de los iniciadores núm. 3 y núm. 4, amplificó el fragmento entre el CBD y el sitio de BamHI, ambos inclusive, lo que introdujo la misma mutación en el CBD (Figura 1A).

Ciclo de la reacción de PCR núm. 1: A) 94 °C 2 min 30 s, B) 94 °C 30 s, C) 55 °C 30 s, D) 72 °C 1 min, Repetir las etapas B a D 29 veces (30 ciclos en total), E) 72 °C 10 min.

Ciclo de la reacción de PCR núm. 2: A) 94 °C 2 min 30 s, B) 94 °C 30 s, C) 60 °C 30 s, D) 72 °C 1 min, Repetir las etapas B a D 29 veces (30 ciclos en total), E) 72 °C 10 min.

Etapa 2: Los productos de las reacciones de PCR núm. 1 y núm. 2 se mezclaron, se dejaron hibridar (en la región que codifica el CBD mutado), y la PCR se realizó con los iniciadores núm. 1 y núm. 4 durante 25 ciclos más (Figura 1B). Ciclo de la reacción de PCR: A) 94 °C 2 min 30 s, B) 94 °C 30 s, C) 72 °C 1 min, Repetir las etapas B a C 9 veces (10 ciclos en total), Añadir los iniciadores núm. 1 y núm. 4, D) 94 °C 30 s, E) 55 °C 30 s, F) 72 °C 1 min, Repetir las etapas D a F 24 veces (25 ciclos en total), G) 72 °C 10 min.

Secuencias de los iniciadores:

Iniciador 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (sec. con núm. de ident.: 49; la secuencia de NheI está subrayada).

Iniciador 2: TCTTGCAGCTTCCCAAGCTAAACCAGTCGCTTCTTTAGCGTAAACATTAATATT (sec. con núm. de ident.: 50; la secuencia que codifica al CBD está subrayada; los codones mutados están en letras negritas y cursivas).

Iniciador 3: GAAGCGACTGGTTTAGCTTGGGAAGCTGCAAGAACGGTAATTGATGACCGGAAC (sec. con núm. de ident.: 51; la secuencia que codifica al CBD está subrayada; los codones mutados están en letras negritas y cursivas).

Iniciador 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (sec. con núm. de ident.: 52; la secuencia de BamHI está subrayada).

La secuencia del CBD de tipo silvestre es ECTGLAWWWR (sec. con núm. de ident.: 18).

La secuencia del CBD mutado es EATGLAWEAAR (sec. con núm. de ident.: 53).

La secuencia del fragmento NheI-BamHI mutado es:

(Sec. con núm. de ident.: 54).

Ejemplo 2: Sustitución de una parte del CBD de LLO con un epítopo de CTL

La mutagénesis dirigida a un sitio se realizó en LLO para sustituir 9 aminoácidos (aa) del CBD con un epítopo de

5 CTL del antígeno NY-ESO-1. La secuencia del CBD (sec. con núm. de ident.: 18) se sustituyó con la secuencia ESLLMWITQCR (sec. con núm. de ident.: 55; los residuos mutados están subrayados), que contiene el epítopo restringido a HLA-A2 157-165 de NY-ESO-1, denominado “ctLLO.”

La estrategia de subclonación usada fue similar a la del Ejemplo anterior. Los iniciadores usados fueron los 10 siguientes:

Iniciador 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (sec. con núm. de ident.: 56; la secuencia de NheI está subrayada).

15 Iniciador 2: TCTGCACTGGGTGATCCACATCAGCAGGCTTTCTTTAGCGTAAACATTAATATT (sec. con núm. de ident.: 57; la secuencia que codifica al CBD está subrayada; los codones mutados (NY-ESO-1) están en letras negritas y cursivas).

Iniciador 3: GAAAGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCAGAACGGTAATTGATGACCGGAAC (sec. con

20 núm. de ident.: 58; la secuencia que codifica al CBD está subrayada; los codones mutados (NY-ESO-1) están en letras negritas y cursivas).

Iniciador 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (sec. con núm. de ident.: 59; la secuencia de BamHI está subrayada). 25 La secuencia del fragmento NheI/BamHI resultante es la siguiente:

Ejemplo 3: mutLLO y ctLLO pueden expresarse y purificarse en sistemas de expresión de E. coli

Para demostrar que mutLLO y ctLLO pueden expresarse en E. coli, se transformaron células de E. coli con pET29b

40 y se indujeron con IPTG 0,5 mM, después los lisados celulares se recolectaron 4 horas más tarde y las proteínas totales se separaron en un gel de SDS-PAGE y se sometieron a tinción de Coomassie (Figura 2A) y transferencia de Western anti-LLO, mediante el uso del anticuerpo monoclonal B3-19 (Figura 2B). Por lo tanto, las proteínas LLO que contienen mutaciones puntuales o sustituciones en el CBD pueden expresarse y purificarse en sistemas de expresión de E. coli.

45 Ejemplo 4: mutLLO y ctLLO muestran una reducción significativa en la actividad hemolítica

Materiales y métodos experimentales

50 Ensayo de hemólisis

1. Las LLO mutada y de tipo silvestre se diluyeron hasta las diluciones indicadas en las Figuras 3A-B en 900 µl de PBS 1x-cisteína (PBS ajustado a pH 5,5 con clorhidrato de cisteína 0,5 M o se ajustó a 7,4). 2. La LLO se activó mediante la incubación a 37 °C durante 30 minutos. 3. Los glóbulos rojos de oveja (200 µl/muestra) se lavaron dos

55 veces en PBS-cisteína y de 3 a 5 veces en PBS 1x hasta que el sobrenadante estuviese relativamente transparente.

4. El sedimento final de los glóbulos rojos de oveja se resuspendió en PBS-cisteína y se añadieron 100 µl de la suspensión celular a los 900 µl de la solución de LLO (solución final al 10 %). 5. Se añadieron 50 µl de glóbulos rojos de oveja a 950 µl de agua + Tween 20 al 10 % (Control positivo para la lisis, contendrá el 50 % de la cantidad de células lisadas con respecto a la cantidad total de células añadidas a los otros tubos; "control al 50 %"). 6. Todos los

60 tubos se mezclaron cuidadosamente y se incubaron a 37 °C durante 45 minutos. 7. Los glóbulos rojos se centrifugaron en una microcentrífuga durante 10 minutos a 1500 rpm. 8. Una alícuota de 200 µl del sobrenadante se transfirió a una placa de ELISA de 96 pocillos y se leyó a 570 nm para medir la concentración de hemoglobina liberada después de la hemólisis, y las muestras se titularon de acuerdo con el control al 50 %.

65 Resultados

La actividad hemolítica de mutLLO y ctLLO se determinó mediante el uso de un ensayo con glóbulos rojos de oveja. mutLLO mostró una reducción significativa (entre 100 veces y 1000 veces) del título de hemólisis a pH 5,5 (Figura 3A), y una actividad hemolítica indetectable a pH 7,4 (Figura 3B). ctLLO mostró una actividad hemolítica indetectable a cualquier pH (Figuras 3A-B).

Por lo tanto, la mutación puntual (mutLLO) o por sustitución (ctLLO) de los residuos de CBD de LLO, que incluyen C484, W491, y W492, anula o reduce grandemente la actividad hemolítica. Además, la sustitución del CBD con un péptido antigénico heterólogo es un medio eficaz para crear un vehículo inmunogénico de un epítopo heterólogo, con una actividad hemolítica reducida significativamente con respecto a la LLO de tipo silvestre.

Ejemplo 5: Construcción y análisis de vacunas de mutLLO-38c13 BCR y ctLLO-38c13 BCR

Las vacunas de mutLLO-38C13 BCR y ctLLO-38C13 BCR se construyen a partir de ADN que codifica mutLLO, ctLLO, y 38C13 como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2006-0269561. Las vacunas se analizan como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2006-0269561, y se encuentra que muestran actividad protectora anti-linfoma.

Ejemplo 6: Construcción y análisis de vacunas de mutLLO-E7 y ctLLO-E7

Las vacunas de mutLLO-E7 y ctLLO-E7 se construyen a partir de ADN que codifica mutLLO, ctLLO, y E7 como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2006-0269561. Las vacunas se analizan como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2006-0269561, y muestran actividad protectora antitumoral.

Ejemplo 7: El efecto de la inmunización con LLO detox-E7 en comparación con los controles sobre el crecimiento de TC-1

Preparación de las vacunas.

E7 recombinante y LLO detox que comprende mutaciones o deleciones en el CBD se purificaron en una columna de níquel y el LPS se eliminó en una columna Norgen Proteospin de conformidad con las instrucciones del fabricante. E7 se conjugó químicamente a la LLO mediante la mezcla de 2 mg de LLO detox con 500 µg de E7 y adición de paraformaldehído a una concentración final de 1 %. La mezcla se agitó en un rotador durante 40 minutos a temperatura ambiente y después se dializó a 4°C durante la noche en PBS.

Regresión del tumor

Se establecieron 1 x 105 células TC-1 en el flanco de cada ratón, y en los días 3 y 10, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 µl de PBS que contenía 50 µg de E7, 200 µg de LLO detox mezclados con 50 µg de E7, 250 µg del conjugado DetoxLLO-E7 o PBS solo (virgen).

El efecto de la inmunización con LLO detox conjugada químicamente a E7 y LLO detox + E7 sobre el crecimiento de TC-1

Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 µl de PBS que contenía: E7 (50 ug), DetoxLLO (200 µg) mezclada con E7 (50 µg), conjugado DetoxLLO-E7 (250 µg), o PBS solo (virgen).

Los ratones administrados con LLO-E7 conjugados demostraron un aumento atenuado del tamaño tumoral en comparación con los controles vírgenes. Los ratones administrados con LLO+E7 mezclados también demostraron un aumento atenuado del tamaño tumoral (Figura 4). Mientras todos los animales vírgenes tenían tumores hacia el día 7, 2/8 ratones estaban libres de tumor después de la administración del conjugado DetoxLLO-E7 y 4/8 ratones estaban libres de tumor después de la administración de DetoxLLO mezclada con E7 en el día 49 (Figura 4, Tabla 1).

El efecto de la inmunización con E7 o la proteína LLO sobre el crecimiento de TC-1

Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 µl de PBS que contenía: E7 (50 µg), LLO detox (250 µg) o PBS solo (virgen).

La regresión del tumor no se observó en los ratones que se inmunizaron con LLO detox o E7 de manera separada donde en cada caso respectivo, 0/8 y 1/8 ratones estaban libres de tumor en el día 45 en los grupos LLO y E7, respectivamente. La inmunización con LLO detox, y en mayor medida con E7 retrasaron el tiempo de aparición del tumor (Figura 5).

El efecto de la inmunización con DTLLO fusionada genéticamente a la secuencia completa de E7 y LLO detoxificada mediante la sustitución de la región de unión al colesterol con el epítopo de E7, sobre el crecimiento de TC-1

Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 µl de PBS que contenía: DTLLO-E7 recombinante completa (secuencia completa de E7 fusionada genéticamente a DTLLO; 250 µg), quimera DTLLO-E7 (LLO detoxificada por sustitución de CBD con el epítopo de E7; 250 µg) o PBS solo (virgen).

5 DTLLO-E7 completa y la quimera DTLLO-E7 retrasaron la aparición de los tumores en comparación con los controles vírgenes (Figura 6). La quimera DTLLO-E7 demostró una mayor inhibición del crecimiento tumoral (8/8 libres de tumor en el día 49 después de la inoculación del tumor) en comparación con DTLLO-E7 completa (5/8 libres de tumor en el día 49 después de la inoculación del tumor; Figura 6 y Tabla 1). Se obtuvieron resultados

10 comparables en experimentos repetidos (Figuras 7-9). Se establecieron 2x10^5 células tumorales TC-1 por vía s.c. en 8 ratones por grupo de vacuna. Los ratones se inmunizaron por vía s.c. con 50 µg de E7, 200 µg de DTLLO, 250 µg de DTLLOE7, o 50 µg de E7 más 200 µg de DTLLO en los días 3 y 10 (Figura 9). Los ratones administrados con DTLLO-E7 conjugados demostraron un aumento atenuado del tamaño tumoral en comparación con los controles vírgenes. Los ratones administrados con DTLLO sola o DTLLO+E7 mezclados también demostraron un aumento

15 atenuado en el tamaño tumoral (Figura 9). Mientras todos los animales vírgenes tenían tumores hacia el día 75, 5/8 ratones tratados con DTLLO+E7 y 7/8 ratones tratados con DTLLOE7 estaban libres de tumor en el día 75 (Figura 9).

Ejemplo 8: Regresión de tumores TC-1 después de la inmunización con ActA, E7, o ActA + E7 mezclados o ActA-E7 20 fusionados genéticamente

Preparación de las vacunas.

E7 recombinante y ActA recombinante o la proteína de fusión ActA-E7 se purificaron en una columna de níquel y el 25 LPS se eliminó en una columna Norgen Proteospin de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Regresión del tumor

Se establecieron 1 x 105 células TC-1 en el flanco de cada ratón, y en los días 6 y 13, los ratones se inmunizaron por

30 vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 µl de PBS que contenía E7 (50 µg), ActA (200 µg) mezclada con E7 (50 µg), ActA-E7 fusionados genéticamente (250 µg), o PBS sólo (virgen).

Resultados

35 Los ratones inmunizados con ActA sola, E7 solo, ActA-E7, o ActA+E7 demostraron un aumento de la latencia hasta la aparición de los tumores en comparación con los controles (Figuras 10-12). Los ratones inmunizados con ActA-E7 (fusionados genéticamente) demostraron una fuerte regresión tumoral, con 7/8 ratones libres de tumor en el día 55 después de la inmunización (Figura 10, Tabla 1). Los ratones inmunizados con ActA+E7 demostraron una regresión tumoral superior en comparación con E7 y los controles vírgenes, con 7/8 ratones libres de tumor en el día 55

40 después de la inoculación del tumor (Figura 11, Tabla 1). Los ratones inmunizados con ActA sola demostraron una regresión tumoral superior en comparación con los ratones inmunizados con E7 o los controles inyectados con PBS (3/8 ratones libres de tumor después de la inmunización en comparación con ninguno de los ratones en los grupos de E7 o virgen; Figura 12, Tabla 1).

Tabla 1. Resumen de las tasas de ratones libres de tumor: Ejemplos 7-8

Vacuna: Figura Núm. de ratones libres de tumor Comentarios

LLO-E7: 6 4/8 Conjugados químicamente

LLO + E7: 6 2/8 Mezclados

E7: 7 1/8

LLO: 7 0/8

LLO-E7: 8 5/8 Fusionados genéticamente

Quimera LLO-E7: 8 7/8 Sustituido genéticamente

E7: 9 0/8

LLO: 9 0/8

LLO-E7: 9 6/8 Fusionados genéticamente

LLO + E7: 9 2/8 Mezclados

Quimera LLO-E7: 10 8/8 Sustituido genéticamente

E7: 11 0/8 Día 33

LLO: 11 0/8 Día 33

LLO-E7: 11 8/8 Día 33

LLO + E7: 11 6/8 Día 33

Quimera LLO-E7: 11 8/8 Día 33

ActA-E7: n/a 7/8 Sistema de expresión anterior

ActA + E7: n/a 4/8

E7: n/a 0/8

ActA: n/a 3/8

Ejemplo 9: DetoxLLO induce la expresión de ARNm de citocinas y la secreción de citocinas por los macrófagos de la médula ósea (BM)

Las BMDC 8e5 del día 7 se descongelaron durante la noche a 37 °C en medio RF10. A continuación, las BMDC se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de medio RF10 fresco a 37 °C durante 1 hr. Las BMDC se trataron con 40 mcg/ml de LLOE7 y los equivalentes molares de E7 y LLO (o con PBS como control negativo o 1 mcg/ml de LPS

45 como control positivo). Después de 2 y 24 hrs, las células se recolectaron por centrifugación y los medios se guardaron para un ELISA y se analizó la secreción de citocinas. Se extrajo el ARN de las células y se convirtió a ADNc. El ADNc se sometió después a análisis de qPCR con iniciadores para diferentes citocinas, y se evaluaron los niveles de expresión del ARNm de citocinas.

Resultados

DetoxLLO, administrada sola, con E7, o fusionada a E7, indujeron la expresión del ARNm de TNF-α (Figuras 13A-B), IL-12 (Figuras 13C-D), e ISG15 (Figura 13E) por los macrófagos de BM después de 2 horas (Figuras 13A y 13C) y 24 horas (Figuras 13B, 13D, y 13E) en comparación con los controles. De manera similar, la detoxLLO indujo la

55 secreción de TNF-α (Figura 14A) e IL-12 (Figura 14B) por los macrófagos de BM después de 2 y 24 horas.

Ejemplo 10: LLO detox regula positivamente los marcadores de maduración de las células dendríticas

La médula ósea se recolectó de los fémures de ratones C57BL/6 a las 6-8 semanas de edad. Las células de la médula ósea de cuatro ratones se mezclaron, y las células se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía FCS 10 % y penicilina/estreptomicina 100 U/ml en placas de Petri de 100 x 15 mm. Después de 2 h de incubación a 37 °C en 10 % de CO2, las células no adherentes se eliminaron mediante lavado con medio calentado. Las células adherentes restantes se recolectaron por raspado con un raspador estéril de células. Después de lavar, las células se ajustaron a 0,5 x 10^6/ml, y se colocaron en una placa de 24 pocillos con GM-CSF murino recombinante a 20

65 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN). El medio se cambió cada 2-3 días. Después de 7 días de cultivo, las células no adherentes se recolectaron, se lavaron, y se usaron en los experimentos.

Estas células dendríticas originadas en la médula ósea (día 7) se sembraron a 2 x 10^6/ml y después se sometieron a un pulso con E7 (10 mcg/ml), LLO (40 mcg/ml), o LLOE7 (50 mcg/ml) más LLO (40 mcg/ml) durante 16 hr a 37 °C, y 5 % de CO2. El fenotipo de las DC obtenidas mediante el uso de este protocolo se analizó por análisis de FACS. Las DC se recolectaron después de 16 h como se describió anteriormente. Las células se tiñeron con AcM marcados con APC específicos para CD11c de ratón, o AcM marcados con FITC específicos para MHC clase II, CD40, CD86 de ratón. La IgG de ratón de igual isotipo se usó como un control negativo y se sustrajo del fondo. Las células se incubaron con los AcM durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Después de dos lavados con PBS, se añadieron 10 µl de 7AAD (Beckman Coulter, Marseille, Francia) 10 min antes de analizar las células en un citómetro de flujo FACS.

Resultados

La médula ósea se recolectó de los fémures de ratones C57BL/6 a las 6-8 semanas de edad. Después de 7 días de cultivo, las células no adherentes se recolectaron, se lavaron, y se sembraron en placas a 2 x 10^6/ml y después se sometieron a un pulso con E7 (10 mcg/ml), LLO (40 mcg/ml), o LLOE7 (50 mcg/ml) más LLO (40 mcg/ml) durante 16 hr en 37 °C, y 5 % de CO2. Las células se tiñeron con AcM marcados con APC específicos para CD11c de ratón, o AcM marcados con FITC específicos para MHC clase II, CD40, CD86 de ratón. La IgG de ratón de igual isotipo se usó como un control negativo y se sustrajo del fondo. Las células se incubaron con los AcM durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Después de dos lavados con PBS, se añadieron 10 µl de 7AAD (Beckman Coulter, Marseille, Francia) 10 min antes de analizar las células en un citómetro de flujo FACS. La población de células vivas se muestra como porcentaje de células positivas a CD11c. La administración de detoxLLO (en los grupos LLO, LLO+E7 y LLOE7) reguló positivamente (Figuras 15A-C) en comparación con los controles.

Ejemplo 11: Translocación nuclear de NF-kappa-B después de la estimulación con DT-LLO

La línea celular de macrófagos J774 se usó como sistema modelo para las células presentadoras de antígenos (APC). Se sembraron 5 x 10^5 células por pocillo (placa de 6 pocillos) en un volumen total de 1 ml. Las células se tiñeron con anti-NF-κB (P65) -FITC (fluorescencia verde) y DAPI para el núcleo (fluorescencia azul). En las Figuras 17B, D, y F, las células también se tiñeron después de 24 horas con anti-CD11B-PE (M1/170, eBioscence), que se expresa en la superficie celular de macrófagos y está implicado en las interacciones adhesivas de las células.

Resultados

NF-kappaB se ubica en el citoplasma después del tratamiento de las células con los medios solos (sin activación) (Figura 16A). Las células tratadas con los medios demuestran una tinción de Cd11b débil (Figura 16B). Después de una estimulación durante la noche (24 hr) con Dt-LLO (30 mcg), NF-kappaB se movió del citoplasma hacia el núcleo (Figura 16C) y hubo un aumento en la tinción de CD11b (Figura 16D). De manera similar, después de la estimulación durante la noche (24 hr) con LPS (10 mcg/ml, control positivo), NF-kappaB se translocó al núcleo (Figura 16E), lo que se enfatiza por el aumento de la tinción de CD11b+ de la membrana plasmática (Figura 16F).

Por lo tanto, en una modalidad, los datos demuestran la capacidad de LLO detox para estimular la inmunidad innata a través de macrófagos y DC.

Listado de secuencias

<110> Los Miembros de la Universidad de Pensilvania

<120> PROTEÍNAS DE FUSIÓN CON LLO NO HEMOLÍTICA Y MÉTODOS PARA UTILIZAR LAS MISMAS

<130> P-7771-PC4

<140> PCT/US09/999999

<141> 2009-06-22

<150> 12/213,696

<151> 2008-06-23

<160> 63

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 180

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211>: 9 50 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211>: 11 60 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211>: 13 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211>: 14 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211>: 15 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211>: 20 45 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens 60

<400> 9

<210> 10

<211>: 10 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211>: 9 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211>: 9 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211>: 9 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211>: 9 50 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211>: 9 60 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5

<400> 16

<210> 17

<211> 98

<212> PRT

<213> Papilomavirus humano

15

<400> 17

<210> 18

<211>: 11 45 <212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 18

<210> 19

<211>: 9 55 <212> PRT

<213> Papilomavirus humano

<400> 19

<210> 20

<211>: 105 65 <212> PRT

<213> Papilomavirus humano

<400> 20

30 <210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Papilomavirus humano

35 <400> 21 40 <210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Papilomavirus humano

45 <400> 22 50 <210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Papilomavirus humano

55 <400> 23

60 <210> 24

<211> 158

<212> PRT

<213> Papilomavirus humano

65 <400> 24

<210> 25

<211> 158

<212> PRT 40 <213> Papilomavirus humano

<400> 25

<210> 26

<211> 145

<212> PRT 25 <213> Mus musculus

<400> 26

<210> 27 65 <211> 124

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

<210> 28

<211> 132 35 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

<210> 29 10 <211> 123

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 29 15

45 <210> 30

<211> 157

<212> PRT

<213> Homo sapiens

50 <400> 30

<210> 31 25 <211> 157

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31 30

<210> 32

<211> 146

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 134 45 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 34

<210> 35

<211> 114 55 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 108

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 36

55 <210> 37

<211> 529

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

60 <400> 37

55: <210> 38 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Iniciador

<400> 38 ggctcgagca tggagataca cc: 22

65: <210> 39 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

49

<220> <223> Iniciador

5: <400> 39 ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28

10: <210> 40 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Iniciador

15: <400> 40 gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31

20: <210> 41 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25: <220> <223> Iniciador <400> 41 ctccctcgag atcataattt acttcatc 28

30: <210> 42 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> Iniciador

<400> 42 gactacaagg acgatgaccg acaagtgata acccgggatc taaataaatc cgttt: 55

40: <210> 43 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> Iniciador

50 55: <400> 43 cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag <210> 44 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador 27

60: <400> 44 gcggatccca tggagataca cctac 25

65: <210> 45 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 45 5 gctctagatt atggtttctg ag 22

<210> 46

<211> 529

<212> PRT 10 <213> Listeria monocytogenes

<400> 46

<210> 47

<211> 535

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 47

<210> 48

<211> 1551 60 <212> ADN

<213> Listeria monocytogenes

<400> 48

<210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

55: <220> <223> Iniciador

<400> 49 gctagctcat ttcacatcgt: 20

65: <210> 50 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220>

55

<223> Iniciador

5 10: <400> 50 tcttgcagct tcccaagcta aaccagtcgc ttctttagcg taaacattaa tatt <210> 51 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador 54

15: <400> 51 gaagcgactg gtttagcttg ggaagctgca agaacggtaa ttgatgaccg gaac 54

20: <210> 52 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> Iniciador

25: <400> 52 ggatccttat tagtggtggt ggtggtggtg ttcgattgg 39

30: <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes

<400> 53

<210> 54

<211> 238 40 <212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 54

35 <210> 55

<211> 11

<212>PRT

<213> Listeria monocytogenes

40 <400>55

<210> 56

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial 50

<220>

<223> Iniciador

<400> 56

<210> 57

<211> 54

<212> PRT 65 <213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 57

<210> 58

<211> 54

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Iniciador

<400> 58

<210> 59 45 <211> 39

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 59

65 <210> 60

<211> 238

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 60 5

<210> 61

<211> 810 60 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 285

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62 <210> 63

<211> 32

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 63

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO), en donde dicha proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) que se ubica en los residuos 483493 de dicha proteína LLO como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37, en donde dicha mutación consiste en una sustitución de los residuos de aminoácidos en las posiciones 484492 como se expone en la sec. con núm. de ident.: 37 con un péptido diferente de LLO de 8-50 residuos de aminoácidos que comprenden una porción inmunogénica de un péptido antigénico, en donde dicho péptido antigénico es un antígeno E7 del virus del papiloma humano (HPV), un antígeno E6 de HPV, un antígeno NY-ESO-1, un receptor de células B (BCR), un antígeno prostático específico (PSA), antígeno de células madre prostáticas (PSCA), un antígeno de la enzima quimiotríptica del estrato córneo (SCCE), antígeno 1 del tumor de Wilms (WT-1), telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), proteinasa 3, proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP2), antígeno de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), sarcoma sinovial X (SSX)-2, antígeno carcinoembrionario (CEA), MAGE-A, receptor alfa de la interleucina 13 (IL13-R alfa), anhidrasa carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 o testisina; y en donde dicha proteína recombinante muestra una reducción de más de 100 veces en la actividad hemolítica con respecto a la LLO de tipo silvestre de la sec. con núm. de ident.: 37.
2.

La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha proteína LLO comprende una deleción de la secuencia del péptido señal de esta.
3.

La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha proteína LLO comprende la secuencia del péptido señal de esta.
4.

La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho antígeno E7 de HPV es un antígeno E7 de HPV-16 o un antígeno E7 de HPV-18.
5.

La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho péptido antigénico comprende un epítopo de E7 de HPV.
6.

La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho antígeno E6 de HPV es un antígeno E6 de HPV-16 o un antígeno E6 de HPV-18.
7.

Una molécula de nucleótidos que codifica la proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8.

Un vector de vacuna recombinante que codifica la proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
9.

Una cepa de Listeria recombinante que comprende la proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
10.

Una composición de una vacuna que comprende la proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la molécula de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 7, y un adyuvante.
11.

La composición de la vacuna de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicho adyuvante comprende una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), una molécula de nucleótidos que codifica una proteína GM-CSF, saponina QS21, monofosforil lípido A, o un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.
12.

La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la molécula de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 7, o el vector de vacuna recombinante de conformidad con la reivindicación 8, o la cepa de Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, para usar como un medicamento.
13.

La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la molécula de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 7, o el vector de vacuna recombinante de conformidad con la reivindicación 8, o la cepa de Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, en donde el péptido antigénico es un péptido E7 de HPV o un péptido E6 de HPV, para usar en la inducción de una respuesta inmunológica al péptido antigénico E7 de HPV o E6 de HPV en un sujeto.
14.

La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la molécula de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 7, o el vector de vacuna recombinante de conformidad con la reivindicación 8, o la cepa de Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, en donde el péptido antigénico es un péptido E7 de HPV, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de

la regresión, reducción de la incidencia de un tumor que expresa E7 de HPV, o la protección contra este, en un sujeto.
15.

La proteína recombinante, molécula de nucleótidos, vector de vacuna recombinante o cepa de Listeria

recombinante para usar de conformidad con la reivindicación 14, en donde el tumor que expresa E7 de HPV 5 es un tumor cervical o un tumor de cabeza y cuello.
16. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la molécula de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 7, o el vector de vacuna recombinante de conformidad con la reivindicación 8, o la cepa de Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, en donde el

10 péptido antigénico es un péptido NY-ESO-1, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia de un tumor que expresa NY-ESO-1, o la protección contra este, en un sujeto.
17. La proteína recombinante, molécula de nucleótidos, vector de vacuna recombinante o cepa de Listeria

15 recombinante para usar de conformidad con la reivindicación 16, en donde el tumor que expresa NY-ESO-1 es melanoma ovárico o cáncer de pulmón.
18. La proteína recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o la molécula de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 7, o el vector de vacuna recombinante de conformidad con

20 la reivindicación 8, o la cepa de Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, en donde el péptido antigénico es un BCR, para usar en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia de un linfoma que expresa BCR, o la protección contra este, en un sujeto.

TRATAMIENTO TRATAMIENTO TRATAMIENTO

TRATAMIENTO TRATAMIENTO TRATAMIENTO TRATAMIENTO