BR112020017778A2 - Anfifilos de cpg e usos dos mesmos - Google Patents

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BR112020017778A2
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Peter C. DeMuth
Martin Steinbuck
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Elicio Therapeutics, Inc.
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Abstract

a invenção refere-se a compostos que incluem uma sequência de oligodesoxinucleotídeo cpg ligada a um lipídio através de um ligante e composições e métodos relacionados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANFIFI- LOS DE CPG E USOS DOS MESMOS".
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência na íntegra. A dita cópia ASCII, criada em ______________, é denominada __________________________ e tem _______ bytes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O câncer relacionado ao papilomavírus humano (HPV) é um dos cânceres de crescimento mais rápido no mundo. No geral, 5 % de todos os cânceres em todo o mundo podem ser atribuídos a infec- ções pelo HPV. Continua a haver a necessidade de tratamentos adici- onais e mais eficazes contra o câncer.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[003] A invenção fornece compostos que podem ser usados em métodos terapêuticos.
[004] Consequentemente, no primeiro aspecto, a invenção apre- senta um composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1) em sua extre- midade 5', ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, onde X é O ou S.
[005] Em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, a sequência de nucleotídeos está ligada ao lipídio.
[006] Em outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, to- dos os grupos internucleosídeos que ligam os nucleosídeos em 5'-
TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1) são fosforo- tioatos.
[007] No segundo aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de câncer em um paciente humano. Este método inclui administrar ao paciente o composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção, uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLL-
RREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHN- GRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO: 2) e uma proteí- na que inclui a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNI-
VTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
[008] Em uma modalidade do segundo aspecto da invenção, o câncer é positivo para o vírus do papiloma humano (HPV) (por exem- plo, positivo para HPV de tipo 16).
[009] Em outra modalidade do segundo aspecto da invenção, o câncer é um carcinoma de células escamosas de cabeça ou pescoço.
[0010] Em uma modalidade adicional do segundo aspecto da in- venção, o paciente está recebendo ou recebeu quimioterapia que con- tém platina. Em outra modalidade, um anticorpo anti-PD-1 (por exem- plo, pembrolizumabe ou nivolumabe) é administrado ao paciente.
[0011] Em outra modalidade do segundo aspecto da invenção, o composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção e as proteí- nas que incluem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 são administrados simultaneamente.
[0012] Em uma outra modalidade do segundo aspecto da inven- ção, o composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção e as proteínas que incluem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:
2 e SEQ ID NO: 3 são administrados sequencialmente.
[0013] Em um aspecto adicional, a invenção apresenta outro mé- todo de tratamento de câncer em um paciente humano. Este método inclui administrar ao paciente o composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção, uma proteína que inclui a sequência de aminoá- cidos: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEY- RHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLD- KKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO:2), uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNI-
VTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO:3) e um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, pembrolizuma- be ou nivolumabe).
[0014] No terceiro aspecto, a invenção se caracteriza por uma composição farmacêutica que inclui um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
[0015] Em uma modalidade do terceiro aspecto, a composição farmacêutica inclui ainda uma proteína que inclui a sequência de ami- noácidos: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEY- RHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLD- KKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO: 2) e uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNI-
VTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
[0016] No quarto aspecto, a invenção apresenta um kit que inclui (i) um composto de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou uma composição de acordo com o segundo aspecto da invenção e (ii) uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ
DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGT- TLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHN- GRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL (SEQ ID NO: 2) e uma proteí- na que inclui a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNI-
VTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3). Definições
[0017] Um "ligante", conforme usado aqui, se refere a um grupo monovalente ou divalente, em que uma valência é covalentemente li- gada a um grupo biologicamente funcional e a outra valência é cova- lentemente ligada a outro grupo biologicamente funcional. Em um exemplo, um ligante conecta uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, de um oligonucleotídeo CpG, a um lipídio (por exemplo, - P(X)(OH)-O-CH(CH2NHCO-(CH2)16-CH3)2, ou um sal do mesmo, em que X é O ou S, conforme descrito aqui). Tais ligantes podem incluir opcionalmente um ou mais nucleotídeos, por exemplo, um dinucleotí- deo (por exemplo, GG).
[0018] Um "veículo farmaceuticamente aceitável ", conforme usa- do aqui, se refere a um veículo capaz de suspender ou dissolver o composto ativo e tem as propriedades de ser não tóxico e não inflama- tório em um paciente. Além disso, um veículo farmaceuticamente acei- tável pode incluir um aditivo farmaceuticamente aceitável, tal como um conservante, antioxidante, fragrância, emulsificante, corante ou excipi- ente conhecido ou usado no campo da formulação de fármacos e que não interfere significativamente com a eficácia terapêutica da atividade biológica do agente ativo e que não é tóxico para o paciente.
[0019] Os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" se referem a abordagens terapêuticas nas quais o objetivo é reverter, aliviar, melho- rar, inibir, desacelerar ou parar a progressão ou gravidade de uma condição associada a uma doença ou transtorno, por exemplo, câncer. Estes termos incluem reduzir ou aliviar pelo menos um efeito adverso ou sintoma de uma condição, doença ou transtorno. O tratamento ge- ralmente é "eficaz" se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos ou se uma resposta desejada (por exemplo, uma res- posta imune específica) for induzida. Alternativamente, o tratamento é "eficaz" se a progressão da doença for reduzida ou interrompida.
[0020] A invenção oferece várias vantagens. Por exemplo, ao in- cluir porções lipídicas e, opcionalmente, um ligante, determinados compostos da invenção se ligam à albumina endógena em indivíduos aos quais eles são administrados, o que aumenta a distribuição dos compostos aos nódulos linfáticos dos indivíduos. Isto facilita a indução de uma resposta imune terapêutica, por exemplo, contra proteínas do HPV administradas ao indivíduo, levando a um tratamento eficaz do câncer.
[0021] Outras características e vantagens da invenção serão evi- dentes a partir da descrição detalhada a seguir, dos desenhos e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A Figura 1 é um gráfico que mostra a resposta imune contra HPV16 E6.
[0023] A Figura 2 é um gráfico que mostra a resposta imune contra HPV16 E7.
[0024] A Figura 3 é um gráfico que mostra a análise de coloração de tetrâmero para HPV16 E7.
[0025] A Figura 4 é uma série de gráficos que mostram que a ad- ministração de HPV16 E6 e HPV16 E7 com um anfifilo-CpG (aCpG)
diminuiu o tamanho do tumor comparado com aCpG apenas ou sem tratamento (Sem Tx).
[0026] A Figura 5 é um gráfico que mostra a resposta superior do tetrâmero de HPV com a vacina aCpG comparado com a vacina CpG solúvel em diferentes pontos de tempo.
[0027] A Figura 6 é um gráfico que mostra respostas sustentadas de tetrâmero de HPV ao longo do tempo com aCpG administrado uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas.
[0028] A Figura 7 é um gráfico que mostra a resposta do tamanho do tumor ao tratamento com a vacina E7.
[0029] A Figura 8 é um gráfico que mostra a sobrevida aprimorada em camundongos C57BL6 tratados com vacina E7 implantados com células tumorais TC-1.
[0030] A Figura 9 é uma série de gráficos que mostram as altera- ções do nível de citocinas no soro após a dosagem.
[0031] A Figura 10 é um gráfico que mostra as respostas do tetrâ- mero ao longo do tempo para uma vacina HPV16 E7/aCpG.
[0032] A Figura 11 é um gráfico que mostra a resposta do cresci- mento tumoral à vacinação com HPV16 E7/aCpG mais ou menos ad- ministração de um anticorpo anti-PD-1.
[0033] A Figura 12 é um gráfico que mostra os efeitos da vacina- ção com HPV16 E7/aCpG mais ou menos administração de um anti- corpo anti-PD-1 sobre a sobrevida em camundongos com tumor TC-1.
[0034] A Figura 13 é um gráfico que mostra a análise de tetrâmero para o escalonamento da dose de aCpG.
[0035] A Figura 14 mostra a estrutura do anfifilo-CpG-7909; 5'- (lipídio de diacila) TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (SEQ ID NO: 1). Todas as bases são DNA. Todas as ligações são fosforamidi- ta, incluindo a ligação entre o lipídio de diacila e o oligodesoxinucleotí- deo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0036] A invenção fornece compostos que podem ser usados em métodos terapêuticos. Os compostos incluem oligodesoxinucleotídeos CpG (ODNs) (por exemplo, um ODN CpG que têm a sequência 5'- TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1)). O ODN CpG está ligado, em sua extremidade 5', a um lipídio, tal como o seguinte: , ou um sal do mesmo, onde X é O ou S. De preferência, X é S. O oligonucleotídeo CpG pode estar diretamente ligado ao lipídio. Alternativamente, o CpG pode ser ligado ao lipídio através de um ligante, tal como GG. No oligonucleotí- deo CpG, todos os grupos internucleosídeos são fosforotioatos (por exemplo, todos os grupos internucleosídeos no composto podem ser fosforotioatos).
[0037] O ODN CpG pode funcionar como um adjuvante para indu- zir a uma resposta imune em um indivíduo, tal como uma resposta imune contra um antígeno canceroso (por exemplo, um antígeno de HPV). Como tal, os compostos e composições da invenção podem ser usados em métodos terapêuticos. Em particular, se o composto que contém ODN CpG for administrado em combinação com uma ou mais proteínas do HPV, o composto pode induzir a uma resposta imune a células cancerosas positivas para HPV. Consequentemente, a inven- ção fornece métodos de tratamento de câncer em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) através da administração de um ou mais compostos ou composições da invenção ao indivíduo. Em vários exemplos, o câncer é um câncer positivo para o HPV (por exemplo, um positivo para o HPV de tipo 16).
[0038] O câncer positivo para o HPV pode ser um carcinoma de células escamosas de cabeça ou pescoço, um câncer cervical, câncer anal, câncer vulvar, câncer de cabeça e pescoço, câncer de orofarin- ge, câncer de pênis, câncer vaginal, câncer induzido por vírus, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de estômago, neuroblasto- ma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, leucemia, sar- coma, carcinoma, carcinoma de células basais, carcinoma de pulmão de células não pequenas, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL), mieloma múltiplo (MM), eritroleucemia, carcinoma de células renais, sarcoma, melanoma, astrocitoma, oli- goastrocitoma, câncer do trato biliar, coriocarcinoma, câncer do SNC, câncer de laringe, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma, carcino- ma de células gigantes (ou granuloma), carcinoma de células escamo- sas, câncer de cavidade oral, câncer de pele, câncer de células ba- sais, câncer de células escamosas, câncer testicular , câncer de tiroi- de, câncer uterino, câncer retal, um câncer do sistema respiratório ou um câncer do sistema urinário.
[0039] Opcionalmente, os métodos da invenção podem incluir ain- da administrar um composto ou composição da invenção em combina- ção com uma segunda (ou outras) abordagem de tratamento diferente.
[0040] A invenção também fornece kits em que contêm, cada um, por exemplo, um primeiro recipiente que inclui um ou mais compostos da invenção, opcionalmente em conjunto com um segundo recipiente que inclui um antígeno canceroso, tal como uma proteína do HPV des- crita aqui. CpG
[0041] ODN CpGs são moléculas de DNA fita simples sintéticas curtas que contém dinucleotídeos CpG não metilados em contextos de sequência particulares. Os ODNs CpG têm uma estrutura básica par- cial ou completamente fosforotioada (PS), em oposição à estrutura de fosfodiéster natural (PO) nas moléculas de DNA. Três classes princi- pais de ODNs CpG estimuladores foram identificadas com base nas características estruturais e na atividade em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) humano, em particular células B e células dendríticas plasmocitoides (pDCs). Estas três classes são Classe A (tipo D), Classe B (Tipo K) e Classe C.
[0042] CpG1826 e CpG7909 estão ambos em Classe B de CpGs. ODN CpGs de Classe B contêm uma estrutura de PS completa com um ou mais dinucleotídeos CpG. Eles ativam fortemente as células B e a sinalização a NF-κB dependente de TLR9, mas estimulam fracamen- te a secreção de IFN-α. HPV Mutante
[0043] Mutações pontuais em C70G, C113G e I135G (sublinhadas abaixo) podem ser introduzidas na proteína viral HPV16 E6 de tipo selvagem para prevenir a interação estereoquímica com p53 humano. O desempenho deste componente como um antígeno é ditado pela sequência da proteína, a estrutura da proteína sendo irrelevante para a função pretendida. mHPV 16 E6 (158 aa; SEQ ID NO: 2)
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL
[0044] As mutações pontuais em C24G e E26G (sublinhadas abai- xo) podem ser introduzidas na proteína viral HPV16 E7 de tipo selva- gem para prevenir a interação estereoquímica com Rb1 humano. No- vamente, o desempenho deste componente como um antígeno é dita-
do pela sequência da proteína, com a estrutura da proteína sendo irre- levante para a função pretendida. mHPV 16 E7 (98 aa; SEQ ID NO: 3)
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP.
[0045] Os ODNs CpG podem ser ligados diretamente ou ligados através de um ligante ao lipídio. Estes compostos podem ser produzi- dos usando a química comum de fosforamidita conhecida na técnica. Em alguns exemplos, o ODN CpG ou ODN CpG-GG pode reagir com o seguinte composto: para produzir um intermediário o qual, após oxidação (por exemplo, métodos de oxidação de fosfito conhecidos na técnica, por exemplo, um agente de sulfurização, tal como 3-((N,N- dimetilaminometilideno)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-5-tiona) e hidrólise do grupo cianoetila, pode produzir um composto da invenção.
[0046] Para que a presente invenção seja mais completamente compreendida, são apresentados os exemplos a seguir. Estes exem- plos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer forma.
EXEMPLOS Exemplo 1: Proteínas HPV16 E6 e HPV16 E7 em combinação com um adjuvante anfifílico CpG geram uma resposta imune
[0047] Camundongos foram imunizados profilaticamente e a res- posta imune gerada foi registrada via coloração com E7-Tetrâmero e coloração de citocina intracelular com IFNγ (ICS) após estimulação com HPV16 E6 e HPV16 E7 (E6/E7).
[0048] A concepção experimental incluiu os 6 grupos de camun- dongos (n = 10 para cada grupo) a seguir:
1. Sem imunização
2. E6/E7 + CpG1826 solúvel
3. E6/E7 + anfifilo CpG1826 (aCpG1826)
4. E6/E7 + CpG7909 solúvel
5. E6/E7 + anfifilo CpG7909 (aCpG7909; Figura 14)
6. E6/E7 + poli IC (pIC)
[0049] pIC foi usado como um controle adjuvante de referência.
[0050] As soluções mãe de proteína foram dissolvidas em ureia a 8 M. Soluções mãe de adjuvante são dissolvidas em H2O. as injeções finais são diluídas com 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) (CF para ureia < 1 M).
[0051] Para aCpG1826, a sequência usada foi a sequência CpG1826 solúvel (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 4) com duas guaninas adicionadas na extremidade 5' (5'-gg tccat gacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 5). Uma concentração de 5 nmol para cada injeção de 100 μl foi usada para CpG1826 e aCpG1826 solúvel. CpG1826 é uma sequência ideal de camundongo, enquanto que CpG7909 é ideal para seres humanos e pouco ativa em camundongos. CpG1826 e CpG7909 estão na mesma classe de CpG (Classe B) e têm, em geral, perfis de atividade similares em suas respectivas espécies.
[0052] Tanto para aCpG7909 como CpG7909 solúvel, a sequência usada foi 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO: 6) em uma concen- tração de 5 nmol para cada injeção de 100 μl.
[0053] HPV16 E6 mutante com mutações pontuais em C70G, C113G e I135G (sublinhado abaixo) foi usado para a imunização. A sequência de aminoácidos usada é fornecida abaixo. mHPV 16 E6 (158 aa; SEQ ID NO:2)
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL
[0054] HPV16 E7 com mutações pontuais em C24G e E26G (sub- linhado abaixo) foi usado para a imunização. A sequência de aminoá- cidos usada é fornecida abaixo. mHPV 16 E7 (98 aa; SEQ ID NO:3)
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMG- TLGIV CPICSQKP
[0055] Para E6/E7, 10 μg de cada um do HPV16 E6 mutante e HPV16 E7 mutante foram usados através de uma injeção de 100 μl.
[0056] Camundongos C57BL/6J fêmeas (B6) foram imunizados pela via subcutânea (sc) com a dose inicial (E6/7 + aCpG) e uma dose de reforço após 2 semanas.
[0057] Análise de tetrâmero para H-2Db HPV16 E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 7) foi realizada 7 dias após a dose de reforço (Figura 3). Coloração de citocina intracelular (ICS) para IFNγ foi realizada no san- gue periférico 7 dias após a dose de reforço para analisar as respostas imunes a E6/E7.
[0058] Estimulação com E6 usou os seguintes peptídeos: (E6-10: EVYDFAFRDL (SEQ ID NO:8); E6 49-57: VYDFAFRDL (SEQ ID NO:9); E6 37-45: CVYCKQQLL; (SEQ ID NO:10); E6 72-80: KCLK- FYSKI (SEQ ID NO:11); e E6 100-108: NKPLCDLLI (SEQ ID NO:12) para gerar os dados mostrados na Figura 1.
[0059] Deconvolução dos estímulos E6 revelou que E49-57 foi o único peptídeo que resultou em estimulação.
[0060] Para a estimulação com E7, foi usado o seguinte peptídeo: RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 13). Este peptídeo foi usado para gerar os dados mostrados na Figura 2.
[0061] Conforme mostrado nas Figuras 1 e 2, o uso de aCpG1826 gerou uma forte resposta imune contra o mutante HPV16 E6 e o mutante HPV16 E7.
[0062] Conforme também mostrado nas Figuras 1 e 2, o uso de aCpG7909, o qual é ideal para seres humanos e geralmente tem um desempenho ruim em camundongos, surpreendentemente gerou uma forte resposta imune contra o HPV16 E6 mutante e HPV16 E7 mutan- te.
[0063] E6/E7 + aCpG diminuiu o crescimento do tumor comparado com aCpG apenas ou nenhum tratamento, com um aumento corres- pondente na porcentagem de sobrevida (Figura 4). Exemplo 2: Determinação de um cronograma de dosagem para HPV 16 E7 e aCPG
[0064] Para determinar um cronograma de dosagem ideal para E7 + aCpG em relação à eficácia antitumoral em camundongos fêmeas C57BL/6U (B6) implantados com tumores TC-1, a dosagem semanal foi comparada com dosagem a cada 2 semanas e com a linha de base (inicial apenas). E7 + aCpG foi comparado com E7 + CpG solúvel. To- das as vacinas foram administradas 3 vezes (inicial e 2 reforços).
[0065] Camundongos C57BL/6J fêmeas (B6) foram inoculados com 50.000 células TC-1 subcutaneamente no flanco no Dia 0 e 12 dias depois; os camundongos foram separados em grupos de trata- mento e tratados conforme indicado na Tabela 1.
Tabela 1 Artigo Intervalo Volume de de Dose a de do- injeção N Parâmetros Teste sagem (ROA) Citocinas séricas Análise de tetrâmero Controle de anticorpos séricos N/D 0 não tra- N/D 10 anti-E7 para H-2Db tado HPV16 E7 Sobrevida e tamanho do tumor Dose 100 μL, di- Citocinas séricas 10 10 μg de única vidido (SC) Análise de tetrâmero E7 100 μL, di- de anticorpos séricos E7 + aCpG-1826 Semanal vidido (SC) 20 anti-E7 para H-2Db aCpG a 1,24 HPV16 E7 nmol b A cada 2 100 μL, di- Sobrevida e tamanho 20 semanas vidido (SC) do tumor Dose 100 μL, di- Análise de tetrâmero 10 μg de única 10 vidido (SC) de anticorpos séricos E7 E7 + 100 μL, di- anti-E7 para H-2Db CpG-1826 Semanal 20 CpG vidido (SC) HPV16 E7 a 1,24 A cada 2 100 μL, di- Sobrevida e tamanho nmol 20 semanas vidido (SC) do tumor a Soluções mãe de proteína foram dissolvidas em ureia a 8 M. As so- luções mãe de adjuvante foram dissolvidas em H2O. As injeções finais foram diluídas com 1X PBS (CF para ureia < 1 M). b equivalente a 8 µg NA = não aplicável; PBS = solução salina tamponada com fosfato; ROA = via de administração; SC = subcutânea
[0066]  Ao longo do estudo, os tamanhos dos tumores foram me- didos em dias alternados até o dia 40 após a inoculação e a sobrevida do animal foi monitorada. A análise de tetrâmero para H-2Db HPV16 E7 (RAHYNIVTF) foi realizada 7 dias após cada administração da va-
cina.
[0067]  Amostras de soro foram retiradas 1 hora e 4 horas após cada administração de vacina para os grupos com aCpG e analisadas via matriz de esferas citométricas para expressão de citocinas (IFNγ, TNFα, IL-6, IL-10, IL-12p70, MCP-1).
[0068]  As titulações de anticorpos séricos anti-E7 foram analisa- das 14 dias após a vacinação inicial. Placas para ELISA foram revesti- das com proteína E7 total, após o que anticorpos séricos foram captu- rados e detectados com anticorpo anti-Fc.
[0069] A resposta de células T específicas para o tetrâmero de HPV à vacina de CpG anfifílico/proteína foi superior àquela da vacina de CpG solúvel/proteína após uma dose única e doses repetidas (Fi- gura 5). A resposta do tetrâmero de HPV à proteína/aCpG aumentou ainda mais após a administração de vacinações de reforço e os au- mentos foram mantidos até os dias 28 e 35 (Figura 6) para os regimes de uma vez por semana e uma vez a cada 2 semanas, respectivamen- te. A forte resposta do tetrâmero de HPV nos grupos com aCpG se correlacionou com reduções no tamanho do tumor comparado com animais vacinados com CpG solúvel (Figura 7) e sobrevida aprimorada (Figura 8). Os aumentos relacionados ao tratamento nas citocinas sis- têmicas foram comparáveis entre os grupos com aCpG e CpG solúvel, exceto quanto à IL-10, a qual foi menor para aCpG comparado com CpG solúvel, e IFNγ, a qual foi maior para aCpG comparado com CpG solúvel (Figura 9). Exemplo 3: Eficácia antitumoral da proteína E7 em combinação com CpG solúvel ou anfifílico e com ou sem a adição de um anticorpo anti- PD-1
[0070] Para avaliar a eficácia antitumoral da proteína E7 em com- binação com CpG solúvel ou anfifílico e com ou sem a adição de um anticorpo anti-PD-1, camundongos fêmeas C57BL/6J (B6) foram ino-
culados no flanco na linha de base com 50.000 células TC-1. Onze dias após a inoculação, os camundongos foram divididos em 5 grupos, conforme mostrado na Tabela 2. O grupo de comparação não foi tra- tado.
Tabela 2 Volume Artigo Intervalo de inje- de Tes- Dose a de dosa- N Parâmetros ção te gem (ROA) Controle N/D 0 N/D 10 não tratado 10 μg de E7 100 μL, E7 + A cada 2 CpG-1826 a dividido 10 CpG semanas 1,24 nmol (SC) 10 μg de E7 100 μL, Tamanho do tumor E7 + A cada 2 aCpG-1826 a dividido 10 a cada dois dias até aCpG semanas 1,24 nmol (SC) o dia 40
Sobrevida 100 μL, E7 + 10 μg de E7 dividido Análise de tetrâmero A cada 2 CpG + CpG-1826 a (SC) para H-2Db HPV16 semanas PD- 1,24 nmol IP de anti- 10 E7 para vacina 1 anti- 230 μL de corpo (100 (Peptídeo RAHYNI- e anticorpo corpo anti-PD-1 μL dividi- VTF; SEQ ID NO: do) 13) 7 dias após ca- da administração da vacina 100 μL, E7 + 10 μg de E7 dividido A cada 2 aCpG aCpG-1826 a (SC) semanas + Anti- 1,24 nmol IP de anti- 10 Para vacina corpo 230 μL de corpo (100 e anticorpo PD-1 anti-PD-1 μL dividi- do) a Soluções mãe de proteína foram dissolvidas em ureia a 8 M.
As so-
luções mãe de adjuvante foram dissolvidas em H2O. As injeções finais foram diluídas com 1X PBS (CF para ureia < 1 M). IP = intraperitoneal; NA = não aplicável; PBS = solução salina tampo- nada com fosfato; ROA = via de administração; SC = subcutâneo
[0071] Ao longo do estudo, os tamanhos dos tumores foram medi- dos em dias alternados até ao dia 40 após a inoculação e a sobrevida dos animais foi monitorada. A análise do tetrâmero para H-2Db HPV16 E7 (RAHYNIVTF) foi realizada 7 dias após cada administração da va- cina.
[0072] A administração da vacina E7/Amph-CpG, sem ou sem an- ti-DP-1 humanizado, causou um aumento robusto em células CD8- Te- trâmero de HPV+ específicas para HPV16 E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 13) peptídeo (Figura 10). Estas respostas foram claramente visí- veis logo após a primeira dose, atingiram o pico na 2ª dose e foram sustentadas até a 3ª dose (em contraste com as respostas mais baixas observadas com E7/CpG as quais, embora aumentadas pela adminis- tração concomitante de anti-PD-1, não foram sustentadas.
[0073] Correspondendo a estas fortes respostas de CD8 Tetrâme- ro de HPV+, o crescimento do tumor foi interrompido por volta do Dia 24 e revertido após a primeira dose de E7/Amph-CpG (com ou sem anticorpo anti-PD-1) e o tamanho do tumor permaneceu pequeno e estável até o final do estudo, em contraste com os outros grupos onde o crescimento progrediu (Figura 11).
[0074] Além disso, correspondendo aos efeitos sobre o tamanho do tumor, o tratamento com a vacina E7/aCpG (com ou sem o anticor- po anti-PD-1) teve um efeito significativo sobre a sobrevida e resultou em 6/7 (85 %) de curas para E7/aCpG sem anticorpo e 8/10 (80 %) de curas para E7/aCpG mais anticorpo anti-PD-1 (Figura 12). Exemplo 4: Estudo de escalonamento de dose de aCpG
[0075] Para determinar uma dose de aCpG que produz a maior resposta de CD8 Tetrâmero+ específica para antígeno ao longo de 6 doses, um estudo de escalonamento de dose foi conduzido usando uma dose fixa de 10 μg de ovalbumina (OVA) como o antígeno. CpG solúvel foi usado como comparador. A tolerabilidade (com base no pe- so corporal e observações gerais) também foi avaliada. A concepção do estudo é descrita na Tabela 3. Tabela 3 Dose Adjuvante ROA (Volume Antígeno/Dose Adjuvante (nmol) de Dose) 0,12 0,60 Amph-CpG-1826 1,2 6 SC (100 μL, 10 μg de OVA 12 dividido) 1,2 CpG-1826 6 solúvel 12 60 ROA = via de administração; SC = subcutâneo
[0076] Até 6 doses de vacina foram administradas em intervalos de 2 semanas para uma duração total do estudo de 11 semanas.
[0077] Amostras de sangue periférico foram coletadas 7 dias após cada injeção e as análises de citometria de fluxo de tetrâmero em célu- las CD8+ foram realizadas usando H-2Kb OVA (SIINFEKL; SEQ ID NO: 14).
[0078] Aumentos significativos em células CD8+ tetrâmero+ foram observados apenas nos grupos tratados com um CpG + OVA, com 6 nmol produzindo o maior efeito farmacológico (Figura 13). Nenhuma perda de peso, perda de interesse/apetite ou feridas/lesões foram ob- servadas. Outras Modalidades
[0079] Embora a invenção tenha sido descrita em relação a moda- lidades específicas da mesma, será entendido que ela é capaz de mo- dificações adicionais e o presente pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo desvios da presente invenção que provêm da prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence e podem ser aplicadas às características essenciais apresentadas aqui.
[0080] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes são aqui incorporados por referência na íntegra na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse es- pecífica e individualmente indicado como sendo incorporado por refe- rência na íntegra.
[0081] Algumas modalidades da invenção estão dentro dos pará- grafos numerados a seguir.
[0082] 1. Composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'- TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1), em sua extre- midade 5', ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
[0083] 2. O composto de acordo com o parágrafo 1, em que a se- quência de nucleotídeos está ligada ao lipídio.
[0084] 3. O composto de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que todos os grupos internucleosídeos que conectam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1) são fosfo- rotioatos.
[0085] 4. Um método de tratamento de câncer em um paciente humano que compreende administrar ao paciente o composto de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ DPQER-
PRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV
YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGCRQKTRCPE EKQRHLDKKQ RFRETGRL (SE- QRHLDKKQ RFRETGRL EKQRHLDKQ RFRETGRL) e uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNI-
VTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
[0086] 5. O método de acordo com o parágrafo 4, em que o câncer é positivo para o papilomavírus humano (HPV).
[0087] 6. O método de acordo com o parágrafo 5, em que o câncer é positivo para HPV de tipo 16.
[0088] 7. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 4 a 6, em que o câncer é um carcinoma de células escamosas de cabe- ça ou pescoço.
[0089] 8. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 4 a 7, em que o paciente está recebendo ou recebeu quimioterapia que contém platina.
[0090] 9. O método de acordo com o parágrafo 4, em que o com- posto de acordo com o parágrafo 1 e as proteínas que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 são administrados simultaneamente.
[0091] 10. O método de acordo com o parágrafo 4, em que o com- posto de acordo com o parágrafo 1 e as proteínas que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 são administrados sequencialmente.
[0092] 11. Uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3 e um veí- culo farmaceuticamente aceitável.
[0093] 12. A composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 11, em que a composição compreende ainda uma proteína que com- preende a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGN-
PYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGCRQKTRCPE EKQRHLDKKQ RFRETGRL (SEQRHLDKKQ RFRETGRL EKQRHLDKQ RFRETGRL) e uma proteína que compre- ende a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT
DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
[0094] 13. Um kit que compreende (i) um composto de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3 ou uma composição de acordo com o parágrafo 11 e (ii) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDII-
LECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI
SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGCRQKTRCPE EKQRHLDKKQ RFRETGRL (SEQRHLDKKQ RFRETGRL EKQRHLDKQ RFRETGRL) e uma proteína que compreende a se- quência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT
DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
[0095] Outras modalidades estão dentro das reivindicações a se- guir.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto caracterizado pelo fato de que consiste na se- quência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1), em sua extremidade 5', ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de nucleotídeos está ligada ao lipídio.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que todos os grupos internucleosídeos que ligam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 1) são fosforotioatos.
4. Método de tratamento de um câncer em um paciente humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente o composto como definido na reivindicação 1 ou 2, uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos:
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC
KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI
SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGCRQKTRCPE EKQRHLDKKQ RFRETGRL (SEQRHLDKKQ RFRETGRL EKQRHLDKQ RFRETGRL) e uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT
DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o câncer é positivo para o papilomavírus humano (HPV).
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o câncer é positivo para HPV de tipo 16.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o câncer é um carcinoma de células escamosas de cabeça ou pescoço.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o paciente está recebendo ou recebeu quimioterapia que contém platina.
9. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto e as proteínas que compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 são admi- nistrados simultaneamente.
10. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o composto e as proteínas que compreendem as se- quências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 são admi- nistrados sequencialmente.
11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 1 ou 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI
HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG
DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGCRQKTRCPE EKQRHLDKKQ RFRETGRL (SEQRHLDKKQ RFRETGRL EKQRHLDKQ RFRETGRL) e uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHGDTPTLHE
YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA
HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
13. Kit caracterizado pelo fato de que compreende (i) um composto como definido na reivindicação 1 ou 2 e (ii) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos: MHQKRTAMFQ
DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY
DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL
YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGCRQKTRCPE EKQRHLDKKQ RFRETGRL (SEQRHLDKKQ RFRETGRL EKQRHLDKQ RFRETGRL) e uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos:
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG
PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP (SEQ ID NO: 3).
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