ES2604635T3 - Anticuerpos humanos contra el factor tisular humano - Google Patents

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ES2604635T3 ES09801426.9T ES09801426T ES2604635T3 ES 2604635 T3 ES2604635 T3 ES 2604635T3 ES 09801426 T ES09801426 T ES 09801426T ES 2604635 T3 ES2604635 T3 ES 2604635T3
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David P. E. Satijn
Rene M. A Hoet
Paul Parren
Jan Van De Winkel
Vibeke Miller Breinholt
Eva Ehrnrooth
Ole Baadsgaard
Tom Vink
Willem Karel Bleeker
Mischa Houtkamp
Maroeska Oudshoorn
Rob N. De Jong
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Abstract

Un anticuerpo humano que se une al Factor Tisular, en donde el anticuerpo comprende una región VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y una región VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 66, 67 y 68.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos humanos contra el factor tisular humano.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a anticuerpos dirigidos al factor tisular, en particular, al factor tisular humano, y a los usos de tales anticuerpos, en particular, a su uso en el tratamiento del cancer, la inflamacion y las enfermedades vasculares.
Antecedentes de la invencion
El factor tisular (TF), tambien llamado tromboplastina, factor de III o CD142 es una protefna presente en el tejido subendotelial, las plaquetas y los leucocitos necesario para el inicio de la formacion de trombina a partir del zimogeno protrombina. La formacion de trombina en ultima instancia conduce a la coagulacion de la sangre. El factor tisular permite a las celulas iniciar la cascada de la coagulacion de la sangre, y funciona como receptor de alta afinidad para el factor de coagulacion VII. El complejo resultante proporciona un evento catalftico que es responsable del inicio de las cascadas de proteasas de coagulacion por proteolisis limitada especffica. A diferencia de los otros cofactores de estas cascadas de proteasas, que circulan en forma de precursores no funcionales, este factor es un potente iniciador que es totalmente funcional cuando se expresa sobre las superficies celulares.
El factor tisular es el receptor de la superficie celular para la serina proteasa factor VIIa (FVIIa). Se ha encontrado que la union de FVIIa al factor tisular inicia los procesos de senalizacion dentro de la celula, jugando dicha funcion de senalizacion un papel en la angiogenesis. Mientras que la angiogenesis es un proceso normal en el crecimiento y el desarrollo, asf como en la curacion de heridas, tambien es una etapa fundamental en la transicion de los tumores a partir de un estado latente a un estado maligno: cuando las celulas cancerosas adquieren la capacidad para producir protefnas que participan en la angiogenesis, los llamados factores de crecimiento angiogenicos, estas protefnas son liberadas por el tumor en los tejidos cercanos, y estimulan la brotacion de nuevos vasos sangufneos a partir de los vasos sangufneos sanos existentes hacia y dentro del tumor. Una vez que los nuevos vasos sangufneos entran en el tumor, este puede expandir rapidamente su tamano e invadir tejidos y organos locales. A traves de los nuevos vasos sangufneos las celulas cancerosas pueden escapar a la circulacion y alojarse en otros organos para formar nuevos tumores (metastasis).
Ademas el TF juega un papel en la inflamacion. Se supone que el papel de TF esta mediado por la coagulacion de la sangre (A. J. Chu: "Tissue factor mediates inflammation" en Archives of biochemistry and biophysics, 2005, vol. 440, Num. 2, pags. 123-132). En consecuencia, la inhibicion de TF p. ej., por anticuerpos monoclonales anti-TF tiene importancia en la interrupcion del ciclo de coagulacion-inflamacion contribuyendo no solo a la anti-inflamacion, sino tambien a las enfermedades vasculares.
La expresion de TF se observa en muchos tipos de cancer y esta asociada con una enfermedad mas agresiva. Ademas, el TF humano tambien existe en una forma empalmada alternativamente soluble, asHTF. Recientemente se ha encontrado que asHTF promueve el crecimiento tumoral (Hobbs et al. 2007 Trombosis Res. 120(2) S13-S21).
Los anticuerpos que se unen a TF se han descrito en la tecnica anterior:
El documento WO98/40408 describe anticuerpos que se pueden unir a TF humano nativo, ya sea solo o presente en un complejo de TF:VIIa, evitando eficazmente la union del factor X a TF o a ese complejo, y reduciendo de este modo la coagulacion de la sangre. Se describe que los anticuerpos se pueden usar para aliviar las trombosis despues de un procedimiento medico invasivo, tal como cirugfa arterial o cardfaca o para eliminar la coagulacion de la sangre que surge del uso de aplicaciones medicas. Se describen otros anticuerpos para su empleo en metodos de diagnostico in vivo que incluyen la formacion de imagenes de diagnostico in vivo de tF humano nativo.
El documento WO04/094475 proporciona anticuerpos capaces de unirse al factor tisular humano, que no inhiben la coagulacion sangufnea mediada por el factor en comparacion con un control de plasma normal. No se describen anticuerpos humanos. Se alega que el anticuerpo puede ser utilizado para el tratamiento del cancer.
El documento WO03/093422 se refiere a anticuerpos que se unen con mayor afinidad al complejo TF:VIIa que al TF solo. Se propone el uso de los anticuerpos como anticoagulante en el tratamiento de ciertas enfermedades, tales como la sepsis, coagulacion intravascular diseminada, la apoplejfa isquemica, la trombosis, el sfndrome coronario agudo y la coagulopatfa en el cancer avanzado.
El documento WO01/27079 describe composiciones y metodos para inhibir la proliferacion celular anormal, en particular la proliferacion de celulas endoteliales, tal como el cancer, el desarrollo anormal de embriones, el mal funcionamiento de la respuesta inmunitaria, asf como la angiogenesis relacionada con la neovascularizacion y el crecimiento tumoral. Se proponen muchas sustancias activas, incluyendo anticuerpos, pero no se describen anticuerpos especfficos.
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El documento WO03/037361 se refiere al uso agonistas o antagonistas del TF para el tratamiento relacionado con la apoptosis.
El documento WO03/029295 (D1) se refiere a anticuerpos humanos aislados que reaccionan inmunologicamente con TF humano para inhibir la union del factor de coagulacion Vila. Sin embargo, la solicitud no describe un solo ejemplo de un anticuerpo que tenga estas propiedades.
El documento WO04/039842 (D2) se refiere a anticuerpos humanizados que reaccionan inmunologicamente con TF humano para inhibir la union del factor de coagulacion Vila para el tratamiento de los trastornos de la coagulacion mediante la inhibicion de la formacion de trombos. D2 describe adicionalmente un anticuerpo humano; HuTF-31 F2 inhibe la generacion de FXa.
Se han aprobado numerosas terapias con anticuerpos monoclonales para el tratamiento de diferentes tipos de tumores, incluyendo, p. ej., bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix™) y trastuzumab (Herceptin®).
Compendio de la invencion
Aunque se han hecho muchos progresos, sigue habiendo una necesidad de mejorar los metodos de tratamiento de enfermedades graves, por ejemplo, de mejorar el tratamiento del cancer, basado en anticuerpos terapeuticos.
Un objeto de la presente invencion es proporcionar nuevos anticuerpos anti-TF humano altamente especfficos y eficaces para uso medico. Los anticuerpos de la invencion muestran caracterfsticas de union a TF que difieren de los anticuerpos descritos en la tecnica. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invencion tienen una alta afinidad hacia el factor tisular humano, median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), inhiben la union de FVIIa a TF, inhiben la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa y la liberacion de IL8, no inhiben o inhiben escasamente la coagulacion.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Alineamiento de secuencias de los anticuerpos de la presente invencion.
Se destacan CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con IMGT: las secuencias en cursiva representan la region CDR1, las secuencias subrayadas representan la region CDR2, las secuencias en negrita representan la region CDR3.
Figura 2: secuencias de IgG4 (SEQ ID NO: 113-114)
SEQ ID NO: 113: Secuencia de aminoacidos de la region CH de tipo salvaje de IgG4 humana. La Secuencia
en cursiva representa la region CH1, la secuencia destacada representa la region bisagra, secuencia regular
representa la region CH2 y la secuencia subrayada representa la region CH3.
sEq ID NO: 114: Secuencia de aminoacidos de la region CH sin bisagra de una IgG4 humana
Figura 3: Union de HuMAb anti-TF al dominio extracelular de TF.
Figura 4: Union de HuMAb anti-TF a un TF unido a membrana.
Figura 5: Inhibicion de la union de FVII a TF.
Figura 6: Inhibicion de la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa.
Figura 6a: Inhibicion de la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa Figura 7: Inhibicion de la liberacion de IL8 inducida por FVIIa.
Figura 8: Inhibicion de la generacion de FXa.
Figura 9: Inhibicion de la coagulacion de la sangre.
Figura 10: Los TF-HuMAb inducen la lisis de las celulas Bx-PC3 por ADCC.
Figura 11: Deposito de los componentes del complemento C3c y C4c sobre las celulas diana.
Figura 12: Analisis inmunohistoqufmico de la union de TF-HuMAb a los glomerulos.
Figura 13: Analisis inmunohistoqufmico de la union de TF-HuMAb a tumores pancreaticos.
Figura 14: Eficacia in vivo de TF-HuMAb en xenoinjerto de tumor MDA-MB-231 establecido.
Figura 15: Tiempo de sangrado determinado en monos cinomolgos tras inyecciones intravenosas de HuMab especffico de tF 011. El anticuerpo se administro el dfa 1 (0 mg/kg), 8 (1 mg/kg), 15 (10 mg/kg) y 22 (100 mg/kg).
Figura 16: Eficacia in vivo de TF-HuMAb en un xenoinjerto de tumor BX-PC3 profilactico y establecido.
Figura 17: Constructo lanzadera y dominios TF
Figura 18: Union de los anticuerpos anti-TF a constructos lanzadera TF
Figura 19: Union de fragmentos Fab de HuMab-TF al dominio extracelular de TF, ELISA
Figura 20: Union de fragmentos Fab de HuMab-TF al dominio extracelular de TF, FACS
Figura 21: Perfil de union de anti-HuMAb dependiente del numero de moleculas de TF expresadas.
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Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Los terminos "factor tisular", "TF", "CD142", "antfgeno del factor tisular", "antfgeno TF" y "antfgeno CD142 se utilizan indistintamente en la presente memoria, y, a menos que se especifique lo contrario, incluyen cualquier variante, isoforma y homologo de especie del factor tisular humano que es expresado de forma natural por las celulas o es expresado en las celulas transfectadas con el gen del factor tisular.
El termino "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoprotefnas estructuralmente relacionadas que consisten en dos pares de cadenas polipeptfdicas, un par de cadenas ligeras (L) de bajo peso molecular y un par de cadenas pesadas (H), que pueden estar interconectadas, las cuatro, por enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas ha sido bien caracterizada. Vease, por ejemplo, Fundamental Immunology. Capftulo 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). En pocas palabras, cada cadena pesada normalmente se compone de una region variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como Vh o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada normalmente se compone de tres dominios, Ch1, Ch2, y Ch3. Cada cadena ligera esta tfpicamente compuesta de una region variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como Vl o VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera normalmente se compone de un dominio Cl. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables que pueden ser hipervariable en secuencia y/o forma de bucles estructuralmente definidos), denominadas tambien regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl normalmente se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (vease tambien Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tfpicamente, la numeracion de los residuos de aminoacido en esta region es de acuerdo a IMGT., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (expresiones tales como numeracion de residuos del dominio variable como en Kabat o de acuerdo con Kabat en la presente memoria se refieren a este sistema de numeracion para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera). Utilizando este sistema de numeracion, la secuencia de aminoacidos lineal real de un peptido puede contener menos o mas aminoacidos correspondientes a un acortamiento de, o una insercion en, una fR o una CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una insercion de un solo aminoacido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) despues del residuo 52 de la CDR2 de Vh y residuos insertados (por ejemplo los residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) despues del residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeracion de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineamiento en las regiones de homologfa de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional".
El termino "anticuerpo" (Ab) en el contexto de la presente invencion se refiere a una molecula de inmunoglobulina, un fragmento de una molecula de inmunoglobulina, o un derivado de cualquiera de los mismos, que tiene la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno en condiciones fisiologicas tfpicas con una semivida de perfodos de tiempo significativos, tales como al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente una hora, al menos aproximadamente dos horas, al menos aproximadamente cuatro horas, al menos aproximadamente 8 horas, al menos aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o mas, aproximadamente 48 horas o mas, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 dfas o mas, etc., o cualquier otro perfodo definido funcionalmente relevante (tal como un tiempo suficiente para inducir, promover, mejorar y/o modular una respuesta fisiologica asociada con la union del anticuerpo al antfgeno y/o un tiempo suficiente para que el anticuerpo reclute una actividad efectora). Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de la molecula de inmunoglobulina contienen un dominio de union que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos (Ab) pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a tejidos o factores del anfitrion, incluyendo varias celulas del sistema inmunitario (tales como celulas efectoras) y componentes del sistema del complemento tales como C1q, el primer componente en el via clasica de activacion del complemento. Un anticuerpo anti-TF tambien puede ser un anticuerpo biespecffico, diacuerpo, o molecula similar (vease, por ejemplo, PNAS USA. 90 (14), 6444-8 (1993) para una descripcion de los diacuerpos). De hecho, los anticuerpos biespecfficos, diacuerpos, y similares, proporcionados por la presente invencion se pueden unir a cualquier diana adecuada, ademas de a una porcion de factores tisulares o complejos de factor tisular FVIIa. Como se indico anteriormente, el termino anticuerpo en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario o se contradiga por el contexto claramente, incluye fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse especfficamente al antfgeno. Se ha demostrado que la funcion de union al antfgeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo completo. Los ejemplos de los fragmentos de union incluidos dentro del termino "anticuerpo" incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1, o un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab); (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios Vh y Ch1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente en los dominios Vl y Vh, (v) un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste esencialmente en un dominio Vh y tambien llamado
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anticuerpo de dominio (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11): 484-90); (vi) anticuerpos de camelido o nanocuerpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Ene; 5(1): 111-24) y (vii) una region determinante de complementariedad aislada (CDR). Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, estos pueden unirse, utilizando metodos recombinantes, por medio de un conector sintetico que permite elaborarlos como una unica cadena de protefna en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como anticuerpos de cadena sencilla o Fv de cadena unica (scFv), vease, por ejemplo, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) y Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tales anticuerpos de cadena sencilla se incluyen dentro del termino anticuerpo a menos que se indique lo contrario o este claramente indicado por el contexto. Aunque tales fragmentos se incluyen generalmente en el sentido de anticuerpo, tomados en conjunto y cada uno independientemente son caracterfsticas unicas de la presente invencion, que presentan diferentes propiedades biologicas y utilidad. Estos y otros fragmentos de anticuerpos utiles en el contexto de la presente invencion se discuten mas adelante en la presente memoria. Tambien debe entenderse que el termino anticuerpo, a menos que se especifique lo contrario, tambien incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), polipeptidos similares a anticuerpos, tales como anticuerpos quimericos y anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpos que retienen la capacidad de unirse especfficamente al antfgeno (fragmentos de union al antfgeno) proporcionados por cualquier tecnica conocida, tales como escision enzimatica, sfntesis de peptidos, y tecnicas recombinantes. Un anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo.
Un "anticuerpo anti-TF" es un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, que se une especfficamente al factor tisular antigenico.
Se pretende que el termino "anticuerpo humano", segun se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagenesis al azar o especffica del sitio in vitro o durante el reordenamiento del gen, o por mutacion somatica in vivo). Sin embargo, no se pretende que el termino "anticuerpo humano", segun se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la lfnea germinal de otra especie de mamffero, como un raton, hayan sido injertadas en secuencias marco humanas.
En una realizacion preferida, el anticuerpo de la invencion es aislado. Se pretende que un "anticuerpo aislado", segun se utiliza en la presente memoria, haga referencia a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigenicas diferentes (por ejemplo un anticuerpo aislado que se une especfficamente al factor tisular esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especfficamente a antfgenos distintos del factor tisular). Un anticuerpo aislado que se une especfficamente a un epftopo, isoforma o variante de factor tisular humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antfgenos relacionados, por ejemplo de otras especies (tales como especies de factores tisulares homologos). Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o producto qufmico. En una realizacion de la presente invencion, dos o mas anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferentes especificidades de union al antfgeno se combinan en una composicion bien definida.
Cuando se usa en la presente memoria en el contexto de dos o mas anticuerpos, el termino "compite con" o "presenta reaccion cruzada con" indica que los dos o mas anticuerpos compiten por la union a TF, p. ej., compiten por la union a TF en el analisis descrito en el Ejemplo 6 en la presente memoria. Para algunos pares de anticuerpos, la competicion en el analisis del Ejemplo 6 solo se observa cuando un anticuerpo se aplica como recubrimiento sobre la placa y el otro se utiliza para competir, y no al reves. Tambien se pretende que el termino "compite con" cuando se usa en la presente memoria abarque tales combinaciones de anticuerpos.
Los terminos "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal" segun se utilizan en la presente memoria, hagan referencia a una preparacion de moleculas de anticuerpo de composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de union y una afinidad para un epftopo particular. En consecuencia, el termino "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una sola especificidad de union que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la lfnea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser generados por un hibridoma que incluye una celula B obtenida de un animal no humano transgenico o transcromosomico, tal como un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera, fusionados a una celula inmortalizada.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "union" en el contexto de la union de un anticuerpo a un antjgeno predeterminado es tfpicamente una union con una afinidad correspondiente a una Kd de aproximadamente 10'rM o menos, tal como aproximadamente 10-8 M o menos, tal como aproximadamente 10-9 M o menos, aproximadamente 10-10M o menos, o aproximadamente 10-11 M o incluso menos cuando se determina por medio de tecnologfa de resonancia de plasmon superficial (SPR) en un aparato BIAcore 3000 utilizando el antfgeno como ligando y el anticuerpo como analito, y se une al antfgeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una Kd que es al
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menos diez veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo al menos 1.000 veces menor, tal como al menos 10.000 veces menor, por ejemplo al menos 100.000 veces inferior a su afinidad para la union a un antfgeno no especffico (p. ej., BSA, casefna) distinto del antfgeno predeterminado o un antfgeno estrechamente relacionado. La cantidad con la cual la afinidad es inferior depende de la Kd del anticuerpo, de modo que cuando la Kd del anticuerpo es muy baja (es decir, el anticuerpo es altamente especffico), la cantidad con la cual la afinidad por el antfgeno es menor que la afinidad por un antfgeno no especffico puede ser de al menos 10.000 veces.
El termino "kd" (seg-1), segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a la constante de velocidad de disociacion de una interaccion anticuerpo-antfgeno concreta. Dicho valor se denomina tambien valor koff.
El termino "ka" (M-1 x seg-1), segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a la constante de velocidad de asociacion de una interaccion anticuerpo-antfgeno concreta.
El termino "Kd" (M), segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a la constante de disociacion de equilibrio de una interaccion anticuerpo-antfgeno concreta.
El termino "Ka" (M-1), segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a la constante de asociacion de equilibrio de una interaccion anticuerpo-antfgeno concreta y se obtiene dividiendo la ka por la kd.
La presente invencion tambien proporciona anticuerpos que comprenden las variantes funcionales de la Vl region, la region Vh, o una o mas CDR de los anticuerpos de los ejemplos. Una variante funcional de una Vl, VhO CDR utilizada en el contexto de un anticuerpo anti-TF todavfa permite que el anticuerpo conserve al menos una proporcion sustancial (al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o mas) de la afinidad/avidez y/o la especificidad/selectividad del anticuerpo parental y en algunos casos semejante anticuerpo anti-TF puede estar asociado con una mayor afinidad, selectividad y/o especificidad que el anticuerpo parental.
Tales variantes funcionales tfpicamente conservan una identidad de secuencia significativa con el anticuerpo parental. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de homologfa = num. de posiciones identicas/num. total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que han de ser introducidas para el alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matematico, como se describe en los siguientes ejemplos no limitantes.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos se puede determinar utilizando el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en
http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos o de aminoacidos tambien se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion de longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en
http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
La secuencia de las variantes de CDR puede diferir de la secuencia de la CDR de las secuencias del anticuerpo parental principalmente a traves de sustituciones conservativas; por ejemplo al menos aproximadamente 35%, aproximadamente el 50% o mas, aproximadamente 60% o mas, aproximadamente 70% o mas, aproximadamente 75% o mas, aproximadamente 80% o mas, aproximadamente 85% o mas, aproximadamente 90% o mas, aproximadamente 95% o mas (p. ej., aproximadamente 65 a 99%, tal como aproximadamente 96%, 97% o 98%) de las sustituciones en la variante son sustituciones de residuos de aminoacidos conservativas.
La secuencia de las variantes de CDR puede diferir de la secuencia de la CDR de las secuencias de anticuerpo parental principalmente a traves de sustituciones conservativas; por ejemplo al menos 10, tal como al menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 de las sustituciones en la variante son sustituciones de residuos de aminoacidos conservativas.
En el contexto de la presente invencion, las sustituciones conservativas pueden definirse mediante sustituciones dentro de las clases de aminoacidos reflejadas en una o mas de las siguientes tres tablas:
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Clases de residuos de aminoacidos para sustituciones conservativas
Residuos acidos
Asp (D) y Glu (E)
Residuos alcalinos
Lys (K), Arg (R), e His (H)
Residuos no cargados hidrofilos
Ser (S), Thr (T), Asn (N), y Gln (Q)
Residuos no cargados alifaticos
Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), y Ile (I)
Residuos no cargados no polares
Cys (C), Met (M), y Pro (P)
Residuos aromaticos
Phe (F), Tyr (Y), y Trp (W)
Clases de sustituciones de residuos de aminoacidos conservativas alternativas
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A S T
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D E
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N Q
4
R K
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I L M
6
F Y W
Clasificaciones ffsicas y funcionales alternativas de residuos de aminoacidos
Residuos que contienen un grupo alcohol
S y T
Residuos alifaticos
I, L, V y M
Residuos asociados a cicloalquenilo
F, H, W, e Y
Residuos hidrofobos
A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, e Y
Residuos cargados negativamente
D y E
Residuos polares
C, D, E, H, K, N, Q, R, S, y T
Residuos cargados positivamente
H, K, y R
Residuos pequenos
A, C, D, G, N, P, S, T, y V
Residuos muy pequenos
A, G, y S
Residuos implicados en la formacion de giros
A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P, y T
Residuos flexibles
Q, T, K, S, G, P, D, E, y R
Las agrupaciones de sustituciones mas conservativas incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, y asparragina-glutamina.
Tambien se puede formular otros grupos de aminoacidos utilizando los principios descritos, p. ej., en Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. (2a ed. 1993) Freeman and Company.
En una realizacion de la presente invencion, la conservacion en terminos de propiedades hidropaticas/hidrofilas y de peso de residuo/tamano tambien se mantiene sustancialmente en una CDR variante en comparacion con una CDR de un anticuerpo de los ejemplos (p. ej., la clase de peso, la puntuacion hidropatica, o ambas secuencias se conservan en al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o mas (p. ej., aproximadamente 65 a 99%)). Por ejemplo, las sustituciones de residuos conservativas pueden estar basadas tambien o alternativamente en la sustitucion de grupos de conservacion fuertes o debiles basandose en el peso, que son conocidos en la tecnica.
La retencion de residuos similares se puede medir tambien o alternativamente por una puntuacion de similitud, como se determina mediante el uso de un programa BLAST (por ejemplo, BLAST 2.2.8 disponible a traves del NCBI utilizando los parametros convencionales BLOSUM62, Hueco abierto = 11 y Hueco extendido = 1) . Las variantes adecuadas presentan tfpicamente una similitud de al menos aproximadamente 45%, tal como al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 75%, al menos
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aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o mas (p. ej., aproximadamente 70 a 99%) con el peptido de origen.
Segun se utiliza en la presente memoria, "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM) que esta codificada por los genes de la region constante de la cadena pesada.
El termino "epftopo" significa un determinante proteico que se puede unir a un anticuerpo especffico. Los epftopos consisten habitualmente en agrupaciones superficiales de moleculas tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucares y normalmente tienen caracterfsticas estructurales tridimensionales especfficas, asf como caracterfsticas de carga especfficas. Los epftopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la union a los primeros, pero no a los segundos se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epftopo puede comprender residuos de aminoacidos implicados directamente en la union (tambien llamados componentes inmunodominantes del epftopo) y otros residuos de aminoacidos, que no estan directamente involucrados en la union, tales como residuos de aminoacidos que estan bloqueados de manera eficaz por el peptido de union a antfgeno especfficamente (en otras palabras, el residuo de aminoacido esta dentro de la huella del peptido de union al antfgeno de manera especffica).
Segun se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo humano "deriva de" una secuencia de la lfnea germinal particular, si el anticuerpo se obtiene a partir de un sistema que utiliza secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo mediante la inmunizacion de un raton transgenico que porta genes de inmunoglobulina humana o por escrutinio de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana, y en donde la secuencia del dominio V del anticuerpo humano seleccionado es identica en al menos 90%, tal como al menos 95%, por ejemplo al menos 96%, tal como al menos 97%, por ejemplo al menos 98%, o tal como al menos 99% en la secuencia del dominio V de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la lfnea germinal. Normalmente, fuera de la CDR3 de la cadena pesada, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de la lfnea germinal humana en particular mostrara diferencias de no mas de 20 aminoacidos, p. ej., diferencias de no mas de 10 aminoacidos, tales como no mas de 9, 8, 7, 6 o 5, por ejemplo diferencias de no mas de 4, 3, 2, o 1 aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de lfnea germinal.
Segun se utiliza en la presente memoria, se pretende que el termino "inhibe el crecimiento" (p. ej., en referencia a celulas, tales como celulas tumorales) incluya cualquier disminucion medible en el crecimiento de la celula cuando entra en contacto con un anticuerpo anti-TF en comparacion con el crecimiento de las mismas celulas cuando no estan en contacto con un anticuerpo anti-TF, p. ej., la inhibicion del crecimiento de un cultivo celular en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, o 100%. Tal disminucion en el crecimiento celular puede producirse por una variedad de mecanismos, p. ej., fagocitosis de celulas efectoras, ADCC, CDC, y/o apoptosis.
Se pretende que el termino "molecula biespecffica" incluya cualquier agente, tal como un protefna, peptido, o complejo de protefna o peptido, que tenga dos especificidades de union diferentes. Por ejemplo, la molecula se puede unir a, o interactuar con, (a) un antfgeno de la superficie celular y (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una celula efectora. Se pretende que el termino "anticuerpo biespecffico" incluya cualquier anticuerpo anti-TF, que sea una molecula biespecffica. El termino "anticuerpos biespecfficos" tambien incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecfficos en los que los dominios Vh y Vl se expresan en una unica cadena polipeptfdica, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union a antfgeno (vease por ejemplo Holliger, P. et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, R.J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)).
Un "anticuerpo con una funcion efectora deficiente" o un "anticuerpo deficiente en funcion efectora" se refiere a un anticuerpo que tiene una capacidad significativamente reducida o nula para activar uno o varios mecanismos efectores, tales como la activacion del complemento o la union al receptor de Fc. Por lo tanto, los anticuerpos deficientes en funcion efectora tienen una capacidad significativamente reducida o nula para mediar la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Un ejemplo de semejante anticuerpo es la IgG4.
El termino "anticuerpo monovalente" significa, en el contexto de la presente invencion, que una molecula de anticuerpo es capaz de unirse a una sola molecula del antfgeno, y por lo tanto no susceptible de entrecruzamiento antigenico.
El termino "anticuerpo IgG4 estabilizado" se refiere a un anticuerpo IgG4 que ha sido modificado para reducir el intercambio de hemimolecula (vease van der Neut Kolfschoten M. et al. (2007) Science 14; 317 (5844) y las referencias de la misma, y tambien Labrijn et al. (2009) Nature Biotechnology, 27, 767-771.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "celula efectora" se refiere a una celula inmunitaria que esta
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implicada en la fase efectora de una respuesta inmunitaria, en oposicion a las fases cognitivas y de activacion de una respuesta inmunitaria. Las celulas inmunitarias ilustrativas incluyen una celula de origen mieloide o linfoide, por ejemplo linfocitos (tales como celulas B y celulas T, incluyendo las celulas T citolfticas (CTL)), celulas asesinas, celulas asesinas naturales, macrofagos, monocitos, eosinofilos, celulas polimorfonucleares, tales como los neutrofilos, granulocitos, mastocitos, y basofilos. Algunas celulas efectoras expresan receptores de Fc especfficos y llevan a cabo funciones inmunitarias especfficas. En algunas realizaciones, una celula efectora es capaz de inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), tal como una celula asesina natural, capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrofagos, que expresan FcR estan implicados en la destruccion especffica de celulas diana y la presentacion de antfgenos a otros componentes del sistema inmunitario, o la union a celulas que presentan antfgenos. En algunas realizaciones, una celula efectora puede fagocitar un antfgeno diana o una celula diana. La expresion de un FcR particular sobre una celula efectora se puede regular mediante factores humorales tales como citoquinas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresion de FcyRI esta regulada al alza por el interferon y (IFN-y) y/o G-CSF. Esta expresion potenciada aumenta la actividad citotoxica de las celulas que portan FcyRI contra las dianas. Una celula efectora puede fagocitar o lisar un antfgeno diana o una celula diana.
Se pretende que el termino "vector", segun se utiliza en la presente memoria, haga referencia a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar otros segmentos de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son susceptibles de replicacion autonoma en una celula anfitriona en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores episomales de mamffero). Otros vectores (tales como los vectores de mamfferos no episomales) se pueden integrar en el genoma de una celula anfitriona tras la introduccion en la celula anfitriona, y de ese modo se replican junto con el genoma del anfitrion. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Tales vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresion recombinante" (o simplemente, "vectores de expresion"). En general, los vectores de expresion de utilidad en las tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente ya que el plasmido es la forma mas comunmente utilizada de vector. Sin embargo, se pretende que la presente invencion incluya dichas otras formas de vectores de expresion, tales como vectores virales (tales como retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven para funciones equivalentes.
Se pretende que el termino "celula anfitriona recombinante" (o simplemente "celula anfitriona"), segun se utiliza en la presente memoria, haga referencia a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion. Debe entenderse que se pretende que tales terminos hagan referencia no solo a la celula sujeto en particular, sino tambien a la progenie de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutacion o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula parental, pero todavfa se incluye dentro del alcance de la expresion "celula anfitriona" segun se utiliza en la presente memoria. Las celulas anfitrionas recombinantes incluyen, por ejemplo, transfectomas, tales como celulas CHO, celulas HEK293, celulas NS/0, y celulas linfocfticas.
El termino "transfectoma", segun se utiliza en la presente memoria, incluye celulas anfitrionas eucariotas recombinantes que expresan el anticuerpo, tales como celulas CHO, celulas NS/0, celulas HEK293, celulas vegetales, o celulas de hongos, incluyendo levaduras.
El termino "animal no humano transgenico" se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o mas transgenes o transcromosomas de cadena pesada y/o ligera humana (ya sea integrados o no integrados en el ADN genomico natural del animal) y que es capaz de expresar anticuerpos completamente humanos. Por ejemplo, un raton transgenico puede tener un transgen de cadena ligera humana y, o bien un transgen de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de forma que el raton produce anticuerpos anti- TF humano cuando se inmunizan con el antfgeno TF y/o celulas que expresan el TF. El transgen de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosomico del raton, como es el caso para ratones transgenicos, por ejemplo ratones HuMAb, tales como ratones HCo7 o HCo12, o el transgen de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosomicamente, como es el caso de los ratones KM transcromosomicos como se describe en el documento WO02/43478. Tales ratones transgenicos y transcromosomicos (denominados colectivamente en la presente memoria como "ratones transgenicos") son capaces de producir multiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para un antfgeno dado (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgD y/o IgE) experimentando recombinacion V-D-J y cambio de isotipo. El animal no humano transgenico tambien se puede utilizar para la produccion de anticuerpos contra un antfgeno especffico mediante la introduccion de genes que codifican tales anticuerpos especfficos, por ejemplo uniendo operativamente los genes a un gen que se expresa en la leche del animal.
"Tratamiento" se refiere a la administracion de una cantidad eficaz de un compuesto terapeuticamente activo de la presente invencion con el proposito de aliviar, mejorar, detener o eliminar (curar) los sfntomas o estados de enfermedad.
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Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapeutico deseado. La cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo anti-TF para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es aquella en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del anticuerpo o porcion de anticuerpo es sobrepasado por los efectos terapeuticamente beneficiosos.
Un anticuerpo "anti-idiotipo" (Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes unicos generalmente asociados con el sitio de union al antfgeno de un anticuerpo.
Otros aspectos y realizaciones de la invencion
Como se ha descrito anteriormente, en un primer aspecto, la invencion se refiere a un anticuerpo humano que se une al Factor Tisular humano en donde el anticuerpo comprende una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 66, 67 y 68.
En una realizacion, el anticuerpo se une al dominio extracelular del Factor Tisular con una afinidad aparente (CE50) de 3 nM o menos, tal como 0,50 nM o menos, p. ej., 0,35 nM o menos, tal como 0,20 nM o menos, p. ej., 0.1 nM o menos, cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 13.
En otra realizacion, el anticuerpo se une a las celulas de mamffero que expresan el Factor Tisular, tales como celulas A431 transfectadas con un constructo que codifica el Factor Tisular, preferiblemente con una afinidad aparente (CE50) de 10 nm o menos, p. ej., 8 nM o menos, tal como 5 nM o menos, p. ej., 2 nM o menos, tal como 1 nM o menos, p. ej., 0,5 nM o menos, tal como 0,3 nM o menos, cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 14.
En otra realizacion, el anticuerpo es capaz de inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en las celulas A431, de preferencia con un valor de CE50 de 2 nM o menos, p. ej., 1 nM o menos, tal como 0,7 nM o menos, o 0,3 nM o menos, tal como 0,2 nM o menos, o 0,1 nM o menos, o 0,05 nM o menos, cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 20.
En otra realizacion, el anticuerpo es eficaz en la inhibicion el crecimiento de tumores MDA-MB-231 establecidos, cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 24 y/o en la inhibicion del crecimiento de tumores BxPC3 establecidos, cuando se determina mediante el metodo descrito en el Ejemplo 26.
En otra realizacion, el anticuerpo inhibe la coagulacion de la sangre inducida por el factor tisular, preferiblemente con una concentracion de inhibicion mediana de menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM, p. ej., menos de 2 nM, tal como menos de 1 nM cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 19.
En otra realizacion, el anticuerpo no inhibe la coagulacion. En una realizacion, la coagulacion se inhibe con un maximo de 30%, tal como 25%, tal como 20%, tal como 15%, tal como 10% o tal como 5% en comparacion con el nivel nativo.
En una realizacion adicional, el anticuerpo inhibe la union de FVIIa al Factor Tisular, preferiblemente con un valor de inhibicion maximo de mas de 80%, tal como mas de 90% cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 15.
En una realizacion adicional, el anticuerpo inhibe la liberacion de IL-8 inducida por FVIIa por las celulas MDA-MB- 231, preferiblemente con un valor de inhibicion maximo de la inhibicion de mas de 40%, tal como mas de 50%, p. ej. mas de 60%, cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 17.
En una realizacion adicional, el anticuerpo inhibe la conversion de FX en FXa por el complejo TF/FVIIa, preferiblemente en menos de 50%, p. ej. menos de 40%, tal como en el intervalo de 1 a 30%, cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 18.
En una realizacion adicional, el anticuerpo compite por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65.
En una realizacion adicional, la union del anticuerpo de la invencion al Factor Tisular no implica los tres siguientes residuos: W en la posicion 45, K en la posicion 46 o Y en la posicion 94 del Factor Tisular. En una realizacion mas, la union no implica ninguno de los siguientes residuos: W en la posicion 45, K en la posicion 46 o Y en la posicion 94 (estos numeros se refieren al TF maduro, las posiciones equivalentes en la entrada GenBank NP_001984 son 77, 78
y 126).
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Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que compiten por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 93.
En una realizacion adicional, el anticuerpo inhibe la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa, preferiblemente con una concentracion inhibicion mediana de menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM, p. ej., menos de 2 nM cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 16.
En una realizacion adicional, el anticuerpo inhibe la fosforilacion de ERK preferiblemente con una concentracion de inhibicion mediana de menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM, p. ej., menos de 2 nM cuando se determina como se describe en el analisis del Ejemplo 16 y no inhibe la liberacion de IL-8 inducida por FVII como se describe en el analisis del Ejemplo 17 en mas de un maximo de 10%. En una realizacion adicional, el anticuerpo es capaz de inducir el deposito de C3c y C4c, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inducir el deposito de C3c y C4c como se determina en el Ejemplo 21.
En una realizacion adicional, los fragmentos Fab de anticuerpo se unen al dominio extracelular del Factor Tisular como se ha descrito en el Ejemplo 28 con un valor de CE50 de menos de 0,1 pg/mL, tal como por debajo de 0,05 pg/mL, p.ej. por debajo de 0,04 pg/mL tal como se mide por medio de ELISA.
En una realizacion adicional, los fragmentos Fab de anticuerpo se unen al dominio extracelular del factor tisular como se ha descrito en el Ejemplo 28 con un valor de CE50 por encima de 1,0 pg/mL, tal como se mide por medio de ELISA.
En una realizacion adicional, los fragmentos Fab de anticuerpo se unen al dominio extracelular del factor tisular como se ha descrito en el Ejemplo 28 con un valor de CE50 por debajo de 10 pg/mL, tal como por debajo de 1 pg/mL, por ejemplo, por debajo de 0,5 pg/mL, o por debajo de 0,2 pg/mL.
En una realizacion adicional, el anticuerpo se une al factor tisular humano y no al factor tisular murino y muestra una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano al constructo barajado de 42-84 mm, que contiene la secuencia humana para TF excepto para el aminoacido 42-84, que ha sido sustituido con la secuencia de raton, como se describe en el Ejemplo 27.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que se unen al factor tisular humano y no al factor tisular murino y muestran una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano al constructo barajado de 85-122, que contiene la secuencia humana para TF excepto para el aminoacido 85-122, que ha sido sustituido con la secuencia de raton, como se describe en el Ejemplo 27.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que se unen al factor tisular humano y no al factor tisular murino y muestran una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano al constructo barajado de 123-137 mm que contiene la secuencia humana para TF excepto para el aminoacido 123-137, que ha sido sustituido con la secuencia de raton, como se describe en el Ejemplo 27.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que se unen al factor tisular humano y no al factor tisular murino y muestran una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano al constructo barajado de 185-225 mm que contiene la secuencia humana para Tf excepto para el aminoacido 185-225, que ha sido sustituido con la secuencia de raton, como se describe en el Ejemplo 27.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que se unen al factor tisular humano y no al factor tisular murino y muestran una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano al constructo barajado de 226-250 mm que contiene la secuencia humana para TF excepto para el aminoacido 226 a 250, que ha sido sustituido con la secuencia de raton, como se describe en el Ejemplo 27.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que muestran una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano a mas de un constructo barajado tal como un anticuerpo que muestra una reduccion de la union al constructo de 42 a 84 mm, asf como a 85 a 122 mm y un anticuerpo que muestra una reduccion de la union a 123-137 mm, asf como al constructo de 185-225 mm. Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que muestran una reduccion de la union al constructo de 123-137 mm, asf como al constructo de 185-225 mm y adicionalmente al constructo de 226-250 mm.
En una realizacion adicional, el anticuerpo es capaz de inducir el deposito de C3c y C4c, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inducir el deposito de C3c y C4c tal como se determina en el Ejemplo 21.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que compiten por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que
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comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65, y no compiten por la Union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 93.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una region CDR3 de VH que tiene
a) la secuencia expuesta en
- el SEQ ID NO: 12,
- el SEQ ID NO: 16,
- el SEQ ID NO: 20,
- el SEQ ID NO: 24,
- el SEQ ID NO: 28,
o
b) una variante de cualquiera de dichas secuencias, tal como una variante que tiene como maximo 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones de aminoacidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una region CDR3 de VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 12 o una variante de la misma, en donde la variante comprende la modificacion en una o mas de las posiciones 2, 3, 6, 9 y 11, preferiblemente donde la modificacion es una sustitucion, mas preferiblemente donde la sustitucion se selecciona del grupo que consiste en
a. R esta sustituido por K cuando esta en posicion 2,
b. S esta sustituido por A o T cuando esta en posicion 3,
c. G esta sustituido por T cuando esta en posicion 6,
d. L esta sustituido por F, cuando en la posicion 9, y
e. S esta sustituido por Y cuando esta en posicion 11.
La presente invencion se refiere a un anticuerpo humano que se une a un Factor Tisular humano y comprende una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 66, 67 y 68. Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 14, 15 y 16, y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 70, 71 y, 72,
b) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 18, 19, 20 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 74, 75 y 76,
c) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 22, 23 y 24 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 78, 79 y 80,
d) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 26, 27 y 28 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 82, 83 y 84, o
e) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
En una realizacion, el anticuerpo comprende una VH que tiene
a) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9, o
b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9.
En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una VL que tiene
a) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65, o
b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65.
En una realizacion adicional, el anticuerpo comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65.
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Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 13 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 69,
b) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 17 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 73,
c) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 21 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 77,
d) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 25 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 81, o
e) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que compiten por la union del Factor Tisular a un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65, y que compiten por la union del Factor Tisular a un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 93.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una region CDR3 de VH que tiene
a) la secuencia expuesta en
- SEQ ID NO: 8,
- SEQ ID NO: 52, o
b) una variante de cualquiera de dichas secuencias, tal como una variante que tiene como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 6, 7 y 8 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 62, 63 y 64,
b) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 50, 51 y 52 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 106, 107 y 108, o
c) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprende una VH que tiene
a) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 5 y 49, o
b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 5 y 49.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una VL que tiene
c) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una secuencia de la region VL seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 61 y 105, o
d) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 61 y 105.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y una region VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 61,
b) una region VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 49 y una region VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 105, o
c) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como
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sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que
- no compiten por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65, y
- compiten por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 93.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una region CDR3 de VH que tiene
a) la secuencia expuesta en
- el SEQ ID NO: 32,
- SEQ ID NO: 36,
- SEQ ID NO: 40,
- SEQ ID NO: 56,
o
b) una variante de cualquiera de dichas secuencias, tales como una variante que tiene como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 30, 31 y 32 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 86, 87 y 88,
b) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 34, 35 y 36 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 90, 91 y 92,
c) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 38, 39 y 40 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 94, 95 y 96,
d) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 54, 55 y 56 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 110, 11 y 112, o
e) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una VH que tiene
a) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 29, 33, 37 y 53, o
b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 29, 33, 37 y 53.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una VL que tiene
a) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una secuencia de la region VL seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 85, 89, 93 y 109, o
b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 85, 89, 93 y 109.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 29 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 85,
b) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 33 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 89,
c) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 93,
d) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 53 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 109, o
e) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como
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maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que compiten por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 41 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 97.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una region CDR3 de VH que tiene
a) la secuencia expuesta en
- el SEQ ID NO: 4,
- el SEQ ID NO: 44,
- el SEQ ID NO: 48,
o
b) una variante de cualquiera de dichas secuencias, tales como una variante que tiene como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 2, 3 y 4 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 58, 59 y 60,
b) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 42, 43 y 44 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 98, 99 y 100,
c) una region VH que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 46, 47 y 48 y una region VL que comprende las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 102, 103 y 104, o
d) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una VH que tiene
a) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 1, 41 y 45 o
b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 1,41 y 45.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden una VL que tiene
c) una identidad de al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o una identidad de 100% con una secuencia de la region VL seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 57, 97 y 101 o
d) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una secuencia de la region VH seleccionada del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 57, 97 y 101.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:
a) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 1 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ I D NO: 57,
b) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 41 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 97,
c) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 45 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 101, o
d) una variante de cualquiera de dichos anticuerpos, en donde dicha variante tiene preferiblemente como maximo 1, 2 o 3 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tales como sustituciones de aminoacidos conservativas en dichas secuencias.
En una realizacion adicional mas, el anticuerpo de la invencion tiene una afinidad para el factor tisular que es menor de 5 nM, tal como menor de 3,5 nM, por ejemplo, menor de 2 nM cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria.
Un grupo particularmente interesante de anticuerpos de la invencion tiene una union al Factor Tisular que se
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caracteriza por una avidez normal o elevada y una velocidad de disociacion (kd) elevada. Como se demuestra en la presente memoria, dichos anticuerpos pueden exhibir una union espedfica a un tumor ya que se unen el tejido canceroso, pero no se unen, o se unen menos, a los tejidos sanos. Sin estar limitado por ninguna teona espedfica, se plantea la hipotesis de que este grupo de anticuerpos solo se une bien a las celulas que expresan altos niveles de TF, porque la union solo es eficaz si es bivalente. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen los anticuerpos 044, 098 y 111, que se describen en la presente memoria.
Por consiguiente, en una realizacion, el anticuerpo de la invencion tiene una kd de mas de 10-3 seg-1 cuando se determina por el metodo de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria, y una avidez menor de 5 nM, tal como menor de 1 nM, por ejemplo, menor de 0,2 nM cuando se determina por el metodo de avidez descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria.
En otra realizacion, el anticuerpo de la invencion tiene una kd mayor de 10"3 seg"1, cuando se determina por el metodo de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria y/o una ka mayor de 5 x 104, Mol seg"1 cuando se determina por el metodo de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria.
En una realizacion adicional, el anticuerpo no muestra union a tejido sano, en particular, no se une a los glomerulos humanos, p. ej. como se determina en el analisis descrito en el Ejemplo 23, pero muestran union a los tumores pancreaticos, p. ej., como se determina en el analisis descrito en el Ejemplo 23 en la presente memoria.
En una realizacion adicional mas, el anticuerpo es eficaz en la inhibicion de crecimiento de los tumores BX-PC3 establecidos cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 26 en la presente memoria.
En otra realizacion, el anticuerpo de la invencion tiene una o mas de las siguientes propiedades: inhibicion de la proliferacion, inhibicion de la angiogenesis tumoral, induccion de la apoptosis de las celulas tumorales, union a Factor Tisular seccionado alternativamente.
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que compiten por la union al Factor Tisular con un anticuerpo que comprende
a) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65,
b) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 1 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 57,
c) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 5 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 61,
d) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 13 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 69;
e) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 17 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 73,
f) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 21 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 77,
g) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 25 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 81,
h) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 29 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 85,
i) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 33 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 89,
j) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 93,
k) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 41 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 97,
l) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 45 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 101,
m) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 49 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 105, o
n) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 53 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 109
Tambien se describen en la presente memoria anticuerpos que se unen al mismo epftopo en el Factor Tisular que un anticuerpo que tiene:
a) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65,
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b) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 1 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 57,
c) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 5 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 61,
d) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 13 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 69,
e) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 17 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 73,
f) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 21 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 77,
g) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 25 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 81,
h) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 29 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 85,
i) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 33 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 89,
j) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 37 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 93,
k) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 41 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 97,
l) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 45 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 101,
m) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 49 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 105, o
n) una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 53 y una region VL que comprende la del SEQ ID NO: 109.
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En una realizacion adicional, el anticuerpo de la invencion comprende:
- una region variable de cadena pesada derivada de una secuencia Vh de la lfnea germinal humana seleccionada del grupo que consiste en: IGHV1-18*01, IGHV3-23*01, IGHV3-30*01, IGHV3-33*01, IGHV3- 333*03, IGHVI-69*02, IGHV1-69*04 e IGHV5-51*01 y/o
- una region variable de cadena ligera derivada de una secuencia de Vk de la lfnea germinal humana seleccionada del grupo que consiste en: IGKV3-20*01, IGKV1-13*02, IGKV3-11*01, e IGKV1D-16*01.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-TF que comprende una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 9, o una variante que tiene como maximo 25 modificaciones de aminoacidos, por ejemplo 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas.
La variante de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 9, puede tener un % de identidad de al menos 80 con cualquiera de dichas secuencias, tal como identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
En un aspecto de la invencion, el anticuerpo monoclonal anti-TF aislado comprende una secuencia de VL expuesta en el SEQ ID NO: 65, o una variante que tiene a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas.
La variante de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 65 puede tener una identidad de al menos 80% con cualquiera de dichas secuencias, tal como identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
En otra realizacion, el anticuerpo comprende
a) una region VL que tiene la secuencia del SEQ ID NO: 65, y una region VH que tiene una secuencia del SEQ ID NO: 9,
b) una variante de cualquiera de las anteriores, en donde dicha variante preferiblemente solo tiene sustituciones conservativas en dichas secuencias.
En una realizacion preferida, el anticuerpo comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID No: 65 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 9, o una variante de cualquiera de las dos
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a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15; 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 9 o el SEQ ID NO: 65, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 57 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 1, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo la variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 57, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 61 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 5, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tales como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 5 o el SEQ ID NO: 61, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 69 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 13, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 13 o el SEQ ID NO: 69, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 73 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 17, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 de modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 17 o el SEQ ID NO: 73, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 77 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 21, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 21 o el SEQ ID NO: 77, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
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Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 81 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 25, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 25 o el SEQ ID NO: 81, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 85 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 29, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 29 o el SEQ ID NO: 85, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 89 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 33, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 33 o el SEQ ID NO: 89, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 93 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 37, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 37 o el SEQ ID NO: 93, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 97 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 41, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 41 o el SEQ ID NO: 97, respectivamente, tal como una
identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o
una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 101 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 45, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 45 o el SEQ ID NO: 101, respectivamente, tal como una
identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o
una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 105 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 49, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
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a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 49 o el SEQ ID NO: 105, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una region VL que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 109 y una region VH que tiene la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 53, o una variante de cualquiera de las dos secuencias, teniendo las variantes
a) a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas, o
b) una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 53 o el SEQ ID NO: 109, respectivamente, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99%.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion pueden, por ejemplo ser producidos por el procedimiento del hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), o pueden ser producidos por metodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las tecnicas descritas en, por ejemplo, por Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener de cualquier fuente adecuada. Asf, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de hibridomas preparados a partir de celulas B esplenicas murinas obtenidas de ratones inmunizados con un antfgeno de interes, por ejemplo en forma de celulas que expresan el antfgeno en la superficie, o un acido nucleico que codifica un antfgeno de interes. Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden obtener a partir de hibridomas derivados de celulas que expresan anticuerpos de seres humanos o mamfferos no humanos inmunizados, tales como ratas, conejos, perros, primates, etc.
En una realizacion, el anticuerpo de la invencion es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el factor tisular pueden generarse utilizando ratones transgenicos o transcromosomicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de raton. Tales ratones transgenicos y ratones transcromosomicos incluyen los ratones referidos en la presente memoria como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en la presente memoria "ratones transgenicos".
El raton HuMAb contiene miniloci de un gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena variable y constante pesada humana (p y y) y variable y constante ligera (k) no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena p y k endogenos (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859
(1994)). En consecuencia, los ratones muestran una reduccion de la expresion de IgM o k de raton y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos, se someten a cambio de clase y mutacion somatica para generar anticuerpos monoclonales IgG,k humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al .
(1994) , supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 1365-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546
(1995) ). La preparacion de ratones HuMAb se describe con detalle en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 29122920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Veanse tambien los documentos US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.
Los ratones HCo7 presentan una interrupcion JKD en sus genes de cadena ligera endogenos (kappa) (como
describen Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una interrupcion CMD en sus genes de la cadena pesada
endogenos (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgen de cadena ligera kappa humana KCo5 (como describen Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgen de cadena pesada humana HCo7 (como se describe en el documento US 5.770.429).
Los ratones HCo12 tienen una interrupcion JKD en sus genes de la cadena ligera endogenos (kappa) (como
describen Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una interrupcion CMD en sus genes de la cadena pesada
endogenos (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgen de la cadena ligera kappa humana KCo5 (como describen Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgen de la cadena pesada humana HCo12 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424).
En la cepa de raton KM, el gen de la cadena ligera kappa de raton endogeno ha sido interrumpido de manera homocigotica como describen Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) y el gen de la cadena pesada de raton
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endogeno se ha interrumpido de manera homocigotica como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de raton lleva un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como describen Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de raton tambien lleva un transcromosoma de la cadena pesada humana compuesto por el fragmento hCF del cromosoma 14 (SC20) como se describe en el documento WO 02/43478.
Los esplenocitos de estos ratones transgenicos se pueden utilizar para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con tecnicas bien conocidas. Los anticuerpos monoclonales o policlonales humanos de la presente invencion, o los anticuerpos de la presente invencion procedentes de otras especies tambien pueden ser generados transgenicamente mediante la generacion de otro mamffero no humano o planta que sean transgenicos para las secuencias de las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera de interes y la produccion del anticuerpo en una forma recuperable. En relacion con la produccion transgenica en mamfferos, los anticuerpos pueden ser producidos en, y recuperados de, la leche de cabras, vacas, u otros mamfferos. Veanse, por ejemplo, los documentos US 5.827.690, US 5.756.687, US 5.750.172 y US 5.741.957.
Ademas, los anticuerpos humanos de la presente invencion o los anticuerpos de la presente invencion de otras especies se pueden generar a traves de tecnologfas de tipo de presentacion, incluyendo, sin limitacion, la presentacion en fagos, la presentacion retroviral, la presentacion ribosomal, y otros mecanismos, utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica y las moleculas resultantes se pueden someter a maduracion adicional, tal como maduracion de afinidad, ya que tales mecanismos son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (presentacion en fagos), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309
(1996) (presentacion en fagos), Hanes y Plucthau, PNAS EE.UU. 94, desde 4.937 hasta 4.942 (1.997) (Visualizacion ribosomal), Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (presentacion en fagos), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), Y documento 5.733.743). Si se utilizan las tecnologfas de presentacion para producir anticuerpos que no son humanos, tales anticuerpos pueden ser humanizados.
El anticuerpo de la invencion puede ser de cualquier isotipo. La eleccion del isotipo normalmente estara orientada por las funciones efectoras deseadas, tales como la induccion de ADCC. Los isotipos ilustrativos son IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4. Se pueden utilizar regiones constantes de la cadena ligera, kappa o lambda. Si se desea, la clase de anticuerpo anti-TF de la presente invencion puede ser cambiada mediante metodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invencion que era originalmente IgM se puede cambiar de clase a un anticuerpo IgG de la presente invencion. Ademas, se pueden utilizar las tecnicas de cambio de clase para convertir una subclase IgG en otra, por ejemplo de IgG1 a IgG2. Asf, la funcion efectora de los anticuerpos de la presente invencion puede ser cambiada por medio de cambio de isotipo, por ejemplo, a un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM para diversos usos terapeuticos. En una realizacion un anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo IgG1, por ejemplo, una IgG1,K.
En una realizacion, el anticuerpo de la invencion es un anticuerpo completo, preferiblemente un anticuerpo IgG1, en particular, un anticuerpo IgG1,K. En otra realizacion, el anticuerpo de la invencion es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla.
Los fragmentos de anticuerpos pueden ser obtenidos, p. ej., por fragmentacion utilizando tecnicas convencionales, y los fragmentos pueden ser escrutados para determinar su utilidad de la misma manera que se describe en la presente memoria para los anticuerpos completos. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'. Los fragmentos Fab se pueden obtener mediante el tratamiento de un anticuerpo IgG con papafna; los fragmentos Fab' se pueden obtener con la digestion con pepsina de un anticuerpo IgG. Tambien se puede producir un fragmento F(ab') mediante la union de Fab' como se describe a continuacion a traves de un enlace tioeter o un enlace disulfuro. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo obtenido cortando un enlace disulfuro de la region bisagra del F(ab')2. Se puede obtener un fragmento Fab' por tratamiento de un fragmento F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. Tambien se puede generar un fragmento de anticuerpo por la expresion de acidos nucleicos que codifican tales fragmentos en celulas recombinantes (vease, por ejemplo Evans et al., J. Immunol. Meth. 184,123-38 (1995)). Por ejemplo, un gen quimerico que codifica una porcion de un fragmento F(ab')2 podrfa incluir secuencias de ADN que codificaran el dominio Ch1 y la region bisagra de la cadena H, seguido de un codon de parada de la traduccion para producir semejante molecula de fragmento de anticuerpo truncada.
En una realizacion, el anticuerpo anti-TF es un anticuerpo monovalente, preferiblemente un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 (Genmab) que tiene una delecion de la region bisagra. Por consiguiente, en una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monovalente, en donde dicho anticuerpo anti-TF se construye mediante un metodo que comprende:
i) proporcionar un constructo de acido nucleico que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo monovalente,
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comprendiendo dicho constructo una secuencia de nucleotidos que codifica la region VL de un anticuerpo anti- TF espedfico del antfgeno seleccionado y una secuencia de nucleotidos que codifica la region CL constante de una Ig, en donde dicha secuencia de nucleotidos que codifica la region VL de un anticuerpo espedfico del antfgeno seleccionado y dicha secuencia de nucleotidos que codifica la region CL de una Ig estan unidos operablemente entre sf, y en donde, en caso de un subtipo IgG1, la secuencia de nucleotidos que codifica la region CL se ha modificado de tal manera que la region CL no contiene aminoacidos capaces de formar enlaces disulfuro o enlaces covalentes con otros peptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos identica de la region CL en presencia de IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano;
ii) proporcionar un constructo de acido nucleico que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo monovalente, comprendiendo dicho constructo una secuencia de nucleotidos que codifica la region VH de un anticuerpo espedfico del antfgeno seleccionado y una secuencia de nucleotidos que codifica una region constante CH de una Ig humana, en donde la secuencia de nucleotidos que codifica la region CH se ha modificado de tal manera que la region correspondiente a la region bisagra y, segun se requiera por el subtipo de Ig, otras regiones de la region CH, tales como la region CH3, no comprende ningun residuo de aminoacido que participe en la formacion de enlaces disulfuro o enlaces covalentes o enlaces entre cadenas pesadas no covalentes estables con otros peptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos identica de la region CH de la Ig humana en presencia de IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano, en donde dicha secuencia de nucleotidos que codifica la region VH de un anticuerpo espedfico del antfgeno seleccionado y dicha secuencia de nucleotidos que codifica la region CH de dicha Ig estan unidos operablemente entre sf;
iii) proporcionar un sistema de expresion celular para la produccion de dicho anticuerpo monovalente;
iv) producir dicho anticuerpo monovalente mediante la expresion simultanea de los constructos de acido nucleico de (i) y (ii) en las celulas del sistema de expresion celular de (iii).
Del mismo modo, en una realizacion, el anticuerpo anti-TF es un anticuerpo monovalente, que comprende
(i) una region variable de un anticuerpo de la invencion como se describe en la presente memoria o una porcion de union al antfgeno de dicha region, y
(ii) una region Ch de una inmunoglobulina o un fragmento de la misma que comprende las regiones Ch2 y Ch3, en donde la region Ch o el fragmento de la misma se han modificado de tal manera que la region correspondiente a la region bisagra y, si la inmunoglobulina no es un subtipo IgG4, otras regiones de la region Ch, tal como la region Ch3, no comprende ningun residuo de aminoacido, que son capaces de formar enlaces disulfuro con una region Ch identica u otros enlaces entre cadenas pesadas covalentes o no covalentes estables con una region identica Ch en presencia de una IgG humana policlonal.
En una realizacion adicional, la cadena pesada del anticuerpo monovalente anti-TF se ha modificado de tal manera que toda la bisagra ha sido eliminada.
En una realizacion adicional, dicho anticuerpo monovalente es del subtipo IgG4 (vease el SEQ ID NO: 114, una variante sin bisagra del SEQ ID NO: 113), pero la region Ch3 ha sido modificada de modo que se han realizado una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos: la Thr (T) en la posicion 234 ha sido reemplazada por Ala (A); la Leu (L) en la posicion 236 ha sido reemplazada por Ala (A); la Leu (L) en la posicion 236 ha sido reemplazada por Val (V); la Phe (F) en la posicion 273 ha sido reemplazada por Ala (A); la Phe (F) en la posicion 273 ha sido reemplazada por Leu (L); la Tyr (Y) en la posicion 275 ha sido reemplazada por Ala (A).
En otra realizacion adicional, la secuencia de dicho anticuerpo monovalente ha sido modificada para que no comprenda sitios aceptores para la glicosilacion ligada a N.
Los anticuerpos anti-TF de la invencion tambien incluyen anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla son peptidos en los que se conectan las regiones Fv de cadena pesada y ligera. En una realizacion, la presente invencion proporciona un Fv de cadena sencilla (scFv) en donde las cadenas pesadas y ligeras en Fv de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion se unen con un conector peptfdico flexible (tfpicamente de aproximadamente 10, 12, 15 o mas residuos de aminoacidos) en una sola cadena peptfdica. Los metodos para producir tales anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos US 4.946.778, Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antiboides, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pags. 269315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) y McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si solo se utiliza una unica Vh y Vl, bivalente, si se utilizan dos Vh y Vl, o polivalente, si se utilizan mas de dos Vh y Vl.
En una realizacion, el anticuerpo anti-TF de la invencion es un anticuerpo de funcion efectora deficiente. Tales anticuerpos son particularmente utiles cuando el anticuerpo se utiliza en la estimulacion del sistema inmunitario a traves del bloqueo de los efectos inhibidores de TF. Para tales aplicaciones, puede ser ventajoso que el anticuerpo no tenga funciones efectoras, tales como ADCC, ya que pueden conducir a una citotoxicidad no deseada.
En una realizacion, el anticuerpo anti-TF de funcion efectora deficiente es un anticuerpo IgG4 estabilizado. Los
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ejemplos de los anticuerpos IgG4 estabilizados adecuados son anticuerpos, en donde la que arginina en la posicion 409 en una region constante de cadena pesada de IgG4 humana, que se indica en el fndice de EU como en Kabat et al., se sustituye por lisina, treonina, metionina o leucina, preferiblemente lisina (descrito en el documento WO2006033386 (Kirin)) y/o en donde la region bisagra comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys.
En una realizacion adicional. el anticuerpo IgG4 anti-TF estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una region constante de IgG4
humano que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posicion
correspondiente a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Val, Gly, Ile y Leu en la posicion correspondiente a 405, y en donde dicho anticuerpo comprende opcionalmente uno o mas sustituciones, deleciones y/o inserciones adicionales, pero no comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la region bisagra. Preferiblemente, dicho anticuerpo comprende un residuo Lys o Ala en la posicion correspondiente a 409 o la region CH3 del anticuerpo se ha reemplazado por la region CH3 de la IgG1 humana, de la IgG2 humana o de la IgG3 humana.
En una realizacion adicional mas, el anticuerpo anti-TF IgG4 estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una region constante de IgG4
humana que tiene un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posicion
correspondiente a 409 y/o un residuo seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Val, Gly, Ile y Leu en la posicion correspondiente a 405, y en donde dicho anticuerpo comprende opcionalmente una o mas sustituciones, deleciones y/o inserciones adicionales y en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys en la region bisagra. Preferiblemente, dicho anticuerpo comprende un residuo Lys o Ala en la posicion correspondiente a 409 o la region CH3 del anticuerpo se ha reemplazado por la region CH3 de la IgG1 humana, de la IgG2 humana o de la IgG3 humana.
En una realizacion adicional, el anticuerpo anti-TF con funcion efectora deficiente es un anticuerpo de un tipo distinto de IgG4, p. ej., IgG1, IgG2 o IgG3 que se ha mutado de tal manera que la capacidad de mediar funciones efectoras, tales como la ADCC, se ha reducido o incluso eliminado. Tales mutaciones, p. ej., han sido descritas por Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2): 1129-1138 (2006) y Hezareh M, J Virol.; 75 (24): 12161-12168 (2001).
En una realizacion adicional, el anticuerpo de la invencion se conjuga con otro radical, tal como un radical citotoxico, un radioisotopo o un farmaco. Tales anticuerpos pueden ser producidos por medio de conjugacion qufmica del otro radical al lado N-terminal o al lado C-terminal del anticuerpo anti-TF o fragmento del mismo (p. ej., una cadena H de anticuerpo anti-TF, una cadena L, o un fragmento especffico/selectivo anti-TF del mismo) (vease, p. ej., Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Tales derivados de anticuerpos conjugados tambien se pueden generar mediante conjugacion en los residuos internos o azucares, cuando sea apropiado.
En general, los anticuerpos anti-TF descritos en la presente memoria pueden ser modificados mediante la inclusion de cualquier numero adecuado de tales aminoacidos modificados y/o asociaciones con tales sustituyentes conjugados. La idoneidad en este contexto se determina generalmente por la capacidad para conservar al menos sustancialmente la selectividad y/o la especificidad para TF asociadas con el anticuerpo parental anti-TF no derivatizado. La inclusion de uno o mas aminoacidos modificados puede ser ventajosa, por ejemplo, para el aumento de la semivida en suero del polipeptido, la reduccion de la antigenicidad del polipeptido, o el aumento de la estabilidad de almacenamiento del polipeptido. Los aminoacidos son modificados, por ejemplo, co-traduccionalmente o post-traduccionalmente durante la produccion recombinante (p. ej., glicosilacion ligada a N en los motivos N-X-S/T durante la expresion en celulas de mamffero) o modificados por medios sinteticos. Los ejemplos no limitantes de un aminoacido modificado incluyen un aminoacido glicosilado, un aminoacido sulfatado, un aminoacido prenilado (p. ej., farnesilado, geranilgeranilado), un aminoacido acetilado, un aminoacido acilado, un aminoacido PEGilado, un aminoacido biotinilado, un aminoacido carboxilado y un aminoacido fosforilado. La bibliograffa esta repleta de referencias adecuadas para orientar a un experto en la modificacion de los aminoacidos. Se encuentran protocolos ilustrativos en Walker (1998) Protein Protocols On Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ. El aminoacido modificado puede ser seleccionado por ejemplo entre un aminoacido glicosilado, un aminoacido PEGilado, un aminoacido farnesilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado, un aminoacido conjugado con un radical lipfdico, o un aminoacido conjugado con un agente derivatizante organico.
Los anticuerpos anti-TF tambien se pueden modificar qufmicamente por conjugacion covalente con un polfmero para aumentar, por ejemplo, su semivida en circulacion. Los polfmeros ilustrativos, y los metodos para el anclaje a peptidos, se ilustran, por ejemplo, en los documentos US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 y US 4.609.546. Otros polfmeros ilustrativos adicionales incluyen polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (p. ej., un PEG con un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 40.000, tal como entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 20.000, por ejemplo, aproximadamente 3.000-12.000 g/mol).
En una realizacion, la presente invencion proporciona un anticuerpo anti-TF que esta conjugado con una segunda
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molecula que se selecciona entre un radionuclido, un sustrato de enzima, un cofactor, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, una etiqueta pepridica, o una partmula magnetica. En una realizacion, se puede conjugar un anticuerpo anti-TF con uno o mas fragmentos de anticuerpo, acidos nucleicos (oligonucleotidos), nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos y colorantes. Estos y otros agentes adecuados se pueden acoplar ya sea directamente ya sea indirectamente a un anticuerpo anti-TF de la presente invencion. Un ejemplo de acoplamiento indirecto de un segundo agente es el acoplamiento por un radical espaciador. Estos espaciadores, a su vez, pueden ser insolubles o solubles (vease, por ejemplo, Diener et al., Science 231, 148 (1986)) y se pueden seleccionar para permitir la liberacion del farmaco del anticuerpo anti-TF en un sitio diana y/o bajo condiciones particulares. Los ejemplos adicionales de agentes que pueden ser acoplados a un anticuerpo anti-TF incluyen lectinas y peptidos fluorescentes.
En una realizacion, se proporcionan anticuerpos anti-TF que comprenden uno o mas aminoacidos radiomarcados. Un anticuerpo anti-TF radiomarcado puede ser utilizado tanto para fines de diagnostico como terapeuticos (la conjugacion con moleculas radiomarcadas es otra caracteristica posible). Los ejemplos no limitantes de marcas para polipeptidos incluyen, pero no se limitan a 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, y 125I, 131I, y 186Re. Los metodos para preparar los aminoacidos radiomarcados y derivados de peptidos relacionados son conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, Junghans et al., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edicion, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y los documentos US 4.681.581, US 4.735.210, US 5.101.827, US 5.102.990 (US RE35,500), US 5.648.471 y US 5.697.902. Por ejemplo, un radioisotopo puede ser conjugado mediante el metodo de la cloramina T.
En una realizacion, un anticuerpo anti-TF de la invencion comprende un acido nucleico conjugado o una molecula asociada a un acido nucleico. En una de tales facetas de la presente invencion, el acido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotoxica. En una realizacion, el acido nucleico conjugado es un acido nucleico antisentido (por ejemplo, una molecula antisentido dirigida a S100A10, que tambien puede ser un componente independiente en una composicion combinada o un metodo de administracion combinado de la presente invencion - vease, por ejemplo Zhang et al., J Biol Chem. 279(3), 2053-62 (2004)). En una realizacion, el acido nucleico conjugado es una molecula de ARN inhibidora (p. ej., una molecula de ARNip). En una realizacion, el acido nucleico conjugado es un acido nucleico inmunoestimulador (p. ej., una molecula de ADN que contiene un motivo CpG inmunoestimulador). En una realizacion, el acido nucleico conjugado es un casete de expresion que codifica la expresion de un gen supresor de tumor, una vacuna contra el cancer, una citoquina anti-cancerosa, o un agente apoptotico. Tales derivados pueden comprender tambien la conjugacion de un acido nucleico que codifica la expresion de una o mas protemas citotoxicas, tales como toxinas vegetales y bacterianas.
En una realizacion, un anticuerpo anti-TF se conjuga con una molecula de acido nucleico funcional. Los acidos nucleicos funcionales incluyen moleculas antisentido, moleculas de acido nucleico de interferencia (p. ej., moleculas de ARNip), aptameros, ribozimas, moleculas que forman triplex, y secuencias grna externas. Las moleculas de acido nucleico funcionales pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores, y estimuladores de una actividad espedfica posefda por una molecula diana, o las moleculas de acido nucleico funcionales pueden poseer una actividad de novo independiente de cualquier otra molecula.
En otra realizacion, un anticuerpo anti-TF de la invencion se conjuga con un aptamero.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona un anticuerpo anti-TF que se conjuga con una ribozima.
Se puede emplear cualquier metodo conocido en la tecnica para conjugar el anticuerpo anti-TF a la molecula o las moleculas conjugadas, tales como los descritos anteriormente, incluyendo aquellos metodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Se pueden unir numerosos tipos de compuestos citotoxicos a las protemas mediante el uso de un grupo reactivo en el compuesto citotoxico o mediante el uso de un agente de entrecruzamiento. Un grupo reactivo comun que formara un enlace covalente estable in vivo con una amina es el isotiocianato (Means et al., Chemical modifications of proteins (Holden-Day, San Francisco 1971) pags. 105-110). Este grupo reacciona preferiblemente con el grupo £-amino de la lisina. La maleimida es un grupo reactivo utilizado comunmente para formar un enlace covalente estable in vivo con el grupo sulfhidrilo de la cistema (Ji., Methods Enzymol 91, 580-609 (1983)). Los anticuerpos monoclonales normalmente no son capaces de formar enlaces covalentes con los iones de metales radiactivos, pero se pueden anclar al anticuerpo indirectamente a traves del uso de agentes quelantes que estan unidos covalentemente a los anticuerpos. Los agentes quelantes pueden estar unidos a traves de aminas (Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) y grupos sulfhidral (Koyama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)) de residuos de aminoacidos y tambien a traves de los grupos carbohidrato (Rodwell et al., PNAS USA 83, 2632-2636 (1986), Quadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)). Dado que estos agentes quelantes contienen dos tipos de grupos funcionales, uno para unirse a iones metalicos y el otro para unir el quelato al anticuerpo, son referidos comunmente como agentes quelantes bifuncionales (Sundberg et al., Nature 250, 587588 (1974)).
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En una realizacion, la presente invencion proporciona un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF humano, conjugado con un radical terapeutico, tal como una citotoxina, un farmaco quimioterapeutico, un inmunosupresor, o un radioisotopo. Tales productos conjugados se denominan en la presente memoria "productos inmunoconjugados". Los productos inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas se conocen como "inmunotoxinas".
Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial (p. ej., destruye) para las celulas. Para una descripcion de estas clases de farmacos que son bien conocidos en la tecnica, y sus mecanismos de accion, vease Goodman et al., Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Ed., Macmillan Publishing Co., 1990. Otras tecnicas relevantes para la preparacion de inmunotoxinas de anticuerpos son proporcionadas, por ejemplo, por Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) y en el documento US 5.194.594.
Los agentes terapeuticos adecuados para la formacion de productos inmunoconjugados de la presente invencion incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidro-testosterona, glucocorticoides, procafna, tetracafna, lidocafna, propranolol, y puromicina, antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, descarbazina, hidroxiurea, asparraginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, tales como carboplatino), antibioticos (tales como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), toxina de la difteria y moleculas relacionadas (tales como la cadena A de la difteria y activos fragmentos de la misma y las moleculas hfbridas), la toxina ricina (tal como ricina A o una toxina de cadena A de ricina desglicosilada), toxina del colera, una toxina similar a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina de pertussis, toxina del tetanos, inhibidor de la proteasa Bowman-Birk de la soja, exotoxina de Pseudomonas, alorin, saporina, modecina, gelanina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, protefnas de Aleurites fordii, protefnas de diantina, protefnas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y toxinas de enomicina. Otras moleculas conjugadas adecuadas incluyen ribonucleasa (ARNasa), ADNasa I, enterotoxina A estafilococica, protefna antiviral de hierba carmfn, toxina difterina, y endotoxina de Pseudomonas. Veanse, por ejemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) y Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Los agentes terapeuticos, que se pueden administrar combinados con un anticuerpo anti-TF de la presente invencion como se describe en la presente memoria en otra parte, tambien pueden ser candidatos para radicales terapeuticos utiles para la conjugacion a un anticuerpo anti-TF de la presente invencion.
En una realizacion, el anticuerpo anti-TF de la presente invencion esta unido a un conector quelante, p. ej., tiuxetano, lo que permite que el anticuerpo se conjugue con un radioisotopo.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a una molecula biespecffica que comprende un anticuerpo anti-TF de la invencion como se describe anteriormente en la presente memoria y una segunda especificidad de union tal como una especificidad de union para una celula efectora humana, un receptor de Fc humano o un receptor de celulas T . O una especificidad de union para otro epftopo de TF.
Las moleculas biespecfficas de la presente invencion pueden incluir ademas una tercera especificidad de union, ademas de una especificidad de union anti-TF y una especificidad de union para una celula efectora humana, un receptor de Fc humano o un receptor de celulas T.
Las moleculas de anticuerpos biespecfficos ilustrativos de la invencion comprenden (i) dos anticuerpos uno con una especificidad para TF y otro para una segunda diana que se conjugan entre si, (ii) un unico anticuerpo que tiene una cadena especffica para TF y una segunda cadena especffica para una segunda molecula, y (iii) un anticuerpo de cadena sencilla que tiene especificidad para TF y una segunda molecula. Normalmente, la segunda diana/segunda molecula es una molecula distinta de TF. En una realizacion, la segunda molecula es un antfgeno de cancer/antfgeno asociado a un tumor, tales como el antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno especffico de prostata (PSA), RAGE (antfgeno renal), a-fetoprotefna, CAMEL (antfgeno reconocido por CTL de melanoma), antfgenos CT (tales como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3 y D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, y SAGE), antfgenos de mucina (p. ej., MUC1, mucina-CA125, etc.), antfgenos gangliosidos, tirosinasa, gp75, C-myc, Mart1, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, y Ep-CAM. En una realizacion, la segunda molecula es una integrina asociada a cancer, tal como la integrina a5p3. En una realizacion, la segunda molecula es un factor angiogenico o otro factor de crecimiento asociado al cancer, tal como un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), receptor del factor de crecimiento epidermico ( EGFR), angiogenina, y los receptores de los mismos, particularmente los receptores asociados con la progresion del cancer (por ejemplo, uno de los receptores de HER1-HER4, c-met o RON). Otras protefnas asociadas a la progresion del cancer comentadas en la presente memoria tambien pueden ser segundas moleculas adecuadas.
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En una realizacion, el anticuerpo biespecffico de la presente invencion es un diacuerpo. Los anticuerpos biespecfficos tambien incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos de un producto heteroconjugado puede estar acoplado a avidina y el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos para dirigirse a las celulas diana del sistema inmunitario no deseadas (vease, por ejemplo el documento US 4.676.980). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar utilizando cualquier metodo de entrecruzamiento conveniente.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un vector de expresion que codifica un anticuerpo de la invencion.
En una realizacion, el vector de expresion de la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de las secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 1 a 112.
En otra realizacion concreta, el vector de expresion de la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de las secuencias de aminoacidos de VH seleccionadas del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 y 53.
En una realizacion concreta, el vector de expresion de la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de las secuencias de aminoacidos CDR3 de VH seleccionadas del grupo que consiste en: los SEQ ID NO 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 y 56.
En otra realizacion particular, el vector de expresion de la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de las secuencias de aminoacidos de VL seleccionadas del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 y 105.
En otra realizacion, el vector de expresion de la invencion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de las secuencias de aminoacidos de CDR3 de VL seleccionadas del grupo que consiste en: los SEQ ID NO: 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104 y 108.
En una realizacion concreta, el vector de expresion de la invencion, comprende una secuencia de nucleotidos que codifica variantes de una o mas de las secuencias de aminoacidos anteriores, teniendo dichas variantes a lo sumo 25 modificaciones de aminoacidos, tal como 20, tal como a lo sumo 15, 14, 13 , 12 u 11 modificaciones de aminoacidos, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, tales como deleciones o inserciones, preferiblemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas o una identidad de al menos 80% con cualquiera de dichas secuencias, tal como una identidad de al menos 85% o una identidad de 90% o una identidad de 95%, tal como una identidad de 96% o una identidad de 97% o una identidad de 98% o una identidad de 99% con cualquiera de las secuencias de aminoacidos mencionadas anteriormente.
En una realizacion adicional, el vector de expresion comprende adicionalmente una secuencia de nucleotidos que codifica la region constante de una cadena ligera, una cadena pesada o ambas cadenas ligera y pesada de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo humano.
Tales vectores de expresion se pueden utilizar para la produccion recombinante de anticuerpos de la invencion.
Un vector de expresion en el contexto de la presente invencion puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo vectores cromosomicos, no cromosomicos, y de acidos nucleicos sinteticos (una secuencia de acido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de la expresion). Los ejemplos de tales vectores incluyen derivados de SV40, plasmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plasmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fagos, y vectores de acido nucleico viral (ARN o ADN). En una realizacion, un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-TF esta incluido en un vector de ADN o ARN desnudo, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresion lineal (como describen, por ejemplo, Sykes y Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), un vector de acido nucleico compactado (como se describe, por ejemplo, en los documentos US 6.077.835 y/o wO 00/70087), un vector plasmfdico tal como pBR322, pUC 19/18, o pUC 118/119, un vector de acido nucleico de tamano mfnimo "MIDGE" (como describen, por ejemplo, Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), o como un constructo de vector de acido nucleico precipitado, tal como un constructo precipitado CaPO4 (como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tales vectores de acido nucleico y el uso de los mismos son bien conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos US 5.589.466 y US 5.973.972).
En una realizacion, el vector es adecuado para la expresion del anticuerpo anti-TF en una celula bacteriana. Los ejemplos de tales vectores incluyen vectores de expresion tales como BlueScript (Stratagene), vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989). vectores pET (Novagen, Madison, WI).
Un vector de expresion puede ser tambien o alternativamente un vector adecuado para la expresion en un sistema de levadura. Se puede emplear cualquier vector adecuado para la expresion en un sistema de levadura. Los vectores
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adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y pGh (revisado en: F. Ausubel et al., Ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley InterScience Nueva York (1987), y Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
Un acido nucleico y/o vector puede tambien comprender una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de secrecion/localizacion, que puede dirigirse a un polipeptido, tal como una cadena polipeptfdica naciente, al espacio periplasmico o al medio de cultivo celular. Tales secuencias son conocidas en la tecnica, e incluyen el lfder de secrecion o peptidos senal, secuencias de direccionamiento de organulos (p. ej., secuencias de localizacion nuclear, senales de retencion ER, secuencias de transito mitocondrial, secuencias de transito del cloroplasto) y secuencias de localizacion/anclaje de la membrana (p. ej., secuencias de detencion de la transferencia ("stop-transfer sequences"), secuencias de anclaje GPI).
En un vector de expresion de la invencion, los acidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-TF pueden incluir o estar asociados con cualquier promotor adecuado, potenciador, y otros elementos que faciliten la expresion. Los ejemplos de tales elementos incluyen promotores fuertes de la expresion (p. ej., promotor/potenciador de IE de CMV humano, asf como promotores de RSV, SV40, SL3-3, MMTV, y LTR de VlH), secuencias de terminacion poli (A) eficaces, un origen de replicacion para el plasmido producto en E. coli, un gen de resistencia a antibioticos como marcador seleccionable, y/o un sitio de clonacion conveniente (p. ej., un poliligador). Los acidos nucleicos tambien pueden comprender un promotor inducible en lugar de un promotor constitutivo tal como IE de CMV (el experto en la tecnica reconocera que tales terminos son en realidad descriptores de un grado de expresion de los genes en ciertas condiciones).
En una realizacion, el vector de expresion que codifica un anticuerpo anti-TF puede ser colocado y/o suministrado a la celula anfitriona o animal anfitrion a traves de un vector viral.
En un aspecto adicional mas, la invencion se refiere a una celula anfitriona eucariota o procariota recombinante, tal como un transfectoma, que produce un anticuerpo de la invencion como se define en la presente memoria o una molecula biespecffica de la invencion como se define en la presente memoria. Los ejemplos de celulas anfitrionas incluyen levaduras, bacterias y celulas de mamfferos, tales como celulas CHO o hEk. Por ejemplo, en una realizacion, la presente invencion proporciona una celula que comprende un acido nucleico integrado de forma estable en el genoma celular que comprende una secuencia que codifica la expresion de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion. En otra realizacion, la presente invencion proporciona una celula que comprende un acido nucleico no integrado, tal como un plasmido, cosmido, fagemido, o elemento de expresion lineal, que comprende una secuencia que codifica la expresion de un anticuerpo anti-TF de la invencion.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo de la invencion como se define en la presente memoria. En un aspecto adicional mas, la invencion se refiere a un animal no humano transgenico que comprende acidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, en donde el animal o planta producen un anticuerpo de la invencion de la invencion. La generacion de tales hibridomas y animales transgenicos se ha descrito anteriormente.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo anti-TF de la invencion, comprendiendo dicho metodo las etapas de
a) cultivar un hibridoma o una celula anfitriona de la invencion como se ha descrito en la presente memoria anteriormente, y
b) purificar el anticuerpo de la invencion a partir de los medios de cultivo.
En un aspecto principal adicional, la invencion se refiere a un anticuerpo anti-TF como se ha definido en la presente memoria o una molecula biespecffica como se ha definido en la presente memoria para su uso como un medicamento.
En un aspecto adicional mas, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende:
- un anticuerpo anti-TF como se define en la presente memoria o una molecula biespecffica como se define en la presente memoria, y
- un portador farmaceuticamente aceptable.
Las composiciones farmaceuticas se pueden formular con portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables, asf como cualquier otro adyuvante y excipiente conocido de acuerdo con tecnicas convencionales tales como las descritos en Remington: The Science and the Practice of Pharmacy, 19a Edicion, Gennaro, Ed, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
Los portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables asf como cualquier otro adyuvante y excipiente conocido deben ser adecuados para el compuesto seleccionado de la presente invencion y el modo de administracion elegida.
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La idoneidad para los portadores y otros componentes de las composiciones farmaceuticas se determina basandose en la ausencia de impacto negativo significativo sobre las propiedades biologicas deseadas del compuesto o composicion farmaceutica elegidos de la presente invencion (p. ej., un impacto menos que sustancial (inhibicion relativa de 10% o menos, inhibicion relativa de 5% o menos, etc.)) sobre la union al antfgeno.
Una composicion farmaceutica de la presente invencion puede incluir tambien diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (p. ej., un detergente no ionico, tal como Tween-20 o Tween-80), estabilizadores (p. ej., azucares o aminoacidos libres de protefnas), conservantes, agentes de fijacion de tejidos, solubilizantes, y/u otros materiales adecuados para su inclusion en una composicion farmaceutica.
Se ha informado de que en las celulas cancerosas, tales como celulas de cancer colorrectal humano, la expresion de TF esta bajo control de 2 grandes eventos de transformacion que conducen a la progresion de la enfermedad (la activacion del oncogen K-ras y la inactivacion del supresor de tumores p53), de una manera dependiente de MEK/protefna quinasa activada por mitogeno (MAPK) y fosfatidilinositol 3'-quinasa (PI3K) (Yu et al. (2005) Blood 105: 1734.
Las celulas cancerosas que expresan en exceso TF pueden ser dianas particularmente buenas para los anticuerpos anti-TF de la invencion, ya que se pueden unir mas anticuerpos por celula. Por lo tanto, en una realizacion, el paciente de cancer que va a ser tratado con un anticuerpo anti-TF de la invencion es un paciente, p. ej., un paciente con cancer de pancreas, cancer de pulmon o cancer colorrectal que se ha diagnosticado que tiene una o mas mutaciones en K-Ras y/o una o mas mutaciones en p53 en sus celulas tumorales.
En una realizacion alternativa, el paciente que va a ser tratado con un anticuerpo anti-TF de la invencion es un paciente, p. ej., un paciente con cancer de pancreas, cancer de pulmon o cancer colorrectal, que no tiene una mutacion en K-Ras. Sin estar limitado por ninguna teorfa especffica, es posible que algunas celulas tumorales que tienen la activacion de K-Ras sean menos susceptibles de tratamiento con el anticuerpo anti-TF, debido a que los efectos de los anticuerpos anti-TF sobre los mecanismos de senalizacion intracelular pueden ser menos eficaces en celulas en las que K-Ras esta activado.
Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden variarse con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente en particular, la composicion y el modo de administracion, sin que sean toxicos para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleadas, o la amida de las mismas, la via de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de excrecion del compuesto particular que esta siendo empleado, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados combinados con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general e el historial medico previo del paciente que esta siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas.
La composicion farmaceutica se puede administrar por cualquier via y modo adecuados. Las vfas adecuadas de administracion de un compuesto de la presente invencion in vivo e in vitro son bien conocidos en la tecnica y pueden ser seleccionadas por los expertos ordinarios en la tecnica.
En una realizacion, una composicion farmaceutica de la presente invencion se administra parenteralmente.
Las expresiones "administracion parenteral" y "administrado parenteralmente" segun se utilizan en la presente memoria significan modos de administracion distintos de la administracion enteral y topica, normalmente por medio de inyeccion, e incluyen la inyeccion e infusion epidermica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardfaca, intradermica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratoracica, epidural e intraesternal.
En una realizacion esa composicion farmaceutica se administra por inyeccion o infusion intravenosa o subcutanea.
Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes de isotonicidad, antioxidantes y agentes retardadores de la absorcion adecuados que son fisiologicamente compatibles con un compuesto de la presente invencion.
Los ejemplos de los portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion incluyen agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, aceite de mafz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, y aceite de sesamo, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa, goma de tragacanto y esteres organicos inyectables, tales
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como oleato de etilo, y/o diversos tampones. Otros portadores son bien conocidos en las tecnicas farmaceuticas.
Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion.
La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden comprender antioxidantes farmaceuticamente aceptables, por ejemplo (1) antioxidantes soluble en agua, tales como acido ascorbico, hidrocloruro de cistefna, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol; y (3) agentes quelantes de metales, tales como acido cftrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico y acido fosforico.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden comprender agentes de isotonicidad, tales como azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro sodico en las composiciones.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden contener uno o mas coadyuvantes apropiados para la via de administracion elegida, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes, conservantes o tampones, que pueden mejorar la vida util o la eficacia de la composicion farmaceutica. Los compuestos de la presente invencion se pueden preparar con portadores que protegeran el compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Tales portadores pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilvinilacetato, polianhfdridos, poli(acido glicolico), colageno, poliortoesteres, y poli(acido lactico) solos o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la tecnica. Los metodos para la preparacion de tales formulaciones son generalmente conocidos para los expertos en la tecnica. Vease, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En una realizacion, los compuestos de la presente invencion se pueden formular para asegurar la distribucion adecuada in vivo. Los portadores farmaceuticamente aceptables para la administracion parenteral incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion. Tambien se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos complementarios.
Las composiciones farmaceuticas para inyectables tfpicamente deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion acuoso o no acuoso que contiene por ejemplo agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como glicerol, manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composicion. Se puede ocasionar una absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes, por ejemplo, como se especifica anteriormente, segun se requiera, seguido de microfiltracion de esterilizacion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un portador esteril que contiene un medio de dispersion alcalino y los otros ingredientes requeridos, por ejemplo, de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los ejemplos de los metodos de preparacion son secado al vacfo y secado por congelacion (liofilizacion) que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion previamente esterilizada por filtracion de la misma.
Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida a un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de microfiltracion de esterilizacion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto
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activo a un portador esteril que contiene un medio de dispersion alcalino y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los ejemplos de los metodos de preparacion son secado al vacfo y secado por congelacion (liofilizacion) que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion de la misma.
La composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener un compuesto de la presente invencion o una combinacion de compuestos de la presente invencion.
Como se describio anteriormente, en otro aspecto, la invencion se refiere al anticuerpo de la invencion como se define en la presente memoria o una molecula biespecffica de la invencion tal como se define en la presente memoria para su uso como medicamento.
Los anticuerpos anti-TF de la invencion pueden ser utilizados para una serie de propositos. En particular, los anticuerpos de la invencion se pueden utilizar para el tratamiento de diversas formas de cancer. En un aspecto, los anticuerpos monoclonales anti-TF de la invencion se utilizan para el tratamiento de diversos tipos de cancer solido tales como: tumores del sistema nervioso central, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon (tal como cancer de pulmon de celulas no pequenas), cancer de mama, cancer de esofago, cancer de estomago, el cancer de hfgado y vesfcula biliar, cancer pancreatico, cancer colorrectal, cancer de vejiga, cancer de rinon, cancer de prostata, cancer endometrial, cancer ovarico, melanoma maligno, sarcoma (tejido blando, p. ej., hueso y musculo), tumores primarios de origen desconocido (es decir primarios desconocidos), leucemia, cancer de la medula osea (tal como mieloma multiple), leucemia linfoblastica aguda, leucemia linfoblastica cronica y linfoma no Hodgkin, cancer de piel, glioma, cancer de cerebro, utero, y recto.
Se pueden elegir otras inflamaciones autoinmunitarias, tales como las miopatfas o la esclerosis multiple con los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de la hemostasis.
Tambien se pueden elegir como diana trastornos hemostaticos relacionados con el cancer con la presente intervencion.
Se pueden elegir como diana otras enfermedades con inflamacion, tales como las miopatfas, la artritis reumatoide, la osteoartritis, la espondilitis anquilosante, la gota, la espondilartropatfas, la espondilitis anquilosante, el sfndrome de Reiter, la artropatfa psoriasica, la espondilitis enteropatica, la artropatfa juvenil, la artropatfa reactiva, la artritis infecciosa o post-infecciosa, la artritis tuberculosa, la artritis viral, la artritis fungica, la artritis sifilftica, la glomerulonefritis, la enfermedad renal en fase terminal, el lupus eritematoso sistemico, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la enfermedad inflamatoria intestinal, la fibrosis qufstica, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), el asma, el asma alergica, la bronquitis, la bronquiolitis aguda, la bronquiolitis cronica, la fibrosis pulmonar idiopatica, o la esclerosis multiple con los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de hemostasis.
Tambien se pueden elegir como diana trastornos hemostaticos relacionados con el cancer con la presente intervencion.
Tambien se pueden tratar con los anticuerpos monoclonales anti-TF las enfermedades vasculares tales como la restenosis vascular, la enfermedad vascular de miocardio, la enfermedad vascular cerebral, la retinopatfa y la degeneracion macular, incluyendo, pero no limitada la DMAE humeda.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de pacientes con riesgo cardiovascular, tales como la aterosclerosis, la hipertension, la diabetes, la dislipidemia y el sfndrome coronario agudo, incluyendo, pero no limitado a, infarto agudo de miocardio, accidente cerebrovascular.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para la inhibicion de la trombosis, tales como la trombosis venosa profunda, la embolia renal, la embolia pulmonar, la trombosis arterial, o para tratar trombosis que se produce despues de la cirugfa arterial, los injertos de bypass vascular periferica o los injertos de bypass de la arteria coronaria, las derivaciones arterio-venosas, la eliminacion de una aplicacion, tal como un dispositivo intraluminal o un cateter.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para la inhibicion de la lesion por reperfusion isquemica renal.
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Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de la hiperlipoproteinemia, el hiperparatiroidismo.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de la vasculitis, la vasculitis ANCA-positiva, la enfermedad de Behcet.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el bloqueo de la insuficiencia respiratoria inducida por trauma, tal como el sfndrome de insuficiencia respiratoria aguda, la lesion pulmonar aguda.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para bloquear la disfuncion organica inducida por infeccion, tales como la insuficiencia renal, el sfndrome de insuficiencia respiratoria aguda, la lesion pulmonar aguda.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para tratar diversos trastornos tromboembolicos tales como los derivados de la angioplastia, el infarto de miocardio, la angina inestable y la estenosis de la arteria coronaria.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles en un entorno profilactico para tratar las complicaciones mediadas por Tf de infecciones sistemicas, tales como la sepsis o la neumonfa.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles como tratamiento profilactico de los pacientes con vasos ateroscleroticos en riesgo de trombosis.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra anfitrion.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para aumentar el injerto de celulas beta en el trasplante de islotes, para prevenir la vasculopatfa del injerto cardiaco (CAV), para prevenir el rechazo agudo del injerto.
Los anticuerpos monoclonales anti-TF de la presente invencion tambien pueden ser utiles para el tratamiento de enfermedades en las que se encuentran presentes micropartfculas que se exponen al factor tisular circulante, tales como, pero no limitadas a la trombosis vascular, la diabetes de tipo II, AMI, la hipertension arterial pulmonar
Del mismo modo, la invencion se refiere a un metodo para inhibir el crecimiento y/o proliferacion de una celula de tumor que expresa TF, que comprende la administracion, a un individuo que lo necesita, de un anticuerpo o una molecula biespecffica de la invencion. En una realizacion, dicha celula tumoral esta implicada en el cancer, tal como cancer de prostata, cancer de pulmon (tal como cancer de pulmon de celulas no pequenas), cancer de mama, cancer colorrectal (tal como cancer colorrectal metastasico), cancer de pancreas, cancer endometrial, cancer de ovario, melanoma cutaneo, leucemia, cancer de medula osea (tal como mieloma multiple), leucemia linfoblastica aguda, leucemia linfoblastica cronica y linfoma no Hodgkin, cancer de piel, cancer de prostata, glioma, cancer de cerebro, rinones, utero, vejiga y recto.
Asimismo, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal que se une a TF humano para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer, tal como una de las indicaciones para canceres especfficos mencionadas anteriormente.
En una realizacion, la seleccion de los pacientes que van a ser tratados con el anticuerpo anti-TF se basa en el nivel de factor tisular (TF) en la orina y/o sangre. En una realizacion concreta, el paciente que va a ser tratado tiene un nivel relativamente alto de TF en la orina y/o sangre. Por ejemplo, el paciente que se va a tratar puede tener un nivel de TF en la orina de mas de 20 ng/mL, tal como mas de 40 ng/mL. p.ej. mas de 100 ng/mL, tal como mas de 200 ng/mL. Alternativamente, o ademas, el nivel de TF en el suero de los pacientes puede ser de mas de 100 pg/mL, tal como mas de 200 pg/mL. Esto se puede determinar, por ejemplo, utilizando un ELISA.
En una realizacion adicional de los metodos de tratamiento de la presente invencion, la eficacia del tratamiento esta siendo controlada durante la terapia, p. ej., en puntos temporales definidos previamente. En una realizacion, la eficacia se puede controlar midiendo el nivel de TF en la orina o sangre, por ejemplo, por medio de ELISA. En otra realizacion, la eficacia se puede determinar mediante la visualizacion de la zona de la enfermedad, p. ej., mediante la realizacion de una o mas exploraciones PET-CT, por ejemplo usando un anticuerpo anti-TF marcado, tal como un anticuerpo anti-TF marcado de la presente invencion. Ademas, los anticuerpos anti-TF marcados, tales como los anticuerpos anti-TF marcados de la invencion, se podrfan utilizar para detectar tumores productores de TF p. ej., utilizando una exploracion PET-CT.
Los regfmenes de dosificacion en los metodos de tratamiento y los usos anteriores se ajustan para proporcionar la respuesta optima deseada (p. ej., una respuesta terapeutica). Por ejemplo, se puede administrar un unico bolo, se
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pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o se puede reducir o aumentar la dosis proporcionalmente segun indiquen las exigencias de la situacion terapeutica. Las composiciones parenterales se pueden formular en formas de dosificacion unitarias para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. Forma de dosificacion unitaria tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificacion de la presente invencion estan dictadas por y dependen directamente de (a) las caracterfsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular que se vaya a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de la composicion de semejante compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Las dosificaciones eficaces y los regfmenes de dosificacion para los anticuerpos anti-TF dependen de la enfermedad o afeccion que se vaya a tratar y pueden ser determinadas por los expertos en la tecnica. Un intervalo no limitante, ilustrativo para una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion es de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg, tal como aproximadamente de 0,1 a 50 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg, tal como aproximadamente de 0,1-10 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,3, tal como aproximadamente 1, o aproximadamente 3 mg/kg.
Un medico o veterinario experto en la tecnica puede determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composicion farmaceutica requerida. Por ejemplo, el medico o veterinario podrfa comenzar con dosis de anticuerpo anti-TF empleado en la composicion farmaceutica a niveles mas bajos que los requeridos con el fin de lograr el efecto terapeutico deseado e incrementar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composicion de la presente invencion sera aquella cantidad del compuesto que es la dosis mas baja eficaz para producir un efecto terapeutico. Tal dosis eficaz dependera generalmente de los factores descritos anteriormente. La administracion puede ser, p. ej., intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutanea, y por ejemplo se administra proxima al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composicion farmaceutica se puede administrar en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado a intervalos apropiados durante todo el dfa, opcionalmente, en formas de dosificacion unitarias. Mientras sea posible administrar solo un compuesto de la presente invencion, es preferible administrar el compuesto en forma de una composicion farmaceutica como se ha descrito anteriormente.
En una realizacion, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por infusion en una dosis semanal de 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Dicha administracion se puede repetir, p. ej., de 1 a 8 veces, tal como 3 a 5 veces. La administracion se puede realizar por infusion continua durante un perfodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas.
En una realizacion, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por infusion continua lenta durante un largo perfodo de tiempo, tal como mas de 24 horas, con el fin de reducir los efectos secundarios toxicos.
En una realizacion, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar a una dosis semanal de entre 250 mg y 2000 mg, tal como por ejemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, durante un maximo de 8 veces, tal como de 4 a 6 veces. La administracion se puede realizar por infusion continua durante un perfodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Semejante regimen se puede repetir una o mas veces segun sea necesario, por ejemplo, despues de 6 meses o 12 meses. La dosificacion se puede determinar o ajustar midiendo la cantidad de compuesto de la presente invencion en la sangre despues de la administracion, por ejemplo, sacando una muestra biologica y utilizando anticuerpos anti-idiotfpicos que dirigen la region de union al antfgeno de los anticuerpos anti-TF de la presente invencion.
En una realizacion, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar por terapia de mantenimiento, tal como, p. ej., una vez a la semana durante un perfodo de 6 meses o mas.
En una realizacion, los anticuerpos anti-TF se pueden administrar mediante un regimen que incluye una infusion de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion seguido de una infusion de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion conjugado con un radioisotopo. El regimen se puede repetir, por ejemplo, 7 a 9 dfas despues.
Como ejemplos no limitantes, el tratamiento de acuerdo con la presente invencion se puede proporcionar en forma de una dosificacion diaria de un compuesto de la presente invencion en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por dfa, en al menos uno de los dfas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o alternativamente, al menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 despues del inicio del tratamiento, o cualquier combinacion de los mismos, utilizando dosis unicas o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4, o 2 horas, o cualquier combinacion de los mismos.
Una "cantidad eficaz" para la terapia tumor tambien se puede medir por su capacidad para estabilizar la progresion
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de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir el cancer se puede evaluar en un sistema modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composicion se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular o para inducir la apoptosis mediante analisis in vitro conocidos por el experto en la materia. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto terapeutico puede disminuir el tamano del tumor, o mejorar de otra manera los sfntomas en un sujeto. Un experto normal en la tecnica serfa capaz de determinar tales cantidades basandose en factores tales como el tamano del sujeto, la gravedad de los sfntomas del sujeto, y la composicion concreta o la via de administracion seleccionada.
Un anticuerpo anti-TF tambien se puede administrar profilacticamente con el fin de reducir el riesgo de desarrollar cancer, retrasar la aparicion de un evento en la progresion del cancer, y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cancer esta en remision. Esto puede ser especialmente util en pacientes en los que es diffcil de localizar un tumor que se sabe que esta presente debido a otros factores biologicos.
Los anticuerpos anti-TF tambien se pueden administrar en una terapia combinada, es decir, combinados con otros agentes terapeuticos relevantes para la enfermedad o afeccion que se vaya a tratar. De acuerdo con ello, en una realizacion, el medicamento que contiene el anticuerpo es para combinarlo con uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como un agente citotoxico, quimioterapeutico o anti-angiogenico.
Tal administracion combinada puede ser simultanea, separada o secuencial. Para la administracion simultanea los agentes se pueden administrar en forma de una composicion o en forma de composiciones separadas, segun sea apropiado. La presente invencion tambien proporciona metodos para tratar un trastorno que afecta a celulas que expresan TF como se ha descrito anteriormente, cuyos metodos comprenden la administracion de un anticuerpo anti- TF de la presente invencion combinado con uno o mas agentes terapeuticos adicionales tal como se describe a continuacion.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de un trastorno que afecta a las celulas que expresan TF en un sujeto, cuyo metodo que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion y al menos un agente quimioterapeutico a un sujeto que lo necesite.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento o la prevencion del cancer, cuyo metodo comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion y al menos un agente quimioterapeutico a un sujeto que lo necesite.
En una realizacion, la presente invencion proporciona el uso de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion para la preparacion de una composicion farmaceutica que se va a administrar con al menos un agente quimioterapeutico para el tratamiento del cancer.
En una realizacion, tal agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un antimetabolito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparraginasa, gemcitabina, cladribina y agentes similares.
En una realizacion, semejante agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un agente de alquilacion, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, tales como carboplatino, y agentes similares.
En una realizacion, semejante agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un agente anti-mitotico, tal como taxanos, por ejemplo docetaxel y paclitaxel, y alcaloides de vinca, por ejemplo vindesina, vincristina, vinblastina y vinorelbina.
En una realizacion, semejante agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un inhibidor de la topoisomerasa, tal como topotecan o irinotecan.
En una realizacion, semejante agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un farmaco citostatico, tal como etoposido y teniposido.
En una realizacion, semejante agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un inhibidor de factor del crecimiento, tal como un inhibidor de ErbBI (EGFR) (tal como Iressa, Erbitux (cetuximab), Tarceva y agentes similares), un inhibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como Herceptin y agentes similares) y agentes similares.
En una realizacion, semejante agente quimioterapeutico se puede seleccionar entre un inhibidor de tirosina quinasa, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 y agentes similares.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de un trastorno que afecta a las
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celulas que expresan TF en un sujeto, cuyo metodo comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF de la presente invencion y al menos un inhibidor de la angiogenesis, la neovascularizacion, y/u otra vascularizacion a un sujeto que lo necesite.
Los ejemplos de tales inhibidores de la angiogenesis son los inhibidores de uroquinasa, inhibidores de metaloproteasa de la matriz (tales como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 y agentes similares), inhibidores de migracion de celulas endoteliales y la proliferacion (tales como, TNP-470, escualamina, 2- metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, Nj) y agentes similares), antagonistas de factores de crecimiento angiogenicos (tales como ZD6474, SU6668, anticuerpos contra agentes angiogenicos y/o sus receptores (tales como, VEGF, bFGF, y angiopoyetina-1), talidomida, analogos de talidomida (tales como, CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogenica (tal como angiozima), interferon a (tal como interferon a2a), suramina y agentes similares), inhibidores de la quinasa VEGF-R y otros inhibidores de la tirosina quinasa anti-angiogenicos (tales como SU011248), inhibidores de la senalizacion de integrina especffica de endotelio/supervivencia (tales como vitaxina y agentes similares), antagonistas/quelantes de cobre (tales como tetratiomolibdato, captopril y agentes similares), carboxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleuquina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, asf como moleculas de nucleotidos inhibidoras de la angiogenesis (tales como ADNc de VEGF antisentido, ADNc que codifica angiostatina, ADNc que codifica p53 y ADNc que codifica el receptor-2 de VEGF defectuoso) y agentes similares.
Otros ejemplos de tales inhibidores de la angiogenesis, la neovascularizacion, y/u otra vascularizacion son los derivados de heparina anti-angiogenicos y moleculas relacionadas (p. ej., heparinasa III), temozolomida, NK4, factor inhibidor de la migracion de macrofagos (MIF), inhibidores de la ciclooxigenasa-2, inhibidores del factor 1 inducible por hipoxia, isoflavonas de soja anti-angiogenicas, oltipraz, fumagilina y analogos de los mismos, analogos de somatostatina, polisulfato de pentosano, tecogalan sodio, dalteparina, tumstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticuerpos contra otras dianas relevantes (tales como anti-integrina alfa- v/beta-3 y mAb anti-kininostatina) y agentes similares.
En una realizacion, un agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser un inmunogeno anti-canceroso, tal como un antfgeno canceroso/antfgeno asociado a tumor (p. ej., molecula de adherencia celular epitelial (EpCAM/TACSTD1), mucina 1 MUC1), antfgeno carcinoembrionario (CEA), glicoprotefna 72 asociada a tumor (TAG-72), gp 100, Melan-AMART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacunas virales asociadas con el cancer (p. ej., vacunas contra el virus del papiloma humano), protefnas de choque termico derivadas de tumores y agentes similares. Otros numerosos antfgenos cancerosos/antfgenos asociados a tumores adecuados descritos en otra parte en la presente memoria y moleculas similares conocidas en la tecnica se pueden utilizar tambien o alternativamente en dicha realizacion. Los peptidos inmunogenicos contra el cancer tambien incluyen las "vacunas" antiidiotfpicas tales como los anticuerpos anti- idiotfpicos BEC2, Mitumomab, CeaVac y anticuerpos anti-idiotfpicos relacionados, el anticuerpo anti-idiotfpico para el anticuerpo MG7, y otros anticuerpos anti-idiotfpicos contra el cancer (veanse por ejemplo Birebent et al., Vaccine. 21(15), 1601-1612 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996) y Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)). Tales Ab antiidiotfpicos pueden estar opcionalmente conjugado con un portador, que puede ser un portador de molecula sintetica (tfpicamente inerte), una protefna (por ejemplo hemocianina de lapa californiana (KLH) (vease, por ejemplo, Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)), o una celula (por ejemplo, un globulo rojo - vease, por ejemplo Wi et al., Methods J Immunol. 122(2), 227-34 (1989)).
En una realizacion, un agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de trastornos como los descritos anteriormente puede ser una citoquina anti-cancerosa, una quimioquina, o una combinacion de las mismas. Los ejemplos de las citoquinas y los factores de crecimiento adecuados incluyen IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (p. ej., INFa2b), IFNp, GM-CSF, CD40L, ligando FIt3, factor de celulas madre, ancestim, y TNFa. Las quimioquinas adecuadas pueden incluir quimioquinas Glu-Leu-Arg (ELR)-negativas tales como IP-10, MCP-3, MIG, y SDF-1a de las familias de quimioquinas CXC y C-C humanas. Las citoquinas adecuadas incluyen derivados de citoquinas, variantes de citoquinas, fragmentos de citoquinas, y protefnas de fusion de citoquinas. Estos y otros metodos o usos que implican acidos nucleicos que codifican peptidos de origen natural en la presente memoria se pueden llevar a cabo alternativamente o adicionalmente mediante "activacion genica" y tecnicas de regulacion al alza de genes por recombinacion homologa, tales como las descritas en los documentos Us 5.968.502, US 6.063.630 y US 6.187.305 y EP 0505500.
En una realizacion, un agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser un control del ciclo celular/regulador de la apoptosis (o "agente regulador"). Un control del ciclo celular/regulador de a apoptosis puede incluir moleculas que eligen como diana y modulan el control del ciclo celular/regulador de la apoptosis tales como (i) cdc-25 (tales como NSC 663284), (ii) quinasas dependientes de ciclina que sobre-estimulan el ciclo celular (tales como flavopiridol (L868275, HMR1275),
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7-hidroxiestaurosporina (UCN-01, KW-2401), y roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), y (iii) moduladores de la telomerasa (tales como BIBR1532, SOT-095, GRN163 y composiciones descritas por ejemplo en los documentos US 6.440.735 y US 6.713.055). Los ejemplos no limitantes de kas moleculas que interfieren en las rutas apoptoticas incluyen ligando de induce la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)/ligando de apoptosis-2 (Apo-2L), anticuerpos que activan los receptores TRAIL, IFN, y Bcl-2 anti-sentido.
En una realizacion, el agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser un agente regulador hormonal, tal como los agentes utiles para la terapia anti-androgenos y anti-estrogenos. Los ejemplos de tales agentes reguladores hormonales son tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinil/estinil estradiol, un antiandrogeno (tal como flutamida/Eulexin), una progestina (tal como caproato de hidroxiprogesterona, medroxi-progesterona/provera, acetato de megestrol/Megace), un adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormona liberadora de hormona luteinizante (y analogos de la misma y otros agonistas de LHRH tales como buserelina y goserelina), un inhibidor de aromatasa (tal como anastrazole/Arimidex, aminoglutetimida/Cytraden, exemestano), un inhibidor hormonal (tal como octreotida/Sandostatina) y agentes similares.
En una realizacion, el agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser un agente anti-anergico (por ejemplo compuestos de molecula pequena, protefnas, glicoprotefnas, o anticuerpos que interrumpen la tolerancia a antfgenos tumorales y cancerosos). Los ejemplos de tales compuestos son moleculas que bloquean la actividad de CTLA-4, tales como MDX-010 (ipilimumab) (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).
En una realizacion, el agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser un acido nucleico que contiene un gen supresor tumoral o un vector tal como un adenovirus de replicacion deficiente que codifica p53/SCH58500 de tipo salvaje recombinante humano, etc.; acidos nucleicos antisentido dirigidos a oncogenes, genes mutados o desregulados; o ARNip dirigido a genes mutados o desregulados. Los ejemplos de las dianas de supresores tumorales incluyen, por ejemplo, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1, y DCC.
En una realizacion, el agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser un acido nucleico anti-canceroso, tal como Genasense (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON
(oligonucleotido antisentido c-raf encapsulado en liposomas/ISIS-5132), MG98, y otros acidos nucleicos antisentido que eligen como diana PKCa, clusterina, IGFBP, protefna quinasa A, ciclina D1, o Bcl-2h.
En una realizacion, el agente terapeutico para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser una molecula de ARN inhibidora anti-cancerosa (veanse por ejemplo Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001), Erratum en: Curr Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) y Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
Las composiciones y los metodos de administracion combinada de la presente invencion tambien incluyen la administracion de vacunas de acido nucleico, tales como vacunas de ADN desnudo que codifican tales antfgenos cancerosos/antfgenos asociados a tumores (veanse por ejemplo los documentos US 5.589.466, US 5.593.972, US 5.703.057, US 5.879.687, US 6.235.523, y US 6.387.888). En una realizacion, el metodo de administracion combinada y/o la composicion combinada comprenden una composicion de vacuna autologa. En una realizacion, la composicion combinada y/o el metodo de administracion combinada comprenden una vacuna de celulas completas o una celula que expresa citoquinas (por ejemplo un fibroblasto que expresa IL-2 recombinante o una celula dendrftica que citoquina recombinante) (veanse por ejemplo Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) y Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Otro ejemplo de semejante enfoque de celulas autologas que puede ser util en los metodos combinados de la presente invencion es el metodo de Inmunoterapia Personalizada MyVax® (referido previamente como GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, USA).
En una realizacion, la presente invencion proporciona composiciones combinadas y metodos de administracion combinada en donde un anticuerpo anti-TF se combina o se administra simultaneamente con un virus o protefnas virales. Los virus de replicacion deficiente, que generalmente son capaces de una o solamente unas pocas rondas de replicacion in vivo, y que se dirigen a celulas tumorales, pueden ser, por ejemplo, componentes utiles de tales composiciones y metodos. Tales agentes virales pueden comprender o estar asociados con acidos nucleicos que codifican inmunoestimulantes, tales como GM-CSF y/o IL-2. Tanto los virus naturalmente oncolfticos como los virus oncolfticos recombinantes (por ejemplo los virus hSV-1, los reovirus, los adenovirus de replicacion deficiente y de replicacion sensible, etc.) pueden ser componentes utiles de tales metodos y composiciones. Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona composiciones combinadas y metodos de administracion
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combinada en donde un anticuerpo anti-TF se combina o se administra simultaneamente con un virus oncolftico. Los ejemplos de tales virus incluyen adenovirus oncolfticos y herpes virus, que pueden ser o no virus modificados (veanse por ejemplo Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) y Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
Las composiciones combinadas y los metodos de administracion combinada de la presente invencion tambien pueden implicar metodos de inmunoterapia "de celulas completas" y "adoptiva". Por ejemplo, tales metodos pueden comprender infusion o re-infusion de celulas de sistema imunitario (por ejemplo linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), tales como celulas T CD4+ y/o CD8+ (por ejemplo celulas T expandidas con antfgenos especfficos de tumores y/o mejora genetica), celulas B que expresan anticuerpos u otras celulas prductoras/presentadoras de anticuerpos, celulas dendrfticas (p. ej., celulas dendrfticas recombinantes que expresan anti-citoquinas, celulas dendrfticas cultivadas con un agente de expansion de DC tal como GM-CSF y/o FIt3-L, y/o celulas dendrfticas cargadas con antfgenos asociados a tumores), celulas NK anti-tumorales, celulas denominadas hfbridas, o combinaciones de las mismas. Los productos lisados celulares tambien pueden ser utiles en tales metodos y composiciones. Las "vacunas" celulares en pruebas clfnicas que pueden ser utiles en tales aspectos incluyen productos lisados celulares de Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics), y Melacine®. Los antfgenos desprendidos de las celulas cancerosas, y las mezclas de los mismos (vease por ejemplo Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 18821887, Julio 2001), opcionalmente mezclados con coadyuvantes tales como alumbre, tambien pueden ser componentes de tales metodos y composiciones combinadas.
En una realizacion, se puede suministrar un anticuerpo anti-TF a un paciente combinado con la aplicacion de un metodo de vacunacion interna. La vacunacion interna hace referencia a la muerte inducida de celulas tumorales o cancerosas, tal como la muerte celular inducida por farmacos o inducida por radiacion de celulas tumorales, en un paciente, que conduce tfpicamente a la provocacion de una respuesta inmunitaria dirigida a (i) las celulas tumorales en su totalidad o (ii) partes de las celulas tumorales incluyendo (a) protefnas, glicoprotefnas u otros productos secretados, (b) protefnas o glicoprotefnas asociadas a la membrana u otros componentes asociados con o insertados en las membranas, y/o (c) protefnas intracelulares u otros componentes intracelulares. Una respuesta inmunitaria inducida por vacunacion interna puede ser humoral (es decir, anticuerpo - mediada por el complemento) o mediada por celulas (p. ej., el desarrollo y/o incremento de linfocitos T citotoxicos endogenos que reconocen las celulas tumorales destruidas internamente o porciones de las mismas). Ademas de la radioterapia, los ejemplos no limitantes de los farmacos y agentes que se pueden utilizar para inducir dicha muerte de celulas tumorales y vacunacion interna son los agentes quimioterapeuticos convencionales, los inhibidores del ciclo celular, los farmacos anti-angiogenesis, los anticuerpos monoclonales, los agentes inductores de la apoptosis, y los inhibidores de la transduccion de la senal.
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos, que pueden ser relevantes como agentes terapeuticos para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente son agentes que inducen la diferenciacion, analogos del acido retinoico (tales como acido todo-trans-retinoico, acido 13-cis retinoico y agentes similares), analogos de la vitamina D (como seocalcitol y agentes similares), inhibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, FIk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA , TRKC, c- met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos, que pueden ser relevantes como agentes terapeuticos para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente son la catepsina B, los moduladores de la actividad deshidrogenasa D de la catepsina, la glutation-S-transferasa (tal como glutacilcistefna sintetasa y lactato deshidrogenasa), y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos, que pueden ser relevantes como agentes terapeuticos para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente son estramustina y epirubicina.
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos, que pueden ser relevantes como agentes terapeuticos para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente son un inhibidor de HSP90 como 17-alilamino geldanamicina, anticuerpos dirigidos contra un antfgeno tumoral tal como PSA, CA125, KSA, etc., integrinas como la integrina p1, inhibidores de VCAM y agentes similares.
Los ejemplos de otros agentes anti-cancerosos, que pueden ser relevantes como agentes terapeuticos para su uso combinado con un anticuerpo anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente son los inhibidores de calcineurina (tales como valspodar, PSC 833 y otros inhibidores de MDR-1 o p-glicoprotefna), inhibidores de Tor (tales como sirolimus, everolimus y rapamicina), e inhibidores de mecanismos de "anidamiento de linfocitos" (tales como FTY720), y agentes con efectos sobre la senalizacion celular, tales como inhibidores de moleculas de adherencia (por ejemplo anti-LFA, etc.).
En una realizacion, el anticuerpo anti-TF de la invencion es para uso combinado con uno o mas de otros anticuerpos
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terapeuticos, tales como bevacizumab (Avastin®), zalutumumab, cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix™), ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab (Lucentis®), Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tysabri, Xolair, raptiva, nimotuzumab, rituximab y/o trastuzumab (Herceptin®). Otros anticuerpos terapeuticos que se pueden utilizar combinados con el anticuerpo de la presente invencion son los descritos en los documentos WO98/40408 (anticuerpos que se pueden unir a Tf humano nativo), WO04/094475 (anticuerpos capaces de unirse al factor tisular humano, que no inhiben la coagulacion sangufnea mediada por el factor en comparacion con un control de plasma normal), WO03/093422 (anticuerpos que se unen con mayor afinidad al complejo TF:VIIa que a TF solo), o WO03/037361 (agonista o antagonista de TF para el tratamiento relacionado con la apoptosis).
En otra realizacion, se utilizan dos o mas anticuerpos diferentes de la invencion como se describe en la presente memoria combinados para el tratamiento de la enfermedad. Las combinaciones particularmente interesantes incluyen dos o mas anticuerpos que no compiten entre si. Por lo tanto, en una realizacion, un paciente es tratado con una combinacion de un anticuerpo del Grupo I de bloque cruzado definido en la presente memoria con un anticuerpo del Grupo II o III, como se define en la presente memoria. En otra realizacion, un paciente es tratado con una combinacion de un anticuerpo del Grupo II como se define en la presente memoria mas abajo, con un anticuerpo del Grupo III. Semejante terapia combinada puede conducir a la union de un mayor numero de moleculas de anticuerpo por celula, lo que puede proporcionar un aumento de la eficacia, p. ej., traves de la activacion de la lisis mediada por el complemento.
En una realizacion, se puede administrar un anticuerpo anti-TF en relacion con el suministro de uno o mas agentes que promueven el acceso del anticuerpo anti-TF o la composicion combinada al interior de un tumor. Tales metodos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, en asociacion con el suministro de una relaxina, que es capaz de relajar un tumor (vease, por ejemplo, el documento US 6.719.977). En una realizacion, un anticuerpo anti-TF de la presente invencion puede estar unido a un peptido de penetracion en las celulas (CPP). Los peptidos de penetracion en las celulas y peptidos relacionados (tales como anticuerpos de penetracion en celulas modificados) son descritos, por ejemplo, por Zhao et al., J Immunol. Methods 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000). Lindgren et al., Biochem J. 377 (Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al., FASEB J. 12 (1), 67-77 (1998) y Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002).
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de un trastorno que afecta a las celulas que expresan TF en un sujeto, cuyo metodo comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF y al menos un agente antiinflamatorio a un sujeto que lo necesite.
En una realizacion semejante agente anti-inflamatorio se puede seleccionar entre aspirina y otros salicilatos, inhibidores de Cox-2 (tales como rofecoxib y celecoxib), AINE (tales como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenaco, piroxicam, ketoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolaco, oxaprozina, e indometacina), anticuerpos anti-IL6R, anticuerpos anti-IL8 (p. ej., los anticuerpos descritos en los documentos WO2004058797, p.ej. 10F8), anticuerpos anti-IL15 (p. ej. los anticuerpos descritos en los documentos WO03017935 y WO2004076620), los anticuerpos anti-IL15R, los anticuerpos anti-CD4 (p. ej., zanolimumab), los anticuerpos anti-CD11a (p. ej., efalizumab), los anticuerpos anti-alfa-4/beta-1 integrina (VLA4) (p. ej. natalizumab), CTLA4-Ig para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, prednisolona, prednisona, farmacos antirreumaticos modificadores de la (FAME) tales como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inhibidores de la sfntesis de pirimidina (tales como leflunomida), agentes de bloqueo de los receptores de IL-1 (tales como anakinra), agentes de bloqueo de TNF-a (tales como etanercept, infliximab y adalimumab) y agentes similares.
En una realizacion, semejante agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar entre ciclosporina, azatioprina, acido micofenolico, micofenolato de mofetilo, corticosteroides tales como prednisona, metotrexato, sales de oro, sulfasalazina, antimalaricos, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxiespergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, globulina anti-timocitos, timopentina, timosina-a y agentes similares.
En una realizacion, semejante agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar entre anticuerpos inmunosupresores, tales como anticuerpos de union a p75 del receptor de IL-2, anticuerpos contra CD25 (p. ej., los descritos en los documentos WO2004045512, tales como AB1, AB7, AB11 y AB12), o anticuerpos que se unen, por ejemplo, a MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNy, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a, CD58 o, o anticuerpos que se unen a sus ligandos.
En una realizacion, semejante agente inmunosupresor y/o inmunomodulador se puede seleccionar entre IL-15R soluble, IL-10, moleculas de B7 (B7-1, B7-2, variantes de las mismas, y fragmentos de las mismas), ICOS, y OX40, una inhibidor de un regulador negativo de las celulas T (tal como un anticuerpo contra CTLA4) y agentes similares.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de un trastorno que afecta a las celulas que expresan TF en un sujeto, cuyo metodo comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF y un anticuerpo anti-C3b(i) a un sujeto que lo necesite.
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En una realizacion, el agente terapeutico para su uso combinado con los anticuerpos anti-TF para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente puede ser seleccionado entre inhibidores de histona desacetilasa (por ejemplo fenilbutirato) y/o agentes de reparacion del ADN (por ejemplo enzimas de reparacion del ADN y composiciones relacionadas tales como Dimericina).
Los metodos de la presente invencion para el tratamiento de un trastorno como se describe anteriormente que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF pueden comprender tambien la terapia fotodinamica dirigida anti-cancerosa (por ejemplo la terapia laser anti-cancerosa - que opcionalmente se puede poner en practica con el uso de un agente fotosensibilizante, vease, por ejemplo, Zhang et al., J. Control Release. 93(2), 141-50 (2003)), ondas de sonido anti-cancerosas y terapias de ondas de choque (vease, por ejemplo, Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)), y/o terapia nutraceutica anti-cancerosa (veanse, por ejemplo Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34 (1), 249-69, viii (2004) y Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004). Del mismo modo, se puede utilizar un anticuerpo anti-TF para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de un trastorno como se describe anteriormente para su administracion con una terapia fotodinamica anti-cancerosa dirigida (por ejemplo terapia laser anti-cancerosa - que opcionalmente se puede poner en practica con el uso de un agente fotosensibilizante, terapias de ondas de sonido anti-cancerosas y de ondas de choque, y/o terapia nutraceutica anti-cancerosa.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento de un trastorno que afecta a las celulas que expresan TF en un sujeto, cuyo metodo comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invencion, y radioterapia a un sujeto que lo necesite.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento o la prevencion del cancer, cuyo metodo comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invencion, y radioterapia a un sujeto que lo necesite.
En una realizacion, la presente invencion proporciona el uso de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invencion, para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento del cancer para ser administrada combinada con radioterapia.
La radioterapia puede comprender radiacion o administracion asociada de radiofarmacos proporcionados a un paciente. La fuente de radiacion puede ser externa o interna al paciente que esta siendo tratado (el tratamiento de radiacion puede estar, por ejemplo, en forma de terapia de radiacion de haz externo (RHE) o braquiterapia (BT)). Los elementos radiactivos que se pueden utilizar en la practica de tales metodos incluyen, p. ej., radio, cesio-137, iridio- 192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yodo-123, yodo-131, e indio-111.
En una realizacion adicional, la presente invencion proporciona un metodo para el tratamiento o la prevencion del cancer, cuyo metodo comprende la administracion a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF de la presente invencion, combinada con la cirugfa.
Como se describio anteriormente, una composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar en terapia combinada, es decir, combinada con uno o mas agentes relevantes para la enfermedad o afeccion que se vaya a tratar o bien en forma de composiciones farmaceuticas separadas o con un compuesto de la presente invencion coformulado con uno o mas agentes terapeuticos adicionales como se ha descrito anteriormente. Tales terapias combinadas pueden requerir dosificaciones menores del compuesto de la presente invencion y/o de los agentes coadministrados, evitando de este modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Ademas de lo anterior, otras terapias combinadas interesantes incluyen las siguientes:
• Para el tratamiento del cancer de pancreas un anticuerpo anti-TF combinado con un antimetabolito, tal como 5-fluorouracilo y/o gemcitabina, posiblemente combinado con uno o mas compuestos seleccionados entre: 90Y- hPAM4, ARC-100, ARQ-197, aZd-6244, bardoxolona metilo, cixutumumab, (IMC-A12), folitixorin calcio, GVAX, ipilimumab, KRX-0601, merbarona, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh-Apo2L, TLN-4601, trabedersen, volociximab (M200), WX-671, pemetrexed, rubitecan, ixabepilona, OCX-0191 Vion, 216586-46-8, lapatinib, matuzumab, imatinib, sorafinib, trastuzumab, exabepilona, erlotinib, bevacizumab y cetuximab
• Para el tratamiento del cancer colorrectal un anticuerpo anti-TF combinado con uno o mas compuestos seleccionados entre: gemcitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, LIF, oxaliplatino, irinotecan, 5- FU/LV, Capecitabina, UFT, agentes de direccionamiento de EGFR, tales como cetuximab. panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab; inhibidores de VEGF, o inhibidores de la tirosina quinasa tales como sunitinib.
• Para el tratamiento del cancer de mama un anticuerpo anti-TF combinado con uno o mas compuestos seleccionados entre: antimetabolitos, antraciclinas, taxanos, agentes alquilantes, epotilonas anti-hormonales (femar, tamoxifeno, etc.), inhibidores de ErbB2 (Her2/neu) (tales como Herceptin y agentes similares), CAF/FAC
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(ciclofosfamida, doxorrubicina, 5FU) AC (ciclo, doxo), CMF (ciclo, metotrexato, 5-FU), Docetaxel + capecitabina, GT (paclitaxel, gemcitabina) FEC (ciclo, epi, 5FU) combinados con herceptina: Paclitaxel +/- carboplatino, Vinorelbina, Docetaxel, CT combinado con lapatinib; Capecitabina
• Para el tratamiento de la vejiga un anticuerpo anti-TF combinado con uno o mas compuestos seleccionados entre: antimetabolitos (gemcitabina, pemetrexed, metotrexato), analogos de platino (cisplatino, carboplatino), inhibidores de EGFr (tales como cetuximab o zalutumumab), inhibidores de VEGF (tales como Avastina), doxorrubicina, inhibidores de tirosina quinasa tales como gefitinib, trastuzumab, agentes anti-mitotico, tales como taxanos, por ejemplo paclitaxel, y alcaloides de la vinca, por ejemplo vinblastina.
• Para el tratamiento de cancer de prostata un anticuerpo anti-TF combinado con uno o mas compuestos seleccionados entre: terapias hormonales/antihormonales; tales como antiandrogenos, agonistas de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), y agentes quimioterapicos, tales como taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vinblastina, ixabepilona,
• Para el tratamiento del cancer de ovario un anticuerpo anti-TF combinado con uno o mas compuestos seleccionados entre: un agente anti-mitotico, tales como taxanos y alcaloides de la vinca, caelyx, topotecan.
Usos de diagnostico
Los anticuerpos anti-TF de la invencion tambien se pueden utilizar con fines de diagnostico. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion de diagnostico que comprende un anticuerpo anti-TF como se define en la presente memoria.
En una realizacion, los anticuerpos anti-TF de la presente invencion se pueden utilizar in vivo o in vitro para el diagnostico de enfermedades en las que las celulas activadas que expresan TF desempenan un papel activo en la patogenesis, mediante la deteccion de los niveles de TF, o los niveles de celulas que contienen TF sobre su superficie de membrana. Esto se puede conseguir, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra que se va a someter a ensayo, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo anti-TF en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo y TF. Despues se detecta la formacion de complejos (p. ej. utilizando un ELISA). Cuando se utiliza una muestra de control junto con la muestra de ensayo, el complejo se detecta en ambas muestras y cualquier diferencia estadfsticamente significativa en la formacion de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de TF en la muestra de ensayo.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invencion se refiere a un metodo para detectar la presencia de un antfgeno TF, o una celula que expresa TF, en una muestra, que comprende:
• poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-TF de la invencion o una molecula biespecffica de la invencion, en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo y TF; y
• analizar si se ha formado un complejo.
En una realizacion, el metodo se realiza in vitro.
Mas especfficamente, la presente invencion proporciona metodos para la identificacion, y el diagnostico de celulas y tejidos invasivos y otras celulas elegidas como diana por los anticuerpos anti-TF de la presente invencion, y para el control de la progresion de los tratamientos terapeuticos, el estado despues del tratamiento, el riesgo de desarrollar cancer y la progresion del cancer.
En un ejemplo de semejante analisis de diagnostico, la presente invencion proporciona un metodo para diagnosticar el nivel de celulas invasivas en un tejido que comprende la formacion de un inmunocomplejo entre un anticuerpo anti- TF y potenciales tejidos que contienen TF, y la deteccion de la formacion del inmunocomplejo, en donde la formacion del inmunocomplejo se correlaciona con la presencia de celulas invasivas en el tejido. La puesta en contacto se puede llevar a cabo in vivo, utilizando anticuerpos marcados aislados y tecnicas de formacion de imagenes convencionales, o se puede llevar a cabo in vitro sobre muestras de tejido.
Los anticuerpos anti-TF se pueden utilizar para detectar peptidos que contienen TF y fragmentos de peptidos en cualquier muestra biologica adecuada mediante cualquier tecnica adecuada. Los ejemplos de los inmunoanalisis convencionales proporcionados por la presente invencion incluyen, sin limitacion, un ELlSA, un RIA, analisis FACS, analisis de resonancia de plasmon, analisis cromatograficos, inmunohistoqufmica de tejidos, transferencia Western, y/o inmunoprecipitacion utilizando un anticuerpo anti-TF. Los anticuerpos anti-TF de la presente invencion se pueden usar para detectar TF y TF-fragmentos de seres humanos. Las marcas adecuadas para el anticuerpo anti-TF y/o los anticuerpos secundarios utilizados en tales tecnicas incluyen, sin limitacion, diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescefna, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye
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luminol; y los ejemplos de los materiales radiactivos adecuados incluyen Y, I, S, y H.
Los anticuerpos anti-TF tambien se pueden analizar en una muestra biologica por medio de un inmunoanalisis de competicion utilizando peptidos TF patron marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-TF no marcado. En tal analisis, la muestra biologica, el patron o los patrones de peptido TF marcado y los anticuerpos anti- TF se combinan y se determina la cantidad de patron de Rf marcado unido al anticuerpo anti-TF no marcado. La cantidad de peptido TF en la muestra biologica es inversamente proporcional a la cantidad de patron de TF marcado unido al anticuerpo anti-TF.
Los anticuerpos anti-TF son particularmente utiles en la formacion de imagenes de tumores in vivo. La formacion de imagenes de tumores asociados con TF in vivo se puede realizad por medio de cualquier tecnica adecuada. Por ejemplo, el marcaje con 99Tc o el marcaje con otro isotopo emisor de rayos gamma se pueden utilizar para marcar los anticuerpos anti-TF en los tumores o complejos de anticuerpo anti-TF:TF marcados secundarios (p. ej., marcados con FITC) anti-TF anticuerpo: complejos de tF de tumores formar imagenes con una camara de centelleo gamma (p. ej., un dispositivo Elscint Apex 409ECT), utilizando tfpicamente un colimador de alta resolucion, de baja energfa, o un colimador para todo uso de baja energfa. Los tejidos tenidos pueden ser evaluados a continuacion para el recuento de la radiactividad como un indicador de la cantidad de peptidos asociados a TF en el tumor. Las imagenes obtenidas mediante la utilizacion de tales tecnicas se pueden utilizar para evaluar la biodistribucion de TF en un paciente, mamffero, o tejido, por ejemplo en el contexto de la utilizacion de TF o fragmentos de TF como un biomarcador para determinar la presencia de celulas cancerosas invasivas. Las variaciones en esta tecnica pueden incluir el uso de imagenes de resonancia magnetica (MRI) para mejorar la formacion de imagenes a traves de tecnicas con camaras gamma. Se describen metodos de inmunocentelleo y principios similares, por ejemplo, por Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioosotopes", en Remington Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, Gennaro et al., (Eds.), pags. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), y Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies" en Biotechnology and Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (Eds.) (Chapman y Hall 1993). Tales imagenes tambien se pueden utilizar para el suministro dirigido de otros agentes anti-cancerosos, cuyos ejemplos se describen en la presente memoria (p. ej., agentes apoptoticos, toxinas, o composiciones quimioterapeuticas CHOP). Por otra parte, tales imagenes pueden servir tambien o alternativamente como base para las tecnicas quirurgicas para eliminar tumores. Ademas, tales tecnicas de formacion de imagenes in vivo puede permitir la identificacion y localizacion de un tumor en una situacion en la que se identifica que un paciente tiene un tumor (debido a la presencia de otro biomarcadores, metastasis, etc.), pero el tumor no puede ser identificado mediante las tecnicas analfticas convencionales. Todos estos metodos son elementos de la presente invencion.
La formacion de imagenes in vivo y otros metodos de diagnostico proporcionados por la presente invencion son particularmente utiles en la deteccion de micrometastasis en un paciente humano (p. ej., un paciente al que no se habfa diagnosticado previamente cancer o un paciente en un perfodo de recuperacion/remision de un cancer). Se ha demostrado que las celulas cancerosas de carcinoma, que pueden representar hasta 90% de todas las celulas cancerosas, por ejemplo, se tinen muy bien con composiciones de productos conjugados de anticuerpos anti-TF. La deteccion con anticuerpos monoclonales anti-TF descrita en la presente memoria puede ser indicativa de la presencia de carcinomas que son agresivos/invasivos y puede proporcionar tambien o alternativamente una indicacion de la viabilidad de la utilizacion de un anticuerpo monoclonal anti-TF relacionado contra tales micrometastasis.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo de formacion de imagenes in vivo en donde un anticuerpo anti-TF de la presente invencion se conjuga con agente radio-opaco promotor de la deteccion, el anticuerpo conjugado se administra a un anfitrion, por ejemplo mediante inyeccion en el torrente sangufneo, y se analiza la presencia y localizacion del anticuerpo marcado en el anfitrion. A traves de esta tecnica y de cualquier otro metodo de diagnostico proporcionado en la presente memoria, la presente invencion proporciona un metodo para el escrutinio de la presencia de celulas relacionadas con enfermedades en un paciente humano o una muestra biologica tomada de un paciente humano.
Para la formacion de imagenes de diagnostico, los radioisotopos se pueden unir a un anticuerpo anti-TF o bien directamente, o bien indirectamente utilizando un grupo funcional intermediario. Los grupos funcionales intermediarios utiles incluyen quelantes, tales como acido etilendiaminotetraacetico y acido dietilentriamino- pentaacetico (vease por ejemplo el documento US 5.057.313).
Ademas de los radioisotopos y los agentes radio-opacos, se pueden realizar metodos de diagnostico utilizando anticuerpos anti-TF que estan conjugados con colorantes (por ejemplo con el complejo de biotina-estreptatividina), agentes de contraste, compuestos o moleculas fluorescentes y agentes potenciadores (p. ej., iones paramagneticos) para la formacion de imagenes por resonancia magnetica (MRI) (vease, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 6.331.175, que describe tecnicas de MRI y la preparacion de anticuerpos conjugados con un agente potenciador de MRI). Tales agentes de diagnostico/deteccion se pueden seleccionar entre los agentes para su utilizacion en la formacion de imagenes por resonancia magnetica, y compuestos fluorescentes. Con el fin de cargar un anticuerpo
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anti-TF con metales radiactivos o iones paramagneticos, puede ser necesario hacerlo reaccionar con un reactivo que tenga una cola larga a la cual se ancla una multiplicidad de grupos quelantes para la union de los iones. Semejante cola puede ser un polfmero tal como una polilisina, un polisacarido, u otra cadena derivatizada o derivatizable que tenga grupos pendientes a lo cuales se pueden unir grupos quelantes tales como p. ej., porfirinas, poliaminas, eteres corona, bistiosemicarbazonas, polioximas, y grupos similares conocidos por ser utiles para este proposito. Los quelatos se pueden acoplar a anticuerpos anti-TF utilizando qufmicas convencionales.
De este modo, la presente invencion proporciona productos conjugados de anticuerpo anti-TF de diagnostico, en donde el anticuerpo anti-TF se conjuga con un agente de contraste (por ejemplo para la formacion de imagenes por resonancia magnetica, la tomograffa computarizada, o un agente potenciador del contraste de ultrasonidos) o un radionuclido que puede ser, por ejemplo, un isotopo emisor de gamma, beta, alpha, electrones Auger, o positrones.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un kit para la deteccion de la presencia del antfgeno TF, o una celula que expresa TF, en una muestra que comprende
• un anticuerpo anti-TF de la invencion o una molecula biespecffica de la invencion; y
• instrucciones para la utilizacion del kit.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un kit para el diagnostico del cancer que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo anti-TF, y uno o mas reactivos para la deteccion de la union del anticuerpo anti-TF a un peptido TF. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimaticas, u otras etiquetas detectables. Los reactivos tambien pueden incluir anticuerpos secundarios o terciarios o reactivos para reacciones enzimaticas, en donde las reacciones enzimaticas producen un producto que puede ser visualizado. En una realizacion, la presente invencion proporciona un kit de diagnostico que comprende uno o mas anticuerpos anti-TF, de la presente invencion en forma marcada o no marcada en uno o varios recipientes adecuados, reactivos para la incubacion durante un analisis indirecto, y sustratos o agentes de derivatizacion para la deteccion en semejante analisis, dependiendo de la naturaleza de la marca. Tambien se pueden incluir los reactivos de control y las instrucciones para su uso.
Los kits de diagnostico tambien pueden ser suministrados para su uso con un anticuerpo anti-TF, tal como un anticuerpo anti-TF conjugado/marcado, para la deteccion de una actividad celular o para la deteccion de la presencia de peptidos TF en una muestra de tejido o un anfitrion. En tales kits de diagnostico, asf como en kits para uso terapeutico descritos en otra parte en la presente memoria, se puede proporcionar un anticuerpo anti-TF tfpicamente en una forma liofilizada en un recipiente, ya sea solo o junto con anticuerpos adicionales especfficos para una celula o peptido diana. Tfpicamente, tambien se incluyen un portador farmaceuticamente aceptable (p. ej., un diluyente inerte) y/o componentes del mismo, tal como tampon Tris, fosfato, o carbonato, estabilizadores, conservantes, biocidas, biocidas, protefnas inertes, p. ej., albumina de suero, o similares (tfpicamente en un recipiente separado para el mezclado) y reactivos adicionales (tambien tfpicamente en recipientes separados). En ciertos kits, tambien se incluye un anticuerpo secundario capaz de unirse al anticuerpo anti-TF, que tfpicamente esta presente en un recipiente separado que tfpicamente esta presente en un recipiente separado. El segundo anticuerpo esta conjugado tfpicamente con una marca y se formula de una manera similar al anticuerpo anti-TF de la presente invencion. Utilizando los metodos descritos anteriormente y en otra parte en la presente memoria se pueden utilizar los anticuerpos anti-TF para definir subgrupos de celulas cancerosas/tumorales y caracterizar tales celulas y tejidos/crecimientos relacionados.
La deteccion in situ se puede completar retirando un especimen histologico de un paciente, y proporcionando la combinacion de anticuerpos anti-TF marcados, de la presente invencion a semejante especimen. El anticuerpo anti- TF de la presente invencion se puede proporcionar aplicando o superponiendo el anticuerpo anti-TF marcado de la presente invencion a una muestra biologica. Por medio de la utilizacion de semejante procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de TF o fragmentos de TF sino tambien la distribucion de tales peptidos en el tejido examinado (p. ej., en el contexto de la evaluacion de la diseminacion de las celulas cancerosas). Utilizando la presente invencion, los expertos en la tecnica percibiran facilmente que cualquiera de una amplia variedad de metodos histologicos (tales como los procedimientos de tiincion) puede ser modificado con el fin de lograr semejante deteccion in situ.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un anticuerpo anti-idiotfpico que se une a un anticuerpo anti-TF de la invencion como se describe en la presente memoria.
Un anticuerpo anti-idiotfpico (Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes unicos generalmente asociados con el sitio de union al antfgeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede preparar inmunizando un animal de la misma especie y tipo genetico que la fuente de un mAb anti-TF con el mAb para el cual se esta preparando un anti-Id. El animal inmunizado puede reconocer y responder tfpicamente a los determinantes idiotfpicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para estos determinantes idiotfpicos (el anticuerpo anti-Id). Tales anticuerpos se describen por ejemplo en el documento US 4.699.880. Tales anticuerpos se adicionalmenet caracterfsticos de la presente invencion.
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Tambien se puede utilizar un anticuerpo anti-Id como un "inmunogeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal mas, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id. Un anti-anti-Id puede ser epitopicamente identico al mAb original, que indujo el anti-Id. De este modo, utilizando anticuerpos para los determinantes idiotfpicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de identica especificidad. Los anticuerpos anti-Id se pueden variar (produciendo de ese modo variantes de anticuerpos anti-Id) y/o derivatizar mediante cualquier tecnica adecuada, tales como las descritas en otra parte en la presente memoria con respecto a anticuerpos anti-TF de la presente invencion. Por ejemplo, los mAb anti-Id se pueden acoplar a un portador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y se pueden utilizar para inmunizar ratones BALB/c. Los sueros de estos ratones contendran tfpicamente anticuerpos anti-anti-Id que tengan propiedades de union similares, sino identicas, a un anticuerpo TF original/parental.
La presente invencion se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que no deben considerarse una limitacion adicional.
Ejemplos
Ejemplo 1
Constructos de expresion para el factor tisular (TF)
Se generaron constructos de codon completamente optimizado para la expresion de TF o sus dominios extracelulares en celulas HEK, NSO o CHO. Las protefnas codificadas por estos constructos son identicas al Acceso GenBank NP_001984 para TF. Las constructos contenfan sitios de restriccion adecuados para la clonacion y una secuencia de Kozak optima (Kozak, 1987). Los constructos se clonaron en el vector de expresion de mamffero pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington, Renner et al. 1992), obteniendo pEE13.4TF. Se utilizo PCR para amplificar la parte, que codifica el dominio extracelular (ECD) (amino acido 1-251) de TF, del constructo sintetico, anadiendo una etiqueta de His C-terminal que contenfa 6 residuos de His (TFECDHis). La construccion se clono en pEE13.4 y se secuencio completamente para confirmar la correccion del constructo.
Ejemplo 2
Expresion transitoria en celulas HEK-293F
Las celulas Freestyle™ 293-F (un subclon de HEK-293 adaptado al medio Freestyle de crecimiento en suspension y qufmicamente definido, (HEK-293F)) se obtuvieron de Invitrogen y se transfectaron con el ADN plasmfdico apropiado, utilizando 293fectin (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el caso de la expresion del anticuerpo, se co-expresaron los vectores de cadena pesada y de cadena ligera apropiados, como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 3
Expresion semi-estable en celulas NS0
Se transfecto de forma estable pEE13.4TF en celulas NS0 y los clones estables se seleccionaron durante el crecimiento en ausencia de glutamina y en presencia de metilsulfoximina (MSX) 7,5 M. Un agrupamiento de clones se desarrollo en cultivo en suspension, mientras se mantenfa la presion de seleccion. Los agrupamientos se sometieron a analisis para determinar la expresion de FT mediante analisis FACS y se aseguraron para su uso adicional.
Ejemplo 4
Expresion estable en celulas CHO
Se transfecto de forma estable pEE13.4TF en celulas CHO-KlSV (Lonza Biologics) y los seleccionaron durante el crecimiento en ausencia de glutamina y en presencia de MSX individuales se seleccionaron y se expandieron y se sometieron a analisis para determinar mediante analisis FACS como se describe a continuacion. Se seleccionaron los clones de aseguraron para su uso adicional.
Ejemplo 5
Purificacion de TF etiquetado con His
Se expreso TFECDhis en celulas I HEK-293F. La etiqueta de His en TFECDHis permite la purificacion por medio de
clones estables se 50 pM. Los clones la expresion de TF alta expresion y se
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cromatograffa de afinidad con metal inmovilizado. En este procedimiento, se carga un quelante fijado sobre la resina cromatografica con cationes Co2+. Se incuba el sobrenadante que contiene TFECDHis con la resina en el modo por lotes (es decir, solucion). La protefna etiquetada con His se une fuertemente a las esferas de resina, mientras que otras protefnas presentes en el sobrenadante de cultivo no se unen fuertemente. Despues de la incubacion las esferas se recuperan del sobrenadante y se empaquetan en una columna. La columna se lava con el fin de eliminar las protefnas debilmente unidas. Las protefnas TFECDHis fuertemente unidas se eluyen a continuacion con un tampon que contiene imidazol, que compite con la union de His a Co2+. El eluyente se retira de la protefna mediante intercambio de tampon en una columna de desalacion.
Ejemplo 6
Procedimiento de inmunizacion de ratones transgenicos
Los ratones HuMab fueron inmunizados cada quince dfas alternando con 5x106 celulas NSO-TF transfectadas semi- estables, o con 20 pg de protefna TFECDHis. Se realizaron ocho inmunizaciones en total, cuatro inmunizaciones intraperitoneales (IP) y cuatro subcutanea (SC) en la base de la cola. La primera inmunizacion con celulas se llevo a cabo en adyuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.). Para todas las otras vacunas, se inyectaron celulas IP en PBS y se inyecto TFECDHis SC utilizando coadyuvante incompleto de Freund (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Cuando se encontro que los tftulos sericos eran suficientes (dilucion de suero de 1/50 o menor que de positivo en analisis de escrutinio especffico de antfgeno como se describe en el Ejemplo 7 durante al menos 2 eventos de escrutinio secuenciales, cada dos semanas), los ratones fueron reforzados dos veces por via intravenosa (IV) con 10 pg de la protefna TFECDHis en 100 pl de PBS, 4 y 3 dfas antes de la fusion.
La primera inmunizacion con celulas se realizo en CFA, para todas las demas (7) inmunizaciones las celulas se inyectaron IP en PBS. Cuando se encontro que los tftulos en suero eran suficientes, los ratones fueron reforzados adicionalmente dos veces IV con 1x106 celulas NSO-TF transfectadas transitoriamente semi-estables en 100 pl de PBS, 4 y 3 dfas antes de la fusion.
Cuando se encontro que los tftulos sericos eran suficientes (definido como antes), los ratones fueron reforzados adicionalmente dos veces por via intravenosa (IV) con 10 pg de la protefna TFECDHis en 100 pl de PBS, 4 y 3 dfas antes de la fusion.
Ejemplo 7
Analisis de escrutinio especffico de antfgeno homogeneo
Se determino la presencia de anticuerpos anti-TF en el sueros de ratones inmunizados o sobrenadante cultivo de hibridoma o transfectoma HuMab (anticuerpo monoclonal humano) por medio de analisis de escrutinio especfficos de antfgeno homogeneos (cuatro cuadrantes) utilizando Fluorometric Micro volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
Para esto, se utilizo una combinacion de 3 analisis basados en celulas y un analisis basado en esferas. En los analisis basados en celulas, se determino la union a celulas TH1015-TF (celulas HEK-293F que expresan transitoriamente TF; producidas tal como se describe mas arriba) y A431 (que expresan TF en la superficie celular), asf como HEK293 de tipo salvaje (no expresan TF, control negativo). En el analisis basado en esferas, se determino la union a TF biotinilado acoplado sobre una esfera de estreptavidina (SB1015-TF).
Las muestras se anadieron a las celulas/cuentas para permitir la union a TF. Posteriormente, la union del HuMab se detecto utilizando un producto conjugado fluorescente (anti-IgG humana-Cy5 de cabra; Jackson ImmunoResearch). El anticuerpo anti-TF humano de raton (ERL; acoplado a Alexa-647 en Genmab) se utilizo como control positivo, el suero agrupado HuMAb-raton y el anticuerpo de raton-chrompure-Alexa647 se utilizaron como controles negativos. Las muestras fueron barridas utilizando un Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System (8200 CDS) y los 'recuentos x fluorescencia' se utilizaron como lectura.
Ejemplo 8
Generacion de hibridoma HuMab
Los ratones HuMab con suficiente desarrollo de tftulo especffico de antfgeno (definido como antes) fueron sacrificados y se recogieron el bazo y los ganglios que flanquean la aorta y la vena cava abdominal. La fusion de los esplenocitos y las celulas de ganglios linfaticos a una lfnea celular de mieloma de raton preparada mediante electrofusion usando un CEEF 50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, EE.UU.), esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Seleccion y cultivo de los hibridomas HuMab
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resultantes se realizo basandose en protocolos convencionales (p. ej., como describen Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. y Strober, W., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006).
Ejemplo 9
Espectrometrfa de masas de anticuerpos purificados
Se purificaron pequenas alfcuotas de 0,8 ml de sobrenadante que contenfa anticuerpo de la fase de 6 pocillos o Hyperflask utilizando columnas PhyTip que contenfan resina de Protefna G (PhyNexus Inc., San Jose, EE.UU.) en una estacion de trabajo SciClone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, EE.UU.). Las columnas PhyTtip se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero los tampones se sustituyeron por: Binding Buffer PBS (B. Braun, Medical BV, Oss, Pafses Bajos) y Tampon de Elucion glicina-HCl 0,1 M pH 2.7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Alemania). Despues de la purificacion, las muestras se neutralizaron con Tris-HCl 2 M pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Pafses Bajos).Alternativamente, en algunos casos se purificaron mayores volumenes de sobrenadante de cultivo utilizando cromatograffa en columna de afinidad con Protefna A.
Despues de la purificacion, las muestras se colocaron en una placa de 384 pocillos (Waters, placa cuadrada de 100 pl, parte Num. 186002631). Las muestras se desglicosilaron durante la noche a 37°C con N-glicosidasa F (Roche Num. Cat. 11365177001. Se anadio DTT (15 mg/ml) (1 pl/pocillo) y se incubo durante 1 h a 37°C. Las muestras (5 o 6 pl) se desalaron en una Acquity UPLC™ (Waters, Milford, EE.UU.) con una columna BEH300 C18, 1,7 pm, 2,1x50 mm a 60°C. Se utilizaron MQ agua y acetonitrilo de calidad LC-MS (Biosolve, Num. Cat. 01204101, Valkenswaard, Pafses Bajos) ambos con acido formico al 0,1% (Fluka, Num. Cat. 56302, Buchs, Alemania), como Eluyentes A y B, respectivamente. Los espectros de masas de ionizacion por electrospray con tiempo de vuelo se registraron en lfnea sobre un espectrometro de masas micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Alemania) funcionando en el modo de iones positivos. Antes del analisis, se calibro una escala de 900 a 3000 m/z con mezcla de sintonizacion ES (Agilent Technologies, Santa Clara, EE.UU.). Los espectros de masas se desconvolucionaron con soporte logico DataAnalysis™ v. 3.4 (Bruker) utilizando el algoritmo de Maxima Entropfa en busca de pesos moleculares comprendidos entre 5 y 80 kDa.
Despues de la desconvolucion se compararon las masas de la cadena pesada y ligera resultantes para todas las muestras con el fin de encontrar anticuerpos duplicados. En la comparacion de las cadenas pesadas se tuvo en cuenta la posible presencia de variantes de lisina C-terminal. Esto dio como resultado una lista de anticuerpos unicos, donde unico se define como una combinacion unica de las cadenas pesadas y ligeras. En caso de que se encontraran anticuerpos duplicados, se utilizaron los resultados de otras pruebas para decidir cual era el mejor material para continuar con los experimentos.
El analisis MS de los pesos moleculares de las cadenas pesada y ligera de los 118 hibridomas especfficos de TF produjo 70 anticuerpos unicos (combinacion unica de cadena pesada/cadena ligera).
Estos se caracterizaron en diversos analisis funcionales, identificando 14 anticuerpos especfficos de TF candidatos principales.
Ejemplo 10
Analisis de secuencia de los dominios variables de HuMab anti-TF y clonacion en vectores de expresion
Se preparo el ARN total de los HuMAb anti-TF a partir 5x106 celulas de hibridoma y ADN complementario (ADNc) de 5'-RACE a partir de 100 ng de ARN total, utilizando el SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las regiones codificantes de VH (region variable de cadena pesada) y VL (region variable de cadena ligera) fueron amplificadas mediante PCR y se clonaron en el vector pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) utilizando el kit de clonacion Zero Blunt PCR (Invitrogen). Para cada HuMab, se secuenciaron 16 clones de VL y 8 clones de VH. Las secuencias se proporcionan en la Lista de Secuencias y la Figura 1 en la presente memoria. La Tabla 1A y la Tabla 1B (a continuacion) proporcionan una vision general de la informacion de las secuencias de anticuerpos y las secuencias de las lfnea germinal mas homologas.
Tabla 1 A Homologfas de la cadena pesada
Ab
GEN V y alelo Identidad de la REGION V, % GEN J y alelo GEN D y alelo longitudes CDR- IMGT
003
IGHV1-69*02, o IGHV1-69*04 97,57% (nt 281/288) IGHJ4*02 IGHD6-13*01 [8,8,11]
098
IGHV1-69*04 95,49% (nt 275/288) IGHJ3*02 IGHD2-21*02 [8,8,11]
011
IGHV3-23*01 96,53% (nt 278/288) IGHJ4*02 IGHD1-26*01 [8,8,11]
017
IGHV3-23*01 98,26% (nt 283/288) IGHJ2*01 IGHD2-15*01 [8,8,13]
092
IGHV3-23*01 97,92% (nt 282/288) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,11]
101
IGHV3-23*01 95,83% (nt 276/288) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,11]
025
IGHV3-30-3*01 97,57% (nt 281/288) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,13]
109
IGHV3-30-3*01 96,18% (nt 277/288) IGHJ4*02 IGHD7-27*01 [8,8,13]
111
IGHV3-30-3*01 97,57% (nt 281/288) IGHJ4*02 IGHD3-10*01 [8,8,13]
114
IGHV3-33*01, o IGHV3-33*03 94,44% (nt 272/288) IGHJ6*02 IGHD3-10*01 [8,8,12]
013
IGHV5-51*01 99,65% (nt 287/288) IGHJ3*02 IGHD6-13*01 [8,8,19]
Tabla 1 B Homologfas de la cadena ligera
Ab
GEN V y alelo Identidad de la REGION V, % (nt) GEN J y alelo Longitudes de CDR- IMGT
003
IGKV1-13*02 99,28% (nt 277/279) IGKJ4*01 [6.3.9]
011
IGKV1D-16*01 98,57% (nt 275/279) IGKJ2*01 [6.3.9]
013
IGKV1D-16*01 98,57% (nt 275/279) IGKJ5*01 [6.3.9]
092
IGKV1D-16*01 99,28% (nt 277/279) IGKJ2*01 [6.3.10]
098
IGKV1D-16*01 100,00% (nt 279/279) IGKJ2*01 [6.3.9]
101
IGKV1D-16*01 100,00% (nt 279/279) IGKJ2*01 [6.3.10]
025
IGKV3-11*01 100,00% (nt 279/279) IGKJ4*01 [6.3.9]
109
IGKV3-11*01 99,64% (nt 278/279) IGKJ4*01 [6.3.9]
017
IGKV3-20*01 99,29% (nt 280/282) IGKJ1*01 [7.3.9]
114
IGKV3-20*01 99,65% (nt 281/282) IGKJ4*01 [7.3.8]
Region VH
SEQ ID NO: 1
VH 013
SEQ ID NO: 2
VH 013, CDR1
SEQ ID NO: 3
VH 013, CDR2
SEQ ID NO: 4
VH 013, CDR3
SEQ ID NO: 5
VH 114
SEQ ID NO: 6
VH 114, CDR1
SEQ ID NO: 7
VH 114, CDR2
SEQ ID NO: 8
VH 114, CDR3
SEQ ID NO: 9
VH 011
SEQ ID NO: 10
VH 011, CDR1
SEQ ID NO: 11
VH 011, CDR2
SEQ ID NO: 12
VH 011, CDR3
SEQ ID NO: 13
VH 017-D12
SEQ ID NO: 14
VH 017-D12, CDR1
SEQ ID NO: 15
VH 017-D12, CDR2
SEQ ID NO: 16
VH 017-D12, CDR3
SEQ ID NO: 17
VH 042
SEQ ID NO: 18
VH 042, CDR1
SEQ ID NO: 19
VH 042, CDR2
SEQ ID NO: 20
VH 042, CDR3
SEQ ID NO: 21
VH 092-A09
SEQ ID NO: 22
VH 092-A09, CDR1
SEQ ID NO: 23
VH 092-A09, CDR2
SEQ I D No: 24
VH 092-A09, CDR3
SEQ ID NO: 25
VH 101
SEQ ID NO: 26
VH 101, CDR1
SEG ID No: 27
VH 101, CDR2
SEQ ID NO: 28
VH 101, CDR3
SEQ ID NO: 29
VH 003
SEQ ID NO: 30
VH 003, CDR1
SEQ ID NO: 31
VH 003, CDR2
SEQ ID NO: 32
VH 003, CDR3
SEQ ID NO: 33
VH 025
SEQ ID NO: 34
VH 025, CDR1
SEQ ID NO: 35
VH 025, CDR2
SEQ ID NO: 36
VH 025, CDR3
SEQ ID NO: 37
VH 109
SEQ ID NO: 38
VH 109, CDR1
SEQ ID NO: 39
VH 109, CDR2
SEQ ID NO: 40
VH 109, CDR3
SEQ ID NO: 41
VH 044
SEQ ID NO: 42
VH 044, CDR1
SEQ ID NO: 43
VH 044, CDR2
SEQ ID NO: 44
VH 044, CDR3
SEQ I D No: 45
VH 087-Lg6
SEQ ID NO: 46
VH 087-Lg6, CDR1
SEQ ID NO: 47
VH 087-Lg6, CDR2
Region VH
SEQ ID NO: 48
VH 087-Lg6, CDR3
SEQ ID NO: 49
VH 098
SEQ ID NO: 50
VH 098, CDR1
SEQ I D No: 51
VH 098, CDR2
SEQ ID NO: 52
VH 098, CDR3
SEQ I D No: 53
VH 111
SEG ID No: 54
VH 111, CDR1
SEQ I D No: 55
VH 111, CDR2
SEQ ID NO: 56
VH 111, CDR3
Region VL
SEQ ID NO: 57
VL 013
SEQ ID NO: 58
VL 013, CDR1
SEQ ID NO: 59
VL 013, CDR2
SEQ ID NO: 60
VL 013, CDR3
SEQ ID NO: 61
VL 114
SEQ ID NO: 62
VL 114, CDR1
SEQ ID NO: 63
VL 114, CDR2
SEQ ID NO: 64
VL 114, CDR3
SEQ ID NO: 65
VL 011
SEQ ID NO: 66
VL 011, CDR1
SEQ ID NO: 67
VL 011, CDR2
SEQ ID NO: 68
VL 011, CDR3
SEQ ID NO: 69
VL 017-D12
Region VH
SEQ ID NO: 70
VL 017-D12, CDR1
SEQ ID NO: 71
VL 017-D12, CDR2
SEQ ID NO: 72
VL 017-D12, CDR3
SEQ ID NO: 73
VL 042
SEG ID No: 74
VL 042, CDR1
SEQ ID NO: 75
VL 042, CDR2
SEQ ID NO: 76
VL 042, CDR3
SEG ID No: 77
VL 092-A09
SEQ ID NO: 78
VL 092-A09, CDR1
SEQ ID NO: 79
VL 092-A09, CDR2
SEQ ID NO: 80
VL 092-A09, CDR3
SEQ ID NO: 81
VL 101
SEQ ID NO: 82
VL 101, CDR1
SEQ ID NO: 83
VL 101, CDR2
SEQ ID NO: 84
VL 101, CDR3
SEQ ID NO: 85
VL 003
SEQ ID NO: 86
VL 003, CDR1
SEQ ID NO: 87
VL 003, CDR2
SEG ID No: 88
VL 003, CDR3
SEQ ID NO: 89
VL 025
SEQ ID NO: 90
VL 025, CDR1
SEQ ID NO: 91
VL 025, CDR2
SEQ ID NO: 92
VL 025, CDR3
Region VH
SEQ ID NO: 93
VL 109
SEQ ID NO: 94
VL 109, CDR1
SEQ ID NO: 95
VL 109, CDR2
SEQ ID NO: 96
VL 109, CDR3
SEQ ID NO: 97
VL 044
SEG ID No: 98
VL 044, CDR1
SEQ ID NO: 99
VL 044, CDR2
SEQ ID NO: 100
VL 044, CDR3
SEQ ID NO: 101
VL 087
SEQ ID NO: 102
VL 087, CDR1
SEQ ID NO: 103
VL 087, CDR2
SEQ ID NO: 104
VL 087, CDR3
SEQ ID NO: 105
VL 098
SEQ ID NO: 106
VL 098, CDR1
SEQ ID NO: 107
VL 098, CDR2
SEQ ID NO: 108
VL 098, CDR3
SEQ ID NO: 109
VL 111
SEQ ID NO: 110
VL 111, CDR1
SEQ ID NO:111
VL 111, CDR2
SEQ ID NO: 112
VL 111, CDR3
Ejemplo 11
Purificacion de anticuerpos 5
El sobrenadante del cultivo se filtro sobre filtros directos de 0,2 pm y se cargo en columnas de Protefna A de 5 ml (rProtefna A FF, Amersham Bioscience) y se eluyo con acido cftrico-NaOH 0,1 M, pH 3. El eluato se neutralizo inmediatamente con Tris-HCl 2M, pH 9 y se sometio a dialisis durante la noche a 12,6 mM NaH2PO4, NaCl 140 mM, pH 7,4 (B. Braun). Despues de la dialisis muestras se esterilizaron mediante filtracion sobre filtros directos de 0,2 10 pm. La pureza se determino mediante SDS-PAGE y la concentracion se midio mediante nefelometrfa y absorbancia a 280 nm. Los anticuerpos purificados se dividieron en alfcuotas y se almacenaron a -80°C. Una vez descongeladas, las alfcuotas de los anticuerpos purificados se mantuvieron a 4°C. Se realizo la espectrometrfa de masas para identificar la masa molecular de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos expresadas por los hibridomas como se describe en el Ejemplo 9.
5
10
15
20
Ejemplo 12
Estudios de competicion cruzada de anticuerpos utilizando ELISA sandwich
Los pocillos de la placa de ELISA se recubrieron durante la noche a +4°C con cada uno de los HuMAbs anti-TF (0,5 o 2 pg/ml 100 pl/pocillo) diluidos en PBS. Los pocillos de ELISA se lavaron con PBS, se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con de suero de pollo al 2% (v/v) (Gibco, Paisley, Escocia) en PBS y se lavaron de nuevo con PBS. Posteriormente, se anadieron 50 pl de HuMab anti-TF (10 pg/mL), seguido de 50 pl de TFECDHis (0,5 o 1 pg/ml) (generado en Genmab; Ejemplo 5), y se incubaron durante 1 hora a RT (con agitacion). Las placas se lavaron 3 veces con PBST (PBS + Tween al 0,05%), y se incubaron con biotina BAM050 anti-His diluido 1:2000 durante una hora a RT (con agitacion). Las placas se lavaron y se incubaron con estreptavidina-poli-HRP (Sanquin, Amsterdam, Pafses Bajos) durante 20 minutos a RT, y se lavaron de nuevo. La reaccion se desarrollo adicionalmente con ABTS (Roche Diagnostics) a RT en la oscuridad, se detuvo despues de 15 minutos mediante la adicion de acido oxalico al 2% (p/v) y se midio la absorbancia a 405 nm.
La Tabla 2 muestra que pudieron ser identificados 3 grupos de bloqueo cruzado (grupos de anticuerpos que competfan entre si por la union a TFECDHis), perteneciendo los anticuerpos 013, 044 y 087-LG6 a un grupo de bloqueo cruzado (grupo I), perteneciendo los anticuerpos 011, 017-D12, 42, 092-A09 y 101 a otro grupo de bloqueo cruzado (grupo II), y perteneciendo los anticuerpos 003, 025, 109 y 111 a un tercer grupo de bloqueo cruzado (grupo III). Se encontro que el anticuerpo 114 competfa por la union a TFECDHis con anticuerpos, del grupo II y III de bloqueo cruzado. La union del anticuerpo 098 a TFECDHis podrfa experimentar competicion por anticuerpos del grupo II y III de bloqueo cruzado.
imagen1
5
10
15
20
25
imagen2
Tabla 2 - Competicion de anticuerpos anti-TF por la union a TFECDHis.
Las casillas de color blanco indican que no hay competicion por la union, las casillas de color gris claro indican competicion parcial por la union, y las casillas de color gris oscuro indican competicion por la union a TFECDHis.
Ejemplo 13
Union de los HuMAb anti-TF al dominio extracelular de TF en el ELISA
La especificidad de los HuMAbs anti-TF obtenidos se evaluo mediante ELISA. Las placas de ELISA (Microlon; Greiner Bio-One) se recubrieron durante la noche a +4°C con 0,5 pg/ml de TFECDHis en PBS, pH 7,4. Las placas de ELISA recubiertas se vaciaron y se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con suero de pollo al 2% (v/v) (Gibco, Paisley, Escocia) en PBS y se lavaron con PBS que contenfa Tween 20 al 0,05% (PBST). Posteriormente, se incubaron HuMAb, diluidos seriadamente en PBSTC (PBS con un suplemento de 2% (v/v) de suero de pollo y Tween-20 al 0,05% (v/v)), durante 1 hora a RT bajo condiciones de agitacion (300 rpm). Los HuMAb unidos se detectaron utilizando anticuerpos de cabra anti-IgG humana conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch) diluidos 1: 5000 en PBSTC, que se incubaron durante 1 hora a rT bajo condiciones de agitacion (300 rpm). La reaccion se desarrollo adicionalmente con ABTS (Roche Diagnostics) a TA en la oscuridad, se detuvo despues de 15-30 minutos mediante la adicion de acido oxalico al 2% (p/v) y a continuacion se midio la absorbancia a 405 nm. Se utilizo HuMab-KLH (un anticuerpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de lapa de ojo de cerradura)), como control negativo. se utilizo anti-TF humano de raton (ERL) como control positivo (anti-IgG de raton marcado con HRP como producto conjugado). Las curvas de union se analizaron mediante regresion no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable) usando el soporte logico GraphPad Prism V4.03.
Como se puede observar en la Figura 3, todos los anticuerpos anti-TF se unieron a TFECDHis. Los valores de CE50 para los HuMAb son la media de 3 experimentos y variaron entre 0,09 y 0,46 nM (Tabla 3 a continuacion).
Tabla 3
grupo
HuMab CE50nM
13 0,24
I
44 0,14
I
87-Lg6 0,09
5
10
15
20
25
grupo
HuMab CE50nM
II
11 0,16
II
017-D12 0,25
II
42 0,23
II
092-A09 0,18
II
101 0,28
II/III
98 0,13
II/III
114 0,17
III
3 0,46
III
25 0,34
III
109 0,27
III
111 0,11
Ejemplo 14
Union de los HuMAb anti-TF a TF unido a membrana
La union de los HuMAb anti-TF a TF unido a la membrana se determino mediante analisis FACS, utilizando celulas CHO transfectadas con TF, o lfneas de celulas tumorales que expresan TF MDA-MB-231, (transfectadas con luciferasa) A431 y Bx-PC3.
Las celulas se resuspendieron en PBS (2 x 106 celulas/ml), se pusieron en placas de 96 pocillos de fondo en V (50 pl/pocillo). Se anadieron 50 pl de HuMab diluido seriadamente en tampon FACS (PBS con un suplemento de BSA al 0,1% y azida sodica al 0,02%) a las celulas y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Despues de lavar tres veces con tampon FACS, se anadieron 50 pl de anti-IgGFc humano de cabra conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch), diluido 1:100 en tampon FACS. Despues de 30 minutos en hielo (en la oscuridad), las celulas se lavaron tres veces, y la union especffica de los HuMAb se detecto mediante citometrfa de flujo en un FACSCalibur (BD Biosciences). El HuMab-KLH se uso como control negativo. El anti-TF de raton seguido del anti-IgGFc de raton conjugado con PE se utilizo como control positivo. Las curvas de union se analizaron mediante regresion no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable) utilizando el soporte logico GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.).
La Figura 4 muestra un ejemplo de curvas de union de los HuMAb especfficos de TF a las celulas MDA-MB-231. La Tabla 4 presenta un resumen de los valores de CE50 de la union de los HuMAb especfficos de TF a celulas CHO transfectadas con TF (S1015-TF), celulas MDA-MB-231, A431 y Bx-PC3.
Tabla 4 - Resumen de CE50 y valores del fndice maximo de fluorescencia media (IMF max) determinados mediante analisis FACS de la union de los HuMAb especfficos del TF a diferentes tipos de celulas.
MDA-MB-231 Bx-PC3 A431 S1015-TF-012
grupo
HuMab TF CE50 IMF Max CE50 IMF Max CE50 IMF Max CE50 IMF Max
I
13 1,58 2451 1,86 1305 8,04 3622 1,07 5207
I
44 0,87 1881 1,88 1136 1,45 2646 2,13 5021
I
87-Lq6 8,28 1107 7,19 1030 nt nt nt nt
II
11 0,47 2143 1,01 1280 0,20 2606 1,32 5654
5
10
15
20
25
30
MDA-MB-231 Bx-PC3 A431 S1015-TF-012
grupo
HuMab TF CE50 IMF Max CE50 IMF Max CE50 IMF Max CE50 IMF Max
II
017-D12 1,33 2401 1,61 1422 1,24 3296 1,21 5792
II
42 0,25 1518 2,45 1701 nt nt nt nt
II
092-A09 0,53 2290 0,84 1262 0,83 3137 1,32 5409
II
101 0,85 2071 2,25 1220 3,16 2934 1,77 5859
II/III
98 0,99 1956 1,38 1151 1,40 2755 0,96 5229
II/III
114 0,47 2438 0,80 1407 0,90 3433 1,72 6095
III
3 3,20 1798 4,98 1106 6,94 2530 2,06 4247
III
25 0,69 2254 0,88 1320 5,19 3170 0,73 5808
III
109 2,16 2052 4,04 1324 1,74 3124 0,92 5629
III
111 1,03 1774 1,83 1128 2,88 3043 0,55 5353
Los valores de CE50 estan en nM. El IMF Max para las celulas MDA-MB-231, BxPC3 y A431 con el anticuerpo a 30 pg/mL, para S1015-TF con el anticuerpo a 7,5 pg/ml.
Ejemplo 15
Inhibicion de la union de FVI a TF
La inhibicion de la union de FVIIa a TFECDHis mediante TF-HuMAb se midio mediante ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron durante la noche con TFECDHis (0,5 pg/ml, 100 pL por pocillo). Las placas se vaciaron, se bloquearon con PBS que contenfa suero de pollo al 2% (v/v) (1 hora, RT), y se vaciaron de nuevo. Se anadieron a los pocillos diluciones seriadas 1:4 de TF-HuMAb o HuMab-KLH (control negativo), seguido de FVIIa a una concentracion CE50 (100 nM), y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (mientras se agitaba, 300 rpm). Las placas se lavaron y se incubaron con anti-FVIIa de conejo (2,5 pg/ml; Abcam) como antes. Las placas se lavaron y se incubaron con anticuerpo porcino anti-IgG de conejo conjugado con HRP (1:2500; DAKO). Despues de lavar, los complejos inmunes se visualizaron utilizando ABTS como sustrato. La reaccion se detuvo mediante la adicion de acido oxalico al 2% v/v, seguido por medicion de la densidad optica a 405 nm utilizando un lector de ELISA. La concentracion de anticuerpo necesaria para obtener una inhibicion de 50% (CI50) se calculo utilizando GraphPad Prism (analisis de regresion no lineal).
La Figura 5 muestra que los anticuerpos de los grupos II y III de bloqueo cruzado inhibieron eficazmente la union de FVIIa a TF, mientras que los anticuerpos del grupo I de bloqueo cruzado no inhibieron (o lo hicieron en un grado mucho menor) la union de FVIIa.
La Tabla 5 muestra los valores de CI50 y valores de inhibicion maxima (porcentaje) de inhibicion de la union de FVIIa a TF por los HuMAb especfficos de Tf.
Tabla 5 - Valores de CI50 y valores de inhibicion maxima (porcentaje) de inhibicion de la union de FVI a TF
por los HuMAb especfficos de TF
grupo
HuMab TF CI50 nM Inhibicion max
I
13 19,3 27
I
44 0,8 54
I
87-Lg6 na 35
5
10
15
20
25
grupo
HuMab TF CI50 nM Inhibicion max
II
11 1,1 91
II
017-D12 1,9 90
II
42 2,7 88
II
092-A09 1,5 90
II
101 0,6 84
II/III
98 0,8 85
II/III
114 1,3 90
III
3 1,9 89
III
25 2,1 90
III
109 1,7 90
III
111 1,7 79
Ejemplo 16
Inhibicion de la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa
Tras la union del factor de coagulacion Vila (FVIIa) a TF, se activa la fosforilacion de la quinasa activada por mitogenos (MAPK p42 y p44 o ERKl y ERK2). La lfnea celular A431 de carcinoma epidermoide expresa altos niveles de TF, y despues de la estimulacion con FVIIa se induce una fosforilacion de ERK (ERK-P) optima (3 a 5 veces), medida utilizando el analisis AlphaScreen Surefire ERK (Perkin Elmer), en el plazo de 10 minutos.
Las celulas A431 (30.000 celulas por pocillo) se sembraron en placas TC de 96 pocillos, y se cultivaron O/N (37°C, 5% de CO2, 85% de humedad) en medio libre de suero (RPMI que contenfa HSA al 20% y penicilina/estreptomicina). A continuacion, se sustituyo el medio por DMEM (sin aditivos) y se incubaron las celulas durante 1,5 horas. Se anadieron diluciones seriadas 1:3 de HuMAb TF o HuMab-KLH y las celulas se incubaron durante 0,5 horas. Las celulas se estimularon a continuacion con FVIIa a una concentracion EC80 (50 nM; 10 minutos; 37°C, 5% de CO 2, 85% de humedad). Las celulas se lavaron una vez con PBS, y se lisaron usando 25 pl de tampon de lisis (Perkin Elmer, kit Surefire). Los productos lisados se centrifugaron (3 minutos, 330 x g, RT). Se transfirieron 4 pl de sobrenadante a Proxiplates de 384 pocillos (Perkin Elmer). Se anadieron 7 pl de mezcla de tampon de Reaccion/tampon de Activacion que contenfa esferas AlphaScreen (kit Surefire de Perkin Elmer), y las placas se incubaron en la oscuridad durante 2 horas a RT. Las placas se leyeron usando el protocolo "Surefire Plus" de la tecnologfa Envision.
La Figura 6 muestra que, medido utilizando el analisis para ERK AlphaScreen Surefire, el anticuerpo 013 no inhibe la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa, 044 y 111 inhiben moderadamente la fosforilacion de ERK, y todos los demas anticuerpos bloquean eficazmente la fosforilacion de ERK.
La Tabla 6 muestra los valores de CI50 y los valores de inhibicion maxima (en porcentaje) de la inhibicion de la fosforilacion de ERK inducida por VIIa por los HuMAb especfficos de TF, medida usando el analisis AlphaScreen Surefire ERK.
grupo
HuMab TF CI50 nM % inhibicion max
I
13 9,11 26
I
44 > 66,6 45
I
87-Lg6 nt nt
II
11 0,79 69
5
10
15
20
25
30
35
40
grupo
HuMab TF CI50 nM % inhibicion max
II
017-D12 2,01 65
II
42 nt nt
II
092-A09 1,27 68
II
101 1,05 57
II/III
98 1,89 64
II/III
114 1,08 68
III
3 7,99 63
III
25 2,16 66
III
109 2,42 72
III
111 > 66,6 52
Tabla 6 - Valores CI50 y valores de inhibicion maxima (porcentaje) de inhibicion de la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa (medida utilizando el analisis para ERK AlphaScreen Surefire) por los HuMAb espedficos de TF.
Los resultados obtenidos en el analisis para ERK AlphaScreen Surefire se confirmaron mediante analisis de Transferencia Western, utilizando lmeas celulares HaCaT y BxPC3. Se sembraron 30.000 celulas/pocillo en DMEM que contema concentraciones mmimas de suero (medio de inanicion) y se cultivaron durante la noche. Las celulas se cultivaron adicionalmente durante 2 horas en DMEM sin suero, se anadieron anticuerpos anti-TF durante los ultimos 30 minutos de cultivo. Las celulas se estimularon con FVIIa 0, 10 o 50 nM durante 10 minutos (37°C), y con posterioridad se lisaron en tampon de lisis celular (tampon de lisis de 50 pL por pocillo, lisis de 30-60 minutos en condiciones agitacion, RT). Se anadieron a cada muestra 25 pL de tampon de muestra que contema SDS. Las muestras se cargaron en geles de SDS-PAGE, se hicieron migrar y se transfirieron utilizando procedimientos convencionales para la transferencia Western. Las transferencias se bloquearon con TBST1x que contema protema irrelevante al 5% (ELK) durante 1 hora a RT. Las transferencias se incubaron con anticuerpo de conejo anti-ERK-P (O/N, 4°C). Las transferencias se lavaron con TBST1x, y se incubaron con anti-IgG de conejo HRP (1 hora, RT), se lavaron, se revelaron utilizando sustrato de HRP y se obtuvo la imagen utilizando el sistema Optigo Ultima Imaging (Isogen Life Sciences).
La Figura 6A muestra los resultados en celulas BxPC3 para un sub-panel de anticuerpos. La fosforilacion de ERK inducida por 10 nM de FVIIa no fue inhibida por el anticuerpo 013, mientras que fue inhibida de manera eficiente por los anticuerpos 111, 044 y 025 (este ultimo como un ejemplo para todos los demas HuMAb espedficos de TF descritos aqrn). La fosforilacion mas fuerte de ERK inducida (FVIIa 50 nM) no fue inhibida por los anticuerpos 013, 111 y 044, pero fue inhibida por el anticuerpo 025.
Ejemplo 17
Inhibicion de la liberacion de IL-8 inducida por FVIIa
La capacidad de los HuMAb espedficos de TF para inhibir la liberacion inducida por FVIIa de IL-8 se sometio a ensayo utilizando celulas MDA-MB-231. Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos (60.000 celulas/pocillo) y se cultivaron (O/N, 37°C, 5% de CO2) en CS que contema DMEM, piruvato de sodio, L-glutamina, MEM NEAA y penicilina/estreptomicina. El medio de cultivo de tejidos se retiro, las celulas se lavaron dos veces en medio libre de suero, con alto contenido de calcio (DMEM que contema penicilina/estreptomicina), y se cultivaron en este medio durante 105 minutos adicionales. Se anadieron diluciones seriadas de anticuerpos, y las celulas se cultivaron cultivadas durante 15 minutos. Se anadio FVIIa (Novo Nordisk; concentracion final 10 nM) y las celulas se cultivaron durante 5 horas. El sobrenadante se retiro y se centrifugo (300 xg, RT). Se midieron las concentraciones de IL-8 en el sobrenadante utilizando un kit de ELISA de IL-8 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sanquin).
La Figura 7 muestra que los anticuerpos de los grupos II y III de bloqueo cruzado inhibian eficazmente la liberacion de IL-8 inducida por FVIIa por las celulas MDA-MB-231, con la excepcion del anticuerpo 111 del grupo III de bloqueo cruzado. Ninguno de los anticuerpos del grupo I de bloqueo cruzado (013, 044 y 87-LG6) inhibio la liberacion de IL-8
5
10
15
20
25
30
inducida por FVIIa.
La Tabla 7 muestra los valores de CI50 y los valores de inhibicion maxima (en porcentaje) de la inhibicion de la liberacion de IL-8 inducida por FVIIa por los HuMAb espedficos de TF.
Tabla 7 - Valores de CI50 y valores de inhibicion maxima (porcentaje) de la inhibicion de la liberacion de IL-8
inducida por FVIIa por los HuMAb espedficos de TF.
grupo
HuMab TF CI50 nM inhibicion max
I
13 na -0,3
I
44 74,6 17,2
I
87-Lg6 na 4,3
II
11 9,4 61,7
II
017-D12 9,0 65,8
II
42 14,9 53,7
II
092-A09 28,2 66,6
II
101 22,7 74,9
II/III
98 9,3 59,0
II/III
114 9,2 71,5
III
3 23,7 76,2
III
25 23,1 75,6
III
109 13,6 70,4
III
111 >200 40,1
Ejemplo 18
Inhibicion de la generacion de Fxa
La capacidad de los HuMAb espedficos de TF para inhibir la generacion de FXa se sometio a ensayo en un analisis en el que se mide la conversion de FX en FXa por el complejo TF/FVIIa utilizando un sustrato espedfico de FXa colorimetrico. Se anadio TF (Innovin) a placas de 96 pocillos de fondo plano, junto con una dilucion seriada de los HuMAb espedficos de TF, control positivo (anti-TF de raton), control negativo (HuMab-KLH) (todo diluido en tampon Hepes que contema CaCl2 3 mM. Las placas se incubaron durante 30 minutos a RT, y se anadieron FVIIa (concentracion final 1 nM) y FX (ERL; concentracion final 200 nM). Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Se transfirieron 50 pl de cada pocillo a una placa de 96 pocillos que contema tampon de parada (EDTA 5 mM en 100 ml de tampon Hepes) (pre-calentado, 37°C). Se anadio sustrato espedfico de FXa Chromogenix-2765 (Instrumation Laboratory Company), las placas se incubaron durante 60 minutos a 37°C y se midio la DO405 nm a 37°C.
La Figura 8 muestra que el anticuerpo 017-D12 inhibia fuertemente la generacion de FXa, 013 demostro inhibicion intermedia y los demas anticuerpos mostraron de baja a ninguna inhibicion de la generacion de FXa.
La Tabla 8 muestra los valores de CI50 y los valores de inhibicion maxima (porcentaje) de la inhibicion de la generacion de FXa por los HuMAb espedficos de TF.
5
10
15
20
25
Tabla 8 - Valores de CI50 y valores de inhibicion maxima (en porcentaje) de la inhibicion de la generacion de FXa
por los HuMAb especfficos de TF.
grupo
HuMab TF CI50 nM % inhibicion max
I
13 0,05 31
I
44 NA 3
I
87-Lg6 nt nt
II
11 0,05 26
II
017-D12 0,28 84
II
42 nt nt
II
092-A09 0,30 21
II
101 nt nt
II/III
98 0,43 14
II/III
114 0,24 21
III
3 0,07 21
III
25 0,30 19
III
109 0,09 18
III
111 0,07 7
Ejemplo 19
Inhibicion de la coagulacion sangufnea
La inhibicion de la coagulacion de la sangre por los HuMAb TF se midio en un analisis de determinacion del tiempo de coagulacion inducido por TF. Las mezclas de 17 pl de CaCl2 100 mM (conc. final de 17 mM), 10 pl de Innovin 1:100 (conc. final 1:1000), 23 pl de 1x tampon HEPES y se prepararon 50 pl anticuerpo diluido seriadamente en placas de 96 pocillos. Se anadieron 50 pl de plasma humano agrupado a pocillos de placas Immulon 2B (Thermo Electron). Se anadieron 50 pl de las mezclas de anticuerpos preparadas a las placas Immulon 2b, y se midio el desarrollo de la coagulacion a 405 nm cada 15 s durante 25 min utilizando un lector de placas cinetico. Se represento el aumento de la densidad optica a lo largo del tiempo y se calculo el tiempo de coagulacion (t1/2). El tiempo de coagulacion se represento frente a la concentracion de anticuerpo. La CI50 de la inhibicion de la coagulacion inducida por anticuerpos se calculo a partir de esto mediante analisis de regresion no lineal utilizando GraphPad Prism.
La Figura 9 muestra que los anticuerpos 044, 087 y 111 no inhibieron la coagulacion de la sangre inducida por TF, mientras que todos los demas anticuerpos si lo hicieron.
La Tabla 9 muestra los valores de CI50 de inhibicion de la coagulacion de la sangre por los HuMAb especfficos de TF.
Tabla 9 - Valores de CI50 de la inhibicion de la coagulacion de la sangre por los HuMAb especfficos de TF.
grupo
HuMab TF CI50 nM
I
13 0,6
I
44 NA
5
10
15
20
25
30
35
grupo
HuMab TF CI50 nM
I
87-Lg6 NA
II
11 1,6
II
017-D12 2,6
II
42 1,5
II
092-A09 0,2
II
101 0,7
II/III
98 1,1
II/III
114 0,4
III
3 7,3
III
25 2,3
III
109 7,6
III
111 NA I
Ejemplo 20
Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos Preparacion de las celulas diana:
Se cosecharon celulas diana que expresaban TF (5x106 celulas Bx-PC3, celulas MDA-MB-231 o celulas A431), se lavaron (dos veces en PBS, 1500 rpm, 5 min) y se recogieron en 1 ml de medio de cultivo RPMI 1640 con un suplemento de Cosmic Calf Serum, Piruvato de Sodio, L-Glutamina, MEM NEAA y Penicilina/Estreptomicina, a lo que se anadieron 100 pCi de 51Cr (cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Pafses Bajos). La mezcla se incubo en un bano de agua con sacudimiento durante 1 hora a 37°C. Despues del lavado de las celulas (dos veces en PBS, 1500 rpm, 5 min), las celulas se resuspendieron en medio de cultivo y las celulas viables se contaron mediante exclusion de azul de tripano. Las celulas viables se llevaron a una concentracion de 1X105 celulas/ml.
Preparacion de celulas efectoras:
Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de capas leucocitarias de nueva aportacion (Sanquin, Amsterdam, Pafses Bajos) utilizando centrifugacion por gradiente de densidad Ficoll convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante (medio de separacion de linfocitos; Lonza, Verviers, Francia). Despues de la resuspension de las celulas en medio de cultivo, las celulas se contaron mediante exclusion de azul de tripano y se llevaron a una concentracion de 1X107 celulas/ml.
Establecimiento de la ADCC:
Se transfirieron 50 pl de celulas dianas marcadas con 51Cr a pocillos de microtitulacion, y se anadieron 50 pl de anticuerpo diluido seriadamente, diluidos en medio de cultivo. Se incubaron las celulas (RT, 15 min), y se anadieron 50 pl de celulas efectoras, dando como resultando una razon de efector a diana de 100:1. Para determinar el maximo nivel de lisis, se anadieron 100 pl de Triton-X100 al 5% en lugar de las celulas efectoras; para determinar el nivel espontaneo de la lisis, se anadieron 100 pl de medio de cultivo; para determinar el nivel de anticuerpos independiente de la lisis, se anadieron 50 pl de celulas efectoras y 50 pl de medio de cultivo). Con posterioridad, las celulas se incubaron O/N a 37°C, 5% de CO2. Despues centrifugar las celulas (1200 rpm, 3 min), se transfirieron 75 pl de sobrenadante a tubos micronicos. El 51Cr liberado se conto en un contador gamma y se calculo el porcentaje de lisis mediada por anticuerpo de la siguiente manera:
5
10
15
20
25
30
((Cpm de la muestra - cpm de la lisis independiente de anticuerpo)/(cpm de la lisis maxima - cpm de la lisis espontanea)) x 100%
en donde es cpm cuentas por minuto.
La Figura 10 muestra que todos los HuMAb TF sometidos a ensayo indujeron la lisis de celulas PC3-Bx por ADCC, aunque con diferentes eficacias (CE50).
La Tabla 10 muestra los valores de CE50 (nM) de ADCC de diferentes lfneas celulares por HuMAbs especfficos de TF.
Tabla 10 - Valores de CE50 (nM) de ADCC de diferentes lfneas celulares de HuMAb especfficos de TF.
MDA-MB-231 Bx-PC3 A431
grupo
HuMab TF CE50 CE50 CE50
I
13 0,06 0,07 0,11
I
44 0,08 0,12 0,19
I
87-Lg6 nt nt nt
II
11 0,07 0,22 0,06
II
017-D12 0,14 0,13 0,18
II
42 nt nt nt
II
092-A09 0,11 0,13 0,22
II
101 0,10 0,09 0,01
II/III
98 0,15 0,02 0,07
II/III
114 0,07 0,07 0,08
III
3 0,29 0,17 0,58
III
25 0,24 0,15 0,16
III
109 0,12 0,06 0,13
III
111 0,84 0,22 1,56
Ejemplo 21
Deposito de complemento
El deposito de los fragmentos del complemento C3c y C4c en celulas diana incubadas con HuMab TF se midio mediante analisis FACS. Se sembraron celulas diana que expresaban TF (celulas Bx-PC3 o MDA-MB-231) en placas de fondo redondo de 96 pocillos (1x105 celulas/pocillo) en RPMI que contenfa BSA al 1%. Se anadio anticuerpo (30 pg/ml) y las celulas se incubaron a RT durante 15 minutos. Se anadieron 25 pL de suero humano reunido como fuente de complemento, el suero humano inactivado por calor se utilizo para determinar la union espontanea del complemento. Las celulas se incubaron a 37°C durante 45 minutos. Las celulas se lavaron una vez, y se incubaron con anti-C3c humano FITC o anti-C4c humano FITC (DAKO) en tampon FACS, y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las muestras se analizaron mediante FACS Canto.
La Figura 11 muestra que los anticuerpos de grupo I de bloqueo cruzado no indujeron el deposito de C3c o C4c en ninguna de las celulas BxPC3 o MDA-MB-231. Todos los anticuerpos sometidos a ensayo de grupo II de bloqueo cruzado indujeron deposito de C3c y C4c, al igual que los anticuerpos de grupo III de bloqueo cruzado, con la excepcion del anticuerpo 003.
5
10
15
20
25
30
Estudios avidez/afinidad Determinacion de la afinidad:
La union del anticuerpo a TF se analizo mediante resonancia de plasmon superficial en un BIAcore 3000 (GE Healthcare). Se utilizo TFECDHis para el analisis. Los anticuerpos HuMab (500 unidades de resonancia) se inmovilizaron sobre el chip sensor CM-5 de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. En pocas palabras, despues de activacion de la superficie mediante EDC y NHS el anticuerpo HuMab se inyecto sobre la superficie CM-5 activada en acetato de sodio 10 mM, oscilando el pH de 4,0 a 5,5 a 5 pl/min, seguido de etanolamina 1 M para la desactivacion. Se inyectaron una serie de concentraciones de TFECDHis en tampon HBS- EP sobre los anticuerpos inmovilizados a una velocidad de flujo de 30 pl/min durante 180 seg. La regeneracion de la superficie de HuMab se realizo mediante la inyeccion de glicina-HCl 10 mM pH 2,0 o acetato de sodio 10 mM de pH 3,0. El analisis cinetico se realizo utilizando la resta doble de referencia y el modelo de analisis de union 1:1 (Langmuir).
La Tabla 1 muestra 1 para la mayorfa de los HuMAb la afinidad determinada en el intervalo (sub)nanomolar. Los parametros cineticos no se pudieron determinar a partir de todos los anticuerpos. 044 produjo una alta variacion en las tasas de disociacion (kd) y tuvo un elevado nivel de residuos, lo que significa que el ajuste de las curvas no fue bueno. 098, 111 y 087-LG6 tuvieron tasas de disociacion, que fueron demasiado altas para el Biacore 3000 para medirlas.
Tabla 11. Constantes cineticas de HuMAbs TF para determinar la reactividad con mediciones de afinidad de TFECDHis.
grupo
HuMab TF afinidad nM ka (1/Ms) kd (1/s)
I
13 2,78 5,67E+05 1,57E-03
I
44 n.a. 8,77E+04 variable
I
87-Lg6 n.a. 5,91 E+05 n.a.
II
11 3,15 2,86E+05 9,02E-04
II
017-D12 2,55 1,02E+05 2,59E-04
II
42 4,22 1,64E+05 6,90E-04
II
092-A09 14,1 1,42E+05 2,00E-03
II
101 3,4 3,18E+05 1,07E-03
II/II
98 n.a. 2,90E+05 n.a.
II/II
114 11 1,77E+05 1,95E-03
III
3 4,51 2,33E+05, 1,26E-03
III
25 1,97 3,29E+05 6,50E-04
III
109 4,75 1,65E+05 7,77E-04
III
111 n.a. 2,13E+05 n.a.
n.a. no evaluable = > 10-3 sec-1
Determinacion de la avidez:
El TF (TFECDHis) que se une a los HuMAb especfficos de TF se determino esencialmente como se ha descrito anteriormente, inmovilizando TFECDHis sobre en el chip sensor CM-5 (300 unidades de resonancia), y la serie de concentraciones de los anticuerpos HuMab utilizados para el analisis cinetico. El analisis cinetico se realizo
61
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20
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40
45
utilizando la resta doble de referencia y el modelo de analisis de union 1:1 (Langmuir). La Tabla 12 muestra las mediciones de avidez de los anticuerpos 11, 98, 109 y 111. Mientras que las mediciones de afinidad para 98 y 111 indicaron altas tasas de disociacion (mas alla de los lfmites de determinacion de Biacore (es decir, > 10~3)), la determinacion de la avidez revelo interaccion en el rango nanomolar.
Tabla 12. Constantes cineticas de TFECDHis para determinar la reactividad con mediciones
de avidez de los HuMAb TF.
Grupo
HuMab TF avidez nM
II
11 0,47
II/III
98 4,85
III
109 0,01
III
111 0,11
Ejemplo: 23
Analisis inmunohistoqufmico de la union a tejidos humanos normales y tumores pancreaticos
La union de los HuMAb TF a diversos tejidos humanos que se sabe que expresan TF (colon, corazon, rinon, piel, pulmon y cerebro) se determino por medio de inmunohistoqufmica (IHC).
IHC en tejido congelado
Se cortaron secciones de tejido congelado (4-6 pm de espesor) y se fijaron en acetona. Se bloqueo la peroxidasa (PO) endogena de tejido y se incubaron previamente secciones de tejido con suero humano normal para evitar la union aespecffica de anticuerpos aplicados con posterioridad a los receptores de Fc endogenos. Se aplico Ab de raton dirigido contra TF humano (y Ab de raton de control negativo) a los tejidos a una dilucion optima y posteriormente se detecto con Powervision-PO (IgG anti-raton/conejo de cabra)-PO. Los HuMAb especfficos de tF se acoplaron a Fab' anti-IgG (Fc) humano-FITC de cabra y, despues de eso se aplicaron a los portaobjetos de tejido congelado en 3 diluciones, incluyendo una dilucion optima predeterminada. Con posterioridad, el complejo de HuMab - Fab-FITC se detecto mediante anti-FITC de conejo y Powervision-PO. La actividad PO se visualizo con AEC como sustrato y los nucleos se visualizaron con hematoxilina. La tincion se analizo mediante microscopio de campo claro.
IHC con Ab de raton en tejido fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE)
Se cortaron biopsias de tejido FFPE a 4 pm, se desparafinaron, se bloquearon para determinar la peroxidasa endogena del tejido y se sometieron a recuperacion de antfgenos (pH 6, tampon citrato). Antes de la incubacion con el tejido con Ab de raton los portaobjetos se preincubaron en suero humano normal para evitar la union aespecffica a los receptores de Fc endogenos. El Ab de raton dirigido contra TF humano (y el Ab de raton de control negativo) se aplico a los portaobjetos de tejido a una dilucion optima y posteriormente se detecto con Powervision-PO (anti-IgG de raton/conejo de cabra)-PO. La actividad PO se visualizo con AEC como sustrato y los nucleos se visualizaron con hematoxilina. La tincion se analizo mediante microscopio de campo claro.
La Figura 12 muestra un ejemplo de la union del anticuerpo 013 (tincion positiva), aceite (tincion positiva), 114 (tincion positiva) y 111 (tincion intermedia) a los glomerulos del rinon. Los anticuerpos 098 y 044 no se unieron a los glomerulos.
La Tabla 13 proporciona una vision general de los resultados de la tincion para todos los HuMAb TF de rinon humano en todos los tejidos examinados.
Tabla 13. Tincion IHC de glomerulos humanos
Grupo
HuMab TF IHC de glomerulos humanos
I 13
13
I
44 -
Grupo
HuMab TF IHC de glomerulos humanos
I
87-Lg6 nt
II
11 +
II
017-D12 +
II
42 nt
II
092-A09 nt
II
101 +
II/III
98 -
II/III
114 +
III
3 +
III
25 nt
III
109 +
III
111 +/-
La Tabla 14 proporciona una vision general de los resultados de la tincion de HuMAb especfficos de TF en rinon, colon, corazon, cerebro y piel humanos, asf como en tumores pancreaticos humanos.
5 Tabla 14. Tincion IHC de tejido humano normal y tumores pancreaticos.
Ab
Rinon Hu Colon Hu Corazon Hu Cerebro Hu Piel Hu tumor pane
13
corpusculo renal + membrana basal ++ - + epidermis + + + +
114
corpusculo renal ++ membrana basal ++ - + + epidermis ++ + + + +
11
corpusculo renal + membrana basal ++ - + + n a. (+) + + +
44
- membrana basal + - +/- n.a. + +
98
- membrana basal + - +/- n a. (+) + + +
111
corpusculo renal +/- membrana basal + - + n.a. + + +
El analisis IHC de la union de HuMAb TF a tumores pancreaticos humanos revelo una tincion positiva para todos los 10 HuMAb TF (ilustrado en la figura 13).
Ejemplo 24:
Tratamiento de xenoinjerto de tumor MDA-MB-231 establecido en almohadillas de grasa mamarias de ratones SCID 15
La eficacia in vivo de los HuMAb TF se determino en los tumores de xenoinjertos MDA-MB-231 ortotopicos establecidos en ratones SCID. Se inyectaron s.c. 2x106 celulas tumorales en PBS en la segunda almohadilla de grasa mamaria de ratones SCID hembra, seguido de tratamiento con HuMAb TF o mAb de control (HuMab-KLH), partiendo de un momento en el que los tamanos tumorales se volvieron medibles. Los anticuerpos se inyectaron el 20 dfa 21 (260 pg/raton), dfa 28 (130 pg/raton) y el dfa 42 (130 pg/raton). El volumen del tumor se determino al menos 2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
veces/semana. Los volumenes (mm3) se calcularon a partir de mediciones con calibre (PLEXX) como 0,52 x (longitud) x (anchura)2.
La Figura 14 muestra que los anticuerpos 114, 111, 013, 098, 011 y 044 eran todos eficaces en la inhibicion del crecimiento de tumores MDA-MB-231 ortotopicos establecidos.
Ejemplo 25:
Dosificacion repetida piloto de un HuMab especffico de TF en monos cynomolgus
Para obtener informacion inicial sobre la toxicologfa de los HuMAb especfficos de TF, incluyendo una evaluacion de la capacidad de los anticuerpos para interferir en la cascada de coagulacion y por lo tanto aumentar potencialmente el riesgo de hemorragia en los animales expuestos, se llevo a cabo una estudio de dosificacion repetida piloto en monos cynomolgus.
Dos monos cynomolgus (Macaca fascicularis) macho y dos hembra, de aproximadamente 2 anos de edad, recibieron inyecciones intravenosas de anticuerpo 011:
• dfa 1 de estudio: 0 mg/kg (solo vehfculo)
• dfa 8: 1 mg/kg; 1 mL/minuto
• dfa 15: 10 mg/kg; 1 mL/minuto
• dfa 22: 100 mg/kg; 1 mL/minuto
Los animales fueron seguidos hasta dfa 27, momento en el cual, los animales fueron sacrificados para la evaluacion por necropsia e histologica de los organos.
Los criterio de valoracion principales del estudio fueron:
• observaciones clfnicas: determinadas diariamente, signos de sangrado de las encfas, ojos.
• tiempo de hemorragia funcional y perdida de sangre: determinados los dfas 1, 8, 15 y 22 (1, 24 y 120 h despues de la dosificacion) y en dos momentos anteriores a la prueba.
• sangre/rastros de sangre/coagulos: Tincion HE de todos los tejidos (determinada en los tejidos obtenidos en el sacrificio final)
• sangre en la orina, heces, vomito: determinado diariamente/semanalmente.
No se observo toxicidad aparente de la dosificacion repetida, creciente del anticuerpo 011. Los animales no mostraron signos clfnicos y no hubo ninguna indicacion de liberacion de citoquinas. Ademas, no hubo signos clfnicos aparentes de un sistema de coagulacion comprometido o hemorragias sistemicas. En el momento de 1 h despues de la dosis, la media del tiempo de sangrado el dfa 22 fue significativamente mayor que la observada el dfa 1 (p =
0. 012). No hubo otras diferencias estadfsticamente significativas entre los dfas 8, 15 y 22 en comparacion con el Dfa
1. Ademas, se encontro que no hubo toxicidad aparente para los organos importantes y no hubo efectos hematologicos adversos. La conclusion preliminar sobre la evaluacion histologica de los tejidos de este estudio es que no hubo hallazgos histologicos en los cuatro animales tratados que pudieran atribuirse al tratamiento con el elemento de analisis.
La Figura 15 muestra los puntos de datos individuales para cada animal (muestras duplicadas) como una funcion del tiempo. Los tiempos de sangrado de 4 animales se determinaron los dfas 1, 8, 15 y 22 (1, 24 y 120 h) y en dos momentos previos a la prueba.
Ejemplo 26
Tratamiento preventivo y terapeutico de xenoinjertos de tumor BxPC3 en ratones SCID
Se determino la eficacia in vivo de los HuMAb TF en el tratamiento preventivo o terapeutico de xenoinjertos de celulas BxPC3 en ratones SCID. Se inyectaron s.c. 10x106 celulas tumorales BxPC3 en PBS en ratones SCID hembra, seguido de tratamiento con HuMAb TF o mAb de control (HuMab-KLH). Para el tratamiento preventivo, los anticuerpos (400 pg/raton) se inyectaron i.p. 1 hora despues de la induccion del tumor. Para el tratamiento terapeutico, se inicio la inyeccion del anticuerpo (300 pg/raton) el dfa 8 despues de la induccion del tumor, seguida de inyecciones de anticuerpos semanales (150 pg/raton). El volumen del tumor se determino al menos 2 veces a la semana. Los volumenes (mm3) se calcularon a partir de mediciones con calibre (PLEXX) como 0,52 x (longitud) x (anchura)2.
La Figura 16 muestra que los HuMAb especfficos de TF son susceptibles de tratamiento preventivo asf como de terapeutico de tumores de xenoinjertos BxPC3.
5
10
15
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30
35
Barajado de ADN entre TF murino y humano para determinar dominios importantes para la union de los HuMAb anti- TF
Para determinar los dominios importantes para la union de los HuMAb anti-TF a TF humano, se llevo a cabo el barajado de ADN entre TF humano y murino. Los constructos barajados se prepararon a partir de ADN que codificaba TF humano, mediante la sustitucion de dominios humanos por dominios murinos y de ADN que codificaba TF murino mediante la sustitucion de dominios murinos por dominios humanos. Si un dominio de TF humano es importante para la union de un HuMab anti-TF, la union se perdera despues del reemplazo de ese dominio por el dominio murino. Los TF humano y murino son homologos en 57% a nivel de protefna. Las Figuras 17A y 17B muestran los constructos de TF humano que contienen dominios TF murinos (TFhs, que contienen dominios TFmm) y para TF murino que contiene dominios de TF humano. Las celulas HEK293F fueron transfectadas transitoriamente con los constructos o con el vector solo (pcDNA3.3SP; simuladamente). El analisis FACS se realizo esencialmente como se ha descrito anteriormente, con 30 pg/ml de material parental purificado. Se utilizo HuMab-KLH como un control de Ab.
La Figura 17 muestra que todos los HuMAb anti-TF menos uno se unen unicamente a TF humano y no a TF murino. El HuMab-TF-003 muestra algunos union a TF murino.
La Figura 18 A a O muestra los resultados para la union de los diferentes HuMAb anti-TF a los constructos expresados en las celulas HEK293F. Estos resultados se resumen en la Tabla 15. En esta tabla los HuMAb anti-TF se clasifican en grupos, basandose en los dominios de TF humano que son importantes para la union de estos HuMAb.
Tabla 15
Constructos barajados: TFhs-
HuMab que muestran disminucion de la union
1-41 mm
Ninguno
42-84 mm
11, 17, 42, 92, 98, 101, 111
85-122 mm
25, 42, 98, 109, 111
123-137 mm
44, 114
185-225 mm
13, 27, 44, 87
226-250 mm
44
Grupos basados en la union a constructos barajados
HuMab en el grupo
1. 42-84
11, 17, 92, 101
2. 42-84 + 85-122
42, 98, 111
3. 85-122
25, 109
4. 123-137
114
5. 185-225
13, 27, 87
6. 123-137 + 185-225 + 226-250
44
Ejemplo 28
Union de fragmentos Fab de los HuMAb anti-TF al dominio extracelular de TF determinado mediante ELISA, y a TF celular en celulas BxPC3, determinado mediante FACS
La union de los fragmentos Fab de los HuMAb anti-TF a TF se midio mediante ELISA (dominio extracelular recubierto de TF) y mediante FACS (TF en celulas BxPC3). El ELISA se realizo esencialmente como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos Fab unidos se detectaron utilizando anti-H+L humano de burro conjugado con HRP. El analisis FACS se realizo esencialmente como se ha descrito anteriormente. Se utilizo anti- IgG humana (H+L) de
65

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Un anticuerpo humano que se une al Factor Tisular, en donde el anticuerpo comprende una region VH que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y una region VL que comprende las secuencias de CDR1, 2 y 3 de los SEQ ID NO: 66, 67 y 68.
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas:
    a) se une al dominio extracelular del Factor Tisular con una afinidad aparente (CE50) de 3 nM o menos, tal como 0,50 nM o menos, p. ej., 0,35 nM o menos, tal como 0,20 nM o menos, por ejemplo, 0,1 nM o menos, cuando se determina como se describe en el analisis en el Ejemplo 13,
    b) se une a las celulas de mamffero que expresan el Factor Tisular, tal como las celulas A431 transfectadas con un constructo que codifica el Factor Tisular, preferiblemente con una afinidad aparente (CE50) de 10 nm o menos, p. ej., 8 nM o menos, tal como 5 nM o menos, p. ej., 2 nM o menos, tal como 1 nM o menos, p. ej., 0,5 nM o menos, tal como 0,3 nM o menos, cuando se determina como se describe en el analisis en el Ejemplo 14,
    c) es capaz de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en las celulas A431, preferiblemente con un valor de CE50 de 2 nM o menos, por ejemplo, 1 nM o menos, tal como 0,7 nM o menos, o 0,3 nM o menos, tal como 0,2 nM o menos, o 0,1 nM o menos, o 0,05 nM o menos, cuando se determina como se describe en el analisis en el Ejemplo 20,
    d) el anticuerpo es eficaz para inhibir el crecimiento de tumores MDA-MB-231 establecidos, cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 24 y/o para inhibir el crecimiento de tumores BxPC3 establecidos, cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 26,
    e) inhibe el factor tisular inducido por coagulacion de la sangre, preferiblemente con una concentracion media de inhibicion de menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM, por ejemplo, menos de 2 nM, tal como menos de 1 nM cuando se determina como se describe en el analisis en el Ejemplo 19,
    f) en donde el anticuerpo inhibe la conversion de FX en FXa por el complejo TF/FVIIa, preferiblemente en menos de 50%, por ejemplo menos de 40%, tal como en el intervalo de 1 a 30%, cuando se determina como se describe en el analisis en el Ejemplo 18, o
    g) inhibe liberacion de IL-8 inducida por FVIIa por las celulas MDA-MB-231, preferiblemente con un valor maximo de inhibicion de la inhibicion de mas de 40%, tal como mas de 50%, p. ej. mas de 60%, cuando se determina en como se describe en el analisis en el Ejemplo 17.
  3. 3. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas:
    a) inhibe la fosforilacion de ERK inducida por FVIIa, preferiblemente con una concentracion media de inhibicion de menos de 10 nM, tal como menos de 5 nM, p. ej., menos de 2 nM cuando se determina como se describe en el analisis en el Ejemplo 16,
    b) es capaz de inducir el deposito de C3c y C4c, preferiblemente en donde el anticuerpo es capaz de inducir el deposito de C3c y C4c tal como se determina en el Ejemplo 21,
    c) los fragmentos Fab de anticuerpo se unen al dominio extracelular del factor tisular como se ha descrito en el ejemplo 28 con un valor de CE50 de menos de 0,1 pg/ml, tal como menos de 0,05 pg/ml, p. ej., menos de 0,04 pg/ml medida por ELISA,
    d) los fragmentos Fab de anticuerpo se unen al dominio extracelular del factor tisular como se ha descrito en el ejemplo 28 con un valor de CE50 de mas de 1,0 pg/ml, medido por ELISA,
    e) los fragmentos Fab de anticuerpo se unen al dominio extracelular del factor tisular como se ha descrito en el ejemplo 28 con un valor de CE50 de menos de 10 pg/ml, tal como menos de 1p g/ml, p. ej., menos de 0,5 pg/ml, o menos de 0,2 pg/ml, o
    f) se une al factor tisular humano y al factor tisular no murino y muestra una reduccion de la union en comparacion con la union a TF humano al constructo barajado de 42-84 mm, que contiene la secuencia humana para TF excepto para el aminoacido 42-84, que ha sido remplazado por la secuencia de raton, como se describe en el ejemplo 27.
  4. 4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende una region VH que tiene
    a) al menos 80% de identidad, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o 100% de identidad con una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9. o
    b) como maximo 20, tal como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tal como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9.
  5. 5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una region VL que tiene
    a) al menos 80% de identidad, tal como al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% o 100% de identidad
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    con una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65 o
    b) como maximo 20, como 15, o 10, o 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoacidos, mas preferiblemente sustituciones de aminoacidos, tal como sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65.
  6. 6. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una region VH que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 9 y una region VL que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 65.
  7. 7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas:
    a) una afinidad por el factor tisular que es de menos de 5 nM, tal como menos de 3,5 nM, p. ej., menos de 2 nM cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria,
    b) una kd de mas de 10"3 seg"1, cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria y/o una ka de mas de 5x104, mol-1seg-1 cuando se determina por el metodo descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria, o
    c) una kd de mas de 10"3 seg"1 cuando se determina por el metodo de afinidad descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria, y una avidez de menos de 5 nM, tal como menos de 1 nM, p. ej., menos de 0,2 nM cuando se determina por el metodo de avidez descrito en el Ejemplo 22 en la presente memoria.
  8. 8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo esta conjugado con otro radical, tal como un radical citotoxico, un radioisotopo o un farmaco.
  9. 9. Una molecula biespecffica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y una segunda especificidad union, tal como una especificidad de union para una celula efectora humana, un receptor de Fc humano o un receptor de celulas T.
  10. 10. Un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 12, y el SEQ ID NO: 65-68.
  11. 11. Una celula anfitriona eucariotica o procariotica huesped que produce un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  12. 12. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una molecula biespecffica como se define en la reivindicacion 9, y un portador farmaceuticamente aceptable.
  13. 13. El anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una molecula biespecffica como se define en la reivindicacion 9 para su uso como medicamento.
  14. 14. El uso del anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una molecula biespecffica como se define en la reivindicacion 9 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
  15. 15. Un metodo para producir un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho metodo las etapas de
    a) cultivar una celula anfitriona de la reivindicacion 11, y
    b) purificar el anticuerpo de los medios de cultivo.
  16. 16. Una composicion de diagnostico que comprende un anticuerpo como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  17. 17. Un metodo para detectar la presencia de Factor Tisular en una muestra, que comprende:
    - poner en contacto la muestra con un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una molecula biespecffica de la reivindicacion 9 en condiciones que permitan la formacion de un complejo entre el anticuerpo o las moleculas biespecfficas y el Factor Tisular; y
    - Analizar si se ha formado un complejo.
  18. 18. Un kit para detectar la presencia de Factor Tisular en una muestra que comprende
    - un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una molecula biespecffica de la reivindicacion 9; y
    - instrucciones para el uso del kit.
  19. 19. Un anticuerpo anti-idiotfpico que se une a cualquier anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
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