BRPI0922350B1 - anticorpo humano que se liga ao fator de tecido humano e molécula biespecífica e seus usos, célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante, composição farmacêutica, método para a produção de um anticorpo, composição de diagnóstico, método para detectar a presença de fator de tecido em uma amostra in vitro, kit para detectar a presença de fator de tecido em uma amostra eanticorpo antiidiotípico - Google Patents

anticorpo humano que se liga ao fator de tecido humano e molécula biespecífica e seus usos, célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante, composição farmacêutica, método para a produção de um anticorpo, composição de diagnóstico, método para detectar a presença de fator de tecido em uma amostra in vitro, kit para detectar a presença de fator de tecido em uma amostra eanticorpo antiidiotípico Download PDF

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David P. E. Satijin
Rene M. A. Hoet
Vibeke Miller Breinholt
Eva Ehrnrooth
Ole Baadsgaard
Willem Karel Bleeker
Mischa Houtkamp
Maroeska Oudshoorn
Rob N. De Jong
Paul Parren
Jan van de Winkel
Tom Vink
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Abstract

ANTICORPO HUMANO, MOLÉCULA BIESPECÍFICA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA EUCARIÓTICA OU PROCARIÓTICA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO ANTICORPO OU DA MOLÉCULA BIESPECÍFICA, MÉTODOS PARA INIBIR O DESENVOLVIMENTO E/OU PROLIFERAÇÃO DE UMA CÉLULA TUMORAL QUE EXPRESSA O FATOR DE TECIDO, PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, E PARA DETECTAR A PRESENÇA DE FATOR DE TECIDO EM UMA AMOSTRA, COMPOSIÇÃO DE DIAGNÓSTICO, E, KIT PARA DETECTAR A PRESENÇA DE FATOR DE TECIDO EM UMA AMOSTRA Os anticorpos monoclonais humanos isolados que ligam-se ao TF humano e composições e moléculas com base em anticorpo relacionadas, são divulgados. Também são divulgadas composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos e métodos terapêuticos e diagnósticos para o uso dos anticorpos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção diz respeito a anticorpos direcionados ao fator de tecido em particular ao fator de tecido humano e usos de tais anticorpos, em particular seu uso no tratamento de câncer, inflamação e doenças vasculares.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] O fator de tecido (TF), também denominado tromboplastina, fator III ou CD142 é uma proteína presente no tecido subendotelial, plaquetas e leucócitos necessários para a iniciação da formação de trombina da protrombina de zimogênio. A formação de trombina ultimamente leva à coagulação do sangue. Este fator permite que as células iniciem as cascatas de coagulação do sangue e suas funções como o receptor de afinidade alta para o fator de coagulação VII. O complexo resultante fornece um evento catalítico que é responsável pela iniciação da coagulação das cascatas de protease pela proteólise limitada específica. Diferente de outros cofatores destas cascatas de protease, que circulam como precursores não funcionais, este fator é um iniciador potente que é totalmente funcional quando expressado nas superfícies celulares.
[003] O fator de tecido é o receptor de superfície celular para o fator de serina protease VIIa (FVIIa). A ligação de FVIIa ao fator de tecido foi observada iniciar os processos de sinalização dentro da dita célula sinalizando a função que desempenha um papel na angiogênese. Visto que a angiogênese é um processo normal no crescimento e no desenvolvimento, bem como na cura de ferimento também é uma etapa fundamental na transição de tumores de um estado dormente a um estado maligno: quando as células cancerígenas ganham a capacidade de produzir proteínas que participam da angiogênese, os denominados fatores de crescimento angiogênico, estas proteínas são liberadas pelo tumor em tecidos próximos e estimulam que novos vasos sanguíneos brotem a partir de vasos sanguíneos saudáveis existentes em torno e no tumor. Uma vez que novos vasos sanguíneos entram no tumor este pode expandir rapidamente seu tamanho e invadir o tecido e os órgãos locais. Através dos novos vasos sanguíneos, as células cancerígenas ainda podem escapar da circulação e alojar em outros órgãos para formar novos tumores (metastases).
[004] Ainda, o TF desempenha um papel na inflamação. O papel do TF é assumido ser mediado pela coagulação sanguínea (A. J. Chu: “Tissue factor mediates inflammation” em Archives of biochemistry and biophysics, 2005, vol. 440, No. 2, pp. 123-132). Consequentemente, a inibição de TF, por exemplo, por anticorpo anti-TF monoclonais é de significância na interrupção do ciclo de inflamação de coagulação em contribuição não apenas para anti-inflamação mas também a doenças vasculares.
[005] A expressão de TF é observada de muitos tipos de câncer e está associada com doença mais agressiva. Além disso, o TF humano também apresenta-se em uma forma alternativamente unida solúvel, asHTF. Foi recentemente observado que o asHTF promove o desenvolvimento tumoral (Hobbs et al.2007 Thrombosis Res. 120(2) S13-S21).
[006] Os anticorpos que ligam-se a TF foram divulgados na técnica anterior:
[007] O WO98/40408 divulga anticorpos que podem ligar o TF humano natural, sozinho ou presente em um complexo de TF:VIIa, evitando eficazmente a ligação do fator X ao TF ou que o complexo e, desse modo, reduz a coagulação sanguínea. É divulgado que os anticorpos podem ser usados para aliviar tromboses seguindo um procedimento médico invasivo, tal como cirurgia arterial ou cardíaca ou para eliminar a coagulação sanguínea que origina-se do de implementação médica. Os anticorpos adicionais são divulgados serem utilizados em métodos de diagnóstico in vivo incluindo a formação de imagem de diagnóstico in vivo do TF humano natural.
[008] O WO04/094475 fornece anticorpos capazes de ligação ao fator de tecido humano, que não inibe a coagulação sanguínea mediada por fator em comparação com um controle de plasma normal. Os anticorpos humanos não são descritos. É alegado que o anticorpo pode ser usado para o tratamento de câncer.
[009] O WO03/093422 diz respeito a anticorpos que ligam-se com a afinidade maior ao complexo de TF:VIIa do que TF sozinho. O uso dos anticorpos como anticoagulante no tratamento de certas doenças, tal como sepse, coagulação intravascular disseminada, acidente vascular isquêmico, trombose, síndromes coronárias agudas e coagulopatia em câncer avançado é proposto.
[010] O WO01/27079 divulga composições e métodos para inibir a proliferação celular anormal, particularmente, proliferação de célula endotelial, tal como câncer, desenvolvimento anormal de embriões, mal funcionamento de respostas imunes, bem como a angiogênese relacionada com a neovascularização e desenvolvimento tumoral. Muitas substâncias ativas, incluindo anticorpos, são propostos, mas nenhum anticorpo específico é divulgado.
[011] WO03/037361 diz respeito ao uso de agonista ou antagonista de TF para o tratamento relacionado com a apoptose.
[012] WO03/029295 diz respeito a anticorpos humanos isolados que imunorreagem com o TF humano para inibir a ligação de fator de coagulação VIIa. Entretanto, a aplicação não divulga um exemplo simples de um anticorpo tendo estas propriedades.
[013] Diversas terapias de anticorpo monoclonal são aprovadas para o tratamento de tipos tumorais diferentes, incluindo, por exemplo, bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix™) e trastuzumab (Herceptin®).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[014] Embora muito progresso seja feito, permanece uma necessidade quanto a métodos melhorados de tratar sérias doenças, por exemplo, tratamento melhorado contra o câncer, com base em anticorpos terapêuticos.
[015] É um objetivo da presente invenção para fornecer anticorpos anti-TF humano altamente específicas e eficazes para o uso médico. Os anticorpos da invenção apresentam as características de ligação de TF que diferem dos anticorpos descritos na técnica. Nas formas de realização preferidas, os anticorpos da invenção têm uma afinidade alta com relação ao fator de tecido humano, mediam a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), inibem a ligação de FVIIa ao TF, inibem a fosforilação de ERK induzida por FVIIa e liberação de IL8, não inibem ou inibem deficientemente a coagulação.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[016] Figura 1: Alinhamento de sequências dos anticorpos da presente invenção.
[017] CDR1, CDR2 e CDR3 de acordo com IMGT são destacados: as sequências em itálico representam a região de CDR1, as sequências sublinhadas representam a região de CDR2, as sequências em negritos representam a região de CDR3.
[018] Figura 2: Sequências IgG4 (SEQ ID N°: 113-114)
[019] SEQ ID N°: 113: A sequência de aminoácido da região CH do tipo selvagem de IgG4 humano. A sequência em itálico representa a região CH1, a sequência destacada representa a região de junta, a sequência regular representa a região CH2 e a sequência sublinhada representa a região CH3.
[020] SEQ ID N°: 114: A sequência de aminoácido da região CH sem junta de um Ig humanoG4
[021] Figura 3: Ligação de anti-TF HuMabs ao domínio extracelular de TF.
[022] Figura 4: Ligação de anti-TF HuMabs ao TF ligado à membrana.
[023] Figura 5: Inibição de FVIIa que liga-se a TF.
[024] Figura 6: Inibição de fosforilação de ERK induzida por FVIIa
[025] Figura 6a: Inibição de fosfilação de ERK induzida por FVIIa
[026] Figura 7: Inibição de Liberação de IL-8 induzido por FVIIa.
[027] Figura 8: Inibição de geração de FXa.
[028] Figura 9: Inibição de coagulação de sangue.
[029] Figura 10: TF-HuMabs induz a lise de células Bx- PC3 por ADCC
[030] Figura 11: Deposição de componentes de complemento C3c e C4c em células alvo.
[031] Figura 12: A análise imunoistoquímica de ligação de TF-HuMabs aos glomérulos.
[032] Figura 13: A análise imunoistoquímica de ligação de TF-HuMabs aos tumores pancreáticos.
[033] Figura 14: A eficácia in vivo de TF-HuMabs em xenoenxerto de tumor de MDA-MB-231 estabelecido.
[034] Figura 15: Tempo de sangramento determinado em macacos cinomolgos nas injeções intravenosas do HuMab 011 específico por TF. O anticorpo foi administrado no dia 1 (0 mg/kg), 8 (1 mg/kg), 15 (10 mg/kg) e 22 (100 mg/kg).
[035] Figura 16: A eficácia in vivo de TF-HuMabs em um xenoenxerto de tumor BX-PC3 profilático e estabelecido.
[036] Figura 17: construção de embaralhamento e domínios TF
[037] Figura 18: ligação de anticorpos anti-TF a construções de embaralhamento de TF
[038] Figura 19: Ligação de fragmentos HuMab-TF Fab para o domínio extracelular domain de TF, ELISA
[039] Figura 20: Ligação de fragmentos HuMab-TF Fab para o domínio extracelular de TF, FACS
[040] Figura 21: O perfil de ligação de anti-TF HuMabs dependente do número de moléculas TF expressadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[041] Os termos “fator de tecido”, “TF”, “CD142”, “antígeno de fator de tecido”, “antígeno TF” e “antígeno CD142 são usados de maneira intercambeável aqui e, a não ser que especificado de outra maneira, incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas de fator de tecido humano que são naturalmente expressados pelas células ou são expressados nas células transfectadas com o fator de tecido gene.
[042] O termo “imunoglobulina” refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas que consistem de dois pares de cadeias de polipeptídeo, um par de cadeias de peso molecular baixo leve (L) e um par de cadeias pesadas (H), que todos os quatro podem ser inter- conectados pela ligação de bissulfeto. A estrutura de imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2° ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Resumidamente, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada tipicamente é compreendido de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve tipicamente é compreendido de um domínio, CL. As regiões VH e VL ainda podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou forma de arcos estruturalmente definidos), também denominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercalado com regiões que são mais conservadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FRs). Cada VH e VL é tipicamente composto de três CDRs e quatro FRs, dispostos a partir de terminal amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácido nesta região ocorre de acordo com IMGT., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (frases, tais como numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat ou de acordo com Kabat neste refere-se a este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve). Usando-se este sistema de numeração, a sequência de aminoácido real de um peptídeo pode conter menos aminoácidos ou adicionais correspondentes a encurtamento de ou inserção em, um FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, uma domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma inserção de aminoácido simples (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de VH CDR2 e os resíduos inseridos (por exemplos os resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão".
[043] O termo “anticorpo” (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina ou um derivado de cada um destes, que tem a capacidade de ligar especificamente a um antígeno sob condições fisiológicas típicas com uma vida média de períodos significantes de tempo, tal como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc. ou qualquer outro período funcionalmente relevante definido (tal como um período suficiente para induzir, promover intensificar e/ou modular uma resposta fisiológica associada com o anticorpo que liga-se ao antígeno e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade atuadora). As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves da molécula de imunoglobulina contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (tal como, células atuadoras) e componentes do sistema de complemento, tal como C1q, o primeiro componente no caminho clássico de ativação de complemento. Um anticorpo anti-TF também pode ser um anticorpo biespecífico ou molécula similar (ver por exemplo PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) para uma descrição de diacorpos). De fato, os anticorpos biespecíficos, diacorpos e outros, fornecidos pela presente invenção podem ligar qualquer alvo adequado além de uma porção de fator de tecido ou complexo de fator de tecido FVIIa. Como indicado acima, o termo anticorpo neste, a não ser que estabelecido de outra maneira ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de ligar especificamente ao antígeno. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizado pelos fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "anticorpo" inclui (i) um fragmento Fab’ ou Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH1 ou um anticorpo monovalente como descrito no WO2007059782 (Genmab); (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de bissulfeto na região de junta; (iii) um fragmento Fd que consiste essencialmente dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste essencialmente de domínios VL e VH, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio VH e também denominado anticorpos de domínio (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90); (vi) camelídeo ou nanocorpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24) e (vii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, são codificados por genes separados, estes podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um ligador sintético que os permitem serem feitos como uma cadeia de proteína simples em que os pares de regiões VL e VH formem moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia simples ou Fv de cadeia simples (scFv), ver, por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia simples estão abrangidas dentro do termo anticorpo a não ser que observado de outra maneira ou claramente indicado pelo contexto. Embora tais fragmentos sejam, em geral, incluídos dentro do significado do anticorpo, coletivamente e cada uma, independentemente, é característica única da presente invenção, apresentando propriedades e utilidade biológicas diferentes. Estes e outros fragmentos úteis no contexto da presente invenção ainda são debatidos neste. Também deve ser entendido que o termo anticorpo, a não ser que especificado de outra maneira, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipeptídeos semelhantes a anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo retendo a capacidade de ligar especificamente ao antígeno (fragmentos de ligação de antígeno) fornecida por qualquer técnica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de peptídeo e técnicas recombinantes. Um anticorpo, quando gerado, pode possuir qualquer isotipo.
[044] Um “anticorpo anti-TF” é um anticorpo como descrito acima, que liga-se especificamente ao fator de tecido de antígeno.
[045] O termo “anticorpo humano”, como usado neste, é pretendido incluir anticorpos tendo regiões variáveis ou constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, as mutações introduzidas por mutagênese aleatórios ou específica ao local in vitro ou durante a redisposição do gene ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como usado neste, não é pretendido incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humana.
[046] Em uma forma de realização preferida, o anticorpo da invenção é isolada. Um "anticorpo isolado", como usado neste, é pretendido referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que liga-se especificamente ao fator de tecido é substancialmente isento de anticorpos que liguem outros antígenos que não o fator de tecido). Um anticorpo isolado que liga-se especificamente a um epítopo, isoforma ou variante de fator de tecido humano pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos relacionados, por exemplo, a partir de outras espécies (tal como homólogos de espécies de fator de tecido). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma forma de realização da presente invenção, dois ou mais anticorpos monoclonais “isolados” tendo especificidades de ligação de antígeno diferentes em uma composição bem definida.
[047] Quando usado aqui no contexto de dois ou mais anticorpos, o termo “compete com” ou “compete de maneira cruzada com” indica que dois ou mais anticorpos competem para a ligação a TF, por exemplo, compete para a ligação de TF no ensaio descrito no Exemplo 6 neste. Para alguns pares de anticorpos, a competição no ensaio do Exemplo 6 é apenas observado quando um anticorpo é revestido na placa e o outro é usado para competir e não vice versa. O termo “compete com” quando usado neste também é pretendido cobrir tais anticorpos de combinação.
[048] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usado neste refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade e afinidade de ligação simples para um epítopo particular. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que apresentam uma especificidade de ligação simples que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico ou transcromossômico, tal como um camundongo transgênico, tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanas, fundido a uma célula imortalizada.
[049] Como usado neste, o termo "ligação' no contexto da ligação de um anticorpo a um antígeno predeterminado tipicamente é uma ligação com uma afinidade correspondente a um KD de cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos ou cerca de 10-11 M ou ainda menos quando determinado, por exemplo, pela tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando-se o antígeno como o ligando e o analito e liga-se ao antígeno predeterminado com uma afinidade correspondente a um KD que é pelo menos dez vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menos, por exemplo pelo menos 1.000 vezes menos, tal como pelo menos 10.000 vezes menos, por exemplo pelo menos 100.000 vezes menos do que sua afinidade que liga-se a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) outro que não o antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com a qual a afinidade é menor é dependente do KD do anticorpo, de modo que quando o KD do anticorpo é muito baixo (isto é, o anticorpo é altamente específico), então a quantidade com a qual a afinidade para o antígeno é menor do que a afinidade para o antígeno é menor do que a afinidade para um antígeno não específico pode ser de pelo menos 10.000 vezes.
[050] O termo “kd” (sec-1), como usado neste, refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interação de antígeno de anticorpo particular. O dito valor também é referido como o valor koff.
[051] O termo "ka" (M-1 x sec-1), como usado neste, refere- se à constante da taxa de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.
[052] O termo "KD" (M), como usado neste, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de anticorpo-antígeno particular.
[053] O termo “KA” (M-1), como usado neste, refere-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação de anticorpo-antígeno particular e é obtido pela divisão de ka pelo kd.
[054] A presente invenção também fornece anticorpos que compreendem variantes funcionais da região VL, região VH ou um ou mais CDRs dos anticorpos dos exemplos. Uma variante funcional de um VL, VH ou CDR usado no contexto de um anticorpo anti-TF ainda permite que o anticorpo retenha pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) da afinidade/avidez e/ou a especificidade/seletividade do anticorpo precursor em alguns casos um tal anticorpo anti-TF pode estar associado com afinidade, seletividade e/ou especificidade maiores do anticorpo precursor.
[055] Tais variantes funcionais retêm identidade de sequência significante ao anticorpo precursor. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas divididas pelas sequências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/total # de posições x 100), levando-se em conta o número de fendas e o comprimento de cada fenda, que necessita ser introduzida para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de identidade percentual entre as duas sequências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
[056] A identidade percentual entre suas sequências de nucleotídeo pode ser determinada usando-se o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando-se uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de fenda de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido também pode ser determinada usando-se o algoritmo de E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando- se uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de fenda de 12 e uma penalidade de fenda de 4. Além disso, uma identidade percentual entre duas sequência de aminoácido pode ser determinada usando- se o algoritmo de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de fenda de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[057] A sequência de variantes de CDR pode diferir da sequência do CDR das sequências de anticorpo precursor através das substituições mais conservativas; por exemplo pelo menos cerca de 35 %, cerca de 50 % ou mais, cerca de 60 % ou mais, cerca de 70 % ou mais, cerca de 75 % ou mais, cerca de 80 % ou mais, cerca de 85 % ou mais, cerca de 90 % ou mais, cerca de 95 % ou mais (por exemplo, cerca de 65 a 99 %, tal como cerca de 96 %, 97 % ou 98 %) das substituições na variante são as substituições de resíduo de aminoácido conservativas.
[058] A sequência de variantes de CDR podem diferir da sequência do CDR das sequências de anticorpo precursor através das substituições mais conservativas; por exemplo pelo menos 10, tal como pelo menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 das substituições na variante são substituições de resíduo de aminoácido conservativas.
[059] No contexto da presente invenção, as substituições conservativas pode ser definidas pelas substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas em uma ou mais das seguintes três tabelas:
Figure img0001
Figure img0002
As classes de resíduo de aminoácido para substituições conservativas alternativas
Figure img0003
Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduos de Aminoácido
Figure img0004
[060] Os agrupamentos de substituições mais conservativas incluem: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.
[061] Os grupos adicionais de aminoácidos também podem ser formulados usando-se os princípios descritos em, por exemplo, Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company.
[062] Em uma forma de realização da presente invenção, a conservação em termos de propriedades hidropáticas/hidrofílicas e tamanho/peso do resíduo também é substancialmente retida em um CDR variante em comparação com um CDR de um anticorpo dos exemplos (por exemplo, a classe de peso, registro hidropático ou ambas as sequências são pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou mais (por exemplo, cerca de 65 a 99 %) retidas). Por exemplo, as substituições de resíduo conservativo também podem, ou alternativamente, serem fundamentadas na substituição de grupos de conservação com base em peso de base forte ou fraca, que são conhecidos na técnica.
[063] O tempo de retenção de resíduos similares também pode ou alternativamente ser medido por um registro de similaridade, como determinado pelo uso de um programa BLAST (por exemplo, BLAST 2.2.8 disponível através do NCBI usando-se ajustes padrão BLOSUM62, Fenda aberta=11 e Fenda estendida=1). As variantes adequadas tipicamente apresentam pelo menos cerca de 45 %, tal como pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % ou mais (por exemplo, cerca de 70 a 99 %) similaridade ao peptídeo precursor.
[064] Como usado neste, "isotipo" refere-se à classe de imunoglobulina (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM) que é codificado por genes de região constante de cadeia pesada.
[065] O termo “epítopo” significa uma proteína determinante capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos usualmente consistem de agrupamentos de superfície de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias secundárias de açúcar e, usualmente, têm características estruturais tri-dimensionais específicas, em como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos em que a ligação ao formador mas não ao último é perdida na presença de solventes de desnaturação. O epítopo pode compreender os resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação (também, o denominado componente imunodominante do epítopo) e outros resíduos e aminoácido, que não estão diretamente envolvidos na ligação, tais como os resíduos de aminoácido que estão eficazmente bloqueados pelo peptídeo de ligação de antígeno especificamente (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da área de cobertura do peptídeo de ligação de antígeno especificamente).
[066] Como usado neste, um anticorpo humano é “derivado de” uma sequência de linha germinativa particular se o anticorpo for obtido a partir de um sistema que usa sequências de imunoglobulina humana, por exemplo, pela imunização de um camundongo transgênico que carrega genes de imunoglobulina humanos ou pela avaliação de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humano e em que a sequência de domínio V de anticorpo humano selecionados é pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95 %, por exemplo pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, por exemplo pelo menos 98 % ou tal como pelo menos 99 % idêntico na sequência de domínio V de aminoácido a uma sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa. Tipicamente, foram de um CDR3 de cadeia pesada, um anticorpo humano derivado de uma sequência de linha germinativa humana particular apresentará não mais do que 20 diferenças de aminoácido, por exemplo, não mais do que 10 diferenças de aminoácido, tal como no mais do que 9, 8, 7, 6 ou 5, por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa.
[067] Como usado neste, o termo “inibe o desenvolvimento” (por exemplo, refere-se às células, tal como células tumorais) é pretendido para incluir qualquer diminuição mensurável no desenvolvimento celular quando contatado com um anticorpo anti-TF em comparação com o desenvolvimento das mesmas células não em contato com um anticorpo anti-TF, por exemplo, a inibição do desenvolvimento de uma cultura celular por pelo menos cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % ou 100 %. Uma tal diminuição no desenvolvimento celular pode ocorrer por uma variedade de mecanismos, por exemplo, fagocitose de célula atuadora, ADCC, CDC e/ou apoptose.
[068] O termo "molécula biespecífica" é pretendido incluir qualquer agente, tal como uma proteína, peptídeo ou complexo de proteína ou peptídeo, que têm duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a ou interagir com, (a) um antígeno de superfície celular e (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula atuadora. O termo "anticorpo biespecífico" é pretendido incluir qualquer anticorpo anti-TF, que é uma molécula biespecífica. O termo "anticorpos biespecíficos" também inclui diacorpos. Os diacorpos são anticorpos biespecíficos bivalentes em que os domínios VH e VL são expressados em uma cadeia de polipeptídeo simples em uma cadeia de polipeptídeo simples, mas usando-se um ligador que é muito curto para permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios ao par com domínios complementares de uma outra cadeia e criando dois locais de ligação de antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P. et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, R.J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)).
[069] Um “anticorpo deficiente na função atuadora” ou um “anticorpo deficiente de função atuadora” refere-se a um anticorpo que não tem nenhuma capacidade ou tem capacidade significantemente reduzida para a ativação de um ou mais mecanismos atuadores, tal como ativação de complemento ou ligação de receptor de Fc. Desta maneira, os anticorpos deficientes na função atuadora não têm nenhuma capacidade ou capacidade significantemente reduzida para mediar a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Um exemplo de um tal anticorpo é IgG4.
[070] O termo “anticorpo monovalente” significa, no contexto da presente invenção que uma molécula de anticorpo é capaz de ligar uma molécula simples do antígeno e desta maneira não é capaz de reticular o antígeno.
[071] O termo “anticorpo IgG4 estabilizado” refere-se a um anticorpo IgG4 que foi modificado para reduzir a troca de molécula média (ver van der Neut Kolfschoten M et al . (2007) Science 14;317(5844) e referências neste e também Labrijn et al. (2009) Nature Biotechnology, 27, 767-771.
[072] Como usado neste, o termo "célula atuadora" refere- se a uma célula imune que está envolvida na fase atuadora de uma resposta imune, como oposto às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. As células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (tais como células B e células T incluindo as células T citolíticas (CTLs)), células matadoras, células matadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tais como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células atuadoras expressam receptores Fc específicos e realizam funções imunes específicas. Em algumas formas de realização, uma célula atuadora é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), tal como uma célula matadora natural, capazes de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR estão envolvidos na morte específica de células alvo e que apresentam antígenos a outros compostos do sistema imune ou que liga-se a células que apresentam antígenos. Em algumas formas de realização, uma célula atuadora pode realizar a fagocitose de um antígeno alvo ou de uma célula alvo. A expressão de um FcR particular em uma célula atuadora pode ser regulada por fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, a expressão de FCYRI foi observada ser super-regulada por interferon y (IFN-Y) e/ou G-CSF. Esta expressão intensificada aumenta a atividade citotóxica de células que carregam FCYRI contra alvos. Uma célula atuadora pode realizar a fagocitose ou a lise de um antígeno alvo ou uma célula alvo.
[073] O termo "vetor," como usado neste, é pretendido referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico ao qual este foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um arco de DNA de filamento duplo circular em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que estas são introduzidas (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de vetores mamíferos de replicação e epissômicos). Outros vetores, (tais como vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e desse modo são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estes são operacionalmente ligados, tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores e expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão, frequentemente, na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados de maneira intercambeável como o plasmídeo na forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, a presente invenção é pretendida incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (tais como retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados defeituosos na replicação), que servem para funções equivalentes.
[074] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), como usado neste, é pretendido referir-se a uma célula em que um vetor de expressão foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são pretendidos referir-se não apenas à célula de objetivo particular, mas também à progênie de uma tal célula. Por causa de certas modificações ocorrerem em gerações sucessoras devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula precursora, mas ainda estão incluídos dentro do termo "célula hospedeira" como usado neste. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células HEK293, células NS/0 e células linfocíticas.
[075] O termo “transfectoma”, como usado neste, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam o anticorpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células vegetais ou fungos, tais como, incluindo células de levedura.
[076] O termo “animal não humano transgênico” refere-se a um animal não humano tendo um genoma que compreende um ou mais transgenes de cadeia pesada e/ou leve humana ou transcromossomos (integrados ou não integrados no DNA genômico natural do animal) e que é capaz de expressar os anticorpos totalmente humanos. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter uma cadeia leve humana e um transgene de cadeia pesada humano ou transcromossomo de cadeia pesada humano, tal que o camundongo produz anticorpos anti-TF humanos quando imunizados com o antígeno TF e/ou células que expressam TF. O transgene de cadeia pesada humano pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso para camundongos transgênicos, por exemplo, camundongos HuMAb, tais como camundongos HCo7 ou HCo12 ou o transgene de cadeia pesada humano pode ser mantido de maneira extracromossômica, como é o caso para os camundongos KM transcromossômicos como descrito no WO02/43478. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos (coletivamente referidos aqui como “camundongos transgênicos”) são capazes de produzir isotipos múltiplos dos anticorpos monoclonais humanos a um dado antígeno (tal como IgG, IgA, IgM, IgD e/ou IgE) passando pela recombinação de V-D-J e troca de isotipo. O animal não humano transgênico também pode ser usado para a produção de anticorpos contra um antígeno específico pela introdução de genes que codificam tais anticorpos específicos, por exemplo, pela ligação operacional no leite do animal.
[077] “Tratamento” refere-se à administração de uma quantidade eficaz de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com o propósito de facilitar, melhorar, suspender ou erradicar (curar) sintomas ou estados de doença.
[078] Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e para períodos de tempo necessários, para atingir um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF pode variar de acordo com fatores, tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo anti- TF evocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo ou porção de anticorpo são excedidos pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[079] Um anticorpo “anti-idiotípico” (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos, em geral, associados com o local de ligação de antígeno de um anticorpo. Aspectos adicionais e formas de realização da invenção
[080] Como descrito acima, em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo humano que liga fator de tecido humano.
[081] Em uma forma de realização, o anticorpo liga-se ao domínio extracelular de fator de tecido com uma afinidade aparente (EC50) de 3 nM ou menos, tal como 0,50 nM ou menos, por exemplo, 0,35 nM ou menos, tal como 0,20 nM ou menos, por exemplo, 0,1 nM ou menos, como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 13.
[082] Em uma outra forma de realização, o anticorpo liga- se às células de mamífero que expressam o fator de tecido, tal como células A431 transfectadas com uma construção que codifica o fator de tecido, preferivelmente com uma afinidade aparente (EC50) de 10 nM ou menos, por exemplo, 8 nM ou menos, tal como 5 nM ou menos, por exemplo, 2 nM ou menos, tal como 1 nM ou menos, por exemplo, 0,5 nM ou menos, tal como 0,3 nM ou menos, como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 14.
[083] Em uma outra forma de realização, o anticorpo é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo em células A431, preferivelmente com um valor de EC50 de 2 nM ou menos, por exemplo, 1 nM ou menos, tal como 0,7 nM ou menos ou 0,3 nM ou menos, tal como 0,2 nM ou menos, ou 0,1 nM ou menos, ou 0.05 nM ou menos, como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 20.
[084] Em uma outra forma de realização, o anticorpo é eficaz na inibição do desenvolvimento de tumores MDA-MB-231 estabelecidos, quando determinado pelo método descrito no Exemplo 24 e/ou na inibição do desenvolvimento de tumores BxPC3 estabelecidos, quando determinado pelo método descrito no Exemplo 26.
[085] Em uma outra forma de realização, o anticorpo inibe a coagulação sanguínea induzida por fator de tecido, preferivelmente com uma concentração de inibição mediana menor do que 10 nM, tal como menor do que 5 nM, por exemplo, menor do que 2 nM, tal como menor do que 1 nM como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 19.
[086] Em uma outra forma de realização, o anticorpo não inibe a coagulação. Em uma forma de realização, a coagulação é inibida com um máximo de 30 %, tal como 25 %, tal como 20 %, tal como 15 %, tal como 10 % ou tal como 5 % em comparação com o nível natural.
[087] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo inibe a ligação de FVIIa ao fator de tecido, preferivelmente com um valor de inibição máximo de inibição de mais do que 80 %, tal como mais do que 90 % como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 15.
[088] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo inibe a liberação de IL-8 induzida por FVIIa por células MDA-MB-231, preferivelmente com um valor de inibição máximo de inibição de mais do que 40 %, tal como mais do que 50 %, por exemplo, mais do que 60 %, quando determinado como descrito no ensaio no Exemplo 17.
[089] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo inibe a conversão de FX em FXa pelo complexo de TF/FVIIa, preferivelmente menor do que 50 %, por exemplo, menor do que 40 %, tal como na faixa de 1 a 30 %, como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 18.
[090] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65.
[091] Em uma forma de realização adicional, a ligação do anticorpo da invenção ao fator de tecido não envolve todos os três dos seguintes resíduos: W na posição 45, K na posição 46 ou Y na posição 94 de fator de tecido. Ainda em uma forma de realização adicional, a ligação não envolve qualquer um dos seguintes resíduos: W na posição 45, K na posição 46 ou Y na posição 94 (estes números referem-se ao TF maduro, as posições equivalentes na entrada Genbank NP_001984 são 77, 78 e 126).
[092] Em uma outra forma de realização do anticorpo da invenção, o anticorpo compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93.
[093] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo inibe a fosforilação de ERK induzido por FVIIa, preferivelmente com uma concentração de inibição mediana menor do que 10 nM, tal como menor do que 5 nM, por exemplo, menor do que 2 nM como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 16.
[094] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo inibe a fosforilação de ERK preferivelmente com uma concentração de inibição mediana menor do que 10 nM, tal como menor do que 5 nM, por exemplo, menor do que 2 nM como determinado como descrito no ensaio no Exemplo 16 e não inibe a liberação de IL-8 induzido por FVII como descrito no ensaio no Exemplo 17 por mais do que no máximo 10 %
[095] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo é capaz de induzir a deposição de C3c e C4c, preferivelmente em que o anticorpo é capaz de induzir a deposição de C3c e C4c como determinado no Exemplo 21.
[096] Em uma forma de realização adicional, os fragmentos Fab de anticorpo ligam-se ao domínio extracelular de fator de tecido como descrito no exemplo 28 com um valor de EC50 abaixo de 0,1 μg/ml., tal como abaixo de 0,05 μg/ml. , por exemplo, abaixo de 0,04 μg/ml. como medido por ELISA.
[097] Em uma forma de realização adicional, os fragmentos Fab de anticorpo ligam-se ao domínio extracelular de fator de tecido como descrito no exemplo 28 com um valor de EC50 acima de 1,0 μg/ml. como medido por ELISA.
[098] Em uma forma de realização adicional, os fragmentos Fab de anticorpo ligam-se ao domínio extracelular de fator de tecido como descrito no exemplo 28 com um valor de EC50 abaixo de 10 μg /ml, tal como abaixo de 1 μg /ml, por exemplo, abaixo de 0,5 μg /ml ou abaixo de 0,2 μg /ml.
[099] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo liga-se ao fator de tecido humano e não fator de tecido murino e mostra ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano à construção de embaralhamento 42 a 84 mm, contendo a sequência humana para TF exceto para aminoácido 42 a 84, que foi substituído pela sequência de camundongo, como descrito no exemplo 27.
[0100] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo liga-se ao fator de tecido humano e não fator de tecido murino and e mostra ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano à construção de embaralhamento 85 a 122, contendo a sequência humana para TF exceto para aminoácido 85 a 122, que foi substituído pela sequência de camundongo, como descrito no exemplo 27.
[0101] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo liga-se ao fator de tecido humano e não fator de tecido murino e mostra ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano à construção de embaralhamento 123 a 137 mm contendo a sequência humana para TF exceto para aminoácido 123 a 137, que foi substituído pela sequência de camundongo, como descrito no exemplo 27.
[0102] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo liga-se ao fator de tecido humano e não fator de tecido murino e mostra ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano à construção de embaralhamento 185 a 225 mm contendo a sequência humana para TF exceto para aminoácido 185 a 225, que foi substituído pela sequência de camundongo, como descrito no exemplo 27.
[0103] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo liga-se ao fator de tecido humano e não fator de tecido murino e mostra ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano para ambas as construções de embaralhamento 226 a 250 mm contendo a sequência humana para TF exceto para aminoácido 226 a 250, que foi substituído pela sequência de camundongo, como descrito no exemplo 27.
[0104] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo apresenta ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano a mais do que uma construção de embaralhamento. Em uma forma de realização um anticorpo apresenta ligação reduzida à construção 42 a 84 mm bem como de 85 a 122 mm. Em uma forma de realização um anticorpo apresenta ligação reduzida de 123 a 137mm bem como de construção 185 a 225 mm. Em uma forma de realização um anticorpo apresenta ligação reduzida à construção 123 a 137 mm bem como de construção 185 a 225 mm e ainda à construção 226 a 250mm.
[0105] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo é capaz de induzir a deposição de C3c e C4c, preferivelmente em que o anticorpo é capaz de induzir a deposição de C3c e C4c como determinado no Exemplo 21.
[0106] Em uma forma de realização do anticorpo da invenção, o dito anticorpo - compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65 e - não compete com a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93.
[0107] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a) a sequência como apresentada na - SEQ ID N°: 12, - SEQ ID N°: 16, - SEQ ID N°: 20, - SEQ ID N°: 24, - SEQ ID N°: 28, ou b) uma variante de qualquer uma das ditas sequências, tal como uma variante tendo, na maioria, 1, 2, 3, 4 ou 5 modificações de aminoácido, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas.
[0108] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 12 ou uma variante desta, em que a variante compreende modificação em uma ou mais das posições 2, 3, 6, 9 e 11, preferivelmente onde a modificação é uma substituição, mais preferivelmente onde a substituição é selecionada do grupo que consiste de a. R é substituído por K quando na posição 2, b. S é substituído por A ou T quando na posição 3, c. G é substituído por T quando na posição 6, d. L é substituído por F quando na posição 9 e e. S é substituído por Y quando na posição 11.
[0109] Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 10, 11 e 12 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 66, 67 e 68, b) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 14, 15 e 16 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 70, 71 e 72, c) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 18, 19, 20 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 74, 75 e 76, d) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 22, 23 e 24 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 78, 79 e 80, e) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 26, 27 e 28 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 82, 83 e 84 ou f) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0110] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VH tendo a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 9, 13, 17, 21 e 25 ou b) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 9, 13, 17, 21, 21 e 25.
[0111] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VL tendo a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VL selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 65, 69, 73, 77 e 81 ou b) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 65, 69, 73, 77 e 81.
[0112] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65, b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 13 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 69, c) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 17 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 73, d) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 21 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 77, e) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 25 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 81 ou f) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0113] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo - compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65 e - compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93.
[0114] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a) a sequência como apresentada na - SEQ ID N°: 8, - SEQ ID N°: 52, ou b) uma variante de qualquer uma das ditas sequências, tal como uma variante tendo, na maioria, 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas.
[0115] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 6, 7 e 8 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 62, 63 e 64, b) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 50, 51 e 52 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 106, 107 e 108 ou c) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0116] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VH tendo a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 5 e 49 ou b) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 5 e 49.
[0117] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VL tendo c) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VL selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 61 e 105 ou d) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 61 e 105.
[0118] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 5 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 61, b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 49 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 105 ou c) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0119] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo - não compete com a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65 e - compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93.
[0120] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a) a sequência como apresentada na - SEQ ID N°: 32, - SEQ ID N°: 36, - SEQ ID N°: 40, - SEQ ID N°: 56, ou b) uma variante de qualquer uma das ditas sequências, tal como uma variante tendo, na maioria, 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas.
[0121] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 30, 31 e 32 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 86, 87 e 88, b) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 34, 35 e 36 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 90, 91 e 92, c) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 38, 39 e 40 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 94, 95 e 96, d) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 54, 55 e 56 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 110, 11 e 112 ou e) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0122] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VH tendo a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 29, 33, 37 e 53 ou b) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 29, 33, 37 e 53.
[0123] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VL tendo a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VL selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 85, 89, 93 e 109 ou b) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 85, 89, 93 e 109.
[0124] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 29 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 85, b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 33 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 89, c) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93, d) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 53 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 109 ou e) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0125] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende competição de anticorpo para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 41 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 97.
[0126] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende uma região VH CDR3 tendo a) a sequência como apresentada na - SEQ ID N°: 4, - SEQ ID N°: 44, - SEQ ID N°: 48, ou b) uma variante de qualquer uma das ditas sequências, tal como uma variante tendo, na maioria, 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas.
[0127] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 2, 3 e 4 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 58, 59 e 60, b) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 42, 43 e 44 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 98, 99 e 100, c) uma região VH que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 46, 47 e 48 e uma região VL que compreende o CDR1, 2 e 3 sequências de SEQ ID N°: 102, 103 e 104 ou d) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0128] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VH tendo a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 1, 41 e 45 ou b) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 1, 41 e 45.
[0129] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende a VL tendo c) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade a uma sequência de região VL selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 57, 97 e 101 ou d) na maioria 20, tal como 15 ou 10 ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas em comparação com uma sequência de região VH selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 57, 97 e 101.
[0130] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 1 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 57, b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 41 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 97, c) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 45 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 101 ou d) uma variante de qualquer um dos ditos anticorpos, em que a dita variante preferivelmente tem, na maioria 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tal como substituições de aminoácido conservativas nas ditas sequências.
[0131] Ainda em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção tem uma afinidade ao fator de tecido que é menor do que 5 nM, tal como menor do que 3.5 nM, por exemplo, menor do que 2 nM quando determinado pelo método descrito no Exemplo 22 neste.
[0132] Um grupo particularmente interessante de anticorpos da invenção tem uma ligação ao fator de tecido que é caracterizado por uma avidez normal ou alta e uma off-rate alta (kd). Como demonstrado neste, tais anticorpos podem apresentar ligação específica de tumor em que estes ligam-se ao tecido canceroso, mas não liga-se ou liga-se menos a tecidos saudáveis. Sem estar ligado por qualquer teoria específica, é hipotetizado que este grupo de anticorpos apenas liga-se bem às células que expressam níveis altos de TF, porque a ligação é apenas eficiente se esta for bivalente. Os exemplos destes anticorpos incluem anticorpo 044, 098 e 111, descritos neste.
[0133] Consequentemente, em uma forma de realização, o anticorpo da invenção tem um kd de mais do que 10-3 sec-1 quando determinado pelo método de afinidade descrito no Exemplo 22 aqui e uma avidez menor do que 5 nM, tal como menor do que 1 nM, por exemplo, menor do que 0,2 nM quando determinado pelo método de avidez descrito no Exemplo 22 neste.
[0134] Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção tem um kd de mais do que 10-3 sec-1, quando determinado pelo método de afinidade descrito no Exemplo 22 neste e/ou um ka de mais do que 5 x 104, Mol -1 sec -1 quando determinado pelo método de afinidade descrito no Exemplo 22 neste.
[0135] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo não apresenta ligação ao tecido saudável, em particular, nenhuma ligação aos glomérulos humanos, por exemplo, como determinado no ensaio descrito no Exemplo 23, mas não apresenta ligação a tumores pancreáticos, por exemplo, como determinado no ensaio descrito no Exemplo 23 neste.
[0136] Ainda em uma forma de realização adicional, o anticorpo é eficaz na inibição do desenvolvimento de tumores BX-PC3 estabelecidos quando determinado pelo método descrito no Exemplo 26 neste.
[0137] Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção tem uma ou mais das seguintes propriedades: inibição da proliferação, inibição da angiogênese tumoral, indução de apoptose de células tumorais, ligação ao Fator de Tecido alternativamente unido.
[0138] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção compete para a ligação de Fator de Tecido com um anticorpo que compreende a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65, b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 1 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 57, c) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 5 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 61, d) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 13 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 69, e) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 17 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 73, f) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 21 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 77, g) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 25 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 81, h) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 29 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 85, i) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 33 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 89, j) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93, k) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 41 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 97, l) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 45 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 101, m) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 49 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 105 ou n) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 53 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 109
[0139] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção liga-se ao mesmo epítopo em Fator de tecido como um anticorpo tendo: a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 65, b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 1 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 57, c) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 5 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 61, d) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 13 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 69, e) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 17 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 73, f) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 21 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 77, g) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 25 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 81, h) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 29 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 85, i) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 33 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 89, j) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 93, k) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 41 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 97, l) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 45 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 101, m) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 49 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 105 ou n) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID N°: 53 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID N°: 109.
[0140] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção compreende: - uma região variável de cadeia pesada derivada de uma sequência VH de linha germinativa humana selecionada do grupo que consiste de: IGHV1-18*01, IGHV3-23*01, IGHV3-30*01, IGHV3-33*01, IGHV3-33*03, IGHV1-69*02, IGHV1-69*04 e IGHV5-51*01 e/ou - uma região variável de cadeia leve derivada de uma sequência VK de linha germinativa humana selecionado do grupo que consiste de: IGKV3-20*01, IGKV1-13*02, IGKV3-11*01 E IGKV1D-16*01.
[0141] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um anticorpo anti-TF monoclonal que compreende uma região VH tendo a sequência como apresentada na seq id no 9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 ou 53 ou uma variante de qualquer uma das ditas sequências, tal como uma variante tendo, na maioria, 25 modificações de aminoácido, tal como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas.
[0142] A variante da sequência como apresentada na seq id no 9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 ou 53 pode ter pelo menos 80 % de identidade a qualquer uma das ditas sequências, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0143] Em um aspecto da invenção o anticorpo anti-TF monoclonal isolado compreende uma sequência VL como apresentada na SEQ ID N°: 65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 ou 105 ou uma variante de qualquer uma das ditas sequências, tal como uma variante tendo, na maioria, 25 modificações de aminoácido, tal como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas.
[0144] A variante da sequência como apresentada na seq id no 65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 ou 105 pode ter pelo menos 80 % de identidade a qualquer uma das ditas sequências, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0145] Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende a) uma região VL tendo a sequência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 ou 105 e uma região VH tendo a sequence selecionado do grupo que consiste de SEQ ID N°: 9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 ou 53, b) uma variante de qualquer um dos acima, em que a dita variante preferivelmente têm apenas as substituições conservativas nas ditas sequências.
[0146] Em uma forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 65 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 9 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 9 ou SEQ ID N°: 65 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0147] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 57 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 1 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 57 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0148] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 61 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 5 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 5 ou SEQ ID N°: 61 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0149] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 69 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 13 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 13 ou SEQ ID N°: 69 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0150] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 73 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 17 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 17 ou SEQ ID N°: 73 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0151] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 77 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 21 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 21 ou SEQ ID N°: 77 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0152] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 81 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 25 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 25 ou SEQ ID N°: 81 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0153] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 85 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 29 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 29 ou SEQ ID N°: 85 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0154] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 89 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 33 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 33 ou SEQ ID N°: 89 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0155] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 93 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 37 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 37 ou SEQ ID N°: 93 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0156] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 97 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 41 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 41 ou SEQ ID N°: 97 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0157] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 101 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 45 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 45 ou SEQ ID N°: 101 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0158] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 105 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 49 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 49 ou SEQ ID N°: 105 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0159] Em uma outra forma de realização preferida o anticorpo compreende uma região VL tendo a sequência como apresentada na SEQ ID N°: 109 e uma região VH tendo a sequência como apresentada SEQ ID N°: 53 ou uma variante de qualquer uma das duas sequências, as variantes tendo a) na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou b) pelo menos 80 % de identidade à SEQ ID N°: 53 ou SEQ ID N°: 109 respectivamente, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade.
[0160] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser, por exemplo, produzidos pelo método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) ou pode ser produzido pelos métodos de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados das bibliotecas de anticorpo de fago usando-se as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de qualquer fonte adequada. Desta maneira, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados a partir de células B esplênicas de murino obtidos a partir de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo, na forma de células que expressam o antígeno na superfície ou um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos de hibridomas derivados de células que expressam anticorpo de humanos imunizados ou mamíferos não humanos, tal como ratos, coelhos, cães, primatas, etc.
[0161] Em uma forma de realização, o anticorpo da invenção é um anticorpo humano. Os anticorpos monoclonais humanos direcionados contra fator de tecido podem ser gerados usando-se camundongos transgênicos ou transcromossômico que carregam partes do sistema imune humano em vez do sistema de camundongo. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos, incluem camundongos referidos aqui como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente e são coletivamente referidos aqui como “camundongos transgênicos".
[0162] O camundongo HuMAb contém minilocais de gene de imunoglobulina humanos que codificam variável e constante pesadas humanas não redispostas (μ e y) e sequências de imunoglobulina de variável e constante (K) leve, junto com mutações alvejadas que inativam os locais de cadeia μ e K endógenos (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Consequentemente, o camundongo apresenta a expressão reduzida de IgM ou k de camundongo em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanas introduzidas, sofrem a mudança de classe e mutação somática para a geração de anticorpos monoclonais de IgG,k humanos de afinidade alta (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994) , Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb é descrita em detalhes em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver também US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.
[0163] Os camundongos HCo7 têm uma interrupção de JKD em seus genes de cadeia leve endógena (capa) (como descrito no Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção CMD em genes de cadeia pesada endógena (como descrito no Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve capa humano KCo5 (como descrito no Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) e um transgene de cadeia de cadeia pesada humana HCo7 (como descrito no US 5,770,429).
[0164] Os camundongos HCo12 têm uma interrupção de JKD em seus genes de cadeia leve endógena (capa) (como descrito no Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção CMD em seus genes de cadeia pesada endógena (como descrito no Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve de capa humano KCo5 (como descrito no Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)) e um transgene de cadeia pesada humana HCo12 (como descrito no Exemplo 2 do WO 01/14424).
[0165] Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve de capa de camundongo endógeno foi homozigotamente interrompido como descrito no Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi homozigotamente interrompido como descrito no Exemplo 1 de WO 01/09187. Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve de capa humano, KCo5, como descrito no Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de camundongo também carrega um transcromossomo de cadeia pesada humana composto de 14 fragmentos de cromossomo hCF (SC20) como descrito no WO 02/43478.
[0166] Os esplenócitos a partir destes camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam os anticorpos monoclonais humanos de acordo com técnicas bem conhecidas.Os anticorpos monoclonais ou policlonais humanos da presente invenção ou anticorpos da presente invenção que originam-se de outras espécies também podem ser gerados de maneira transgênica através da geração de um outro mamífero não humano ou planta que é transgênica para as sequências de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de interesse e produção do anticorpo em uma forma recuperável destes. Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, os anticorpos podem ser produzidos e recuperado do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver, por exemplo US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 e US 5,741,957.
[0167] Além disso, os anticorpos humanos da presente invenção ou anticorpos da presente invenção de outras espécies podem ser gerados através das tecnologias do tipo apresentação, incluindo, sem limitação, apresentação de fago, apresentação retroviral, apresentação ribossômica e outras técnicas, usando-se técnicas bem conhecidas na técnica e as moléculas resultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como maturação por afinidade, como tais técnicas são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (apresentação de fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (apresentação de fago), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (apresentação ribossômica), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (apresentação de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) e US 5,733,743). Se as tecnologias de apresentação forem utilizadas para a produção de anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados.
[0168] O anticorpo da invenção também pode ser de qualquer isotipo. A escolha de isotipo será tipicamente guiada pelas funções atuadoras desejadas, tal como indução de ADCC. Os isotipos exemplares são IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada uma das regiões constantes de cadeia leve humanas, capa ou lambda, podem ser usados. Se desejado, a classe de um anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser trocada por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que foi originalmente IgM pode ser a classe trocada a um anticorpo IgG da presente invenção. Ainda, as técnicas de troca de classe também podem ser usadas para converter uma subclasse de IgG a uma outra, por exemplo, do IgG1 ao IgG2. Esta maneira, a função atuadora dos anticorpos da presente invenção pode ser mudada pela troa de isotipo para, por exemplo, um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos terapêuticos. Em uma forma de realização um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG1, por exemplo, um IgG1,K.
[0169] Em uma forma de realização, o anticorpo da invenção é um anticorpo de comprimento total, preferivelmente um anticorpo IgG1, em particular um anticorpo IgG1,K. Em uma outra forma de realização, o anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples.
[0170] Os fragmentos de anticorpos podem, por exemplo, serem obtidos por fragmentação usando-se técnicas convencionais e os fragmentos avaliados quanto à utilizada da mesma maneira como descrito aqui para anticorpos totais. Por exemplo, os fragmentos F(ab')2 podem ser gerados pelo tratamento de anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab')2 resultante pode ser tratado para reduzir as ligações em ponte de bissulfeto para a produção de fragmentos Fab'. Os fragmentos Fab podem se robtidos pelo tratamento de um anticorpo de IgG com papaína; os fragmentos Fab' podem ser obtidos com a digestão de pepsina de anticorpo de IgG. Um fragmento F(ab') também pode ser produzido pela ligação de Fab' descrito abaixo por intermédio de uma ligação de tioéter ou uma ligação de bissulfeto. Um fragmento Fab' é um fragmento de anticorpo obtido pelo corte de uma ligação de bissulfeto da região de junta do F(ab')2. Um fragmento Fab' pode ser obtido pelo tratamento de um fragmento F(ab')2 com uma gente de redução, tal como ditiotreitol. O fragmento de anticorpo também pode ser gerado pela expressão de ácidos nucleicos que codificam tais fragmentos em células recombinantes (ver, por exemplo, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção de um fragmento F(ab')2 pode incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e a região de junta da cadeia H, seguido por um códon de interrupção de tradução para a produção de uma tal molécula de fragmento de anticorpo truncado.
[0171] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-TF é um anticorpo monovalente, preferivelmente um anticorpo monovalente como descrito no WO2007059782 (Genmab) (incorporado neste por referência) tendo uma anulação da região de junta. Consequentemente, em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monovalente, em que o dito anticorpo anti-TF é construído por um método que compreende: i) fornecer uma construção de ácido nucleico que codifica a cadeia leve do dito anticorpo monovalente, a dita construção compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a região VL de um anticorpo anti- TF específico de antígeno selecionado e uma sequência de nucleotídeo que codifica a região CL constante de um Ig, em que a dita sequência de nucleotídeo que codifica a região VL de um anticorpo específico de antígeno selecionado e a dita sequência de nucleotídeo que codifica a região CL de um Ig são operacionalmente ligadas juntas e em que, no caso de um subtipo IgG1, a sequência de nucleotídeo que codifica a região CL foi modificada tal que a região CL não contenha quaisquer aminoácidos capazes de formar ligações de bissulfeto ou ligações covalentes com outros peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácido idêntica da região CL na presença de IgG humano policlonal ou quando administrado a um animal ou ser humano; ii) fornecer uma construção de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada do dito anticorpo monovalente, a dita construção compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a região VH de um anticorpo específico de antígeno selecionado e uma sequência de nucleotídeo que codifica uma região CH constante de um Ig humano, em que a sequência de nucleotídeo que codifica a região CH foi modificada tal que a região correspondente a uma região de junta e, como requerido pelo subtipo Ig, outras regiões da região CH, tal como a região CH3, não compreende quaisquer resíduos de aminoácido que participa da formação de ligações de bissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalente ou estável não covalente com outros peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácido idêntica da região CH do Ig humano na presença de IgG humano policlonal ou quando administrado a um animal ser humano, em que a dita sequência de nucleotídeo que codifica a região VH de um anticorpo específico de antígeno selecionado e a dita sequência de nucleotídeo que codifica a região CH do dito Ig são operacionalmente ligados; iii) fornecer um sistema de expressão celular para produzir o dito anticorpo monovalente; iv) produzir o dito anticorpo monovalente pela co-expressão das construções de ácido nucleico de (i) e (ii) nas células do sistema de expressão de (iii).
[0172] Similarmente, em uma forma de realização, o anticorpo anti-TF é um anticorpo monovalente, que compreende (i) uma região variável de um anticorpo da invenção como descrito aqui ou uma parte de ligação de antígeno da dita região e (ii) Uma região CH de uma imunoglobulina ou um fragmento desta que compreende as regiões CH2 e CH3, em que a região CH ou fragmento desta foi modificada tal que a região correspondente a uma região de junta e, se a imunoglobulina não for um subtipo IgG4, outras regiões da região CH, tal como a região CH3, não compreendem quaisquer resíduos de aminoácido, que são capazes de formar ligações de bissulfeto com uma região CH idêntica ou outras ligações de cadeia inter-pesada covalente ou não covalente estável com uma região CH idêntica na presença de IgG humano policlonal.
[0173] Em uma forma de realização adicional, a cadeia pesada do anticorpo monovalente anti-TF foi modificada tal que uma junta inteira foi anulada.
[0174] Em uma forma de realização adicional, o dito anticorpo monovalente é do sub-tipo IgG4 (ver a SEQ ID N°: 114, uma variante sem junta de SEQ ID N°: 113), mas uma região CH3 foi modificada de modo que uma ou mais seguintes substituições de aminoácido foram feitas: Thr (T) na posição 234 foi substituído por Ala (A); Leu (L) na posição 236 foi substituído por Ala (A); Leu (L) na posição 236 foi substituído por Val (V); Phe (F) na posição 273 foi substituído por Ala (A); Phe (F) na posição 273 foi substituído por Leu (L); Tyr (Y) na posição 275 foi substituído por Ala (A).
[0175] Em uma outra forma de realização adicional, a sequência do dito anticorpo monovalente foi modificada de modo que esta não compreenda quaisquer locais receptores para a glicosilação ligada por N.
[0176] Os anticorpos anti-TF da invenção também incluem anticorpos de cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples são peptídeos em que as regiões de Fv de cadeia pesada e leve são conectados. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um Fv de cadeia simples (scFv) em que as cadeias pesadas e leves no Fv de um anticorpo anti-TF da presente invenção são unidos com um ligador de peptídeo flexível (tipicamente de cerca de 10, 12, 15 ou mais resíduos de aminoácido) em uma cadeia de peptídeo simples. Os métodos de produzir tais anticorpos são descritos em, por exemplo, o US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) e McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, se apenas um VH e VL simples forem usados, bivalente, se dois VH e VL forem usados ou polivalente, se mais do que dois VH e VL forem usados.
[0177] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-TF da invenção é um anticorpo deficiente da função atuadora. Tais anticorpos são particularmente úteis quando o anticorpo é para o uso na estimulação do sistema imune através do bloqueio dos efeitos inibidores de TF. Para tais aplicações, pode ser vantajoso que o anticorpo não tenha funções atuadoras, tais como ADCC, assim como estas podem levar à citotoxicidade indesejada.
[0178] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-TF deficiente na função atuadora é um anticorpo IgG4 estabelecido. Os exemplos de anticorpos IgG4 estabilizados adequados são anticorpos, em que arginina na posição 409 em uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humano, que é indicado no índice EU como em Kabat et al., é substituído por lisina, treonina, metionina ou leucina, preferivelmente lisina (descrito em WO2006033386 (Kirin)) e/ou em que a região de junta compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys.
[0179] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo IgG4 anti-TF estabilizado é um anticorpo IgG4 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende uma região constante de IgG4 humana tendo um resíduo selecionado do grupo que consiste de: Lys, Ala, Thr, Met e Leu na posição correspondente a 409 e/ou um resíduo selecionado do grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, Ile e Leu na posição correspondente a 405 e em que o dito anticorpo opcionalmente compreende uma ou mais substituições adicionais, anulações e/ou inserções, mas não compreende a sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de junta. Preferivelmente, o dito anticorpo compreende um resíduo Lys ou Ala na posição correspondente a 409 ou a região CH3 do anticorpo foi substituído por uma região CH3 de IgG1 humano, de IgG2 humano ou de IgG3 humano.
[0180] Ainda em uma forma de realização adicional. O anticorpo IgG4 anti-TF estabilizado é um anticorpo de IgG4 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende uma região constante de IgG4 humana tendo um resíduo selecionado do grupo que consiste de: Lys, Ala, Thr, Met e Leu na posição correspondente a 409 e/ou um resíduo selecionado do grupo que consiste de: Ala, Val, Gly, Ile e Leu na posição correspondente a 405 e em que o dito anticorpo opcionalmente compreende uma ou mais substituições adicionais, anulações e/ou inserções e em que o dito anticorpo compreende a sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de junta. Preferivelmente, o dito anticorpo compreende um resíduo Lys ou Ala na posição correspondente a 409 ou a região CH3 do anticorpo foi substituído por uma região CH3 de IgG1 humano, de IgG2 humano ou de IgG3 humano.
[0181] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo anti-TF deficiente na função atuadora é um anticorpo de um tipo que não IgG4, por exemplo, IgG1, IgG2 ou IgG3 que foi mutado tal que a capacidade de mediar as funções atuadoras, tais como ADCC, foram reduzidas ou ainda eliminadas. Tais mutações, por exemplo, foram descritas em Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006) e Hezareh M, J Virol. ;75(24):12161-12168 (2001).
[0182] Em uma forma de realização adicional, o anticorpo da invenção é conjugado a uma outra porção, tal como uma porção citotóxica, um radioisótopo ou um medicamento. Tais anticorpos podem ser produzidos pela conjugação química da outra porção à extremidade de terminal N ou extremidade de terminal C do anticorpo anti-TF ou fragmento desta (por exemplo, um anticorpo anti-TF, cadeia H, cadeia L ou fragmento específico/seletivo anti-TF deste) (ver, por exemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Tais derivados de anticorpo conjugados também podem ser gerados por conjugação em resíduos internos ou açúcares, quando apropriado.
[0183] Em geral, os anticorpos anti-TF descritos nestes podem ser modificados por inclusão de qualquer número adequado de tais aminoácidos modificados e/ou associações com tais substituintes conjugados. Adequadamente neste contexto é, em geral, determinado pela capacidade de pelo menos reter substancialmente a seletividade e/ou a especificidade de TF associado com o anticorpo anti-TF precursor não derivatizado. A inclusão de um ou mais aminoácidos modificados pode ser vantajosa em, por exemplo, aumento da vida média de soro de polipeptídeo, redução da antigenicidade de polipeptídeo ou aumento da capacidade de armazenagem de polipeptídeo. Os aminoácidos são modificados, por exemplo, de maneira de co-tradução ou pós-trandução durante a produção recombinante (por exemplo, glicosilação ligada por N em motivos N-X-S/T durante a expressão em células de mamífero) ou modificado por meios sintéticos. Os exemplos não limitantes de um aminoácido modificado incluem um aminoácido glicosilado, um aminoácido sulfatado, um aminoácido prenilado (por exemplo, farnesilado, geranilgeranilado), um aminoácido acetilado, um aminoácido acilado, um aminoácido PEGilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido carboxilado, um aminoácido fosforilado e outros. Referências adequadas para guiar uma pessoa habilitada na técnica na modificação de aminoácidos são repletas por toda a literatura. Os protocolos do exemplo são encontrados em Walker (1998) Protein Protocols On Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ. O aminoácido modificado pode, por exemplo, ser selecionado de um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma porção de lipídeo ou um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
[0184] Os anticorpos anti-TF também podem ser quimicamente modificados pela conjugação covalente para, por exemplo, aumentar sua vida média de circulação. Os polímeros exemplares e os métodos para ligá-los aos peptídeos, são ilustrados em, por exemplo, US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 e US 4,609,546. Os polímeros ilustrativos adicionais incluem polióis polioxietilado e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, um PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000, por exemplo, cerca de 3.000 a 12.000 g/mol).
[0185] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TF que é conjugado a uma segunda molécula de um radionuclídeo, uma enzima, um substrato de enzima, um cofator, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um rótulo de peptídeo ou uma patícula magnética. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-TF pode ser conjugado a um ou mais fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos (oligonucleotídeos), nucleases, hormônios, imunomoduladores, queladores, compostos de boro, agentes fotoativos, pigmentos e outros. Estes e outros agentes adequados podem ser ligados direta ou indiretamente a um anticorpo anti-TF da presente invenção. Um exemplo de ligação indireta de um segundo agente é a ligação por uma porção espaçadora. Estes espaçadores, por sua vez podem ser insolúveis ou solúveis (ver, por exemplo, Diener et al., Science 231, 148 (1986)) e pode ser selecionado para permitir a liberação de medicamento do anticorpo anti-TF em um local alvo e/ou sob condições particulares. Os exemplos adicionais de agentes que podem ser ligados a um anticorpo anti-TF incluem lectinas e peptídeos fluorescentes.
[0186] Em uma forma de realização, os anticorpos anti-TF que compreendem um ou mais aminoácidos radiorrotulados são fornecidos. Um anticorpo anti-TF radiorrotulado pode ser usado tanto para propósitos de diagnóstico quanto terapêuticos (conjugação a moléculas radiorrotuladas é uma outra característica possível). Os exemplos não limitantes de rótulos para polipeptídeos incluem mas não limitam-se a 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc e 125I, 131I e 186Re. Os métodos para a preparação de aminoácidos radiorrotulados e derivados de peptídeo relacionados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 e US 5,697,902. Por exemplo, um radioisótopo pode ser conjugado por um método de cloramina T.
[0187] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-TF da invenção compreende um ácido nucleico conjugado ou molécula associada com ácido nucleico. Em um tem aspecto da presente invenção, o ácido nucleico conjugado é uma ribonuclease citotóxica. Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um ácido nucleico anti-sentido (por exemplo uma molécula anti-sentido alvejada S100A10, que também pode ser um componente independente em um método de composição de combinação ou administração de combinação da presente invenção - ver por exemplo Zhang et al., J Biol Chem. 279(3), 2053-62 (2004)). Em uma forma de realização, o ácido nucleico é uma molécula de RNA inibidora (por exemplo, uma molécula de siRNA). Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um ácido nucleico imunoestimulador (por exemplo, uma molécula de DNA contendo o motivo CpG imunoestimulador). Em uma forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um cassete de expressão que codifica quanto ao cassete de expressão para a expressão de um gene supressor de tumor, vacina anti-câncer, citocina anti-câncer ou agente apoptótico. Tais derivados também podem compreender a conjugação de um ácido nucleico que codifica quanto à expressão de uma ou mais proteínas citotóxicas, tal como toxinas vegetais e bacterianas.
[0188] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-TF é conjugado a uma molécula de ácido nucleico funcional. Os ácidos nucleicos funcionais incluem moléculas antisentido, moléculas de ácido nucleico de interferência (por exemplo, moléculas de siRNA), aptâmeros, ribozimas, moléculas formadoras de triplex e sequências guias externas. As moléculas de ácido nucleico funcionais podem atuar como atuadores, inibidores, moduladores e estimuladores de uma atividade específica possuída por uma molécula alvo ou as moléculas de ácido nucleico funcionais podem possuir uma atividade de novo independente de quaisquer outras moléculas.
[0189] Em uma outra forma de realização, um anticorpo anti-TF da invenção é conjugado a um aptâmero.
[0190] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TF que é conjugado a uma ribozima.
[0191] Qualquer método conhecido na técnica para conjugar o anticorpo anti-TF às moléculas conjugadas, tais como aquelas descritas acima, podem ser utilizadas, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Diversos tipos de compostos citotóxicos podem ser unidos às proteínas através do uso de um grupo reativo no composto citotóxico ou através do uso de um agente de reticulação. Um grupo reativo comum que formará uma ligação covalente estável in vivo com uma amina é isotiocianato (Means et al., Chemical modifications of proteins (Holden-Day, San Francisco 1971) pp. 105-110). Este grupo, preferivelmente, reage com o grupo ε-amina de lisina. A maleimida é um grupo reativo comumente usado para formar uma ligação covalente in vivo com o grupo de sulfidrila em cisteína (Ji., Methods Enzymol 91, 580-609 (1983)). Os anticorpos monoclonais, tipicamente, são incapazes de formar ligações covalentes com os íons radiometálicos, mas estes podem ser ligados ao anticorpo indiretamente através do uso de agentes queladores que são covalentemente ligados aos anticorpos. Os agentes queladores podem ser ligados através de aminas (Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) e grupos sulfidral (Koyama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)) de resíduos de aminoácido e também através de grupos de carboidrato (Rodwell et al., PNAS USA 83, 2632-2636 (1986), Quadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)). Visto que estes agentes queladores contém dois tipos de grupos funcionais, um para ligar os íons metálicos e o outro para unir o quelado ao anticorpo, que são comumente referidos como agentes queladores bifuncionais (Sundberg et al., Nature 250, 587-588 (1974)).
[0192] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF humano, conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um medicamento quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Tais conjugados são referidos aqui como “imunoconjugados”. Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como “imunotoxinas".
[0193] Uma citotoxina ou um agente citotóxico inclui qualquer agente que é nocivo às (por exemplo, mata) células. Para uma descrição destas classes de medicamentos que são bem conhecidos na técnica e seus mecanismos de ação, ver Goodman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8° Ed., Macmillan Publishing Co., 1990. As técnicas adicionais relevantes a uma preparação de imunotoxinas de anticorpo são fornecidas em, por exemplo, Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) e US 5,194,594.
[0194] Os agentes terapêuticos adequados para a formação de imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, antimetabólitos (tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tal como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamide, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina), antibióticos (tal como dactinomicina (isto é actinomicina), bleomicina, daunorubicina (isto é, daunomicina), doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), toxina da difteria e moléculas relacionadas (tais como cadeia de difteria A e seus fragmentos ativos e moléculas híbridas), toxina de ricina (tal como ricina A ou uma toxina de cadeia A de ricina desglicosilada), toxina da cólera, uma toxina semelhante a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina de Shiga, toxina da coqueluxe, toxina do tétano, inibidor da protease de Bowman-Birk de soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e toxinas de enomicina. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de caruru-de-cacho, toxina da difterina e endotoxina de Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) e Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Os agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-TF da presente invenção como descrito em qualquer lugar neste, também podem ser candidatos para porções terapêuticas úteis para a conjugação de um anticorpo anti-TF da presente invenção.
[0195] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-TF da presente invenção é ligado a um ligador de quelador, por exemplo, tiuxetano, que permite que o anticorpo seja conjugado com um radioisótopo.
[0196] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma molécula biespecífica que compreende an anticorpo anti-TF da invenção como descrito acima e uma segunda especificidade de ligação tal como uma especificidade de ligação para uma célula atuadora humana, um receptor Fc humano ou um receptor de célula T. Ou uma especificidade de ligação para outro epítopo de TF.
[0197] As moléculas biespecíficas da presente invenção ainda podem incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-TF e uma especificidade de ligação para uma célula atuadora humana, um receptor Fc humano ou um receptor de célula T.
[0198] As moléculas de anticorpo biespecíficos exemplares da invenção compreendem (i) dois anticorpos, um com uma especificidade ao TF e um outro a um segundo alvo que são conjugados juntos, (ii) um anticorpo simples, que têm uma cadeia específica ao TF e uma segunda cadeia específica a uma segunda molécula e (iii) uma cadeia de anticorpo simples que tenha especificidade ao TF e uma segunda molécula. Tipicamente, o segundo alvo/segunda molécula é uma outra molécula que não TF. Em uma forma de realização, a segunda molécula é um antígeno de câncer/antígeno associado com tumor, tal como antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno específico de próstata (PSA), RAGE (antígeno renal), α-fetoproteina, CAMEL (antígeno reconhecido por CTL em melanoma), antígenos CT (tais como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3 e D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE e SAGE), antígenos de mucina (por exemplo, MUC1, mucin-CA125, etc.), antígenos de gangliosídeo, tirosinase, gp75, C-myc, Mart1, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7 e Ep-CAM. Em uma forma de realização, a segunda molécula é uma integrina associada com câncer, tal como α5β3 integrina. Em uma forma de realização, a segunda molécula é um fator angiogênico ou outro fator de crescimento associado com câncer, tal como um fator de desenvolvimento endotelial vascular (VEGF), um fator de desenvolvimento de fibroblasto (FGF), fator de desenvolvimento epidérmico (EGF), receptor do fator de desenvolvimento epidérmico (EGFR), angiogenina e receptores destes, particularmente os receptores associados com a progressão do câncer (por exemplo um dos receptores de HER1-HER4, c-met ou RON). Outras proteínas associadas com a progressão do câncer debatidas neste também podem ser as segundas moléculas adequadas.
[0199] Em uma forma de realização, um anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo. Os anticorpos biespecíficos também incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos em um heteroconjugado podem ser ligados à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos alvejar as células do sistema imune a células indesejadas (ver, por exemplo, US 4,676,980). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando-se quaisquer métodos de reticulação convenientes.
[0200] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um vetor de expressão que codifica um anticorpo da invenção.
[0201] Em uma forma de realização, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 1 a 112.
[0202] Em uma outra forma de realização particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das sequências de aminoácido VH selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 9, 1, 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49 e 53.
[0203] Em uma forma de realização particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das sequências de aminoácido VH CDR3 selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID NO 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 e 56.
[0204] Em uma outra forma de realização particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das sequências de aminoácido VL selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 65, 57, 61, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101 e 105.
[0205] Em uma outra forma de realização, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das sequências de aminoácido VL CDR3 selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID N°: 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104 e 108.
[0206] Em uma forma de realização particular o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica variantes de uma ou mais das sequências de aminoácido acima, as ditas variantes tendo na maioria 25 modificações de aminoácido, tais como 20, tal como na maioria 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificações de aminoácido, tal como anulações ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou pelo menos 80 % de identidade a qualquer uma das ditas sequências, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade à qualquer uma das sequências de aminoácido mencionadas acima.
[0207] Em uma forma de realização adicional, o vetor de expressão ainda compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou tanto cadeias leves quanto pesadas de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo humano.
[0208] Tais vetores de expressão podem ser usados para a produção recombinante de anticorpos da invenção.
[0209] Um vetor de expressão no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácido nucleico cromossômicos, não cromossômicos e sintéticos (uma sequência de ácido nucleico que compreende um série adequada de elementos de controle de expressão). Os exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago e vetores de ácido nucleico virais (RNA ou DNA). Em uma forma de realização, um ácido nucleico que codifica anticorpo anti-TF é compreendido de um vetor de DNA ou RNA nu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito, por exemplo, em Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compacto (como descrito no por exemplo US 6,077, 835 e/ou WO 00/70087), um vetor de plasmídeo tal como pBR322, pUC 19/18 ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucleico de tamanho mínimo de "mosquito-pólvora" (como descrito em por exemplo Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)) ou como um vetor de construção de ácido nucleico precipitado, tal como uma construção precipitada CaP04- (como descrito no por exemplo WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978) e Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tais vetores de ácido nucleico e o uso destes são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo US 5,589,466 e US 5,973,972).
[0210] Em uma forma de realização, o vetor é adequado para a expressão do anticorpo anti-TF em uma célula bacteriana. Os exemplos de tais vetores incluem vetores de expressão, tais como BlueScript (Stratagene), vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vetores de pET (Novagen, Madison WI) e outros).
[0211] Um vetor de expressão também ou alternativamente pode ser um vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura pode ser utilizado. Os vetores adequados incluem, por exemplo, vetores que compreendem promotores constitutivos ou indutíveis, tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH (revisto em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987) e Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
[0212] Um ácido nucléico e/ou vetor também pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de secreção/localização, que pode alvejar um polipeptídeo, tal como uma cadeia de polipeptídeo nascente, ao espaço periplásmico ou em meio de cultura de célula. Tais sequências são conhecidas na técnica e incluem condutor de secreção ou sequências que alvejam organelas de peptídeos sinalizadores (por exemplo, sequências de localização nuclear, sinais de retenção de ER, sequências de trânsito mitocondrial, sequências de trânsito de cloroplasto), localização de membrana / sequências âncora (por exemplo, sequências de transferência de interrupção, sequência âncoras de GPI) e outros.
[0213] Em um vetor de expressão da invenção, os ácidos nucleicos que codificam anticorpo anti-TF podem compreender ou estarem associados com qualquer promotor, intensificador e outros elementos que facilitam a expressão adequados. Os exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão fortes (por exemplo, promotor/intensificador de CMV IE humano bem como promotores RSV, SV40, SL3-3, MMTV e HIV LTR), sequências de terminação de poli (A) eficazes, uma origem de replicação para o produto de plasmídeo em E. coli, um gene de resistência de antibiótico como marcador selecionável e/ou um local de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligador). Os ácidos nucleicos também podem compreender um promotor indutível como oposto a um promotor constitutivo, tal como CMV IE (o técnico habilitado reconhecerá que tais termos são realmente descrições de um grau de expressão genética sob certas condições).
[0214] Em uma forma de realização, o vetor de expressão que codifica o anticorpo anti-TF pode ser posicionado em e/ou liberado à célula hospedeira ou animal hospedeiro por intermédio de um vetor viral.
[0215] Ainda em um outro aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante, tal como um transfectoma, que produz um anticorpo da invenção como definido neste ou uma molécula biespecífica da invenção como definido neste. Os exemplos de células hospedeiras incluem levedura, células bacterianas e de mamífero, tais como células CHO ou HEK. Por exemplo, em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma célula que compreende um ácido nucleico estavelmente integrado no genoma celular que compreende uma sequência que codifica quanto à expressão de um anticorpo anti-TF da presente invenção. Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece uma célula que compreende um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo ou elemento de expressão linear, que compreende uma sequência que codifica a expressão de an anticorpo anti-TF da invenção.
[0216] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um hybridoma que produz um anticorpo da invenção como definido neste. Ainda, em um outro aspecto adicional, a invenção diz respeito a um animal não humano transgênico que compreende ácidos nucleicos que codifica uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produz um anticorpo da invenção. A geração de tais hibridomas e animais transgênicos foi descrita acima.
[0217] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a ummétodo para produção de um anticorpo anti-TF da invenção, o dito método que compreende as etapas de a) cultivar um hibridoma ou uma célula hospedeira da invenção como descrito neste acima e b) purificar o anticorpo da invenção a partir do meio de cultura.
[0218] Ainda em um aspecto principal, a invenção diz respeito a um anticorpo anti-TF como definido neste ou uma molécula biespecífica como definido neste para uso como um medicamento.
[0219] Ainda em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende: - um anticorpo anti-TF como definido neste ou uma molécula biespecífica como definido neste e - um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0220] As composições farmacêuticas podem ser formuladas com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com as técnicas convencionais tal como aquelas divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19° Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
[0221] Os carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos devem ser adequados para o composto escolhido da presente invenção e o modo escolhido de administração. Adequadamente para os carreadores e outros componentes das composições farmacêuticas é determinado com base na falta do impacto negativo significante das propriedades biológicas desejadas do composto escolhido ou composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, menor do que um impacto substancial (10 % ou menos de inibição relativa, 5 % ou menos de inibição relativa, etc.)) na ligação de antígeno.
[0222] A composição farmacêutica da presente invenção também pode incluir diluentes, enchedores, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween-80), estabilizadores (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteína), conservantes, fixadores de tecido, solubilizadores e/ou outros materiais adequados para inclusão na composição farmacêutica.
[0223] Foi relacionado que em células cancerígenas, tal como células cancerígenas colorretais humanas, expressão TF está sob o controle de 2 maiores eventos de transformação levando a progressão da doença (ativação de oncogene K-ras e inativação do supressor do tumor p53), em uma maneira dependente na cinase de proteína ativada por mitogênio/MEK (MAPK) e fosfatidilinositol 3’-cinase (PI3K) (Yu et al. (2005) Blood 105:1734.
[0224] O TF que expressa as células cangerígenas pode ser alvos particularmente bons para os anticorpos anti-TF da invenção, visto que mais anticorpos podem ser ligados pela célula. Deste modo, em uma forma de realização, um paciente com câncer a ser tratado com um anticorpo anti-TF da invenção é um paciente, por exemplo, um paciente com câncer pancreático, câncer pulmonar ou câncer colorretal que foi diagnosticado ter uma ou mais mutações em K-Ras e/ou uma ou mais mutações em p53 em suas células de tumor.
[0225] Em uma forma de realização alternativa, o paciente a ser tratado com um anticorpo anti-TF da invenção é um paciente, por exemplo, um paciente com câncer pancreático, câncer pulmonar ou câncer colorretal, que não tem uma mutação em K-Ras. Sem ser ligado por qualquer teoria possível, é possível que algumas células de tumor tendo ativação K-Ras são menos suscetíveis ao tratamento anti-TF de anticorpo, por causa dos efeitos dos anticorpos anti-TF nos mecanismos de sinalização intracelulares podem ser menos efetivos nas células em que K-Ras é ativado.
[0226] Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo como para obter uma quantidade do ingrediente ativo que é efetivo para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá em uma variedade dos fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizados, ou a amida destes, a via de administração, o período de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo utilizado, a duração do tratamento, outros medicamentos, compostos e/ou materiais usados na combinação com as composições particulares utilizadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica.
[0227] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e modo adequado. Vias adequadas de administração de um composto da presente invenção in vivo e in vitro são bem conhecidos na técnica e pode ser selecionados por aquela pessoa habilitada na técnica.
[0228] Em uma forma de realização, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada parenteralmente.
[0229] As frases "administração parenteral" e "parenteralmente administrada" como usado neste significa os modos de administração outros do que administração tópica e enteral, usualmente pela injeção e incluem injeção e infusão epidermal, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, intratendinoso, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinal, intracranial, intratorácico, epidural e intrasternal.
[0230] Em uma forma de realização que a composição farmacêutica é administrada pela injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.
[0231] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer e todos os solventes adequados, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes retardantes de absorção e outros que são fisiologicamente compatíveis com um composto da presente invenção.
[0232] Exemplos dos carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada por fosfato, etanol, dextrose, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e mistura adequada destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de colza e óleo de gergelim, soluções coloidais de carboximetil celulose, goma de tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila e/ou vários tampões. Outros carreadores são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas.
[0233] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões ou pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tal meio e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que como qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, uso destes nas composições farmacêuticas da presente invenção é considerado.
[0234] A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso dos materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso dos tensoativos.
[0235] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, tal como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e outros; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tal como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e outros; e (3) agentes de quelação metálico, tal como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e outros.
[0236] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, tal como açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.
[0237] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via escolhida de administração tal como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificadores, agentes de dispersão, conservantes ou tampões, que podem intensificar a vida de prateleira ou efetividade da composição farmacêutica. Os compostos da presente invenção podem ser preparados com carreadores que protegerá o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulado. Tais carreadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biocomaptíveis, biodegradáveis tal como acetato de etileno vinil, polianidretos, ácido poliglicólicos, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Os métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos aquela pessoa habilitada na técnica. Ver por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0238] Em uma forma de realização, os compostos da presente invenção podem ser formulados para garantir a própria distribuição in vivo. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a administração parenteral incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões ou pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tal meio e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que como qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, uso destes nas composições farmacêuticas da presente invenção é considerado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[0239] As composições farmacêuticas para injeção podem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra estruturas ordenada adequada a concentração de medicamento alto. O carreador pode ser um solvente aquoso ou não aquoso ou meio de dispersão contendo por exemplo água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e mistura adequada destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso da dispersão e pelo uso dos tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como glicerol, manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio em uma composição. A absorção prolongada das composições injetáveis podem ser realizados para incluir em uma composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes por exemplo, como enumerado acima, como requerido, seguido pela microfiltração pela esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos por exemplo, a partir daquele enumerado acima. No caso dos pós estéreis para a preparação das soluções injetáveis estéreis, exemplos dos métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produziu um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução filtrada-estéril previamente destes.
[0240] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela microfiltração pela esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes requeridos a partir daquele enumerado acima. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos da preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produziu um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir da solução filtrada-estéril previamente destes.
[0241] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um composto da presente invenção ou uma combinação dos compostos da presente invenção.
[0242] Como descrito acima, em outro aspecto, a invenção diz respeito ao anticorpo da invenção como definido neste ou uma molécula biespecífica da invenção como definido neste para uso como um medicamento.
[0243] Os anticorpos anti-TF da invenção podem ser usados para um número de propósitos. Em particular, os anticorpos da invenção podem ser usados para o tratamento de várias formas de câncer. Em um aspecto os anticorpos monoclonais anti-TF da invenção são usados para o tratamento de vários tipos de cânceres sólidos tal como: tumores do sistema nervoso central, câncer de cabeça e pescoço, câncer pulmonar (tal como câncer pulmonar da célula não menor), câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer de fígado e biliar, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de próstata, câncer endometrial, câncer ovariano, melanoma malígno, sarcoma (tecido macio por exemplo osso e músculo), tumores de origem primária desconhecidos (isto é primários desconhecidos), leucemia, câncer de medula óssea (tal como mieloma múltiplo) leucemia linfoblástico agudo, leucemia linfoblástico crônico e não linfoma de Hodgkin, câncer de pele, glioma, câncer do cérebro, útero e reto.
[0244] Ainda a inflamação autoimune, tal como miopatias ou esclerose múltipla podem ser alvejados com os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção.
[0245] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de hemostase.
[0246] Distúrbios hemostáticos relacionados ao câncer também podem ser alvejados com a presente intervenção.
[0247] Ainda doenças com inflamação, tal como miopatias, Artrite reumatóide, osteoartrite, espondilite ansilosante, gota, espondilartropatias, espondilite ansilosante, síndrome de Reiter, artropatia psoriática, espondilite enterapátrica, artropatia juvenil, artropatia reativa, artrite pós-infecciosa ou infecciosa, artrite tuberculosa, artrite viral, artrite fúngica, artrite sifilítica, glomerulonefrite, doença renal de estágio final, lupus sistêmico eritemasoso, mb. Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, asma alérgica, bronquite, bronquite aguda, bronquite crônica, fibrose pulmonar idiopática, ou esclerose múltipla podem ser alvejados com os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção.
[0248] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de hemostase.
[0249] Os distúrbios hemostáticos relacionados ao câncer também podem ser alvejados com a presente intervenção.
[0250] Também as doenças vasculares tal como restenose vascular, doença vascular miocardial, doença vascular cerebral, retinopatia e degeneração macular, incluindo mas não limitado a AMD úmido pode ser tratado com anticorpos monoclonais anti-TF.
[0251] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de pacientes com risco cardiovascular, tal como ateroesclerose, hipertensão, diabetes, dislipidemia e síndrome coronária aguda, incluindo mas não limitado a infarto do miocárdio agudo, acidente vascular cerebral.
[0252] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para a inibição de trombose, tal como DVT, embolismo renal, embolismo pulmonar, trombose arterial, ou para tratar trombose que ocorre seguindo cirurgia arterial, enxertos de desvio vascular periférico ou enxertos de desvio da artéria coronária, desvios arterio- venosos, remoção de uma implementação, tal como um stent ou catéter
[0253] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para a inibição de dano de reperfusão isquêmico renal .
[0254] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de hiperlipoproteineimia, hiperparatiroidismo,
[0255] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de vasculite, vasculite positive ANCA, doença de Behcet.
[0256] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o bloqueio da deficiência respiratória induzida por trauma, tal como síndrome da angústia respiratória aguda, dano pulmonar agudo.
[0257] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o bloqueio da disfunção de órgão induzido por infecção, tal como deficiência renal, síndrome da angústia respiratória aguda, dano pulmonar agudo
[0258] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para tratar vários distúrbios tromboembólicos tal como aqueles que originam-se de angioplastia, infarto do miocárdio, angina instável e estenose da artéria coronária.
[0259] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis em um ajuste profilático para tratar complicações medidas por TF as infecções sistêmicas, tal como sepse ou pneumonia.
[0260] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis como o tratamento profilático dos pacientes com vasos ateroscleróticos no risco para trombose.
[0261] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de doença enxerto- versus-hospedeiro.
[0262] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o aumento do enxerto de célula beta e beta no transplante de ilhota, para evitar a vasculopatia de aloenxerto cardíaco (CAV), para evitar rejeição de enxerto agudo.
[0263] Os anticorpos monoclonais anti-TF da presente invenção também podem ser úteis para o tratamento de doenças onde a circulação das micropartículas que expõe do fator de tecido estão presentes, tal como mas não limitado a trombose vascular, diabetes tipo II, AMI, hipertensão arterial pulmonar. Similarmente, a invenção diz respeito a um método para a inibição do desenvolvimento e/ou proliferação de um TF que expressa a célula de tumor, que compreende a administração, a um indivíduo em necessidade destes, de um anticorpo ou uma molécula biespecífica da invenção. Em uma forma de realização, a dita célula de tumor está envolvida em câncer, tal como câncer de próstata, câncer pulmonar (tal como câncer pulmonar da célula não menor), câncer de mama, câncer colorretal (tal como câncer colorretal metastático), câncer pancreático, câncer endometrial, câncer ovariano, melanoma cutâneo, leucemia, câncer de medula óssea (tal como mieloma múltiplo), leucemia linfoblástico agudo, leucemia linfoblástico crônico e não linfoma de Hodgkin, câncer de pele, câncer de próstata, glioma, câncer do cérebro, rins, útero, bexiga e reto.
[0264] Também, a invenção diz respeito ao uso de um anticorpo monoclonal que liga-se ao TF humano para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, tal como uma das indicações do câncer específico mencionados acima.
[0265] Em uma forma de realização a seleção de pacientes a serem tratados com anticorpo anti-TF é com base no nível de fator de tecido (TF) em sua urina e/ou sangue. Em uma forma de realização particular o paciente a ser tratado tem um nível relativamente alto de TF na urina e/ou sangue. Por exemplo, o paciente a ser tratado pode ter um nível de TF na urina de mais do que 20 ng/ml, tal como mais do que 40 ng/ml. Por exemplo, mais do que 100 ng/ml, tal como mais do que 200 ng/ml. Alternativamente, ou além disso, o nível TF no soro dos pacientes podem ser mais do que 100 pg/ml, tal como mais do que 200 pg/ml. Este pode por exemplo, ser determinado usando um ELISA.
[0266] Em uma forma de realização adicional dos métodos de tratamento da presente invenção, a eficácia do tratamento está sendo monitorado durante a terapia, por exemplo, em pontos pré-definidos no período. Em uma forma de realização, a eficácia pode ser monitorada pela medição dos níveis de TF monitorado pela medição do nível de, por exemplo por ELISA. Em outra forma de realização, a eficácia pode ser determinada pela visualização da área doente, por exemplo, pela reação de uma ou mais avaliações PET-CT, por exemplo usando um anticorpo anti-TF rotulado, tal como a anticorpo anti-TF rotulado da presente invenção. Além disso, anticorpos anti-TF rotulados, tal como anticorpos anti-TF rotulados da invenção, devem ser usados para detectar tumores que produzem TF por exemplo, usando uma avaliação PET-CT.
[0267] Os regimes de dosagem nos métodos acima do tratamento e uso são ajustados para fornecer a ótima resposta desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo simples pode ser administrado, diversas dosagens divididas podem ser administradas no período ou a dosagem pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicada pelas exigências da situação terapêutica. As composições parenterais podem ser formuladas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como usado neste refere-se as unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada do composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da presente invenção são ditadas por e diretamente dependentes em (a) as únicas características do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser atingido e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade nos indivíduos.
[0268] As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para os anticorpos anti-TF dependentes da doença ou condição a ser tratado e podem ser determinadas pela pessoa habilitada na técnica. Uma faixa limitante exemplar para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção é cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como cerca de 0,1-50 mg/kg, por exemplo cerca de 0,1-20 mg/kg, tal como cerca de 0,1-10 mg/kg, por exemplo cerca de 0,5, cerca de tal como 0,3, cerca de 1, ou cerca de 3 mg/kg.
[0269] Um médico ou veterinário tendo habilidade comum na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz do composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário pode iniciar dosagens do anticorpo anti-TF utilizado na composição farmacêutica em níveis inferiores do que aqueles requeridos a fim de atingir o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumenta a dosagem até o efeito desejado ser atingido. Em geral, uma dosagem diária adequada de uma composição da presente invenção será aquela que a quantidade do composto que é a dosagem eficaz menor para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dosagem eficaz geralmente dependerá dos fatores descritos acima. A administração pode ser por exemplo, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea e por exemplo administrada próxima ao local do alvo. Se desejado, a dosagem eficaz diariamente da composição farmacêutica pode ser administrada como dois, três, quarto, cinco, seis ou mais sub-dosagens administradas separadamente nos intervalos apropriados em toda parte do dia, opcionalmente, nas formas de dosagem unitárias. Enquanto é possível para um composto da presente invenção ser administrada sozinha, é preferível administrar o composto como uma composição farmacêutica como descrito acima.
[0270] Em uma forma de realização, os anticorpos anti-TF pode ser administrada pela infusão em uma dosagem semanalmente de 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, por exemplo, 1 a 8 vezes, tal como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas.
[0271] Em uma forma de realização, os anticorpos anti-TF podem ser administrados pela infusão contínua lenta em um período longo, tal como mais do que 24 horas, a fim de reduzir os efeitos colaterais tóxicos.
[0272] Em uma forma de realização os anticorpos anti-TF podem ser administrados em uma dosagem semanalmente de 250 mg a 2000 mg, tal como por exemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou 2000 mg, por até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. A administração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 A 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada pela medição da quantidade do composto da presente invenção no sangue na administração por exemplo retirando-se uma amostra biológica e usando anticorpos anti-idiotípicos com alvo da região de ligação de antígeno dos anticorpos anti-TF da presente invenção.
[0273] Em uma forma de realização, os anticorpos anti-TF podem ser administrados pela terapia de manutenção, tal como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[0274] Em uma forma de realização, os anticorpos anti-TF podem ser administrados por um regime incluindo uma infusão de um anticorpo anti-TF da presente invenção seguido pela an infusão de um anticorpo anti-TF da presente invenção conjugado a um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, 7 a 9 dias depois.
[0275] Como exemplos não limitantes, o tratamento de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como uma dosagem diária de um composto da presente invenção em uma quantidade de cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um do dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente, pelo menos um da semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 após iniciação do tratamento, ou qualquer combinação destes, usando dosagens simples ou divididas de cada 24, 12, 8, 6, 4, ou 2 horas, ou qualquer combinação destes.
[0276] Uma "quantidade eficaz" para a terapia de tumor também pode ser medida por sua capacidade de estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto inibir o câncer pode ser avaliado em um sistema de modelo animal predito da eficácia nos tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada pelo exame da capacidade do composto para inibir o desenvolvimento celular ou para induzir a apoptose pelos ensaios in vitro conhecidos pelo médico habilitado. A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra maneira melhorando os sintomas em um paciente. Uma pessoa habilitada na técnica deve ser capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do paciente, a gravidade dos sintomas dos pacientes e a composição particular ou via de administração selecionada.
[0277] Um anticorpo anti-TF também pode ser administrado profilaticamente a fim de reduzir o risco do desenvolvimento do câncer, atraso no início da ocorrência de um evento na progressão do câncer e/ou reduzir o risco da recorrência quando um câncer está em remissão. Este pode ser especialmente útil nos pacientes em que este é difícil para localizar um tumor que é conhecido ser presente devido a outros fatores biológicos.
[0278] Os anticorpos anti-TF também podem ser administrados em uma terapia de combinação, isto é, combinado com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratado. Consequentemente, em uma forma de realização, o medicamento contendo o anticorpo é para a combinação com um ou mais agente terapêutico adicional, tal como um agente citotóxico, quimioterapêutico ou anti-angiogênico.
[0279] Tal administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para a administração simultânea os agentes podem ser administradas como uma composição ou como composições separadas, como apropriado. A presente invenção deste modo também fornece os métodos para o tratamento de um distúrbio que envolve as células que expressam TF como descrito acima, no qual os métodos compreendem a administração de um anticorpo anti-TF da presente invenção combinado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descritos abaixo.
[0280] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratamento de um distúrbio que envolvem células que expressam TF em um paciente, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF da presente invenção e pelo menos um agente quimioterapêutico a um paciente em necessidade destes.
[0281] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar ou evitar o câncer, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF da presente invenção e pelo menos um agente quimioterapêutico a um paciente em necessidade destes.
[0282] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-TF da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico para o tratamento do câncer.
[0283] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um antimetabólito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gemcitabina, cladribina e agentes similares.
[0284] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um agente de alquilação, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina e agentes similares.
[0285] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um agente anti-mitótico, tal como taxanos, por exemplo docetaxel e paclitaxel e alcalóides vinca, por exemplo vindesina, vincristina, vinblastina e vinorelbina.
[0286] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor de topoisomerase, tal como topotecano ou irinotecano.
[0287] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um medicamento citostático, tal como etoposídeo e teniposídeo.
[0288] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor de fator de desenvolvimento, tal como um inibidor de ErbB1 (EGFR) (tal como Iressa, erbitux (cetuximab), tarceva e agentes similares), um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como herceptina e agentes similares) e agentes similares.
[0289] Em uma forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor de tirosina cinase, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 e agentes similares.
[0290] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratamento de um distúrbio que envolvem células que expressam TF em um paciente, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF da presente invenção e pelo menos um inhibitor de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização a um paciente em necessidade destes
[0291] Exemplos de um tal angiogênese são inibidores de urocinase, inibidores de metaloprotease de matriz (tal como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares), inibidores de migração e proliferação da célula endotelial (tal como TNP-470, esqualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistas de fatores de desenvolvimento angiogênicos (tal como tal como ZD6474, SU6668, anticorpos contra angiogênicos e/ou seus receptores (tal como VEGF, bFGF e angiopoietin-1), talidomida, análogos de talidomida (tal como CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogênica (tal como angiozima), interferon α (tal como interferon α2a), suramina e agentes similares), inibidores de cinase VEGF-R e outros inibidores de tirosina cinase anti-angiogênicos (tal como SU011248), inibidores de sinalização de sobrevivência/integrina específico- endotelial (tal como vitaxina e agentes similares), antagonistas de cobre/queladores (tal como tetratiomolibdato, captoprila e agentes similares), carboxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E bem como moléculas de nucleotídeos que inibem a angiogênese (tal como antisentido-VEGF- cDNA, cDNA codificados pela angiostatina, cDNA codificados por p53 e cDNA codificados pelos receptor VEGF-2 deficientes) e agentes similares.
[0292] Outros exemplos de tais inibidores de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização são derivados de heparina anti- angiogênicos e moléculas relacionadas (por exemplo, heperinase III), temozolomida, NK4, fator inibidor de migração de macrófago (MIF), inibidores de ciclooxigenase-2, inibidores de fator 1 indutível por hipoxia, isoflavonas de soja anti-angiogênicas, oltipraz, fumagilina e análogos destes, análogos de somatostatina, polissulfato de pentosano, tecogalan de sódio, dalteparina, tumstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticorpos contra outros alvos relevantes (tal como integrina anti- alfa-v/beta-3 e anti-quininostatina mAbs) e agentes similares.
[0293] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser um imunogênio anti-câncer, tal como um antígeno associado ao tumor/antígeno do câncer (por exemplo, molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM/TACSTD1), mucina 1 (MUC1), antígeno carcinoembriônico (CEA), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas virais associados ao câncer (por exemplo, vacinas de papilomavírus humano), proteínas de choque por calor derivados por tumor e agentes similares. Um número de outros antígenos do câncer adequado/antígenos associados ao tumor descritos em outra parte e moléculas similares conhecidas na técnica também podem ou alternativamente ser usados em tal forma de realização. Os peptídeos imunogênicos anti-câncer também incluem "vacinas" anti- idiotípicas tal como anticorpos anti-idiotípicos BEC2, Mitumomab, CeaVac e anticorpos anti-idiotípicos relacionados, anticorpo anti-idiotípicos ao anticorpo MG7 e outros anticorpos anti-idiotípicos anti-câncer (ver por exemplo Birebent et al., Vaccine. 21(15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996) e Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)). Um tal Abs anti-idiotípico pode ser opcionalmente conjugado a um carreador, que pode ser um carreador da molécula sintética (tipicamente inerte), uma proteína (por exemplo hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) (ver por exemplo Ochi et al., Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)), ou uma célula (por exemplo red blood cell - ver por exemplo Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)).
[0294] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser uma citocina anti-câncer, quimiocina, ou combinação destes. Exemplos de citocinas adequadas e fatores de desenvolvimento incluem IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (por exemplo, INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, fator de célula tronco, ancestima e TNFα. Quimiocinas adequadas podem incluir quimiocinas negativas Glu-Leu-Arg (ELR) tal como IP-10, MCP-3, MIG e SDF-1α a partir das famílias de quimiocina CXC e C-C humanas. As citocinas adequadas incluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina e proteínas de fusão de citocina. Estes e outros métodos ou usos que envolvem o uso dos ácidos nucleicos que codificam o peptídeo de ocorrência natural neste podem alternativamente ou adicionalmente ser realizado pela "ativação do gene" e técnicas de super regulação do gene de recombinação homóloga, tais como são descritos em U.S. 5.968.502, U.S. 6.063.630 e U.S. 6.187.305 e EP 0505500.
[0295] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser um controle do ciclo celular/regulador de apoptose (ou "agente de regulação"). Um controle do ciclo celular/regulador de apoptose podem incluir moléculas que alvejam e modulam o controle do ciclo celular/regulador de apoptoses tal como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) cinases dependentes de ciclina que super estimulam o ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroxistaurosporina (UCN-01, KW-2401) e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)) e (iii) moduladores de telomerase (tal como BIBR1532, SOT-095, GRN163 e composições descritos em por exemplo U.S. 6.440.735 e U.S. 6.713.055). Exemplos não limitantes das moléculas que interferem com caminhos apoptóticos incluem ligando que induzem a apoptose relacionado ao TNF (TRAIL)/ligando de apoptose-2 (Apo-2L), anticorpos que ativam os receptores TRAIL, IFNs,D e Bcl-2 anti-sentido.
[0296] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima pode ser um agente de regulação hormonal, tal como agentes úteis para a terapia anti-androgênio e anti-estrogênio. Exemplos de tais agentes de regulação hormonais são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinil estradiol/estinila, um anti-androgene (tal como flutaminda/eulexin), uma progestina (tal como tal como caproato de hidroxiprogesterona, medroxiprogesterona/provera, acepato megestrol/megace), um adrenocorticosteróide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormônio que libera o hormônio de luteinização (e análogos destes e outros agonistas LHRH tal como buserelina e goserelina), um inibidor de aromatase (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citraden, exemestano), um inibidor de hormônio (tal como octreotida/sandostatina) e agentes similares.
[0297] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser um agente anti-anérgico (por exemplo compostos de molécula menor, proteínas, glicoproteínas, ou anticorpos que quebram a tolerância aos antígenos de tumor e câncer). Exemplos de tais compostos são as moléculas que bloqueiam a atividade de CTLA-4, tal como MDX-010 (ipilimumab) (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).
[0298] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser um gene supressor de tumor contendo ácido nucleico ou vetor tal como a adenovírus deficiente de replicação que codifica p53/SCH58500 de tipo selvagem reocmbinante humano, etc.; ácidos nucleicos anti-sentido alvejado aos genes desregulados, mutados ou oncogenes; ou siRNA alvejado aos genes desregulados ou mutados. Exemplos dos alvos supressores de tumor incluem, por exemplo, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 e DCC.
[0299] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser um ácido nucleico anti-câncer, tal como genasense (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (lipossomo encapsulado do oligonucleotídeo anti-sentido c-raf/ISIS-5132), MG98 e outros ácidos nucleicos anti-sentido que alvejam PKCα, clusterin, IGFBPs, cinase A de proteína, ciclina D1, ou Bcl-2h.
[0300] Em uma forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser uma molécula de RNA inibidor anti-câncer (ver por exemplo Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001), Erratum in: Curr Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) e Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
[0301] As composições e métodos de administração de combinação da presente invenção também incluem a administração das vacinas do ácido nucleico, tal como vacinas de DNA nu que codifica tais antígenos de câncer/antígenos associados ao tumor (ver por exemplo U.S. 5.589.466, U.S. 5.593.972, U.S. 5.703.057, U.S. 5.879.687, U.S. 6.235.523 e U.S. 6.387.888). Em uma forma de realização, a composição de combinação e/ou método de administração de combinação que compreende uma composição de vacina autóloga. Em uma forma de realização, a composição de combinação e/ou método de administração de combinação que compreende uma vacina celular total ou célula que expressa a citocina (por exemplo um fibroblasto que expressa IL-2 recombinante, célula dendrítica que expressa a citocina recombinante e outros) (ver por exemplo Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) e Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Outro exemplo de um tal método de célula autóloga que pode ser útil nos métodos de combinação da presente invenção é o método de imunoterapia personalizado MyVax® (previamente referido como GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, USA).
[0302] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece a combinação das composições e métodos de administração de combinação em que um anticorpo anti-TF é combinado ou co-administrado com um vírus, proteínas virais e outros. Vírus deficiente de replicação, que geralmente são capazes de um ou apenas poucos ciclos de replicação in vivo e que são alvejados as células de tumor, podem ser por exemplo componentes úteis de tais composições e métodos. Tais agentes virais podem compreender ou serão associados com ácidos nucleicos que codificam os imunoestimulantes, tal como GM-CSF e/ou IL-2. tanto o vírus oncolítico recombinante quanto o tal vírus oncolítico de ocorrência natural (por exemplo vírus HSV-1, reovírus, adenovírus sensível a replicação e deficiente a replicação, etc.) podem ser componentes úteis de tais métodos e composições. Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção fornece a combinação das composições e métodos de administração de combinação em que um anticorpo anti-TF é combinando ou co-administrado com um vírus oncolítico. Exemplos de tais vírus incluem adenovírus oncolítico e vírus da herpes, que podem ou não podem ser vírus modificados (ver por exemplo Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) e Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
[0303] A combinação das composições e métodos de administração de combinação da presente invenção também podem envolver métodos de imunoterapia de "célula total e "adotivo". Por exemplo, tais métodos podem compreender a infusão ou re-infusão das células de sistema imune (por exemplo linfócitos de infiltração ao tumor (TILs), tal como as células CD4+ e/ou CD8+ T (por exemplo células T expandidas com antígenos específicos por tumor e/ou intensificadores genéticos), células B que expressam o anticorpo ou outras células de apresentação/que produzem anticorpos, células dendríticas (por exemplo, células dendríticas recombinantes que expressam anti-citocina, células dendríticas cultivadas com um agente que expande DC tal como GM-CSF e/ou Flt3-L e/ou células dendríticas carregadas ao antígeno associado ao tumor), células NK anti-tumor, células híbridas denominadas, ou combinações destes. Os lisados celulares também podem ser úteis em tais métodos e composições. As "vacinas" celulares nos ensaios clínicos que podem ser úteis em tais aspectos incluem Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics) e lisados celulares Melacine®. Antígenos protegidos das células cancerígenas e misturas destes (ver por exemplo Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001), opcionalmente misturados com adjuvante tal como alume, também pode ser componentes em tais métodos e composições de combinação.
[0304] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-TF pode ser liberado em um paciente em combinação com a aplicação de um método de vacinação interno. A vacinação interna refere-se a morte da célula cancerígena, tal como morte celular induzida pela radiação ou induzida por medicamento das células de tumor, em um paciente, que tipicamente leva a extração de uma resposta imune direcionada em direção a (i) as células de tumor como um total ou (ii) partes das células de tumor incluindo (a) proteínas secretadas, glicoproteínas ou outros produtos, (b) proteínas associadas a membrana ou glicoproteínas ou outros componentes associados com ou inserido nas membranas e/ou (c) proteínas intracelulares ou outros componentes intracelulares. Uma vacinação interna resposta imune induzida pode ser humoral (isto é anticorpo- mediado pelo complemento) ou mediado pela célula (por exemplo, o desenvolvimento e/ou aumento dos linfócitos T citotóxicos endógenos que reconhecem a células de tumor internamente mortas ou partes destes). Além disso a radioterapia, exemplos não limitantes de medicamentos e agentes que podem ser usados para induzir uma dita célula da morte do tumor e vacinação interna são quimioagentes terapêuticos convencionais, inibidores do ciclo celular, medicamentos anti-angiogênese, anticorpos monoclonais, agentes que induzem a apoptose e inibidores de transdução de sinal.
[0305] Exemplos de outros agentes anti-cânceres, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima são agentes que induzem a diferenciação, análogos do ácido retinóico (tal como todos os ácido trans retinóicos, ácido 3-cis retinóico e agentes similares), análogos de vitamina D (tal como seocalcitol e agentes similares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentes similares.
[0306] Exemplos de outros agentes anti-câncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima são catepsina B, moduladores da atividade de desidrogenase de catepsina D, glutationa-S-transferase (tal como sintetase de glutacilcisteína e lactato de desidrogenase) e agentes similares.
[0307] Exemplos de outros agentes anti-câncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima são estramustina e epirubicina.
[0308] Exemplos de outros agentes anti-câncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima são um inibidor HSP90 semelhante a 17-alil amino geld-anamicina, anticorpos direcionados contra um antígeno de tumor tal como PSA, CA125, KSA, etc., integrinas semehantes a integrina β1, inibidores de VCAM e agentes similares.
[0309] Exemplos de outros agentes anti-câncer, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um anticorpo anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima são inibidores de calcineurina (tal como valspodar, PSC 833 e outros inibidores MDR-1 ou p-glicorproteína), inibidores TOR (tal como sirolimus, everolimus e rapamciin) e inibidores de mecanismos “retorno de linfócito” (tal como FTY720) e agentes com efeitos na sinalização celular tal como inibidores de molécula de adesão (por exemplo anti-LFA, etc.).
[0310] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-TF da invenção é para uso em combinação com um ou mais outros anticorpos terapêuticos, tal como bevacizumab (Avastin®), zalutumumab, cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix™), ofatumumab, zanolimumab, daratumumab, ranibizumab (Lucentis®), Zenapax, Simulect, Remicade, Humira, Tysabri, Xolair, raptiva, nimotuzumab, rituximab e/ou trastuzumab (Herceptin®). Outros anticorpos terapêuticos que podem ser usados na combinação com o anticorpo da presente invenção são aqueles divulgadas em WO98/40408 (anticorpos que podem ligar-se ao TF humano natural), WO04/094475 (anticorpos capazes de ligar-se aos fatores de tecido humano, que não inibem o fator mediado pela coagulação sanguínea a um controle de plasma normal), WO03/093422 (anticorpos que ligam-se com maior afinidade ao complexo TF:VIIa do que ao TF sozinho), ou WO03/037361 (agonista ou antagonista TF para o tratamento relacionado a apoptose).
[0311] Em outra forma de realização, dois ou mais anticorpos diferentes da invenção como descritos neste são usados na combinação para o tratamento da doença. Particularmente as combinações de interesse incluem dois ou mais anticorpos de não competição. Deste modo, em uma forma de realização, um paciente é tratado com uma combinação de um anticorpo do grupo I de bloqueio cruzado definido neste com um anticorpo do grupo II ou III, como definido neste. Em outra forma de realização, um paciente é tratado com uma combinação de um anticorpo do grupo II como definido neste abaixo, com um anticorpo do grupo III. Tal terapia de combinação pode levar a ligação de um número aumentado das moléculas de anticorpo por célula, que pode dar o aumento da eficácia, por exemplo, por intermédio da ativação de lise mediada pelo complemento.
[0312] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-TF pode ser administrado em conexão com a liberação de um ou mais agentes que promovem o acesso do anticorpo anti-TF ou composição de combinação no interior de um tumor. Tais métodos podem ser por exemplo realizados em associação com a liberação de uma relaxina, que é capaz de relaxar um tumor (ver por exemplo U.S. 6.719.977). Em uma forma de realização, um anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser ligado a um peptídeo que penetra a célula (CPP). Os peptídeos que penetram a célula e peptídeos relacionados (tal como anticorpos que penetram a célula projetada) são descritos em por exemplo Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000). Lindgren et al., Biochem J. 377(Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al., FASEB J. 12(1), 67-77 (1998) e Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002).
[0313] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratamento de um distúrbio que envolve células que expressam TF em um paciente, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF e pelo menos um agente anti-inflamatório a um paciente em necessidade destes.
[0314] Em uma forma de realização um tal agente anti- inflamatório pode ser selecionado de as pirina e outros salicilatos, inibidores Cox-2 (tal como rofecoxib e celecoxib), NSAIDs (tal como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenaco, piroxicam, quetoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozina e indometacina), anticorpos anti-IL6R, anticorpos anti-IL8 (por exemplo, anticorpos descritos em WO2004058797, por exemplo, 10F8), anti-IL15 anticorpos (por exemplo, anticorpos descritos em WO03017935 e WO2004076620), anticorpos anti- IL15R, anticorpos anti-CD4 (por exemplo, zanolimumab), anticorpos anti- CD11a (por exemplo, efalizumab), anticorpos de integrina anti-alfa-4/beta-1 (VLA4) (por exemplo, natalizumab), CTLA4-Ig para o tratamento das doenças inflamatórias, prednisolona, prednisona, medicamentos anti- reumáticos que modificam a doença (DMARDs) tal como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inibidores da síntese de pirimidina (tal como leflunomida), agentes de bloqueamento do receptor IL-1 (tal como anaquinra), agentes de bloqueamento de TNF-α (tal como etanercept, infliximab e adalimumab) e agentes similares.
[0315] Em uma forma de realização, um tal agente imunosupressivo e/ou imunomoduladores podem ser selecionados de ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato de mofetil, corticosteróides tal como prednisona, metotrexato, sais de ouro, sulfasalazina, antimalariais, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxispergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, globulina anti-timócito, timopentina, timosin-α e agentes similares.
[0316] Em uma forma de realização, um tal um agente imunosupressivo e/ou imunomodulador pode ser selecionado de anticorpos imunosupressivos, tal como ligação de anticorpos a p75 do receptor IL-2, anticorpos contra CD25 (por exemplo, aqueles descritos em WO2004045512, tal como AB1, AB7, AB11 e AB12), ou ligação de anticorpos a por exemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNy, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a, ou CD58, ou ligação de anticorpos a seus ligandos.
[0317] Em uma forma de realização, um tal um agente imunosupressivo e/ou imunomodulador pode ser selecionado de moléculas IL-15R, IL-10, B7 solúveis (B7-1, B7-2, variantes destes e fragmentos destes), ICOS e OX40, um inibidor de um regulador de célula T negativa (tal como um anticorpo contra CTLA4) e agentes similares.
[0318] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratamento de um distúrbio que envolvem células que expressam TF em um paciente, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF e um anti-C3b(i) a um paciente em necessidade destes
[0319] Em uma forma de realização, um agente terapêuitico para uso em combinação com anticorpos anti-TF para tratamento dos distúrbios como descrito acima podem ser selecionados de inibidores de histona deacetilase (por exemplo fenilbutirato) e/ou agentes de reparo de DNA (por exemplo enzimas de reparo de DNA e composições relacionadas tal como dimericina).
[0320] Os métodos da presente invenção para o tratamento de um distúrbio como descrito acima que compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF também pode compreender a terapia fotodinâmica direcionada anti-câncer (por exemplo terapia a laser anti-câncer- que opcionalmente podem ser praticados com o uso do agente fotosensitizante, ver, por exemplo Zhang et al., J Control Release. 93(2), 141-50 (2003)), terapias com ondas sonoras e ondas de choque anti-câncer (ver por exemplo Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)) e/ou terapia nutraceutical anti-câncer (ver por exemplo Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004) e Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004). Igualmente, um anticorpo anti-TF pode ser usado para a preparação de a composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio como descrito acima a ser administrada com a terapia fotodinâmica direcionada anti-câncer (por exemplo terapia a laser anti-câncer - que opcionalmente pode ser praticado com o uso do agente fotosensitizante, terapias com ondas sonoras e ondas de choque anti-câncer e/ou terapia nutraceutical anti-câncer.
[0321] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratamento de um distúrbio que envolvem células que expressam TF em um paciente, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF da presente invenção e a radioterapia a um paciente em necessidade destes.
[0322] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar ou evitar o câncer, no qual o método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF da presente invenção e a radioterapia a um paciente em necessidade destes.
[0323] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF da presente invenção, para a preparação de a composição farmacêutica para o tratamento do câncer a ser administrado em combinação com a radioterapia.
[0324] A radioterapia pode podem compreender a radiação ou administração associada dos radiofarmacêuticos a um paciente é fornecido. A fonte de radiação pode ser interna ou externa ao paciente sendo tratado (tratamento de radiação pode, por exemplo, ser na forma da terapia de radiação de suporte externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Elementos radioativos que podem ser usado na práticas de tais métodos incluem, por exemplo, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnétio-99, iodo-123, iodo-131 e índio-111.
[0325] Em uma forma de realização adicional, a presente invenção fornece um método para tratar ou evitar o câncer, no qual o método compreende a administração a um paciente em necessidade destes de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF da presente invenção, em combinação com cirurgia.
[0326] Como descrito acima, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada na terapia de combinação, isto é, combinado com um ou mais agentes relevantes para a doença ou condição a ser tratado como composições farmacêuticas separadas ou com um composto da presente invenção co-formulados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descritos acima. Tais terapias de combinação podem requerer as dosagens inferiores do composto da presente invenção e/ou os agentes co- administrados, deste modo evitando as toxicidades possíveis ou complicações associadas com as várias monoterapias.
[0327] Além disso acima, outras terapias de combinação interessantes incluem os seguintes: • Para o tratamento de câncer pancreático um anticorpo anti- TF em combinação com um antimetabólito, tal como 5-fluorouracila e/ou gemcitabina, possivelmente em combinação com um ou mais compostos selecionados de: 90Y-hPAM4, ARC-100, ARQ-197, AZD-6244, bardoxolona metil, cixutumumab, (IMC-A12), folitixorin cálcio, GVAX, ipilimumab, KRX-0601, merbarona, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh-Apo2L, TLN-4601, trabederseno, volociximab (M200), WX-671, pemetrexed, rubitecan, ixabepilona, OCX-0191Vion, 216586-46-8, lapatinib, matuzumab, imatinib, sorafinib, trastuzumab, exabepilona, erlotinib, avastina e cetuximab • Para o tratamento de câncer colorretal um anticorpo anti-TF em combinação com um ou mais compostos selecionados de: gemcitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIRI, XELOX, IFL, oxaliplatina, irinotecan, 5- FU/LV, Capecitabina, UFT, agentes de alvejamento EGFR, tal como cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab; inibidores VEGF, ou inibidores de tirosina cinase tal como sunitinib. • Para o tratamento de câncer de mama um anticorpo anti-TF em combinação com um ou mais compostos selecionados de: antimetabólitos, antraciclinas, taxanos, agente de alquilaçãos, epotilonas anti-hormonal (femar, tamoxifeno etc), inibidores de ErbB2 (Her2/neu) (tal como herceptina e agentes similares),CAF/FAC (ciclofosfamida, doxorubicina, 5FU) AC (ciclo, doxo), CMF (ciclo, metotrexato, 5FU), Docetaxel + capecitabina, GT (paclitaxel, gemcitabina) FEC (ciclo, epi, 5FU) em combinação com herceptina: Paclitaxel +/- carboplatina, Vinorelbina, Docetaxel, CT em combinação com lapatinib; Capecitabina • Para o tratamento de bexiga um anticorpo anti-TF em combinação com um ou mais compostos selecionados de: antimetabólitos (gemcitabina, alimta, metotrexato), análogos de platina (cisplatina, carboplatina), inibidores de EGFr (tal como cetuximab ou zalutumumab), inibidores VEGF (tal como Avastin) doxorubicina, inibidores de tirosina cinase tal como gefitinib, trastuzumab, agente anti-mitótico, tal como taxanos, por exemplo paclitaxel e vinca alcalóides, por exemplo vinblastina. • Para o tratamento de câncer de próstata um anticorpo anti-TF em combinação com um ou mais compostos selecionados de: terapias hormonais/anti-hormonais; tal como antiandrogênios, agonsitas de liberação do hormônio de luteinização (LHRH) e quimioterapêuticos tal como taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vinblastina, ixabepilona, • Para o tratamento de câncer ovariano um anticorpo anti-TF em combinação com um ou mais compostos selecionados de: um agente anti- mitótico, tal como taxanos e vinca alcalóides, caelix, topotecan.
[0328] Usos diagnósticos
[0329] Os anticorpos anti-TF da invenção também podem ser usados para os propósitos diagnósticos. Deste modo, em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma composição diagnóstica que compreende um anticorpo anti-TF como definido neste.
[0330] Em uma forma de realização, os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usado in vivo ou in vitro para o diagnóstico das doenças em que as células ativadas que expressam TF desempenham um papel ativo na patogênese, pelos níveis de detecção de TF, ou níveis das células que contém TF em sua superfície de membrana. Este pode ser atingido, por exemplo, pelo contato com uma amostra a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra de controle, com o anticorpo anti-TF sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e TF. A formação do complexo é então detectada (por exemplo, usando um ELISA). Quando usando uma amostra de controle junto com a amostra testada, o complexo é detectado em ambas as amostras simples e qualquer diferença estatisticamente significante na formação dos complexos entre as amostras é indicativo na amostra da presença de TF na amostra testada.
[0331] Deste modo, em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um método para a detecção da presença de antígeno TF, ou uma célula que expressa TF, em uma amostra que compreende: - contatar a amostra com um anticorpo anti-TF da invenção ou uma molécula biespecífica da invenção, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e TF; e - analisar se um complexo foi formado. Em uma forma de realização, o método é realizado in vitro.
[0332] Mais especificamente, a presente invenção fornece métodos para a identificação de e diagnóstico das células invasivas e tecidos e outras células alvejadas pelos anticorpos anti-TF da presente invenção e para o monitoramento do progresso dos tratamentos terapêuticos, estado após o tratamento, risco de desenvolvimento do câncer, progressão do câncer e outros.
[0333] Em um exemplo de um tal ensaio diagnóstico, a presente invenção fornece um método de diagnóstico do nível das células invasivas em um tecido que compreende formando um imunocomplexo entre um anticorpo anti-TF e tecidos contendo TF potenciais e detectar a formação do imunocomplexo, em que a formação do imunocomplexo diz respeito a presença das células invasivas no tecido. O contato pode ser realizado in vivo, usando anticorpos isolados rotulados e técnicas de imagem padrão, ou podem ser realizados in vitro nas amostras de tecido.
[0334] Os anticorpos anti-TF podem ser usados para detectar os peptídeo contendo TF e fragmentos de peptídeos em qualquer amostra biológica adequada por qualquer técnica adequada. Exemplos de imunoensaios convencionais fornecidos pela presente invenção incluem, sem limitação, um ELISA, um RIA, ensaios FACS, ensaios de ressonância de plasmon, ensaios cromatográficos, imunohistoquímica de tecido, Western blot e/ou imunoprecipitação usando um anticorpo anti-TF. Os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usados para detectar os fragmentos TF e TF a partir dos humanos. Os rótulos adequados para os anticorpos secundários e/ou anti-TF usados em tais técnicas incluem, sem limitação, várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, alcalino fosfatase, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos do grupo prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente incluem luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S e 3H.
[0335] Os anticorpos anti-TF também podem ser submetidos ao ensaio em uma amostra biológica pelo imunoensaio de competição utilizando os padrões de peptídeo TF rotulados com uma substância detectável e um anticorpo anti-TF rotulado. Em um tal ensaio, a amostra biológica, os padrões de peptídeo TF rotulados e os anticorpos anti- TF são combinados e a quantidade do padrão TF rotulado ligado ao anticorpo anti-TF rotulado é determinado. A quantidade de peptídeo TF na amostra biológica é proporcioanl inversamente a quantidade do padrão TF rotulado ao anticorpo anti-TF.
[0336] Os anticorpos anti-TF são particularmente úteis na imagem in vivo de tumores. A imagem in vivo de tumores associados com TF podem ser realizados por qualquer técnica adequada. Por exemplo, rotulação por 99Tc ou rotulação com outro isótopo que emite raio de gama pode ser usado para rotular os anticorpos anti-TF em tumores ou complexos de anticorpo anti-TF:TF rotulados secundários (por exemplo, FITC rotulado) a partir dos tumores e submetidos a formação de imagem com uma câmera de cintilação gama (por exemplo, um dispositivo Elscint Apex 409ECT), tipicamente usando energia baixa, colimador de resolução alta ou um colimador para todos os propósitos de baixa energia. Os tecidos tingidos podem então ser avaliados para a contagem da radioatividade como um indicador da quantidade de peptídeos associados ao TF no tumor. As imagens obtidas pelo uso de tais técnicas podem ser usadas para avaliar a biodistribuição de TF em um paciente, mamífero, ou tecido, por exemplo no contexto de uso dos fragmentos TF ou TF como um biomarcador para a presença das células cancerígenas invasivas. As variações nesta técnica podem incluir o uso da formação de imagem de ressonância magnética (MRI) para melhorar a formação de imagem nas técnicas da câmera gama. Os métodos de imunoscintigrafia similar e princípios são descritos em, por exemplo, Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18° Edition, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990) e Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993). Tais imagens também podem ser usadas para a liberação alvejada de outros agentes anti-câncer, exemplos de que são descritos neste (por exemplo, agentes apoptóticos, toxinas, ou composições de quimioterapia CHOP). Além disso, tais imagens também podem ou alternativamente servir como a base para as técnicas cirúrgicas para remover os tumores. Além disso, tal formação de imagem in vivo pode permitir para a identificação e localização de um tumor em uma situação onde um paciente é identificado como tendo um tumor (devido a presença de outros biomarcadores, metastase, etc.), mas o tumor não pode ser identificado pelas técnicas analíticas tradicionais. Todos destes métodos são características da presente invenção.
[0337] A formação de imagem in vivo e outros métodos diganósticos fornecidos pela presente invenção são particularmente úteis na detecção das micrometastases em um paciente humano (por exemplo, um paciente não previamente diagnosticado com câncer ou um paciente em um período de recuperação/remissão de um câncer). O carcinoma das células cancerígenas, que podem fabricar até 90 % de todas as células cancerígenas, por exemplo, foi demonstrado tingir muito bem com as composições do conjugado de anticorpo anti-TF. A detecção com anticorpos anti-TF monoclonais descritos neste podem ser indicativos da presença dos carcinomas que são agressivos/invasivos e também ou alternativamente fornecem uma indicação da praticabilidade de uso do anticorpo anti-TF monoclonal relacionado contra tais micrometastases.
[0338] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método de formação de imagem in vivo em que um anticorpo anti-TF da presente invenção é conjugado a um agente radio-opaco que promove a detecção, o anticorpo conjugado é administrado a um hospedeiro, tal como pela injeção na corrente sanguínea e a presença e localização do anticorpo rotulado do anticorpo rotulado no hospedeiro é submetido ao ensaio. Embora esta técnica e qualquer outro método diagnóstico fornecido neste, a presente invenção fornece um método para avaliação da presença das células relacionadas a doença em um paciente humano ou uma amostra biológica tirada a partir de um paciente humano.
[0339] Para a formação de imagem diagnóstico, os radioisótopos podem ser ligados a um anticorpo anti-TF diretamente, ou indiretamente pelo uso de um grupo funcional intermediário. Os grupos funcionais intermediários úteis incluem queladores, tal como ácido etilenodiaminatetraacético e ácido dietilenotriaminapentaacético (ver por exemplo U.S. 5.057.313).
[0340] Além disso aos radioisótopos e agentes radio- opacos, os métodos diagnósticos podem ser realizados usando anticorpos anti- TF que são conjugados aos pigmentos (tal como com o complexo de estreptavidina-biotina), agentes de contraste, compostos fluorescentes ou moléculas e agentes de intensificação (por exemplo, íons paramagnéticos) para a formação de imagem de ressonância magnética (MRI) (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 6.331.175, que descreve as técnicas MRI e a preparação dos anticorpos conjugados a um agente de intensificação MRI). Tais agentes diagnósticos/detecção podem ser selecionados de agentes para uso em formação de imagem de ressonância magnética e compostos fluorescentes. A fim de carregar um anticorpo anti-TF com metais radioativos ou íons paramagnéticos, pode ser necessário para reagir com um reagente tendo uma cauda longa que são ligados a uma multiplicidade dos grupos quelantes para a ligação de íons. Uma tal cauda pode ser um polímero tal como uma polilisina, polissacarídeo, ou outra cadeia derivatizável ou derivatizada tendo grupos pendentes que podem ser ligados aos grupos quelantes tal como, por exemplo, porfirinas, poliaminas, éteres coroa, bistiosemicarbazonas, polioximas e grupos semelhantes a serem úteis para este propósito. Os quelantes podem ser ligados aos anticorpos anti-TF usando as químicas padrão.
[0341] Deste modo, a presente invenção fornece os conjugados anti-TF de anticorpo diagnóstico, em que o anticorpo anti-TF é conjugado a um agente constraste (tal como for formação de imagem de ressonância magnética, tomografia computadorizada, ou agente de intensificação de constraste de ultrassom) ou um radionuclídeo que pode ser, por exemplo, um gama-, beta-, alfa-, elétron Auger -, ou isótopo que emite positron.
[0342] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um kit para detecção da presença do antígeno TF, ou uma célula que expressa TF, em uma amostra que compreende - um anticorpo anti-TF da invenção ou uma molécula biespecífica da invenção; e - instruções para uso do kit.
[0343] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um kit para diagnóstico do câncer que compreende um recipiente que compreende um anticorpo anti-TF e um ou mais reagentes para detecção da ligação do anticorpo anti-TF a um peptídeo TF. Os reagentes podem incluir, por exemplo, rótulos fluorescentes, rótulos enzimáticos, ou outros rótulos detectáveis. Os reagentes também podem incluir anticorpos ou reagentes secundários ou terciários para as reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que podem ser visualizados. Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um kit diagnóstico que compreende um ou mais anticorpos anti-TF, da presente invenção na forma rotulada ou não rotulado nos recipientes adequados, reagentes para as incubações para um ensaio indireto e substratos ou agentes de derivação para a detecção em um tal ensaio, dependendo da natureza do rótulo. Os reagentes de controle e instruções para uso também podem ser incluídos.
[0344] Os kits diagnósticos também podem ser fornecidos pelo uso com um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF rotulado/conjugado, para a detecção de uma atividade celular ou para a detecção da presença dos peptídeos TF em uma amostra de tecido ou hospedeiro. Em um tal kit diagnóstico, bem como nos kits para os usos terapêuticos descritos em outra parte neste, um anticorpo anti-TF tipicamente pode ser fornecido em uma forma liofilizada em um recipiente, sozinho ou conjunção com anticorpos adicionais específicos para uma célula alvo e peptídeo. Tipicamente, um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um diluente inerte) e/ou componentes destes, tal como um Tris, fosfato, ou tampão de carbonato, estabilizadores, conservantes, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina de soro, ou outros, também são incluídos (tipicamente em um recipiente separado para a mistura) e reagentes adicionais (também tipicamente nos recipientes separados). Em certos kits, um anticorpo secundário capaz de ligar-se ao anticorpo anti-TF, que tipicamente está presente em um recipiente separado, também é incluído. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um rótulo e formulado na maneira similar ao anticorpo anti-TF a presente invenção. Usando os métodos descritos acima e em toda parte nestes os anticorpos anti-TF podem ser usados para definir as sub-séries das células cancerígenas/tumor e caracterizando tais células e desenvolvimentos/relacionados aos tecidos.
[0345] A detecção in situ pode ser acompanhada pela remoção de uma espécime histológica a partir do paciente e fornece a combinação de anticorpos anti-TF rotulados, da presente invenção a uma tal espécime. O anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser fornecido pela aplicação ou pela sobreposição do anticorpo anti-TF rotulado da presente invenção a uma amostra biológica. Embora o uso de um tal procedimento, é possível determinar não apenas a presença de TF ou fragmentos TF mas também a distribuição de tais peptídeos no tecido examinado (por exemplo, no contexto de avaliação da expansão das células cancerígenas). Usando a presente invenção, aquela pessoa com habilidade comum na técnica prontamente entenderá qualquer um de uma ampla variedade de métodos histológicos (tal como procedimentos de tingimento) podem ser modificados a fim de atingir tal detecção in situ.
[0346] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um anticorpo anti-idiotípico que liga-se a um anticorpo anti-TF da invenção como descritos neste.
[0347] Um anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados com o local de ligação de antígeno de um anticorpo. Um anticorpo Id pode ser preparado pela imunização de um animal das mesmas espécies e tipo genético como a finte de um anti-TF mAb com o mAb no qual um anti-Id está sendo preparado. O animal imunizado tipicamente pode reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo de imunização pela produção de um anticorpo aqueles determinantes idiotípicos (o anticorpo anti-Id). Tais anticorpos são descritos em por exemplo U.S. 4.699.880. Tais anticorpos ainda são característicos da presente invenção.
[0348] Um anticorpo anti-Id também pode ser usado como um "imunogênio" para induzir uma resposta imune, já em outro animal, produzindo um anticorpo denominado anti-anti-Id. Um anti-anti-Id pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original, que induz o anti-Id. Deste modo, pelo uso dos anticorpos aos determinantes idiotípicos de um mAb, é possível identificar outros clones que expressam os anticorpos da especificidade idêntica. Os anticorpos anti-Id podem ser variados (portanto produzindo as variantes do anticorpo anti-Id) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, tal como aquela descrita em toda parte neste com relação aos anticorpos anti-TF da presente invenção. Por exemplo, anti-Id mAbs podem ser ligados a um carreador tal como hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) e usado para imunizar os camundongos BALB/c. O soro destes camundongos tipicamente conterá anticorpos anti-anti-Id que tem as propriedades de ligação similares se não idênticas a um anticorpo original/ TF precursor.
[0349] A presente invenção ainda é ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitantes adicionais.
EXEMPLOS Exemplo 1 Construções de expressão para o fator de tecido (TF)
[0350] As construções totalmente otimizadas por códon para a expressão de TF ou seus domínios extracelulares em células HEK, NS0 ou CHO, foram gerados. As proteínas codificadas por estas construções são idênticas a acessão Genbank NP_001984 por TF. As construções contêm os locais de restrição adequados para a clonagem e uma ótima sequência Kozak (Kozak, 1987). As construções foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pEE13.4 (Lonza Biologics) (Bebbington, Renner et al. 1992), obtendo pEE13.4TF. O PCR foi usado para amplificar a parte, que codifica o domínio extracelular (ECD) (aminoácido 1-251) de TF, a partir da construção sintética, adição de um rótulo His de terminal C contendo 6 resíduos His (TFECDHis). A construção foi clonada em pEE13.4 e totalmente sequenciado para confirmar a precisão da construção. Exemplo 2 Expressão transitória nas células HEK-293F
[0351] As células FreestyleTM 293-F (um subclone HEK- 293 adaptado aos desenvolvimento de suspensão e meio Freestyle quimicamente definido, (HEK-293F)) foram obtidas a partir do Invitrogen e transfectadas com o DNA de plasmídeo apropriado, usando 293 fectina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. No caso da expressão de anticorpo, a cadeia pesada apropriada e vetores de cadeia leve, como descrito em Exemplo 10, foram co-expressados. Exemplo 3 Expressão semi-estável nas células NS0
[0352] O pEE13.4TF foi estavelmente transferido nas células NS0 e os clones estáveis foram selecionados no desenvolvimento da ausência da glutamina e na presença de 7,5 μM de metilsulfoximina (MSX). Um grupo de clones foi desenvolvido na cultura de suspensão enquanto mantém a pressão da seleção. Os grupos foram testados para a expressão TF pela análise FACS e atingido para o uso adicional. Exemplo 4 Expressão estável nas células CHO
[0353] O pEE13.4TF foi estavelmente transferido nas células CHO-K1SV (Lonza Biologics) e os clones estáveis foram selecionados na ausência de glutamina e na presença de 50 μM de MSX. Clones simples foram selecionados e expandidos e testados para a expressão TF pela análise FACS como descrito abaixo. Os clones de expressão alta foram escolhidos e atingidos para o uso adicional. Exemplo 5 Purificação de TF rotulado por His
[0354] O TFECDhis foi expressado as células I HEK-293F. o rótulo his em TFECDHis capaz da purificação com cromatografia de afinidade de metal imobilizado. Neste processo, um quelador fixo na resina cromatográfica é carregado com os cátions Co2+. O sobrenadante contendo TFECDHis é incubado com a resina no modeo de batelada (isto é solução). A proteína rotulada por His liga-se fortemente as pérolas de resina, enquanto outras protéinas presentes no sobrenadante de cultura não ligam-se fortemente. Após incubação as pérolas são recuperadas a partir do sobrenadante e empacotada em uma coluna. A coluna é lavada a fim de remover as proteínas fracamente ligadas. As proteínas TFECDHis fortemente ligadas são então eluídas com um tampão contendo imidazol, que compete com a ligação de His ao Co2+. O eluente é removido a partir da proteína pelo trocador de tampão em uma coluna de dessalinização. Exemplo 6 Procedimento de imunização dos camundongos transgênicos
[0355] Os camundongos HuMab foram imunizados a cada quinzena alternando com 5x106 células NS0-TF transfectadas semi-estáveis, ou com 20 μg da proteína TFECDHis. Oito imunizações foram realizadas em quatro imunizações intraperitoneais totais (IP) e quatro subcutâneas (SC) na base da cauda. A primeira imunização com as células foi feita no adjuvantes de Freunds completo (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Para todas as outras imunizações, as células foram injetadas IP em PBS e TFECDHis foi injetado SC usando o adjuvante de Freunds incompleto (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Quando os tituladores de soro foram observados ser suficientes (diluição do soro de 1/50 ou menor encontrado positivo no ensaio de avaliação específico de antígeno como descrito em Exemplo 7 em pelo menos 2 eventos de avaliação quinzenalmente sequencial), os camundongos foram adicionalmente intensificado duas vezes intravenosamente (IV) com 10 μg da proteína TFECDHis em 100 μl de PBS, 4 e 3 dias antes da fusão.
[0356] A primeira imunização com as células foi feita em CFA, para todas as outras células de imunização (7) foram injetadas IP em PBS. Quando os tituladores de soro foram observados ser suficientes, os camundongos foram adicionalmente intensificados duas vezes IV com 1x106 transitoriamente as células NS0-TF transfectadas semi-estáveis em 100 μl de PBS, 4 e 3 dias antes da fusão.
[0357] Quando os tituladores de soro foram observados ser suficientes (definidos como acima), os camundongos foram adicionalmente intensificados duas vezes intravenosamente (IV) com 10 μg de proteína TFECDHis em 100 μl de PBS, 4 e 3 dias antes da fusão. Exemplo 7 Ensaio de avaliação específico por antígeno homogêneo
[0358] A presença de anticorpos anti-TF no soro de camundongos imunizados ou hibridoma HuMab (anticorpo monoclonal humano) ou sobrenadante de cultura de transfectoma foi determinado pelos ensaios de avaliação específicos por antígeno homogêneo (quatro quadrantes) usando Fluorometric Micro volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
[0359] Para este, uma combinação de 3 ensaios com base celular e um ensaio com base em pérola foi usado. Nos ensaios com base celular, a ligação a TH1015-TF (células HEK-293F transitoriamente que expressam TF; produzidos como descrito acima) e A431 (que expressam TF na superfície celular) bem como células de tipo selvagem HEK293 (não expressam TF, controle negativo) foi determinado. No ensaio com base de pérola, ligação ao TF biotinilado ligado em uma pérola de estreptavidina (SB1015-TF) foi determinado.
[0360] As amostras foram adicionadas as células/pérolas para permitir a ligação ao TF. Subsequentemente, a ligação de HuMab foi detectada usando um conjugado fluorescente (IgG-Cy5 anti-humano de cabra; Jackson ImmunoResearch). O anticorpo humano anti-TF de camundongo (ERL; ligado ao Alexa-647 a Genmab) foi usado como controle positivo, camundongo HuMAb unido por soro e anticorpo de camundongo-crompure- Alexa647 foram usados como controle negativo. As amostras foram avaliadas usando um sistema de detecção celular Applied Biosystems 8200 (8200 CDS) e ‘contagens x fluorescência’ foi usado como leitura. Exemplo 8 Geração de hibridoma HuMab
[0361] Os camundongos HuMab com desenvolvimento do titulador específico pelo antígeno suficiente (definidos como acima) foram submetidos a eutanásia e o baço e linfonodos que flanqueiam a aorta abdominal e veia cava foram coletada. A fusão de esplenócitos e células de linfonodos a uma linha celular de mieloma de camundongo foi feito pela eletrofusão usando um sistema de eletrofusão CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), essencialmente de acordo com as insttruções do fabricante. A seleção e cultivo das hibridomas HuMab resultante foi feito nos protocolos padrão (por exemplo, como descrito em Coligan J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. and Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006). Exemplo 9 Espectrometria de massa de anticorpos purificados
[0362] As alíquotas menores de 0,8 ml de anticorpo contendo sobrenadante de estágio de 6 reservatórios ou Hyperflask foram purificados usando as colunas PhyTip contendo a resina de proteína G (PhyNexus Inc., San Jose, USA) em uma estação de trabalho Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA). As colunas PhyTtip foram usadas de acordo com as instruções dos fabricantes, mas os tampões foram substituídos por: tampão de ligação PBS (B.Braun, Medical B.V., Oss, Netherlands) e tampão de eluição 0,1M de glicina -HCl pH 2,7 (Fluka Riedel- de Haen, Buchs, Germany). Após purificação, as amostras foram neutralizadas com 2M de Tris-HCl pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands). Alternativamente, em alguns casos volumes amplos do sobrenadante de cultura foram purificados usando cromatografia de coluna pela afinidade de proteína A.
[0363] Após purificação, as amostras foram colocadas em uma placa de 384 reservatórios (Waters, placa de reservatório quadrada de 100 ul, parte# 186002631). As amostras foram desglicosiladas durante a noite a 37° C com N-glicosidase F (Roche cat n° 11365177001. DTT (15 mg/ml) foi adicionado (1 μl / reservatório) e incubadas por 1 hora a 37° C. as amostras (5 ou 6 ul) foram dessalinizadas em um Acquity UPLC™ (Waters, Milford, USA) com um BEH300 C18, 1,7 μm, 2,1 x 50 mm coluna a 60° C. A água MQ e acetonitrila de grau LC-MS (Biosolve, cat n° 01204101,Valkenswaard, The Netherlands) com ambos ácidos fórmico a 0,1 % (Fluka, cat n° 56302, Buchs, Germany), foram usados como Eluens A e B, respectivamente. O espectro de massa de ionização por eletropulverização Time-of-flight foi registrado em linha em um espectrômetro de massa micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Germany) operando no modo de íon positivo. Antes da análise, uma escala 900-3000 m/z foi calibrada com mistura de ajuste ES (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Os espectros de massa foram determinados com o software DataAnalysis™ v. 3.4 (Bruker) usando o algorítmo Maximal Entropy buscando os pesos moleculares entre 5 e 80 kDa.
[0364] Após desconvolução as massas da cadeia pesada e leve resultante para todas as amostras foram comparadas a fim de observar os anticorpos duplicados. Em comparação das cadeias pesadas a possível presença das variantes de lisina de terminal C foi levada em conta. Este resultou em uma lista de anticorpos únicos, onde o único é definido como uma combinação única das cadeias pesadas e leves. No caso de anticorpos duplicados serem observados, os resultados de outros testes foram usados que foi o melhor material aos experimentos contínuos.
[0365] A análise MS dos pesos moleculares das pesadas e leves dos hibridomas específicos 118 TF produziu 70 anticorpos únicos (combinação de cadeia pesada/cadeia leve única). Estes foram caracterizados em diversos ensaios funcionais, identificação de 14 candidatos guia, anticorpos específicos por TF. Exemplo 10 Análise da sequância dos domínios variáveis anti-TF HuMab e clonagem nos vetores de expressão
[0366] O RNA total dos anti-TF HuMabs foi preparado de 5x106 células de hibridoma e DNA complementar 5’-RACE (cDNA) foi preparado de 100 ng de RNA total, usando o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech), de acordo com as instruções do fabricante. Regiões codificadoras VH (região variável de cadeia pesada) e VL (região variável de cadeia leve) foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) usando o kit de clonagem Zero Blunt PCR (Invitrogen). Para cada HuMab, 16 clones VL e 8 clones VH foram sequenciados. As sequências são dadas na listagem de sequência e figura 1 neste.
[0367] Tabela 1A e Tabela 1B (abaixo) dão um resumo da informação das sequências de anticorpo e sequências de linha germinativa mais homóloga. Tabela 1A Homologias de cadeia pesada
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Tabela 1B Homologias de cadeia leve
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Referências a listagem de sequência:
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Exemplo 11 Purificação de anticorpos
[0368] O sobrenadante de cultura foi filtrado em filtros de extremidade inerte de 0,2 μm e carregados na coluna de proteína de 5 ml (rProtein A FF, Amersham Bioscience) e eluído com 0,1 M de ácido cítrico - NaOH, pH 3. O eluato foi imediatamente neutralizado com 2M de Tris-HCl, pH 9 e dializado durante a noite a 12,6 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCl, pH 7,4 (B.Braun). Após amostras de diálise serem filtradas estéreis em filtros de 0,2 μm de extremidade inerte. A pureza foi determinada por SDS-PAGE e concentração foram medidas pela nefelometria e absorbância a 280 nm. Os anticorpos purificados foram submetidos a alíquota e armazenados a -80° C. Uma vez descongelados, as alíquotas do anticorpo purificado foram mantidos a 4° C. A espectrometria de massa foi realizada para identificar a massa molecular do anticorpo das cadeias pesadas e leves expressado pelos hibridomas como descrito em Exemplo 9. Exemplo 12 Estudos de competição cruzada de anticorpo usando sanduíche-ELISA
[0369] Os reservatórios de placa de ELISA foram revestidos durante a noite a +4° C com cada um dos anti-TF HuMabs (0,5 ou 2 μg/ml 100 μL/reservat0rio) diluídos em PBS. Os reservatórios ELISA foram lavados com PBS, bloqueados por uma hora em temperatura ambiente com 2 % de soro de galinha (v/v) (Gibco, Paisley, Scotland) em PBS e lavado novamente com PBS. Subsequentemente, 50 μL de anti-TF HuMab (10 μg/mL) seguido por 50 μL de TFECDHis (0,5 ou 1 μg/ml) (gerado em Genmab; Exemplo 5) foi adicionado e incubado por 1 hora em temperatura ambiente (enquanto agitação). As placas foram lavadas 3 vezes com PBST (PBS+0,05 % de tween) e incubadas com 1:2000 de biotina anti-his diluída BAM050 por uma hora em temperatura ambiente (enquanto agitação). As placas foram lavadas e incubadas com estreptavidina-poli-HRP (Sanquin, Amsterdam, The Netherlands) por 20 minutos em temperatura ambiente e lavado novamente. A reação ainda foi desenvolvida com ABTS (Roche Diagnostics) em temperatura ambiente no escuro, interrompido após 15 minutos pela adição de 2 % de ácido oxálico (p/v) e a absorbância em 405 nm foi medida.
[0370] A Tabela 2 mostra que 3 de grupos de bloqueio cruzados (grupos de anticorpos que competem com todos os outros para a ligação TFECDHis) deve ser identificado, com anticorpos 013, 044 e 087-Lg6 pertencendo a um grupo de bloqueio cruzado (grupo I), anticorpos 011, 017- D12, 42, 092-A09 e 101 permitindo outro grupo de bloqueio cruzado (grupo II) e anticorpos 003, 025, 109 e 111 permitindo um terceiro grupo de bloqueio cruzado (grupo III). O anticorpo 114 foi observado competir para a ligação TFECDHis com os anticorpos a partir de tanto o grupo de bloqueio cruzado II quanto III. A ligação do anticorpo 098 a TFECDHis deve ser competido pelos anticorpos a partir tanto do grupo de bloqueio cruzado II quanto III.
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Tabela 2 - Competição dos anticorpos anti-TF para ligação ao TFECDHis.
[0371] As caixas brancas não indicam competição para a ligação, as caixas cinzas indicam a competição parcial para a ligação e as caixas cinza escuro indicam a competição para a ligação ao TFECDHis. Exemplo 13 Ligação de anti-TF HuMabs ao domínio extracelular de TF em ELISA
[0372] A especificidade dos anti-TF HuMabs obtidos foi avaliado por ELISA. As placas ELISA (Microlon; Greiner Bio-One) foram revestidas durante a noite a +4° C com 0,5 μg/mL de TFECDHis em PBS, pH 7,4. As placas ELISA revestidas foram esvaziadas e bloqueadas por uma hora em temperatura ambiente com 2 % de soro de galinha (v/v) (Gibco, Paisley, Scotland) em PBS e lavado com PBS contendo 0,05 % de Tween 20 (PBST). Subsequentemente, HuMabs, periodicamente diluído em PBSTC (PBS suplementado com 2 % de soro de galinha (v/v) e 0,05 % (v/v) Tween-20), foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente sob condições de agitação (300 rpm). Os HuMabs de ligação foram detectados usando anticorpos IgG anti-humano de cabra conjugados por HRP (Jackson ImmunoResearch) diluído 1:5.000 em PBSTC, que foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente sob condições de agitação (300 rpm). A reação ainda foi desenvolvida com ABTS (Roche Diagnostics) em temperatura ambiente no escuro, interrompido após 15 a 30 minutos pela adição de 2 % de ácido oxálico (p/v) e então a absorbância 405 nm foi medido. HuMab-KLH (um anticorpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de lapa buraco de fechadura)), foi usado como um controle negativo. O anti-TF humano de camundongo (ERL) foi usado como controle positivo (IgG anti-camundongo rotulado por HRP como conjugado). As curvas de ligação foram analisadas usando regressão não linear (dosagem-resposta sigmoidal com declínio variável) usando o software GraphPad Prism V4.03.
[0373] Como pode ser visto nas Figura 3, todos dos anticorpos anti-TF ligados por TFECDHis. Os valores The EC50 para os HuMabs são a média dos 3 experimentos e variados entre 0,09 e 0,46 nM (Tabela 3 abaixo). Tabela 3:
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Exemplo 14 Ligação de anti-TF HuMabs ao TF que liga a membrana
[0374] A ligação de anti-TF HuMabs ao TF que liga a membrana foi determinado pela análise FACS, usando as células CHO transfectadas por TF, ou linhas celulares de tumor que expressam TF MDA- MB-231, (luciferase transfectada) A431 e Bx-PC3.
[0375] As células foram recolocadas em suspensão em PBS (2 x 106 células/ml), colocadas em placas de fundo em V de 96 reservatórios (50 μl/reservat0rio). 50 μl de HuMab periodicamente diluído no tampão FACS (PBS suplementado com 0,1 % de BSA e 0,02 % de Na-azida) foi adicionado as céluals e incubados por 30 minutos em gelo. Após lavagem três vezes com tampão FACS, 50 μl de IgGFc anti-humano de cabra conjugado por ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch), diluído 1:100 no tampão FACS, foi adicionado. Após 30 minutos em gelo (no escuro), as células foram lavadas três vezes e a ligação específica de HuMabs foi detectada pela citometria de fluxo em um FACSCalibur (BD Biosciences). HuMab-KLH foi usado como um controle negativo. Camundongo anti-TF seguido por IgGFc anti-camundongo conjugado por PE foi usado como controle positivo. As curvas de ligação foram analisadas usando regressão não linear (dosagem- resposta sigmoidal com o declínio variável) usando o software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[0376] A figura 4 mostra um exemplo de curvas de ligação de HuMabs específicos por TF-specific as células MDA-MB-231. A Tabela 4 dá um resumo dos valores EC50 da ligação de HuMabs específico por TF as células CHO transfectadas por TF (S1015-TF), MDA-MB-231, A431 e células Bx-PC3.
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Tabela 4 - Resumo de EC50 e índice de valores de fluorescência média máxima (MFI max) determinados pela análise FACS de ligação de HuMabs específicos por TF aos tipos de células diferentes.
[0377] Os valores EC50 estão em nM. MFI max por MDA- MB-231, BxPC3 e células A431 a 30 μg/mL de anticorpo, por S1015-TF a 7,5 μg/mL de anticorpo. Exemplo 15 Inibição de ligação FVIIa ao TF
[0378] A inibição de ligação de FVIIa a TFECDHis pelos TF-HuMabs foi medida por ELISA. As placas de ELISA foram revestidas durante a noite com TFECDHis (0,5 μg/mL, 100 μL por reservatório). as placas foram esvaziadas, bloqueadas com PBS contendo 2 % de soro de galinha (v/v) (1 hora, RT) e esvaziadas novamente. As diluições em série 4 vezes de TF-HuMabs ou HuMab-KLH (controle negativo) foram adicionados aos reservatórios seguido pelo FVIIa a concentração EC50 (100 nM) e as placas incubadas por 1 hora em temperatura ambiente (enquanto agitação, 300 rpm). As placas foram lavadas e incubadas com anti-FVIIa de coelho (2,5 μg/mL; Abcam) como acima. As placas foram lavadas e incubadas com anticorpo IgG-HRP anti-coelho de porco (1:2.500; DAKO). Após lavagem, os complexos imunes foram visualizados usando ABTS como um substrato. A reação foi interrompida pela adição de 2 % de ácido oxálico v/v seguido pela medição de densidade óptica a 405 nm usando um leitor ELISA. A concentração de anticorpo necessita obter 50 % de inibição (IC50) foi calculada usando GraphPad prism (análise de regressão não linear).
[0379] A Figura 5 mostra que os anticorpos a partir dos grupos de bloqueio cruzados II e III eficientemente inibem a ligação FVIIa ao TF, enquanto os anticorpos a partir do grupo de bloqueio cruzado I não (ou a uma extensão muito menor) inibiu a ligação FVIIa. A Tabela 5 mostra os valores IC50 e valores de inibição máximos (porcentagem) de inibição de ligação FVIIa ao TF pelos HuMabs específicos por TF.
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Tabela 5 - IC50 Os valores e valores de inibição máxima (porcentagem) de inibição de ligação FVIIa ao TF pelos HuMabs específicos por TF. Exemplo 16 Inibição de FVIIa induzido pela fosforilação ERK
[0380] Na ligação de fator de coagulação VIIa (FVIIa) ao TF, a fosforilação da cinase ativada pelo mitogênio (p42 e p44 MAPK ou ERK1 e ERK2) é disparado. A linha celular do carcinoma epidermóide A431 que expressa os níveis altos de TF e após estimulação com FVIIa uma fosforilação ERK ótima (3 a 5 vezes) (ERK-P), medida usando o ensaio AlfaScreen Surefire ERK (Perkin Elmer), é induzido dentro de 10 minutos.
[0381] As células A431 (30.000 células por reservatório) foram semeados em placas TC de 96 reservatórios e cultivados O/N (37° C, 5 % de CO2, 85 % de umidade) no meio livre de soro (RPMI contendo 20 % de HSA e penicilina/estreptomicina). O meio foi então substituído por DMEM (sem aditivos) e as células foram incubadas por 1,5 horas. 3 vezes das diluições em séries de TF-HuMabs ou HuMab-KLH foram adicionados e as células incubadas por 0,5 horas. As células foram então estimuladas com FVIIa na concentração EC80 (50 nM; 10 minutos; 37° C, 5 % de CO2, 85 % de umidade). As células foram lavadas uma vez com PBS e lisado usando 25 μL de tampão de líse (Perkin Elmer, Surefire kit). Os lisados foram centrifugados (3 minutos, 330 x g, RT). Quatro μL do sobrenadante foram transferidos as Proxiplacas de 384 reservatórios (Perkin Elmer). 7 μl de tampão de reação/mistura de tampão de ativação contendo pérolas AlfaScreen (Perkin Elmer Surefire kit) foi adicionado e as placas foram incubadas no escuro por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lidas usando o protocolo “Surefire Plus” da tecnologia EnVision.
[0382] A Figura 6 mostra que, medida usando o ensaio AlfaScreen Surefire ERK, anticorpo 013 não inibe FVIIa induzido pela fosforilação ERK, 044 e 111 moderadamente inibem a fosforilação ERK e todos os outros anticorpos eficientemente bloqueiam a fosforilação ERK.
[0383] A Tabela 6 mostra os valores IC50 e valores de inibição máximos (porcentagem) de inibição de FVIIa induzido pela fosforilação ERK pelos HuMabs específicos por TF, medido usando o ensaio AlfaScreen Surefire ERK.
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Tabela 6 - Os valores IC50 e valores de inibição máximos (porcentagem) de inibição de FVIIa induzido pela fosforilação ERK (medido usando o ensaio AlfaScreen Surefire ERK) pelos HuMabs específicos por TF.
[0384] Os resultados obtidos no ensaio AlfaScreen Surefire ERK foram confirmados pela análise Western Blot, usando as linhas celulares HaCaT e BxPC3. 30.000 células/reservatório foram semeadas em DMEM contendo concentrações mínimas de soro (meio de inanição) e cultivados durante a noite. As células ainda foram cultivadas por 2 horas em DMEM sem soro, anticorpos anti-TF foram adicionados durante os 30 minutos finais da cultura. As células foram estimuladas com 0, 10 ou 50 nM de FVIIa por 10 minutos (37° C) e subsequentemente lisadas no tampão de líse celular (50 μL de tampão de líse por reservatório, 30 a 60 minutos de líse sob condição de agitação, temperatura ambiente). 25 μL de SDS contendo o tampão de amostra foi adicionado a cada amostra. As amostras foram carregadas em géis SDS-PAGE, realizadas e manchadas usando os procedimentos padrão por Western blotting. As manchas foram bloqueadas com TBST1x contendo 5 % de proteína irrelevante (ELK) por 1 hora em temperatura ambiente. As manchas foram incubadas com anticorpo anti-ERK-P de coelho (O/N, 4° C). As manchas foram lavadas com TBST1x e incubadas com IgG HRP anticoelho (1 hora, temperatura ambiente), lavada, desenvolvidas usando o substrato HRP e formadas as imagens usando o sistema Optigo Ultima Imaging (Isogen Life Sciences).
[0385] A Figura 6A mostra os resultados nas células BxPC3 por um sub-painel de anticorpos. A fosforilação ERK induzida por 10 nM de FVIIa não foi inibida pelo anticorpo 013, enquanto este foi eficientemente inibido pelos anticorpos 111, 044 e 025 (o último como um exemplo para todos os outros HuMabs específicos por TF descritos aqui). A fosforilação ERK induzida mais forte (50 nM FVIIa) não foi inibida pelos anticorpos 013, 111 e 044, mas foi inibida pelo anticorpo 025. Exemplo 17 Inibição da liberação L-8 induzida por FVIIa
[0386] A capacidade dos HuMabs específicos por TF para inibir a liberação induzida por FVIIa de IL-8 foi testada usando as células MDA-MB-231. As células foram semeadas em placas de 96 reservatórios (60.000 células/reservatório) e cultivadas (O/N, 37° C, 5 % de CO2) em DMEM contendo CS, piruvato de sódio, 1-glutamina, MEM NEAA e penicilina/estreptomicina. O meio de cultura de tecido foi removido, as células foram lavadas duas vezes em soro livre, meio de cálcio alto (DMEM contendo penicilina/estreptomicina) e cultivadas neste meio por 105 minutos adicionais. As diluições em séries de anticorpos foram adicionadas e as células cultivadas por 15 minutos. FVIIa (Novo Nordisk; concentração final 10 nM) foi adicionado e as células foram cultivadas por 5 horas. O sobrenadante foi removido e centrifugado (300 x g, RT). As concentrações IL-8 no sobrenadante foram medidas usando um kit ELISA IL-8 de acordo com os protocolos do fabricante (Sanquin).
[0387] A figura 7 mostra que os anticorpos a partir dos grupos de bloqueio cruzados II e III eficientemente inibem a liberação IL-8 induzida por FVIIa pelas células MDA-MB-231, com a exceção do anticorpo 111 a partir do grupo de bloqueio cruzado III. Os anticorpos do grupo de bloqueio cruzado I (013, 044 e 87-Lg6) não inibem a liberação IL-8 FVIIa induzida por FVIIa.
[0388] Tabela 7 mostra os valores IC50 e valores de inibição máxima (porcentagem) de inibição de liberação IL-8 induzida por FVIIa pelos HuMabs específicos por TF.
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[0389] Tabela 7 - Valores IC50 e valores de inibição máxima (porcentagem) de inibição de liberação IL-8 induzida por FVIIa pelos HuMabs específicos por TF. Exemplo 18 Inibição de geração FXa
[0390] A capacidade de HuMabs específicos por TF para inibir a geração de FXa foi testada em um ensaio no qual a conversão de FX em FXa pelo complexo de TF/FVIIa é medida usando um substrato específico por FXa colorimétrico. O TF (Innovin) foi adicionado as placas de fundo plano de 96 reservatórios, junto com uma diluição em série de HuMabs específicos por TF, controle positivo (anti-TF de camundongo) de controle negativo (HuMab-KLH) (todos diluídos em tampão de Hepes contendo 3 mM de CaCl2. As placas foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente e FVIIa (concentração final 1 nM) e FX (ERL; concentração final 200 nM) foi adicionado. As placas foram incubadas 30 minutos a 37° C. 50 μl de cada reservatório foi transferido a uma placa de 96 reservatórios contendo (pré-aquecido, 37° C) tampão de interrupção (5 mM de EDTA em 100 ml de tampão de Hepes). O substrato específico por FXa Chromogenix-2765 (Instrumation Laboratory Company) foi adicionado, as placas incubadas por 60 minutos a 37° C e OD405 nm a 37° C foi medido.
[0391] A figura 8 mostra que o anticorpo 017-D12 fortemente inibiu a geração FXa, 013 inibição intermediária demonstrada e outros anticorpos mostram-se inferiores a nenhuma inibição da geração FXa.
[0392] A Tabela 8 mostra os valores IC50 e valores de inibição máxima (porcentagem) de inibição da geração FXa pelos HuMabs específicos por TF.
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Tabela 8 - Valores IC50 e valores de inibição máxima (porcentagem) de inibição da geração FXa pelos HuMabs específicos por TF. Exemplo 19 Inibição de coagulação sanguínea
[0393] A inibição de coagulação sanguínea por TF- HuMabs foi medida em um ensaio que determina o tempo de coagulação induzido por TF. As misturas de 17 μl de 100 mM de CaCh (concentração final 17 mM), 10 μl de 1:100 inovina (concentração final 1:1000), 23 μl 1x de tampão de HEPES e 50 μl de anticorpo periodicamente diluído foram preparados nas placas de 96 reservatórios. Cinquenta μl de plasma humano unido foi adicionado aos reservatórios de placas Immulon 2B (Thermo Electron). Cinquenta μl das misturas de anticorpo preparados foi adicionado as placas Immulon 2b e o desenvolvimento da coagulação a 405 nm foi medida a cada 15 segundos por 25 minutos usando um leitor de placa cinético. O aumento na densidade óptica foi plotado no período e no tempo de coagulação (t1/2) foi calculado. O tempo de coagulação foi plotado contra a concentração de anticorpo. IC50 da inibição de coagulação induzida pelo anticorpo foi calculada a partir deste pela análise de regressão não linear usando GraphPad Prism.
[0394] A Figura 9 mostra que o anticorpo 044, 087 e 111 não inibiu a coagulação sanguínea induzida por TF, considerando todos os outros anticorpos. A Tabela 9 mostra os valores IC50 da inibição de coagulação sanguínea pelos HuMabs específicos por TF.
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Tabela 9 - Valores IC50 da inibição de coagulação sanguínea pelos HuMabs específicos por TF. Exemplo 20 Citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo Preparação das células alvos:
[0395] As células alvos que expressam TF (5x106 células Bx-PC3, células MDA-MB-231 ou células A431) foram coletadas, lavadas (duas vezes em PBS, 1500 rpm, 5 minutos) e coletadas em 1 ml de RPMI 1640 do meio de cultura suplementado com soro de soro Cosmic Calf, piruvato de sódio, L-Glutamina, MEM NEAA e Penicilina/estreptomicina, no qual 100 μCi 51Cr (Crômio-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, The Netherlands) foi adicionado. A mistura foi incubada em um banho de água em agitação por 1 hora a 37° C. Após lavagem das células (duas vezes em PBS, 1500 rpm, 5 minutos), as células foram recolocadas em suspensão no meio de cultura e as células viáveis contadas pela exclusão de azul de tripano. As células viáveis foram levadas a uma concentração de 1x105 células/ml. Preparação das células eficazes:
[0396] As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) foram isoladas a partir da camada leucocitária frescos (Sanquin, Amsterdam, The Netherlands) usando a centrifugação da densidade Ficoll padrão de acordo com as instruções do fabricante (meio de separação de linfócito; Lonza, Verviers, France). Após recolocar em suspensão as células no meio de cultura, as células foram contadas pela exclusão de azul de tripano e levadas a uma concentração de 1x107 células/ml. Apresentação ADCC:
[0397] 50 μl de células alvos rotuladas por 51Cr foram transferidas aos reservatórios microtituladores e 50 μl do anticorpo periodicamente diluído foi adicionado, diluído no meio de cultura. As células foram incubadas (temperatura ambiente, 15 minutos) e 50 μl das células eficazes foram adicionadas, resultando em um atuador para a razão alvo de 100:1. para determinar o nível máximo de líse, 100 μl de 5 % de Triton-X100 foi adicionado em vez das células atuadoras; para determinar o nível espontâneo de líse, 100 μl do meio de cultura foi adicionado; para determinar o nível da líse independente do anticorpo, 50 μl das células atuadoras e 50 μl do meio de cultura foi adicionado). Subsequentemente, as células foram incubadas O/N a 37° C, 5 % de CO2. Após rotação as células (1200 rpm, 3 min), 75 μl do sobrenadante foi transferido aos tubos micrônicos. O 51Cr liberado foi contado em um contador de gama e a porcentagem de líse mediada pelo anticorpo foi calculado como seguem: ((amostra cpm - líse independente do anticorpo cpm)/(líse máxima cpm - líse espontânea cpm)) x 100 % em que cpm é a contagem por minuto.
[0398] A Figura 10 mostra que todos os TF-HuMabs testados induzidos por líse das células Bx-PC3 por ADCC, embora com as eficiências diferentes (EC50).
[0399] A Tabela 10 mostra os valores EC50 (nM) de ADCC das linhas celulares diferentes pelos HuMabs específicos por TF.
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Tabela 10 - Os valores EC50 (nM) de ADCC das linhas celulares diferentes pelos HuMabs específicos por TF. Exemplo 21 Deposição de complemento
[0400] A deposição dos fragmentos C3c e C4c de complemento pelas células alvos incubadas por TF-HuMab foi medida pela análise FACS. As células alvos que expressam TF (Bx-PC3 ou células MDA- MB-231) foram colocados nas placas de fundo redondo de 96 reservatórios (1x10 e 5 células/reservatório) em RPMI contendo 1 % de BSA. O anticorpo (30 μg/mL) foi adicionado e as células incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos. Vinte e cinco μL de soro humano unido foi adicionado como uma fonte de complemento, o soro humano inativado por calor foi usado para determinar a ligação de complemento espontâneo. As células foram incubadas a 37° C por 45 minutos. As células foram lavadas uma vez e incubadas com C3c FITC anti-humano ou C4c FITC anti-humano (DAKO) em tampão FACS e incubadas por 30 minutos em gelo. As amostras foram analisadas usando FACS Canto.
[0401] A Figura 11 mostra que os anticorpos a partir do grupo de bloqueio cruzado I não induzem a deposição C3c ou C4c nas células BxPC3 ou MDA-MB-231. Todos os anticorpos testados a partir do grupo de bloqueio cruzado II não induzem a deposição C3c e C4c, como anticorpos a partir do grupo de bloqueio cruzado III, com a exceção do anticorpo 003. Exemplo 22: Estudos de avidez/afinidade Determinação da afinidade:
[0402] A ligação de anticorpo ao TF foi analisado pela ressonância de plasmon de superfície em um BIAcore 3000 (GE Healthcare). O TFECDHis foi usado pela análise. Os anticorpos HuMab (500 unidades de ressonância) foram imobilizados no chip de sensor CM-5 de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante. Brevemente, após a ativação de superfície por EDC e anticorpo NHS HuMab foi injetado em uma superfície CM-5 ativada em acetato de sódio 10 mM, pH que varia de 4,0 a 5,5 a 5 μl/min. Seguido pela 1 M de Etanolamina para a desativação. As séries de concentrações de TFECDHis no tampão HBS-EP foram injetadas nos anticorpos imobilizados em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 180 segundos. A regeneração da superfície HuMab foi realizada pela injeção de 10 mM de glicina-HCl pH 2,0 ou 10 mM de acetato de sódio pH 3,0. A análise cinética foi realizada usando subtração de referência dupla e modelo de análise de ligação 1:1 (langmuir).
[0403] A Tabela 11 mostra para mais HuMabs a afinidade determinada na faixa nanomolar (sub). Nem em todos os anticorpos os parâmetros cinéticos devem ser determinados. 044 dão uma alta variação nas taxas (kd) e tem resíduos altos, que significam que o ajuste das curvas não foi bem. 098, 111 e 087-Lg6 tem taxas que foram mais altas pelo Biacore 3000 para medir.
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n.a. não avaliável = > 10-3 sec-1 Tabela 11. Aa constantes cinéticas de TF-HuMabs para a reatividade com TFECDHis - medições de afinidade. Determinação de avidez:
[0404] A ligação TF (TFECDHis) aos HuMabs específicos por TF foi determinada essencialmente como descrito acima, com TFECDHis sendo imobilizado no chip sensor CM-5 (300 unidades de ressonância) e séries de concentração do anticorpos Humab usados para a análise cinética. A análise cinética foi realizada usando a subtração de referência dupla e modelo de ensaio de ligação 1:1 (langmuir).
[0405] A Tabela 12 mostra as medições de avidez para os anticorpos 11, 98, 109 e 111. Considerando as medições por afinidade pelas altas taxas indicadas 98 e 111 (além do limite da determinação por Biacore (isto é >10-3)), determinação de avidez revelou a interação da faixa nanomolar.
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Tabela 12. Constantes cinéticos de TFECDHIS para a reatividade com TF- HuMabs - medições por avidez. Exemplo 23: Análise imunohistoquímica de ligação aos tecidos humanos normais e tumores pancreáticos
[0406] A ligação de TF-HuMabs aos vários tecidos humanos conhecidos para expressar TF (cólon, coração, rim, pele, pulmão e cérebro) foi determinada pela imunohistoquímica (IHC). IHC no tecido congelado
[0407] As seções de tecido congelado foram cortadas (4-6 μm de espessura) e fixos em acetona. A peroxidase de tecido endógeno (PO) foi bloqueado e as lâminas de tecido foram pré-incubadas com soro humano normal para evitar a ligação específica de anticorpos aplicados posteriores aos receptores Fc endógenos. O Ab de camundongo direcionado contra TF humano (e Ab de camundongo de controle negativo) foi aplicado nos tecidos na ótima diluição e subsequentemente detectada com Powervision-PO (antimouse de cabra/-IgG de coelho)-PO. Os HuMabs específicos por TF foram ligados ao IgG anti-humano de cabra Fab' (Fc)-FITC e portanto aplicado as lâminas de tecido congelado em 3 diluições, incluindo uma ótima diluição pré-determinada. Subsequentemente o complexo HuMab - Fab-FITC foi detectado pelo anti-FITC de coelho e Powervision-PO. A atividade PO foi visualizada com AEC como substrato e núcleos foram visualizados com hematoxilina. O tingimento foi analisado pela microscopia de campo claro. IHC com Ab de camundongo em formalina fixa e tecido embebido por parafina (FFPE)
[0408] As biopsias de tecido FFPE foram cortadas a 4 μm, desparafinizadas, bloqueadas pela peroxidase de tecido endógeno e submetidas ao antígeno retrieval (pH6, tampão de citrato). Antes da incubação com as lâminas de tecido Ab de camundongo foram pré-incubadas em soro humano normal para evitar a ligação específica aos receptores Fc endógenos. O Ab de camundongo direcionado contra TF humano (e camundongo Ab de controle negativo) foi aplicado as lâminas de tecido em ótima diluição e subsequentemente detectada com Powervision-PO (anti-camundongo de cabra/-IgG de coelho)-PO. A atividade PO foi visualizada com AEC como substrato e os núcleos foram visualizados com hematoxilina. O tingimento foi analisado pelo microscópio de campo claro.
[0409] A Figura 12 mostra um exemplo de ligação de anticorpo 013 (tingimento positivo), 011 (tingimento positivo), 114 (tingimento positivo) e 111 (tingimento intermediário) ao glomérulo do rim. O anticorpo 098 e 044 não liga-se ao glomérulo.
[0410] A Tabela 13 dá um resumo dos resultados de tingimento para todos os TF-HuMabs no rim humano de todos os tecidos examinados.
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Tabela 13. Tingimento IHC do glomérulo humano
[0411] A Tabela 14 dá um resumo dos resultados de tingimento dos HuMabs específicos por TF selecionados no rim, cólon, coração, cérebro e pele humana bem como nos tumores pancreáticos humanos.
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Tabela 14. Tingimento IHC do tecido humano normal e tumores pancreáticos.
[0412] A análise IHC da ligação de TF-HuMabs aos tumores pancreáticos humanos revelou o tingimento positivo para todos os TF-HuMabs (exemplificado na Figura 13). Exemplo 24: Tratamento do xenoenxerto de tumor MDA-MB-231 estabelecidos nas almofadas de gordura de mamíferos dos camundongos SCID
[0413] A eficácia in vivo de TF-HuMabs foi determinada nos tumores de xenoenxerto MDA-MB-231 ortotópicos estabelecidos em camundongos SCID. As células de tumor 2x106 em PBS foram injetados s.c. na 2° almofada de gordura de mamífero dos camundongos SCID fêmeas, seguido pelo tratamento com TF-HuMabs ou mAb de controle (HuMab- KLH), partindo em um momento que os tamanhos dos tumores tornam-se medidos. Os anticorpos foram injetados no dia 21 (260 μg/camundongo), dia 28 (130 μg/camundongo) e dia 42 (130 μg/camundongo). O volume do tumor foi determinado pelo menos 2x/semana. Os volumes (mm3) foram calculados a partir das medições de paquímetro (PLEXX) como 0,52 x (comprimento) x (altura)2.
[0414] A Figura 14 mostra que os anticorpos 114, 111, 013, 098, 011 e 044 foram todos efetivos na inibição do desenvolvimento dos tumores MDA-MB-231 ortotópicos estabelecidos. Exemplo 25: Dosagem de repetição piloto de um HuMab específico por TF nos macacos cinomólgos
[0415] Para obter a informação inicial na toxicologia dos HuMabs específicos por TF, incluindo uma avaliação da capacidade dos anticorpos para interferir com a cascata de coagulação e visto que potencialmente aumenta o risco dos animais expostos, um estudo de dosagem de repetição piloto nos macacos cinomólgos foi realizado.
[0416] Dois macacos cinomólgos machos e fêmeas (Macaca fascicularis), idade de aproximadamente 2 anos, receberam injeções intravenosas de anticorpo 011: - dia 1 do estudo: 0 mg/kg (apenas veículo) - dia 8: 1 mg/kg; 1 mL/minuto - dia 15: 10 mg/kg; 1 mL/minuto - dia 22: 100 mg/kg; 1 mL/minuto
[0417] Os animais foram seguidos até o dia 27, período de tempo no qual os animais foram submetidos à eutanásia para necropsia e avaliação histológica dos órgãos.
[0418] O ponto final principal dos estudos foram: - observações clínicas: determinados diariamente, sinais de sangramento das gengivas, olhos. - tempo de sangramento e perda de sangue funcionais: determinado nos dias 1, 8, 15 e 22 (1, 24 e 120 h pós dosagem) e em dois pontos de tempo pré-ensaio. - sangue/traços de sangue/coágulos: tingimento com HE de todos os tecidos (determinado em tecidos obtidos no sacrifício final) - sangue na urina, fezes, vômito: determinado diariamente/semanalmente.
[0419] Nenhuma toxicidade aparente de dosagem crescente repetida de anticorpo 011 foi observada. Os animais não apresentaram sinais clínicos e não houve indicação de liberação de citocina. Além disso, não houveram sinais clínicos aparentes de um sistema de coagulação comprometido ou sangramentos sistêmicos. Em 1 hora após o ponto de tempo de dosagem, o tempo de sangramento médio no dia 22 foi significantemente maior do que o visto no dia 1 (p = 0,012). Não houveram outras diferenças estatisticamente significantes entre os dias 8, 15 e 22 em comparação com o dia 1. Além disso, foi observado que não houve toxicidade aparente aos órgãos principais e nenhum e feito hematológico adverso. A conclusão preliminar na avaliação histológica de tecidos a partir deste estudo é que não existe descobertas de histologia nos quatro animais tratados que possam ser atribuídas para o tratamento com o item de teste.
[0420] A Figura 15 mostra os pontos de dados individuais para cada animal (amostras em duplicata) como uma função de tempo. O tempo de sangramento para os 4 animais foram determinados nos dias 1, 8, 15 e 22 (1, 24 e 120 h) e em dois pontos de tempo pré-ensaio. Exemplo 26 Tratamento preventivo e terapêutico de xenoenxertos de tumor BxPC3 em camundongos SCID
[0421] A eficácia in vivo de TF-HuMabs no tratamento preventivo ou terapêutico de xenoenxertos de célula BxPC3 em camundongos SCID foi determinada. 10x106 células tumorais BxPC3 em PBS foram injetadas s.c. em camundongos fêmeas SCID, seguido pelo tratamento com TF-HuMabs ou mAb controle (HuMab-KLH). Para o tratamento preventivo, os anticorpos (400 μg/camundongo) foram injetados i.p. 1 hora após a indução de tumor. Para o tratamento terapêutico, a injeção de anticorpo (300 μg/camundongo) foi iniciada no dia 8 após a indução tumoral, seguido pelas injeções de anticorpo semanais (150 μg/camundongo). O volume tumoral foi determinado pelo menos 2x / semana. Os volumes (mm3) foram calculados a partir das medições com paquímetro (PLEXX) como 0,52 x (comprimento) x (largura)2.
[0422] A Figura 16 mostra que os HuMabs específicos de TF são capazes de prevenir também o tratamento terapêutico de tumores de xenoenxerto de BxPC3. Exemplo 27 Mistura de DNA entre TF murino e humano para determinar os domínios importantes para a ligação de HuMabs anti-TF
[0423] Para determinar os domínios importantes para a ligação de anti-TF HuMabs ao TF humano, a mistura de DNA foi realizada entre TF humano e murino. A mistura das construções foi preparada a partir do DNA que codifica TF humano, substituindo-se os domínios humanos com domínios de murino e de DNA que codifica TF murino substituindo-se os domínios murinos por domínios humanos. Se um domínios em TF humano for importante para a ligação de um HuMab anti-TF, a ligação será perdida na substituição daquele domínio pelo domínio murino. O TF humano e murino são 57 % homólogos no nível de proteína. A Figura 17 A e 17 B mostram as construções para o TF humano contendo domínios de TF murino (TFhs, contendo domínios TFmm) e para TF murino contendo domínios de TF humano. As células HEK293F foram transitoriamente transfectadas com as construções ou com o vetor apenas (pcDNA3.3SP; falso). A análise de FACS foi realizada como descrito essencialmente como descrito supra, com 30 μg/mL de material precursor purificado. O HuMab-KLH foi usado como um Ab controle.
[0424] A Figura 17 mostra que todos, mas um HuMabs anti-TF liga-se unicamente ao TF humano e não ao TF murino. O HuMab-TF-003 mostra alguma ligação ao TF murino.
[0425] A Figura 18 A a O mostra os resultados para a ligação do HuMabs anti-TF diferente às construções expressadas nas células HEK293F. Estes resultados são resumidos na Tabela 15. Nesta tabela os HuMabs anti-TF são classificados em grupo, com base nos domínios em TF humano que são importantes para a ligação destes HuMabs.
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Tabela 15 Exemplo 28 Ligação de Fab fragmentos de HuMabs anti-TF ao domínio extracelular de TF, determinado por ELISA e ao TF celular em células BxPC3, determinado por FACS
[0426] A ligação de fragmentos Fab de HuMabs anti-TF a TF foi medida por ELISA (domínio extracelular revestido de TF) e por FACS (TF em células BxPC3). O ELISA foi realizado essencialmente como descrito supra. Os fragmentos Fab ligados foram detectados usando-se H+L anti humano de jumento conjugado por HRP. A análise FACS foi realizada essencialmente como descrito supra. O IgG anti-humano de cabra conjugado por FITC (H+L) (Jackson) foi usado para detectar os candidatos guia ligados. A fluorescência foi medida em um FACSCantoII. As curvas de ligação foram analisadas como descrito supra, usando-se o software GraphPad Prism 5.
[0427] A Figura 19 mostra menos ligação de fragmentos de HuMab-TF-098 e -111 Fab ao domínio extracelular de TF, em comparação com os fragmentos de -011 Fab, medido por ELISA.
[0428] A Figura 20 mostra menos ligação de fragmentos HuMab-TF-098 e -111 Fab ao TF celular, em comparação com os fragmentos -011 Fab, medido por FACS em células BxPC3.
[0429] A Tabela 16 mostra valores de EC50 de fragmentos de HuMab-TF Fab para a ligação ao domínio extracelular de TF por ELISA e ao TF celular por FACS em células BxPC3.
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Tabela 16 - Resumo de valores EC50 para a ligação de fragmentos HuMab-TF Fab ao domínio extracelular de TF, determinado por ELISA e ao TF celular em células BxPC3, determinado por FACS.
[0430] Os valores EC50 estão em μg/mL. na - não pode ser calculado. Exemplo 29 Ligação de anti-TF HuMabs às linhas celulares que expressam níveis diferentes de TF
[0431] A ligação de HuMabs anti-TF ao TF que liga a membrana em linhas celulares que expressam os níveis diferentes de TF foi determinada pela análise FACS, essencialmente como descrito supra. anticorpo anti-TF de camundongo seguido por IgGFc anti-camundongo conjugado por PE foi usado como um controle positivo. A fluorescência foi medida em um FACSCantoII. As curvas de ligação foram analisadas como descrito supra, usando-se o software GraphPad Prism 5. A quantidade de moléculas TF em linhas celulares foi determinada pelo kit Qifi (Dako, Glostrup, Dinamarca), de acordo com as instruções do fabricante. Foi determinado que as células SW480 expressam ~ 20.000 molécula de TF por célula, as células SK-OV-3 expressam ~ 60.000 moléculas por célula, as células AsPC-1 expressam ~ 175.000 moléculas por célula e as células MDA-MB-231 ~ 900.000 moléculas por célula.
[0432] Figura 21 HuMab-TF-98 e -111 apresentam características de ligação similares como HuMab-TF-11, -13 e 109 na linha celular que expressa TF alto MDA-MD-231. Nas linhas celulares com TF inferior por célula, por exemplo as linhas celulares SK-OV-3 e SW480, HuMab-TF-98 e 111 apresentam características de ligação diferentes em comparação com os outros anticorpos HuMab-TF.

Claims (18)

1. Anticorpo humano que se liga ao fator de tecido humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região VH compreendendo as sequências CDR1, 2 e 3 da SEQ ID NO: 10, 11 e 12 e uma região VL compreendendo as sequências CDR1, 2 e 3 da SEQ ID NO: 66, 67 e 68.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui uma ou mais das seguintes características: a) liga-se ao domínio extracelular do Fator de Tecidos com uma afinidade aparente (EC50) de 3 nM ou menos, como 0,50 nM ou menos, por exemplo, 0,35 nM ou menos, como 0,20 nM ou menos, por exmeplo 0,1 nM ou menos, quando determinado como descrito no ensaio no Exemplo 13, b) liga-se a células de mamífero que expressam o Fator de Tecidos, tais como células A431 transfectadas com uma construção que codifica o Fator de Tecidos, preferencialmente com uma afinidade aparente (EC50) de 10 nM ou menos, por exmeplo 8 nM ou menos, como 5 nM ou menos, por exemplo 2 nM ou menos, como 1 nM ou menos, por exmeplo 0,5 nM ou menos, como 0,3 nM ou menos, quando determinado como descrito no ensaio no Exemplo 14, c) é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo em células A431, preferencialmente com um valor EC50 de 2 nM ou menos, por exemplo, 1 nM ou menos, como 0,7 nM ou menos ou 0,3 nM ou menos, como 0,2 nM ou menos, 0,1 nM ou menos, ou 0,05 nM ou menos, quando determinado conforme descrito no ensaio no Exemplo 20, d) o anticorpo é eficaz na inibição do crescimento de tumores MDA-MB-231 estabelecidos, quando determinado pelo método descrito no Exemplo 24 e/ou na inibição do crescimento de tumores BxPC3 estabelecidos, quando determinado pelo método descrito no Exemplo 26, e) inibe a coagulação sanguínea induzida pelo Fator de Tecidos, preferencialmente com uma concentração mediana de inibição menor que 10 nM, tal como menor que 5 nM, por exemplo, inferior a 2 nM, tal como inferior a 1 nM, quando determinado como descrito no ensaio no Exemplo 19, f) em que o anticorpo inibe a conversão de FX em FXa pelo complexo TF/FVIIa, preferencialmente em menos de 50%, por exemplo, inferior a 40%, como na faixa de 1 a 30%, quando determinado como descrito no ensaio no exemplo 18, ou g) inibe a liberação de IL-8 induzida por FVIIa por células MDA-MB-231, de preferência com um valor de inibição máximo de inibição superior a 40%, tal como superior a 50%, por exemplo, mais de 60%, quando determinado conforme descrito no ensaio no Exemplo 17.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo possui uma ou mais das seguintes características: a) inibe a fosforilação de ERK induzida por FVIIa, de preferência com uma concentração média de inibição inferior a 10 nM, tal como inferior a 5 nM, por exemplo, inferior a 2 nM quando determinado como descrito no ensaio no Exemplo 16, b) é capaz de induzir deposição de C3c e C4c, de preferência em que o anticorpo é capaz de induzir deposição de C3c e C4c, conforme determinado no Exemplo 21, c) os fragmentos Fab do anticorpo se ligam ao domínio extracelular do fator de tecido como descrito no exemplo 28 com um valor de EC50 abaixo de 0,1 μg/mL, tal como abaixo de 0,05 μg/mL, e. abaixo de 0,04 μg/mL medido por ELISA, d) os fragmentos Fab do anticorpo se ligam ao domínio extracelular do fator tecidual, conforme descrito no exemplo 28, com um valor de EC50 acima de 1,0 μg / mL, conforme medido por ELISA, e) os fragmentos Fab do anticorpo se ligam ao domínio extracelular do fator de tecido como descrito no exemplo 28 com um valor de EC50 abaixo de 10 μg/mL, tal como abaixo de 1 μg/mL, e. abaixo de 0,5 μg/mL, ou abaixo de 0,2 μg/mL, ou f) liga-se ao fator de tecido humano e não ao fator de tecido murino e mostra ligação reduzida em comparação com a ligação ao TF humano na construção de embaralhamento 42-84 mm, contendo a sequência humana para o FT, exceto o aminoácido 42-84, que foi substituído com a sequência do camundongo, conforme descrito no exemplo 27.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 9.
5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 65.
6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma região VH compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 9 e uma região VL compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 65.
7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui uma ou mais das seguintes características: a) uma afinidade para o fator de tecido que é menor que 5 nM, tal como menor que 3,5 nM, p. inferior a 2 nM quando determinado pelo método descrito no Exemplo 22 deste documento, b) um kd de mais de 10-3 seg-1, quando determinado pelo método descrito no Exemplo 22 aqui e/ou um ka de mais de 5x104, mol-1 sec-1 quando determinado pelo método descrito no Exemplo 22 deste documento ou c) um kd de mais de 10-3 seg-1 quando determinado pelo método de afinidade descrito no Exemplo 22 deste documento, e uma avidez inferior a 5 nM, tal como inferior a 1 nM, p. inferior a 0,2 nM quando determinado pelo método de avidez aqui descrito no Exemplo 22.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com outra porção, como uma porção citotóxica, um radioisótopo ou uma droga.
9. Molécula biespecífica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e uma segunda especificidade de ligação, tal como uma especificidade de ligação a uma célula efetora humana, um receptor Fc humano ou um receptor de células T.
10. Célula hospedeira procariótica recombinante caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
11. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou uma molécula biespecífica como definida na reivindicação 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou uma molécula biespecífica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento.
13. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou de uma molécula biespecífica como definida na reivindicação 9 caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de câncer.
14. Método para a produção de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, e b) purificação do anticorpo a partir do meio de cultura.
15. Composição de diagnóstico caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
16. Método para detectar a presença de fator de tecido em uma amostra in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende: - contatar a amostra IN VITRO com um anticorpo como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou uma molécula biespecífica como definida na reivindicação 9, em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou moléculas biespecíficas e o fator de tecido; e - analisar se um complexo foi formado.
17. Kit para detectar a presença de fator de tecido em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende - anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou uma molécula biespecífica como definida na reivindicação 9; e - instruções de uso do kit.
18. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado pelo fato de que se liga a qualquer anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-7.
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