ES2603613T3

ES2603613T3 - Inhibidores de quinasa y su uso en el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2603613T3
Application number: ES11764988.9T
Authority: ES
Inventors: Peter Brent Sampson; Yong Liu; Sze-Wan Li; Bryan T. Forrest; Heinz W. Pauls; Louise G. Edwards; Miklos Feher; Narendra Kumar B. Patel; Radoslaw Laufer; Guohua Pan
Original assignee: University Health Network; University of Health Network
Current assignee: University Health Network; University of Health Network
Priority date: 2010-04-06
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2017-02-28
Anticipated expiration: 2031-04-06
Also published as: CY1118610T1; US20140045838A1; AU2011238384B2; PT2556071T; IL221556A; US20180282306A1; WO2011123947A1; HRP20161498T1; TW201134471A; US20110263598A1; US20130096301A1; US9579327B2; ES2639757T3; US10077255B2; EP2556070B1; CN102892766B; MX2012011516A; LT2556071T; EA201270752A1; JP2013523784A

Abstract

Un compuesto representado por la fórmula estructural siguiente:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: Ra es -F, metoxi, metilo o etilo; R4 es -H o metilo; y R6 es -CH>=CH-(fenilo sustituido opcionalmente), en donde el fenilo en -CH>=CH-(fenilo) está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, (aminoalquilo C1-6), (alquilamino C1-6)alquilo C1-6, (fenil)alquilo C1-6, amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1-6, -(CH2)0-3-N-piperidinilo, -(CH2)0-3-N-morfolinilo, -(CH2)0-3-N-pirrolidinilo, -(CH2)0-3-Npiperazinilo y -(CH2)0-3-N-oxazepanilo, en donde el N-piperazinilo está sustituido opcionalmente en N' con alquilo C1-6 o acilo C1-6.

Description

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-NR21C(O)OR21, -OC(O)N(R21)2, -NR21C(O)N(R21)2, -NRC(O)ON(R)2, -NR21SO2N(R21)2, -OR21, -SR21, haloalcoxi C110, -C(O)R21, -C(O)OR21 y -OC(O)R21; o

iii) (alquileno C0-10)-Ar1, (alquenileno C2-10)-Ar1, en donde Ar1 es un grupo arilo C6-14 o un grupo heteroarilo de 5-14 miembros, cada uno sustituido opcionalmente e independientemente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, nitro, ciano, alquilo C1-10, haloalquilo C1-10, (haloalcoxi C1-10)alquilo C1-10, (alcoxi C1-10)alquilo C1-10, hidroxialquilo C1-10, aminoalquilo C1-10, (alquilamino C1-10)alquilo C1-10, (dialquilamino C1-10)alquilo C1-10, -N(R21)2, -C(O)N(R21)2, -C(O)N(R21)2, -NR21C(O)R21, -SO2R22, -SO2N(R21)2, -NR21SO2R22, -NR21C(O)N(R21)2, -NRC(O)ON(R)2, -NR21SO2N(R21)2, -OR21, -SR21, haloalcoxi C1-10, -C(O)R21, -C(O)OR21, OC(O)R21, fenilo y heteroarilo de 5-6 miembros, en donde dicho fenilo y dicho heteroarilo de 5-6 miembros están cada uno sustituido independientemente y opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, nitro, ciano, amino, alquilo C1-3, haloalquilo C1-3, alcoxi C1-3 y haloalcoxi C1-3;

cada R1 es independientemente:

i) hidrógeno;

ii) un grupo arilo C6-14 o un grupo heteroarilo de 5-14 miembros, cada uno sustituido opcionalmente e independientemente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, -NO2, -CN, -NCS, alifático C1-C10, (alquileno C1-10)-Ar10, (alquenileno C2-10)-Ar10, -C(O)OR10, -C(O)R10, -C(S)R10, -OC(O)R10, -C(O)N(R11)2, -C(S)N(R11)2, -OC(O)N(R11)2, -S(O)R12, -S(O)2R12, -SO3R12, -SO2N(R11)2, -OR10, -SR10, -N(R11)2, -NR11C(O)R10, -NR11S(O)R12, -NR11C(O)OR12, -N(R11)C(O)N(R11)2, -NR11SO2N(R11)2 y -NR11SO2R12; o

iii) un grupo alifático C1-10 sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, -NO2, -CN, -NCS, Ar10, -C(O)OR10, -C(O)R10, -C(S)R10, -OC(O)R10, -C(O)N(R11)2, -C(S)N(R11)2, -OC(O)N(R11)2, -S(O)R12, -S(O)2R12, -SO3R12, -SO2N(R11)2, -OR10, -SR10, -N(R11)2, -NR11C(O)R10, -NR11S(O)R12, -NR11C(O)OR12, -N(R11)C(O)N(R11)2, -NR11SO2N(R11)2 y -NR11SO2R12,

siempre que R1 sea diferente de hidrógeno cuando el sustituyente es -S(O)R1, -S(O)2R1, -SO3R1, -NR2S(O)R1 o -NR2SO2R1; y

cada R2 es independientemente –H o alquilo C1-C6 o, considerados en conjunto con NR1, forman un grupo heterocíclico no aromático sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en =O, =S, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1-6, aminoalquilo C1-6, (alquilamino C1-6)alquilo C1-6, (dialquilamino C1-6)alquilo C1-6, (fenil)alquilo C1-6, (heteroarilo de 5-6 miembros)alquilo C1-6, alcoxi C1-6, haloalcoxi C1-6, alquilcarboniloxi C1-6, alcoxicarbonilo C1-6, alquilcarbonilo C1-6, fenilo y heteroarilo de 5-6 miembros;

i) hidrógeno;

ii) un grupo arilo C6-14 o un grupo heteroarilo de 5-14 miembros, cada uno sustituido opcionalmente e independientemente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, nitro, ciano, hidroxi, alquilo C1-10, haloalquilo C1-10, (haloalcoxi C1-10)alquilo C1-10, (alcoxi C1-10)alquilo C1-10, hidroxialquilo C1-10, aminoalquilo C1-10, (alquilamino C1-10)alquilo C1-10, (dialquilamino C1-10)alquilo C1-10, (fenil)alquilo C1-10, (heteroarilo de 5-6 miembros)alquilo C1-10, amino, alquilamino C1-10, dialquilamino C1-10, alcoxi C1-10, haloalcoxi C1-10, alquilcarboniloxi C1-10, alcoxicarbonilo C1-10 y alquilcarbonilo C1-10; o

iii) un grupo alquilo C1-10 sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, nitro, ciano, hidroxi, haloalquilo C1-10, alcoxi C1-10, haloalcoxi C1-10, amino, alquilamino C1-10, dialquilamino C1-10, alquilcarboniloxi C1-10, alcoxicarbonilo C1-10, alquilcarbonilo C1-10 y fenilo, estando dicho fenilo sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, nitro, ciano, amino, alquilo C1-3, haloalquilo C1-3, alcoxi C1-3 y haloalcoxi C1-3;

cada R11 es independientemente R10, -CO2R10, -SO2R10 o -C(O)R10, o -N(R11)2 considerado en conjunto es un grupo heterocíclico no aromático sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en =O, =S, halógeno, nitro, ciano, hidroxi, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1-6, aminoalquilo C1-6, (alquilamino C1-6)alquilo C1-6, (dialquilamino C1-6)alquilo C1-6, alcoxi C1-6, haloalcoxi C1-6, alquilcarboniloxi C1-6, alcoxicarbonilo C1-6 y alquilcarbonilo C1-6; y

cada R12 es independientemente R10, siempre que R12 no sea hidrógeno;

cada R21 es independientemente hidrógeno, alquilo C1-6, fenilo o heteroarilo de 5-6 miembros, en donde cada uno de los grupos fenilo y heteroarilo representados por R21 está sustituido independientemente y opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, nitro, ciano, amino, alquilo C1-3, haloalquilo C1-3, alcoxi C1-3 y haloalcoxi C1-3, y en donde el grupo alquilo representado por R21 está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, nitro, ciano, amino, alquilo C1-3, haloalquilo C1-3, alcoxi C1-3 y haloalcoxi C1-3; o

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sobre la dosificación requerida para tratar efectivamente a un sujeto que padece cáncer, y estos factores incluyen, pero no están limitados a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes.

Además, un régimen de “tratamiento” de un sujeto con una cantidad efectiva del compuesto de la presente invención puede consistir en una única administración, o alternativamente comprende una serie de aplicaciones. Por ejemplo, el compuesto de la presente invención puede administrarse al menos una vez por semana. Sin embargo, en otro aspecto, el compuesto puede administrarse al sujeto de aproximadamente una vez por semana a una vez diariamente para un tratamiento dado. La duración del período de tratamiento depende de una variedad de factores, tales como la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, la concentración y la actividad de los compuestos de la presente invención, o una combinación de los mismos. También se apreciará que la dosificación efectiva del compuesto usado para el tratamiento o profilaxis puede incrementarse o disminuirse durante el curso de un régimen de tratamiento o profilaxis particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar y llegar a ser evidentes mediante ensayos de diagnóstico estándar conocidos en la técnica. En algunos casos, puede requerirse administración crónica.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término “tratamiento” es una estrategia para obtener resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no están limitados a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, reducción de la probabilidad de diseminación de la enfermedad, demora o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o alivio del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total) de la enfermedad, ya sea detectable o no detectable. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe el tratamiento. “Tratamiento” también incluye reducir la probabilidad de que se desarrolle la enfermedad

o reducir la probabilidad de recidiva de la enfermedad.

Un “sujeto” es un mamífero, preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un animal que necesita de tratamiento veterinario, por ejemplo, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos, y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas, y similares).

En un aspecto, la presente invención se refiere a una monoterapia, en donde las composiciones farmacéuticas de la invención se administran solas. Por consiguiente, en este aspecto, el compuesto de la invención es el único ingrediente farmacéuticamente activo en las composiciones farmacéuticas, o el único ingrediente farmacéuticamente activo administrado al sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere a una co-terapia con uno o más de otros fármacos terapéuticamente activos

o terapias conocidas en la técnica para tratar las enfermedades o indicaciones deseadas. En un ejemplo, una o más de otras terapias anticancerosas o anti-proliferativas se combinan con los compuestos de la invención. En otro ejemplo, los compuestos descritos en la presente memoria se co-administran con uno o más de otros fármacos anticancerosos conocidos en la técnica. Las terapias anticancerosas que pueden usarse en combinación con el compuesto de la invención incluyen cirugía, radioterapia (que incluye, pero no está limitada a, radiación gamma, radioterapia con haz de neutrones, radioterapia con haz de electrones, terapia con protones, braquiterapia e isótopos radiactivos sistémicos) y terapia endocrina. Los agentes anticancerosos que pueden usarse en combinación con los compuestos de la invención incluyen modificadores de la respuesta biológica (que incluyen, pero no están limitados a, interferones, interleuquinas y factor de necrosis tumoral (TNF), hipertermia y crioterapia, agentes que atenúan cualquier efecto adverso (por ejemplo, antieméticos), y otros fármacos quimioterapéuticos aprobados (por ejemplo, taxol y análogos de mismo).

Cuando los compuestos de la invención se combinan con otros fármacos anticancerosos, pueden administrarse contemporáneamente. Tal y como se usa en la presente memoria, el término “administradas contemporáneamente” significa que dos sustancias se administran a un sujeto, de modo que ambas son biológicamente activas en el sujeto al mismo tiempo. Los detalles exactos de la administración dependerán de la farmacocinética de las dos sustancias, una en presencia de la otra, y pueden incluir administrar una sustancia dentro de un período de tiempo de alguna otra, por ejemplo, 24 horas de administración de la otra, si las farmacocinéticas son adecuadas. Los diseños de los regímenes de dosificación adecuados son rutinarios para un experto en la técnica. En aspectos particulares, dos sustancias se administrarán sustancialmente simultáneamente, es decir, dentro de minutos de la otra, o en una única composición que comprenda ambas sustancias. Alternativamente, los dos agentes pueden administrarse por separado, de modo que sólo uno sea biológicamente activo en el sujeto al mismo tiempo.

Los compuestos de la invención pueden administrarse a un paciente en una variedad de formas, dependiendo de la ruta de administración seleccionada, como lo entenderán los expertos en la técnica. Los compuestos de la invención pueden administrarse, por ejemplo, mediante administración oral, parenteral, bucal, sublingual, nasal, rectal, por medio de parche, bomba, o transdérmica, y las composiciones farmacéuticas pueden formularse en consecuencia. La administración parenteral incluye modos de administración intravenoso, intraperitoneal, subcutáneo, intramuscular, transepitelial, nasal, intrapulmonar, intratecal, rectal, y tópico. La administración parenteral puede ser mediante infusión continua durante un período de tiempo seleccionado.

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% de e.e.: % de exceso enantiomérico

Et2O: éter dietílico

Et3N: trietilamina

EtOAc: acetato de etilo

EtOH: etanol

h: horas

Hex: hexano

AcOH: ácido acético

HPLC: cromatografía de líquidos de alto rendimiento

LC-MS: cromatografía de líquidos acoplada a espectroscopía de masa

MeCN: acetonitrilo

MeOH: metanol

min: minutos

MsCl: cloruro de metanosulfonilo

MS ESI: espectro de masa, ionización por electropulverización

RMN: resonancia magnética nuclear

O/N: durante la noche

Pd(OAc)2: acetato de paladio

PPh3: trifenilfosfina

prepHPLC: cromatografía de líquidos de alta presión de escala preparativa

prepTLC: cromatografía en capa fina de escala preparativa

RBF: matraz de fondo redondo

rt: temperatura ambiente

saturado: saturado

SEM: 2-(trimetilsilil)etoxi)metilo

tBuOOH: hidroperóxido de terc-butilo

TBAF: fluoruro de tetrabutilamonio

tBuOK: terc-butóxido de potasio

temp.: temperatura

THF: tetrahidrofurano

% en peso: porcentaje en peso

Preparación de materiales de partida Síntesis de 5-metoxioxindol

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bajo un balón de oxígeno (sin purga). No ocurrió más conversión, y de esta manera se añadió más KOtBu (20,0 g, 178 mmoles). La captación de oxígeno fue inmediatamente evidente, sugiriendo que este gran exceso de base se requiere para una desprotección efectiva. Después de otras 5 h, la mezcla se vertió en NH4Cl ac. sat. (100 mL). La mayor parte del THF se eliminó bajo presión reducida, y la mezcla resultante se extrajo con porciones de EtOAc (4 x 5 50 mL). Las porciones orgánicas combinadas se lavaron con tiosulfato de sodio ac. sat. (50 mL) y salmuera (50 mL), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se suspendió en CH2Cl2 (100 mL) y se vertió sobre una almohadilla de sílice corta (2 cm de profundidad x 5 cm de diámetro) bajo succión. El subproducto principal (Rf de 0,6 en 1:1 de EtOAc/ciclohexano, Rf de 0,15 en CH2Cl2) se eluyó usando CH2Cl2 (aproximadamente 1 L). El producto (Rf de 0,25 en 1:1 de EtOAc/ciclohexano) se eluyó usando MeOH/EtOAc al 2% después al 5%. 10 Una impureza co-eluyó con el producto, como la última incorrectamente “alterada”. La concentración de las fracciones que contenían el producto rindió el compuesto del título (2,5 g, 64%) como un sólido marrón pálido, contaminado con un segundo compuesto que contenía ciclopropano (<10%; posiblemente un compuesto monobencilado). La HPLC indicó una pureza óptica de 94% de e.e. (aunque se sospecha la presencia de una impureza que co-eluye), con el enantiómero principal (1R,2S) eluyendo a

15 14,3 min (Daicel Chiralpak AS-H (250 x 4,6 mm); isocrático EtOH al 40% en n-heptano; 1 mL/min; 35°C; detección: 254, 230, 210 nm). A partir del estándar de referencia racémico, el tiempo de retención del enantiómero (1S,2R) fue 9,9 min usando este método. Los datos analíticos fueron idénticos a los obtenidos en el ejemplo A2.

Ejemplo A5. (1R*,2R*)-2-(1H-indazol-6-il)espiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona

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20 El diastereómero menor de la reacción del ejemplo A2 se aisló como un sólido de color beige (3,5 mg, 2%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,97 (s, 1H), 10,33 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,99 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,41 (s, 1H), 7,18-7,12 (m, 2H), 6,99-6,94 (m, 2H), 6,86 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 8,3 Hz), 2,27-2,23 (m, 1H), 2,18-2,15 (m, 1H); MS ESI 276,1 [M + H]+, calculado para [C17H13N3O+ H]+ 276,3.

Ejemplo A6. (1R*,2S*)- y(1R*,2R*)-2-(3-yodo-1H-indazol-6-il)-5'-metoxiespiro-[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona

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A una disolución de NaH (380 mg, 9,5 mmoles) en DMF (8 mL) a 0°C, se añadió yoduro de trimetilsulfoxonio (694 mg, 3,15 mmoles). La mezcla resultante se agitó a rt durante 30 min, seguido de la adición de (E/Z)-3-((3-yodo-1Hindazol-6-il)metilen)-5-metoxiindolin-2-ona (658 mg, 1,6 mmoles, relación E/Z de 84:16) en DMF (2 mL). La mezcla de reacción se agitó a rt durante 18 h. La reacción se enfrió hasta 0°C y se paró con NH4Cl saturado. La mezcla se 30 extrajo con EtOAc, y los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron, para proporcionar un aceite viscoso amarillo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de gel de sílice (95:5 CH2Cl2/MeOH) para rendir un sólido amarillo, el cual se trituró entonces con una mezcla 1:1 de hexanos y EtOAc, para proporcionar el compuesto del título como un polvo blanco (471 mg, 69%). Se obtuvo una mezcla de diastereómeros (7:1 mediante RMN). En operaciones repetidas, la relación de los diastereómeros varió de

35 6:1 a 10:1 en favor del diastereómero 1R*,2S*. El material se usó sin más purificación como un intermedio para reacciones posteriores. Alternativamente, el material se recristalizó a partir de metanol para rendir el compuesto del título como una mezcla 12:1 en favor del diastereómero 1R*,2S*. Datos analíticos para el isómero principal: 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 13,48 (s, 1H), 10,43 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,33 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,74 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,57 (dd, J = 8,4 Hz, J = 2,4 Hz, 1H), 5,62 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,29 (s, 3H), 3,18 (t, J = 8,2

40 Hz, 1H), 2,34 (dd, J = 7,8 Hz, J = 4,6 Hz, 1H), 1,98 (dd, J = 9,2 Hz, J = 4,8 Hz, 1H); MS ESI 432,1 [M + H]+, calculado para [C18H14IN3O2 + H]+ 432,0.

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5,4 mmoles, 2 eq.), seguido de Pd(PtBu3)2 (14 mg, 0,027 mmoles, 1% en moles). La mezcla resultante se purgó con argón y entonces se tapó y se calentó a 80°C (temperatura del aceite) durante 2 h. Después de enfriamiento hasta rt, se paró con NaHCO3 sat. (10 mL), H2O (10 mL), se extrajo con EtOAc (30 mL x 2) y se secó (Na2SO4). Después de la evaporación de los disolventes, el residuo se purificó mediante un sistema de columna Biotage (gradiente de

5 EtOAc/hex: 0-100%), para proporcionar (E)-4-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenetil)morfolina como un sólido blanco (714 mg, 77%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3)  7,42 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 19,0 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 6,13 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 3,75 (t, J = 4,4 Hz, 4H), 2,84-2,77 (m, 2H), 2,63-2,56 (m, 2H), 2,53 (br, pseudo s, 4H), 1,32 (s, 12H).

B. Síntesis de (1R,2S)-5'-metoxi-2-(3-(4-(2-morfolinoetil)estiril)-1H-indazol-6-il)espiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona

10 A una mezcla de (1R,2S)-2-(3-yodo-1H-indazol-6-il)-5'-metoxiespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona (172 mg, 0,4 mmoles) y (E)-4-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenetil)morfolina (138 mg, 0,4 mmoles) en PhCH3/EtOH (8 mL/4 mL) en un vial de microondas de 20 mL, se añadió Na2CO3 1M (0,8 mL, 0,8 mmoles), seguido de Pd(PPh3)4 (23 mg, 0,02 mmoles, 5% en moles). La mezcla resultante se purgó con argón, y entonces se calentó en el microondas durante 2 h a 125°C. Después de enfriamiento hasta rt, la mezcla se diluyó con H2O (20 mL), se

15 extrajo con EtOAc (30 mL x 2) y se secó (Na2SO4). Después de la eliminación de los disolventes, el residuo se redisolvió en DMF (4 mL) y se purificó mediante HPLC preparativa, para proporcionar el compuesto del título (sal de TFA, 115 mg, 45%) como un sólido amarillo pálido. 1H RMN (400 MHz, CD3OD)  7,90 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,43 (s, 1H), 7,37 (d, J = 6,4 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,57

20 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,57 (s, 1H), 4,06 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,80 (t, J = 11,2 Hz, 2H), 3,56 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,38 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 3,27-3,12 (m, 5H), 3,07 (t, 2H), 2,20-2,10 (m, 2H); MS ESI 521,4 [M + H]+, calculado para [C32H32N4O3 + H]+ 521,2.

Ejemplo A54. 4-((E)-2-(6-((1R*,2S*)-2'-oxoespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2-il)-1H-indazol-3-il)vinil)benzonitrilo

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25 A. 6-formil-1H-indazol-3-carbonitrilo

A una disolución de 3-yodo-1H-indazol-6-carbaldehído (3 g, 10,8 mmoles) en DMF (25 mL), se añadió cianuro de cobre (1,9 g, 21 mmoles). La disolución se calentó mediante irradiación de microondas a 185°C durante 10 min. Se añadió agua (100 mL), y se recogió un precipitado blanco. El precipitado se disolvió en EtOAc (250 mL), se lavó con agua

30 (2 x 25 mL), se secó sobre MgSO4 y se concentró, para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (1,1 g, 73%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 14,92 (bs, 1H), 10,17 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,06 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8,5 Hz, 1H).

B. (E)-6-((2-oxoindolin-3-iliden)metil)-1H-indazol-3-carbonitrilo

A una mezcla de 6-formil-1H-indazol-3-carbonitrilo (1,10 g, 6,4 mmoles) y 2-oxindol (871 mg, 6,5 mmoles) en EtOH

35 (25 mL), se añadió piperidina (0,1 mL, 1 mmol). La mezcla resultante se puso a reflujo (temperatura del aceite, 75°C) durante 90 min, y entonces se enfrió hasta rt. El precipitado resultante se recogió mediante filtración con succión y se secó, para proporcionar el compuesto del título como un sólido anaranjado (1,5 g, 82%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 14,6 (s, 1H), 10,66 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 8,01 (d, J = 8,5 Hz, 1H) 7,78 (s, 1H), 7,67 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,48 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,24 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,83 (t, J = 7,8 Hz, 1H).

40 C. 6-((1R*,2S*)-2'-oxoespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2-il)-1H-indazol-3-carbonitrilo

El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A1, usando (E)-6-((2-oxoindolin-3-iliden)metil)-1Hindazol-3-carbonitrilo (1,5 g, 5,2 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (1,3 g, 83%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,73 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,18 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,08-7,04 (m, 1H), 6,94 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,58 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 5,93 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,38-3,34 (m, 1H), 2,27-2,18 (m, 1H).

45 D. 6-((1R*,2S*)-2'-oxoespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2-il)-1H-indazol-3-carbaldehído

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El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A6, excepto sustituyendo (E)-3-((3-yodo-1H-indazol6-il)metilen)-1-metilindolin-2-ona (545 mg, 1,36 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como una mezcla

9:1 de diastereómeros (405 mg, 72%); MS ESI 416,0 [M + H]+, calculado para [C18H14IN3O + H]+ 416,03.

C. 2,2,2-trifluoroacetato de (1R*,2S*)-(E)-1'-metil-2-(3-(4-(morfolinometil)estiril)-1H-indazol-6-il)espiro[ciclopropan5 1,3'-indolin]-2'-ona

El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A45 en el documento WO2010/115279, excepto sustituyendo (1R*,2S*)-2-(3-yodo-1H-indazol-6-il)-1'-metilespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona (30 mg, 0,072 mmoles) y (E)-4-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)bencil)morfolina (31 mg, 0,094 mmoles). Después de acoplamiento de Suzuki, el disolvente se eliminó y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa,

10 para proporcionar el compuesto del título (16 mg, 45%); 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,54-7,46 (m, 5H), 7,14 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 6,64 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,38 (s, 2H), 4,08-4,04 (m, 2H), 3,75-3,69 (m, 2H), 3,43-3,34 (m, 6H), 3,27-3,19 (m, 2H), 2,29– 2,25 (m, 1H), 2,22-2,18 (m, 1H); MS ESI [M + H]+ 491,3, calculado para [C31H30N4O2 + H]+ 491,24.

Ejemplo A89. 2,2,2-Trifluoroacetato de (1R*,2S*)-(E)-1'-metil-2-(3-(4-(piperazin-1-il)estiril)-1H-indazol-6-il)espiro 15 [ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona

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A. 4-(4-etinilfenil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo

Un vial de microondas se cargó con 4-(4-yodofenil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (300 mg, 0,773 mmoles), trimetilsililacetileno (0,22 mL, 1,54 mmoles), NEt3 (3,0 mL), DMF (1,5 mL), CuI (15 mg, 0,080 mmoles) y

20 PdCl2(PPh3)2 (27 mg, 0,039 mmoles). El vial se tapó y se calentó en el microondas a 100°C durante 1 h. Después de eliminar el NEt3 en vacío, el residuo se extrajo con EtOAc (15 mL). La capa orgánica se lavó entonces con NaHCO3 (sat.) (5 mL), H2O (5 mL), salmuera (5 mL), y entonces se secó sobre MgSO4. El disolvente se eliminó, y entonces el material se

25 disolvió en MeOH (4 mL) y THF (2 mL). Se añadió K2CO3 (1,0 mL de una disolución 1 M), y la reacción se agitó durante 3 h. El disolvente se eliminó, y el residuo se extrajo con EtOAc (15 mL). La capa orgánica se lavó con salmuera (5 mL) y entonces se secó sobre MgSO4. El disolvente se eliminó y el producto se secó bajo alto vacío, para proporcionar el compuesto del título como un sólido marrón (212 mg, 96%); MS ESI 287,0 [M + H]+, calculado para [C17H22N2O2 + H]+ 287,18.

30 B. 4-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenil)-piperazin-1-carboxilato de (E)-terc-butilo

El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A42A, excepto sustituyendo 4-(4etinilfenil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (212 mg, 0,740 mmoles) para proporcionar, después de cromatografía en columna (gel de sílice, hexanos/EtOAc, 6:1 a 5:1), el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (137 mg, 45%); MS ESI 415,3

35 [M + H]+, calculado para [C23H35BN2O4 + H]+ 415,28.

C. 2,2,2-trifluoroacetato de (1R*,2S*)-(E)-1'-metil-2-(3-(4-(piperazin-1-il)estiril)-1H-indazol-6-il)espiro[ciclopropan-1,3'indolin]-2'-ona

El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A45 en el documento WO2010/115279, excepto sustituyendo (1R*,2S*)-2-(3-yodo-1H-indazol-6-il)-1'-metilespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona (37 mg, 0,090

40 mmoles) y 4-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenil)piperazin-1-carboxilato de (E)-terc-butilo (45 mg, 0,109 mmoles). El disolvente se eliminó, y la amina protegida con Boc se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice, CH2Cl2/MeOH, 95:5), para proporcionar un producto impuro el cual se disolvió en CH2Cl2 (2,0 mL), y se añadió TFA (200 µL). La reacción se agitó durante 2 h, el disolvente se eliminó y el residuo se purificó

45 mediante HPLC preparativa, para proporcionar el compuesto del título como un polvo blanquecino (2,0 mg, 4,0%); 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,97 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,46-7,41 (m, 2H), 7,30 (d, J = 17 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,06-6,99 (m, 4H), 6,65 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,49-3,44 (m,

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4,52 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (452 mg, 79%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,09 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 3,54 (s, 2H), 2,26 (s, 6H); MS ESI 249,9 [M + H]+, calculado para [C9H10BrF2N + H]+ 249,0.

b. 1-(4-etinil-2,6-difluorofenil)-N,N-dimetilmetanamina

Una mezcla de 1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-N,N-dimetilmetanamina (0,45 g, 1,79 mmoles), trimetilsililacetileno (0,356 mL, 2,24 mmoles), Pd(PPh3)2Cl2 (50,49 mg, 0,071 mmoles), CuI (3,42 mg, 0,017 mmoles) y DIPEA (0,46 mL, 2,69 mmoles) en DMF (3,0 mL), se selló bajo atmósfera de argón y se calentó con agitación bajo irradiación de microondas a 100°C durante 2 h. La reacción se diluyó con metanol (9 mL), y el precipitado resultante se retiró por filtración. El licor madre se concentró bajo vacío a 45°C/75 mbares, para proporcionar un aceite espeso marrón. El residuo se purificó sobre Biotage usando una columna SNAP de 25 g con gradiente de hexano:acetato de etilo (100 a 80:20), para proporcionar un aceite amarillo como un éter de trimetilsililo (0,250 g, 52%); MS ESI 268,0 [M + H]+,calculado para [C14H19F2NSi + H]+ 268,13.

La desprotección del éter de trimetilsililo anterior se llevó a cabo en metanol (10 mL) y disolución de K2CO3 al 10% (1,67 mL) a rt durante 1,5 h. Los disolventes se eliminaron en vacío por debajo de 40°C, y entonces se añadió agua (5 mL) a temperatura ambiente. El producto se extrajo usando diclorometano (2 x 15 mL), y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio. El disolvente se eliminó bajo vacío a 40°C/200 mbares, para proporcionar un aceite parduzco, el cual se purificó sobre Biotage usando una columna SNAP de 25 g con gradiente de hexano:acetato de etilo (100 a 75:75), para proporcionar un aceite amarillo (98 mg, 54%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,04 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 3,68 (s, 2H), 3,17 (s, 1H), 2,35 (s, 6H); MS ESI 195,8 [M

+: H]+, calculado para [C11H11F2N + H]+ 195,09.

c.: (E)-1-(2,6-difluoro-4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenil)-N,N-dimetilmetanamina

Según el procedimiento para la síntesis del ejemplo A42A, usando 1-(4-etinil-2,6-difluorofenil)-N,Ndimetilmetanamina (97 mg, 0,496 mmoles) y 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (0,21 mL, 1,488 mmoles), para proporcionar el compuesto del título después de purificación sobre Biotage usando una columna SNAP KPNH de 25 g con gradiente de hexano:acetato de etilo (100 a 50:50), como un semisólido marrón (67 mg, 41%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,24 (d, J = 18,4 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 6,13 (d, J = 18,4 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 2,28 (s, 6H), 1,32 (s, 12H); MS ESI 324,2 [M + H]+, calculado para [C17H24BrF2NO2 + H]+ 323,19.

Método 2

a. (E)-2,6-difluoro-4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il) vinil)benzaldehído

Según el procedimiento para la síntesis del ejemplo A51A, usando 4-bromo-2,6-difluorobenzaldehído (1,10 g, 4,98 mmoles) y 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1,3,2-dioxaborolano (0,97 mL, 5,72 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (1,10 g, 76%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 10,31 (s, 1H), 7,05 (d, J = 9,6 Hz, 2H), 7,22 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 1,33 (s, 12H); MS ESI 295,1 [M + H]+, calculado para [C15H17BF2O3 + H]+ 295,13.

b. (E)-1-(2,6-difluoro-4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenil)-N,N-dimetilmetanamina

Según el procedimiento para la síntesis del ejemplo A211A, usando (E)-2,6-difluoro-4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2dioxaborolan-2-il)vinil)benzaldehído (1,10 g, 3,74 mmoles), triacetoxiborohidruro de sodio (1,19 g, 5,61 mmoles) y disolución de dimetilamina 2M (3,74 mL, 7,48 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un aceite espeso incoloro (0,571 g, 47%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,24 (d, J = 18,4 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 6,13 (d, J = 18,4 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 2,28 (s, 6H), 1,32 (s, 12H); MS ESI 324,2 [M + H]+, calculado para [C17H24BrF2NO2

+: H]+ 323,19.

B.: 2,2,2-trifluoroacetato de (1R,2S)-2-(3-(4-((dimetilamino)metil)-3,5-difluoroestiril)-1H-indazol-6-il)-5'-metoxiespiro [ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona

El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A51B, usando (1R,2S)-2-(3-yodo-1H-indazol-6-il-)5'-metoxiespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona (500 mg, 1,15 mmoles) y (E)-1-(2,6-difluoro-4-(2-(4,4,5,5-tetrametil1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)fenil)-N,N-dimetilmetanamina (393,4 mg, 1,21 mmoles). La purificación mediante HPLC preparativa, proporcionó el compuesto del título como un sólido de color crema (400 mg, 56,1%). Los datos espectrales fueron idénticos a los obtenidos en el ejemplo A215.

Rotación óptica: [α]22D = -88° (c 0,354, metanol).

Ejemplo A217. 2,2,2-Trifluoroacetato de (1R*,2S*)-(E)-2-(3-(3,5-difluoro-4-(morfolinometil)estiril-1H-indazol-6-il)-5'metoxiespiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona

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Según el procedimiento para la síntesis del ejemplo A216A, método 1b, usando N-(4-bromo-2,6-difluorobencil-)Netiletanamina (660 mg, 2,37 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un aceite marrón claro (252 mg, 48%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,99 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 3,67 (s, 2H), 3,13 (s, 1H), 2,57-2,51 (m, 4H), 1,08 (t, J = 7,2 Hz, 6H); MS ESI 224,0 [M + H]+, calculado para [C13H15F2N + H]+ 224,12.

C: (E)-N-(2,6-difluoro-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)vinil)bencil)N-etiletanamina

Según el procedimiento para la síntesis del ejemplo A42A, usando N-etil-N-(4-etinil-2,6-difluorobencil)etanamina (252 mg, 1,12 mmoles) y 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (0,493 mL, 3,36 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un semi-sólido de color crema (410 mg, 90%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,24 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 6,12 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H), 2,58-2,52 (m, 4H), 1,32 (s, 12H), 1,08 (t, J = 6,8 Hz, 6H); MS ESI 352,2 [M + H]+, calculado para [C27H26N6O2 + H]+ 351,22.

Este intermedio también puede prepararse mediante el siguiente método:

Según el procedimiento para la síntesis del ejemplo A211A, usando (E)-2,6-difluoro-4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2dioxaborolan-2-il)vinil)benzaldehído (1,10 g, 3,74 mmoles), triacetoxiborohidruro de sodio (1,19 g, 5,61 mmoles) y dietilamina (0,58 mL, 5,61 mmoles), para proporcionar el compuesto del título como un sólido de color crema (0,54 g, 41%).

C. 2,2,2-trifluoroacetato de (1R,2S)-2-(3-(4-((dietilamino)metil)-3,5-difluoroestiril)-1H-indazol-6-il)espiro[ciclopropan1,3'-indolin]-2'-ona

El compuesto del título se sintetizó según el método del ejemplo A51B, usando (1R,2S)-2-(3-yodo-1H-indazol-6-il-)espiro[ciclopropan-1,3'-indolin]-2'-ona (125 mg, 0,311 mmoles) y (E)-N-(2,6-difluoro-(4-(2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2dioxaborolan-2-il)vinil)bencil)-N-etiletanamina (131,4 mg, 0,373 mmoles). La purificación mediante HPLC preparativa, proporcionó el compuesto del título como un sólido de color crema (54 mg, 28,4%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,98 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 16,4 Hz, 1H), 7,55-7,45 (m, 4H), 7,04 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,55 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 5,96 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,35-3,28 (m, 5H), 2,24-2,21 (m,1H), 2,19-2,15 (m, 1H), 1,42 (t, J = 6,8 Hz, 6H); MS ESI 499,4 [M + H]+, calculado para [C30H28F2NO4 + H]+ 499,23.

Rotación óptica: [α]22D = -126° (c 0,46, metanol).

Ejemplo B: ensayo de inhibición de PLK4

Se purificó PLK4 activa a partir de un sistema de expresión de E. coli como una fusión de GST amino terminal de los residuos 1-391 de PLK4 humana. La proteína se purificó a partir de extractos de células clarificados después de inducción a 15°C durante la noche, usando cromatografía de permeación de gel de glutatión sefarosa e intercambio iónico (Resource Q). La proteína resultante se desfosforiló con fosfatasa lambda (NEB, No. de catálogo P0753), y se resolvió de la fosfatasa usando glutatión sefarosa. La fusión GST-PLK4 desfosforilada se almacenó en alícuotas a 80°C hasta su uso.

Se midió la actividad de PLK4 usando un sistema de detección de ELISA indirecto. Se incubó GST-PLK4 (4 nM) desfosforilada en presencia de ATP 15 µM (Sigma, No. de catálogo A7699), HEPES-Na2+ 50 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM, Brij 35 al 0,01% (Sigma, No. de catálogo 03-3170), en una placa de microtitulación de 96 pocillos pre-recubierta con MBP (Millipore, No. de catálogo 30-011). Se dejó que la reacción procediera durante 30 minutos, seguida de 5 lavados de la placa con tampón de lavado (TRIS-Cl 50 mM, pH 7,4 y Tween 20 al 0,2%), e incubación durante 30 minutos con una dilución 1:3.000 de anticuerpo primario (Cell Signaling, No. de catálogo 9381). La placa se lavó 5 veces con tampón de lavado, se incubó durante 30 minutos en presencia de anticuerpo secundario acoplado con peroxidasa de rábano picante (BioRad, No. de catálogo 1721019, concentración 1:3.000), se lavó otras 5 veces con tampón de lavado, y se incubó en presencia de substrato TMB (Sigma, No. de catálogo T0440). Se dejó que la reacción colorimétrica continuara durante 5 minutos, seguida de la adición de disolución de parada (ácido sulfúrico 0,5 N), y se cuantificó por detección a 450 nm bien con un lector de placa monocromático o basado en filtro (M5 de Molecular Devices, o DTX880 de Beckman, respectivamente).

Se determinó la inhibición del compuesto bien a una concentración fija (10 μM), o a una concentración variable del inhibidor (típicamente 50 μM a 0,1 μM en una titulación de respuesta a la dosis de 10 puntos). Los compuestos se pre-incubaron en presencia de la enzima durante 15 minutos antes de la adición de ATP, y se cuantificó la actividad remanente usando el ensayo de actividad descrito anteriormente. El % de inhibición de un compuesto se determinó usando la siguiente fórmula: % de inhibición = 100 x (1 – (valor experimental – valor de fondo)/(control de alta actividad – valor de fondo)). El valor de CI50 se determinó usando un ajuste de curva logística de 4 puntos no lineal (XLfit4, IDBS), con la fórmula: (A+(B/(1+((x/C)^D)))), en donde A = valor de fondo, B = intervalo, C = punto de inflexión, y D = parámetro de ajuste de la curva.

Ejemplos C A E (Omitidos):

Ejemplo F: Ensayo de inhibición de Aurora A

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Se determinó la inhibición de Aurora A usando el kit de ensayo Z-Lyte de Invitrogen. El ensayo se llevó a cabo usando las instrucciones recomendadas por el fabricante con ATP 20 μM y Aurora A 12 nM (Invitrogen, No. de catálogo PV3612). Los valores del % de inhibición se determinaron según las instrucciones del fabricante, y se obtuvieron valores de CI50 usando un ajuste de curva logística de 4 puntos no lineal (XLfit4, IDBS).

5 Ejemplo G: Ensayo de inhibición de Aurora B

Se determinó la inhibición de Aurora B usando el kit de ensayo Z-Lyte de Invitrogen. El ensayo se llevó a cabo usando las instrucciones recomendadas por el fabricante con ATP 128 μM y Aurora B 28 nM (Invitrogen, No. de catálogo PV3970). Los valores del % de inhibición se determinaron según las instrucciones del fabricante, y se obtuvieron valores de CI50 usando un ajuste de curva logística de 4 puntos no lineal (XLfit4, IDBS).

10 En la tabla 1, los valores de CI50 para las quinasas PLK4, Aurora A y Aurora B se indican como “A”, “B” y “C” para aquellos menores de o iguales a 0,1 µM; aquellos mayores de 0,1 µM y menores de o iguales a 1 µM; y aquellos mayores de 1 µM, respectivamente. Los porcentajes de inhibición relativa a una dosis de 1 µM se indican como “X” e “Y” para aquellos iguales a o mayores de 50% de inhibición, y aquellos menores de 50% de inhibición, respectivamente. Como se muestra en la taba 1, numerosos compuestos de la invención son inhibidores efectivos

15 de PLK4. Con respecto a PLK1, PLK2 y PLK3, los ejemplos A22 y A23 no mostraron más de 50% de inhibición a 10 µM. Además, varios compuestos de la invención inhiben también las quinasas Aurora, en particular la quinasa Aurora B.

Tabla 1: Datos de inhibición de las quinasas PLK4, Aurora A y Aurora B

Compuesto No.: Intervalos de CI50

PLK4: Aurora A Aurora B

Ejemplo A1: C -- --

Ejemplo A2: C Y C

Ejemplo A3: C -- --

Ejemplo A4: B -- --

Ejemplo A5: C -- --

Ejemplo A6: A Y B

Ejemplo A7: A Y B

Ejemplo A8: C -- --

Ejemplo A9: B Y B

Ejemplo A10: B Y B

Ejemplo A11: C Y C

Ejemplo A23: A A A

Ejemplo A24: A X A

Ejemplo A25: B X B

Ejemplo A26: A X A

Ejemplo A34: A X A

Ejemplo A35: A B A

Ejemplo A36: A X A

Ejemplo A40: B Y B

Ejemplo A41: A X A

Ejemplo A42: A X A

88 89 90

Compuesto No.: Intervalos de CI50

PLK4: Aurora A Aurora B

Ejemplo A51: A A A

Ejemplo A54: A X B

Ejemplo A55: A X A

Ejemplo A56: A A A

Ejemplo A57: A X B

Ejemplo A58: A X A

Ejemplo A59: A X A

Ejemplo A60: A X B

Ejemplo A61: A X A

Ejemplo A64: A X A

Ejemplo A65: A X A

Ejemplo A66: A X A

Ejemplo A70: A Y A

Ejemplo A71: A Y A

Ejemplo A72: A X A

Ejemplo A73: A X A

Ejemplo A74: A X A

Ejemplo A75: A X A

Ejemplo A76: A Y A

Ejemplo A78: A X A

Ejemplo A79: A X A

Ejemplo A80: A X B

Ejemplo A81: A X A

Ejemplo A82: A X A

Ejemplo A83: A X A

Ejemplo A84: A X B

Ejemplo A87: A X A

Ejemplo A89: A X A

Ejemplo A90: A X A

Ejemplo A91: A X A

Ejemplo A92: A X A

Ejemplo A94: A X A

Ejemplo A95: A X A

Compuesto No.: Intervalos de CI50

PLK4: Aurora A Aurora B

Ejemplo A102: A X A

Ejemplo A106: A X A

Ejemplo A109: A X A

Ejemplo A112: A X A

Ejemplo A113: A X --

Ejemplo A115: A Y --

Ejemplo A116: A X A

Ejemplo A131: A X A

Ejemplo A132: A B A

Ejemplo A133: A X A

Ejemplo A134: A B A

Ejemplo A135: A X A

Ejemplo A146: A Y A

Ejemplo A147: A X B

Ejemplo A151: A A A

Ejemplo A152: A X B

Ejemplo A160: A X A

Ejemplo A162: A X A

Ejemplo A164: A X A

Ejemplo A165: A X A

Ejemplo A167: A X A

Ejemplo A169: A X A

Ejemplo A174: A X A

Ejemplo A175: A Y A

Ejemplo A177: A X A

Ejemplo A178: A A A

Ejemplo A179: A A A

Ejemplo A180: A A A

Ejemplo A182: A X A

Ejemplo A185: A X A

Ejemplo A186: A X A

Ejemplo A187: A X A

Ejemplo A188: A X A

Compuesto No.: Intervalos de CI50

PLK4: Aurora A Aurora B

Ejemplo A189: A X A

Ejemplo A190: A X A

Ejemplo A194: A X A

Ejemplo A195: A X --

Ejemplo A196: A X A

Ejemplo A198: A X A

Ejemplo A199: A X A

Ejemplo A200: A X A

Ejemplo A201: A X A

Ejemplo A203: A X A

Ejemplo A204: A X A

Ejemplo A205: A X A

Ejemplo A206: A X A

Ejemplo A208: A X A

Ejemplo A211: A X A

Ejemplo A212: A X A

Ejemplo A215: A A A

Ejemplo A216: A X A

Ejemplo A217: A X A

Ejemplo A218: A X A

Ejemplo A219: A X A

Ejemplo A220: A X A

Ejemplo A221: A X A

Ejemplo H: Ensayo de inhibición de FLT3

La actividad enzimática de FLT3 se determinó usando el kit de ensayo Z-Lyte de Invitrogen (Invitrogen, No. de catálogo PV3191). El ensayo se llevó a cabo usando las instrucciones recomendadas por el fabricante con ATP

5 117,5 µM y FLT3 1 nM (Invitrogen, No. de catálogo PV3182). Los valores del % de inhibición se determinaron según las instrucciones del fabricante, y se obtuvieron valores de CI50 usando un ajuste de curva logística de 4 puntos no lineal (XLfit4, IDBS). En la tabla 2, los valores de CI50 para la inhibición de FLT3 se indican como “A”, “B” y “C” para aquellos menores de o iguales a 0,1 µM; aquellos mayores de 0,1 µM y menores de o iguales a 1 µM; y aquellos mayores de 1 µM, respectivamente, para compuestos seleccionados de la invención.

10 Tabla 2: Datos de la inhibición de Flt3

Compuesto No.: Intervalos de CI50 Compuesto No. Intervalos de CI50

Ejemplo A24: A Ejemplo A131 C

Ejemplo A42: A Ejemplo A132 A

91

Ejemplo A56: A Ejemplo A134 A

Ejemplo A58: A Ejemplo A175 A

Ejemplo A71: B Ejemplo A185 B

Ejemplo A112: B Ejemplo A217 A

Ejemplo I: Ensayos de selectividad de quinasa

La actividad inhibidora de compuestos seleccionados de la invención fue evaluada frente a un panel de 45 enzimas quinasas diferentes por CEREP, Francia. Los ensayos se llevaron a cabo usando métodos de ensayo de HTRF 5 estándar como se documenta por CEREP, frente a los ortólogos humanos de Ab1 quinasa, Akt1/PKBa, AMPKa, BMX quinasa (Etk), Brk, CaMK2a, CaMK4, CDC2/CDK1 (cycB), CHK1, CHK2, c-Met quinasa, CSK, EphB4 quinasa, ERK1, ERK2 (P42mapk), FGFR2 quinasa, FGFR4 quinasa, FLT-1 quinasa (VEGFR1), FLT-3 quinasa, Fyn quinasa, IGF1R quinasa, IRK (InsR), JNK 2, KDR quinasa (VEGFR2), Lck quinasa, Lyn quinasa, MAPKAPK2, MEK1/MAP2K1, p38a quinasa, p38d quinasa, p38g quinasa, PDGFRb quinasa, PDK1, PKA, PKCa, PKCb1, PKCb2,

10 PKCg, Ret quinasa, ROCK2, RSK2, Src quinasa, Syk y TRKA (tabla 3). El % de inhibición se determinó mediante la fórmula: % de inhibición = 100 x (1 – (valor experimental – valor de fondo)/(control de alta actividad – valor de fondo)).

Tabla 3: Valores de porcentaje de inhibición para los ejemplos A2 y A26 a concentración de 10 µM

Quinasa: Ejemplo A2 % de inhibición a 10 µM Ejemplo A26 % de inhibición a 10 µM

Abl: 3 100

Akt1/PKBalfa: -2 -4

AMPKalfa: 57 69

BMX (Etk): -3 39

Brk: 1 53

CaMK2alfa: 41 9

CaMK4: 7 -4

CDC2/CDK1: 57 60

CHK1: -4 43

CHK2: -10 -3

c-Met: 15 61

CSK: 9 75

EphB4: 11 65

ERK1: 4 1

ERK (P42mapk): 9 2

FGFR4: 0 -12

FLT-1 (VEGFR1): 1 30

FLT-3: 62 102

Fyn: 7 55

IGF1R: 20 0

92

IRK (InsR): 4 5

JNK 2: -2 5

KDR (VEGFR2): 14 58

Lck: 17 100

Lyn: 26 86

MAPKAPK2: -4 2

MEK1/MAP2K1: 4 -2

p38alfa: 6 -22

p38delta: -10 5

p38gamma: 4 -5

PDGFRbeta: 4 59

PDK1: 4 2

PKA: 0 -7

PKCalfa: -2 6

PKCbeta 1: 1 -2

PKCbeta 2: 4 26

PKCgamma: 7 10

Ret: 14 86

ROCK2: 39 32

RSK2: 17 22

Src: -10 51

Syk: -- --

TRKA: 54 101

La tabla 3 anterior muestra los valores del porcentaje de inhibición obtenidos para los ejemplos A2 y A24 a concentración de 10 µM. A partir de estos datos de inhibición, es evidente que ciertas quinasas, por ejemplo, Ab1, CSK, FLT-3, Lck, Lyn, Ret y TRKA, son inhibidas por los compuestos de la invención. Estas actividades pueden impartir un beneficio terapéutico adicional a estos compuestos.

La actividad inhibidora de compuestos seleccionados de la invención fue evaluada frente a un panel de 284 enzimas quinasas diferentes por Millipore Corporation. El % de inhibición se determinó mediante la fórmula: % de inhibición = 100 x (1 – (valor experimental – valor de fondo)/(control de alta actividad – valor de fondo)).

Tabla 4: Valores de porcentaje de inhibición para el ejemplo A42 a concentración de 0,1 µM

Quinasa: % de inhibición a 0.1 µM

Abl: 77

Abl(m): 92

Abl (H396P): 93

93 94

Quinasa: % de inhibición a 0.1 µM

Abl (M351T): 91

Abl (Q252H): 83

Abl(T315I): 98

Abl(Y253F): 75

ALK: 64

Arg: 89

Arg(m): 90

ARK5: 86

Aurora-A: 100

Aurora-B: 101

Bmx: 92

EphA1: 61

EphB1: 54

FGFR1: 96

FGFR1(V561M): 91

FGFR2: 88

FGFR2(N549H): 87

FGFR3: 90

Flt3: 54

GCK: 80

IRAK1: 52

Itk: 82

Lck: 77

Lck activada: 90

MuSK: 90

Ret (V804L): 60

Ron: 62

Ros: 93

Tie2: 98

Tie2(R849W): 83

Tie2(Y897S): 92

TrkA: 100

TrkB: 101

La tabla 4 anterior muestra los valores del porcentaje de inhibición obtenidos para el ejemplo A42 a concentración de 0,1 µM. Del panel de 284 quinasas, sólo los ejemplos que mostraron más de 50% de inhibición a 0,1 µM se reportan en la tabla 4. A partir de estos datos de inhibición, es evidente que ciertas quinasas, por ejemplo, Ab1, Arg, AurA, AurB, FGFR3, TrkA y TRKB, son inhibidas por los compuestos de la invención. Estas actividades pueden impartir un

5 beneficio terapéutico adicional a estos compuestos.

Ejemplo J: Datos de los compuestos de la invención en líneas de células cancerosas

Se sembraron células de cáncer de mama (MCF-7, MDA-MB-468, HCC1954), células de cáncer de colon (SW620) y células de cáncer de pulmón (A549), junto con células primarias epiteliales mamarias humanas (HMEC) (1.000 a

4.000 por 80 μl por pocillo, dependiendo de la tasa de crecimiento de las células) en placas de 96 pocillos, 24 horas

10 antes de la extensión del compuesto. Los compuestos se prepararon como disoluciones madre de 10 mM en DMSO al 100%, las cuales se diluyeron con medio de crecimiento de células DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) que contenía FBS (suero bovino fetal) al 10% hasta concentraciones que variaron de 50 nM a 250 μM. Se extendieron alícuotas (20 μl) de cada concentración a 80 μl de las células presembradas en las placas de 96 pocillos para obtener concentraciones finales de 10 nM a 50 μM. Las células se

15 cultivaron durante 5 días antes de llevara a cabo el ensayo de sulforodamina B (SRB) para determinar la actividad de inhibición del crecimiento celular por el compuesto.

La sulforodamina B (adquirida de Sigma, Oakville, ON, Canadá), es un colorante soluble en agua que se une a los aminoácidos básicos de las proteínas celulares. De esta manera, la medición colorimétrica del colorante unido proporciona una estimación de la masa total de proteínas que está relacionada con el número de células. Las 20 células se fijan in situ retirando por aspiración suave el medio de cultivo y añadiendo 50 µl de ácido tricloroacético (TCA) al 10% enfriado en hielo por pocillo, y se incuba a 4°C durante 30-60 min. Las placas se lavan con agua cinco veces, y se deja que se sequen al aire durante 5 min. La adición de 50 µl de disolución de SRB al 0,4% (p/v) en ácido acético al 1% (v/v) a cada pocillo, e incubación durante 30 min a RT, concluye la reacción de tinción. Después de la tinción, las placas se lavan cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el colorante no unido, y

25 entonces se deja que se sequen al aire durante 5 min. El colorante se solubiliza con 100 μl de Tris 10 mM, pH 10,5 por pocillo. La absorbancia se lee a 570 nm.

El porcentaje (%) de inhibición relativa del crecimiento se calculó por comparación con células sólo tratadas con DMSO (100%). Se determinaron los valores de GI50 para compuestos con actividad citotóxica. La GI50 se calculó usando el software GraphPad PRISM (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EEUU). GI50 (inhibición del

30 crecimiento), es la concentración de compuesto que causa 50% de inhibición del crecimiento de las células.

En la tabla 5 siguiente, se proporcionan intervalos de valores de GI50 para varios ejemplos de compuestos frente a una línea de células de cáncer de mama luminal (MCF-7), dos líneas de células de cáncer de mama basal (MDAMB-468, HCC1954), una línea de células de cáncer de pulmón (A549), una línea de células de cáncer de colon (SW620) y células de mama primarias (HMEC). Los compuestos ejemplo demostraron actividades variables de inhibición 35 del crecimiento/inducción de la muerte celular, frente a las células cancerosas del cáncer de mama luminal y las células del cáncer de mama basal, cáncer de pulmón y cáncer de colon. En general, estos compuestos mostraron menos o poca actividad frente a las células normales, como se ejemplifica por HMEC. Los intervalos de GI50 se indican como “A”, “B”, “C” y “D” para valores menores de o iguales a 0,1 µM; aquellos mayores de 0,1 µM y menores de o iguales a 1 µM; aquellos mayores de 1 µM y menores de o iguales a 10 µM; y aquellos mayores de 10 µM,

40 respectivamente.

Tabla 5: Datos de la inhibición del crecimiento celular

Ejemplo No.: Intervalo de GI50 de la línea de células

MCF-7: MDA-MB-468 A-549 SW-620 HCC-1954 HMEC

A2: D D D D D --

A4: C C D C C --

A6: B B B B B --

A7: B B B B B --

A23: A A A A C D

A24: B A A A D

A25: C B B C D --

A26: B B B B C --

95 96 97

Ejemplo No.: Intervalo de GI50 de la línea de células

MCF-7: MDA-MB-468 A-549 SW-620 HCC-1954 HMEC

A34: -- -- -- B C --

A35: A A A A C D

A41: A A A C C --

A42: A A A A B D

A51: A A A A A --

A55: B A A B C --

A56: B A A A B D

A57: B B B B C --

A58: D A A A C D

A59: -- A A A C D

A60: A A A B --

A60: B A A A A C

A61: C A A A C --

A64: A A A A B -

A65: B A A A A D

A65: A A A A B

A70: C B B C C -

A71: B B B B B -

A72: B A A A C --

A73: C A A A C --

A74: C A A A C -

A75: B A A A D -

A76: B B B C C -

A78: C A A A B --

A79: B A A A C --

A83: C A A A C --

A87: A A A B C --

A89: C A A B C --

A90: A A A A B --

A91: A A A A C --

A92: A A A A B D

A94: A A A A B --

A95: C A A A C --

Ejemplo No.: Intervalo de GI50 de la línea de células

MCF-7: MDA-MB-468 A-549 SW-620 HCC-1954 HMEC

A102: C A A B D --

A106: D A A A A C

A109: A A A A A --

A112: A A A A C --

A115: C A A A B --

A116: A A A B B --

A119: A A A A B

A131: C A A A B --

A132: B A A A C D

A133: A A A B D --

A134: A A A A B D

A135: A A A B D --

A146: C A A A C --

A147: A A A B C --

A151: B B A B C D

A152: B A A B C --

A160: C A A A A D

A162: B A A B C --

A165: C A A A C --

A167: B A A A C --

A169: A A A C --

A174: A A A A B --

A175: B A A A B C

A177: A A A A A --

A178: A A A A B --

A179: A A A A C --

A180: B A A A B --

A182: A A A A A --

A185: A A A B A --

A186: B A A A C --

A187: A A A A B --

A188: A A A A B --

A189: A A A A A C

Ejemplo No.: Intervalo de GI50 de la línea de células

MCF-7: MDA-MB-468 A-549 SW-620 HCC-1954 HMEC

A190: A A A A A C

A194: A A A B D D

A196: A A A A B --

A198: A A A B A --

A199: A A A A D --

A200: D A A A C --

A201: B A A A B --

A203: A A A A C --

A204: C A A A D --

A205: B A A A B --

A206: A A A A C --

A208: B A A A B --

A211: B A A B C --

A212: A A A A C --

A215: A A A A A --

A216: B A A A C --

A217: A A A B B --

A218: A A A B A --

A219: B A A A B --

A220: B A A A D --

A221: D A A B C --

Además de las líneas de células ensayadas como se ha descrito anteriormente, se han ensayado compuestos

seleccionados frente a un panel extendido. Éstas incluyen: líneas de células de cáncer de mama (T47 D, MDA-MB

231, HS578T, BT474, SKBR3, HCC1954), una línea de células de cáncer de pulmón (H358), líneas de células de

5 cáncer de cerebro (A172, Hs683, SK-N-SH), líneas de células de cáncer de colon (Colo 205, CT-15, HCT116+/-,

HCT116+/+), líneas de células de cáncer de ovario (OVCAR-3, SK-OV-3, SW 626), una línea de células de

melanoma (518A2), una línea de células de cáncer de próstata (PC-3) y una línea de células de mama

inmortalizadas (184A1). El ensayo de sulforodamina B (SRB) descrito anteriormente, se usó para ensayar los

compuestos de ensayo frente al panel extendido (tabla 6). Los intervalos de GI50 se indican como “A”, “B”, “C” y “D” 10 para valores menores de o iguales a 0,1 µM; aquellos mayores de 0,1 µM y menores de o iguales a 1 µM; aquellos

mayores de 1 µM y menores de o iguales a 50 µM; y aquellos mayores de 50 µM, respectivamente.

98

Tabla 6: Datos de la inhibición del crecimiento celular

Ejemplo No.: Intervalo de GI50

Línea celular: A23

T47 D: A

MDA-MB-231: A

HS578T: A

BT474: C

SKBR3: C

H358: A

A172: A

Hs683: A

SK-N-SH: A

Colo 205: A

HCT-15: C

HCT116+/-: C

HCT116+/+: C

OVCAR-3: A

SK-OV-3: C

SW 626: C

518A2: A

PC-3: C

184A1: C

Ejemplo K: Ensayo de angiogénesis in vitro

Ciertos compuestos de la invención exhibieron actividad micromolar y submicromolar frente a tirosinas quinasas de

5 receptor (RTK), tales como FGFR2, VEGFR1, VEGFR2 y PDGFDbeta. La actividad frente a estas RTK puede resultar en actividad antiangiogénica la cual está asociada con crecimiento retardado del tumor y/o regresión del tumor. Para medir los efectos antiangiogénicos de los compuestos de la invención, se ensayaron ejemplos seleccionados en un ensayo de angiogénesis como se describe a continuación. Nótese que el compuesto del ejemplo A23 mostró efectos antiangiogénicos a concentraciones submicromolares (La Figura).

10 Se obtuvieron células HUV-EC-C de la American Type Culture Collection (ATCC, CRL-1730), y se usaron en un subcultivo temprano para el ensayo. Se usó el kit de ensayo de angiogénesis in vitro (Chemicon), según las recomendaciones del fabricante. Una mezcla enfriada en hielo de ECMatrix se transfirió a una placa de 96 pocillos pre-enfriada. Después de que la disolución de la matriz hubiera solidificado (>1 hr de incubación a 37°C), se mezclaron 8.000 células con la concentración de inhibidor apropiada (en 100 microlitros de EGM-2), y se sembraron

15 en cada pocillo. El antiangiogénico clínico Sutent se usó como un control positivo en comparación con un compuesto de la invención, A13. Después de incubación a 37°C durante 4 hr, se inspeccionó la formación de tubos. Dos métodos, el reconocimiento de patrones y el recuento de puntos de ramificación, se usaron para cuantificar la progresión de la angiogénesis, y se expresaron como un porcentaje del recuento de tubos control (la Figura).

Aunque esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a ejemplos de realizaciones de la

20 misma, los expertos en la técnica entenderán que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalles de la misma, sin apartarse del alcance de la invención englobada por las reivindicaciones adjuntas.

99

Claims

imagen1

imagen2