ES2601429T3

ES2601429T3 - Filtración de virus de medios de cultivo celular

Info

Publication number: ES2601429T3
Application number: ES13731015.7T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Mundt; Artur Mitterer; Manfred Reiter; Meinhard Hasslacher; Leopold Grillberger; Thomas Kreil
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2033-06-13
Also published as: MY173835A; HK1198335A1; CA2876473C; AU2013277532A1; AU2013277532B2; MX2014015950A; SG11201408490PA; TW201412986A; CN104640969A; JP2017184765A; BR112014031842B1; US20170260498A1; EP2732020A1; SI2732020T1; JP2019022526A; CN108795724A; EP3103861A1; BR112014031842A2; NZ629083A; EA201990887A1

Abstract

Un método para eliminar un contaminante vírico de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, que comprende el paso de: a) someter dicha preparación a filtración durante al menos aproximadamente 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de máximo 75 nm y una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 l/m2.

Description

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aproximadamente 4 °C a temperaturas de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 37 °C. Sin embargo, todas estas realizaciones están dentro del alcance que el uso de la filtración durante al menos aproximadamente 24 horas efectúa, de manera que la capacidad de los costosos filtros de virus usados puede aprovecharse mejor, llegando a un aumento de 2 a 100 veces de la capacidad volumétrica, al tiempo que se mantiene la integridad del filtro.

5 En una realización preferida, el método para eliminar un contaminante vírico partir de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, comprende el paso de someter dicha preparación a filtración durante al menos aproximadamente 10 días a aproximadamente 2 meses a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de máximo 75 nm a una presión de aproximadamente 1000 mbar a 2000 mbar y a una temperatura de 10 °C a 40 °C, y que tiene una capacidad volumétrica de al menos 2000 l/m2. Por supuesto, todos los demás parámetros pueden combinarse también con esta realización. Además, como una realización más preferida, dicho método se realiza en un modo continuo de filtración, en el que la preparación que se prefiere es un medio de cultivo celular, por ejemplo, un medio de cultivo celular que comprende un hidrolizado de soja o un medio de cultivo celular que comprende componentes derivados de animales, en el que

15 el filtrado se alimenta continuamente a un biorreactor, en particular, un reactor quimiostato. En otra realización, esta realización puede además realizarse usando al menos 2 filtros de virus dispuestos en paralelo o en serie.

Se contempla que los métodos de filtración de virus como se describe en este documento pueden usarse para reducir la contaminación vírica de cualquier preparación que sea un medio de cultivo celular o un componente de un medio de cultivo celular, es decir, un medio y tampones adecuados para el crecimiento de células animales, y preferiblemente células de mamíferos, en cultivo celular in vitro. Normalmente, el medio de cultivo contiene un tampón, sales, una fuente de energía, aminoácidos, vitaminas y oligoelementos esenciales.

El término «preparación» también incluye cualquier componente que es una posible parte de un medio de cultivo

25 celular en el sentido de la presente invención y capaz de soportar el crecimiento de la célula adecuada en cultivo. Dichas preparaciones incluyen, por ejemplo, un tampón o soluciones de al menos un aminoácido o proteína; soluciones de al menos una vitamina; soluciones de al menos una sal orgánica o inorgánica; o soluciones que comprenden al menos una fuente de hidratos de carbono o azúcares.

En el contexto de la presente invención, «valor de reducción logarítmica» (LRV) es una medida de la eficacia de una membrana para retener una partícula tal como bacterias o virus, que se define como el logaritmo (en base 10) de la relación entre dicho recuento de partículas en la corriente de alimentación y el recuento de partículas en el permeado de la membrana del filtro de virus. El valor LRV es específico para un tipo de partículas dado. En una realización de acuerdo con la invención, el filtro de virus alcanza al menos un valor de reducción de 1 Log10 (LRV)

35 para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 2 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 3 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 5 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 6 Log10 para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 7 Log10 para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 8 Log10 para un contaminante vírico, preferiblemente al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante vírico. Por supuesto, es evidente para una persona experta en la técnica, que cualquier valor de reducción de Log10 (LRV) de un contaminante vírico o potencialmente vírico de la preparación a ser filtrada es beneficiosa con el fin de mejorar la seguridad de un proceso de producción. Por lo tanto, especialmente este parámetro puede combinarse con todos los demás parámetros que se usan en el método de la presente invención.

45 «Flujo», tal y como se usa en este documento, intercambiable con «caudal específico» o «caudal», es una medida utilizada para caracterizar las membranas, se refiere a la tasa de flujo del filtrado (expresada en el volumen o el peso de la solución que permea a través de la membrana de filtración de virus por área de filtro y el tiempo, por ejemplo, l/(m2 x h). En el contexto de la invención, el término «específico» significa dentro de un tiempo definido, sin embargo, cuando se utiliza solo «caudal», es evidente, a partir de las unidades de este parámetro, que se refiere también al «caudal específico». Como abreviatura de la cantidad «volumen» dada en la unidad «litro», "I" o "L" se usan indistintamente. El caudal específico dentro del método de la presente invención puede variar dentro de un rango o permanecer considerablemente fijo a lo largo de toda la duración del proceso de filtración que usa un filtro de virus dado. En una realización de la presente invención, el caudal específico puede variar de aproximadamente 5 l/(m2 x

55 h) a aproximadamente 500 l/(m2 x h) durante al menos 24 horas hasta aproximadamente 7 meses. El límite inferior para el flujo puede ser de aproximadamente 5 l/(m2 x h) o aproximadamente 10 l/(m2 x h). El límite superior puede ser de aproximadamente 25 l/(m2 x h), aproximadamente 75 l/(m2 x h), aproximadamente 100 l/(m2 x h), aproximadamente 200 l/(m2 x h), aproximadamente 250 l/(m2 x h), aproximadamente 300 l/(m2 x h) o aproximadamente 500 l/(m2 x h). El flujo puede, además, variar de aproximadamente 5 l/(m2 x h) a aproximadamente 100 l/(m2 x h), aproximadamente 10 l/(m2 x h) a aproximadamente 100 l/(m2 x h) o aproximadamente 10 l/(m2 x h) a aproximadamente 25 l/(m2 x h).

«Filtración por lotes» o filtración hecha en modo por lotes, se refiere en este documento a un proceso en el que se filtra una cantidad o volumen totales específicos de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos

65 un componente de un cultivo celular medio, a través de un filtro de virus en un lote que depende de la capacidad del

filtro de virus, y en el que el proceso de filtración se finaliza antes de que el filtrado se dirija o alimente al proceso en el que se usa o se consume.

El término «filtración continua» o «filtración en línea» se refiere a un proceso de filtración en el que se filtra la

5 cantidad o el volumen totales específicos de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, a través del filtro de virus que depende continuamente de la capacidad del filtro de virus, y en el que el proceso de filtración está todavía en curso cuando el filtrado ya se dirige o alimenta al proceso en el que se utiliza o se consume.

Todas las realizaciones de la presente invención pueden realizarse usando filtración por lotes o filtración continua. El efecto beneficioso de la invención ya se consigue sometiendo una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, a filtración durante al menos 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de máximo 75 nm y una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 l/m2 con el fin de eliminar un contaminante vírico de dicha preparación.

15 En una realización preferida de acuerdo con la invención, el método para eliminar un contaminante vírico de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, en el que dicha preparación se somete a filtración durante al menos aproximadamente 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de máximo 75 nm y una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 l/m2, se realiza como filtración continua. Este modo de funcionamiento tiene la ventaja de que el filtrado producido de la preparación puede ser directa y continuamente alimentado al proceso en el que se utiliza o se consume. En una realización más preferida, la preparación filtrada de virus, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, puede alimentar directa y continuamente un biorreactor, más preferiblemente un biorreactor de gran escala usado en un proceso de cultivo celular alimentado de forma continua,

25 por ejemplo, un proceso de quimiostato, un proceso de perfusión o un proceso de lote alimentado. Esta realización se lleva a cabo en una realización que usa una presión de aproximadamente 1000 mbar a 2000 mbar y una temperatura de 10 °C a 40 °C, en la que la capacidad volumétrica es de al menos 2000 l/m2 o al menos 5000 l/m2. Además, es más preferible que la filtración de virus de la preparación se lleve a cabo durante al menos aproximadamente 24 horas o aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 7 meses, más preferiblemente durante al menos aproximadamente una semana hasta aproximadamente 5 meses y más preferiblemente al menos aproximadamente una a aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 3 meses e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 2 a aproximadamente 3 meses. Por supuesto, todos los demás parámetros pueden combinarse con esta realización. Además, se prefiere que la preparación a filtrar sea un medio de cultivo celular y el modo de filtración sea una filtración de modo continuo.

35 Por supuesto, una persona experta en la técnica sabe que las preparaciones de filtrados de virus que se pueden obtener de acuerdo con cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención también pueden dirigirse o alimentar a otros procesos de producción relacionados con el cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas, así como preparaciones alimenticias. También en esas realizaciones se prefiere una filtración continua de las preparaciones.

Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular que puede obtenerse de acuerdo con cualquiera de los métodos de acuerdo con la invención para el cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas, así

45 como preparaciones alimenticias.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular a filtrar de virus es estéril, o se ha pretratado de otra manera. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende proteínas o suero animales u otros componentes derivados de animales, o no contiene proteínas animales, o suero, o componentes derivados de animales, o posee cualquier combinación de las características anteriores. En otras realizaciones, el medio de cultivo celular comprende hidrolizados variables en las concentraciones y en las especies de plantas o microorganismos de los que se derivan, especialmente hidrolizados de soja. En una realización preferida, el medio de cultivo celular es un medio libre de proteínas animales que comprende concentraciones variables de al menos un hidrolizado de soja. Sin embargo, se ha de destacar que el método de acuerdo con la invención es especialmente adecuado para la filtración

55 de virus de preparaciones que comprenden proteínas o suero de origen animal u otros componentes derivados de animales a fin de mejorar aún más la seguridad virológica de las preparaciones, en particular, cuando se usa en procesos de cultivo celular, en preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas, así como en preparaciones alimenticias.

«Medio de cultivo celular» se define, para los fines de la invención, como un medio adecuado para el crecimiento de células, y preferiblemente células animales, más preferiblemente células de mamíferos, en cultivo celular in vitro. Se puede usar cualquier medio capaz de soportar el crecimiento de las células adecuadas en cultivo celular. El medio de cultivo celular de acuerdo con la invención puede estar basado en cualquier medio basal tal como DMEM, F12 de Ham, Medio 199, McCoy o RPMI, generalmente conocidos por el experto. El medio basal puede comprender varios

65 ingredientes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, y fuentes de hidratos de carbono, estando cada ingrediente presente en una cantidad que permite el cultivo de una célula que es generalmente

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filtros paralelos o filtros dispuestos en serie con el fin de tener la posibilidad de reemplazar uno de los filtros sin detener el proceso de filtración por razones de mantenimiento.

En algunas realizaciones, el filtro se somete a una prueba de integridad antes de usarlo. La prueba de integridad 5 puede ser en forma de una prueba basada en la difusión de aire-agua, en la que el aire se dirige al filtro y el filtro se sumerge luego en agua estéril y se examina para detectar burbujas, lo que indicaría una fuga en el filtro.

En una realización, el filtro de virus o la membrana del filtro de virus pueden pretratarse antes del procedimiento de filtración de virus, por ejemplo, lavándolos con un agente de lavado, en particular, con un agente de lavado ácido, un agente de lavado alcalino y/o etanol.

En una realización de la invención, también se puede realizar en el método de acuerdo con la invención una filtración de flujo tangencial. En el contexto de la presente invención, «filtración de flujo tangencial», se usa en este documento de manera intercambiable con el término «filtración de flujo cruzado». En el modo de flujo tangencial, la 15 trayectoria de flujo del líquido en el lado aguas arriba del filtro se dirige más o menos en paralelo o tangencialmente

o a través de la superficie del filtro. El paso del permeado se facilita mediante la restricción del flujo de retenido con respecto a la alimentación, lo que resulta en una contrapresión en el sistema y permitiendo la migración del permeado a través de la membrana del filtro. La corriente de barrido constante a través de la superficie de la membrana tiene el efecto de minimizar la obstrucción por contaminantes en el producto que se filtra. Es adecuado cualquier filtro de virus que alcance al menos un valor de reducción de 1 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 2 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 3 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 5 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 6 Log10 para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 7 Log10 para un 25 contaminante vírico, o por lo menos un valor de reducción del 8 Log10 para un contaminante vírico, preferentemente al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante vírico. Todos los factores de reducción logarítmica pueden servir para cualquiera de los tamaños de poro efectivos de máximo 75 nm del filtro de virus. En una realización de acuerdo con la invención, el límite inferior del tamaño de poro efectivo del filtro de virus es de aproximadamente 5 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm o aproximadamente 60 nm. En dicha realización de acuerdo con la invención, el límite superior del tamaño de poro efectivo del filtro de virus es de aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 60 nm o aproximadamente 75 nm. En algunas realizaciones de la invención, el filtro de virus tiene un tamaño de poro efectivo

35 de aproximadamente 5 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 20 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nm.

En algunas realizaciones de la presente invención se usa filtración de flujo normal. «Filtración de flujo normal», utilizada en este documento de manera intercambiable con los términos «sin salida», «paso único» y «filtración de flujo directo», se refiere a un proceso de filtración con filtro de virus en el que la trayectoria de flujo del líquido se dirige por lo general perpendicularmente a la superficie del filtro, dependiendo de la construcción del módulo de filtro la corriente de fluido también podría dirigirse tangencialmente a la membrana del filtro, sin embargo, en contraste con la filtración de flujo cruzado, no se aplica recirculación del retenido, lo que significa que el caudal específico 45 antes y después del filtro es idéntico. Es adecuado cualquier filtro de virus que alcance al menos un valor de reducción de 1 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 2 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 3 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 5 v (LRV) para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 6 Log10 para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 7 Log10 para un contaminante vírico, o al menos un valor de reducción de 8 Log10 para un contaminante vírico, preferiblemente al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante vírico. Todos los factores de reducción logarítmica pueden servir para cualquiera de los tamaños de poro efectivos de máximo 75 nm del filtro de virus. En una realización de acuerdo con la invención, el límite inferior del tamaño de poro efectivo del filtro de virus es de aproximadamente 5 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm,

55 aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm o aproximadamente 60 nm. En dicha realización de acuerdo con la invención, el límite superior del tamaño de poro efectivo del filtro de virus es de aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 60 nm o aproximadamente 75 nm. En algunas realizaciones de la invención, el filtro de virus tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 5 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 20 a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nm.

65 Como los expertos ordinarios en la técnica apreciarán, todas las realizaciones de la invención se pueden implementar con la ayuda de cualquier sistema disponible técnicamente útil para el propósito, por ejemplo, una

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Ejemplo 3: Preparación del filtro:

5 Los filtros de virus se prepararon de acuerdo con los manuales de los productos de los fabricantes de filtros de virus. Los filtros se esterilizaron en autoclave a >121 °C durante 20 minutos, a menos que los filtros se entregaran y montaran de forma estéril.

Ejemplo 4: Prueba de integridad

10 Después de usarlos, los filtros de tamaño apropiado (filtros A, C, E y F de la tabla 2) se lavaron de acuerdo con las recomendaciones del respectivo fabricante. Se realizó una prueba de flujo de avance con Palltronic Flowstar XC (Pall, EE. UU.) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Todas las pruebas de integridad realizadas después de los experimentos de filtración descritos en este documento cumplen los límites especificados.

15 Ejemplo 5: Relación proporcional entre la presión diferencial y el flujo

Para investigar la relación entre la diferencia de presión y el caudal volumétrico, el medio de cultivo celular se sometió a filtración a temperatura ambiente usando filtros de virus esterilizados en autoclave. Se introdujo el medio

20 en un recipiente de presión y se conectaron los filtros de virus al recipiente de presión, que luego se presurizó a diferentes niveles. Los caudales específicos y las presiones diferenciales se midieron con una balanza y un transductor de presión y se registraron en el tiempo (fig. 3).

Ejemplo 6: Modelo de sistema de fermentación de escalamiento descendente de 10 l

25 Se realizó una comparación de los medios de cultivo celular con y sin filtración de virus usando un sistema de fermentación de células CHO para la expresión de proteínas recombinantes (fig. 6). Se investigó el rendimiento con respecto a la tasa de crecimiento y las producciones. Se preparó medio de cultivo celular como se describe en el ejemplo 2. Una parte del experimento se llevó a cabo solamente con medio de filtrado y estéril, mientras que la otra

30 parte se llevó a cabo con el mismo medio y una filtración de virus adicional utilizando un Sartorius Virosart CPV 180 cm2. La filtración se llevó a cabo a 2-8 °C. El experimento de fermentación se llevó a cabo en biorreactores de mesa tipo Rushton de 10 l de tanque agitado con pH, pO2 y temperatura controlados en línea. Los puntos de ajuste de parámetros y los rangos para la fermentación fueron los siguientes:

35 pH: 7,05 (6,8-7,3)

T: 37,0 °C (35-39 °C) OD: 20 % (saturación de aire) (10-60 %)

Las células se cultivaron en modo por lotes seguido de un cultivo en quimiostato usando los medios con y sin

40 filtración de virus adicional. Los datos del modo del quimiostato (tasas de crecimiento y productividad) se generaron a partir de un cultivo celular continuo de 4 semanas. Los recuentos de células se determinaron por medición CASY. En el cultivo en quimiostato, la tasa de crecimiento específico (μ) se calculó por:

µ = D + ln (Xt1/Xt0) / (t1 -t0)

45 donde D es la tasa de dilución, calculada como la relación entre tasa de alimentación de medio por día y el volumen de trabajo [1/d]. Las tasas de crecimiento se calcularon a partir de recuentos de células homogeneizados CASY. Para el análisis bioquímico, la suspensión homogénea se centrifugó a 400 g en una multífuga Heraeus 1 S-R durante 10 minutos y se prepararon alícuotas de 1,0 ml en tubos Eppendorf y se almacenó a ≤20 °C. Se analizaron

50 los sobrenadantes libres de células para la actividad de una proteína recombinante expresada mediante un ensayo cromogénico de acuerdo con los procedimientos de operación estándar. La productividad volumétrica P en este experimento se calculó por:

P [U / (L x d)] = Actividad [mU/ml] * tasa de dilución [d-1] 55 La productividad específica celular qP se calculó por:

qP [mU / (células 10E06 x d)] = P [U / (L * D)] / recuento celular [células 10E06/ml]

60 Ejemplo 7: Modelo de sistema de fermentación de escalamiento descendente de 120 l

Se investigó una técnica de filtración de virus continua realizada en un volumen de trabajo de 120 l de los medios antes de su adición a un sistema de fermentación de células CHO para la expresión de proteínas recombinantes con respecto a su efecto sobre la tasa de crecimiento y las producciones (fig. 6A, fig. 6B y fig. 6C) El estudio comparó los 65 procesos de producción que utilizan tres variaciones de los mismos medios de cultivo celular: a) medios estándar; b)

medios estándar filtrados usando filtros de virus Virosart CPV; y c) medios estándar filtrados utilizando filtros de virus Millipore Viresolve NFP. Durante el proceso de producción continua, se usaron alternativamente para diferentes intervalos de tiempo los dos filtros de virus diferentes (Virosart CPV Midicap de 2000 cm2 de tamaño y Millipore Viresolve NFP de 850 cm2 de

5 tamaño). El filtro Sartorius CPV se usó desde el día de cultivo K00-K14, K23-K30 y K39-K63 y el filtro Millipore NFP se utilizó desde el día de cultivo K14-K23 y K30-K39. Los puntos de ajuste de parámetros y los rangos para la fermentación fueron los siguientes:

pH: 7,05 (6,8-7,3)

T: 37,0 °C (35-39 °C) OD: 20 % (saturación de aire) (10-60 %)

Muestreo y análisis

15 Los recuentos celulares se determinaron mediante el contador de células y sistema analizador CASY ®. Para el análisis bioquímico de la suspensión homogénea se centrifugó a 400 g en una multífuga Heraeus 1 S-R (Thermo Scientific, EE. UU.) durante 10 minutos. Se analizaron los sobrenadantes libres de células para la actividad de una proteína recombinante expresada mediante un ensayo cromogénico. En el cultivo en quimiostato, la tasa de crecimiento específico (μ) se calculó por:

µ = D + ln (Xt1/Xt0) / (t1 -t0)

donde D es la tasa de dilución, calculada como la relación entre tasa de alimentación de medio por día y el volumen de trabajo [1/d]. Las tasas de crecimiento se calculan a partir de recuentos de células homogeneizados CASY.

25 La productividad volumétrica P en este experimento se calculó por:

P [U / (L x d)] = Actividad [mU/ml] * tasa de dilución [d-1]

La productividad específica celular qP se calculó por:

Ejemplo 8: Filtración de virus con filtros de virus ASAHI Planova 15N

35 Los medios que contienen hidrolizado de soja (DOMO SE50 MAF N.° 5) se enriquecieron con MMV y se colocaron en un depósito conectado a un suministro de gas nitrógeno a presión. El material enriquecido con MMV se pasó a través de un filtro de virus de 10 cm2 ASAHI Planova 15N instalado en línea en un modo sin salida a una presión constante de 1100 mbar (punto de ajuste). Los valores mínimos y máximos de los parámetros siguientes se midieron y registraron de forma continua: presión de alimentación; temperatura de alimentación, del filtrado y ambiente y peso del filtrado (el cambio de este se utilizó para calcular el caudal de filtrado). Se tomaron muestras diariamente durante hasta 7 días y se analizaron para determinar el título de virus MMV (fig. 7).

Ejemplo 9: Filtración de virus con filtros de virus ASAHI Planova BIOEX

45 Los medios que contienen hidrolizado de soja (serie n.° 1 con hidrolizado de soja DMV SE50 MAF UF n.° 5); serie n.° 2 con hidrolizado de soja SDMV SE50 MAF UF n.° 4) se enriquecieron con MMV y se colocaron en un depósito conectado a un suministro de gas nitrógeno a presión. El material enriquecido con MMV se pasó a través de un filtro de virus de 10 cm2 ASAHI Planova BIOEX instalado en línea en un modo sin salida a una presión constante de 2000 mbar (punto de ajuste). Los valores mínimos y máximos de los parámetros siguientes se midieron y registraron de forma continua: presión de alimentación; temperatura de alimentación, del filtrado y ambiente y peso del filtrado (el cambio de este se utilizó para calcular el caudal de filtrado). Se tomaron muestras diariamente durante 5 días y se analizaron para determinar el título de virus MMV (fig. 8).

55 Ejemplo 10: Resumen de la filtración de virus

Los medios de cultivo celular que contienen diferentes hidrolizados de soja se enriquecieron con MMV y se colocaron en un depósito conectado a un suministro de gas nitrógeno a presión. Los diferentes filtros de virus se usaron en combinación con los diferentes hidrolizados de soja como se indica en la tabla 6:

Tabla 6: Combinación de filtros de virus e hidrolizados de soja usados en experimentos de adición

Experimento n.°: Filtro Lote de hidrolizado de soja Tiempo de ejecución [días]

1: D 7 5

2: D 6 5

3: I 3 19

4: I 5 17

5: G 7 7

6: G 7
6

7: B 6 14

8: H 3 11

Las filtraciones se configuraron en un modo sin salida a una presión constante de 2 bar (punto de ajuste) para todas las series excepto para las series de los experimentos 5 y 6 que se realizaron a una presión constante de 1,1 bar (punto de ajuste). Los valores mínimos y máximos de los parámetros siguientes se midieron y registraron de forma

5 continua: presión de alimentación; temperatura de alimentación, del filtrado y ambiente y peso del filtrado (el cambio de este se utilizó para calcular el caudal de filtrado). Se tomaron muestras durante el tiempo de ejecución del experimento y se analizaron para determinar el título de virus MMV. Las reducciones logarítmicas globales se calcularon a partir de la diferencia entre la carga total de infectividad del virus en el filtrado y la carga total de infectividad del virus antes de la filtración (fig. 9).

10 Ejemplo 11: Filtración de larga duración con adición de virus MMV

El medio de cultivo celular como se describe en el ejemplo 2 se enriqueció con MMV a un título de 5,0 [Log10(TCID50/ml)] y se sometió a una filtración de larga duración de 30 días a través de un filtro vírico con un

15 tamaño de poro de 20 nm (Sartorius Visrosart CPV 5 cm2). La filtración se llevó a cabo con una configuración comparable a la del ejemplo 9 y el ejemplo 10, pero con una presión constante de 1,1 bar (intervalo especificado: de 0,8 bar a 1,2 bar) y con interrupciones regulares de presión y de flujo para poner a prueba al filtro vírico. Se registraron los caudales en el curso del experimento y se mantuvieron por encima de 4 l/(m2 x h) (figura 10). Se tomaron 20 muestras dede ad filtrado (hasta 5 veces por semana) y se determinó el título y la carga de virus

20 MMV. No se observó entrada de virus en ninguna de las 20 fracciones ensayadas. Las cargas de virus variaron de < 0,9 [Log10(TCID50)] a < 2,8 [Log10(TCID50)] dependiendo del volumen de fracción. La carga total de virus en los filtrados fue < 3,0 [Log10(TCID50)], que, cuando se resta de la carga de virus inicial del material añadido (es decir, 8,5 [Log10(TCID50)]), resulta en un factor de reducción global de virus > 5,5 Log10. Esto se consideró eficaz y completo (figura 11).

25

Claims

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