MX2014015950A

MX2014015950A - Filtracion de virus de medio de cultivo celular.

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Publication number: MX2014015950A
Application number: MX2014015950A
Authority: MX
Inventors: Leopold Grillberger; Meinhard Hasslacher; Manfred Reiter; Artur Mitterer; Wolfgang Mundt; Thomas Kreil
Original assignee: Baxter Int
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2015-07-17
Also published as: MY173835A; HK1198335A1; CA2876473C; AU2013277532A1; AU2013277532B2; SG11201408490PA; TW201412986A; CN104640969A; JP2017184765A; BR112014031842B1; US20170260498A1; EP2732020A1; SI2732020T1; JP2019022526A; CN108795724A; EP3103861A1; BR112014031842A2; NZ629083A; EA201990887A1; AR092847A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para eliminar un contaminante viral de una preparación, siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular. El método comprende someter la preparación a una filtración durante al menos aproximadamente 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 75 nm máximo. Además, la presente invención se refiere al uso de un filtro de virus en una filtración de al menos aproximadamente 24 horas, en donde el filtro de virus tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 75 nm máximo para la eliminación de un contaminante viral de una preparación, siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular. En algunas modalidades la filtración de acuerdo con la presente invención opera en una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 L/m2. Además, la presente invención se refiere al uso de una preparación, siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular que se puede obtener de acuerdo con el método de la presente invención para un cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas así como en preparaciones alimenticias.

Description

FILTRACIÓN DE VI RUS DE MEDIO DE CULTIVO CELULAR Antecedentes de la I nvención La seguridad virológica es un aspecto importante en la industria biofarmaceutica. A pesar de los esfuerzos para mitigar el riesgo, ha surgido el aspecto en la industria de los incidentes que implican la contaminación viral a gran escala de los biológicos . Los eventos altamente perfilados incluyen , por ejemplo, detección de una contaminación de Vesivirus 21 1 7 de subcultivo celular C HO (ovario de hámster Ch ino) de Genzima 2009 , que obstaculizó la producción de la contaminación de Cerezyme® y Fabrazyme® y Merck's 201 0 de su vacuna Rotarix® por el circovirus de porcino 1 . U na fuente probable de contaminación está en la etapa de enltivo celular. Además de la pérd ida económica por parte de la compañía de fabricación (un reporte indica que el estimado está aproximadamente en una pérd ida de cien millones por contaminación de un bioreactor de 10000 L más los recargos impuestos por las agencias) , dichos eventos imponen un riesgo en los pacientes e interrumpen el acceso a los productos biofarmacéuticos (Liu et al . , Biotechnol . Prog . 2000, 16, 425-434) . Como resultado, existe un escrutinio altamente regularizado y demanda de nuevas téenicas para detectar, prevenir y remediar las contaminaciones virales.

Campo de la I nvención En general , los contaminantes virales pueden ser d iferenciados en corrientes virales de corriente ascendente y corriente descendente. Las contaminaciones de corriente descendente pueden ser controladas aplicando sistemas cerrados, sin embargo, especialmente las contaminaciones de corrientes descendentes son difíciles de controlar y detectar incluso a traves de pruebas extensas . Los contaminantes virales también se pueden originar del uso de materiales derivados de animales en la producción biofarmacéutica. Cuando la l ínea celular de producción está libre de contaminantes virales extraños, y la producción no implica el uso de materiales derivados de animales, aún pueden entrar contaminantes virales a través del medio del cultivo celular. Por ejemplo, los medios sintéticos pueden ser suplementados con factores de crecimiento recombinante prod ucidos en un sistema suplementado por suero y en u n med io libre de proteína, sin embargo, pueden contener hidrolizados de proteína filtrados. Sin embargo, la contaminación viral puede ocurrir en un medio completamente definido en forma qu ímica, debido a que se pueden empacar en contenedores no estériles grandes cantidades de componentes del medio. Los filtros del g rado de esterilización que son convencionales no están diseñados ni tienen la capacidad de proteger contra contaminantes virales, de modo que se deben emplear otras medidas para asegurar la seguridad virológica .

La detección de virus accidentales en uno o más puntos de revisión del proceso de producción , es una práctica estándar. Sin embargo, la detección sola es una medida no adecuada contra la contaminación viral de los productos biofarmaceuticos, especialmente en donde el contaminante viral presente, el cual no ha sido sospechado, es desconocido o es un agente viral emergente. Dichos agentes virales pueden escapar de la detección incluso mediante microformaciones de ADN bien diseñadas representativas de una gran recolección dé virus secuenciados. El desafío es adicionalmente complejo por los bajos niveles de contaminantes virales necesarios para detectar un enltivo celular, y la sensibilidad del ensayo de detección actualmente limitada.

Los altos tituladores del contaminante viral pueden no manifestarse en la forma de parámetros de cultivo celular alterado, por ejemplo, densidad de cultivo , tituladores de proteína, más allá de su rango normal . Por otra parte, los ensayos de capacidad de infección son altamente específicos y requ ieren diferentes condiciones para cada virus. Como resultado de la contaminación viral , se pueden contaminar el equipo, los fluidos y los productos de corriente descendente, incurriendo en millones de dólares en el escaneado de los lotes, desecho de desperdicio, ventas pérdidas y descontaminación . La clasificación profunda de las materias primas con respecto a virus, es muy difícil debido a la heterogenidad de la muestra de los g randes volúmenes implicados en procesos de producción biofarmaceuticos.

Se pueden clasificar téenicas de despeje viral en uno de dos grupos : desactivación y filtración . Los métodos de desactivación buscan la pérdida irreversible de capacidad de infección viral , mientras que los métodos de filtración buscan reducir mecánicamente el contaminante viral. Los métodos de desactivación convencionales emplean radiación ultravioleta (UV) , radiación gamma, calor, pH bajo o alto, o exposición a solvente/detergente. En casos en donde la radiación UV puede eliminar en forma efectiva e irreversible la actividad viral, puede ser impráctica en una base a gran escala o no adecuada para medios preparados. El autoclave, aunq ue es posible para líq uidos estables por calor, puede alterar el medio sensible. Un método alternativo conocido como tratamiento térmico de alta temperatu ra, corto tiempo (HTST) no es tan severo, pero demanda equipo, automatización y procedimientos de validación costosos para conservar las características del medio. La exposición a un pH bajo o alto es inefectiva a través del espectro de posibles contaminantes virales y puede impactar negativamente la cantidad u osmolaridad del medio. La exposición a solvente/detergente es probable q ue no sea una solución de amplio espectro, y es efectivo ú nicamente para virus con una envoltura de lípido. Por lo tanto, el método ideal debe balancear las consideraciones de costo y las necesidades de realizar el despeje viral en materias primas , y proporcionar una solución de amplio espectro sin comprometer el rango de crecimiento o el rendimiento.

La filtración de retención viral ofrece el balance adecuado. No altera químicamente los componentes del medio, y es adecuada para utilizarse con una alimentación/medio sensible al calor. Además, la filtración de retención viral es u na solución de amplio espectro, ya que opera en un principio de exclusión por tamaño. Sin embargo, las membranas de retención viral son costosas (de aproximadamente 2000 a 5000 Eu ros por m2). Los bajos rangos de flujo específico característicos de la filtración de volúmenes medios, han hecho al metodo económicamente difícil en una escala adecuada para un suministro de bioreactor a gran escala, debido al costo del área de membrana necesario. Por ejemplo, cuando la filtración de virus se conecta en serie a una filtración de medio de grado de esterilización , la filtración del virus necesita preferentemente ocu rrir dentro de un d ía de operación , es decir, un máximo de 2 a 10 horas después de la preparación del medio en volumen con el objeto de prevenir la contaminación en volumen . Por consiguiente, se necesita una gran área de filtración para permanecer dentro de su ventana de tiempo importante, lo cual, a su vez, eleva los costos.

Sorprendentemente, se ha descubierto que los inconvenientes de dicha filtración de virus de la téenica anterior pueden ser superados mediante la filtración de la preparación respectiva, siendo u n medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, d urante al menos aproximadamente 24 horas a traves de u n filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm como máximo. Si el volumen requerido de las preparaciones respectivas se filtra durante una estructura de tiempo más larga , es decir, durante al menos 24 horas, la capacidad volumétrica de los filtros del virus incrementa enormemente. Sorprendentemente, se ha descubierto en forma adicional que se puede lograr una reducción de titulador de virus en general significativa durante este período de tiempo prolongado . Esto es especialmente benéfico en la eliminación de virus de corriente ascendente en sistemas de cultivo celular.

Por consiguiente, el método de la presente invención incrementa la eficiencia económica de la filtración de virus, incrementando el rendimiento y la capacidad volumétrica, respectivamente. El método de acuerdo con la presente invención opera en una capacidad volumétrica de al menos 2000 L/m2, ayudando de esta forma a maximizar el uso de filtros de virus de alta capacidad, disminuyendo los costos efectivos asociados con el mismo, y presentando una solución práctica en una gran escala y fácilmente integrable en los procesos de producción existentes.

Se podrá comprender el enorme impacto del método de acuerdo con la presente invención y el uso inventivo de los filtros de virus respectivos en procesos de fabricación estéril , en particular, procesos en donde se utilizan preparaciones esteriles, por ejemplo, medios y amortiguadores de cultivo celular, a través del siguiente ejemplo. Suponiendo que un metro cuad rado de una membrana de filtro de virus cuesta aproximadamente 3000 Euros en promedio , y se utiliza un medio de cultivo celular que cuesta aproximadamente 10 Euros por litro del medio, entonces los costos para 1000 L de medio con vi rus fi ltrado son de 13 Euros por litro de medio, lo cual incrementa los costos de los productos para la preparación del medio en aproximadamente el 30% . Si se pueden filtrar 2000 L con u na membrana de filtro de virus, entonces los costos d isminuyen a 1 1 .50 Euros. El incremento adicional de las capacidades volumétricas , por ejemplo, más allá de 5000 L reduce los costos a menos de 0.6 Euros por litro de med io, lo cual incrementa los costos para proporcionar un medio con virus filtrado considerablemente bajo. Como resultado, los altos costos de utilizar filtros de virus, en particular, en la descontaminación de corriente ascendente de la contaminación viral potencial , disminuye sign ificativamente incrementando la capacidad volumétrica del método de filtración de virus.

La presente invención se dirige completamente a este problema de los altos costos y baja capacidad volumétrica de los filtros de virus, respectivamente. La capacidad volumétrica del filtro de virus puede ser incrementada llevando a cabo la filtración de virus du rante al menos aproximadamente 24 horas a traves de u n filtro de virus que tiene u n tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo. Sorprendentemente, se ha descubierto que la capacidad volumétrica de los filtros de virus costosos utilizados, puede ser mejor explotada cond uciendo a un incremento de 2 a 100 veces en la capacidad volumétrica, manteniendo al mismo tiempo la integridad del filtro. Aunque un incremento de 2 a 3 veces en la capacidad volumétrica tiene un gran impacto en los costos del proceso de producción y la prod ucción relacionada, con el método de acuerdo con la presente invención se puede log rar un incremento de hasta 100 veces de la capacidad volumétrica o incluso más. Esto ofrece mayores oportunidades y hace a la eliminación de virus eficiente en costo, incluso con filtros de virus costosos que ahora han sido utilizados para incrementar en forma ad icional la segu ridad viral en procesos de cultivo celu lar, en particular, en la eliminación viral de la corriente ascendente de procesos de cultivo celular, procesos farmacéuticos, de diagnóstico y/o cosméticos y de alimento.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para eliminar un contaminante viral de una preparación, que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular. El método comprende someter la preparación a filtración du rante al menos aproximadamente 24 horas, a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo.

Además, la presente invención se refiere al uso de un filtro de virus q ue tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo en una filtración durante al menos aproximadamente 24 horas para la eliminación del contaminante viral de una preparación , siendo un medio de enltivo celular o al menos un componente de u n medio de cultivo celular.

Además , la presente invención se refiere al uso de una preparación , que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, que se puede obtener de acuerdo a cualquier metodo de la presente invención para el cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico, y/o cosméticas, así como en preparaciones alimenticias .

Todos los métodos y usos de acuerdo con la presente invención pueden operar en una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 L/m2, preferentemente al menos aproximadamente 3000 L/m2, lo más preferentemente al menos aproximadamente 5000 L/m2. Además, la preparación se somete a filtración y se lleva a cabo la filtración , respectivamente, durante al menos 24 horas o du rante al menos aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 7 meses o aproximadamente 72 horas hasta aproximadamente 3 meses. La filtración se lleva a cabo en una temperatura de aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 60°C , o de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40°C , preferentemente de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 37°C .

En todas las modalidades de la presente invención, se lleva a cabo filtración en una presión que fluctúa de aproximadamente 100 mbar hasta aproximadamente 4000 mbar, preferentemente de aproximadamente 200 mbar hasta aproximadamente 3500 mbar, lo más preferentemente de aproximadamente 1 000 mbar hasta aproximadamente 3000 mbar.

En todas las modalidades de la presente invención, el filtro de virus utilizado logra al menos un valor de reducción de 1 Log10 (LRV) para un contaminante viral .

Sorprendentemente, se ha descubierto que la capacidad volumetrica de filtros de virus puede ser enormemente incrementada cuando se opera el proceso de filtración durante al menos aproximadamente 24 horas. Normalmente, las preparaciones del enltivo celular, por ejemplo, medio de cultivo celular en volumen o amortiguadores, se filtran en forma de lotes dentro del aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 10 horas después de la preparación de las preparaciones en volumen con el objeto de evitar la contaminación de las preparaciones por parte de crecimiento bacteriano o viral. Se ha obtenido como resultado en la práctica , q ue la máxima capacidad de filtros de virus utilizados casi no es explotada en los procesos de filtración que filtran las preparaciones respectivas dentro de la estructura de tiempo de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 horas. Por consiguiente, se tiene que utilizar un área de filtro excesiva. En contraste con esto, se ha descubierto que debido al uso del metodo de la presente invención , la capacidad volumétrica de los filtros de virus costos utilizados, puede ser mejor explotada, lo que conduce a un incremento de 2 a 100 veces en la capacidad volumétrica, manteniendo al mismo tiempo la integridad del filtro. Aunque un incremento de 2 a 3 veces en la capacidad volumétrica ya tiene un g ran impacto en el proceso de costo de producción y los costos de producción relacionados, con el método de acuerdo con la presente invención se puede lograr un incremento de hasta 100 veces, o incluso más. Esto ofrece mayores oportu nidades y hace el costo de eliminación viral eficiente incluso con filtros de virus costosos, que ahora pueden ser utilizados para mejorar en forma adicional la seg uridad viral en los procesos de cultivo celular, en particular, en la eliminación viral de corriente ascendente de los procesos de cultivo celular, procesos farmacéuticos, de diagnóstico y/o cosméticos y alimenticios.

Las modalidades preferidas específicas de la presente invención , pod rán ser evidentes a partir de la descripción más detallada de ciertas modalidades que se encuentra a continuación y de las reivindicaciones adj untas.

Breve Descripción de los Dibujos Se elaboran descripciones más particulares de la presente invención , a traves de la referencia a ciertas modalidades de ejemplo de la misma, las cuales se ilustran en las figuras adjuntas. Estas figuras forman parte de la especificación. Sin embargo, se deberá observar, que las fig uras adju ntas ilustran modalidades de ejemplo de la presente invención , y por consiguiente no serán consideradas como que limitan su alcance.

La figura 1 , m uestra las cinéticas de filtración de virus llevadas a cabo aplicando una filtración de virus controlada por flujo (figura 1 C) utilizando diferentes filtros, todos combinados con un medio de cultivo celular suplementado con 3 diferentes lotes de hidrolizado de soya (Kerry HyPep 1510 #1 , DO MO SE50 MAF U F #1 y #2) .

Filtro y condiciones experimentales aplicadas (ver también Ejemplo 1 a Ejemplo 4) : Filtro A: Sartorius Virosart CPV, 1 80 cm2; a una temperatura de 30°C con rangos de flujo de aproximadamente 30 L/(m2 x hr).

Filtro B : Millipore Viresolve N FP 3.1 cm2; a una temperatura de 30°C con rangos de flujo de aproximadamente 40 a60 L/(m2 x h r) . Las filtraciones se llevaron a cabo durante hasta un máximo de 9 d ías o hasta q ue se excedió una presión máximo de 2000 mbar. La figura 1 A muestra la capacidad volumetrica , como volumen filtrado por área de superficie de membrana trazado contra el tiempo, que fluctúa de aproximadamente un m ínimo de 4000 L/m2 hasta aproximadamente 12000 L / m2. La presión máxima al final de la filtración fue de entre aproximadamente 600 mbar y 2400 mbar dependiendo del tipo del filtro (fig ura 1 B). En general, la diferencia entre los hid rolizados de soya es considerablemente baja para la capacidad volumétrica y la presión máxima .

La figura 2 , muestra las cinéticas de filtración de virus llevadas a cabo aplicando una filtración de virus controlada por flujo (figu ra 2C), utilizando diferentes filtros y un medio de cultivo celular suplementado con 3 diferentes lotes de hidrolizado de soya (Kerry HyPep 151 0 #1 , DOMO SE50 MAF UF #1 y #2) .

Filtro y condiciones experimentales aplicadas (ver también de Ejemplo 1 a Ejemplo 4) : Filtro A: Sartorius Virosart CPV, 1 80 cm2; a u na temperatura de 30°C con rangos de flujo de aproximadamente 30 L / ( m2 x hr).

Filtro D: Asahi BioEX 1 0 cm2; a temperatura ambiente (aproximadamente 22°C) con rangos de flujo de aproximadamente 20 L/(m2 x hr) . En contraste, con los experimentos descritos en la figura 1 , las filtraciones se llevaron a cabo durante un tiempo más largo de hasta 81 días, o hasta se alcanzó una presión de 2000 mbar. La fig ura 2A muestra la capacidad volumetrica como volumen filtrado por área de superficie de membrana trazado contra el tiempo, que fluctúa de aproximadamente un m ínimo de 16000 L/m2 (para el filtro A con DO MO SE50 MAF #2) hasta aproximadamente 35000 U m2 (para el filtro D con los 3 diferentes lotes de hidrolizado). La presión máxima al final de la filtración fue de entre aproximadamente 1200 mbar y 2000 mbar, dependiendo del tipo del filtro (figura 2B) . En general la diferencia entre los hidrolizados de soya es considerablemente baja para la capacidad volumétrica y la presión máxima .

La figura 3 , es u na g ráfica que muestra la relación entre la presión de flujo y diferencial tal como se observa a una temperatu ra de aproximadamente 22°C utilizando el Filtro A (Sartorius Virosart CPV 180 cm2), y el medio que contiene hidrolizado de soya DOMO SE50 MAF U F , Lote #2 (ver Ejemplo 5) .

Se requiere una presión m ín ima diferencial de aproximadamente 100 mbar para log rar un rango de flujo específico mínimo detectable, el cual posteriormente se incrementa en forma gradual con una correlación proporcional obviamente lineal entre el rango de flujo y presión d iferencial específico.

La figura 4, muestra la diferencia entre una filtración controlada por presión y controlada por rango de flujo utilizando el Filtro A (Sartorius CPV, 180 cm2) , y el medio con hidrolizado de soya Kerry HyPep 1 510 #2 (ver Ejemplos 1 a Ejemplo 4) .

Las filtraciones se llevaron a cabo durante 19 días y alcanzaron en este tiempo, una capacidad volumétrica de aproximadamente 6000 a 7000 L/m2. La presión final de la filtración controlada por flujo, fue comparable con la presión de la filtración controlada por presión (ver figura 4B) , y el rango de flujo específico final de la filtración controlada por presión fue comparable con el rango de flujo de la filtración controlada por rango de flujo (ver figu ra 4C). Esto demuestra que ambas estrategias de control para la filtración de virus, pueden dar como resultado una capacidad volumétrica comparable.

La figura 5, muestra los resultados de un experimento de bioreactor de 1 0 L utilizando un medio con virus filtrado versus un medio sin virus filtrado descrito en el Ejemplo 6. Los medios de cultivo celular fueron en forma de lotes con virus filtrado con el Filtro A antes del inicio del experimento. Los experimentos se llevaron a cabo con 3 diferentes hidrolizados de soya (Kerry HyPep 1510, Lote #1 ; DOMO SE50 MAF UF, Lote #1 y DOMO SE50 MAF U F, Lote #2). Los datos se calcularon a partir de las ú ltimas 3 semanas de un cultivo celular continuo de 4 semanas. Se pueden detectar diferencias entre el med io con virus filtrado respectivo (Soya 1 NF , Soya 3 N F y Soya 2 N F) versus su referencia no filtrada (Soya 1 , Soya 3 y Soya 2), a la productividad específica (figura 5A) , para la prod uctividad volumétrica (fig ura 5B) y el rango de crecimiento específico (figura 5C) .

La figura 6, muestra los resultados de un experimento de bioreactor de 1 20 L que utiliza un medio con virus filtrado versus medio sin virus filtrado descrito en el Ejemplo 7. Los medios de cultivo celular se filtraron en línea de la línea de la alimentación del medio de los bioreactores, utilizando en forma alternativa, el Filtro E (Sartorius Virosart CPV, 2000 cm2) y el Filtro F (M illipore Viresolve N FP 850 cm2) durante aproximadamente 58 días en modo contin úo. Los intervalos de tiempo y capacidad volumetrica de las alimentaciones del medio con virus filtrado se muestran en la figura 6A. Los datos se calcularon a los intervalos utilizando los diferentes filtros. No se pueden detectar diferencias entre el medio con virus filtrado versus la referencia no filtrada, respectivos, con respecto al rango de crecimiento específico (fig ura 6B) y la productividad volumétrica (figura 6C) .

La figura 7, muestra el cambio del titulador de infección M MV [TC I D50/mL] encontrado en muestras de filtrado en secuencias tomadas durante el enrso de filtración del medio incrementado con M MV que contiene h idrolizado de soya DOMO SE50 MAF#5 UF con filtros del virus del Filtro G (ASAH I Planova 15N) (ver Ejemplo 8) . Se observó u n rompimiento del virus de bajo nivel en 2 a 3 d ías. Sin embargo, se observó cómo efectiva la eliminación del virus.

La figura 8, muestra el cambio del titulador de infección M MV [TC ID 50/mL] encontrado en muestras de filtrado en secuencias tomadas durante el curso de la filtración del medio incrementado con MMV que contiene hidrolizado de soya (Corrida #1 con h id rolizado de soya DMV SE50 MAF U F #5; Corrida #2 con hidrolizado de soya DMV SE50 MAF U F #4) con los filtros de virus del Filtro D (Asahi BioEX) (ver Ejemplo 9) . No se observó rompimiento del virus y se observó la eliminación del virus como efectiva y completa.

La figura 9, muestra el cambio del titulador de infección M MV [TC I D50/mL] encontrado en muestras de filtrado en secuencias tomadas en el curso de la filtración del medio incrementado con M MV tal como se describe en el Ejemplo 10. No se observó rompimiento del virus para las corridas #1 y #2 (Filtro D), dando como resu ltado una eliminación del virus efectiva y total del medio que contiene hidrolizado de soya. Se observó rompimiento del virus debajo nivel para las corridas #3 y #4 (Filtro I) y corridas #5 y #6 (Filtro G), dando como resultado una eliminación de virus efectiva pero no completa del medio q ue contiene hidrolizado de soya . Se observó un rompimiento del virus más sig nificativo para las corridas #7 (Filtro B) y corrida #8 (Filtro H) dando como resultado factores de eliminación de virus red ucidos en el l ímite de importancia. Sin embargo, con todos los filtros, al menos en un experimento, se pudo log rar una reducción de un titulador general m ínima de más de aproximadamente 1 log TCI D50/mL.

Tabla 1 : Combinación de filtros de virus e h idrolizados de soya utilizados en experimentos de incremento La figura 10 muestra las cinéticas de una filtración viral llevada a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1 1 . Se mantuvo la presión entre 0.8 y 1 .2 bar (promedio 1 .1 bar) excepto para las interrupciones de presión y flujo intencionales, lo cual simula el peor caso de las condiciones de operación . Se lograron rangos de flujo iniciales de aproximadamente 38 L/(m2 x hr) , los cuales disminuyeron g radualmente hasta el final del experimento. Sin embargo, se puede mantener un rango de flujo mínimo de 4 L/(m2 x h r) . La duración general , incluyendo las interrupciones de presión , fue de 30 días. Se pasaron en el filtro aproximadamente 6500 L/m2.

La figura 1 1 , muestra el cambio del titulador de infección M MV [log io(TCI D5o/mL)] encontrado en las muestras de filtrado secuenciales tomadas en el curso de la filtración del medio incrementado con M MV tal como se describe en el ejemplo 1 1 . No se observó rompimiento del virus en ninguna de las 20 fracciones ensayadas. Las cargas de virus fluctuaron de < 0.9 [log 10(TCI D5o)] a < 2.8 [log10 (TC I D 5 o ) ] dependiendo del volumen de fracción . La cara de virus total en los filtrados fue de < 3.0 [log-io TCI D50)] lo cual - cuando se restó de la carga de virus inicial del material incrementado (es decir 8.5 [log 10(TC I D50)]) -se obtuvo como resultado un factor de red ucción de virus general de > 5.5 log10. Esto se observó cómo efectivo y completo.

Descri pción Detal lada de la Invención La presente invención proporciona un metodo para eliminar un contaminante viral de u na preparación, que es un med io de enltivo celular o al menos u n componente de un medio de cultivo celular. El método comprende someter la preparación a filtración d urante al menos aproximadamente 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo.

Además, la presente invención se refiere al uso de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo en una filtración d u rante al menos 24 horas para la eliminación del contaminante viral de u na preparación , siendo u n medio de cultivo celular o al menos un componente de un med io de cultivo celular.

Además, la presente invención se refiere al uso de una preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular q ue se puede obtener de acuerdo a cualquier metodo de la presente invención para el cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas así como en preparaciones alimenticias.

En todas las modalidades de la presente invención , la preparación se somete a filtración de virus , la filtración de virus o el uso del filtro del virus se lleva a cabo du rante al menos aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas , aproximadamente 4 d ías, aproximadamente 5 d ías, aproximadamente 6 d ías, aproximadamente 7 d ías, aproximadamente 1 semana , aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses o aproximadamente 7 meses. Además en u na modalidad , la preparación se somete a filtración de virus o la filtración de virus se lleva a cabo du rante aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 3 semanas, de aproximadamente 2 semanas hasta aproximadamente 3 semanas, de aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 4 semanas, de aproximadamente 2 semanas hasta aproximadamente 4 semanas, de aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 7 meses, de aproximadamente 1 meses hasta aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 5 meses, de aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 4 meses, de aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 3 meses o al menos de aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 7 meses o de aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 5 meses o de aproximadamente 72 horas hasta aproximadamente 3 meses. Además, en u na modalidad , la preparación se somete a filtración de virus o la filtración de virus se lleva a cabo durante más de aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 7 meses, preferentemente de aproximadamente una semana hasta aproximadamente 5 meses o de aproximadamente 3 semanas hasta aproximadamente 3 meses o de aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 3 meses.

El metodo de acuerdo con la presente invención pueden operar en una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 L/rn2, o al menos aproximadamente 3000 L/m2, o al menos aproximadamente 4000 L/m2 o al menos aproximadamente 5000 L/m2, al menos aproximadamente 7500 L/m2, al menos aproximadamente 10000 L/m2, o al menos aproximadamente 20000 L/m2. A este respecto, la “capacidad volumétrica” se refiere al volumen de solución que puede ser filtrada a través de un área específica de la membrana de filtro del virus antes de que se reduce el flujo de filtrado o se incrementa la contrapresión hasta condiciones de operación no deseables debido a la obstrucción de la membrana del filtro.

Se contempla que la presente invención , incluyendo todas las modalidades, se pueda emplear sola o ju nto con otros metodos conocidos en la téenica para minimizar la contaminación viral, por ejemplo, clasificación , abastecimiento, detección , desactivación viral, retención de absorción, etc. Los métodos de la presente invención se dirigen a la entrada de agentes virales no deseados a través de la preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un med io de cultivo celular, en las etapas tempranas en el proceso de producción, y proporcionar un mecanismo de reducción viral. Las ventajas de la presente invención incluyen la facilidad de implementación sobre una base a gran escala, el área de membrana de filtro red ucida necesaria para procesar un volumen de una preparación determinado, que es u n medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, aseg urando de esta forma el costo reducido. En particular, la filtración de virus de las preparaciones de acuerdo con la presente invención , es fácil de integ rar en procesos de fabricación continuos, por ejemplo, procesos de cultivo celular continuos tipos sistemas de bioreactor de perfusión o q uimioestato.

El término “temperatu ra”, tal como se utiliza en la presenta invención , se refiere la temperatura de las preparaciones filtradas de acuerdo con la presente invención , por ejemplo, un medio de cultivo celular o u n amortiguador, en el momento en que pasa a traves del filtro del virus. En una modalidad de acuerdo con la presente invención , la temperatura fluctúa de aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 60°C. En una modalidad , el límite inferior del rango de temperatura es de aproximadamente 2°C, aproximadamente 4°C, aproximadamente 8°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente 1 5°C , aproximadamente 20°C , aproximadamente 22°C , aproximadamente 25°C , aproximadamente 30°C, aproximadamente 37°C o aproximadamente 40°C . El límite superior del rango de temperatura de acuerdo con la presente invención es de aproximadamente 10°C , aproximadamente 20°C , aproximadamente 22°C , aproximadamente 25°C , aproximadamente 30°C , aproximadamente 37°C , aproximadamente 40°C , aproximadamente 50°C o aproximadamente 60°C . En una modalidad la temperatura está dentro del rango de aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 45°C, o a una temperatura dentro del rango de aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 40°C, o de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 40°C , o de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 37°C . También en una modalidad , la temperatura es temperatura ambiental, la cual está en un rango de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 30°C. Por supuesto, tambien se prefieren modalidades en donde las preparaciones se someten a filtración sin cualq uier calentamiento o enfriamiento adicional de las preparaciones. Por consiguiente, en una modalidad particular, se utiliza una temperatura de aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 30°C dependiendo de la temperatura del lugar respectivo en el cual se lleva a cabo la filtración . En otra modalidad , se utilizan temperaturas de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 37°C , por ejemplo, precalentando una preparación líq uida antes de filtración . El filtrado resultante a partir de esta filtración de u na preparación, puede alimentarse en forma continua a u n bioreactor.

En una modalidad de la presente invención , la filtración se lleva a cabo en u na presión que fluctúa de aproximadamente 100 mbar hasta aproximadamente 4000 mbar, o de aproximadamente 200 mbar hasta aproximadamente 3500 mbar. En una modalidad , la filtración del virus se lleva a cabo en un rango de presión , en donde el límite inferior es de aproximadamente 1 00 mbar, aproximadamente 200 mbar, aproximadamente 500 mbar, aproximadamente 1000 mbar, aproximadamente 1200 mbar, aproximadamente 1 500 mbar, aproximadamente 2000 mbar, aproximadamente 2500 mbar o aproximadamente 2800 mbar. El límite superior es de aproximadamente 1 200 mbar, aproximadamente 1 500 mbar, aproximadamente 2000 mbar, aproximadamente 2500 mbar, aproximadamente 2800 mbar o aproximadamente 3000 mbar. En u na modalidad, la filtración se lleva a cabo en una presión que fluctúa de aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 4000 mbar, aproximadamente 1500 hasta aproximadamente 3500 mbar, 1 700 mbar hasta aproximadamente 3300 mbar o aproximadamente 1 000 mbar hasta aproximadamente 2000 mbar.

Se pueden utilizar ajustes de presión de temperatura y presión en modalidades adicionales de la presente invención , para regular el rango de flujo específico y la capacidad volumetrica. Las mejorías adicionales en la capacidad volumétrica y la du ración de tiempo de uso de filtro de virus, se pueden obtener regulando otros parámetros del proceso, tal como la presión y temperatura de filtración . Por ejemplo, ha resultado q ue en alg unas modalidades, se prefiere someter la preparación a filtración a una temperatu ra de aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 40°C a una presión de aproximadamente 1000 mbar hasta aproximadamente 2000 mbar.

Los experimentos de filtración preliminares han demostrado la influencia de la temperatu ra de las preparaciones que serán filtradas en el rango de flujo específico. Se ha observado un incremento en el rango de flujo de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100%, cuando se incrementa la temperatu ra de filtración a partir de una preparación de acuerdo con la presente invención que tiene u na temperatu ra de almacenamiento de aproximadamente 4°C hasta temperatu ras de desde aproximadamente 18°C hasta aproximadamente 37°C . Sin embargo , todas estas modalidades están dentro del alcance, ya que el uso de filtración durante al menos aproximadamente 24 horas, hace que pueda ser mejor aprovechada la capacidad de los filtros de virus costosos utilizados, lo q ue conduce a un incremento de 2 a 100 veces de la capacidad volumetrica, manteniendo al mismo tiempo la integ ridad del filtro.

En una modalidad preferida, el método para eliminar un contaminante viral de una preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, comprende el paso de someter la preparación a filtración du rante al menos aproximadamente 1 0 días hasta aproximadamente 2 meses a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo en una presión de aproximadamente 1000 mbar hasta 2000 mbar y a una temperatura de 10°C a 40°C que tiene u na capacidad volumétrica de al menos 2000 L/m2. Por supuesto, también se pueden combinar con esta modalidad todos los otros parámetros. Además, como una modalidad preferida adicional, el método se lleva a cabo en un modo de filtración continuo, en donde la preparación es preferentemente un medio de cultivo celular, por ejemplo un medio de cultivo celular q ue comprende un hidrolizado de soya o un medio de cultivo celular q ue comprende componentes derivados de animal , en donde el filtrado es alimentado en forma continua a u n bioreactor, en particular un reactor de q uimiostato. En otra modalidad , esta modalidad puede ser llevada en forma adicional utilizando al menos 2 filtros de virus distribuidos en paralelo o en series.

Se contempla que los metodos de filtración de virus tal como aqu í se describe, puede utilizarse para reducir la contaminación viral de cualq uier preparación que sea un medio de cultivo celular o un componente de un medio de cultivo celular, es decir, un medio y amortiguadores adecuados para el crecimiento de células animales, y preferentemente células de mam ífero, en un cultivo celular in vitro. Normalmente, el med io de cultivo contiene u n amortiguador, sales, una fuente de energía, aminoácidos, vitaminas y elementos esenciales residuales.

El término “preparación” también incluye cualquier componente que sea una posible parte de un medio de cultivo celular en el sentido de la presente invención , y que tenga la capacidad de soportar el crecimiento de la célula adecuada en el cultivo. Las preparaciones incluyen por ejemplo, un amortiguador o soluciones de al menos un aminoácido o proteína; las soluciones de al menos u n vitamina; las soluciones de al menos una sal orgánica o inorgánica; o las soluciones que comprenden al menos una fuente de carbohidratos o azúcares.

Dentro del contexto de la presente invención el termino “valor de reducción Log” (LRV) es una medida de una eficiencia de membrana para retener una partícula, tal como una bacteria o virus, definida como el logaritmo (base 10) de la proporción del conteo de partículas en la corriente de alimentación al conteo de partículas en la impregnación de la membrana del filtro de virus. El valor LRV es específico de un tipo de partícula determinado. En una modalidad de acuerdo con la presente invención , el filtro del virus logra al menos u n valor de reducción 1 Log (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción 2 Log™ (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción 3 Log™ (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción 4 Log™ (LRV) para un contaminante viral, o al menos un valor de reducción 5 Log™ (LRV) para u n contaminante viral, o al menos un valor de red ucción 6 Log™ para un contaminante viral , o al menos un valor de red ucción 7 Log™ para u n contaminante viral , o al menos un valor de reducción 8 Log™ para un contaminante viral, preferentemente al menos un valor de reducción 4 Log™ (LRV) para un contaminante viral . Por supuesto , es evidente para un experto en la téenica que es benéfico cualquier valor de reducción Log™ (LRV) de un contaminante viral o potencial de la preparación que será filtrada, con el objeto de mejorar la seguridad de un proceso de prod ucción . Por consiguiente, especialmente este parámetro puede ser combinado con todos los otros parámetros que se utilizan en el metodo de la presente invención .

El término “flujo”, tal como se utiliza en la presenta invención , se utiliza de manera intercambiable con “rango de flujo específico" o “rango de flujo” y es una medida utilizada para caracterizar membranas, y se refiere al rango de flujo de filtrado (expresado en el volumen o peso de la solución que se filtra a través de la membrana de filtración del virus por área y tiempo de filtro , por ejemplo, L/(m2 x hr) . Dentro del contexto de la presente invención, el término “específico” significa dentro de un tiempo definido, sin embargo, cuando se utiliza únicamente “rango de flujo”, también de las u nidades de este parámetro, se puede apreciar de manera evidente que significa el “rango de flujo específico”. Como abreviatu ra de la cantidad se utiliza de manera intercambiable “volumen” proporcionado en una unidad de “litro” “I” o “L”. El rango de flujo específico dentro del método de la presente invención , puede variar dentro de un rango , o permanecer sustancialmente fijo a lo largo de la d uración del proceso de filtración utilizando un filtro de virus determinado. En una modalidad de la presente invención el rango de flujo específico puede fluctuar de aproximadamente 5 L / (m2 x hr) hasta aproximadamente 500 L / (m2 x hr) durante al menos 24 horas hasta aproximadamente 7 meses. El límite inferior para el flujo puede ser de aproximadamente 5 L / (m2 x hr) o aproximadamente 10 L / (m2 x hr) . El límite superior puede ser de aproximadamente 25 L / (m2 x hr) , aproximadamente 75 L / (m2 x hr) , aproximadamente 100 L / (m2 x hr), aproximadamente 200 L / (m2 x hr) , aproximadamente 250 L / (m2 x h r) , aproximadamente 300 L / (m2 x hr) o aproximadamente 500 L / (m2 x h r). El flujo puede fluctuar además de aproximadamente 5 L / (m2 x hr) hasta aproximadamente 100 L / (m2 x hr) , aproximadamente 10 L / (m2 x h r) hasta aproximadamente 1 00 L / (m2 x hr) o aproximadamente 10 L / (m2 x hr) hasta aproximadamente 25 L / (m2 x hr).

El “filtración por lote”, de otra manera conocida como “filtración en forma de lote” o “filtración elaborada en modo de lotes” se refiere en la presente invención a u n proceso en donde se filtra u na cantidad total específica o volumen de una preparación , que es un medio de enltivo celular o al menos un componente de u n medio de cultivo celular, a traves un filtro de virus en un lote que depende de la capacidad del filtro de virus, y en donde el proceso de filtración se finaliza antes de q ue el filtrado se dirija o alimente al proceso en el cual se utiliza o consume.

El término “filtración continua” o “filtración online” o “filtración en línea” se refiere a un proceso de filtración, en donde la cantidad o volumen total específico en una preparación , que es un medio de enltivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, se filtra a traves del filtro de virus que depende en forma continua de la capacidad del filtro de virus, y en donde el proceso de filtración aún va cuando el filtrado ya se dirige o se alimenta al proceso en el cual se utiliza o consume.

Todas las modalidades de la presente invención pueden llevarse a cabo utilizando filtración por lotes o continúas. El efecto benéfico de la presente invención , ya se puede lograr sometiendo u na preparación , que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cu ltivo celular a filtración durante al menos 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo, con el objeto de eliminar un contaminante viral de la preparación .

En una modalidad preferida de acuerdo con la presente invención , el método para eliminar un contaminante viral de una preparación , que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular, en donde la preparación se somete a filtración d u rante al menos aproximadamente 24 horas a través un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo, se lleva a cabo como una filtración continua. Este modo de operación tienen la ventaja de q ue el filtrado producido de la preparación , puede ser alimentado al proceso en forma d irecta y continua, en donde se utiliza o consume. En una modalidad preferida adicional, la preparación de virus filtrada, que es un medio de cultivo celular o al menos u n componente de un medio de cultivo celular, puede alimentar directa o continuamente un bioreactor, más preferentemente u n bioreactor a gran escala utilizado en un proceso de cultivo celular de alimentación continúa, por ejemplo, un proceso de quimioestato , un proceso de perfusión o u n proceso de alimentación por lotes. Esta modalidad se lleva a cabo en una modalidad utilizando u na presión de aproximadamente 1000 mbar a 2000 mbar y u na temperatura de 10°C a 40°C , en donde la capacidad volumetrica es de al menos 2000 L/m2 o al menos 5000 L/m2. Además , se prefiere en forma adicional q ue la filtración del virus de la preparación se lleva a cabo durante al menos aproximadamente 24 horas o aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 7 meses, más preferentemente durante al menos aproximadamente un semana hasta aproximadamente 5 meses, y lo más preferido d u rante al menos aproximadamente u na aproximadamente 3 semanas o aproximadamente 3 semanas hasta aproximadamente 3 meses, incluso más preferido al menos aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 meses. Por supuesto, se pueden combinar con esta modalidad todos los otros parámetros. Además, se prefiere que la preparación que será filtrada sea un medio de cultivo celular y el modo de filtración es una filtración de modo continuo.

Por supuesto , los expertos en la teenica saben que las preparaciones de virus filtrada obtenidas de acuerdo con cualquiera de los métodos de acuerdo con la presente invención , también pueden dirigirse o alimentarse a otros procesos de producción que se relacionan con el cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas así como preparaciones de alimentación . También en dichas modalidades, se prefiere una filtración continua de las preparaciones.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso de una preparación , que es un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular que se puede obtener de acuerdo con cualquiera de los métodos de acuerdo con la presente invención para cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico, y/o cosméticas, así como preparaciones de alimentación .

En alg unas modalidades, el medio de cultivo celular que será filtrada contra virus es estéril , o es tratada previamente de otra forma. En algunas modalidades, el medio de cultivo celular comprende proteínas animales o suero u otros componentes derivados de animales, o son componentes libres de proteína animal , libres de suero o libres de componentes derivados de animales, o poseen cualquier combinación de las característica anteriores. En otras modalidades, el medio de cultivo celular comprende diversas concentraciones y especies de hidrolizados derivados de plantas o microbios, especialmente hidrolizados de soya . En una modalidad preferida, el medio de cultivo celular es un medio libre de proteína animal que comprende diversas concentraciones de al menos un hid rolizado de soya. Sin embargo, se ha enfatizado que el metodo de acuerdo con la presente invención es especialmente adecuado para filtración de virus de preparaciones que comprenden componentes derivados de proteína animal o suero u otros componentes derivados de animales, con el objeto de mejorar en forma adicional la seguridad virológica de dichas preparaciones, en particular cuando se utilizan en procesos de cultivo celular, en preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico, y/o cosméticas así como en preparaciones alimenticias.

El “medio de cultivo celular” se define, para los propósitos de la presente invención, como un medio adecuado para el crecimiento de las células, y preferentemente células animales , más preferentemente células de mam ífero , en cultivo celular in vitro. Se puede utilizar cualquier medio con la capacidad de soportar el crecimiento de las células adecuadas en cultivo celular. El medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención , puede estar basado en cualquier medio basal tal como DMEM , Ham's F12, Médium 1 99, McCoy o RPM I generalmente conocidos para los expertos en la téenica. El medio basal puede comprender un número de ingredientes, incluyendo aminoácidos , vitaminas, sales orgán icas e inorgánicas , y fuentes de carbohidrato, cada ing rediente estando presente en una cantidad que soporta el cultivo de u na celula, lo cual generalmente es conocido para los expertos en la téenica . El medio puede contener sustancias auxiliares, tal como sustancias amortiguadoras tipo bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizadores para contrarrestar la tensión mecánica o inhibidores de proteasa. Si se requiere, se puede agregar como un agente de eliminación de espuma un tensoactivo no iónico tal como mezclas de polietilenglicoles y polipropilenglicoles (por ejemplo, Pluronic F68. RTM . , SERVA) .

Tal como se utiliza en la presente invención , un “medio q ue comprende una proteína animal” es un medio de cultivo celular que comprende cualquier proteína q ue ha sido derivada de una fuente humana o una fuente animal .

Tal como se utiliza en la presente invención , un “medio libre de proteína” es un medio de cultivo celular que está libre de cualquier proteína q ue ha sido derivada de una fuente humana o u na fuente animal .

El término “medio de cultivo celular libre de proteína animal” de acuerdo con la presente invención , se refiere a un medio que no contiene proteínas y/o componentes de proteína de eucariotos multicelulares superiores que no proceden de plantas. Las proteínas típicas que son evitadas, son las que se encuentran en suero y sustancias derivadas de suero, tal como albúmina, transferina , insulina y otros factores de crecimiento.

El medio de cultivo celular libre de proteína animal tambien está libre de cualquiera productos derivados de animal pu rificados y productos derivados de animal recombinantes, así como digestiones y extractos de proteína de los mismos o extractos de lípidos o componentes purificados de los mismos. Las proteínas animales y los componentes de proteínas serán d isting uidos de las proteínas no animales, péptidos pequeños y oligopéptidos que se puedan obtener de plantas (normalmente 10 a 30 aminoácidos de longitud), tal como frijol de soya, y eucariotos inferiores , tal como levad ura que se pueden incluir en el medio de cultivo celular libre de proteína animal de acuerdo con la presente invención .

El término “hidrolizado” incluye cualquier digestión de un material fuente derivado de animal o derivado de planta, extractos derivados de levadura o bacterias. En el medio de cultivo celular de acuerdo con la presente invención, el “hidrolizado de soya” puede estar comprendido de manera que pueda ser un hidrolizado de soya altamente purificado, un hidrolizado de soya purificado o un h idrolizado de soya crudo.

El término “que comprende suero” tal como se aplica al medio, incluye cualquier medio de cultivo celular que no contenga suero.

El término “libre de suero” tal como se aplica al med io, incluye cualquier medio de cultivo celular que no contenga suero. Por el término “libre de suero”, q ueda entendido que el med io tiene preferentemente menos del 0.1 % de suero y más preferentemente menos del 0.01 % de suero. El termino “suero” se refiere a la parte de fluido de la sang re obtenida después de la eliminación del coágulo de fibrina y las células de sangre.

En algunas modalidades, el filtrado o el flujo del filtrado obtenido del proceso de filtración se alimenta en u n cultivo celular y bioreactor a gran escala, respectivamente. Un cultivo celular “a g ran escala”, tal como se utiliza en la presenta invención , se refiere a un cultivo celular en u na escala de al menos aproximadamente 100 L, al menos aproximadamente 200 L, al menos aproximadamente 300 L, al menos aproximadamente 400 L, al menos aproximadamente 500 L, al menos aproximadamente 1000 L, al menos aproximadamente 1500 L, al menos aproximadamente 2000 L, al menos aproximadamente 2500 L, al menos aproximadamente 3000 L, al menos 4000 L, al menos aproximadamente 5000 L, al menos aproximadamente 7500 L, al menos aproximadamente 10000 L o al menos aproximadamente 20000 L. En una modalidad preferida el flujo de filtrado obtenido en cualquier método de acuerdo con la presente invención se alimenta a un bioreactor usado en un proceso de q uimiostato , a un proceso de perfusión o un proceso de alimentación por lotes, preferentemente mediante filtración continua.

El cultivo celular aquí contemplado puede ser cualquier cultivo celular independientemente del tipo y natu raleza de las celulas cultivadas y la fase de crecimiento de las células cultivadas, por ejemplo, células adherentes o no ad herentes; crecimiento o células con detención de crecimiento.

El término “estéril”, tal como se utiliza de acuerdo con la presente invención , se refiere a una sustancia que es libre, o esencialmente libre, de contaminación microbiana y/o viral. A este respecto, el “contaminante” significa un material que es diferente a los componentes deseados en una preparación que es un medio de enltivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular. Dentro del contexto de “filtración estéril”, el término “filtración estéril” es una descripción funcional de la filtración de una preparación a través de un filtro estéril para eliminar los contaminantes bacterianos y/o de micoplasma.

El término “filtración de virus”, se utiliza en la presente invención de manera intercambiable con el término “nanofiltración” y significa que para el proceso de filtración, se utiliza u n filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo, definido. En general, dichos filtros estánd dedicados a eliminas virus.

El contaminante viral dirigido para eliminación med iante filtración de acuerdo con todos los métodos de la presente invención , puede ser cualquier virus actualmente conocido en la téenica o que será descubierto en el futuro. Esta definición también incluye un contaminante viral potencial q ue será eliminado mediante filtración , y tambien incluye q ue se elimine más de un virus a través de los métodos de la presente invención . Por ejemplo, el contaminante viral o contaminante viral potencial puede ser un miembro de las familias virales de Orthomyxoviridae, Arenaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Togaviridae, Arteriviridae, RetParvoviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Retroviridae, Reoviridae, Circoviridae, Adenoviridae , Poxviridae, Herpesviridae , Iridoviridae o Reoviridae. Más específicamente, el contaminante viral puede ser cualquier g rupo q ue consiste en un parvoviridae canino (C PV), virus de ratón pequeño (MVM) , virus Cache Vallcy, virus Bunyamwera, virus de encefalitis de Northway, virus de I nfluenza A/B, virus de Junin , virus de Parainfluenza 1 /2/3, virus de Simio 5, virus de paperas, virus sincitial respiratorio de Bovino, virus Sendai, virus de enfermedad de Newcastle, virus de Neumonía de ratón , virus de estomatitis vesicular, virus de Rabia, coronavirus de Bovino , virus de hepatitis de M úrido, virus de fiebre Amarilla, virus del N ilo Occidental , virus del Dengue, virus de encefalitis llevado por Garrapata, virus de encefalitis de St. Louis, Vesivirus 21 17, virus de Encefalomiocarditis, virus de Coxsackie B-3, virus de encefalitis de ratón de Theiler, virus de enfermedad de Pies y boca, enterovirus de Bovino, enterovirus de Porcino , virus del Bosque de Semliki, virus de Sindbis, virus de Rubéola, virus de encefalitis Japonesa , virus de encefalitis de equmo Oriental, virus de síndrome reproductivo y respiratorio de Porcino, virus Espumoso, Reovirus 1 /2/3, reovirus Avian , Rotavirus, circovirus 1 de Porcino, Adenovirus , virus de Pseudorabia, gammaherpes de M úrido 68, virus de Herpes simple 1 , virus de Sapo 3, virus pequeño de cortada de ratón (MVMc) , virus de lengua azul (BTV), virus de enfermedad hemorrágica de Epizootic (EH DV) , virus de diarrea viral de bovino (BVDV) , parvovirus de porcino (PPV), virus de encefalomiocarditis (EMCV), Reovirus 3, y virus de leucemia de múrido (M uLV), Hepatitis A, polio, o Parvoviridae B 19.

El termino “filtro de virus”, se utiliza de manera intercambiable en la presente invención con los términos “filtro de retención de virus”, “filtro viral” y “nanofiltro” y se refiere generalmente a un filtro cuyas características, como una totalidad, lo hacen adecuado para retención de virus que tiene un tamaño de poro efectivo para cumplir con esta función . Estas características incluyen, a manera de ejemplo, tributos de membrana tal como morfolog ía , tamaño de poro, densidad de poro , y uniformidad , tamaño de poro efectivo, grosor de membrana , etc. Las membranas de filtro de virus útiles en la presente invención comprenden membranas que operan mediante exclusión por tamaño y carga, y posiblemente en combinación con retención de absorción . Los mecanismos de exclusión por tamaño y de retención de absorción no son exclusivos necesariamente uno del otro, y un filtro puede emplear tambien u no o más mecanismos.

El filtro de virus, tal como se define en la presente invención y el cual se utiliza en una modalidad de la presente invención , está caracterizado por tener una membrana con un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo. En una modalidad de acuerdo con la presente invención , el límite inferior del tamaño de poro efectivo es de aproximadamente 5 nm , aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm , aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm o aproximadamente 60 nm . En dicha modalidad de acuerdo con la presente invención , el límite superior del tamaño de poro efectivo es de aproximadamente 10 nm, aproximadamente 1 5 nm, aproximadamente 20 nm , aproximadamente 25 nm , aproximadamente 35 nm , aproximadamente 50 nm , aproximadamente 60 nm o aproximadamente 75 nm. En algunas modalidades de la presente invención, el filtro de virus tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35 nm .

El tamaño de poro efectivo, tal como se utiliza en la presenta invención , es una característica de una membrana y se refiere al tamaño de una partícula que puede ser retenida efectivamente por la membrana , considerando q ue el nivel de efectividad se describe a traves de un factor de reducción logarítmico de una partícula de dicho tamaño.

El filtro de virus utilizado en los métodos de la presente invención , puede ser cualquier filtro que tenga u na construcción suficiente para soportar una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 L/m2, o al menos aproximadamente 3000 L/m2, o al menos aproximadamente 4000 L/m2 o al menos aproximadamente 5000 L/m2, o al menos aproximadamente 7500 L/m2, o al menos aproximadamente 10000 L/m2 o al menos aproximadamente 20000 L/m2, o que pueda operarse durante un tiempo mayor aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 7 meses o preferentemente d urante al menos aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 4 d ías , aproximadamente 5 d ías, aproximadamente 6 d ías, aproximadamente 7 d ías, aproximadamente 1 semana , aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses o aproximadamente 7 meses.

Por supuesto, si se utiliza más de u n filtro en un metodo de acuerdo con la presente invención , también se pueden utilizar diferentes tipos de filtros de virus y combinarse en el proceso de filtración , preferentemente en paralelo o en serie.

El filtro de virus de ejemplo comprende u na membrana simple o de capas múltiples y se construye de materiales tales como fluoru ro de polivinilideno (PVDF) , celulosa, celulosa modificada, por ejemplo, fibras huecas de celulosa regeneradas por cupramonio o poliétersulfona. Las membranas de los filtros del virus pueden tener una carga neutral , negativa, o positiva. Las membranas pueden ser membranas iónicas, es decir, pueden contener grupos catiónicos o aniónicos , au nque las membranas neutrales pueden ser preferidas dependiendo de las condiciones de pH . Las membranas de filtro de virus pueden ser seleccionadas de membranas h idrofóbicas e hidrofílicas. En una modalidad preferida, la membrana del filtro de virus utilizada en el método de acuerdo con la presente invención se elabora de un fluoruro de polivinilideno (PVDF) o poliétersulfona.

Los fabricantes de los filtros de ejemplo que tienen capacidad de mostrar para eliminar los virus incluyen , sin exclusión , Asah i/Planova, PALL, Millipore, Sartorius, Gambro, y Amersham/AG Tech nology. Los filtros adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen , sin limitación el filtro Asahi's Planova 15 N (Asahi Kasei Corporation , Planova División) , filtro Planova 20 N (Asahi Kasei Corporation , Planova División) , filtro Planova 35 N (Asahi Kasei Corporation , Planova División) , y el filtro BioEX (Asahi Kasei Corporation , Planova División) .

Por supuesto , es deseable que el filtro utilizado en uno de los metodos de la presente invención , tenga la capacidad de autoclave y/o con autoclave y/o esterilizado de otra forma antes de utilizarse. Sin embargo, todas las otras posibilidades para asegurar la esterilidad del filtro de virus utilizado son adecuadas para llevar a cabo la presente invención . Además, es deseable que el filtro pueda ser probado con respecto a la integridad antes del uso y/o después del uso. En una modalidad preferida, el método de acuerdo con la presente invención, se utiliza un filtro de virus probado con respecto a integridad, de autoclave , que tiene una membrana de fluoru ro de polivinilideno (PVDF) o poliétersulfona.

El filtrado, utilizado de manera intercambiable con la presente invención con el término “impregnación", se refiere a la solución que atraviesa un filtro o membrana, así como la solución que ha cruzado un filtro o membrana .

La “retención”, tal como se utiliza en la presenta invención , se refiere al componente de la solución que es retenido y no cruza un filtro o membrana , así como q ue no ha cruzado un filtro o membrana.

El eq uipo de filtración del virus útil en la presente invención , comprende al menos un elemento de membrana de filtración de virus que divide la alimentación en una sección pre y post filtro. El eq uipo de filtración normalmente tambien incluye medios para controlar la presión y flujo, tal como bombas y válvulas y medidores de flujo y presión y medidores de densidad . El equipo también puede incluir diversos elementos de membrana de filtración en diferentes combinaciones, ajustadas en paralelo, o en serie, o ambos.

El flujo de filtración varía de acuerdo con la presión . En general, en un rango de operación normal, entre mayor es la presión , mayor es el flujo. El flujo también varía con la temperatura. Un incremento de la temperatu ra de operación incrementa el flujo. Sin embargo, con mayores temperaturas y con mayores presiones, existe una tendencia incrementada de una ruptura de membrana. Para membranas inorgánicas, se pueden utilizar temperaturas y presiones mayores y rangos de pH mayores q ue las membranas poliméricas. U n experto en la téenica, es evidente de manera no ambigua q ue en lugar de un filtro de virus de acuerdo con la presente invención , se puede utilizar un filtro que tiene un corte de peso molecular menor a aproximadamente 5000 Daltons o menor a aproximadamente 1000 Daltons con el objeto de eliminar también virus. En este contexto, el “Corte de peso molecular” (MWCO) es una membrana característica de un filtro que específica el peso molecular promedio de los solutos, sin embargo, tampoco partículas y virus impregnaran la membrana de este filtro.

El valor de pH en el proceso de filtración de virus de la presente invención , puede ajustarse en cualq uier rango necesario para conservar la estabilidad y funcionalidad de la preparación que está siendo filtrada, preferentemente un medio de cultivo celular o amortiguador. Por ejemplo, el valor de pH puede ajustarse aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10, preferentemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 o de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7, preferentemente de aproximadamente 6.8 hasta aproximadamente 8 o lo más preferentemente de aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 7.45 (valor de pH fisiológico).

Tambien está contemplado que el método de acuerdo con la presente invención puede integrarse en una corriente descendente del sistema de un filtro de grado de esterilización que elimina los contaminantes bacterianos y de esta forma prod uce una corriente de alimentación estéril de una preparación q ue puede ser la “preparación de partida”, es decir, la preparación que se utiliza en cualquier método de la presente invención .

En una modalidad , el método de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando dos o más filtros ajustados en serie. Esto tiene la ventaja de aumentar la capacidad de despeje del virus y proteger contra una falla o rompimiento potencial del filtro de virus. En modalidades alternativas, la filtración se lleva a cabo utilizando dos o más filtros de virus ajustados en paralelo, permitiendo de esta forma un reemplazo del filtro de virus sin interrumpir un proceso contin uo y evitar retenciones del medio imprevistas, por ejemplo, debido a obstrucción .

Aún en otras modalidades, la filtración se lleva a cabo utilizando al menos dos filtros ajustados en paralelo en un sistema de tubería que comprende una unión en forma de Y, en donde cada filtro está en comunicación de fluidos con una ramificación de la unión en forma de Y, y una fuente de suministro de la preparación . En alg unas modalidades, la unión con forma de Y comprende un conector. En otras modalidades, la filtración se lleva a cabo utilizando una preparación que contiene una pluralidad de filtros ajustados tanto en serie como en paralelos. Especialmente útil dentro del contexto de la presente invención es una distribución , en donde se ajusta al menos u n segundo filtro en forma paralela en conexión con otros filtros paralelos o filtros ajustados en serie, con el objeto de tener la posibilidad de reemplazar uno de los filtros sin detener el proceso de filtro por razones de mantenimiento.

En algunas modalidades, el filtro se somete a una prueba de integ ridad antes de utilizarse. La prueba de integridad puede tomar la forma de u na prueba a base de difusión de aire-agua, en donde se dirige aire al filtro y posteriormente el filtro se sumerge en agua esteril y se revisa con respecto a burbujas, lo cual podría indicar una filtración en el filtro.

En una modalidad , el filtro del virus o la membrana del filtro del virus puede ser tratada previamente antes del procedimiento de filtración de virus, por ejemplo, lavando un agente de lavado, en particular con u n agente de lavado ácido, un agente de lavado alcalino y/o etanol .

En una modalidad de la presente invención , tambien se puede llevar a cabo una filtración de flujo tangencial en el método de acuerdo con la presente invención . Dentro del contexto de la presente invención , la “filtración de flujo tangencial”, se utiliza de manera intercambiable en la presente invención con el término “filtración de flujo cruzado”. En el modo de flujo tangencial , la trayectoria de fluido líquido en la parte de corriente ascendente del filtro, se dirige en forma paralela o en forma tangencial o cruza la superficie del filtro. El paso de la impreg nación se facilita restringiendo el flujo de la retención relativa a la alimentación, dando como resultado una contra presión en el sistema y permitiendo la migración de la impregnación a través de la membrana del filtro. La corriente de barrido constante a través de la superficie de membrana tiene el efecto de minimizar la obstrucción por parte de los contaminantes en el producto q ue está siendo filtrado. Cualquier filtro de virus es adecuado siempre que log re al menos u n valor de reducción 1 Log10 (LRV) para un contaminante viral , o al menos u n valor de reducción 2 Log10 (LRV) para un contaminante viral, o al menos u n valor de reducción 3 Log 10 (LRV) para un contaminante viral, o al menos u n valor de reducción 4 Log 10 (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción 5 Log 10 (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción 6 Log10 para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción 7 Log10 para un contaminante viral, o al menos un valor de reducción 8 Log1 0 para un contaminante viral, preferentemente al menos un valor de reducción 4 Log 10 (LRV) para un contaminante viral. Todos los factores de reducción log pueden aplicar para cualquiera de los tamaños de poro efectivos de 75 nm máximo del filtro de virus. En una modalidad de acuerdo con la presente invención , el límite inferior del tamaño de poro efectivo del filtro del virus es de aproximadamente 5 nm , aproximadamente 10 nm , aproximadamente 1 5 nm , aproximadamente 20 nm , aproximadamente 25 nm , aproximadamente 30 nm , aproximadamente 35 nm , aproximadamente 50 nm o aproximadamente 60 nm. En la modalidad de acuerdo con la presente invención , el límite superior del tamaño de poro efectivo del filtro del virus es de aproximadamente 10 nm , aproximadamente 1 5 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 60 nm o aproximadamente 75 nm . En algunas modalidades de la presente invención , el filtro del virus tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 35 nm .

En algunas modalidades de la presente invención , se utiliza filtración de flujo normal . El término “filtración de flujo normal”, utilizado de manera intercambiable con los términos “extremo muerto”, “pase simple” y “filtración de flujo directo”, se refiere a un proceso de filtración de filtro de virus en donde la trayectoria de flujo del líquido se dirige normalmente en forma perpendicular a la superficie del filtro, dependiendo de la construcción del módulo del filtro , la corriente de fluido también puede ser dirigida en forma tangencial a la membrana del filtro, sin embargo en contraste con la filtración de flujo de cruce, no se aplica recirculación de la retención , lo cual significa que el rango de flujo específico antes y después del filtro es idéntico. Cualquier filtro de virus es adecuado siempre que logre al menos un valor de reducción de 1 Log 1 0 (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción de 2 Log o (LRV) para un contaminante viral, o al menos un valor de reducción de 3 Log1 0 (LRV) para un contaminante viral, o al menos un valor de reducción de 4 Log1 0 (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción de 5 Log10 (LRV) para un contaminante viral, o al menos u n valor de reducción de 6 Log1 0 (LRV) para u n contaminante viral, o al menos un valor de reducción de 7 Log 1 0 (LRV) para un contaminante viral , o al menos un valor de reducción de 8 Log10 (LRV) para un contaminante viral, preferentemente al menos un valor de reducción de 4 Log10 (LRV) para un contaminante viral . Todos los factores de reducción logarítmicos pueden aplicar para cualq uiera de los tamaños de poro efectivos de 75 nm máximo del filtro de virus. En una modalidad de acuerdo con la presente invención , el l ímite inferior del tamaño de poro efectivo del filtro de virus es de aproximadamente 5 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm , aproximadamente 30 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm o aproximadamente 60 nm. En la modalidad de acuerdo con la presente invención , el límite superior del tamaño de poro efectivo del filtro de virus es de aproximadamente 10 nm, aproximadamente 1 5 nm , aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm , aproximadamente 35 nm, aproximadamente 50 nm , aproximadamente 60 nm o aproximadamente 75 nm . En algunas modalidades de la presente invención , el filtro de virus tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35 nm.

Los expertos en la teenica pod rán apreciar, que todas las modalidades de la presente invención pueden ser implementadas con la ayuda de cualquier sistema disponible técnicamente útil para el propósito, por ejemplo , una bomba peristáltica de velocidad variable o velocidad fija, una bomba centrífuga, etc. También se puede utilizar cualquier tipo de envase presurizado u otro contenedor para generar flujo a través del filtro de virus con presión constante o variable durante el proceso de filtración .

Los expertos en la técnica apreciarán que la elección del tipo y modo del filtro (filtración de extremo muerto o filtración de flujo tangencial) dependerá de factores tales como la composición , el contenido de proteína , la d istribución de peso molecular, la carga de impureza/particulado o cualquier otra propiedad bioqu ímica o física en la alimentación que será procesada , req uerimientos y limitaciones del proceso (presión disponible, tiempo del proceso, volúmenes que serán filtrados) o características del contaminante viral potencial, por ejemplo, tamaño de virus . La disponibilidad de una prueba de integridad en proceso y las log ísticas de estudios de despeje viral, también pueden ser tomadas en consideración . La filtración de extremo muerto normalmente debe emplearse para corrientes de alimentación con alta pureza para prod ucir un flujo de proceso razonable , mientras que en algu nas modalidades, la filtración del flujo tangencial puede acomodar las corrientes de alimentación con una alta carga de particulado. En algunas modalidades preferidas, se prefiere una filtración de flujo normal en combinación con un modo de filtración continuo utilizando al menos un filtro de virus que tenga u n tamaño de poro de 75 nm máximo. Por supuesto, esta modalidad tambien puede ser combinada con todos los otros parámetros de la presente invención .

Por supuesto, quedará entendido que la presente invención no se limita a las modalidades particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También quedará entendido que la terminolog ía aquí utilizada es con el propósito de describir únicamente modalidades particulares, y no estáproyectada para ser limitante, ya q ue el alcance de la presente invención será limitado ú nicamente por las reivindicaciones adju ntas.

Cuando se proporciona un rango de valores, queda entendido que cada valor de intervención, hasta la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el texto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de d icho rango y cualquier otro valor manifestado o de intervención en dicho rango manifestado, está comprendido dentro de la presente invención . Los límites superiores e inferiores de estos rangos menores, pueden ser incluidos independientemente en los rangos menores, y tambien estar comprendidos dentro de la presente invención , sujetos a cualq uier límite específicamente excluido dentro del rango manifestado. Cuando el rango manifestado incluye u no o ambos l ímites, los rangos que incluyen cualquiera o ambos de estos l ímites incluidos, también están incluidos en la presente invención .

A menos q ue se defina de otra forma, todos los términos téenicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado al comú nmente comprendido por un experto en la técnica a la cual pertenece la invención. Aunque también se pueden utilizar cualquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aqu í descritos en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales ilustrativos, representativos .

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente especificación están incorporadas a la misma como referencia, como si cada publicación o patente individual fuera específica e individualmente indicada como incorporada como referencia , y se incorporan a la presente invención como referencia para detallar y describir los métodos y/o materiales en relación con las publicaciones que se mencionan . La mención de cualq uier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no deberá construirse como una admisión de que la presente invención no está titulada para anteceder dicha publicación en virtud de la teenica anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas deben ser d iferentes a las fechas de publicación reales, las cuales puede ser necesario que se confirmen de manera independiente.

Se deberá observar que, tal como se utiliza en la presente descripción y las reivindicaciones adju ntas, las formas sing ulares “un”, “uno, una”, y “el, la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario . Deberá observarse en forma adicional que las reivindicaciones pueden ser redactadas para excluir cualquier elemento opcional . Por lo tanto, esta manifestación no pretende servir como una base de antecedente para el uso de la terminolog ía exclusiva tal como “solamente”, “únicamente”, y similares en relación con la mención de los elementos reivindicados, o el uso de una limitación “negativa”.

Tal como lo apreciarán los expertos en la técnica al momento de la presente descripción , cada una de las modalidades individuales descritas e ilustradas en el presente documento, tiene componentes y características independientes q ue pueden ser fácilmente separados o combinados con las características de cualquiera de las otras diversas modalidades sin apartarse del alcance o espíritu de la presente invención . Cualquier método mencionado puede ser llevado a cabo en el orden de eventos mencionados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

EJ EMPLOS A continuación se proporcionan ejemplos que ilustran la presente invención . Estos ejemplos no pretenden restringir la presente invención a cualquier aplicación o teoría de operación en particular.

Ejemplo 1 : Red ucción de filtración de virus con diferentes filtros de virus y medios de cultivo celular.

Se evaluaron membranas de filtración de virus de diferentes fabricantes (ver tabla 2) con respecto a sus cineticas de filtración en diferentes tamaños de filtro con el medio de cultivo celular que contiene una concentración de hidrolizados de soya de 4 g/L de diferentes lotes y proveedores (ver tabla 3) . La composición y preparación del medio de cultivo celular se describe en el Ejemplo 2. Se llevaron a cabo experimentos de filtración controlando la presión con un envase presurizado (figura 3, figura 4, figura 5 y experimentos de incremento en la figura 7, figura 8 y fig ura 9), o controlando el rango de flujo, por ejemplo, a través de una bomba peristáltica (figura 1 , figura 2 , figu ra 3 y figura 6). En la tabla 4 se describe otro equipo utilizado para el control de temperatu ra y presión de los experimentos.

Tabla 2: Lista de filtros de virus Tabla 3: Lista de hidrolizados de soya Tabla 4: Lista de equipo Ejemplo 2. Preparación de Medio de Cultivo Celular En la tabla 5 que se encuentra a continuación , se proporciona u na descripción general de la composición de medio de cultivo celular con la composición de diferentes hidrolizados de soya descritos en la tabla 3 anterior. Los diferentes lotes del medio de cultivo celular fueron filtrados en forma esteril con un filtro de grado estéril, por ejemplo, un Cartucho de Filtro de Membrana Pall Fluorodyne® I I DJL de 0.1 m antes de las diferentes filtraciones de virus descritas en los ejemplos. Se utilizaron las preparaciones del medio aquí descritas para todos los experimentos descritos y mostrados en de la figura a la fig ura 1 1 .

Tabla 5. Composición de medio Ejemplo 3: Preparación de Filtro: Se prepararon filtros del virus de acuerdo con los man uales del producto de los fabricantes del filtro de virus. A menos que los filtros fueran proporcionados y ensamblados en forma esteril , los filtros fueron con autoclave a una temperatura de > 1 21 °C durante 20 minutos.

Ejemplo 4: Prueba de I ntegridad Después del uso, se lavaron filtros de tamaño adecuado (Filtros A, C, E y F de la tabla 2) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante respectivo. Se llevó a cabo una Prueba de Flujo Directo con Palltronic Flowstar XC ( P a 11 , U S) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Todas las pruebas de integridad llevadas a cabo después de los experimentos de filtración aquí descritos, cumplieron con los límites especificados.

Ejemplo 5 : Relación proporcional entre presión y flujo d iferencial .

Para investigar la relación entre el rango de diferencial de presión y flujo volumetrico, el medio de cultivo celular se sometió a filtración utilizando filtros de virus de autoclave a temperatu ra ambiente. El medio se llenó en u n envase de presión y los filtros de virus se conectaron al envase de presión , el cual posteriormente se presu rizó en diferentes niveles. El rango de flujo y las presiones d iferenciales específicas se midieron con un equ ilibrio y u n transductor de presión y se registraron con el tiempo (figu ra 3) .

Ejemplo 6: Modelo del Sistema de Reducción de Fermentación de 10L Se llevó a cabo una comparación del medio de cultivo celular con y sin filtración de virus utilizando un sistema de fermentación de célula CHO q ue expresa proteína recombinante (figu ra 6) . Se investigó el desempeño con respecto al rango de crecimiento y rendimiento. Se preparó el medio de cultivo celular tal como se describe en el Ejemplo 2. Una parte del experimento se llevó a cabo únicamente con un med io filtrado estéril , mientras que la otra parte se llevó a cabo con el mismo med io y una filtración de virus ad icional utilizando Sartorius Virosart CPV 180 cm2. La filtración se llevó a cabo u na temperatura de 2 a 8°C . El experimento de fermentación se llevó a cabo en biorreactores de anaquel de 10L agitados tipo Rushton con un pH , p02 y temperatura controlada en línea. Los puntos de ajuste del parámetro y los rangos para fermentación fueron como se indica a continuación : pH : 7.05 (6.8 a 7.3) T: 37.0°C (35 a 39°C) DO: 20% (Saturación de aire) (1 0 a 60%) Las celulas se cultivaron en un modo por lote seguido de un cultivo de quimiostato utilizando el medio con y sin filtración de virus adicional. Los datos de modo quimiostato (rangos de crecimiento y productividad) se generaron a partir de u n cultivo celular continuo de 4 semanas.

Se determinaron los conteos celulares mediante una medida CASY. En el cultivo de quimiostato, se calculó el rango de crecimiento específico (m) med iante: m = D + In (X t /X to) / (t — t0) en donde D es el rango de dilución calculado como la proporción del rango de alimentación y volumen de trabajo promedio por d ía [1 /d] Los rangos de crecimiento se calcularon a partir de conteos celulares homogenizados CASY.

Para el análisis bioqu ímico, se centrifugó la suspensión homogénea con 400 x g en un Heraeus M ultifuge 1 S-R durante 10 minutos y se prepararon alícuotas de 1 .0 mL en tubos Eppendorf y se almacenaron a u na temperatura de £20°C. Se analizaron los sobrenadantes libres de celulas con respecto a la actividad de una proteína recombinante expresada a través de u n ensayo cromogénico de acuerdo con procedimientos de operación estándar.

La productividad volumétrica P en este experimento se calculó mediante: P [U / (L x d)] = Actividad [mll/mL] rango de dilución [d 1] La prod uctividad específica de la célu la qP se calculó med iante: q P [mU / (10E06 células x d)] = P [U / (L x d] / conteo celular [1 0E06 células/mL] Ejemplo 7: Modelo de Sistema de Reducción de Fermentación de 120L Se investigó una téenica de filtración de virus continua llevada a cabo en un volumen del med io de operación de 120L, antes de su adición a un sistema de fermentación de célula CHO que expresa proteína recombinante, con respecto a su efecto en el rango de crecimiento y rendimientos (figura 6A, fig ura 6B y figura 6C) . El estudio comparó los procesos de prod ucción utilizando tres variaciones del mismo medio de cultivo celular: a) medio estándar; b) medio estándar filtrado utilizando filtros de virus Virosart CPV; y c) medio estándar filtrado utilizando filtros de virus M illipore Viresolve N FP.

Du rante el proceso de producción continuo, los dos diferentes filtros de virus (Virosart CPV Midicap tamaño 2000 cm2 y M i 11 i p o re Viresolve N FP tamaño 850 cm2) se utilizaron en forma alternativa para diferentes intervalos de tiempo. Se utilizó el filtro Sartorius CPV procedente del día de cultivo K00-K14, K23-K30 y K39-K63, y se utilizó el filtro M illipore NFP del día de cultivo K14-K23 y K30-K39.

Los pu ntos de ajuste de los parámetros y los rangos para la fermentación fueron como se indica a continuación : pH : 7.05 (6.8 a 7.3) T: 37.0°C (35 a 39°C) DO: 20% (Saturación de aire) (10 a 60%) M uestreo y Análisis Se determinaron conteos celulares med iante el sistema de analizador y conteo celular CASY ®. Para análisis bioquímicos, se centrifugó la suspensión homogenea con 400 x g en Heraeus M ultifuge 1 S-R (Thermo Scientific, U SA) durante 10 minutos. Se analizaron los sobrenadantes libres de célu las con respecto a la actividad de una proteína recombinante expresada a través de un ensayo cromogénico .

En cultivo de quimiostato se calculó el rango de crecimiento específico (m) mediante: m = D + In (X„/Xto) / (t, - t0) en donde D es el rango de dilución calculada como la proporción del rango de alimentación promedio por d ía y el volumen de operación [1 /d] . Se calcularon los rangos de crecimiento a partir de conteos celulares homogenizados CASY.

La productividad volumetrica P en este experimento se calculó mediante: P [U / (L d)] = Actividad [mU/mL] rango de dilución [d - 1 ] La productividad específica de la célula q P se calculó mediante: q P [mU / (10E06 células x d)] = P [U / (L d)] / conteo celular [10E06 células/mL] Ejemplo 8: Filtración de virus con filtros de Virus ASAH I Planova 1 5N Se incrementaron los medios que contienen hid rolizado de soya (DOMO SE50 MAF #5) con M MV y se colocaron en un tanque conectado a un suministro de gas de nitrógeno presurizado. El material incrementado con M MV se pasó a través de un filtro de virus ASAH I Planova 1 5N de 10 cm2 preparado en línea en un modo de extremo muerto en una presión constante de 1 100 mbar (pu nto de ajuste). Los valores mínimos y máximos de los sigu ientes parámetros, fueron medidos y registrados en forma continua : Presión de alimentación ; alimentación, temperatu ra del filtrado y del ambiente y peso del filtrado (cuyo cambio se utilizó para calcular el rango de flujo de filtrado) . Se tomaron muestras d iariamente d urante hasta 7 d ías y se analizaron para el titulador de virus MMV (figura 7) .

Ejemplo 9: Filtración de virus con filtros de Virus ASAH I Planova BioEX El medio que contiene hidrolizado de soya (Corrida #1 con hidrolizado de DMV SE50 MAF UF #5) ; Corrida #2 con hidrolizado de soya SDMV SE50 MAF U F #4) se incrementaron con MMV y se colocaron en un tanque conectado a un suministro de gas de nitrógeno presu rizado. Se pasó el material incrementado con M MV a traves de u n filtro de virus ASAH I Planova BioEX de 1 0 cm2 configurado en línea en un modo de extremo muerto en una presión constante de 2000 mbar (punto de ajuste) . Los valores mínimos y máximos de los siguientes parámetros se midieron y registraron en forma contin ua: Presión de alimentación : alimentación , temperatu ra del filtrado y del ambiente y peso del filtrado (cuyo cambio se utilizó para calcular el rango de flujo del filtrado) . Las muestras se tomaron d iariamente d urante 5 días y se analizaron con respecto al titulador de virus M MV (figura 8) .

Ejemplo 10: Resumen de Filtración de Virus Los medios de cultivo que contienen diferentes hidrolizados de soya se incrementaron con M MV y se colocaron en un tanque conectado a un sumin istro de gas de n itrógeno presurizado. Se utilizaron diferentes filtros de vid rios en combinación con los diferentes hidrolizados de soya tal como se describen en la Tabla 6: Tabla 6: Combinación de filtros de vid rios e h idrolizados de soya utilizados en experimentos de incremento Las filtraciones se prepararon en un modo de extremo muerto a una presión constante de 2 bar (punto de ajuste) para todas las corridas excepto para las corridas de los Experimentos #5 y 6 las cuales se llevaron a cabo a una presión constante de 1 .1 bar (punto de ajuste) . Los valores m ínimos y máximos de los sigu ientes parámetros, fueron med idos y registrados en forma continua: Presión de alimentación ; alimentación , temperatura del filtrado y del ambiente y peso del filtrado (cuyo cambio se utilizó para calcu lar el rango de flujo del filtrado) . Se tomaron muestras d urante el tiempo de corrida del experimento, y se analizaron con respecto al titulador de virus M MV. Se calcularon las reducciones logarítmicas generales a partir de la diferencia de la carga de infección del virus total en el filtrado, y la carga de infección de virus total antes de la filtración (figura 9) .

Ejemplo 1 1 : Filtración a largo plazo con incremento por virus M MV El m edio de cultivo celular tal com o se describe en el Ejem plo 2 , se incrementó con M MV hasta obtener un titulador de 5.0 [log io(TC I D50/mL)] y se sometió a filtración a largo plazo de 30 días sobre un filtro viral con tamaño de poro de 20 nm (Sartorius Visrosart CPV 5 cm2) . Se llevó a cabo la filtración con una preparación comparable a la del Ejemplo 9 y el Ejemplo 10, pero con una presión constante de 1 .1 bar (rango específico: 0.8 bar a 1 .2 bar) y con una presión regular e interrupciones de flujo para estimular el filtro viral. Los rangos de flujo durante el curso del experimento se registraron y mantuvieron arriba de 4 L/(m2 x hr) (figura 10) .

Se tomaron 20 muestras del filtrado (hasta 5 veces a la semana) y se determinó la carga y el titulador de virus MMV. No se observó rompimiento del virus en cualquiera de las 20 fracciones ensayadas. Las cargas de virus fluctuaron de < 0.9 [log io(TCI D50)] a < 2.8 [log1 0(TCI D50)] dependiendo del volumen de fracción. La carga de virus total en los filtrados fue de < 3.0 [log 10(TCI D5o)] , la cual - cuando se substrajo de la carga de virus inicial del material incrementado (por ejemplo , 8.5 [log10(TC I D5o)] - dio como resultado un factor de reducción de virus general de > 5.5 log 1 0. Esto se observó como efectivo y completo (figu ra 1 1 ) .

Aunque la invención anterior se describió con cierto detalle por medio de ilustraciones y ejemplos con el propósito de claridad y comprensión , los expertos en la teenica podrán apreciar fácilmente a la luz de las enseñanzas de las mismas, que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones sin apartarse de la esencia o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACION ES

1 . U n metodo para eliminar un contaminante viral de una preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de u n medio de cultivo celular, en donde el método comprende el paso de: a) Someter la preparación a filtración durante al menos 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la filtración opera en una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 L/m2, preferentemente al menos aproximadamente 3000 L/m2, más preferentemente de al menos aproximadamente 5000 L/m2.

3. El método de acuerdo con cualquiera reivindicaciones de la 1 a la 2, en donde la preparación se somete a filtración durante al menos aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 7 meses, y preferentemente aproximadamente 72 horas hasta aproximadamente 3 meses.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde el método comprende además el paso de: b) Alimentar el filtrado a un cultivo celular o a otros componentes que también son componentes de u n medio de cultivo celular.

5. El método de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en donde la filtración es una filtración contin ua.

6. El metodo de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde la filtración se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 60°C , preferentemente aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 40°C, más preferentemente de aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 37°C.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en donde el filtro de virus logra al menos un valor de reducción 1 Log 1 0 (LRV) para un contaminante viral, preferentemente al menos un valor de reducción 4 Log10 (LRV) para un contaminante viral, y lo más preferentemente al menos u n valor de reducción 6 Log o (LRV) para u n contaminante viral.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, en donde la filtración se lleva a cabo utilizando dos o más filtros distribuidos en serie, en paralelo o una mezcla de ambos.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la filtración se lleva a cabo utilizando dos filtros ajustados en paralelo en un sistema de tubos que comprende u na unión en forma de Y y en donde cada filtro está en comunicación de fluidos con u na ramificación de la unión en forma de Y y una fuente de suministro de la preparación .

10. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9 , en donde la filtración se lleva a cabo a una presión que fluctúa de aproximadamente 100 mbar hasta aproximadamente 4000 mbar, preferentemente de aproximadamente 100 mbar hasta aproximadamente 3500 mbar, más preferentemente de aproximadamente 1 000 mbar hasta aproximadamente 3000 mbar.

1 1 . El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, en donde el filtro de virus es autoclavable.

1 2. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 1 1 , en donde el medio de cultivo celular comprende hidrolizado de soya.

1 3. El uso de u n filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de 75 nm máximo en u na filtración durante al menos 24 horas para la eliminación de un contaminante viral de una preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la filtración opera en una capacidad volumétrica de al menos 2000 L/m2, preferentemente al menos 3000 L/m2, más preferentemente de al menos 5000 L/m2.

1 5. El uso de acuerdo con cualquiera reivindicaciones de la 13 a la 14, en donde la filtración se lleva a cabo al menos aproximadamente 48 horas hasta aproximadamente 7 meses, y preferentemente aproximadamente 72 horas hasta aproximadamente 3 meses.

16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15, en donde la filtración es una filtración continua.

1 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 16, en donde la filtración se lleva a cabo en un rango de temperatura de aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 60°C , preferentemente aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 40°C, más preferentemente de aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 37°C .

18. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 1 7, en donde el filtro de virus logra al menos un valor de reducción 1 Log1 0 (LRV) para un contaminante viral, preferentemente, al menos un valor de reducción 4 Logi0 (LRV) para un contaminante viral, y lo más preferentemente al menos un valor de reducción 6 Log10 (LRV) para un contaminante viral.

1 9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 3 a la 18, en donde la filtración se lleva a cabo utilizando dos o más filtros distribuidos en serie, en paralelo o una mezcla de ambos.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 9, en donde la filtración se lleva a cabo utilizando dos filtros ajustados en paralelo en un sistema de tubos que comprende una unión en forma de Y y en donde cada filtro está en comunicación de fluidos con una ramificación de la unión en forma de Y y una fuente de suministro de la preparación .

21 . El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 3 a la 20, en donde la filtración se lleva a cabo a una presión que fluctúa de aproximadamente 100 mbar hasta aproximadamente 4000 mbar, preferentemente de aproximadamente 100 mbar hasta aproximadamente 3500 mbar, lo más preferentemente de aproximadamente 1000 mbar hasta aproximadamente 3000 mbar.

22. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 3 a la 21 , en donde el filtro de virus es autoclavable.

23. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 22 , en donde el medio de cultivo celular comprende hidrolizado de soya.

24. El uso de una preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular que se puede obtener de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12 para un cultivo celular; preparaciones farmaceuticas, de diagnóstico y/o cosméticas, así como preparaciones alimenticias. RESUM EN La presente invención se refiere a un metodo para eliminar un contaminante viral de una preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular. El método comprende someter la preparación a una filtración durante al menos aproximadamente 24 horas a través de un filtro de virus que tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 75 nm máximo. Además, la presente invención se refiere al uso de u n filtro de virus en una filtración de al menos aproximadamente 24 horas, en donde el filtro de virus tiene un tamaño de poro efectivo de aproximadamente 75 nm máximo para la eliminación de un contaminante viral de una preparación , siendo un medio de enltivo celular o al menos un componente de un medio de cu ltivo celular. En algunas modalidades la filtración de acuerdo con la presente invención opera en una capacidad volumétrica de al menos aproximadamente 2000 L/m2. Además, la presente invención se refiere al uso de u na preparación , siendo un medio de cultivo celular o al menos un componente de un medio de cultivo celular que se puede obtener de acuerdo con el método de la presente invención para un cultivo celular; preparaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o cosméticas así como en preparaciones alimenticias.