ES2585702T3 - Composiciones y métodos para la unión al ácido lisofosfatídico - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une al ácido lisofosfatídico (LPA) en condiciones fisiológicas y que comprende al menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 56, 57, y 58 y un dominio variable de cadena ligera que comprende tres CDR de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 59, 60, y 61, en el que dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno opcionalmente: a. se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo madurado por afinidad, o un fragmento de unión a antígeno de cualquier anticuerpo de este tipo; y/o b. se conjuga con un resto seleccionado del grupo que consiste en un polímero, un radionúclido, un agente quimioterapéutico y un agente de detección.

Description

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fosfatidilinositol (PI), fosfatidiletanolamina (PEA), ácido fosfatídico, factor de activación plaquetaria (PAF), cardiolipina, fosfatidilglicerol (PG) y diacilglicérido (DG). Además, otros lípidos bioactivos se obtiene a partir del ácido araquidónico; estos incluyen los eicosanoides (incluyendo los metabolitos eicosanoides tales como los HETE, cannabinoides, leucotrienos, prostaglandinas, lipoxinas, ácidos epoxieicosatrienoicos, e isoeicosanoides),

5 mediadores cannabinoides no eicosanoides. Otros lípidos bioactivos, incluyendo otros fosfolípidos y sus derivados, también se pueden usar de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones de la invención puede ser preferente dirigir bioactivos lípidos basados en glicerol (los que tienen una cadena principal derivada de glicerol, tal como los LPA) para producción de anticuerpo, en oposición a los lípidos bioactivos basados en esfingosina (los que tienen una cadena principal esfingoide, tales como esfingosina y S1P). En otras realizaciones, se puede desear la dirección de lípidos bioactivos derivados del ácido araquidónico para generación de anticuerpo, y en otras realizaciones son preferentes los lípidos bioactivos derivados del ácido araquidónico y derivados de glicerol pero no lípidos bioactivos derivados de esfingoide. En conjunto, los lípidos bioactivos derivados del ácido araquidónico y derivados de glicerol se pueden denominar en el presente documento

15 "lípidos bioactivos no esfingoides".

De la clase de lípidos bioactivos de acuerdo con la invención están excluidos de forma específica fosfatidilcolina y fosfatidilserina, así como sus metabolitos y derivados que funcionan principalmente como miembros estructurales de la laminilla interna y/o externa de las membranas celulares.

La expresión "biológicamente activo", en el contexto de un anticuerpo o fragmento o variante de anticuerpo, se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o variante de anticuerpo que es capaz de unirse al epítopo deseado y en cierto modo ejercen un efecto biológico. Algunos efectos biológicos incluyen, pero no se limitan a, la modulación de una señal de crecimiento, la modulación de una señal antiapoptótica, la modulación de una señal

25 apoptótica, la modulación de la cascada de función efectuará, y modulación de otras interacciones de ligando.

Un "biomarcador" es un agente bioquímico específico en el organismo que tiene una característica molecular en particular que le hace útil para medir la evolución de la enfermedad por los efectos del tratamiento. Por ejemplo, S1P es un biomarcador para ciertas afecciones hiperproliferativas y/o cardiovasculares.

"Terapia cardiovascular" incluye terapia cardiaca (tratamiento de isquemia del miocardio e insuficiencia cardiaca) así como la prevención y/o tratamiento de otras enfermedades asociadas con el sistema cardiovascular, tal como enfermedad cardiaca. La expresión "enfermedad cardiaca" incluye cualquier tipo de enfermedad, trastorno, traumatismo o tratamiento quirúrgico que se relacione con el tejido cardiaco o del miocardio. Son de interés en

35 particular las afecciones asociadas con la remodelación tisular. La expresión "agente cardioterapéutico" se refiere a un agente que es terapéutico para enfermedades y enfermedades causadas por o asociadas con enfermedades y trastornos cardiacos y del miocardio.

Un "vehículo" se refiere a un resto adaptado para conjugación con un hapteno, haciendo de ese modo que el hapteno sea inmunogénico. Una clase no limitante, representativa de vehículos son las proteínas, ejemplos de las cuales incluyen albúmina, hemocianina de lapa californiana, hemaglutanina, tétanos, y toxoide de difteria. Otras clases y ejemplos de vehículos adecuados para uso de acuerdo con la invención se conocen en la técnica. Estos, así como algunos vehículos de origen natural o sintéticos descubiertos o inventados posteriormente, se pueden adaptar para aplicación de acuerdo con la invención.

45 Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y " cultivo celular" se usan de forma indistinta y todas las denominaciones de este tipo incluyen progenie. Por tanto, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de las mismas sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Está incluida la progenie mutante que tienen la misma función o actividad biológica tal como se identifica sistemáticamente en la célula originalmente transformada. Cuando se hace referencia a distintas denominaciones, será evidente a partir del contexto.

La expresión "agente quimioterapéutico" significa se refiere a agentes anticáncer y otros agentes

55 antihiperproliferativos. Por lo tanto, algunos agentes quimioterapéuticos son un subconjunto de agentes terapéuticos en general. Algunos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a: agentes que dañan el ADN y agentes que inhiben la síntesis del ADN: antraciclinas (doxorrubicina, donorrubicina, epirrubicina), agentes de alquilación (bendamustina, busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, dacarbazina, hexametilmelamina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalán, mitotano, mitomicina, pipobromano, procarbazina, estreptozocina, tiotepa, y trietilenomelamina), derivados de platino (cisplatino, carboplatino, cis diamina-dicloroplatino), e inhibidores de la topoisomerasa (Camptosar); antimetabolitos tales como capecitabina, clorodesoxiadenosina, citarabina (y su forma activada, ara-CMP), arabinósido de citosina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, 5-DFUR, gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, metotrexato, pentostatina, trimetrexato, 6-tioguanina); antiangiogénicos (bevacizumab, talidomida, sunitinib, lenalidomida, TNP-470, 2-metoxiestradiol, ranibizumab, sorafenib, erlotinib,

65 bortezomib, pegaptanib, endostatina); agentes de interrupción vascular (flavonoides/flavonas, DMXAA, derivados de combretastatilna tales como CA4DP, ZD6126, AVE8062A, etc.); agentes biológicos tales como anticuerpos

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(Herceptin, Avastin, Panorex, Rituxin, Zevalin, Mylotarg, Campath, Bexxar, Erbitux); terapia endocrina: inhibidores de la aromatasa (4-hidroandrostendiona, exemestano, aminoglutetimida, anastrazol, letozol), antiestrógenos (Tamoxifeno, Toremifina, Raoxifeno, Faslodex), esteroides tales como dexametasona; agentes inmunomoduladores: citoquina las tales como IFN-beta e IL2), inhibidores para integrinas, otras proteínas de adhesión y

5 metaloproteinasas de matriz); inhibidores de la histona desacetilasa tales como ácido suberoilanilida hidroxámico; inhibidores de transducción de señales tales como inhibidores de tirosina quinasas tales como imatinib (Gleevec); inhibidores de proteínas de choque térmico tales como 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina; retinoides tales como todos los ácidos trans retinoicos; inhibidores de factores de crecimiento o los factores de crecimiento por sí mismos; compuestos antimitóticos y/o agentes de despolimerización de tubulina tales como los taxoides (paclitaxel, docetaxel, taxotere, BAY 59-8862), navelbina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina; agentes antiinflamatorios tales como inhibidores de la CO x y reguladores del ciclo celular, por ejemplo, reguladores del control e inhibidores de la telomerasa.

El término anticuerpo "quimérico" (o inmunoglobulina) se refiere a una molécula que comprende una cadena pesada

15 y/o ligera que es idéntica con u homóloga a secuencias correspondientes anticuerpos derivada de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, aunque el resto de la cadena(s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada (Cabilly, et al., a continuación; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 81: 6851 (1984)). Las secuencias de anticuerpos pueden ser de origen en vertebrado o invertebrado, por ejemplo, de mamíferos, aves o peces, incluyendo peces cartilaginosos, roedores, caninos, felinos, animales ungulados y primates, incluyendo seres humanos.

La expresión "terapia de combinación" se refiere a un régimen terapéutico que implica la provisión de al menos dos

25 terapias distintas para conseguir un efecto terapéutico indicado. Por ejemplo, un ataque de combinación puede implicar la administración de dos o más principios activos químicamente distintos, por ejemplo, un agente quimioterapéutico de acción rápida y un anticuerpo antilipídico. Como alternativa, una terapia de combinación puede implicar la administración de un anticuerpo antilipídico y/o uno o más agentes quimioterapéuticos, solos o junto con la administración de otro tratamiento, tal como terapia de radiación y/o cirugía. En el contexto de la administración de dos o más principios activos químicamente distintos, se entiende que los principios activos se pueden administrar como parte de la misma composición o como diferentes composiciones. Cuando se administran como composiciones separadas, las composiciones que comprenden los diferentes principios activos se pueden administrar al mismo tiempo o en diferentes tiempos, con la misma vía de administración o con diferentes vías de administración, usando los mismos regímenes de dosificación, o diferentes regímenes de dosificación, todo tal como

35 lo requiera el contexto en particular y tal como lo determine el médico que prescribe. De forma análoga, cuando una

o más especies de anticuerpo antilipídico, por ejemplo, un anticuerpo anti-LPA, solo o en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos se combinan, por ejemplo, con radiación y/o cirugía, el fármaco(s) se puede administrar antes o después de la cirugía o tratamiento de radiación.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de forma operativa en un organismo hospedador en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucariota se conocen porque usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

45 Un "lípido bioactivo derivatizado" es un lípido bioactivo, por ejemplo, LPA, que tiene un grupo de cabeza polar y al menos una cadena de hidrocarburos, en el que un átomo de carbono dentro de la cadena de hidrocarburos se derivatiza con un grupo reactivo colgante [por ejemplo, un grupo sulfhidrilo (tiol), un grupo ácido carboxílico, un grupo ciano, un éster, un grupo hidroxi, un alqueno, un alquino, un grupo cloruro de ácido o un átomo de halógeno] que puede estar protegido o no. Esta derivatización sirve para activar al lípido bioactivo para reacción con una molécula, por ejemplo, para conjugación con un vehículo.

Un "conjugado de lípido bioactivo derivatizado" se refiere a un lípido bioactivo derivatizado que se conjuga covalentemente con un vehículo. El vehículo puede ser una molécula de proteína o puede ser un resto tal como

55 polietilenglicol, oro coloidal, adyuvantes o perlas de silicona. Un conjugado de lípido bioactivo derivatizado se puede usar como un inmunógeno para la generación de una respuesta a anticuerpo de acuerdo con la presente invención, y el mismo conjugado de lípido bioactivo o uno diferente se puede usar como un reactivo de detección para detectar el anticuerpo producido de este modo. En algunas realizaciones el conjugado lípido bioactivo derivatizado se une a un soporte sólido Hasta cuando se usa para detección.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena poli peptídica (VH -VL). Mediante el uso de un conector que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven 65 forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen de forma más completa, por ejemplo, en el documento EP 404.097; documento WO

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93/11161; y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

"Concentración eficaz" se refiere a la concentración y/o actividad absoluta, relativa y/o disponible de, por ejemplo, ciertos lípidos bioactivos deseados. En otras palabras, la concentración eficaz de un lípido bioactivo es la cantidad

5 de lípido disponible, y capaz, de realizar su función biológica. En la presente invención, un resto derivado del sistema inmunológico tal como, por Ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido a un lípido bioactivo (tal como, por ejemplo, C1P) es capaz de reducir la concentración eficaz del lípido mediante la unión al lípido y haciendo que sea incapaz de realizar su función biológica. En este ejemplo, el lípido en sí mismo todavía está presente (no se degrada por el anticuerpo, en otras palabras), pero ya no se puede unir a su receptor u otras dianas para causar un efecto cadena abajo, por lo que la "concentración eficaz" en lugar de la concentración absoluta es la medición apropiada. Existen métodos y ensayos para medir de forma directa y/o indirecta las concentraciones eficaces de lípidos bioactivos.

Un "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a la parte de un antígeno que reacciona con una parte de unión a antígeno del anticuerpo derivada de un anticuerpo.

15 La expresión "casete de expresión" se refiere a una molécula de nucleótido capaz de influir en la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia de codificación de proteína, tal como un anticuerpo de la invención) en un hospedador compatible con tales secuencias. Algunos casetes de expresión incluyen al menos un promotor unido de forma operativa con la secuencia que codifica polipéptido, y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción. También se pueden usar algunos elementos adicionales reguladores necesarios o útiles en la realización de la expresión, por ejemplo, potenciadores. Por lo tanto, los casetes de expresión incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante y similares.

25 Un "anticuerpo completamente humano" puede hacer referencia a un anticuerpo producido en un animal modificado por ingeniería genética (es decir, transgénico), por lo general un mamífero, normalmente un ratón (por ejemplo, como se puede obtener de Medarex) que, cuando se presenta con un inmunógeno adecuado puede producir un anticuerpo humano que no requiere necesariamente injerto de CDR. Estos anticuerpos son totalmente "humanos" porque se generan a partir de un animal (por ejemplo, un ratón transgénico) en el que los genes de anticuerpo no humanos se sustituyen o se suprimen y se reemplazan con algunos o todos los genes de inmunoglobulina humana. En otras palabras, los anticuerpos de la invención incluyen los generados frente a lípidos bioactivos, de forma específica LPA, cuando se presentan en una forma inmunogénica a ratones u otros animales modificados genéticamente para producir armazones humanos para las CDR pertinentes.

35 Un "hapteno" es una sustancia que es no inmunogénica pero que puede reaccionar con un antígeno o parte de unión a antígeno que se obtiene a partir de un anticuerpo. En otras palabras, los haptenos tienen la propiedad de la antigenicidad pero no de la inmunogenicidad. Por lo general un hapteno es una molécula pequeña que puede, en la mayoría de las circunstancias, provocar una respuesta inmunológica (es decir, actuar como un antígeno) solamente cuando se une a un vehículo, por ejemplo, una proteína, polietilenglicol (PEG), oro coloidal, perlas de silicona, o similares. El vehículo puede ser uno que tampoco provoque una respuesta inmunológica por sí mismo.

El término "anticuerpo heteroconjugado" puede hacer referencia a dos anticuerpos unidos de forma covalente. Tales anticuerpos se pueden preparar usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo el uso de agentes de reticulación. Como se usa en el presente documento, el término "conjugado" se refiere a moléculas

45 formadas por la unión covalente uno o más fragmento(s) de anticuerpo o restos de unión a una o más molécula(s) de polímero.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima que se obtiene de inmunoglobulina no humana. O, visto de otro modo, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo humano que también contiene secuencias seleccionadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) en lugar de las secuencias humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir sustituciones conservadoras de aminoácidos o restos no naturales de la misma o diferentes especies que no alteran de forma significativa su actividad de unión y/o biológica. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos

55 humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que algunos restos de una región que determina la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, camello, bovino, cabra, o conejo que tienen las propiedades deseadas. En algunos casos, la región marco conservada (FR) de restos de inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes restos no humanos.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o marco importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. Por lo tanto, en general, un anticuerpo humanizado comprenderá todos los de al menos uno, y en un aspecto dos, dominios variables, en los que todos o todos los bucles 65 hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá

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acabada, tal como la proporciona un fabricante a un usuario final (por ejemplo, un médico o enfermera), es un líquido

o solución, en oposición a un sólido. En el presente documento, "sólido" se refiere a composiciones que no son ni líquidos ni soluciones. Por ejemplo, algunos sólidos incluyen composiciones secas preparadas por liofilización, secado por congelación, precipitación, y procedimientos similares.

5 La expresión "anticuerpos lineales", cuando se usa en toda la presente solicitud, se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

El termino "metabolitos" se refiere a compuestos a partir de los que se forman los LPA, así como los que resultan de la degradación de los LPA; es decir, compuestos que están implicadas en las rutas metabólicas lisofosfolipídicas. La expresión "precursores metabólicos" se puede usar para hacer referencia a compuestos a partir de los que se forman los esfingolípidos.

15 La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb), como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, o a dicha población de anticuerpos. Los anticuerpos individuales que comprenden la población son esencialmente idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos frente a un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales que por lo general incluye diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige frente a un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del

25 anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención se pueden formar con el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, Nature 256: 495 (1975), o se puede formar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos n.º 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar a partir de bibliotecas de anticuerpo de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo, o con otros métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen de forma específica anticuerpos quiméricos en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos que se obtienen de una especie en particular que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en

35 anticuerpos que se obtienen de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada (documento de Patente de Estados Unidos n.º 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

"Monoterapia" se refiere a un régimen de tratamiento basado en la entrega de un compuesto terapéuticamente eficaz, bien administrado como una sola dosis o varias dosis a lo largo del tiempo.

La expresión "anticuerpo multiespecífico" puede hacer referencia a un anticuerpo, o un anticuerpo monoclonal, que tiene propiedades de unión para al menos dos epítopos diferentes. En una realización, los epítopos son del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos o más antígenos diferentes. En la técnica se conocen algunos

45 métodos para preparar anticuerpos multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos incluyen anticuerpos biespecíficos (que tienen propiedades de unión para dos epítopos), anticuerpos triespecıficos (tres epítopos) y así sucesivamente. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos se pueden producir usando de forma recombinante la coexpresión de dos o más pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Como alternativa, los anticuerpos multiespecíficos se pueden preparar usando enlace químico. Un experto puede producir anticuerpos multiespecíficos usando estos u otros métodos como se puede saber en la técnica. Los anticuerpos multiespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpos multiespecíficos. Un ejemplo de un anticuerpo multiespecífico (en este caso, biespecífico) comprendido en la presente invención es un anticuerpo que tiene propiedades de unión para un epítopo de S1P y un epítopo de C1P, que de este modo es capaz de reconocer y unirse tanto a S1P como a C1P. Otro ejemplo de un anticuerpo biespecífico comprendido por la presente invención es un anticuerpo que tiene

55 propiedades de unión para un epítopo de un lípido bioactivo y un epítopo de un antígeno de superficie celular. De este modo, el anticuerpo es capaz de reconocer y unirse al lípido bioactivo y es capaz de reconocer y unirse a células, por ejemplo, con fines de dirección.

"Neoplasia" o "cáncer" se refiere a un crecimiento celular anómalo e incontrolado. Una "neoplasia", o tumor o cáncer, es una proliferación del crecimiento celular anómala, desregulada y desorganizada, y por lo general se denomina cáncer. Una neoplasia puede ser benigna o maligna. Una neoplasia es maligna, o cancerosa, si tiene propiedades de crecimiento destructivo, invasividad y metástasis. Invasividad se refiere a la propagación local de una neoplasia por infiltración o destrucción del tejido circundantes, por lo general rompiendo a través de las láminas basales que definen los límites de los tejidos, con lo que a menudo entran en el sistema circulatorio del organismo. Por lo

65 general, metástasis se refiere a la diseminación de células tumorales por los vasos linfáticos o sanguíneos. Metástasis también se refiere a la migración de las células tumorales por extensión directa a través de cavidades

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un grupo de cabeza polar y al menos una cadena de hidrocarburo, en el que un átomo de carbono dentro de al menos una de dicha al menos una cadena de hidrocarburo se derivatiza con un grupo reactivo colgante opcionalmente protegido. El grupo reactivo colgante puede ser un grupo sulfhidrilo (tiol), un grupo ácido carboxílico, un grupo ciano, un éster, un grupo hidroxi, un alqueno, un alquino, un grupo cloruro de ácido o un átomo de 5 halógeno y el ácido lisofosfatídico derivatizado puede estar asociado con un soporte sólido. El ácido lisofosfatídico derivatizado se puede conjugar adicionalmente con un resto de vehículo que es opcionalmente, polietilenglicol, oro coloidal, adyuvante, una perla de silicona o una proteína, y en el que la proteína es opcionalmente hemocianina de lapa californiana, albúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja. Este conjugado se puede unir a un soporte sólido. Se proporcionan algunos métodos para detectar LPA en una muestra, que comprenden la detección de la unión de un anticuerpo anti-LPA de la invención a LPA o un metabolito del mismo en una muestra. La muestra puede ser una muestra biológica incluyendo una muestra de tejido, tal como una muestra de biopsia, y una muestra líquida, que es opcionalmente sangre completa, plasma, suero, orina, semen, bilis, humor acuoso, humor vítreo, fluido de lavado broncoalveolar, mucosa, o esputo. El método de detección puede incluir adicionalmente la detección de al menos un marcador de fibrosis. La detección de LPA también por incluir la comparación de un nivel de LPA en

15 la muestra con un nivel de referencia de LPA para indicar la presencia de enfermedad o para controlar un régimen terapéutico para la modulación de la concentración eficaz de LPA. Además se desvelan kits de ELISA para la detección de LPA.

Los aspectos mencionados anteriormente y otros aspectos de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, figuras adjuntas, y las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

A continuación se proporciona un breve resumen de cada una de las figuras y tablas que se describen en la

25 presente memoria descriptiva, al igual que un listado de diversas secuencias de nucleótidos y aminoácidos que se describen en el presente documento.

Figura 1. Esquema de síntesis orgánica para preparar un análogo de S1P tiolado habitual que se usó como un componente fundamental de un inmunógeno de acuerdo con la invención, así como el componente fundamental del material de depósito para los ensayos de ELISA y BiaCore. Figura 2. Esquema de síntesis orgánica para preparar el ácido graso relacionado tiolado usado en la síntesis del análogo de LPA tiolado de la Figura 3. Figura 3. Esquema de síntesis orgánica para preparar el análogo de LPA tiolado que es un componente fundamental de un inmunógeno de acuerdo con la invención, así como un componente fundamental del material

35 de depósito para el ensayo de ELISA y otros ensayos.

Descripción detallada de la invención

A. LPA derivatizado y/o conjugado

1. Composiciones

La presente solicitud desvela LPA que se ha derivatizado de una manera tal como para facilitar la respuesta inmunogénica (es decir, producción de anticuerpos). En una realización, el LPA se puede derivatizar para permitir la

45 conjugación de la molécula de LPA a una molécula vehículo. En una realización, un átomo de carbono dentro de la cadena de hidrocarburo del LPA se derivatiza con un grupo reactivo colgante [por ejemplo, un grupo sulfhidrilo (tiol), un grupo ácido carboxílico, un grupo ciano, un éster, un grupo hidroxi, un alqueno, un alquino, un grupo cloruro de ácido o un átomo de halógeno] que pueden estar o no protegidos. Esta derivatización sirve para activar el lípido bioactivo para reacción con una molécula, por las, para conjugación con un vehículo. En una realización, el LPA derivatizado es LPA tiolado. En una realización, el LPA derivatizado es LPA C12 o C18 derivatizado. En una realización, el LPA tiolado se conjuga a través de un agente de reticulación, por ejemplo, un agente de reticulación bifuncional tal como IOA o SMCC, a un vehículo, que puede ser una proteína. Puede ser útil conjugar el LPA de este modo a una proteína u otro vehículo que sea inmunogénico en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero (incluyendo albúmina de suero bovino o BSA), tiroglobulina bovina, o

55 inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoíl sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, en el que R y R1 son diferentes grupos alquilo. En la técnica donde se conocen algunos vehículos no proteicos (por ejemplo, oro coloidal) para su uso en producción de anticuerpos.

El LPA derivatizado o derivatizado y conjugado desvelado en el presente documento se puede usar para generar los anticuerpos anti-LPA de la invención. El LPA derivatizado o derivatizado y conjugado también se puede usar en los métodos de diagnóstico de la invención, en particular en métodos de diagnóstico.

65 2. Investigación y cursos de diagnóstico para LPA derivatizado

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Por lo tanto, no de forma sorprendente, desde entonces se han aprobado veinte anticuerpos monoclonales para su uso en entornos clínicos, incluyendo nueve que se prescriben para el cáncer. El éxito de estos productos, así como la reducción del costo y el tiempo para desarrollar anticuerpos monoclonales en comparación con moléculas pequeñas ha convertido a los agentes terapéuticos de anticuerpo monoclonal en la segunda mayor categoría de

5 candidatos a fármacos más allá de las moléculas pequeñas. Además, la excelente especificidad de los anticuerpos en comparación con agentes terapéuticos de molécula pequeña ha demostrado ser una gran ventaja tanto en términos de eficacia como de toxicidad. En la actualidad, solamente para el cáncer de hay más de 270 proyectos bestiales de I + D con anticuerpos con más de 50 empresas que participan en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos de anticuerpo para el cáncer. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales están a punto de convertirse en una pieza importante en el tratamiento de cáncer y se calcula que pueden capturar una parte importante del mercado de agentes terapéuticos para el cáncer. Por lo general, los mAb terapéuticos están dirigidos a proteínas; solo recientemente ha sido factible aumentar los mAb para lípidos bioactivos (por ejemplo, anticuerpos para S1P, véase el documento US 20070148168 de los Solicitantes.

15 La identificación de mediadores extracelulares que estimulan el crecimiento y la supervivencia tumoral es una etapa fundamental en el descubrimiento de intervenciones terapéuticas que reducirán la morbilidad y la mortalidad del cáncer. Como se describe a continuación, se considera que el LPA es un factor de crecimiento tumorigénico, pleiotrópico. El LPA promueve el crecimiento tumoral mediante estimulación de proliferación celular, supervivencia celular, y metástasis. El LPA también estimula la angiogénesis tumoral mediante el apoyo a la migración y supervivencia de células endoteliales a medida que forman nuevos vasos dentro de los tumores. Tomado en conjunto, el LPA inicia una secuencia proliferativa, proangiogénica y antiapoptótica de sucesos que contribuye a la progresión del cáncer. Por lo tanto, las terapias que modulan, y, en particular, reducen los niveles de LPA in vivo serán eficaces en el tratamiento del cáncer.

25 Por lo general, los métodos de la invención para tratamiento o prevención de un trastorno hiperproliferativo tal como el cáncer implican la administración, a un sujeto que padece un trastorno hiperproliferativo, de una cantidad eficaz de cada uno de un agente (o una pluralidad de diferentes especies de agente) de acuerdo con la invención y un agente citotóxico. Algunos agentes citotóxicos incluyen fármacos quimioterapéuticos.

Un aspecto relacionado se refiere a métodos para reducir la toxicidad de un régimen terapéutico para tratamiento o prevención de un trastorno hiperproliferativo. Tales métodos comprenden administrar a un sujeto que padece un trastorno hiperproliferativo una cantidad eficaz de un agente (o una pluralidad de diferentes especies de agente) de acuerdo con la invención antes, durante o después de la administración de un régimen terapéutico destinado a tratar

o prevenir el trastorno hiperproliferativo. Se cree que mediante la sensibilización de células, por ejemplo, células

35 cancerosas, a fármacos quimioterapéuticos, se puede conseguir eficacia en dosis más bajas y, por lo tanto, disminuir la toxicidad debida a fármacos quimioterapéuticos.

Además, otro aspecto de la invención se refiere al uso de anticuerpos de la invención en métodos para mejorar una probabilidad de supervivencia de un sujeto tratado por un trastorno hiperproliferativo mediante la administración, a un sujeto que padece un trastorno hiperproliferativo, un agente (o una pluralidad de diferentes especies de agente) de acuerdo con la invención antes, durante o después de la administración de un régimen terapéutico destinado a tratar o prevenir el trastorno hiperproliferativo para aumentar la probabilidad de supervivencia del sujeto.

3. Fibrosis, curación de heridas y la formación de cicatrices

45 Los fibroblastos, en particular los miofibroblastos, son elementos celulares fundamentales en la formación de cicatrices como respuesta a lesión celular e inflamación (Tomasek et al., (2002), Nat Rev Mol Cell Biol, vol. 3: 34963, y Virag y Murry (2003), Am J Pathol, vol 163: 2433-40). La expresión genética del colágeno por los miofibroblastos es una evidencia de remodelación y es necesaria para la formación de cicatrices (Sun y Weber (2000), Cardiovasc Res, vol 46: 250-6, y Sun y Weber (1996), J Mol Cell Cardiol, vol 28: 851-8).

La fibrosis se puede describir como la formación o desarrollo de tejido conectivo fibroso en exceso o anómalo en un órgano o tejido como parte de un proceso reparador o reactivo patológico, al contrario que en la curación o desarrollo de heridas normal. Las formas más comunes de fibrosis son: fibrosis hepática, pulmonar, renal, cutánea,

55 uterina y de ovario. Algunas afecciones, tales como esclerodermia, sarcoidosis y otras, se caracterizan por fibrosis en múltiples órganos y tejidos.

Recientemente, el ácido lisofosfatídico (LPA) lisofosfosfolípido bioactivo ha sido reconocido por su papel en reparación tisular y curación de heridas. Watterson et al., Wound Repair Regen. (2007) 15: 607-16. Como mediador biológico, el LPA ha sido reconocido por su papel en reparación de tejidos y curación de heridas (Watterson, 2007). En particular, el LPA está relacionado con la inflamación pulmonar y renal y con la fibrosis. El LPA es detectable en lavado broncoalveolar humano (BAL) en fluidos en valor inicial y su expresión aumenta durante la inflamación alérgica, Georas, S. N. et al. (2007) Clin Exp Allergy. (2007) 37: 311-22. Además, el LPA estimula la inflamación en células epiteliales de las vías respiratorias. Barekzi, E. et al (2006) Prostaglandin Leukot Essent Fatty Acids. 74: 35765 63. Recientemente, las fibrosis pulmonar y renal se han relacionado con el aumento de liberación y señalización de LPA a través del receptor de tipo 1 de LPA (LPA1). Los niveles de LPA eran elevados en muestras de lavado

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broncoalveolar (BAL) de pacientes con IPF y la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones era dependiente de la activación de LPA1. Tager et al., (2008) Proc Am Thorac Soc. 5: 363. (2008) después de la obstrucción ureteral unilateral en ratones, La fibrosis tubulointersticial se redujo en ratones con supresión genética de LPA1 y la expresión de citoquina profibrótica estaba atenuada en ratones de tipo silvestre tratados con un

5 antagonista de LPA1. J. P. Pradere et al., (2007) J. Am. Soc. Nephrol. 18: 3110-3118. Se ha demostrado que el LPA tiene efectos fibrogénicos directos en fibroblastos cardiacos mediante estimulación de la expresión y proliferación genética de colágeno. Chen, et al. (2006) FEBS Lett. 580: 4737-45. Combinados, estos estudios demuestran un papel para LPA en reparación de tejidos y fibrosis, e identifican lípidos bioactivos como una clase previamente no reconocida de dianas en el tratamiento de trastornos fibróticos.

a. Esclerodermia

Los anticuerpos de la invención serán útiles para tratar trastornos y enfermedades caracterizados, al menos en parte, por neovascularización, angiogénesis, fibrogénesis, fibrosis, cicatrización, inflamación y respuesta

15 inmunológica anómalas. Una de estas enfermedades es la esclerodermia, que también se conoce como esclerosis sistémica.

La esclerodermia es una enfermedad autoinmunitaria que causa cicatrización o engrosamiento de la piel, y en ocasiones implica a otras zonas del cuerpo, incluyendo los pulmones, corazón y/o riñones. La esclerodermia se caracteriza por la formación de tejido cicatricial (fibrosis) en la piel y órganos del cuerpo, que puede conducir a engrosamiento y firmeza de las zonas implicadas, con la consiguiente reducción en la función. En la actualidad, aproximadamente 300.000 estadounidenses tienen esclerodermia, de acuerdo con la Fundación de Esclerodermia. Un tercio o menos de los afectados tienen una enfermedad generalizada, mientras que los dos tercios restantes tienen principalmente síntomas cutáneos. Cuando la enfermedad afecta a los pulmones y causa formación de 25 cicatrices, la respiración puede llegar a estar limitada debido a que los pulmones ya no pueden expandir como deberían. Para medir la capacidad de respiración, los médicos usan un dispositivo que evalúa la capacidad vital forzada (FVC). En las personas con una FVC inferior a un 50 por ciento de la lectura esperada, la tasa de mortalidad en 10 años por enfermedad pulmonar relacionada con esclerodermia es de aproximadamente un 42 por ciento. Una de las razones por las que la tasa de mortalidad es tan elevada es que en la actualidad no hay un tratamiento eficaz.

Sin desear quedar ligado por ninguna teoría en particular, se cree que las concentraciones inapropiadas de lípidos tales como S1P y/o LPA, y/o sus metabolitos, causan o contribuyen al desarrollo de la esclerodermia. Como tal, las composiciones y métodos de la invención se pueden usar para tratar la esclerodermia, en particular mediante la disminución de la concentración eficaz in vivo de un lípido diana particular, por ejemplo, LPA.

35 La evidencia indica que LPA es un factor de crecimiento profibrótico que puede contribuir a la activación de fibroblastos, proliferación, y el consiguiente aumento de la actividad de los fibroblastos asociado con cicatrización de y remodelación inadaptada. Además, se han demostrado papeles potenciales para LPA en la actividad de los fibroblastos de la piel. Por ejemplo, se ha mostrado que LPA estimula la migración de fibroblastos de piel en murino (Hama et al., J Biol Chem 23 de abril 2004; 279 (17): 17634-9).

b. Fibrosis pulmonar

La fibrosis pulmonar, a veces denominada enfermedad pulmonar intersticial o ILD, afecta a más de 5 millones de

45 personas en todo el mundo. Dentro de Estados Unidos, parece que la prevalencia de la enfermedad se subestima y varía de 3 a 6 casos por cada 100.000 habitantes a 28 por 100.000. Dentro de Europa, las cifras varían dependiendo de los países, y se han informado aproximadamente de 1 a 24 casos por cada 100.000 sin un claro efecto de género. La enfermedad normalmente se diagnostica entre 40 y 70 años de edad. La supervivencia media es de 3 a 5 años. A pesar de su prevalencia, no hay terapias disponibles para detener o revertir la progresión de la IPF y no hay cursos de tratamiento aprobados por la FDA. Por lo tanto, existe una necesidad sin satisfacer de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de IPF, así como otras enfermedades que implican fibrosis tisular patológica.

La enfermedad pulmonar intersticial, o ILD, incluye más de 180 trastornos pulmonares crónicos, que son crónicos,

55 no maligno y no infecciosos. Las enfermedades pulmonares intersticiales se nombran para el tejido entre los sacos de aire de los pulmones denominado tejido intersticial -el tejido afectado por la fibrosis (cicatrización). Las enfermedades pulmonares intersticiales también se pueden denominar fibrosis pulmonar intersticial o fibrosis pulmonar. Los síntomas y curso de estas enfermedades pueden variar de persona a persona, pero el vínculo común entre las muchas formas de ILD es que todas comienzan con una inflamación, por ejemplo: bronquiolitis inflamación que afecta a los bronquiolos (vías respiratorias inferiores); alveolitis -inflamación que afecta a los alvéolos (sacos de aire); vasculitis -inflamación que afecta a los vasos sanguíneos pequeños (capilares).

Más de un 80 % de las enfermedades pulmonares intersticiales se diagnostican como neumoconiosis, enfermedad inducida por fármacos, o neumonitis por hipersensibilidad. Los otros tipos son:

65 Exposiciones ocupacionales y ambientales: muchos trabajos, en particular los que implican trabajar con amianto,

21

suelo de piedra, o polvo de metal, pueden causar fibrosis pulmonar. Las partículas pequeñas se inhalan, dañan los alvéolos, y causan fibrosis. Algunas sustancias orgánicas, tales como heno mohoso también pueden iniciar la fibrosis pulmonar; esto se conoce como pulmón de granjero.

5 La asbestosis se provoca normalmente cuando partículas pequeñas en forma de aguja de asbesto se inhalan en los pulmones. Esto puede causar cicatrización pulmonar (fibrosis pulmonar) y además puede conducir a cáncer de pulmón. El factor fundamental para la asbestosis es la prevención. En la fabricación de productos de amianto, tanto el empleador como el empleado deben ser conscientes de las normas gubernamentales y todos deberían tomar precauciones para evitar la inhalación de las partículas. El peligro principal al trabajar con amianto llega cuando los productos que contienen amianto, friables (desmenuzables), viejos se sustituyen o se destruyen. En esas circunstancias, las partículas se pueden liberar en el aire y respirar en los pulmones. En la actualidad, sin embargo, las fibras de amianto por lo general están "fijadas" por aglutinantes tales como cemento, caucho o plástico, evitando de ese modo que las partículas floten en el aire libre. El hábito de fumar tiene una relación interactiva con el amianto -el trabajador de amianto que fuma tiene una probabilidad mucho más elevada de desarrollar cáncer de pulmón que

15 la que tiene el no fumador.

La silicosis es otra enfermedad que produce fibrosis pulmonar en la que la causa es desconocida. Es una enfermedad que resulta de la inhalación de polvo de sílice cristalina libre. Todos los tipos de minería en los que el mineral se extrae de la roca de cuarzo pueden producir silicosis si no se toman precauciones. Ésta incluye la extracción de oro, plomo, cinc, cobre, hierro, carbón de antracita (duro), y algún carbón bituminoso (blando). Los trabajadores en fundiciones, molienda de piedra arenisca, construcción de túneles, limpieza con chorro de arena, rotura de hormigón, talla de granito, y fabricación de porcelana también se encuentran con sílice.

Las grandes partículas de sílice se detienen en las vías respiratorias superiores. Pero las motas más pequeñas de

25 sílice pueden llegar hasta los alvéolos en los que conducen a fibrosis pulmonar. La silicosis puede ser leve o grave, en proporción directa al porcentaje de concentración de sílice en el aire y la duración de la exposición. La silicosis se puede prevenir con medidas diseñadas de forma específica para cada industria y cada trabajo. El control del polvo es esencial. A veces esto se consigue mediante la humectación de las minas, la mejora de la ventilación, o el uso de mascarillas.

Fibrosis pulmonar idiopática: aunque una serie de enfermedades separadas pueden iniciar la fibrosis pulmonar, muchas veces la causa es desconocida. Cuando esto es así, la afección se llama "fibrosis pulmonar idiopática (de origen desconocido)". En la fibrosis pulmonar idiopática, el examen cuidadoso de la historia ambiental y ocupacional del paciente no da pistas para la causa. Algunos médicos y científicos creen que la enfermedad es una afección

35 infecciosa o alérgica, sin embargo algunas bacterias y otros microorganismos no se encuentran habitualmente en los pulmones de estos pacientes. Por otro lado, en ocasiones parece que la afección sigue una enfermedad tipo viral. Por lo tanto, aunque en muchos casos se conoce la causa de la fibrosis pulmonar, la variedad idiopática sigue siendo un misterio.

La sarcoidosis es una enfermedad que se caracteriza por la formación de granulomas (zonas de células inflamatorias), que puede atacar a cualquier zona del cuerpo pero con más frecuencia afecta a los pulmones.

Ciertos medicamentos pueden tener el efecto secundario no deseado de causar fibrosis pulmonar; por ejemplo, Nitrofurantoína (en ocasiones se usa para infecciones del tracto urinario); Amiodarona (en ocasiones prescrita para

45 un ritmo cardiaco irregular); Bleomicina, ciclofosfamida, y metotrexato (en ocasiones se prescribe para combatir el cáncer).

La radiación, proporcionada como tratamiento para el cáncer de mama, también puede causar fibrosis pulmonar. Otras enfermedades caracterizadas, al menos en parte, por fibrosis pulmonar incluyen tuberculosis, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, esclerosis sistémica, pulmonar de manipulador de grano, pulmón de trabajador con hongos, bagazosis, pulmón de trabajador con detergentes, pulmón del separador de corteza de arce, pulmón de trabajadores de malta, pulmón de separador de pimentón, pulmón de criador de aves y síndrome de Hermansky Pudlak. La fibrosis pulmonar también se puede heredar genéticamente.

55 Características clínicas:

La disnea es la marca distintiva de la fibrosis pulmonar. Muchas enfermedades pulmonares muestran disnea como síntoma principal -un hecho que puede complicar y confundir el diagnóstico. Normalmente la fibrosis pulmonar idiopática con disnea aparece por primera vez durante el ejercicio. La afección puede evoluciona hasta el punto en el que cualquier esfuerzo es imposible. Una tos seca es un síntoma común. Las puntas de los dedos pueden aumentar de tamaño en los extremos y adquieren una apariencia bulbosa. A menudo, esto se denomina "dedos en palillo de tambor".

Algunos síntomas adicionales pueden incluir: dificultad para respirar, especialmente con esfuerzo, fatiga y debilidad,

65 pérdida de apetito, pérdida de peso, tos seca que no produce flema, malestar en el pecho, dificultad para respirar y hemorragia en los pulmones.

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inflamatorias, estimula la formación de miofibroblastos y producción exagerada de tejido cicatricial que conduce a fibrosis tisular (Scotton, 2007). Por lo tanto, algunas estrategias clínicas actuales para el tratamiento de IPF y otros trastornos fibróticos se han dirigido a factores bioquímicos que estimulan la formación de miofibroblastos y la posterior producción de tejido fibroso.

5 Recientemente, el ácido lisofosfatídico lisofosfolipídico bioactivo (LPA) ha sido reconocido por su papel en la reparación de tejido y curación de heridas (Watterson, 2007). El LPA es un lisofosfolípido bioactivo (< 500 Dalton) con una sola cadena principal de hidrocarburo y un grupo de cabeza polar que contiene un grupo fosfato. El LPA provoca numerosos efectos celulares a través de la interacción con receptores específicos acoplados a la proteína G (GPCR), denominados EGD2/LPA1, EDG4/LPA2, EDG7/LPA3, y LPA4. Anliker B. y J. Chun, (2004) Seminars in Cell & Developmental Biology, 15: 457-465. Como mediador biológico, el LPA ha sido reconocido por su papel en la reparación de tejidos y curación de heridas (Watterson, 2007). En particular, el LPA está relacionado con la inflamación y la fibrosis pulmonar y renal. El LPA se puede detectar en fluidos de lavado broncoalveolar (BAL) humano en el valor inicial y su expresión aumenta durante la inflamación alérgica (Georas, 2007). Además, el LPA

15 estimular la inflamación en células epiteliales de las vías respiratorias (Barekzi, 2006). Recientemente, la fibrosis pulmonar y renal se ha relacionado con el aumento de liberación y señalización de LPA aún con el receptor de tipo 1 del LPA (LPA1). Los niveles de LPA eran elevados en muestras de lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes con IPF y la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones era dependiente de la activación de LPA1 (Tager, 2008). Después de la obstrucción ureteral unilateral en ratones, la fibrosis tubulointersticial se redujo en ratones con supresión genética de LPA1 y la expresión de citoquina profibróticas estaba atenuada en ratones de tipo silvestre tratados con un antagonista de LPA1 (Pradere, 2007). Combinados, estos estudios demuestran un papel para LPA en la reparación tisular y fibrosis, e identifican lípidos bioactivos como una clase previamente no reconocida de dianas en el tratamiento de IPF y otros trastornos fibróticos.

25 c. Fibrosis hepática (hígado)

El hígado posee una notable capacidad de regeneración, por lo tanto, el proceso de reparación mediante regeneración evoluciona a restitutio ad integrum completa (restauración completa). Sin embargo, si el daño ha afectado a la estructura reticular, la reparación se producirá mediante formación de cicatrices (fibrosis) que puede conducir a la reordenación de la circulación de la sangre y a cirrosis.

La reacción a la lesión evoluciona como sigue a continuación: Daño (necrosis), acompañado de cambios celulares y cambios tisulares; reacción inflamatoria; y reparación (ya sea por regeneración (restitutio ad integrum) o mediante cicatrización (fibrosis).

35 Algunas enfermedades hepáticas crónicas conducen a fibrosis lo que conduce a una alteración de la arquitectura, hipertensión portal y puede producir un reordenamiento irreversible de la circulación como para causar cirrosis. Existe una fina línea entre fibrosis y cirrosis. La fibrosis no es solamente el resultado de necrosis, colapso y formación de cicatrices, sino también el resultado de alteraciones en la síntesis y degradación de la matriz por las células mesenquimales lesionadas que sintetizan los diversos componentes de la matriz que, en el hígado, son las siguientes categorías: colágenos, glicoproteínas y proteoglicanos.

Evaluación de la Fibrosis Hepática

45 La evaluación de la Fibrosis Hepática puede ser histológica, por ejemplo, con tinción con tricromo de Masson, tinción con reticulina de plata, anticuerpos específicos para tipos de colágeno, desmina y vimentina para lipocitos, o vimentina para miofibroblastos, o puede ser bioquímica, por ejemplo, mediante: determinación de diversas enzimas en matriz o de laminina sérica en fibrosis benigna.

Clasificaciones de la Fibrosis Hepática

Existen 2 tipos principales, fibrosis hepática congénita y adquirida. La primera es un trastorno genético, que causa enfermedades hepáticas poliquísticas. La última tiene muchas categorías diferentes y está causada principalmente por lesiones de células hepáticas. Patológicamente, la fibrosis se puede clasificar como:

55 Fibrosis de la zona portal: Hay proliferación de fibroblastos y expansión de fibras de las áreas portales al lóbulo. Por último, estas fibras se conectan para formar separaciones con puentes. Este tipo de fibrosis se observa principalmente en la hepatitis vírica y en la fibrosis hepática por mala nutrición.

Fibrosis intralobular: En el lóbulo normal casi no se encuentran fibroblastos. Cuando grandes números de células hepáticas se degeneran y experimentan necrosis, el marco de la fibra reticular se colapsa y se convierte en fibras de colágeno gruesas. Al mismo tiempo, el tejido fibrótico intra lóbulo prolifera y rodea las células hepáticas.

Fibrosis central: El tejido fibrótico proliferado rodea principalmente la arena central y provoca el engrosamiento 65 de la pared de la vena central.

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Los clones de las líneas de células de hibridoma anti-LPA se cultivaron en DMEM (Medio de Eagle Modificado con Dulbecco con GlutaMAX™ I, 4500 mg/l de D-Glucosa, Piruvato Sódico; Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, 111-035003), FBS al 10 % (Clon I Fetal Estéril, Perbio Science), y 1X de glutamina/Penicilina/Estreptomicina (Gibco/Invitrogen). El ARN total se aisló de 107 células de hibridoma usando un procedimiento basado en el kit 5 RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN se usó para generar una primera hebra de ADNc siguiendo el protocolo del fabricante para el Kit de Amplificación dec ADN SMART RACE (Clonetech).

El ADNc de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (VH) se amplificó por PCR usando los cebadores enumerados en la Tabla 6. La preparación de la PCR de la región variable de cadena pesada fue como

10 sigue a continuación: MHCG1 (cebador conocido de la región constante de IgG1) se combinó con cebadores de la región V del Grupo 1 y del Grupo 2 para los cinco anticuerpos. El producto de cada reacción se ligó en el vector pCR2.1®-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad CA) usando el kit y secuencia de clonación TOPO-TA®.

De forma análoga, las regiones variables de la cadena ligera de inmunoglobulina (VK) se amplificaron usando the los

15 cebadores enumerados en la Tabla 7. La preparación de la PCR de la región variable de cadena ligera fue como sigue a continuación: cada uno de dos cebadores de región constante se combinaron con cebadores de la región V del Grupo 1, Grupo 2 y Grupo 3 para los cinco anticuerpos. El producto de cada reacción se ligó en el vector pCR2.1®-TOPO® usando el kit y secuencia de clonación TOPO-TA®.

20 El listado de oligonucleótidos se diseñó de acuerdo con la bibliografía (Dattamajumdar, A.K., Jacobson, D.P., Hood,

L.E. y Osman, G.E. (1991) Rapid cloning of any rearranged mouse immunoglobulin variable genes. Immunogenetics. 43 (3): 141-51; Coloma, M.J., Hastings, A., Wims, L.A. y Morrison, S.L. (1992) Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polimerase chain reaction. J Immunol Methods, 152 (1): 89104; Coronella, J.A., Telleman, P., Truong, T.D., Ylera, F. y Junghans, R.P. (2000) Amplification of IgG VH and VL 25 (Fab) from single human plasma cells and B cells. Nucleic Acids Res., 28 (20): E85.).

Tabla 6: Listado de oligonucleótidos para la clonación de los dominios variables de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales anti-LPA

Variable

Cadena Pesada SEQ ID NO:

MHV1

ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC 1

MHV2

ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 2

Grupo

MHV3 ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT 3

1

MHV4 ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT 4

MHV5

ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT 5

MHV6

ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC 6

MHV7

ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT 7

MHV8

ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 8

MHV9

ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG 9

Grupo

MHV10 ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG 10

2

MHV11 ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 11

MHV12

ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG 12

MH1:

ATATCCACCA TGGRATGSAG CTGKGTMATS CTCTT 13

Constante

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MHCG1

CAGTGGATAGACAGATGGGGG 14

MHCG2a

CAGTGGATAGACCGATGGGGC 15

MHCG2b

CAGTGGATAGACTGATGGGGG 16

MHCG3

CAAGGGATAGACAGATGGGGC 17

MVG1R

5'-GGCAGCACTAGTAGGGGCCAGTGGATA3' 18

30 Tabla 7: Listado de oligonucleótidos para la clonación de los dominios variables de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales anti-LPA

Variable

Cadena ligera SEQ ID NO:

Grupo1

MLALT1 GGGCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 19

MLALT2

GGGCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG 20

MLALT3

GGGCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA 21

MLALT4

GGGCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT 22

MLALT5

5'-CACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' 23

56

Variable

Cadena ligera SEQ ID NO:

Grupo2

MKVla ATGAAGTTGVVTGTTAGGCTGTTGGTGCTG 24

MKV2

ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG 25

MKV3

ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG 26

MKV4

ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG 27

MKV5

ATGGATTTWAGGTGCAGATTWTCAGCTTC 28

MKV6

ATGAGGTKCKKTGKTSAGSTSCTGRGG 29

MKV7

ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG 30

MKV8

ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG 31

MKV9

ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG 32

MKV10

ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT 33

MKV11

ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC 34

VK8

TGGGTATCTGGTRCSTGTG 35

MKV20

ATGGAGWCAGACACACTSCTG 36

Grupo3

CL12A ATGRAGTYWCAGACCCAGGTCTTYRT 37

CL12B

ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT 38

CL13

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT 39

CL14

ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTCTT 40

CL15

ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT 41

CL16

ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT 42

CL17A

ATGAGGTGCCTARCTSAGTTCCTGRG 43

CL17B

ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG 44

CL17C

ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG 45

Constante

MKC

ACTGGATGGTGGGAAGATGG 46

33615:

5'GAAGATCTAGACTTACTA TGCAGCATCAGC-3' 47

Los clones de TOPO2.1 que contenían las regiones variables de cadena pesada y ligera se secuenciaron y las regiones CDR se determinaron. El dominio variable de la cadena ligera se amplificó a continuación por PCR mediante la adición de una secuencia líder y los sitios de corte sugeridos por Lonza la clonación en el vector de 5 expresión y cadena ligera de Lonza, pCONkappa2 (5' Hindlll, 3' BsiWI, secuencia líder de LC: ATG TCT GTG CCT ACC CAG GTG CTG GGA CTG CTG CTG CTG TGG CTG ACA GAC GCC CGC TGT, SEQ ID NO: 48). El dominio variable de la cadena pesada se amplificó a continuación por PCR añadiendo una secuencia líder y los sitios de corte sugeridos por Lonza para clonación en el vector de expresión de cadena pesada de Lonza, pCONgamma1f (5' Hindlll, 3' Apal, secuencia líder de HC: ATG GAA TGG AGC TGG GTG TTC CTG TTC TTT CTG TCC GTG ACC

10 ACA GGC GTG CAT TCT, SEQ ID NO: 49). A continuación, los productos finales se insertaron en vectores de expresión de cadena ligera o pesada, que contenían las regiones constantes, con digestión y ligación con el Kit de Ligación Rápida (Roche).

Los plásmidos de cadena pesada y ligera se transformaron en células bacterianas químicamente competentes One

15 Shot® TOP 10 (Invitrogen) y se preservaron en glicerol. El ADN de plásmido a gran escala se preparó como lo describe el fabricante (Qiagen, kit MAXIPREP™ sin endotoxina). Las muestras de ADN, purificadas usando el Kit QIAprep Spin Miniprep de Qiagen o el Kit EndoFree Plasmid Mega/Maxi, se secuenciaron usando un secuenciador automatizado ABI 3730x1, que también traduce las señales fluorescentes en sus correspondientes secuencias de nucleobases. Los cebadores se diseñaron en los extremos en las posiciones 5' y 3' de modo que la secuencia

20 obtenida se podría superponer.

Amplificación de las regiones variables por PCR

Las Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) se realizaron usando el kit de ADN polimerasa Pfx de Invitrogen

25 con tampón 10 x y MgSO4 50 mM (n.º de cat 1708-013) y dNTP 10 mM (Invitrogen, n.º de cat 18427-013). La mezcla de reacción consistía en 5 ul de tampón de amplificación pfx 10 x, 1,5 ul de dNTP 10 mM, 1 ul de MgSO4 50 mM, 1,5 ul del oligonucleótido 1, 1,5 ul del oligonucleótido 2, 0,5 ul de molde (~50 ng), 0,5 ul de ADN polimerasa de Pfx, 38,5 ul de agua estéril. Se añadieron todos los reactivos menos Pfx y a continuación se añadió Pfx inmediatamente antes de comenzar con el termociclador. Después de desnaturalización de los moldes a 95 ºC durante 3 minutos, se

30 realizaron 35 ciclos de 95 ºC durante 30 segundos, seguido a 58 ºC con un gradiente de +/-5 ºC y extensión a 68 ºC durante 30 segundos. Después de una extensión final a 68 ºC durante 5 minutos, las muestras se mantuvieron a 4 ºC.

Digestión de restricción y reacciones de liberación para clonar las regiones variables

35 Las digestiones de restricción se realizaron en ADN para preparar fragmento para ligación o para que la verificación

57

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Secuencia

SEQ ID NO:

GCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTCTAAAAACTA ATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCA GTCTCCAAAACTCCTAATCTTCAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG GGGTCCCGGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGACT TCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAG TTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGC ACGGGGACAAAATTGGAAATAAAACGTACG

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Tabla 19: Secuencias de aminoácidos del clon B3 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de B3

KLAATMEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVKLQQSGPELVRPGTSVKV SCTASGDAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGLIYPDSGYINYNENFK GKATLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRFAYYGSGYYF DYWGQGTTLTVSSASTKG

114

Cadena Ligera de B3

KLAATMSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQ ASISCRSSQSLLKTNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIFKVSNRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEI KRT

115

Tabla 20: Secuencias de ácidos nucleicos del clon B7 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de B7

AAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTGTTCCTGTTCT TTCTGTCCGTGACCACAGGCGTGCATTCTCAGGTCCAACTGCA GCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAA GGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACGGCTTCATTAATTACTTA ATAGAGTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGG ATTGGACTGATTAATCCTGGAAGTGATTATACTAACTACAATG AGAACTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAGTCCT CCAGCACTGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGA CTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAGATTTGGTTACTACGGT AGCGGCAACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC

116

Cadena Ligera de B7

AAGCTTGCCGCCACCATGTCTGTGCCTACCCAGGTGCTGGGAC

117

TGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACGCCCGCTGTGATGTTGTGAT GACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAA GCCTCCATCTCTTGCACATCTGGTCAGAGCCTTGTCCACATTAA

63 64 65 66

Secuencia

SEQ ID NO:

TGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAG TCTCCAAAGCTCCTCATCTACAAAGTTTCCAACCTATTTTCTGG GGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTT CACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGT TTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCA CGGGGACAAAATTGGAAATAAAACGTACG

Tabla 21: Secuencias de aminoácidos del clon B7 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de B7

KLAATMEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLQQSGAELVRPGTSVK VSCKASGYGFINYLIEWIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENF KGKATLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNY FDYWGQGTTLTVSSASTKG

118

Cadena Ligera de B7

KLAATMSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQ ASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEI KRT

119

Tabla 22: Secuencias de ácidos nucleicos del clon B58 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de B58

AAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTGTTCCTGTTCT TTCTGTCCGTGACCACAGGCGTGCATTCTCAGGTCCAGCTGCA GCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTCAGGCCTGGGACTTCAGTGAA GGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGAGACGCCTTCACTAATTACTTG ATCGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGG ATTGGACTGATTATTCCTGGAACTGGTTATACTAACTACAATG AGAACTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAATCCT CCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGA CTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAGATTTGGTTACTACGGT AGTAGCAACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC

120

Cadena Ligera de B58

AAGCTTGCCGCCACCATGTCTGTGCCTACCCAGGTGCTGGGAC TGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACGCCCGCTGTGATGTTGTGAT

121

GACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAA GCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTA ATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCA

Secuencia

SEQ ID NO:

GTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGACCAGGGACAGATT TCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAA TTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATTTTCCATTCACTTTCGGC ACGGGGACAAAATTGGAAATAAAACGTACG

Tabla 23: Secuencias de aminoácidos del clon B58 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de B58

KLAATMEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLQQSGAELVRPGTSVK VSCKASGDAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGLIIPGTGYTNYNENF KGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSSNY FDYWGQGTTLTVSSASTKG

122

Cadena Ligera de B58

KLAATMSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQ ASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGV PDRFSGSGPGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHFPFTFGTGTKLE IKRT

123

Tabla 24: Secuencias de ácidos nucleicos del clon 3A6 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de 3A6

AAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTGTTCCTGTTCT TTCTGTCCGTGACCACAGGCGTGCATTCTCAGGTCCAGCTGCA GCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTCAGGCCTGGGACTTCAGTGAA GTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGAGACGCCTTCACTAATTACTTG ATCGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGG ATTGGACTGATTATTCCTGGAACTGGTTATACTAACTACAATG AGAACTTCAAGGGCAAGGCAACACTGACTGCAGACAAGTCCT CCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGA CTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAGATTTGGTTACTACGGT AGTGGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC

124

Cadena Ligera de 3A6

AAGCTTGCCGCCACCATGTCTGTGCCTACCCAGGTGCTGGGAC TGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACGCCCGCTGTGATGTTGTGAT GACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAA

125

GCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTA ATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCA GTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG

Secuencia

SEQ ID NO:

GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGACCAGGGACAGATT TCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAG TTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGC ACGGGCACAAAATTGGAAATAAAACGTACG

Tabla 25: Secuencias de aminoácidos del clon 3A6 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de 3A6

KLAATMEWSWVFLFFLSVTTGVHSQVQLQQSGAELVRPGTSVKL SCKASGDAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGLIIPGTGYTNYNENFK GKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGYYF DYWGQGTTLTVSSASTKG

126

Cadena Ligera de 3A6

KLAATMSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVVMTQTPLSLPVSLGDQ ASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGV PDRFSGSGPGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKL EIKRT

127

Tabla 26: Secuencias de ácidos nucleicos del clon A63 con secuencia líder y sitios de corte añadidos

Secuencia

SEQ ID NO:

Cadena Pesada de A63

AAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTGTTCCTGTTCT TTCTGTCCGTGACCACAGGCGTGCATTCTGATATACAGCTTCA GGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCT CTCACCTGCTCTGTCACTGGCTTCTCCATCACCAGTGGTTATTA CTGGACCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTG GGTGGCCTACATAGGCTACGATGGTAGCAATGACTCCAACCCA TCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACCCGTGACACATCTAAGA ACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACAC AGCCACATATTACTGTGCAAGAGCGATGTTGCGGCGAGGATTT GACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCT CCACCAAGGGCCC

128

Cadena Ligera de A63

AAGCTTGCCGCCACCATGTCTGTGCCTACCCAGGTGCTGGGAC TGCTGCTGCTGTGGCTGACAGACGCCCGCTGTCAAATTGTTCT CACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAG GTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTTTAAGTTACATGC

129

ACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGA TTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCA

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Claims (1)

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