JP2010530218A - リゾホスファチジン酸結合のための組成物と方法 - Google Patents

リゾホスファチジン酸結合のための組成物と方法 Download PDF

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Abstract

例えば、モノクローナル抗体などの抗LPA薬剤の製造および使用のための組成物および方法を記載する。

Description

本出願は、本出願者が所有する２００７年５月３０日に出願された仮出願番号６０／９４０，９６４の利益および優先権を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に援用する。
本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）とその変異体に結合する薬剤、特に、生理学的条件下でＬＰＡに対して特異的に反応する、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体に関する。かかる薬剤は、かかる薬剤を含む医薬品組成物の送達を介して、様々な疾患または障害の治療および／または予防に使用できる。
ＬＰＡは、多様な細胞タイプにおいて、増殖、分化、血管形成、運動性、アポトーシスからの保護を含む、多数の細胞応答を媒介する生理活性脂質の１つである。
ＬＰＡは、成長を促す腫瘍のマイクロ環境を提供し、血管形成を促進することにより、ガンの形成と進行に関与する。さらに、ＬＰＡは、線維症、黄斑変性症のような眼病、ならびに疼痛に関連する障害にも関連している。したがって、ＬＰＡを中和するための抗体を使用するアプローチは、これらの適応症のための現行の治療手段を増やす潜在的可能性を提供する。
本発明者らは、ＬＰＡに対する高親和性、特異的モノクローナル抗体ファミリーを発明したが、その１つは、ＬｐａｔｈｏｍａｂまたはＬＴ３０００として公知である。ガン、線維症、眼疾患の様々な動物モデルにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの有効性は、このクラスの抗ＬＰＡ抗体（およびそれに由来する分子）の、例えば、悪性腫瘍、血管形成、線維症に関連する障害の治療における有用性を強調する。
１．はじめに
以下に記載の説明は、本発明を理解するために役に立ち得る情報を含む。ここに記載するいかなる情報、またはここに明示的または暗示的に引用するいかなる刊行物も、ここで請求される発明の従来技術であること、または特別に関連性があることさえも認めるものではない。
２．背景
生理活性シグナル伝達脂質
脂質とそれらの誘導体は現在、単なる細胞膜中の１つの構造エレメントまたはβ酸化、解糖などの代謝プロセスの源としてではなく、医学研究のための重要な標的として認識されている。特に、ある種の生理活性脂質は、動物およびヒト疾患において重要なシグナル伝達メディエーターとして機能する。原形質膜に由来する脂質のほとんどは、構造的役割のみを果たしているにもかかわらず、それらの小部分は、細胞外刺激の細胞内への取り次ぎに関与している。これらの脂質は「生理活性脂質」、または「生理活性シグナル伝達脂質」と呼ばれている。「脂質シグナル伝達」とは、細胞膜脂質を第二のメッセンジャーとして使用する多数の細胞シグナル伝達経路のうちのいずれかを意味し、ならびに脂質シグナル伝達分子とその特異的レセプターとの直接的相互作用を意味する。脂質シグナル伝達経路は、増殖因子から炎症性サイトカインに至る様々な細胞外刺激によって活性化され、アポトーシス、分化、増殖のような細胞運命の決定を制御する。生理活性脂質シグナル伝達の研究は、精力的に科学的研究が推し進められている分野であり、ますます多くの生理活性脂質が同定され、その作用が特徴づけられている。
生理活性脂質の例は、エイコサノイド（カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸、イソエイコサノイドを含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーター、リン脂質およびホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のようなそれらの誘導体、血小板活性化因子（ＰＡＦ）およびカルジオリピン、ならびにリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）のようなリゾリン脂質を含む。生理活性シグナル伝達脂質はまた、スフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）、スフィンゴシン−１−リン酸のようなスフィンゴ脂質を含む。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体は、重要な細胞プロセスに多面発現効果を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子のグループを代表する。生理活性シグナル伝達脂質のその他の例は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシド、セレブロシドを含む。
１．リゾ脂質
リゾリン脂質（ＬＰＬ）は、リゾ脂質としても知られており、１つの炭化水素主鎖と１つのリン酸基 を含む１つの極性頭基を含む、 低分子量（一般的には約５００ダルトン未満）の脂質である。リゾ脂質のあるものは、生理活性シグナル伝達脂質である。医学的に重要な生理活性リゾ脂質の２つの具体的な例は、ＬＰＡ（グリセロール主鎖）とＳ１Ｐ（スフィンゴイド主鎖）である。特定のＬＰＡ、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐの構造を以下に示す。
Figure 2010530218
ＬＰＡの構造主鎖は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）のようなグリセロールを核とするリン脂質に由来する。Ｓ１Ｐのようなリゾスフィンゴ脂質の場合は、セラミド主鎖の脂肪酸が欠失している。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）の構造主鎖は、スフィンゴミエリン由来のスフィンゴシンを核にしている。
ＬＰＡとＳ１Ｐは、同一クラスの複数の膜貫通ドメインＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）に結合することによって、様々な細胞シグナル伝達経路を制御する。Ｓ１Ｐレセプターは、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５ （かつてはＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−６、ＥＤＧ−８）と呼ばれ、ＬＰＡレセプターは、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３ （かつては ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７）と呼ばれる。このファミリーの第４のＬＰＡレセプターは、ＬＰＡ（ＬＰＡ４）として同定されており、これらのリゾリン脂質のその他の推定レセプターも報告されている。
ＬＰＡとＳ１Ｐは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球のような免疫関連細胞の調節を介し、免疫応答においてある種の役割を果たしていることが示されている。これらの脂質は、免疫応答部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞の増殖ならびに様々なサイトカインの分泌を制御している。特に、Ｓ１Ｐは、末梢循環中へのリンパ球の放出を制御すると考えられている。したがって、ＬＰＡとＳ１Ｐに結合する薬剤は、望ましくない、過剰なまたは異常な免疫応答を低減するための方法、ならびに、ある種の血液ガン、およびリンパ球の望ましくない、過剰なまたは異常な関与および／または異常な免疫応答に関連する自己免疫疾患を含む、疾患および状態の治療に有効であると考えられる。
ａ．リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）
リゾホスファチジン酸（モノ−アシルグリセロール−３−リン酸、＜５００ダルトン）は、１つの炭化水素主鎖と１つのリン酸基を含む１つの極性頭基からなる。ＬＰＡは、単一分子実体ではなく、異なる長さと飽和度からなる脂肪酸を有する内在性構造変異体の総称である。生物学的に関連性のあるＬＰＡの変異体は、１８：２、１８：１、１８：０、１６：０、２０：４を含む。飽和脂肪酸（１６：０および１８：０）と不飽和脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２、２０：４）の両方を有するＬＰＡ種が、血清と血漿中に検出されている。血液中に存在する主な種は１６：０、１８：１、１８：２、２０：４のＬＰＡイソ型である。
有意な濃度（＞１ μＭ）の生理活性ＬＰＡが、血清、唾液、卵胞液、悪性浸出液を含む様々な体液中に検出できる。
本発明は、その形態の中から、以下に詳細に説明するように、増殖過剰性障害およびその他の様々な疾患の治療または予防に有効な抗ＬＰＡ薬剤を提供する。特に、本発明の特定の実施態様は、限定はされないが、ＬＰＡの１８：２、１８：１、１８：０、１６：０、２０：４変異体を含む、ＬＰＡを標的とする抗体を導出する。
ＬＰＡは、真核および原核細胞双方におけるリン脂質生合成の前駆体として長く公知であったが、ＬＰＡが、活性化された細胞（特に血小板）によって迅速に生成・放出され、特定の細胞表面レセプターに作用することによって標的細胞に影響を及ぼすシグナル伝達分子として浮上したのは、ごく最近のことである。小胞体中で合成され、より複雑なリン脂質に処理されることに加え、ＬＰＡは、細胞活性化後に先在のリン脂質の加水分解によって生成されることができ、例えば、脱アシル化によって、ｓｎ−２位は通常、脂肪酸残基を欠失し、その結果、ｓｎ−３ヒドロキシル基のみが脂肪酸とエステル結合する。さらに、ＬＰＡ産生に係わる主要な酵素であるオートタキシン（リゾＰＬＤ／ＮＰＰ２）は、多数の種類の腫瘍がオートタキシンの発現量を増加させるため、発癌遺伝子の生成物であり得る。高感度かつ特異的なＬＣ／ＭＳ法を用いた算出を含め、ヒト血漿および血清中のＬＰＡ濃度が報告されている。例えば、２５℃で１時間放置された新鮮ヒト血清中のＬＰＡ濃度は約１．２ ｍＭと推定されており、ＬＰＡ類似体１６：０、１８：１、１８：２、２０：４が主要種である。同様に、２５℃で１時間放置された新鮮ヒト血漿中のＬＰＡ濃度は、約０．７ ｍＭと推定されており、１８：１および１８：２ＬＰＡが主要種である。
ＬＰＡは、複数の膜貫通Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の１つのクラスに結合することによって、その生物学的機能を優先的に媒介する。ＬＰＡ１〜５と呼ばれる５つのＬＰＡ特異的ＧＰＣＲがこれまでに同定されており、それらは、重複的および独特なシグナル伝達特性と組織発現を呈する。ＬＰＡ１〜３レセプターは、ＧＰＣＲの所謂ＥＤＧサブファミリー（ＥＧＤ２／ＬＰＡ１、ＥＤＧ４／ＬＰＡ２、ＥＤＧ７／ＬＰＡ３）に属し、互いに５０％の配列類似性を有する。これらのレセプターに最も近いものは、生理活性脂質２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）とアラキドノイルエタノールアミンに結合するカンナビノイドＣＢ１レセプターである。ＬＰＡ４（かつてのＧＰＲ２３／ｐ２ｙ９）とＬＰＡ５（かつてのＧＰＲ９２）と呼ばれる２つの新しく同定されたＬＰＡレセプターは、Ｐ２Ｙヌクレオチドレセプターにさらに密接に関連している。また、ＬＰＡは、細胞内レセプターであるＰＰＲγを認識する。
ＬＰＡ１は、広範囲の組織と臓器において発現するが、ＬＰＡ２とＬＰＡ３はより限定された発現プロファイルを呈する。しかしながら、ＬＰＡ２とＬＰＡ３発現は、卵巣および結腸癌ならびに炎症において増加することが示されており、これはＬＰＡ２とＬＰＡ３が病態生理学的状況において主要な役割を果たすことを示唆する。
これらのレセプターの役割は、マウスにおけるレセプターノックアウト研究によって一部解明されている。ＬＰＡ１欠損マウスは、嗅覚障害に起因する吸入異常による一部の出生後死亡率を示している。ＬＰＡ１欠損マウスはまた、ブレオマイシン誘導性肺損傷による肺線維症から保護される。さらに、ＬＰＡ１レセプター遺伝子を欠損するマウスは、神経損傷誘導性の神経障害性疼痛行動と現象を生じない。
これとは対照的に、ＬＰＡ２レセプターを欠損するマウスは、正常に見える。ＬＰＡ３レセプターノックアウトマウスは、胚盤胞移植の遅延と胚のスペーシングの改変のために、産仔数が少なく、ＬＰＡ３欠損動物の子宮は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）発現とプロスタグランジン合成の低下を示す。ＬＰＡ３欠損メスマウスへのＰＧＥ２投与は、着床異常をレスキューすることが報告されている。
ＬＰＡは、細胞増殖の誘導、細胞移動の刺激および神経突起の退縮、ギャップ結合の閉鎖、粘菌の走化性を含む、広範な生物学的応答に影響を及ぼす。ＬＰＡの生物学に関する知識体系は、より多くの細胞系がＬＰＡ応答性について試験されているため、さらに増え続けている。ＬＰＡの主要な生理学的および病態生理学的作用は、例えば、以下を含む。
(創傷治癒)
細胞の成長と増殖を刺激することに加えて、ＬＰＡは、創傷の修復と再生における重要なイベントである、細胞張力と細胞表面のフィブロネクチン結合を促進することが現在公知である。
アポトーシス：最近では、抗アポトーシス活性もまたＬＰＡに帰するとされ、ペルオキシソーム増殖レセプターγは、ＬＰＡのレセプター／標的であることが最近報告されている。
(血管の成熟）
ＬＰＡ産生の役割を担う分泌型リゾホスホリパーゼＤであるオートタキシンは、血管形成の発達段階に必須である。さらに、不飽和ＬＰＡは、血管平滑筋細胞脱分化の誘導に主要な役割を担うことが明らかにされた。
浮腫と血管透過性：ＬＰＡは、マウスにおいて、血漿浸出とヒスタミンの遊離を誘導する。
(炎症）
ＬＰＡは、ヒト角膜上皮細胞において炎症メディエーターとして作用する。ＬＰＡは、角膜創傷治癒に関与し、水晶体におけるＲＯＳの放出を刺激する。ＬＰＡはまた、ウサギ角膜において、ＨＳＶ−１を再活性化できる。
毒蜘蛛、Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｒｅｃｌｕｓａ（ブラウンレクルーススパイダー）の咬刺傷は、重篤で長期にわたり持続する組織損傷を起因し、時には死に至ることがある、壊死性潰瘍を引き起こす。この蜘蛛の咬刺傷から生じる創傷の病態は、ＡＡとプロスタグランジンに媒介される激烈な炎症反応からなる。Ｌ． ｒｅｃｌｕｓａ蜘蛛毒素の主成分は、しばしばスフィンゴミエリナーゼＤ（ＳＭａｓｅ Ｄ）と呼ばれる、スフィンゴミエリンを加水分解してＣ１Ｐを生成する、ホスホリパーゼＤ酵素である。ところが、様々な頭基を有するリゾリン脂質は、Ｌ． ｒｅｃｌｕｓａ酵素によって加水分解されて、ＬＰＡを放出することが分かっている。本発明によるもののような抗ＬＰＡ薬剤は、限定はされないが、Ｌ． ｒｅｃｌｕｓａ毒物注入に起因する炎症を含む、様々なタイプの炎症の低減または治療に有効であると考えられている。
(線維症および瘢痕形成）
ＬＰＡは、真皮線維芽細胞において、ＥＲＫ依存経路を介して、ＴＧＦが媒介するI型コラーゲンｍＲＮＡの安定性の刺激作用を抑制する。さらに、ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現と線維芽細胞の増殖を刺激することによって、ある程度の直接的な線維形成効果を有する。
(免疫応答）
ＬＰＡは、Ｓ１Ｐのように、免疫関連細胞の調節を介して、免疫応答に役割を果たすことが示されている。これらの脂質は、免疫応答部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞の増殖ならびに様々なサイトカインの分泌を制御する。
したがって、Ｌｐａｔｈ社の抗ＬＰＡモノクローナル抗体のような、ＬＰＡの有効濃度を低下させる薬剤は、望ましくない、または過剰な、または異常なＬＰＡ濃度に関連する、創傷治癒および線維症、アポトーシス、血管形成および血管新生、血管透過性、炎症に関連する疾患と状態を治療するための方法において有効であると考えられる。
最近、本出願人は、ＬＰＡに対するいくつかのモノクローナル抗体を開発した。これらの抗ＬＰＡ抗体は、様々なＬＰＡを中和し、それらの生物学的および薬理学的作用を緩和することができる。抗ＬＰＡ抗体は、したがって、過剰な、望ましくない、または異常なＬＰＡ濃度に関連する様々な疾患および状態の予防および／または治療に有効であると考えられる。
ＬＰＡを迅速かつ特異的に検出する方法も望まれている。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とそれに続くガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および／または質量分析（ＭＳ）のような技術を使用して、ＬＰＡのようなリン脂質を分離し半定量的測定する方法は公知である。例えば、脂質は、体液のテストサンプルから抽出され得る。一方、薄層クロマトグラフィーを使って、様々なリン脂質を分離することができる。リン脂質とリゾリン脂質は、さらに、例えば、紫外線を使用して、プレート上で可視化することができる。他方、リゾリン脂質濃度は、リン脂質から分離後、あるいはリン脂質の一部として、ＮＭＲまたはＨＰＬＣによって同定することができる。また、卵巣癌患者から採取した腹水中のＬＰＡ濃度が、培養真核細胞に対するリゾＰＡ特異的効果に依拠するアッセイを用いて測定されている。ただし、これらの従来の方法は、時間を要し、高価であり、値にばらつきがあり、一般的には半定量的でしかない。生体液中のＬＰＡのようなリゾリン脂質検出のための酵素法、ならびにリゾリン脂質濃度の変化に関連する状態を関連づけ、検出するための酵素法もまた公知である。米国特許第６，２５５，０６３号および６，２４８，５５３号は当初、Ａｔａｉｒｇｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．に譲渡されていたが、現在は本発明と共に所有されている。
３．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明との関連において使用されるいくつかの用語の定義を行う。これらの用語に加えて、他の用語も本明細書の他の箇所で、必要に応じて定義されている。本明細書に特に定義しない限り、本明細書に使用する技術用語は、それらの技術分野において認識されている意味を有する。
「異常な」という用語は、例えば、タンパク質または生理活性脂質のような細胞内標的物の量または有効濃度に関連して、過剰である、または望ましくないことを意味する。
「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、免疫グロブリン遺伝子、またはそのフラグメントに由来し、それらをモデルとする、またはそれらによってコード化される、抗原またはエピトープと結合可能な、あらゆる形態のペプチド、ポリペプチドを意味する。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（免疫生物学）、第５版、 Ｃ． Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｐ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｍ．， Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．編集Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ(２００１）を参照。「抗体」という用語は、本明細書では最も広範な意味で使用され、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異性抗体、ミニ抗体、ヘテロコンジュゲート、二重特異性抗体、三重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、抗体フラグメント、親抗体のＣＤＲ（または抗原結合活性を保有するその変異体）を使用する結合剤を包含する。抗体は、本明細書において、親抗体の所望する活性を少なくとも１つ保有するものとして定義される。望ましい活性には、特異的に抗原に結合する能力、インビトロで増殖を抑制する能力、インビボで血管形成を抑制する能力、ならびにインビトロでサイトカインプロフィールを改変する能力が含まれ得る。本明細書において、抗体および抗体フラグメント、変異体、誘導体は、「免疫由来部分」と呼ばれることもあり、そのような分子、または少なくともそれらの抗原結合部位は、抗ＬＰＡ抗体に由来している。
自然抗体（天然免疫グロブリン）は、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、典型的には、２本の同一な軽（Ｌ）鎖と２本の同一な重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は、典型的には、１つの共有結合であるジスルフィド結合によって重鎖に連結されており、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖と軽鎖はまた、規則正しく間隔をおく鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に１つの可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に１つの可変ドメイン（ＶＬ）を有し、さらにもう一端に１つの定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間に界面を形成する。
あらゆる脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なるタイプ、カッパ（κ）とラムダ（λ）のうち１つに割り当てられ得る。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは、それぞれ異なるクラスに割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主要クラスがある。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、そしてこれらのいくつかはさらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２といったサブクラス（アイソタイプ）に分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）、ミュー（μ）と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニットの構造と三次元立体配置は公知である。
「抗体誘導体」とは免疫由来部分であり、即ち、抗体に由来する分子である。これは、例えば、抗原に対して所望する量の結合活性を保有する、抗体変異体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、複合抗体などと理解される。
本明細書に使用する場合、「抗体フラグメント」とは、抗原結合部位またはインタクト（無傷）な抗体の可変領域を含む、インタクトな抗体の一部分を意味し、この部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）を含まなくてよい。一方、定常重鎖ドメイン部分（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）は、「抗体フラグメント」に含まれてもよい。抗体フラグメントは抗原結合を保有し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、三重特異性抗体、単鎖抗体分子（Ｓｃ−Ｆｖ）、抗体フラグメントから形成されるミニ抗体、ナノ抗体、多重特異性抗体を含む。抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一な抗原結合フラグメントが生成され、そのそれぞれが１つの抗原結合部位と、その名が示すように容易に結晶化する能力を有する１つの残「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を交差する能力を有する、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する。一例として、Ｆａｂフラグメントには、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）が含まれる。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最も小さな抗体フラグメントである。この領域は、堅固に非共有結合する１本の重鎖と１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用するこの立体構造によって、ＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位が決定される。つまり、６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、たった１つの可変ドメイン（つまり、抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりは親和性は低いものの、抗原を認識かつ結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶＨとＶＬドメイン間に１つのポリペプチドリンカーを含み、これによってｓＦｖは、抗原結合のために望ましい構造を形成できる。ｓＦｖについての総説は、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（モノクローナル抗体の薬理学）、ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編集。Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５(１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むいくつかの残基が付加されている点がＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担うＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元来、ヒンジシステインを間に有する１対のＦａｂ’フラグメントとして生成された。抗体フラグメントのその他のケミカルカップリングも公知である。
「変異型」抗ＬＰＡ抗体は、本明細書では、抗体配列中の１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって、自然抗ＬＰＡ抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なり、抗結合親抗体の所望する活性を少なくとも１つ保有する分子を意味する。望ましい活性には、特異的に抗原に結合する能力、インビトロで増殖を抑制する能力、インビボで血管形成を抑制する能力、ならびにインビトロでサイトカインプロフィールを改変する能力が含まれ得る。抗体変異体におけるアミノ酸の変化は、軽鎖および／または重鎖の可変領域または定常領域内で、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域を含み得る。１つの実施態様では、変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域に、１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域に、少なくとも１つ、例えば、約１〜約１０個、好ましくは約２〜約５個の置換を含み得る。通常、変異体は、親抗体の重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは８０％、それより好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ある状況においては、少なくとも５０％の配列同一性が好ましく、その場合、分子の他の特徴が、結合および特異性のような所望する属性を備える。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書では、配列同一性の割合を最大値にするために、必要に応じて配列を整合しギャップを導入した後の、親抗体残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率（％）として定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または配列内部の伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすものとは解釈されない。変異体は、ＬＰＡに結合する能力を保有し、好ましくは、親抗体のそれよりも優れた所望活性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性、血管形成を低下および／または腫瘍の進行を停止させる強力な能力を有し得る。かかる所望の特性（例えば、低免疫性、半減期の延長、強力な安定性、強力な力価）を分析するためには、例えば、抗スフィンゴ脂質抗体の型式が本明細書に開示する生物活性検定法においてその活性に影響を及ぼすことが発見されているため、変異体のＦａｂ型を親抗体のＦａｂ型と比較したり、変異体の全長型を親抗体の全長型と比較すべきである。本明細書で特に関心の対象となる変異型抗体は、少なくとも１つの所望する活性を少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約５％、２５％、５９％またはそれ以上を示すものであり得る。好ましい変異体は、親抗体と比較するときに、インビトロ測定の際に優れた生物物理学的特性を有するか、あるいはインビトロまたはインビボ測定の際に優れた生物活性を有するものである。
「抗ＬＰＡ薬剤」とは、ＬＰＡに結合する治療薬を意味し、抗体、抗体変異体、抗体由来分子、またはＬＰＡまたはその変異体に結合する非抗体由来部分を含む。
「生理活性脂質」とは、脂質シグナル伝達分子を意味する。生理活性脂質は、細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介し、したがって、分化、移動、増殖、分泌、生存、その他のプロセスを調節することによって、多種の細胞の機能制御に関与するという点において、構造脂質（例えば、膜結合リン脂質）と区別される。インビボで、生理活性脂質は、細胞外液中に見出され、その他の分子、例えば、アルブミンおよびリポタンパク質のような血清タンパク質とコンジュゲートを形成するか、「遊離」型、即ち、その他の分子種とコンジュゲートを形成しない状態で存在し得る。細胞外メディエーターとして、生理活性脂質の一部は、膜結合イオンチャネルまたはＧタンパク質共役レセプターまたは酵素、あるいは因子を活性化することにより細胞シグナル伝達を改変し、その結果として、複雑なシグナル伝達系を活性化し、細胞機能または生存に変化をもたらす。細胞内メディエーターとして、生理活性脂質は、酵素のような細胞内コンポーネント、またはイオンチャネル、またはアクチンのような構造エレメントと直接相互作用することによって、それらの作用を発揮することができる。
生理活性脂質の例は、セラミド、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）のようなスフィンゴ脂質を含む。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体と代謝物は、（スフィンゴミエリン由来の）スフィンゴイド主鎖によって特徴づけられる。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体と代謝物は、重要な細胞プロセスに多面発現効果を有する、一群の細胞外および細胞内シグナル伝達分子である。それらは、スルファチド、ガングリオシド、セレブロシドを含む。その他の生理活性脂質は、グリセロールを核とする主鎖によって特徴づけられ、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および様々なリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）のようなリゾリン脂質、ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ホスファチジン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）である。さらに、その他の生理活性脂質はアラキドン酸に由来し、エイコサノイド（ＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸（ ｅｐｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄｓ）、イソエイコサノイドを含む）、非エイコサノイドカンナビノイドメディエーターを含む。その他のリン脂質とそれらの誘導体を含む、その他の生理活性脂質もまた、本発明に従って使用し得る。
本発明のいくつかの実施態様では、抗体産生には、スフィンゴシンを核とする生理活性脂質（スフィンゴシンおよびＳ１Ｐのように、スフィンゴイド主鎖を有するもの）に対して、グリセロールを核とする生理活性脂質（ＬＰＡのようにグリセロール由来の主鎖を有するもの）を標的にすることが好ましい場合がある。その他の実施態様では、抗体生成にはアラキドン酸由来の生理活性脂質を標的にすることが好ましい場合があり、その他の実施態様では、スフィンゴイド由来生理活性脂質ではなく、アラキドン酸由来およびグリセロール由来の生理活性脂質が好ましい。合わせて、アラキドン酸由来およびグリセロール由来の生理活性脂質は、本明細書では、「非スフィンゴイド生理活性脂質」と呼ぶ。
本発明に従う生理活性脂質のクラスから特に除外されるものは、主として細胞膜の内側および／または外側小葉の構造メンバーとして機能する、ホスファチジルコリンとホスホチジルセリン、ならびにそれらの代謝物と誘導体である。
抗体または抗体フラグメントあるいは変異体との関連における「生物活性」という用語は、所望するエピトープに結合可能であり、かつ何らかの方法で生物学的作用を発現できる抗体、または抗体フラグメント、または抗体変異体を意味する。生物学的作用は、以下に限定はされないが、成長シグナルの調節、抗アポトーシスシグナルの調節、アポトーシスシグナルの調節、エフェクター機能カスケードの調節、その他のリガンド相互作用の調節を含む。
「バイオマーカー」とは、疾患の進行または治療効果を測定する上で有用となる特定の分子特性を有する、体内に存在する特定の生化学物質である。例えば、Ｓ１Ｐは、ある種の増殖過剰および／または心血管系状態のバイオマーカーである。
「心血管系治療」とは、心臓治療（心筋虚血症および心不全の治療）、ならびに心臓疾患のような心血管系に関連するその他の疾患の予防および／または治療を包含する。「心臓疾患」とは、心臓または心筋組織に関するあらゆる種類の疾患、障害、外傷または外科処置を包含する。特に関心の対象となるのは、組織リモデリングに関連する状態である。「心疾患治療剤」とは、心臓および心筋の疾患と障害に起因する、あるいは関連する疾患と障害に対して治療効果のある薬剤を意味する。
「担体」とは、ハプテンに結合し、それによってハプテンを免疫原性とするために用いられる成分である。担体を代表するが、それに限定されることはない担体のクラスはタンパク質であり、その例は、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、血球凝集素、破傷風、ジフテリアトキソイドを含む。本発明に従う用途に適する担体のその他のクラスおよび例は、当該分野に公知である。これら、ならびに将来発見または発明される天然由来または合成担体は、本発明に従う用途に適応され得る。
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」という表現は、互換性を持って使用され、かかるすべての呼称は、プロジェニー（子孫）を含む。したがって、「形質転換体」と「形質転換細胞」という用語は、トランスファー数に関係なく得られた一次的な対象細胞と培養を含む。なお、故意による、あるいは偶発性の突然変異のために、すべてのプロジェニーは、ＤＮＡ含有量において正確に同一でない可能性もある。当初の形質転換細胞においてスクリーンされるものと同じ機能または生体活性を有する突然変異体プロジェニーは含まれる。個別に呼称することを意図する場合、それは文脈から明らかになるであろう。
「化学療法剤」という用語は、抗癌剤およびその他の抗増殖過剰剤を意味する。したがって、化学療法剤は、一般的な治療薬のサブセットである。化学療法剤は、限定されることはないが、以下を含む。ＤＮＡ損傷剤およびＤＮＡ合成阻害剤：アントラサイクリン（ドキソルビシン、ドノルビシン、エピルビシン）、アルキル化薬（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ、およびトリエチレンメラミン）、白金誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、シスジアミン−ジクロロ白金）およびトポイソメラーゼ阻害薬（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型、ａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、デカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトキサート、６−チオグアニンなどの代謝拮抗剤、血管新生阻害薬（ベバシズマブ、サリドマイド、スニチニブ、レナリドマイド、ＴＮＰ−４７０、２−メトキシエスタンジオール、ラニビズマブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ペガプタニブ、エンドスタチン）、血管破壊剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａなどのようなコンブレタスタチン誘導体）、抗体のような生物製剤（ハーセプチン、アバスチン、パノレックス、リツキサン、ゼバリン、マイロターグ、カンパス、ベクサー、エルビタックス）、内分泌療法、 アロマターゼ阻害薬（４−ヒドロアンドロステネジオン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール）、抗エストロゲン（タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ファスロデックス）、デキサメタゾンのようなステロイド、免疫調節薬、 ＩＦＮ−βおよびＩＬ２のようなサイトカイン）、インテグリン阻害薬、その他の接着タンパク質とマトリックスメタロプロテイナーゼ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸のようなヒストン脱アセチル化酵素阻害薬、イマチニブ（グリベック）のようなチロシンキナーゼ阻害薬のようなシグナル伝達阻害薬、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−脱メトキシゲルダナマイシンのような熱ショックタンパク質阻害薬、オールトランスレチノイン酸のようなレチノイド、成長因子レセプターまたは成長因子の阻害薬、タキソイド（パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、ＢＡＹ ５９−８８６２）、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンのような抗有糸分裂化合物および／またはチューブリンー脱ポリマー化剤、ＣＯＸ阻害薬のような抗炎症薬と細胞サイクル制御薬（例えば、チェックポイント制御薬およびテロメラーゼ阻害薬）。
「キメラ」抗体（または、免疫グロブリン）という用語は、特定種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同である１本の重鎖および／または軽鎖からなり、その一方で、残りの鎖は他種に由来する、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同である分子を意味し、さらにそれらが所望する生物活性を提示する限りにおいては、かかる抗体のフラグメントを意味する（Ｃａｂｉｌｌｙら， ｉｎｆｒａ、 Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ｖｏｌ． ８１：６８５１(１９８４））。抗体配列は、その起源が脊椎動物または無脊椎動物であってよく、例えば、哺乳類、または鳥類、または魚類由来であって、軟骨魚、齧歯類、イヌ、ネコ、有蹄類、ヒトを含む霊長類に由来し得る。
「併用療法」という用語は、必要な治療効果を達成するために、少なくとも２つの異なる療法の供与を含む、治療手段を意味し、例えば、併用療法は、２つ以上の化学的に異なる活性成分、例えば、速効性化学療法剤と抗脂質抗体の投与を含んでよい。一方、併用療法は、抗脂質抗体および／または１つ以上の化学療法剤を単独、あるいは放射線治療および／または外科手術のような他の治療の送達と合わせて投与することを含み得る。２つ以上の化学的に異なる活性成分の投与の関連において、その活性成分は、同一組成物の一部または異なる組成物として投与することができる。別々の組成物として投与される場合、異なる活性成分を含む組成物は、同時または異なる時に、同一または異なるルートで、同一または異なる投与計画を用いて、特定の状況が必要とする全て、ならびに担当医師の決定に従って、投与され得る。同様にして、１つ以上の抗脂質抗体種（例えば、抗ＬＰＡ抗体）が、単独であるいは１つ以上の化学療法剤と併用して、例えば、放射線および／または外科手術と組み合わされる場合、その薬物は、外科手術または放射線療法の前または後で送達されてよい。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において、機能できる形で連結するコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適するコントロール配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーを利用することが公知である。
「誘導体化生理活性脂質」とは、生理活性脂質、例えばＬＰＡのことであり、１つの極性頭基と少なくとも１つの炭化水素鎖を有し、ここで炭化水素鎖内の炭素原子は、ペンダント反応基［例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩素基、ハロゲン原子］で誘導体化されおり、このペンダント反応基は保護されていても保護されていなくてもよい。この誘導体化は、分子と反応させるために（例えば、担体とコンジュゲートするために）、生理活性脂質を活性化する役割を果たす。
「誘導体化生理活性脂質コンジュゲート」とは、担体に共有結合的にコンジュゲートしている誘導体化された生理活性脂質を意味する。担体は、タンパク質分子またはポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズのような部分であり得る。誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、本発明に従って抗体応答を発生させるための免疫原として使用することができ、同一または異なる生理活性脂質コンジュゲートは、そのようにして産生された抗体検出のための検出試薬として使用され得る。いくつかの実施態様では、誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、検出に使用される際の固体支持体に付着する。
「二重特異性抗体」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを意味し、そのフラグメントは、同一ポリペプチド鎖に存在する１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる（ＶＨ−ＶＬ）。同一鎖上の２つのドメイン間に対合を形成するには短すぎるリンカーを使用することで、このドメインは他の鎖の相補ドメインとの対合を余儀なくされ、２つの抗原結合部位が創出される。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ ４０４，０９７、ＷＯ ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒらＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８(１９９３）に詳説されている。
「有効濃度」とは、例えば、特定の望ましくない生理活性脂質の、絶対的、相対的、および／または利用可能な濃度および／または活性を意味する。換言すれば、生理活性脂質の有効濃度は、利用可能な、そしてその生体機能を遂行することのできる、脂質の量である。本発明においては、例えば、生理活性脂質（例えば、Ｃ１Ｐなど）に対して誘導されたモノクローナル抗体のような免疫由来部分は、その脂質に結合して、その生体機能の遂行を不可能にすることによって、その脂質の有効濃度を低下させることができる。この例では、脂質自体は依然として存在するが（換言すれば、抗体によって分解されない）、そのレセプターまたはその他の標的に結合して下流効果を生じることがもはやできないため、絶対濃度というよりはむしろ「有効濃度」を測定することが適切である。生理活性脂質の有効濃度を直接的および／または間接的に測定するための方法とアッセイが存在する。
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体に由来する抗体の抗原結合部分と反応する抗原部分を意味する。
「発現カセット」という用語は、構造遺伝子（即ち、本発明による抗体のようなタンパク質コード配列）の発現を、かかる配列に適合性のある宿主内において、影響することができるヌクレオチド分子を意味する。発現カセットは、ポリペプチドをコードする配列、および、任意に、例えば、転写終止シグナルのようなその他の配列と機能できる形で連結する少なくとも１つのプロモーターを含む。発現を影響するために必要または役に立つその他の制御エレメント（例えば、エンハンサー）を使用してもよい。したがって、発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組み換えウィルス、すべての形態の組み換え型「裸のＤＮＡ」ベクターなどを含む。
「完全ヒト抗体」とは、適切な免疫原を提示されたときに、必ずしもＣＤＲ部分の移植を必要としないヒト抗体を産生できる、遺伝子改変（即ち、トランスジェニック）動物、典型的には哺乳類、一般的にはマウス（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ社から購入できるような）において産生される抗体を意味する。これらの抗体は、非ヒト抗体遺伝子が置換あるいは抑制され、ヒト免疫グロブリン遺伝子のいくつかまたは全てで置換されている動物（例えば、トランスジェニックマウス）から産生されるという点で、完全に「ヒト」抗体である。換言すれば、本発明による抗体は、関連するＣＤＲのヒトフレームワークを産生するように遺伝子改変されたマウスまたはその他の動物に免疫原性のある形で提示されたときに、生理活性脂質、特にＬＰＡに対して産生される抗体を含む。
「ハプテン」とは、非免疫原性であるが、抗体または抗体由来の抗原結合部分と反応できる物質である。換言すれば、ハプテンは、免疫原性ではなく抗原性の特性を有する。「ハプテン」とは、一般的には、ほとんどの状況下で、例えば、タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コロイド金、シリコーンビーズなどの担体に付着したときのみ、免疫応答を誘導する（即ち、抗原として作用する）ことができる小分子である。担体は、それ自体では免疫応答を誘導できないものであり得る。
「ヘテロコンジュゲート抗体」という用語は、共有結合で連結された２つの抗体を意味し得る。かかる抗体は、架橋剤の使用を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を用いて調製することができる。本明細書で使用する場合、「コンジュゲート」という用語は、 １つ以上の抗体フラグメントまたは結合部分が１つ以上のポリマー分子に共有結合することによって形成される分子を意味する。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。または、別の見方をすれば、ヒト化抗体は、ヒト配列の代わりに、非ヒト（例えば、マウス）抗体から選択された配列も含む、ヒト抗体である。ヒト化抗体は、その結合および／または生理活性を顕著に改変しない、同種または異種からの保存的アミノ酸置換または非天然残基を含み得る。かかる抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望する特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ、ウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲやフレームワーク配列のいずれにも見られない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精製かつ最大化するために行われる。したがって、一般的には、ヒト化抗体は、全て、または全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの可変ドメイン全体、また１つの形態では２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、またはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、 欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号、 Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、 Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号、 Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６／０１５３３、 Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号、 Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号、 Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号、 Ｐａｄｌａｎら、欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号、 Ｑｕｅｅｎ ら（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、ｖｏｌ． ８６：１００２９−１００３３）を参照。詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５(１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９(１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３−５９６(１９９２）およびＨａｎｓｅｎ， ＷＯ２００６１０５０６２を参照。
「増殖過剰疾患」という用語は、限定はされないが、癌および良性腫瘍を起因する臓器や組織細胞の制御不能な増殖を含む、細胞の制御不能な増殖に関連する疾患および障害を意味する。上皮細胞に関連する増殖過剰疾患は、血管腫のような血管形成疾患、子宮内膜症、肥満症、加齢黄斑変性、様々な網膜症、アテローム性動脈硬化治療においてステント留置の結果としての再狭窄を起因する上皮細胞と平滑筋の増殖を引き起こし得る。線維芽細胞に関連する増殖過剰疾患（即ち、線維形成）は、限定はされないが、加齢黄斑変性、心筋梗塞に関連する心臓リモデリングと心不全のような過剰な瘢痕化（即ち、線維症）、ならびに外科手術または傷害、ケロイド、類線維腫とステント留置の結果として通常生じる過剰な創傷治癒を含む。
「免疫原」とは、特定の免疫応答、特に免疫原を投与された動物において抗体応答を誘導できる分子である。本発明では、免疫原は、担体に結合された誘導体化生理活性脂質、即ち、「誘導体化生理活性脂質コンジュゲート」である。免疫原として使用される誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、この免疫原に対する応答において産生される抗体検出のための捕獲物質として使用され得る。したがって、免疫原は検出試薬としても使用できる。他方、捕獲物質として使用される誘導体化生理活性脂質コンジュゲートは、免疫原とは異なるリンカーおよび／または担体部分を備えていてもよい。
「阻害する」とは、特に生物学的現象との関連において、減少、または抑制、または遅延することを意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」を生じる治療とは、全く腫瘍を形成しないこと、または腫瘍の形成が遅くなること、または治療していないコントロールよりも腫瘍の数が少なくなることを意味し得る。
「単離」組成物とは、天然環境の構成成分から同定および分離された、および／または回収されたものである。天然環境の混入成分とは、抗体の診断または治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施態様では、この組成物は抗体であり、（１）ローリー法によって測定される抗体の９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％以上まで、または（２）スピニングカップシーケネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端または中間部アミノ酸配列を得るに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。組み換え細胞内インサイツの抗体は、その抗体の天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないため、単離抗体に含まれる。しかしながら、 通常は、単離抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
本明細書で使用される場合「標識」という用語は、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされるもののような、検出可能な化合物または組成物を意味する。標識はそれ自体によって検出可能であり（例えば、ラジオアイソトープ標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変を触媒し得る。
「リポソーム」とは、（本明細書に開示されるスフィンゴ脂質抗体、および任意に化学療法剤のような）薬物を哺乳類に送達するために役に立つ、様々な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小胞である。リポソームの構成成分は、一般的には、生体膜の脂質配置と同様に、二重層構造に配置されている。「単離」核酸分子とは、抗体核酸の天然原料と通常関連する少なくとも１つの混入核酸分子から同定および分離された核酸分子である。単離核酸分子は、天然で見いだされる形態または設定以外の状態にある。したがって、単離核酸分子は、天然細胞に存在する核酸分子とは区別される。ただし、単離核酸分子は、例えば、核酸分子が非改変細胞とは異なる染色体上の位置にあるような、通常抗体を発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
本発明との関連において、「液性組成物」とは、製造元からエンドユーザー（例えば、医師または看護師）に供給されたときの充填／完成形態が、固体に対して、液体または溶液であるものを意味する。本明細書では、「固体」とは、液体または溶液ではない組成物を意味する。例えば、固体は、凍結乾燥、沈降、類似の方法によって調製された乾燥組成物を含む。
本願を全体を通して使用される場合の「線状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に説明される抗体を意味する。簡潔には、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデム（直列）型Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）から構成される。線状抗体は、二特異性または単一特異性であり得る。
「代謝物」という用語は、それからＬＰＡが生成される化合物、ならびにＬＰＡの分解に起因する化合物、即ち、リゾリン脂質代謝経路に関与する化合物を意味する。「代謝前駆体」という用語は、それからスフィンゴ脂質が生成される化合物を指すのに使用され得る。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、あるいは前記抗体の集団を意味する。この集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る自然に発生する可能性のある突然変異を除いて、ほぼ同一のものである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して誘導され、極めて特異的である。さらに、通常は、異なる決定基（エピトープ）に対して誘導される異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体組成物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対して誘導される。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体産生を必要するとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ法、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作成し得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に説明されるテクニック、または当該分野に公知のその他の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。本明細書のモノクローナル抗体は特に、１本の重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同であり、残りの鎖（複数でもよい）が他種に由来するまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同であるキメラ抗体、さらにそれらのキメラ抗体が所望する生物活性を提示する限りにおいては、かかる抗体のフラグメントを含む（米国特許番号４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
「単独療法」とは、単回用量またはある期間にわたって反復用量として投与するにかかわらず、治療効果のある単一の化合物の送達に基づく治療法を意味する。
「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特性を有する、抗体、またはモノクローナル抗体を意味し得る。１つの実施態様では、複数のエピトープが同一抗原に由来する。他の実施態様では、複数のエピトープが２つ以上の異なる抗原に由来する。多重特異性抗体を作成する方法は、当該分野で公知である。多重特異性抗体は、二重特異性抗体（２つのエピトープに対する結合特性を有する）、三重特異性抗体（３つのエピトープ）などを含む。例えば、多重特異性抗体は、２つ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて、組み換えによって産生し得る。他方、多重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。当業者は、当該分野に公知であり得るこれらまたはその他の方法を用いて、多重特異性抗体を産生できる。多重特異性抗体は、多重特異性抗体フラグメントを含む。本発明によって理解される多重特異性（この場合は、二重特異性）抗体の一例は、Ｓ１ＰエピトープとＣ１Ｐエピトープに対する結合特性を有し、したがって、Ｓ１ＰとＣ１Ｐのどちらも認識かつ結合できる抗体である。本発明によって理解される二重特異性抗体のもう１つの例は、生理活性脂質からのエピトープと細胞表面抗原からのエピトープに対する結合特性を有する抗体である。したがって、抗体は、生理活性脂質を認識かつ結合できるため、例えば、標的目的で、細胞を認識かつ結合できる。
「新生物」または「癌」とは、異常かつ制御不能な細胞増殖を意味する。「新生物」、または腫瘍あるいは癌は、異常で、制御不能、かつ細胞成長の無秩序な増殖であり、一般的には癌と呼ばれる。新生物は、良性または悪性であり得る。新生物は、破壊的な増殖、侵襲性、転移特性を有する場合は、悪性または癌性である。侵襲性とは、周辺組織の浸潤または破壊、通常、組織の境界を規定する基底膜を破壊し、それによってしばしば身体の循環系に侵入することによる、新生物の局所的な伝播を意味する。転移は通常、リンパ系または血管による腫瘍細胞の播種を意味する。転移はまた、漿液腔、またはくも膜下腔あるいはその他の腔を通じての直接的な伸展による腫瘍細胞の移動を意味する。転移プロセスを通じて、身体の他の部分への腫瘍細胞の移動は、原発部位から離れた場所に新生物を形成する。
核酸がその他の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、核酸は「機能できる形で連結されている」。例えば、プレ配列または分泌型リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡと機能できる形で連結されている。プロモーターやエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列と機能できる形で連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進できるように配置されている場合、コード配列と機能できる形で連結されている。一般的に、「機能できる形で連結する」ということは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、したがって、分泌型リーダーの場合、近接かつ読み取りフェーズにあることを意味する。ただし、エンハンサーは近接に位置する必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーション（連結）によって達成される。かかる部位が存在しないならば、従来の技術に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
本明細書において「親」抗体とは、変異体の調製に使用されたアミノ酸配列によってコードされている抗体である。親抗体は、天然抗体または既に、例えばキメラ抗体のように、変異体であってもよい。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であり得る。
本発明による「特許性のある」組成物、方法、装置、製品とは、その内容が、鑑定実施時に特許性の全法定要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、非自明性などに関して、後の審査によって、１つ以上のクレームが、新規性、非自明性などを打ち消す１つ以上の実施態様を包含することが判明すれば、クレームは、定義上、特許性のある実施態様に限定されるので、特許性のない実施態様を明確に除外する。さらに、本明細書に添付のクレームの範囲は、最も広範で妥当な適用範囲を定め、かつそれらの正当性を保つと解釈されるものである。さらに、本出願の申請時または特許登録時から、１つ以上の付属クレームの有効性が疑問視されるまでの間に、１つ以上の特許性の法定要件が補正される場合、またはある特許性の法定要件を満たすか否かを評価するための基準が改変された場合は、クレームは、（１）有効性を保ち、かつ（２）その条件において最も広範で妥当な解釈を得るように解釈されるものである。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明による薬剤および化合物の生物学的有効性と特性を保有し、生物学上であろうがなかろうが望ましくない塩を意味する。多くの場合、本発明による薬剤と化合物は、荷電基（例えば、荷電アミノおよび／またはカルボキシル基またはそれらの類似基）によって酸および／または塩基塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製することができ、一方、薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩から調製できる。薬学的に許容される塩についての総説については、Ｂｅｒｇｅら(１９７７）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ６６， １−１９を参照。
「複数」とは１つ以上を意味する。
「プロモーター」という用語は、細胞内でコード配列の転写を引き起こすことが可能なすべての配列を含む。したがって、本発明によるコンストラクトで使用されるプロモーターとは、遺伝子転写の時期および／または比率の制御または調節に関与する、シス作用性転写制御エレメントおよび制御配列を含む。例えば、プロモーターは、転写制御に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複写開始点、染色体組み込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列を含む、シス作用性転写調節領域であり得る。本発明の用途に適する転写制御領域は、限定はされないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ またはｔｒｐプロモーター、原核または真核細胞またはそれらのウィルスの遺伝子発現を調節することが公知であるその他のプロモーターを含む。
「組み換えＤＮＡ」という用語は、人間によって操作、または創出、または改変された核酸とそれから発現する遺伝子産物を意味する。「組み換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって産生されたポリペプチドまたはタンパク質であり、例えば、所望するポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来性ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞に由来するポリペプチドまたはタンパク質である。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成によって調製されたポリペプチドまたはタンパク質である。
「分離された」、「精製された」、「単離された」などの用語は、試料を収容する容器内に含まれる試料の１つ以上の成分が、容器内に存在する１つ以上のその他の試料成分の存在下で、物理的に除去されたり、希釈されたことを意味する。分離または精製工程中に除去または希釈され得る試料成分は、化学反応生成物、未反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質、非結合分子を含む。
「固体相」とは、本発明による抗体が付着できるものなどの非液性マトリックスを意味する。本明細書で包含する固体相の例は、その一部または全体がガラス（例えば、制御多孔質ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、シリコーンで形成されているものを含む。ある実施態様では、コンテキストに応じて、固体相は、アッセイプレートのウェルを含んでもよく、他の実施態様では、精製カラム（例えば、アフィニティクロマトグラフィカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載の固体相のように、個々の粒子からなる非連続的な固体相も含む。
本明細書で使用する「種」という用語は、例えば、化学療法剤の特定の種というように、様々なコンテキストで使用される。それぞれのコンテキストにおいて、この用語は、特定のコンテキストで言及されるような、化学的には不明瞭な分子の集団を意味する。
抗体−抗原相互作用との関連において、「特異的」または「特異性」という用語は、抗体とその標的であるエピトープ間の選択的な、非ランダム相互作用を意味する。ここで、「抗原」という用語は、抗体分子またはその他の免疫由来部分によって認識かつ結合される分子を意味する。抗体によって結合される抗原の特定部分は、「エピトープ」と呼ばれる。この相互作用は、分子間に適切な化学的または分子的相互作用を生じさせるような構造的な、疎水性／親水性および／または静電気的特性の存在に依存する。したがって、抗体は、一般的に、その標的抗原のエピトープに「結合する」（または「特異的に結合する」）、あるいは「〜に反応性がある」（または「〜に特異的に反応性がある」）、あるいは、同様な意味合いで、「〜に対して反応性がある」（または「〜に対して特異的に反応性がある」）と言える。抗原に対する抗体結合を手短に表現する際には、当該分野では、一般的に、抗体は、抗原に「対して」または「に向けて」として説明される。したがって、「Ｃ１Ｐに結合する抗体」、「Ｃ１Ｐに対して反応性のある抗体」、「Ｃ１Ｐと反応性のある抗体」、「Ｃ１Ｐに対する抗体」ならびに「抗Ｃ１Ｐ抗体」のすべては、当該分野では同一の意味を有する。抗体分子は、所定の一連の条件下で、所望する抗原に対する結合を、非関連抗原または類似抗原あるいは抗原混合物に対する結合と比較することによって、結合の特異性を試験できる。本発明に従う抗体は、非関連抗原、または標的抗原の類似体にさえ顕著な結合を欠如することが好ましい。
本明細書において、「安定な」とは、所望する目的や操作のために十分安定な状態に保つことができる２つの分子（例えば、ペプチドとＴＬＲ分子）間の相互作用を意味する。例えば、ペプチドとＴＬＲ分子間の「安定な」相互作用とは、所望効果を達成するために十分な期間、ペプチドがＴＬＲ分子と会合し、その状態を保っているような相互作用を意味する。
「被験者」または「患者」とは、本発明による分子がもたらすことのできる処置（治療）を必要とする動物を意味する。本発明に従って治療され得る動物は、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、特に好ましい例である霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）などの哺乳類が属する、脊椎動物を含む。
「代用マーカー」とは、疾患状態に対する治療効果を間接的に示す、体内の生理活性の検査測定結果を意味する。増殖過剰および／または心血管系症状の代用マーカーの例は、ＳＰＨＫおよび／またはＳ１ＰＲを含む。
「治療薬」とは、限定はされないが、以下を含む、治療効果を与えることを意図する薬剤または化合物を意味する。ＣＯＸ阻害薬およびその他のＮＳＡＩＤＳを含む抗炎症薬、抗血管新生薬、上記に定義するような化学療法剤、心血管系作用薬、免疫調節薬、神経変性疾患治療に使用される薬、眼薬など。
「治療有効量」（または「有効量」）とは、例えば、かかる治療を必要とする被験者に投与した際に治療効果をもたらすために十分な有効成分（例えば、本発明による薬剤）の量を意味する。したがって、何をもって本発明に従う組成物の治療有効量とするかは、当業者によって容易に決定され得る。癌治療との関連において、「治療有効量」とは、特定の癌と相関する１つ以上の遺伝子発現の増加または低下、腫瘍量の減少、癌細胞の溶解、生体試料（例えば、バイオプシー（生検）および全血、血漿、血清、尿などのような体液のアリコート）における１つ以上の癌細胞の細胞死マーカーの検出、アポトーシスの誘導またはその他の細胞の死経路を含む、癌細胞の生存または代謝に関連する１つ以上のパラメータの客観的に計測される変化を生じる量である。勿論、治療有効量は、個々の被験者と治療対象となる病状、被験者の体重および年齢、疾患状態の重症度、選択された特定の化合物、従うべき投与計画、投与時期、投与方法などによって異なるが、これら全ては、当業者によって容易に決定され得る。併用療法との関連においては、何をもって特定の有効成分の治療有効量とするかは、単独療法（即ち、有効成分として１つの化学的実体のみを用いる治療法）として投与されるときの治療有効量とは異なる可能性がある。
本発明による組成物は、生理活性脂質を用いる治療法において使用される。本明細書で使用される場合、「治療」および「治療の」という用語は、疾患、または障害、または身体的外傷の予防および／または治療の全領域を包含する。本発明による「治療」薬は、リスクにある（薬理遺伝学）と特定され得る個人をターゲットとしてデザインされた手順を組み入れる方法などの予防的な様式で、または事実上寛解または治療するように、または治療対象となる疾患または障害の少なくとも１つの症状の進行速度または度合いを遅延するように、または疾患、または障害、または身体的外傷からの回復に関連する不快感や疼痛、または身体的制限に要する時間、または発症、または度合いを最小限にするように作用できるか、またはその他の治療法や処置に対するアジュバントとして使用することができる。
疾患または障害の「治療」または「治療すること」という用語は、疾患または障害に対して予防または保護すること（即ち、臨床症状が発現しないようにすること）、疾患または障害を抑制すること（即ち、臨床症状の発現を停止、または遅延、または抑止すること）、および／または疾患または障害を緩和すること（即ち、臨床症状を退行させること）を含む。言うまでもなく、疾患または障害を「予防すること」と「抑止すること」を区別するのは、最終的に誘導するイベントまたは複数のイベントが未知であり潜在的である可能性があるため、いつでも可能であるとは限らない。「治療の必要がある」ものとは、既に障害を罹患しているもの、ならびに障害が予防されるべきものを含む。したがって、「予防法」という用語は、「予防すること」ならびに「抑止すること」の双方を包含するタイプの「治療」を意味する。したがって、「保護」という用語は「予防」を含む。
「治療法」という用語は、化学療法剤および細胞毒薬、放射線療法、外科手術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチンとＤＮＡ療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管新生療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよび抗体と抗体変異体、レセプターデコイ、その他のタンパク質基剤の薬物療法のようなその他の生物製剤を用いる、疾患または障害の治療全般を意味する。
フレームワークおよび相補領域またはＣＤＲ（別名、超可変領域として知られている）からなる（抗体の）「可変」領域という用語は、抗体間で配列が広範囲にわたって異なり、特定の抗原に対するそれぞれ特定の抗体の結合および特異性において使用される、可変ドメインの特定の部分を意味する。しかしながら、この可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布されてはいない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインの超可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのさらに高度に保存されている部分は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主としてβシート立体配置をとり、３つの超可変領域によって連結され、連結するループを形成し、ある場合は、βシート構造の一部分を形成する、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）からなる。本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合の役割を担う、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基からなり（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ(免疫学的関心となるタンパク質配列）、第５版、公衆衛生サービス、国立保健研究所， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．(１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、９６〜１０１（Ｈ３）からなる、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７(１９８７））。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
各鎖の超可変領域は、ＦＲ領域よって合わせて近接に保たれており、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的関心となるタンパク質配列）、第５版、公衆衛生サービス、国立保健研究所、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９９１）， ６４７−６６９ページを参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような、様々なエフェクター機能を示す。
「ベクター」、または「プラスミド」、または「発現ベクター」とは、１つ以上の組み換え遺伝子の発現を引き起こすために、細胞内に一時的にまたは安定して維持され得る核酸を意味する。ベクターは、単独の、あるいはその他の化合物と複合体を形成している核酸を含み得る。ベクターは任意に、ウィルスまたは細菌の核酸および／またはタンパク質および／または膜を含む。ベクターは、限定はされないが、それに対してＤＮＡフラグメントが付着しているか、あるいは複製されるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。したがって、ベクターは、限定はされないが、ＲＮＡ、自律自己複製環状または線状のＤＮＡまたはＲＮＡを含み、発現および非発現プラスミドの双方を含む。プラスミドは、市販されており、制限されることなく公に入手可能であるか、公開されたプロトコルによって報告されるように、入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、発現ベクターはまた、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン抵抗性のような形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する遺伝子を含み得る。
本願は、ＬＰＡに結合し、かつ記載の配列を有する規定のアイデンティティのＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む、抗ＬＰＡ薬を提供する。抗ＬＰＡ薬は、キメラ抗体、ヒト化抗体、全長抗体、親和性成熟抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントのいずれかを含む抗体、あるいは非抗体由来部分であり得る。抗ＬＰＡ薬は、ポリマー、放射性核種、化学療法剤、検出薬からなる群から選択される部分とコンジュゲートしており、担体や、任意に薬剤として許容できる担体において提供され得る。さらに、抗ＬＰＡ薬は、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体変異体のいずれかであり得る、ＬＰＡ以外の分子に結合し得る第二の薬剤と組み合わせて提供され得る。抗ＬＰＡ薬と第二の薬剤は、任意に共有結合によって結合され得る。
また、少なくとも１つのＣＤＲペプチドをコードする、記載のヌクレオチド配列を有する規定のアイデンティティの配列を含む、単離核酸分子が供給される。この核酸分子は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のフラグメント、または全長免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードし、サカナ、トリ、哺乳類、任意に霊長類、任意にヒトに由来し得る。これらの核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞が供給される。
さらに、動物免疫グロブリン重鎖または軽鎖からのフレームワーク領域を少なくとも１つ、および与えられた配列を有する規定のアイデンティティのＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む、単離ポリペプチドが供給される。このポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の全長可変ドメイン、全長免疫グロブリン重鎖または軽鎖、または免疫グロブリン重鎖または軽鎖のフラグメントであり得る。また、生理学的状況においてＬＰＡに結合し、免疫グロブリン重鎖の可変領域由来のフレームワーク領域を少なくとも１つ、ならびに与えられた配列を有する規定のアイデンティティのＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む２本の免疫グロブリン重鎖、ならびに、２本の免疫グロブリン重鎖と機能的に会合する、生理学的状況においてＬＰＡに結合し、免疫グロブリン軽鎖の可変領域由来のフレームワーク領域を少なくとも１つ、ならびに与えられた配列を有する規定のアイデンティティのＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む２本の免疫グロブリン軽鎖からなる、単離抗体分子も供給される。これらの単離抗体分子は、ヒト化抗体分子であり得る。
さらに、本発明は、少なくとも第一と第二のリガンド結合エレメントを含み、前記第一のリガンド結合エレメントがＬＰＡに結合し、与えられた配列を有する規定のアイデンティティのＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む多価結合分子を供給する。多価結合分子は、全長免疫グロブリン重鎖または軽鎖、あるいはそれらのフラグメントであり得る。第二の結合エレメントはまたＬＰＡに結合し、２つ以上のリガンド結合エレメントがあってもよい。多価結合分子は、リガンド結合エレメントが連結される足場（スキャフォールド）を含んでもよい。
本発明では、規定の配列の可変ドメインを有する単離抗ＬＰＡ抗体重鎖、ならびに規定の配列の可変ドメインを有する単離抗ＬＰＡ抗体軽鎖が供給される。単離抗ＬＰＡ抗体中への２本のかかる重鎖と２本のかかる軽鎖の組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体であり得る担体中にかかる抗体を含む組成物が開示される。
ＬＰＡの異常な量に関連する疾患または障害の治療または予防法が提供され、その方法は、ＬＰＡの有効濃度を低下させるために効果のある量の抗ＬＰＡ抗体を含む本発明による組成物の１つを、被験者に投与することを含む。この疾患または障害は、癌を含む増殖過剰疾患、自己免疫疾患・同種移植片拒絶・移植片対宿主病を含む免疫関連疾患、神経変性疾患、肥満症、２型糖尿病、黄斑変性を含む眼病、疼痛、または異常な血管形成または血管新生に関連する疾患、アポトーシス、強皮症・肺線維症・腎線維症・皮膚線維症・心臓線維症・肝線維症を含む線維形成または線維症、創傷修復および治癒、蜘蛛咬刺症であり得る。動物において、本発明による組成物を使用して、異常な増殖過剰、免疫応答、神経変性、血管形成、血管新生、アポトーシス、線維形成、線維症を低減する方法もまた請求される。治療対象となる線維症は、肝臓、腎臓、肺、心臓、子宮、皮膚の線維症であり得る。ヒトを含む、動物からの試料中に、ＬＰＡと同様に、線維症マーカーを少なくとも１つ検出することが望まれる。
さらに、１つの極性頭基と少なくとも１つの炭化水素鎖を含み、前記少なくとも１つの炭化水素鎖内の炭素原子が任意に保護されているペンダント反応基によって誘導体化されている、誘導体化リゾホスファチジン酸を含む、診断用試薬が提供される。このペンダント反応基は、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩素基、ハロゲン原子であってよく、さらにこの誘導体化リゾホスファチジン酸は、固体支持体と会合していてもよい。この誘導体化リゾホスファチジン酸はさらに、任意にポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、シリコーンビーズ、タンパク質（ここで前記タンパク質は、任意にキーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、ウシサイログロブリン、大豆トリプシン阻害剤である）である担体部分とコンジュゲートしていてもよい。このコンジュゲートは、固体支持体に付着していてもよい。試料中の抗ＬＰＡ薬を検出する方法が提供され、この方法は、誘導体化ＬＰＡを含む診断用試薬に対する試料中の抗ＬＰＡ薬の結合を検出することを含む。抗ＬＰＡ薬は、抗体、任意にヒト抗ＬＰＡ抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、非抗体由来部分のいずれかであってよく、さらにこの試料はバイオプシー試料のような組織試料を含む生体試料、および任意に全血、血漿、血清、尿、精液、胆汁、房水、硝子体液、気管支肺胞上皮洗浄液、粘膜、痰のいずれかである液性試料であり得る。この検出法はさらに、少なくとも１つの線維症マーカーの検出を含み得る。ＬＰＡの検出はまた、疾患の存在を示し、またはＬＰＡの有効濃度調節のための治療法をモニターするために、試料中のＬＰＡ量をＬＰＡの基準量と比較することを含み得る。この検出法はまた、誘導体化ＬＰＡを含む診断用試薬を担う診断デバイスの使用を伴い得る。さらに、ＬＰＡ検出のためのＥＬＩＳＡキットが開示される。
本発明の前記ならびにその他の形態は、下記の詳細な説明、付属図面ならびに請求からさらに明確となろう。
特に定義しない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本発明の実施または試験には、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を使用してよいが、適切な方法と材料については以下に記載する。本明細書に言及される全ての出版物、特許出願、特許、その他の参考文献は、その全てが参照により援用される。不一致が生じた場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、実施例は説明を目的とするもので、限定を意図してはいない。
本明細書に記載の各図表の簡単な概略を、本願に記載の様々なヌクレオチドおよびアミノ酸配列のリストと合わせて以下に示す。
本発明に従う免疫原の主要成分として、ならびにＥＬＩＳＡとＢｉａＣｏｒｅアッセイのためのレイダウン材料の主要成分として使用された、典型的なチオール化Ｓ１Ｐ類似体作成の有機合成模式図。 図３のチオール化ＬＰＡ類似体の合成において使用されたチオール化関連脂肪酸作成の有機合成模式図。 本発明に従う免疫原の主要成分であり、ならびにＥＬＩＳＡおよびその他のアッセイのためのレイダウン材料の主要成分である、典型的なチオール化ＬＰＡ類似体作成の有機合成模式図。
Ａ．誘導体化および／またはコンジュゲート化ＬＰＡ
１．組成物
本発明は、免疫原性応答（即ち、抗体産生）を促進するような方法で誘導体化されたＬＰＡを供給する。１つの実施態様では、ＬＰＡは、ＬＰＡ分子が担体分子とコンジュゲートするように、誘導体化され得る。１つの実施態様では、ＬＰＡの炭化水素鎖内の炭素原子は、ペンダント反応基によって［例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩素基、ハロゲン原子］で誘導体化されており、前記ペンダント反応基は保護されていても保護されていなくてもよい。この誘導体化は、分子と反応させるために（例えば、担体とコンジュゲートするために）、生理活性脂質を活性化する役割を果たす。１つの実施態様では、誘導体化ＬＰＡは、チオール化ＬＰＡである。１つの実施態様では、誘導体化ＬＰＡは、誘導体化Ｃ１２またはＣ１８ＬＰＡである。１つの実施態様では、このチオール化ＬＰＡは、クロスリンカー（例えば、ＩＯＡまたはＳＭＣＣなどの二機能性クロスリンカー）を介して、タンパク質であり得る担体にコンジュゲートされる。免疫される種において、ＬＰＡを、免疫原であるタンパク質またはその他の担体、例えば、キーホールインペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（ウシ血清アルブミンまたはＢＳＡを含む）、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二機能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでＲとＲ1は異なるアルキル基）を用いてコンジュゲートさせることは有用であり得る。非タンパク質担体（例えば、コロイド金）も、抗体産生における用途が、当該分野では公知である。
誘導体化ＬＰＡまたは誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡは、抗ＬＰＡ抗体（ポリクローナルおよび／またはモノクローナル）を産生するために使用できる。誘導体化ＬＰＡまたは誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡはまた、本発明による方法、特に診断法において使用できる。
２．誘導体化ＬＰＡの研究ならびに診断的用途
本発明による誘導体化ＬＰＡは、抗ＬＰＡ抗体の検出および／または精製に使用することができ、前述のように担体とコンジュゲートさせることができる。この誘導体とコンジュゲートは、臨床診断法を含む診断法における用途では、固体支持体にコンジュゲートさせることが好ましい。例えば、ＬＰＡ抗体の検出および／または定量は、ＬＰＡが関与する様々な医学的状態の診断に使用できる。ＬＰＡ抗体の定量はまた、用量、半減期、ならびに、例えば本明細書に説明するＬＴ３０００のような抗ＬＰＡ抗体による治療後の薬の量を評価するために臨床の現場において有用である。
１つの実施態様では、誘導体化ＬＰＡコンジュゲート（例えば、ＢＳＡまたはＫＬＨにコンジュゲートされたチオール化ＬＰＡ）は、抗ＬＰＡ抗体の検出に使用されるＥＬＩＳＡのレイダウン材料として使用される。１つの実施態様では、ＬＰＡは、ＢＳＡにコンジュゲートされたチオール化 Ｃ１２ ＬＰＡまたはチオール化Ｃ１８ ＬＰＡである。この実施態様は、例えば、ＬＰＡ検出のためのＥＬＩＳＡアッセイの（プレートをコーティングするための）レイダウン材料として有用である。例えば、ＬＰＡ競合ＥＬＩＳＡでは、プレートは、誘導体化ＬＰＡおよび／または誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡでコーティングされる。１つ以上のＬＰＡ標準物質と１つ以上の試料（例えば、血清または細胞培養上清）のセットを、本発明によるマウス抗ＬＰＡ抗体と混合してから、誘導体化ＬＰＡでコーティングされたプレートに加える。抗体は、プレートに結合したＬＰＡ、あるいは試料または標準物質中のＬＰＡのいずれかに対する結合を競合する。インキュベートならびに幾つかのＥＬＩＳＡ工程後、４５０ ｎｍで吸光度を測定し、検量線との比較によって、試料中のＬＰＡ濃度を求める。
誘導体化ＬＰＡまたは誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡはまた、固体支持体（例えば、樹脂またはその他のカラムマトリックス、ビーズ、膜、プレート）に結合されてもよく、例えば、血液または血清から、抗ＬＰＡ抗体を単離および／または精製するために使用できる。かかる抗ＬＰＡ抗体は、本発明によるもの（例えば、ＬＰＡに対する哺乳類モノクローナルまたはポリクローナル抗体）のように新しく生成された抗体であるか、天然のヒト抗ＬＰＡ抗体であり得る。
したがって、本発明による誘導体化ＬＰＡおよび誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡは、研究および臨床的診断のどちらにも有用である。
３．本発明による誘導体化ＬＰＡを組み込んだ診断キット
便宜上、本発明による誘導体化ＬＰＡは、例えば、診断アッセイ実施用の取扱説明書が添付された、規定量の試薬を組み合わせてパッケージした、キット中に供給され得る。
前述のように、１つの実施態様では、誘導体化ＬＰＡコンジュゲート（例えば、ＢＳＡまたはＫＬＨにコンジュゲートされたチオール化ＬＰＡ）は、抗ＬＰＡ抗体の検出に使用されるＥＬＩＳＡキットの（プレートをコーティングするための）レイダウン材料として使用される。かかるキットは、ＬＰＡの検出に有用である。例えば、ＬＰＡ競合ＥＬＩＳＡキットでは、（供給の）プレートは、誘導体化ＬＰＡおよび／または誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡでコーティングされる。１つ以上のＬＰＡ標準物質と１つ以上の試料（例えば、血清または細胞培養上清）の一式を、本発明によるマウス抗ＬＰＡ抗体と混合してから、誘導体化ＬＰＡでコーティングされたプレートに加える。抗体は、プレートに結合したＬＰＡ、あるいは試料または標準物質中のＬＰＡのいずれかに対する結合を競合する。インキュベートならびに幾つかのＥＬＩＳＡ工程（取扱説明書と試薬はキットに含まれる）後、４５０ ｎｍで吸光度を測定し、検量線との比較によって、試料中のＬＰＡ濃度を求める。１つの実施態様では、ＥＬＩＳＡキットのレイダウン材料として使用されるＬＰＡは、ＢＳＡにコンジュゲートされたチオール化Ｃ１２ ＬＰＡまたはチオール化Ｃ１８ ＬＰＡである。このキットで使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明によるＬｐａｔｈ社の誘導体化かつコンジュゲート化されたＬＰＡと本発明によるＬｐａｔｈ社の抗ＬＰＡ抗体を組み込んだキットは、Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ(リゾホスファチジン酸アッセイキット、カタログ番号Ｋ−２８００）から市販されている。
Ｂ．抗ＬＰＡ抗体を含む抗ＬＰＡ薬剤
１．はじめに
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、安全かつ有効な治療薬であることが示されているため、様々な疾患および障害の治療薬としてのその使用が急増している。承認済みの治療用モノクローナル抗体は、アバスチン（ＡｖａｓｔｉｎTM）、エルビタックス（ＥｒｂｉｔｕｘTM）、リツキサン（ＲｉｔｕｘａｎTM）を含む。その他のモノクローナル抗体は、その大部分が様々な形態の癌を標的とする様々な疾患について、臨床開発の様々なフェーズにある。一般的には、モノクローナル抗体は非ヒト哺乳類で生成される。マウスモノクローナル抗体の治療上の実用性は、非ヒト哺乳類抗体のキメラ化またはヒト化によって改善され得る。ヒト化は、投与された治療用のモノクローナル抗体に対する免疫応答の発生を大幅に減少させることによって、半減期、ならびにかかる応答の結果として生じる治療効果の低下を回避する。大部分は、ヒト化プロセスは、マウスの相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）中に移植することからなる。ＦＲにある選択された残基のマウスアミノ酸残基への逆突然変異が、当初の移植コンストラクトで喪失された親和性を改善または取り戻すためにしばしば必要とされる。
モノクローナル抗体の製造は、免疫グロブリンタンパク質それ自体の可変性から生じる複雑なプロセスである。この異種性は、代替ジスルフィド対の形成、脱アミド、イソアスパラギン酸残基の形成、メチオニンとシステイン酸化、Ｎ末端グルタミン残基のピログルタミン酸への環化、ならびに哺乳類カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リジンの部分的な酵素的切断に帰すことができる。安定性の増強、プロテアーゼ抵抗性、凝集挙動、異種系における発現量の増強のような、特性を改善するために、通常、抗体に操作が加えられる。
２．ＬＰＡ関連疾患と抗ＬＰＡ薬の治療用途
ＬＰＡは、多数の疾患と障害に関連している。総説としては、Ｇａｒｄｅｌｌら、（２００６）
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１２（２）：６５−７５、ならびにＣｈｕｎ Ｊ． およびＲｏｓｅｎ， Ｈ．、(２００６）Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍａ． Ｄｅｓｉｇｎ １２：１６１−１７１を参照。これらは、糖尿病・多発性硬化症・強皮症などの自己免疫疾患、癌を含む増殖過剰疾患、血管形成および血管新生に関連する疾患、肥満症、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、統合失調症、移植拒絶および移植片対宿主病などの免疫関連疾患などを含む。
ａ．増殖過剰疾患
本発明の１つの形態は、増殖過剰疾患の治療方法に関する。これらの方法は、ＬＰＡ関連増殖過剰疾患を罹患していることが知られているまたは疑われる哺乳類（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの動物、特にヒト）に、意図する適用が必要とするような、好ましくは、薬学的または獣医学的に許容される担体中にあるＬＰＡ濃度および／または活性を妨害する薬剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。ＬＰＡ関連の増殖過剰疾患は、腫瘍、内皮細胞増殖に関連する障害、線維形成に関連する疾患を含む。多くの場合、腫瘍は癌である。内皮細胞増殖に関連する代表的な疾患は、例えば、固形腫瘍に起因する癌、血液学的腫瘍、加齢黄斑変性のような血管形成依存性疾患である。線維形成に関連する疾患は、心不全のような、異常な心臓リモデリングを伴う疾患を含む。
多数の公知の増殖過剰疾患が存在しているが、それらにおいては、様々な組織と臓器の細胞が、成長、増殖、移動、シグナル伝達、老化、死亡の異常なパターンを示す。これらの疾患のいくつかに対応するために、多数の治療法が開発されているが、それら疾患の多くは未だ既存のテクノロジーではほとんど治療不能であり、その他の場合は、治療法はあるが、往々にして最適な治療法とは言い難く、ほとんど治癒不能である。
癌は、おそらく最も広く認識されている増殖過剰疾患の部類の代表的なものである。癌は、破壊的な部類の疾患であると共に、心血管系疾患の次に高い致死率を有する。多くの癌は、分子レベルでは完全に理解されていない。その結果、癌は、米国政府ならびに製薬会社双方にとって、研究開発の大きな関心の的である。その結果、癌に対する闘いを支援するために、かつてないほどの研究開発の努力がなされ、多数の価値ある治療薬が製造されている。
あいにく、莫大な量の癌研究も、癌に起因する甚大な損傷に打ち勝つには十分でない。米国のみをとっても、未だに、毎年１００万を超える癌の新しい症例が生じ、５０万人が癌のために死亡している。これは、癌のための新しい治療法を発見するために莫大な努力が払われようとも、この疾患を撲滅するための有効な治療法はまだ実現されていないということを如実に表している。
癌は現在、主として３種類の治療法（外科手術、放射線療法、化学療法）のうちから１つまたは併用によって治療されている。外科手術は、疾患組織のバルク除去を含む。外科手術は、例えば、乳房、結腸、皮膚のような、特定の部位に局在する腫瘍の除去には往々にして有効であるが、背骨のようなその他の領域に局在する腫瘍の治療、または白血病のような播種性腫瘍状態の治療には使用できない。放射線療法は、生体組織の電離放射線への曝露を含み、曝露された細胞に死または損傷をもたらす。放射線療法の副作用は、急性かつ一過性であり得るが、不可逆的な場合もある。化学療法は、細胞複製または細胞代謝の破壊を含む。
更なる痛手は、現在の治療薬は通常、毒性および重篤な副作用の形で、患者にとって著しい難点を伴うことである。したがって、多数のグループが最近、癌と闘うための新しいアプローチに注目し始めた。これらの新しい、いわゆる「革新的療法」は、遺伝子療法およびモノクローナル抗体のような治療用タンパク質を含む。
癌の治療のために臨床使用された最初のモノクローナル抗体は、１９９７年に発売されたリツキサン（リツキシマブ）であり、モノクローナル抗体の治療薬としての有用性を実証した。そのためそれ以来、癌のために処方される９つのモノクローナル抗体を含む、２０個のモノクローナル抗体が、認可されたことは驚くに足らない。これらの製品の成功、ならびに小分子と比較するとモノクローナル抗体開発に要するコストと時間が低いことによって、モノクローナル抗体治療法は、小分子に次いで２番目に大きな候補薬のカテゴリーとなっている。さらに、小分子治療薬と比較して、抗体は鋭敏な特異性を持つが、これは有効性と毒性双方の観点から大きな利点であることが証明されている。癌のみをとってみても、現在企業によって２７０以上の抗体についての研究開発プロジェクトが進行しており、５０社以上が、新しい癌抗体治療薬の開発に携わっている。その結果、モノクローナル抗体は、癌治療の主役となる状態が整っており、癌治療薬のマーケットシェアの増大を掴むと予想されている。一般的に治療用モノクローナル抗体は、タンパク質を標的とする。ごく最近になって、生理活性脂質に対するモノクローナル抗体を産生させることが可能となった（例えば、Ｓ１Ｐに対する抗体、本出願人による米国特許出願第２００７０１４８１６８号を参照。）
腫瘍の成長と生存を促進する細胞外メディエーターの同定は、癌の罹患率と死亡率を減少させるための治療介入の開発において不可欠な工程である。以下に説明するように、ＬＰＡは、多面発現性の、腫瘍原性増殖因子であると考えられている。ＬＰＡは、細胞増殖、細胞生存、転移を刺激することで、腫瘍の成長を促進させる。ＬＰＡはまた、内皮細胞が腫瘍内で新しい血管を形成するときにその移動と生存を助けることで、腫瘍の血管形成を促進する。まとめると、ＬＰＡは、癌の進行に寄与するイベントの増殖性・血管新生誘導性・抗アポトーシス性のシーケンスを開始する。したがって、インビボでＬＰＡ量を調節する、そして特に減少させる治療法は、癌の治療に有効であろう。
典型的に、癌のような増殖過剰疾患の治療または予防のための本発明による方法は、増殖過剰疾患を罹患する被験者に、有効量の本発明に従う各薬剤（または複数の異なる薬種）と細胞毒性薬剤を投与することを含む。細胞毒性薬剤とは、化学療法剤を含む。
関連する形態は、増殖過剰疾患の治療または予防のための治療手段の毒性を減少させる方法に関する。かかる方法は、増殖過剰疾患を罹患する被験者に、その増殖過剰疾患を治療または予防することを意図する治療手段の投与前、投与中、投与後に、本発明に従う薬剤（または複数の異なる薬種）の有効量を投与することを含む。細胞（例えば、癌細胞）を化学療法剤に対して感作することによって、低用量で効力が達成されるため、化学療法剤ゆえの毒性が低くなると考えられる。
さらに本発明の他の形態は、増殖過剰疾患を罹患する被験者に、被験者の生存の可能性を高めるために、その増殖過剰疾患を治療または予防することを意図する治療手段の投与前、投与中、投与後に、本発明に従う薬剤（または複数の異なる薬種）を投与することによって、増殖過剰疾患の治療を受けている被験者の生存の可能性を高める方法に関する。
３．線維症、創傷治癒、瘢痕形成
線維芽細胞、特に筋線維芽細胞は、細胞損傷と炎症に対する応答において、瘢痕形成の主要な細胞エレメントである（Ｔｏｍａｓｅｋら（２００２）、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ｖｏｌ ３： ３４９−６３、ならびにＶｉｒａｇおよびＭｕｒｒｙ(２００３）、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， ｖｏｌ １６３： ２４３３−４０）。筋線維芽細胞によるコラーゲン遺伝子発現は、リモデリングの特徴であり、瘢痕形成に必要である（ＳｕｎおよびＷｅｂｅｒ(２０００）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ， ｖｏｌ ４６： ２５０−６、ならびにＳｕｎおよびＷｅｂｅｒ(１９９６）、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ， ｖｏｌ ２８： ８５１−８）。
線維症は、正常な創傷治癒または発生とは対照的に、病的な修復または反応過程の一部として、臓器または組織における過剰または異常な線維性結合組織の形成または発生として説明できる。線維症の最もよくある形態は、肝臓、肺、腎臓、皮膚、子宮、卵巣線維症である。強皮症、サルコイドーシスなどの状態は、複数の臓器と組織における線維症とみなされる。
最近になって、生理活性リゾリン脂質である、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が組織修復と創傷治癒に役割を果たすことが認識されている。Ｗａｔｔｅｒｓｏｎら、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．(２００７）１５：６０７−１６。生体メディエーターとして、ＬＰＡは、組織修復と創傷治癒におけるその役割が認められている（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ、２００７）。特に、ＬＰＡは、肺と腎臓の炎症および線維症に関連している。ＬＰＡは、ベースラインでヒト気管支肺胞上皮洗浄（ＢＡＬ）液中に検出され、アレルギー性炎症中にその発現が増加する（Ｇｅｏｒａｓ， Ｓ．Ｎ．ら(２００７）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ．(２００７）３７： ３１１−２２）。さらに、ＬＰＡは、気道上皮細胞における炎症を促進する。Ｂａｒｅｋｚｉ， Ｅ．ら(２００６）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ． ７４：３５７−６３。最近になって、肺と腎臓の線維症が、ＬＰＡ放出の増加とＬＰＡ１型レセプター（ＬＰＡ1）を介するシグナル伝達に関連づけられている。ＩＰＦ患者からのヒト気管支肺胞上皮洗浄（ＢＡＬ）試料中では、ＬＰＡ量が上昇しており、マウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症は、ＬＰＡ1活性化に左右される。Ｔａｇｅｒら、（２００８）Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｏｃ． ５： ３６３．(２００８）。マウスにおける一側性尿管閉塞後、ＬＰＡ1ノックアウトマウスでは、尿細管間質性線維症が軽減し、線維化促進性サイトカイン発現は、ＬＰＡ1 アンタゴニストを投与した野生型マウスにおいて、減弱した。Ｊ．Ｐ． Ｐｒａｄｅｒｅら（２００７）Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １８：３１１０-３１１８。ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現と増殖を刺激することによって、心臓線維芽細胞における直接的な線維形成作用を有することが示されている。Ｃｈｅｎ， ら（２００６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０：４７３７−４５。総合すると、これらの研究は、組織修復と線維症におけるＬＰＡの役割を実証しており、生理活性脂質を、線維性疾患の治療における過去には認識されていなかったクラスのターゲットとして特定している。
ａ．強皮症
本発明による組成物と方法は、少なくとも部分的には、異常な血管新生、血管形成、線維形成、線維症、瘢痕、炎症、免疫応答によって特徴づけられる疾患および障害の治療に有効であろう。かかる疾患の１つは強皮症であり、これは全身性硬化症とも呼ばれる。
強皮症は、皮膚の瘢痕または肥厚を起因する自己免疫疾患であり、ときには、肺、心臓および／または腎臓を含む、身体の他の部分も巻き込む。強皮症は、身体の皮膚と臓器における瘢痕組織（線維症）の形成によって特徴づけられ、これは、罹患領域の肥厚と硬化を招き、その結果として機能低下に繋がる可能性がある。強皮症財団によれば、現在強皮症を罹患している米国人はおよそ３０万人に上る。罹患している人々の三分の一以下は広汎性疾患を患い、残りの三分の二は主に皮膚症状を有する。この疾患が肺に影響を及ぼして瘢痕を生じると、肺はもはやこれまで通り拡張できないために、呼吸が制限される可能性がある。呼吸能力を測定するために、医師は、努力肺活量（ＦＶＣ）を評価する装置を使用する。ＦＶＣが期待値の５０％未満の人々では、強皮症関連肺疾患による１０年死亡率はおよそ４２％である。死亡率がこれほど高い１つの理由は、現在有効な治療法がないことである。
特定の理論に縛られることを望むものではないが、Ｓ１Ｐおよび／またはＬＰＡのような脂質および／またはそれらの代謝物の不適切な濃度が、強皮症の発症の原因であるか、あるいはその発症にの一因であると考えられている。そのため、本発明による組成物と方法は、特に、特定の標的となる脂質（例えば、ＬＰＡ）の有効インビボ濃度を低下させることにより、強皮症の治療に使用することができる。
ＬＰＡは、線維芽細胞の活性化、増殖の一因となり得る線維化促進性増殖因子であり、その結果としての線維芽細胞活性の増加が、不適応な瘢痕とリモデリングに関連していたことが立証されている。さらに、皮膚の線維芽細胞活性においてＬＰＡが果たし得る役割が実証されている。例えば、ＬＰＡがマウス皮膚線維芽細胞の移動を刺激することが示されている（Ｈａｍａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００４ Ａｐｒ ２３、２７９（１７）：１７６３４−９）。
ｂ．肺線維症
しばしば間質性肺疾患（ＩＬＤ）と呼ばれる肺線維症は、全世界で５００万人以上の人々が罹患している。米国におけるこの疾患の有病率は、実際よりも低く見積もられているが、１０万人当たり３〜６症例から、１０万人当たり２８症例とばらつきがあるようである。欧州では、国によってこの数は異なり、明確な性差はなく、およそ１０万人当たり１〜２４症例と報告されている。この疾患は通常、４０歳〜７０歳で診断される。生存期間中央値は、３〜５年である。その有病率にも係わらず、ＩＰＦの進行を停止または逆行させるために利用可能な治療法はなく、ＦＤＡの承認を受けた治療コースもない。したがって、ＩＰＦならびに病的な組織線維症を伴うその他の疾患を治療するための新しい治療戦略について未だ満たされていないニーズがある。
間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、１８０以上の慢性肺疾患を含み、それらは慢性で、非悪性かつ非感染性である。間質性肺疾患は、間質と呼ばれる肺の気嚢の間にある組織―線維症に冒される組織（瘢痕）―にちなんで名付けられた。間質性肺疾患はまた、間質性肺線維症または肺線維症とも呼ばれることがある。これらの疾患の症状と経過は人によって異なるが、ＩＬＤの多くの型の共通点は、それらの全てが炎症、例えば、細気管支炎−気管支梢（小気道）を巻き込む炎症、肺胞炎−肺胞（気嚢）を巻き込む炎症、血管炎−小血管（毛細管）を巻き込む炎症から始まることである。
８０％以上の間質性肺疾患は、塵肺、または薬剤性疾患、または過敏性肺炎と診断される。その他のタイプは以下に示す。
職業・環境曝露：特に石綿、澱石、金属粉塵を扱う多くの仕事は、肺線維症を起因することがある。小粒子が吸入され、肺胞を損傷し、線維症を起因する。黴びた干し草のような有機物質の一部は肺線維症を惹起することもあり、これは農夫肺として公知である。
石綿症は、通常は、石綿の小さな針様粒子が肺に吸入されたときに生じる。これは、肺の瘢痕（肺線維症）を起因し、さらに肺癌に至る可能性がある。石綿症の鍵は、予防である。石綿製品の製造においては、雇用主と雇用人双方が、政府の基準を認識し、この粒子の吸入に対して全ての予防策を講じるべきである。石綿の扱いにおいて最たる危険は、古く、脆い（砕けやすい）石綿含有製品を交換したり壊したりするときに生じる。そのような状況では、粒子が空気中に放出され、肺中に吸い込まれる。しかしながら今日、石綿繊維は通常、セメント、ゴム、プラスチックのような成形剤によって「封じ込め」られているために、その粒子が自由に空気中に浮遊しないようになっている。タバコの喫煙は、石綿との相互作用関係を有し、喫煙する石綿作業員は、非喫煙者よりも肺癌を発症する確率が遙かに高い。
ケイ肺症は、肺線維症を生じるもう１つの疾患であり、その原因は明らかとなっている。この疾患は、浮遊している結晶性シリカ粉塵を吸い込むことに起因する。鉱石を石英岩から抽出する全タイプの鉱業は、予防策を講じていない場合、ケイ肺症を引き起こす可能性がある。これは、金、鉛、亜鉛、銅、鉄、無煙（硬）炭、いくつかの瀝青（軟）炭についての鉱業を含む。鋳物工場、砂岩粉砕、トンネル堀、サンドブラスト（砂吹き）、コンクリート破砕、御影石彫刻、陶磁器製造に従事する作業者もシリカに接する。
大きなシリカ粒子は、上気道で停止される。しかしながら、シリカの極小片は肺胞まで運ばれて、そこで肺線維症を誘因する。ケイ肺症は、空気中のシリカの割合と濃度ならびに曝露期間に正比例して、軽症であったり重症であったりする。ケイ肺症は、各産業および各職種で立案された施策によって防止できる。塵埃コントロールが不可欠である。ときには、これは、鉱床を湿潤させたり、換気を改善したり、マスクを着用することによって達成される。
(特発性肺線維症）
多数の異なる疾患が肺線維症を引き起こし得るが、多くの場合、その原因は不明である。そのような場合、この状態は、「特発性（原因不明の）肺線維症」と呼ばれる。特発性肺線維症では、患者の環境および職業歴を注意深く考査しても原因についての手がかりが得られない。医師と科学者の中には、この疾患を感染性またはアレルギー性の状態とする者もいるが、かかる患者の肺には、細菌およびその他の微生物が常に発見されるわけではない。他方、この状態は確かに、ウィルス様疾病を辿るように見えることもある。したがって、多くの症例における肺線維症の原因は知られているにも係わらず、特発性の変種については未だ謎のままである。
サルコイドーシスは、身体のどの領域も攻撃できるが、ほとんどの場合は肺を冒す、肉芽腫（炎症細胞の部分）の形成によって特徴づけられる。
ある種の医薬品は、肺線維症を発症する望ましくない副作用を有し、その例は、ニトロフラントイン（尿路感染症治療薬としてよく使用される）、アミオダロン（不整脈の治療薬としてよく処方される）、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート（癌の治療薬としてよく処方される）である。
乳癌治療としての放射線療法もまた、肺線維症を発症する可能性がある。少なくとも部分的には、肺線維症によって特徴づけられるその他の疾患は、肺結核、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、穀物作業者肺、キノコ栽培者肺、サトウキビ肺、洗剤作業者肺、カエデ樹皮剥き肺、麦芽労働者肺、パプリカ裂作業者肺、愛鳥家肺、ヘルマンスキー・プドラック症候群を含む。肺線維症はまた、遺伝的に受け継がれる。
（臨床的特徴）
息切れは、肺線維症の特徴である。多くの肺疾患では、息切れがその主要な症状として認められるが、それ故に診断が複雑かつ分かりにくくなる。一般的に、特発性肺線維症では、まず運動中に息切れが生じる。この状態は、労作が不可能な時点まで進行し得る。乾性咳が、よくある症状である。最後には指先が肥大して、球状の外観を呈する。これはしばしば、「ばち状指」と呼ばれる。
その他の症状は以下を含み得る。特に、労作、疲労、脱力感を伴う息切れ、食欲不振、体重の減少、痰を伴わない乾性の咳、胸部不快感、呼吸困難、肺出血。
（診断）
総合的既往歴ならびに健康診断に加えて、肺線維症の診断を絞り込み、および／または確定するには、以下の検査が必要なことがある。肺機能検査−肺の特徴と容量を測定する、肺活量測定−強制呼気量を測定する、ピークフローメーター−呼吸の変化と医薬品に対する反応を評価する、血液検査−血液中の二酸化炭素と酸素の量を分析する、Ｘ線検査、コンピューター断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、気管支鏡検査−気管支鏡と呼ばれる長く細いチューブを使って肺を検査する、気管支肺胞洗浄−炎症を特定し、特定の原因を除外するために、下気道から細胞を除去する、肺生検−病理臨床検査のために肺から組織を除去する。
(治療)
肺線維症の公知の原因のうち１つがある場合、その基礎疾患の治療またはその疾患の原因となる環境から患者を排除することは、有効であり得る。これは、以下による治療を含み得る。副腎皮質ステロイドを含む経口薬物療法、インフルエンザワクチン、肺炎球菌性肺炎ワクチン、ポータブルタンクを使う酸素療法および／または肺移植。
多くの場合、治療は、肺に発生する免疫応答の治療に限られる。これは、炎症を止めることによって、肺の中に瘢痕組織や線維症が根付くことを防止することで、この疾患の進行を止めることを期待して行われる。
副腎皮質ステロイドは、通常は炎症を止めるために投与される薬である。この治療の利点は全ての症例において実証されているわけではないが、この薬が疾患過程の早期に投与される場合は、改善の可能性が高いと思われる。副腎皮質ステロイド薬物療法は様々な副作用を生じ得るため、これらの薬物療法を受けている患者は、この療法の安全性と利点を判断するために、担当医師によって頻繁に再評価されなければならない。
その他の薬も試みられているが、それらの効力を納得させるようなエビデンスは欠如している。肺線維症の薬物療法は必ずしも成功するとは限らないが、この状態に伴う息切れを緩和する支持療法という形でできることは多くある。リハビリテーションと教育プログラムは、より効果的な呼吸法、ならびに息切れを少なくするような日常活動を行う方法を患者に教えることで大きく役立ち得る。時には、息切れを治療するために、酸素補給療法が必要とされる。胸部感染症の早期治療が必要とされる。タバコの影響は息切れを悪化させるため、喫煙は止めなければならない。
転帰
多くの場合、この疾患はほとんど症状を伴わず、軽症であり、長い間著しい進行は見られない。その他の場合、つまり肺線維症が関節リウマチのようなその他の基礎疾患に起因する場合、肺の状態の進行は、基礎疾患の進行を反映する可能性がある。極めて稀に、肺線維症は、突然発症し急速に進行して、数週間呼吸不全になって死に至る。しかしながら、肺線維症、特に特発性肺線維症の通常の経過は、ゆっくり進行する肺の瘢痕形成の１つである。このプロセスの持続期間と速度は不定である。ある患者は治療に応答する。その他の場合、患者は治療に応答せず、数ヶ月から数年の間にゆっくりと増悪し、肺がもはや十分に機能できなくなったときに、結局は死に至る。
(ＬＰＡと肺線維症)
正確な病因は不明であるが、ＩＰＦは、肺損傷後の異常な創傷治癒に起因すると考えられている。Ｓｃｏｔｔｏｎ， Ｃ．Ｊ．およびＣｈａｍｂｅｒｓ， Ｒ．Ｃ．(２００７）Ｃｈｅｓｔ， １３２：１３１１−２１。特に、肺線維芽細胞の増殖と移動の増加、ならびに瘢痕組織を形成する筋線維芽細胞の形成は、ＩＰＦ発病の主要なイベントである。筋線維芽細胞は、α平滑筋アクチン（a−ＳＭＡ）を発現する平滑筋様線維芽細胞であり、アクチンフィラメントと顕著なストレスファイバーに器質化する関連タンパク質から構成される収縮装置を含んでいる。組織ホメオスタシスと修復におけるこれらの通常の役割に加えて、筋線維芽細胞は数多くの線維性疾患における病態メディエーターである。Ｈｉｎｚ， Ｂ．(２００７）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １２７：５２６−３７。肺線維症の動物モデルの線維性病巣において、筋線維芽細胞数とその密度の増加が認められている。筋線維芽細胞は組織損傷後に形成され、それによって増加した増殖因子、サイトカイン、機械的刺激の量が、常在する組織の線維芽細胞が収縮性の瘢痕組織を形成する筋線維芽細胞に変換することを促進する。肺とその他の組織において、ＴＧＦβ、ＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、種々の炎症性サイトカインを含む生化学的メディエーター量の持続的な上昇は、筋線維芽細胞の形成を促進し、瘢痕組織の形成を悪化させて、組織線維症に至らしめる（Ｓｃｏｔｔｏｎ、２００７）。したがって、ＩＰＦおよびその他の線維性疾患治療のための現在の臨床戦略は、筋線維芽細胞形成とそれに続く線維性組織の形成を促進する、生化学的因子を標的としている。
最近になって、生理活性リゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の、組織修復と創傷治癒におけるその役割が認識されている（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ、２００７）。ＬＰＡは、１つの炭化水素主鎖と、１つのリン酸基を含む１つの極性頭基を有する、生理活性リゾリン脂質（５００ダルトン未満）である。ＬＰＡは、ＥＧＤ２／ＬＰＡ1、ＥＤＧ４／ＬＰＡ2、ＥＤＧ７／ＬＰＡ3、ＬＰＡ4と呼ばれる特定のＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）との相互作用を介して、数々の細胞効果を惹起する。Ａｎｌｉｋｅｒ Ｂ．およびＪ． Ｃｈｕｎ，(２００４）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（細胞および発生生物学に関するセミナー）， １５： ４５７−４６５。生物学的メディエーターとして、ＬＰＡは、組織修復と創傷治癒に関与することが認められている（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ、２００７）。特に、ＬＰＡは、肺と腎臓の炎症および線維症に関連している。ＬＰＡは、ベースラインにおけるヒト気管支肺胞上皮洗浄（ＢＡＬ）液中に検出され、アレルギー性炎症中にその発現が増加する（Ｇｅｏｒａｓ、２００７）。さらに、ＬＰＡは、気道上皮細胞における炎症を促進する（Ｂａｒｅｋｚｉ、２００６）。最近になって、肺と腎臓の線維症が、ＬＰＡ放出ならびにＬＰＡ１型レセプター（ＬＰＡ1）を介するシグナル伝達に関連づけられている。ＩＰＦ患者からのヒト気管支肺胞上皮洗浄（ＢＡＬ）試料中では、ＬＰＡ量が上昇しており、マウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症はＬＰＡ1活性化に依存していた(Ｔａｇｅｒ、２００８）。マウスにおける一側性尿管閉塞後、ＬＰＡ1ノックアウトマウスでは尿細管間質性線維症が軽減し、線維化促進性サイトカイン発現は、ＬＰＡ1 アンタゴニストを投与した野生型マウスにおいて、減弱した（Ｐｒａｄｅｒｅ、２００７）。総合すると、これらの研究は、組織修復と線維症におけるＬＰＡの役割を立証しており、生理活性脂質を、ＩＰＦならびにその他の線維性疾患の治療における過去には認識されていなかったクラスのターゲットとして特定している。
ｃ．肝（肝臓）線維症
肝臓は、優れた再生能力を有しているため、再生による修復プロセスは、 ｒｅｓｔｉｔｕｔｉｏ ａｄ ｉｎｔｅｇｒｕｍ（完全回復）するように進行する。しかしながら、もし損傷が網状構造に影響を及ぼす場合、修復は瘢痕形成（線維症）によって生じ、これは血液循環の再編成と肝硬変に繋がり得る。
損傷に対する反応は、以下のように進行する。細胞の変化および組織の変化を伴う損傷（壊死）、炎症反応、修復（再生（原状回復）あるいは瘢痕（線維症）のいずれかによる）。
慢性肝疾患は、構造の撹乱である門脈高血圧症に至る線維症を誘因し、血液循環に不可逆的な再編成を生じて、肝硬変を起因し得る。線維症と肝硬変は紙一重である。線維症は、壊死、崩壊、瘢痕形成のみならず、肝臓においては、以下のカテゴリー、即ち、コラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンであるマトリックスの様々な成分を合成する間葉細胞が損傷を受けたことによる、マトリックスの合成と分解の撹乱の結果、生じる。
（肝線維症の診断）
肝線維症は、例えば、マッソントリクローム染色、鍍銀法、コラーゲン型に対する特異抗体、脂質細胞のデスミンとビメンチン染色、あるいは筋線維芽細胞のビメンチン染色のような組織学的方法、または、例えば、マトリックス中の種々の酵素あるいは良性線維症における血清ラミニンの測定による、生化学的方法によって診断し得る。
（肝線維症の分類）
肝線維症には、先天性および後天性の２つの主要な型がある。前者は遺伝疾患であり、多嚢胞性肝疾患を起因する。後者には多数の異なるカテゴリーがあり、主として肝細胞の損傷に起因する。病理学的には、線維症は以下のように分類できる。
（門脈領域線維症）
門脈領域から小葉に、線維芽細胞が増殖し、線維の伸展を生じる。結局は、これらの線維は連絡して橋架様隔壁を形成する。この種の線維症は、主として、ウィルス性肝炎および低栄養性肝線維症に見られる。
（小葉内線維症）
正常な小葉には線維芽細胞はほとんど見られない。多数の肝細胞が変性したり壊死を生じる場合、網状線維の枠組みが崩壊して、太いコラーゲン線維になる。同時に、小葉内線維性組織が増殖して、肝細胞を取り囲む。
中央線維症：増殖した線維化組織は、主として中心静脈を取り囲み、中心静脈壁の肥厚を生じる。
（微小胆管周囲の線維症）
この種の線維症は、主として、長期にわたる胆管貯留に起因し、主として、胆管周囲に発症する。顕微鏡的には、新しく形成された毛細胆管と胆管栓塞を取り囲む結合組織がある。毛細胆管の基底膜が線維化する。
免疫学的には、肝線維症は、以下のように分類できる。
（受動的線維症）
肝細胞の広範な壊死および副次的な肝構造の崩壊と瘢痕形成が生じ、それが結合組織の増殖を起因する。
（能動的線維症）
リンパ細胞およびその他の炎症細胞の浸潤および再発・一貫性炎症は、結合組織の小葉への浸潤を促進する。原因により、肝線維症は以下のように分類できる。
（ウィルス肝炎による線維症）
ウィルス肝炎による線維症は、通常は、Ｂ、Ｃ、Ｄ型慢性肝炎によって発症する。全世界で、Ｂ型肝炎保菌者は３．５億人に上り、１．７億人の人々がＣ型肝炎に感染している。Ｂ型肝炎患者の約１５％ならびにＣ型肝炎患者の約８５％が慢性肝炎を発症し、線維症に至る。そのような場合、肝臓は、門脈周辺領域に炎症と漸次壊死ならびに線維化を呈する。そのような多数の人口集団が罹患しているため、これは肝線維症の最も重要なカテゴリーである。
（寄生虫感染症による線維症）
この種の肝線維症は、主として、開発途上国で発症し、住血吸虫症に起因する。アジア、アフリカ、南米、中南米では２．２億人が、この感染症を罹患している。再感染と住血吸虫の卵が肝臓に蓄積して、肝線維症と肝硬変を引き起こす。
（アルコール性線維症）
これは主として、アルコールの酸化代謝物であるアセトアルデヒドに起因する。西欧諸国では、この疾患の発生率は、アルコール摂取量と正比例している。米国におけるアルコール性線維症の総症例数は、Ｃ型肝炎患者数の約３倍である。アルコール性線維症は、肝臓に以下の２つの形態学的変化を生じる。脂肪肝と細胞小器官の劣化。線維症は、まず中心静脈周辺に発症し、同時に肝実質細胞の炎症を起こす。徐々に線維症は、肝臓全体に広がる。
（胆管線維症）
胆管線維症には、原発性のものと二次性のものがある。原発性胆汁性肝線維症（ＰＢＨＦ）は、慢性肝臓内胆汁貯留が肝線維症を起因する、自己免疫疾患である。この疾患は、４０〜６０歳の女性に多く発症する。血清検査では、γグロブリン値が上昇し、抗ミトコンドリア抗体に陽性を示す。病理学的研究によって、主として、微小胆管周囲の線維症と門脈周辺領域の線維症ならびに炎症があることが判明した。二次性胆管線維症は、胆管閉塞後に発症し、門脈周囲領域の炎症と進行性線維症を起因する。
（代謝性線維症）
このカテゴリーは一般的ではなく、稀に見られる症例である。ウィルソン病や肝レンズ核変性およびヘモクロマトーシス（血色素症）は、代謝性線維症を起因する主な疾患である。前者は遺伝病であり、銅代謝障害と肝臓沈着を起因する。後者は、鉄代謝障害であり、肝臓にヘモグロビン沈着を起因する。これらの代謝障害のどちらも、肝線維症と肝硬変を起因する。
（中毒性線維症）
四塩化炭素、有機リン、ジメチルニトロソアミン、チオアセトアミドなどの肝臓毒性物質と長期間接触したり、イソニアジド、チオ酸化ピリミジン、ウインタミン、テトラサイクリン、アセトアミノフェンなどの肝臓毒性のある医薬品を服用することは、いずれの場合も異なる度合いの肝細胞損傷、壊死、胆管貯留、またはアレルギー性炎症を生じたり、肝線維症を起因する。
（低栄養性線維症）
この種の線維症は、主として、不十分またはバランスを欠く栄養摂取によって生じる。長期にわたる低タンパク質または高脂質食は、脂肪肝を起因し、線維症に至る。
心原性線維症：慢性鬱血性心不全は、肝細胞の虚血性変性を起因する、長期間持続する肝静脈鬱血を生じ得る。この種の肝線維症では、結合組織の肥大が、肝臓小葉の中央部から始まり、徐々に小葉の残りの部分に拡大する。
肝線維症の診断および病期決定
肝臓の健康を評価するための最も基準となる検査は、肝生検である。しかしながら、この方法は、皮膚に針を挿入する必要があるため、合併症の発生率は極めて低いとはいえ、合併症の可能性がある。肝生検の合併症は、内出血、ならびに肺、胃、腸、肝臓に近いその他の臓器などの他の臓器を穿刺することを含み得る。生検の正確性に関しては、正しく病期を決定し、肝生検をグレード付けするために、肝臓組織の標本サイズが重要である。その他の問題は、肝臓の一部から採取された組織は、肝臓全体を１００％代表するわけではないということである。いったん肝臓組織試料が採取されると、専門家（病理学者）によって、グレード付けされ、病期が決定されるが、これは結果の解釈においてヒューマンエラーが生じる可能性に繋がる。さらに、標準化された解釈のプロトコルがないため、別の病理学者によって読解された別の生検結果と比較することが困難である。標準的な肝生検の費用は、１，５００〜２，０００ドルかかることがあるため、費用も１つの問題である。
これらの生じ得る問題からして、非侵襲性検査の開発のために多大な研究が実施されていることは驚くに足りない。これまでに開発された検査は、肝生検の結果と比較する場合、正確性に関しては種々異なる結果が得られている。種々の非侵襲性マーカーからの結果を、肝生検の結果と比較する、前向き臨床試験はほとんど実施されていない。
線維症の病期を客観的に評価するためには、肝生検、特に一連の生検が今日使用されている主要な方法である。生検から、肝臓炎症のグレードならびに線維症の病期を診断することが可能である。最も頻繁に使用されるスコアシステムは、カーネルスコアシステムであり、これは線維症を０〜５の病期に分ける（同時に、この生検診断はまた、炎症グレードを０〜４に分類する）。０期：正常、１期：門脈域の線維症拡大（３分の１未満の血路が小束の橋架を伴う）、２期：架橋形成線維症、３期：顕著な架橋形成線維症または初期肝硬変（薄い隔壁線維症を伴う）、４期：５０％未満の生検が線維症である明確な肝硬変、５期：５０％以上の生検が線維症である明確な肝硬変。
肝線維症診断用血液検査：生検は侵襲性手技であるため、多くの患者は、この手技に関しては慎重である。線維症の進行を評価するための方法として、血液検査が研究されている。最も頻繁に使用されている血清化学分析法では、血清中のＨＡ（ヒアルロン酸）、ＬＮ（ラミニン）、ＣIV（IV型コラーゲン）、ＰＣIII（III型プロコラーゲン）の量を測定する。これらは、線維症活性度の指標として使用できる。血液検査から、ＡＳＴ／ＡＬＴ比が得られ、この値が１以上の場合、線維症の度合いが比較的進行していることがしばしば示されている。脾臓の肥大、血小板数とアルブミン濃度の低下があるかどうかと組み合わせて、線維症の病期を推定することも可能である。進行線維症では、脾臓は通常肥大しており、血小板数が１００を下回りでアルブミンは３．５を下回る。血液検査の結果で行えることは、線維症の重症度の診断を、０、１期ならびに３、４、５期に評価することのみである。２期と３期を区別することはできない。
Ｂ−超音波、ＣＴ、ＭＲＩなどの医療画像診断もまた、肝線維症診断のために使用できる。Ｂ−超音波画像は、脾臓の大きさを調べ、門脈の主要尾部の直径、左右門脈枝の直径、脾臓の門戸での静脈直径、門脈の血流速度を測定するためにしばしば使用される。ＧＩ内視鏡検査は、胃と食道に静脈瘤があるかどうかを調べるために使用できる。これらは、肝臓医が、線維症の病期を診断するための参考として使用できる。
一般的に、線維症という用語は、線維性（瘢痕）組織の異常な形成を意味する。肝炎患者では、線維症は、肝臓がしばらくの間、肝炎による攻撃下にある状態を意味する。線維症の初期は、肝臓の１つの門戸（ゾーン）における、別々の局在化した瘢痕領域によって同定される。線維症後期は、肝臓のゾーンを横断する瘢痕組織である、「架橋形成」線維症によって同定される。炎症から線維症に進行し、最終的に肝硬変に至る比率は一様ではなく、非常に多様であるが、ほとんどの人ではその進行は極めて遅い。ＨＣＶ感染に対するインターフェロン療法に応答する人は、組織瘢痕の量が減少する可能性があるというかなりのまとまったエビデンスがある。このことは、肝臓の再生能力を物語っている。線維症がかなり進行した状態は、肝硬変と呼ばれる。肝生検は、炎症の度合い（グレード）と瘢痕の度合い（病期）を評価するために実施される。
（診断）
肝臓学界と胃腸病学界が直面する主要な臨床上の問題の１つは、益々その数が増加している、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）が同定された患者に対する最良の診断・管理法である。過去１０年間における、ＨＣＶについての血清学的およびウィルス学的検査の進歩ならびに治療法の向上によって、より多くの患者が同定されて、治療を求めるようになった。しかしながら、肝臓損傷、特に線維症の度合いを判定したり、個々の患者について疾患進行のリスクを予見する能力を向上する能力の進歩はほとんど達成されていない。
臨床医は、患者の生命に大きなインパクトを持ち得る、予後かつ治療法についての判断については、生検結果に依拠している。シングルパス方式の肝生検は、８０％の患者において、線維症の病期または肝硬変の有無を正しく診断することができる。肝生検の診断の正確性を向上する要素は、ＨＣＶのように肝臓全体に渡る均一な疾患の存在、複数のパス、使用される生検針タイプ、長さが２ｃｍ以上のフラグメント化しない生検コアを含む。経験豊富な医師が肝生検を行い、専門の病理医が生検を解読しても、この最も基準となる検査法では、病期決定に２０％以上のエラーを伴う。
ｄ．腎（腎臓）線維症
ＬＰＡは、腎臓炎症と線維症に関連している。最近になって、腎臓の線維症は、ＬＰＡ放出の増加とＬＰＡ１型レセプター（ＬＰＡ1）を介するシグナル伝達に関連づけられている。マウスにおける一側性尿管閉塞後、ＬＰＡ1ノックアウトマウスでは尿細管間質性線維症が軽減し、線維化促進性サイトカイン発現は、ＬＰＡ1 アンタゴニストを投与した野生型マウスにおいて減弱した（Ｐｒａｄｅｒｅ、２００７）。
ｅ．その他の線維症
子宮線維症は、子宮平滑筋腫（一般的に筋腫と呼ばれる）として公知の非悪性腫瘍である。この腫瘍は、孤立または群発し、リンゴの種のサイズから、グレープフルーツよりも大きなサイズまで、多様なサイズで生じる。子宮筋腫の診断は、一般的には、超音波検査、Ｘ線検査、ＣＡＴスキャン、腹腔鏡検査および／または子宮鏡検査によって達成される。子宮筋腫の治療は、内科的（薬物治療、例えば、非ステロイドケイ抗炎症剤またはゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト）または外科的（例えば、筋腫切除術、子宮摘出術、子宮内膜切除または筋融解）のいずれかであり、子宮筋腫塞栓術や熱超音波焼灼術のような侵襲性の少ない方法も最近になって開発されている。
皮膚線維症は、皮膚の肥厚または硬化として説明でき、強皮症ならびにその他の線維化性皮膚疾患において発症する。重症の場合、線維症は、運動や正常機能を制限することがある。ケロイドは、外傷、ときには耳のピアス形成やニキビのような軽い外傷への応答において形成される過剰な瘢痕である。正常な瘢痕形成とは異なり、ケロイドは、線維芽細胞の不釣合な増殖を有し、コラーゲン性組織の塊を生じる。それゆえ、この瘢痕は、周囲の皮膚表面へ突出し、当初外傷を受けていなかった皮膚にも浸潤する。皮膚の線維芽細胞活性においてＬＰＡが役割を果たすことが実証されている。例えば、ＬＰＡがマウス皮膚線維芽細胞の移動を刺激することが示されている（Ｈａｍａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００４ Ａｐｒ ２３、２７９（１７）：１７６３４−９）。したがって、抗体のような抗ＬＰＡ薬剤は、ケロイドや皮膚線維症のような異常な皮膚線維症の治療に有効である。
心筋線維症
ＬＰＡはまた、コラーゲン遺伝子発現と線維芽細胞の増殖を刺激することによって、心臓の線維芽細胞において直接的な線維形成作用を有することが示されている。Ｃｈｅｎ， ら（２００６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０：４７３７−４５。したがって、抗体のような抗ＬＰＡ薬剤は、心臓細胞においても同様に抗線維化作用を有することが予測され、したがって、心筋線維症の治療に有効であることが期待される。
Ｌｐａｔｈ社の抗ＬＰＡモノクローナル抗体のような、ＬＰＡの有効濃度を低下させる薬剤は、異常な線維症によって特徴づけられる疾患と状態を治療する方法において有用であると考えられる。
４．心血管系および脳血管系障害
ＬＰＡは、肝臓組織の線維形成と創傷治癒（Ｄａｖａｉｌｌｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３４２６８−３４６３３、２０００、 Ｉｋｅｄａら、Ａｍ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ． Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７９：Ｇ３０４−Ｇ３１０， ２０００）、傷ついた脈管構造の治癒（Ｌｅｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７８：Ｃ６１２−Ｃ６１８、２０００）、その他の疾患状態、または癌のような疾患・血管形成・炎症に関連するイベント（Ｐｙｎｅら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３４９：３８５−４０２、２０００）に関与するため、本開示による組成物と方法は、これらの疾患のみならず、心臓疾患、特に組織リモデリングに関連する疾患の治療にも同様に適用し得る。ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現と心臓線維芽細胞の増殖を刺激することによって、ある程度直接的な線維形成効果を有する。Ｃｈｅｎ， ら（２００６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５８０：４７３７−４５。
５．肥満症と糖尿病
ＬＰＡ合成を担うホスホリパーゼＤであるオートタキシンは、脂肪細胞によって分泌され、肥満症・糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス由来の脂肪細胞、ならびに極度に肥満な女性被験者と２型糖尿病を罹患するヒト患者（肥満とは無関係に）においてその発現が増加していることが発見されている（Ｆｅｒｒｙ ら(２００３）ＪＢＣ ２７８：１８１６２−１８１６９、 Ｂｏｕｃｈｅｒら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４８：５６９−５７７、Ｐｒａｄｅｒｅら（２００７）ＢＢＡ １７７１：９３−１０２に引用されている）。ＬＰＡ自体が、前脂肪細胞の増殖と分化に影響を及ぼすことが示されている。Ｐｒａｄｅｒｅら、２００７． 合わせて、これは、肥満症と糖尿病の治療における抗ＬＰＡ薬剤の役割を示唆しているる。
３．抗体の生成とキャラクテリゼーション
下記の実施例は、治療の観点から望ましい特性を有する、抗ＬＰＡ薬剤、特に抗ＬＰＡ抗体の生成を説明する。（ａ）ＬＰＡおよび／または１８：２、１８：１、１８：０、１６：０、１２：０、２０：４ ＬＰＡを含むその変異体に対する結合親和性。抗体親和性は、下記の実施例において説明するように測定される。抗体は、高親和性でＬＰＡに結合することが好ましく、例えば、Ｋd値が、決して約１ ｘ １０-7 Ｍを超えない、可能であれば、１ ｘ １０-8 Ｍを超えない、５ ｘ １０-9 Ｍを超えないこと。生理学的状況においては、抗体は、ＬＰＡレセプターに対するＬＰＡの親和性よりもさらに高い親和性でＬＰＡを結合することが好ましい。言うまでもなく、診断検査法のような非生理学的状況においては、必ずしもこうである必要はない。
ＬＰＡに対する強い結合親和性を有する抗体の他に、治療上の観点からその他の有益な特性を有する、キメラ抗体、ヒト化抗体、変異体抗体を選択することも望ましい。例えば、抗体は、瘢痕形成を減少させたり、あるいは腫瘍の進行を改変するものであり得る。本発明による抗ＬＰＡ抗体の活性を測定するための１つのアッセイは、ＥＬＩＳＡである。ヒト患者に抗体の治療有効量を投与した際に、免疫原性応答を惹起しないヒト化抗体または変異体抗体が好ましい。免疫原性応答が惹起されるにしても、抗体が、それで治療を受けた患者に治療効果を与えるような応答が好ましい。
本発明の１つの実施態様に従って、ヒト化抗ＬＰＡ抗体は、本明細書に定義するようなエピトープを結合する。関心対象の抗体によって結合されるＬＰＡ上のエピトープに結合する抗体（例えば、ＬＰＡに対する抗体の結合をブロックするもの）を選別するために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体、実験マニュアル）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ(１９８８）に記載のような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。あるいは、抗体が関心対象のエピトープを結合するかどうかを判定するために、例えば、Ｃｈａｍｐｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１３８８−１３９４(１９９５）に説明されるようなエピトープマッピングを行うことができる。
本発明による抗体は、以下の式に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する。ＦＲ１−ＣＤＲＨ１−ＦＲ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲ４。式中、「ＦＲ１−４」は、４つのフレームワーク領域、そして「ＣＤＲＨ１−３」は抗ＬＰＡ抗体の重鎖可変ドメインの３つの超可変領域を表す。ＦＲ１−４は、コンセンサス配列（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の１つのクラス、サブクラス、サブグループの最も共通するアミノ酸）に由来するか、個々のヒト抗体フレームワーク領域または異なるフレームワーク領域配列の組み合わせに由来し得る。多くのヒト抗体フレームワーク領域配列は、例えば、Ｋａｂａｔら、前出に編集されている。１つの実施態様では、重鎖可変ＦＲが、Ｋａｂａｔら、前出にデータがまとめられているように、ヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列によって提供される。
このヒト重鎖可変ＦＲ配列は、その中に、例えば、ヒトＦＲ残基が対応する非ヒト残基によって置換されている（「対応する非ヒト残基」とは、ヒトと非ヒト配列を整列したとき、関心対象のヒト残基と同じＫａｂａｔの位置番号を有する非ヒト残基を意味する）ような置換を有してもよいが、非ヒト残基による置換は必須ではない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換ＦＲ残基は、ファージディスプレイによって選択され得る。
本明細書の好ましい実施態様の抗体は、以下の式に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。ＦＲ１−ＣＤＲＬ１−ＦＲ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲ４。式中、「ＦＲ１−４」は、４つのフレームワーク領域、そして「ＣＤＲＬ１−３」は、抗ＬＰＡ抗体の軽鎖可変ドメインの３つの超可変領域を表す。ＦＲ１−４は、コンセンサス配列（例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の１つのクラス、サブクラス、サブグループの最も共通するアミノ酸）に由来するか、個々のヒト抗体フレームワーク領域または異なるフレームワーク領域配列の組み合わせに由来し得る。１つの好ましい実施態様では、軽鎖可変ＦＲが、Ｋａｂａｔら、前出にデータがまとめられているように、ヒト免疫グロブリンサブグループのコンセンサス配列によって提供される。
ヒト軽鎖可変ＦＲ配列は、その中に、例えば、ヒトＦＲ残基が、対応するマウス残基によって置換されているような置換を有していてもよいが、非ヒト残基による置換は必須ではない。例えば、対応する非ヒト残基以外の置換残基は、ファージディスプレイによって選択され得る。本明細書に記載する関心対象のヒト化抗ＬＰＡ抗体を生成する方法を、以下に詳細に述べる。
ａ．抗体の調製
抗ＬＰＡ抗体および抗ＬＰＡ抗体の変異体を生成する方法が、以下の実施例で説明される。ヒト化抗ＬＰＡ抗体は、非ヒト抗ＬＰＡ抗体に基づいて、調製し得る。完全ヒト抗体はまた、例えば、遺伝子改変（即ち、トランスジェニック）マウス（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ社から）において、免疫原を提示したときに、必ずしもＣＤＦ移植を必要としない、ヒト抗体を生成することができる。これらの抗体は、非ヒト抗体遺伝子が抑制されて、ヒト抗体遺伝子発現で置換されているマウスのような動物に由来する完全ヒト抗体（１００％ヒトのタンパク質配列）である。本出願人は、該当するＣＤＲのヒトフレームワークを生成できるようなこのような遺伝子改変マウスやその他の動物に提示したときに、生理活性脂質に対する抗体を生成できると考える。
変異体を生成する場合は、親抗体を調製する。かかる非ヒト抗体および親抗体を生成するための代表的な技術を以下の項に説明する。
（i）抗原の調製
抗体の生成に使用される抗原は、例えば、インタクトなＬＰＡまたはＬＰＡの一部（例えば、エピトープを含むＬＰＡフラグメント）であり得る。抗体を生成するために役に立つ抗原のその他の形態は、当業者には明らかであろう。
（ii）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、該当する抗原とアジュバンドの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって、動物（哺乳類、鳥類、軟骨魚を含む魚類を含む脊椎動物または無脊椎動物）において惹起することが好ましい。該当する抗原を、免疫される種において免疫原であるタンパク質またはその他の担体、例えば、キーホールインペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、大豆トリプシン阻害剤に、二機能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステル（システイン残基を介してコンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、 ＳＯＣｌ2または、Ｒ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでＲとＲ1は異なるアルキル基）、を用いてコンジュゲートさせることが有用であり得る。非タンパク質担体（例えば、コロイド金）も、抗体生成のために、当該分野に公知である。
動物は、抗原、免疫原性コンジュゲート、誘導体に対して、例えば、１００mｇまたは５mｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスに）を３容積のフロイント完全アジュバントと混合して、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、免疫される。１ヵ月後に、当初の量の１／５〜１／１０の量のペプチドまたはフロイント完全アジュバントを、複数部位に皮下注射することによって、動物を追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血して、抗体価について血清を定量する。動物は、抗体価がプラトーになるまで追加免疫を受ける。同一抗原であるが、別のタンパク質および／または異なる交差試薬にコンジュゲートされているコンジュゲートで動物を追加免疫することが好ましい。また、コンジュゲートは、タンパク質融合のような、組み換え細胞培養で調製することができる。さらに、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答の増強を目的とする用途に適する。
（iii）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５(１９７５）が最初に説明したハイブリドーマ法を用いて作成するか、組み換えＤＮＡ法のようなその他の方法によって作成し得る（米国特許第４，８１６，５６７号）。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の好適な宿主動物（ハムスターまたはマカクザルなど）を、免疫に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することが可能なリンパ球を誘導するために、上述のように免疫化する。あるいは、インビトロでは、リンパ球が免疫されてもよい。リンパ球を次に、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を用いて、ミエローマ細胞と融合させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（モノクローナル抗体：原理と手法）、ｐｐ．５９−１０３(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を抑制する物質を１つ以上含む、好適な培地に播種して増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたは ＨＰＲＴ）を欠損する場合、ハイブリドーマ用培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むことになる（ＨＡＴ培地）。
好ましいミエローマ細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルな抗体産生をサポートし、ＨＡＴ培地のような培地に感受性があるものである。これらの中では、好ましいミエローマ細胞株は、米国カリフォルニア州、サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍、米国メリーランド州ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するようなマウスミエローマ株である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１(１９８４）、 Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（モノクローナル抗体産生技術と応用）， ｐｐ． ５１−６３(Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、あるいは放射性免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０(１９８０）によるスキャッチャード分析によって測定することができる。
ハイブリドーマ細胞が、所望する特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生することが確認された後で、そのクローンは、限界希釈法によってサブクローンされて、標準法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（モノクローナル抗体：原理と手法）、ｐｐ．５９−１０３(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。この目的のための好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０ 培地などである。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物体内の腹水腫瘍としてインビボでも増殖し得る。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培地、腹水、血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法、アフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、適宜分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）を用いて、容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましいソースとして役立つ。いったん単離されると、そのＤＮＡは、当該分野では公知である発現ベクター中に配置されてから、Ｅ ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体の組み換え産生については、以下にさらに詳説する。
（iv）ヒト化およびアミノ酸配列変異体
抗体のヒト化についての一般的方法は、米国特許最新５８６１１５５、ＵＳ１９９６０６５２５５８ １９９６０６０６、ＵＳ６４７９２８４、ＵＳ２００００６６０１６９ ２００００９１２、ＵＳ６４０７２１３、ＵＳ１９９３０１４６２０６ １９９３１１１７、ＵＳ６６３９０５５、ＵＳ２００００７０５６８６ ２０００１１０２、ＵＳ６５００９３１、ＵＳ１９９５０４３５５１６ １９９５０５０４、ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９， ＵＳ１９９５０４７７７２８ １９９５０６０７、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ１９９５０４７４０４０ １９９５０６０７、ＵＳ５６９３７６２， ＵＳ１９９５０４８７２００ １９９５０６０７、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ１９９５０４８４５３７ １９９５０６０７、ＵＳ２００３２２９２０８、ＵＳ２００３０３８９１５５ ２００３０３１３、ＵＳ５７１４３５０、ＵＳ１９９５０３７２２６２ １９９５０１１３、ＵＳ６３５０８６１、ＵＳ１９９７０８６２８７１ １９９７０５２３、ＵＳ５７７７０８５、ＵＳ１９９５０４５８５１６ １９９５０５１７、ＵＳ５８３４５９７、ＵＳ１９９６０６５６５８６ １９９６０５３１、ＵＳ５８８２６４４、ＵＳ１９９６０６２１７５１ １９９６０３２２、ＵＳ５９３２４４８、ＵＳ１９９１０８０１７９８ １９９１１１２９、ＵＳ６０１３２５６、ＵＳ１９９７０９３４８４１ １９９７０９２２、ＵＳ６１２９９１４、ＵＳ１９９５０３９７４１１ １９９５０３０１、ＵＳ６２１０６７１、ｖ、ＵＳ６３２９５１１、ＵＳ１９９９０４５０５２０ １９９９１１２９、ＵＳ２００３１６６８７１、ＵＳ２００２００７８７５７ ２００２０２１９、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ１９９１０７８２７１７ １９９１１０２５、ＵＳ６５４８６４０、ＵＳ１９９５０４５２４６２ １９９５０５２６、ＵＳ５６２４８２１、ＵＳ１９９５０４７９７５２ １９９５０６０７に説明されている。
ある実施態様では、これらのヒト化抗体のアミノ酸配列変異体、特に、抗体の結合親和性またはその他の生物学的特性を改善したものを作成することが望ましいことがある。
抗ＬＰＡ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＬＰＡ抗体ＤＮＡ中に適切なヌクレオチドの変化を導入するか、あるいはペプチド合成によって調整される。かかる変異体は、例えば、本明細書の実施例にある抗ＬＰＡ抗体のアミノ酸配列内からの残基の欠失、および／またはアミノ酸配列内への残基の挿入および／または残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性を有しているという前提で、欠失、挿入、置換の組み合わせが、最終コンストラクトに達するために使用される。また、アミノ酸の変化は、ヒト化抗ＬＰＡ抗体または抗LPA抗体変異体の、グリコシル化部位の数または位置の変化といった、翻訳後プロセスを改変し得る。
変異誘発に好ましい部位である、抗ＬＰＡ抗体の特定の残基または領域の同定に役立つ方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５(１９８９）によって説明されているように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、アミノ酸とＬＰＡ抗原との相互作用を影響するために、残基または標的残基グループが同定され（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、グルタミン酸のような荷電残基）、中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（アラニンまたはポリアラニンが最も好ましい）によって置換される。置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸部位は次に、置換部位に更なる変異体または他の変異体を導入することによって緻密化される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されるが、変異自体の本質を予め決定する必要はない。例えば、所定の部位での変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドンまたは領域で、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発が行われ、所望する活性について、発現した抗ＬＰＡ抗体変異体が選別される。アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さに渡るアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基またはエピトープタグ融合抗体を含む。その他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させるような酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含む。
変異体のその他のタイプは、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基が抗体分子から除去され、異なる残基がその場所に挿入されている。置換性変異誘発についての最も関心対象となる部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考慮される。保存的置換が好ましいが、より実質的な変化が導入され、生成物の選別が行われてもよい。置換の例を以下に列記する。
典型的なアミノ酸残基置換
Ａｌａ(Ａ）ｖａｌ； ｌｅｕ； ｉｌｅ ｖａｌ
Ａｒｇ(Ｒ）ｌｙｓ； ｇｌｎ； ａｓｎ ｌｙｓ
Ａｓｎ(Ｎ）ｇｌｎ； ｈｉｓ； ａｓｐ， ｌｙｓ； ｇｌｎ ａｒｇ
Ａｓｐ(Ｄ）ｇｌｕ； ａｓｎ ｇｌｕ
Ｃｙｓ(Ｃ）ｓｅｒ； ａｌａ ｓｅｒ
Ｇｌｎ(Ｑ）ａｓｎ； ｇｌｕ ａｓｎ
Ｇｌｕ(Ｅ）ａｓｐ； ｇｌｎ ａｓｐ
Ｇｌｙ(Ｇ）ａｌａ ａｌａ
Ｈｉｓ(Ｈ）ａｓｎ； ｇｌｎ； ｌｙｓ； ａｒｇ ａｒｇ
Ｉｌｅ(Ｉ）ｌｅｕ； ｖａｌ； ｍｅｔ； ａｌａ； ｌｅｕ ｐｈｅ； ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ
Ｌｅｕ(Ｌ）ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ； ｉｌｅ； ｖａｌ； ｉｌｅ ｍｅｔ； ａｌａ； ｐｈｅ
Ｌｙｓ(Ｋ）ａｒｇ； ｇｌｎ； ａｓｎ ａｒｇ
Ｍｅｔ(Ｍ）ｌｅｕ； ｐｈｅ； ｉｌｅ ｌｅｕ
Ｐｈｅ(Ｆ）ｌｅｕ； ｖａｌ； ｉｌｅ； ａｌａ； ｔｙｒ ｔｙｒ
Ｐｒｏ(Ｐ）ａｌａ ａｌａ
Ｓｅｒ(Ｓ）ｔｈｒ ｔｈｒ
Ｔｈｒ(Ｔ）ｓｅｒ ｓｅｒ
Ｔｒｐ(Ｗ）ｔｙｒ； ｐｈｅ ｔｙｒ
Ｔｙｒ(Ｙ）ｔｒｐ； ｐｈｅ； ｔｈｒ； ｓｅｒ ｐｈｅ
Ｖａｌ(Ｖ）ｉｌｅ； ｌｅｕ； ｍｅｔ； ｐｈｅ； ｌｅｕ ａｌａ； norleucine
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートまたはラセン立体構造のような、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位の分子の荷電または疎水性、(ｃ）副鎖のバルク、の維持に対する効果において著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然残基は、共通の副鎖特性に基づいて、グループに分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
（２）中性親水性： システイン、セリン、スレオニン
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン
（５）鎖の配向性を影響する残基：グリシン、プロリン
（６）芳香族：トリプシン、チロシン、フェニルアラニン
非保存的な置換は、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスと交換することを伴う。
また、分子の酸化安定性を向上させ、異常な交差を防止するために、抗体の正しい立体構造の維持に関与しないシステイン残基はすべて置換され得る。逆に、安定性を向上させるために、（特に、抗体が、Ｆｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）、システイン結合を抗体に付加してもよい。
置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域の置換を含む。一般的には、その結果、さらなる開発のために選択された変異体は、その元となる親抗体と比較して、より改善された生物学的特性を有することになる。かかる置換変異体を作成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡単に言うと、各部位ですべての可能なアミノ置換を作成するために、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）に変異を導入する。このようにして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子III産物に対する融合物として、糸状ファージ粒子から、一価様式でディスプレイされる。ファージディスプレイによる変異体は次に、本明細書に開示するように、生物学的活性（例えば、結合親和性）について選別される。修飾のために候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはこれに加えて、抗体と抗原間の接触ポイントを同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。かかる接触残基と隣接残基は、本明細書に詳説する手法に従う置換の候補である。いったんかかる変異体が生成されると、変異体のパネルは、本明細書に記載のように選別を受け、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、更なる開発のために選択され得る。
抗体のアミノ酸変異体のもう１つのタイプは、抗体の元来のグリコシル化を改変する。改変するとは、抗体中の１つ以上の炭水化物部分を欠失すること、および／または抗体中に存在しないグリコシル化部位を１つ以上付加することを意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型および／またはＯ結合型である。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の副鎖への炭水化物部分の付加を意味する。トリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸）は、アスパラギン副鎖への炭水化物部分の酵素的付加の最も一般的な認識部位である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することによって、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用し得るが、最も一般的にはセリンまたはスレオニン）への糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、キシロースの付加を意味する。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、便利なことに、１つ以上の上記のトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を改変することによって達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。この改変はまた、元の抗体配列に対する、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはセリンまたはスレオニン残基による置換によって行われる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
抗スフィンゴ脂質抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野に公知の様々な方法によって調製される。これらの方法は、限定はされないが、天然源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチドを介する（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、以前に調製された変異体のカセット変異誘発または抗スフィンゴ脂質抗体の非変異体バージョンによる調製を含む。
（v）ヒト抗体
ヒト化のほかに選択可能な方法として、ヒト抗体を生成できる。例えば、今では、免疫されると、内在性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパトワを生じることができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作成することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系列変異マウスにおける抗体の重鎖結合領域（ＪH）遺伝子のホモ接合型欠失は、内在性抗体産生の完全な抑制を生じることが説明されている。かかる生殖細胞系列変異マウスへのヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原攻撃に際してヒト抗体の産生を生じることになる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２５５１(１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３(１９９３）、ならびに米国特許第５，５９１，６６９、５，５８９，３６９、５，５４５，８０７号。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーからも生成できる(Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１(１９９１）、ＭａｒｋｓらＪ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７(１９９１）、ならびに米国特許第５，５６５，３３２および５，５７３，９０５号）。ヒト抗体はまた、インビボで活性化されたＢ細胞によっても生成できる（米国特許第５，５６７，６１０および５，２２９，２７５号を参照。）
（vi）抗体フラグメント
ある実施態様では、抗ＬＰＡ薬剤は、抗原結合を含む、少なくとも１つの所望する活性を保持する抗体フラグメントである。抗体フラグメント産生のために、様々な技術が開発されてきている。従来より、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１(１９８５）を参照。）しかしながら、今では、これらのフラグメントは、組み換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ． ｃｏｌｉから直接回収でき、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７(１９９２））。別の実施態様では、Ｆ（ａｂ’）2は、Ｆ（ａｂ’）2分子のアセンブリを促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。別のアプローチに従って、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、組み換え宿主細胞培養から直接単離され得る。抗体フラグメント産生のためのその他の技術は、当業者には明らかであろう。
（vii）多重特異性抗体およびその他の薬剤
いくつかの実施態様では、抗ＬＰＡ薬剤は、第一結合部分と第二結合部分からなり、ここで第一結合部分は、ＬＰＡまたはＬＰＡ代謝物である第一分子と特異的に反応し、第二結合部分は、第一分子とは異なる分子種である第二分子と特異的に反応する。かかる薬剤は、複数の第一結合部分、または複数の第二結合部分、または複数の第一結合部分と複数の第二結合部分を得る。第一結合部分と第二結合部分の比率は、約１０００：１〜約１：１０００の範囲に渡ってもよいが、好ましくは、約１：１であり、ここでこの比率は、原子価に換算して測定することが好ましい。
第一部分が抗体である実施態様において、結合部分は抗体でもあり得る。好ましい実施態様では、第一および第二部分は、リンカー部分を介して結合されており、１つまたは別々のケミストリーによる第一および第二結合部分の付着について、２〜数百または数千の原子価を有し得る。二重特異性抗体の例は、２つの異なるエピトープに対して反応性のある抗体を含み、ある実施態様では、１つのエピトープはＬＰＡエピトープであり、二番目のエピトープは、例えば、Ｓ１Ｐのような他の生理活性脂質である。他の実施態様では、二重特異性抗体は、ＬＰＡ上にあるエピトープおよび細胞表面に検出されるエピトープに対して反応性がある。これは、ＬＰＡ特異性抗体部分を細胞に対して標的させるのに役立つ。
本発明による組成物はまた、第一薬剤と第二薬剤からなるが、ここで第一薬剤は、ＬＰＡとＬＰＡ代謝物からなる群から選択される第一分子と特異的に反応する第一結合部分を含み、第二薬剤は、第一分子とは異なる分子種である第二分子と特異的に反応する第二結合部分を含む。第一薬剤および／または第二薬剤は、抗体であり得る。第一薬剤と第二薬剤の比率は、約１，０００：１〜１：１，０００の範囲であってよいが、好ましい比率は、約１：１である。
好ましい実施態様では、ＬＰＡ活性を妨害する薬剤は、ＬＰＡと特異的に反応する抗体である。いくつかの実施態様では、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＬＰＡ抗体を生成することが望ましいことがある。代表的な二重特異性抗体は、ＬＰＡの２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗ＬＰＡ（抗体の）アームは、例えば、Ｓ１Ｐまたは細胞表面に対する抗体の局在化のための細胞表面特異性抗原のような異なる分子に結合するアームと組み合わせてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2 二重特異性抗体）として調製され得る。
二重特異性抗体作成のための別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を操作することによって、組み換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合（％）を最大化することができる。好ましい界面は、抗体の定常ドメインのＣH３ドメインを少なくとも一部含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの１つ以上の小アミノ酸副鎖が、大型の副鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換されている。大型アミノ酸副鎖を小型副鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、この大型副鎖と同一サイズまたは似たサイズの代償「空洞」が、第二抗体分子の界面上に作成される。これは、ホモ二量体のような他の望ましくない最終産物の収率よりもヘテロ二量体の収率を増加させるためのメカニズムを提供する。１９９６年９月６日に公開されたＷＯ９６／２７０１１を参照。
二重特異性抗体は、交差または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに、他方はビオチンに結合し得る。ヘテロコンジュゲート抗体は、便利な交差方法を用いて作成することができる。好適な交差剤は、当該分野に公知であり、数々の交差技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技術はまた、文献に説明されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて作成することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１(１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解によって開裂して、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生成する方法を説明する。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。生成されたＦａｂ’フラグメントは次に、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは次に、メルカプトエチルアミンによる還元によって、Ｆａｂ’−−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用因子として使用できる。さらに他の実施態様では、Ｅ． ｃｏｌｉから直接回収されたＦａｂ’−ＳＨフラグメントは、インビトロで化学的に結合されて、二重特異性抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５：２１７−２２５(１９９２）。
組み換え細胞培養から二重特異性抗体フラグメントを直接作成および単離するための様々な技術も説明されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３(１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されて、単量体を形成し、次に再酸化されて、抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８(１９９３）によって説明された「二機能性抗体」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のための別のメカニズムを提供した。このフラグメントは、同一鎖上にある２つのドメイン間で対合するには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶL）と結合された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。従って、１つのフラグメントのＶHおよびＶLドメインは、他のフラグメントの相補ＶLおよびＶH ドメインと対合することを余儀なくされ、その結果、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ）二量体の使用による、二重特異性抗体フラグメント作成のための他の方法も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８(１９９４）を参照。あるいは、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７−１０６２(１９９５）によって説明されるように産生される「直鎖状抗体」であり得る。
２価以上を有する抗体が検討されている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０(１９９１）。
アームまたはフラグメントにつき１つ以上の結合部位を含む、本発明による抗体（またはポリマーまたはポリペプチド）を本明細書では、「多価」抗体と呼ぶ。例えば、本発明による「二価」抗体は、そのＦａｂまたはフラグメントにつき２つの結合部位を含むが、本発明による「三価」ポリペプチドは、そのＦａｂまたはフラグメントにつき３つの結合部位を含む。本発明による多価ポリマーにおいて、Ｆａｂにつき２つ以上の結合部位が、同一または異なる抗原に結合し得る。例えば、本発明による多価ポリペプチドにおける２つ以上の結合部位は、同一抗原に対して（例えば、当該抗原の同じ部分またはエピトープに対して、あるいは当該抗原の２つ以上の同じまたは異なる部分またはエピトープに対して）、および／または異なる抗原、あるいはその組み合わせに対して作成され得る。従って、本発明による二価ポリペプチドは、例えば、２つの同一結合部位、抗原の第一部分またはエピトープに対する第一結合部位ならびに当該抗原の同一部分またはエピトープまたは当該抗原の別の部分またはエピトープに対する第二結合部位、あるいは抗原の第一部分またはエピトープに対する第一結合部位と、異なる抗原に対する第二結合部位を含み得る。しかしながら、上記の記述から明らかであるように、本発明による多価ポリペプチドは、同一または異なる抗原に対する結合部位をいくつでも含み得るという意味において、本発明はそれに限定されることはない。１つの実施態様では、多価ポリペプチドは、少なくとも２つのリガンド結合エレメントを含み、その１つは、本明細書に示すＣＤＲペプチド配列を１つ以上含む。他の実施態様では、多価ポリペプチドは、本明細書に開示されるＣＤＲ配列からそれぞれ独立して選択される３つのリガンド結合部位を含む。
少なくとも１つのリガンド結合エレメントがＬＰＡを結合する。１つの実施態様では、少なくとも１つのリガンド結合エレメントが他の標的を結合する。１つの実施態様では、多価結合分子中には、最高１０，０００の結合エレメントが存在し、リガンド結合エレメントは、スキャフォールドに結合してもよい。
Ｆａｂまたはそのフラグメントにつき少なくとも２つの結合部位を含み、そのうち少なくとも１つの結合部位が第一の抗原に対し、第二の結合部位が第一の抗原と異なる第二の抗原に対する、本発明による抗体（またはポリマーまたはポリペプチド）もまた、「多重特異性」と呼ぶこととする。したがって、「二重特異性」ポリマーは、第一の抗原に対する少なくとも１つの部位および第二の抗原に対する少なくとも１つの第二の部位を含むが、「三重特異性」とは、第一の抗原に対する少なくとも１つの結合部位、第二の抗原に対する少なくとも１つの更なる結合部位、第三の抗原に対する少なくとも１つの更なる結合部位などを含む。したがって、最も単純な型では、本発明による二重特異性ポリペプチドは、本発明による二価ポリペプチド（Ｆａｂにつき）である。しかしながら、前述から明らかであるように、本発明による多重特異性ポリペプチドは、２つ以上の異なる抗原に対する結合部位をいくつでも含み得るという意味において、本発明はそれに限定されることはない。
（viii）その他の修飾
抗ＬＰＡ抗体のその他の修飾が検討されている。例えば、本発明はまた、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物、動物由来の酵素活性を有するトキシン、またはそれらのフラグメント）のような細胞毒剤、あるいは放射性同位元素（例えば、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む免疫コンジュゲートに関連する。コンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩(ＳＰＤＰ）、イミノチオラン(ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体(ジメチルアジプイミダート塩酸塩など）、活性エステル類(ジスクシイミジルスベリン酸塩など）、アルデヒド類(グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物(ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−アゾニウム誘導体(ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸塩（トリエン２，６−ジイソシアナートなど）、ビス−活性フッ素化合物(１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような様々な二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作成される。
本明細書で開示される抗ＬＰＡ抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化し得る。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：３６８８(１９８５）、Ｈｗａｎｇ ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４０３０(１９８０）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５および４，５４４，５４５号などのように、当該分野に公知の方法で調製される。循環時間を改良したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。例えば、リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、ＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）からなる脂質組成物を用いて、逆相蒸発法によって生成できる。リポソームを規定の孔サイズのフィルターを通して押し出すことによって、所望する直径を有するリポソームを産生する。本発明による抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：２８６−２８８(１９８２）に説明されるように、リポソームにコンジュゲートすることができる。もう一つの活性成分が任意に、リポソーム内に含まれてもよい。
上記に論述したヘテロ二機能性交差試薬の使用のような当該分野に公知の技術によって、酵素またはその他のポリペプチドは、抗ＬＰＡ抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明による酵素の少なくとも１つの機能的活性部分に結合した、本発明による抗体の少なくとも１つの抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野に公知の組み換えＤＮＡ法を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８(１９８４）を参照）。
本発明のある実施態様では、例えば、標的組織と細胞への浸透を高めるために、インタクトな抗体よりもむしろ抗体フラグメントを使用することが望ましいことがある。この場合、血清半減期を延長させるために、抗体フラグメントを修飾することが望ましいことがある。これは、例えば、抗体フラグメント中にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことによって（例えば、抗体フラグメントの該当領域の変異、またはエピトープをペプチドタグ内に組み込んでから、それを抗体フラグメントのいずれかの末端または中央部で（例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって）融合させることによって）達成し得る。１９９６年１０月１７日に公開されたＷＯ９６／３２４７８を参照。
抗ＬＰＡ抗体の共有結合的修飾も、本発明の範囲に含まれる。これらは、化学合成、または該当する場合には、抗体の酵素的または化学的切断によって作成できる。抗体の共有結合的修飾の他のタイプは、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された副鎖あるいはＮ−またはＣ−末端残基と反応させることが可能な有機誘導化剤と反応させることによって、分子中に導入される。ポリペプチドの代表的な共有結合的修飾は、参考文献として特に本明細書に援用されている、米国特許第５，５３４，６１５号に説明されている。抗体の共有結合的修飾の好ましいタイプは、米国特許第 ４，６４０，８３５、４，４９６，６８９、４，３０１，１４４、４，６７０，４１７、４，７９１，１９２、４，１７９，３３７号に示すような方法で、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類のような、種々の非タンパク質性ポリマーの１つに抗体を結合させることを含む。
ｂ．ベクター、宿主細胞、組み換え法
本発明はまた、抗ＬＰＡ抗体をコードする単離核酸、核酸を含むベクターと宿主細胞、抗体産生のための組み換え技術を提供する。
抗体の組み換えによる産生には、それをコードする核酸を単離して、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）と発現のために複製可能なベクター中に挿入することができる。他の実施態様では、抗体は、例えば、参考文献として特に本明細書に援用されている、米国特許第５，２０４，２４４号に記載のように、相同組み換えによって産生することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離および配列決定することができる。多数のベクターが使用可能である。ベクターの構成成分は、一般的に、限定はされないが、以下を１つ以上を含む。例えば、１９９６年７月９日に公布され、参考文献として特に本明細書に組み込まれている米国特許第５，５３４，６１５号に記載のような、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終止配列。
本明細書のベクターにおいてＤＮＡのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、前述の原核、またはイースト、または高等真核細胞である。本目的に適する原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌類（例：Ｅ． ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（例： Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、赤痢菌属、ならびにＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ(例えば、１９８９年４月１２日に出版されたＤＤ ２６６，７１０ に開示されるＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）のような桿菌、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなシュードモナス属、ならびにストレプトマイセス属のような真正細菌を含む。１つの好ましいＥ． ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ． ｃｏｌｉ ２９４(ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｂ， Ｅ． ｃｏｌｉ Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３１，５３７）および Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ２７，３２５）などの他の菌株も好適である。これらの実施例は、限定するものではなく、説明するためのものである。
原核生物の他に、糸状菌やイーストのような真核微生物は、抗スフィンゴ脂質抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。ただし、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（分裂酵母）、クリベロミセス属宿主（例： Ｋ． ｌａｃｔｉｓ、Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ(ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ(ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ(ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ． ｗａｌｔｉｉ(ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ(ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ヤロウィア属(ＥＰ ４０２，２２６）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（メタノール資化酵母）（ＥＰ １８３，０７０）、カンジダ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ(ＥＰ ２４４，２３４）、 Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのシュワンニオマイセス属、ならびに例えば、ニューロスポラ属、アオカビ属、トリポクラジウム属などの糸状菌、ならびにＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ． ｎｉｇｅｒのようなアスペルギリウス宿主などの多数のその他の属、種、株が本明細書では使用可能かつ有用である。
グリコシル化抗スフィンゴ脂質抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物と昆虫細胞を含む。多数のバキュロウィルス株と変異体ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ(ヨウトガ、イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ(ネッタイシマカ、蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ(ヒトスジシマカ、蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ(ショウジョウバエ）、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ(カイコ）などの宿主に由来する該当する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々なウィルス株が市販されており、その例は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶ（核多角体病ウィルス）のＬ−１変異株およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株であり、かかるウィルスは本発明に従って本明細書のウィルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）細胞のトランスフェクションのために使用し得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコの植物細胞培養もまた、宿主として利用できる。
ただし、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養脊椎動物細胞の増殖（組織培養）が常用法となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または浮遊培養によって増殖するためにサブクローンされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９(１９７７）、ベイビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６(１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３−２５１(１９８０））、サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−６８(１９８２））、 ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌株(Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗体産生のために、前述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導する、または形質転換株を選択する、または所望する配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修正された従来の栄養培地で培養される。
本発明による抗体を産生させるために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養できる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０(Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地(ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０(Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販培地が、宿主細胞の培養に適する。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４(１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５(１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、 第４，６５７，８６６号、 第４，９２７，７６２号、 第４，５６０，６５５号、 または第５，１２２，４６９号、 ＷＯ ９０／０３４３０、 ＷＯ ８７／００１９５、 または米国再発行特許第３０，９８５号に記載のいずれの培地も宿主細胞のための培養培地として使用し得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、またはトランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、バッファー（緩衝剤）（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTMなど）、トレースエレメント（通常最終濃度でマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される）、グルコースやそれと同等なエネルギー源で補充されてもよい。その他のいかなる必要なサプリメントもまた、当業者には公知である適切な濃度で含まれてよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前使用したものと同様であり、当業者には公知であろう。
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞膜周辺腔内において、細胞内で産生されるか、培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解されたフラグメントのいずれかである微粒子デブリが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７(１９９２）は、Ｅ． ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体の単離法を説明する。手短に言うならば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分解凍する。細胞デブリは遠心分離によって取り除くことができる。抗体が培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、一般的にはまず、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ超濾過ユニットのような、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害薬を前述のいずれの工程に含んでもよく、外来性汚染菌の増殖を防止するために、抗生物質を含んでもよい。
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。プロテインＡのアフィニティリガンドとしての適性は、種と抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒト重鎖に基づく抗体の精製に使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２：１−１３(１９８３））。プロテインＧは、全マウスアイソタイプとヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． ５：１５６７１５７５(１９８６））。アフィニティリガンドが付着するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリックスも使用可能である。細孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースよりもより速いフロー速度と短いプロセス時間で実現できる。抗体がＣH3ドメインを含む場合、その精製には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ．ＴＭ．樹脂（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ充填クロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥTM充填クロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）充填クロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降などのタンパク質精製のためのその他の技術もまた、回収される抗体によっては使用可能である。
予備精製の工程後、関心対象の抗体と混入物を含む混合物は、２．５〜４．５のｐＨで溶出バッファーを用いて、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることができる。
ｃ．医薬品製剤、用量、投与ルート
本発明は、抗ＬＰＡ抗体および関連する組成物と生理活性脂質ＬＰＡの血中および組織濃度を低下させるための方法を提供する。
本発明による治療法と組成物は、これらの治療が、望ましくないまたは有毒な脂質の相対濃度、または絶対濃度、または有効濃度を改変できることを示すために、「ＬＰＡベースの」と呼ばれる。「望ましくない脂質」は、有毒な生理活性脂質、ならびに有毒脂質の代謝物、特に代謝前駆体を含む。特に関心の対象となる望ましくない生理活性脂質の一例は、ＬＰＡである。
患者において、望ましくないＬＰＡの量を制御する１つの方法は、１つ以上のＬＰＡを結合する１つ以上の抗ＬＰＡ抗体を含む組成物を提供することにより、遊離する望ましくないＬＰＡ量を低下させる治療上の「スポンジ」として作用することである。化合物が「遊離状態」にあると記載される場合、その化合物は、いかなる方法においても、制限されることなく、それが望ましくない作用を及ぼす部位または複数部位に到達できる。典型的に、遊離化合物は、その作用部位であるか、あるいは作用部位を含んでいるか、またはそこから自由に作用部位に移動し得る、血液および組織中に存在する。遊離化合物はまた、その化合物を望ましくない化合物に変換する酵素によって作用を受けることができる。
抗ＬＰＡ抗体は、疾患、または障害、または身体的外傷の治療を含む、様々な目的のために有効な医薬品組成物中に配合し得る。本発明による抗ＬＰＡ抗体を１つ以上含む医薬品組成物は、かかる治療のためのキットまたは医療用デバイス中に組み込むことができる。医療用デバイスは、本発明による医薬品組成物を、それを必要とする患者に投与するために使用することができ、本発明の１つの実施態様に従って、そのようなデバイスを含むキットが提供される。そのようなデバイスとキットは、自己投与を含め、本発明による医薬品組成物の定期投与のためにデザインされ得る。かかるデバイスとキットはまた、例えば、救急車や救急処置室、または手術中、あるいは傷害が生じる可能性があるにも係わらず、必要なときに総合的な医療処置を直ちに受けることができない可能性がある活動（例えば、ハイキングやキャンプ、または戦争のような状況）における救急用としてもデザインされ得る。
抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容される担体、または賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ薬理科学）第１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ． 編集（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の剤形に調製して保管することができる。許容できる担体、または賦形剤、または安定剤は、使用する用量と濃度においてレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などのバッファー、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンズエトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、 ｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、またはゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、デキストリンを含むその他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ショ糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）、および／またはＴＷＥＥＮTM、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳTM、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ）などの非イオン系界面活性剤を含む。
本明細書に記載の製剤はまた、特定の治療適応の必要に応じて、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な作用を有する、１つ以上の有効な化合物を含んでもよい。かかる分子は、適宜、意図する目的のために有効な量で配合される。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセルのそれぞれを、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションに含んで、封入することもできる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ薬科学）第１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ． 編集（１９８０）に開示されている。
インビボ投与用に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に達成できる。
徐放性組成物も調製し得る。徐放性組成物の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーによる半透過性マトリックスを含み、そのようなマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような成形物の形態をとる。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−メタクリル酸ヒドロキシエチル）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性酢酸エチレンビニル、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ．ＴＭ．(乳酸・グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフィア）などの分解性乳酸・グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日に渡って分子の放出を可能にする一方、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短期間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長期間残存すると、３７℃で湿気に曝されることによって変性したり凝集したりすることがあり、その結果、生物活性が失われたり、免疫原性に変化が生じることがある。関連するメカニズムに基づいて、安定化させる合理的な方法を考案することが可能である。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると分かったら、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用、特定のポリマーマトリクス組成物の開発により、安定化を達成することもできる。
治療上の適用として、本発明による、抗ＬＰＡ薬剤（例えば、抗体）は、ボーラスとして静脈内投与、または一定期間にわたって持続注入、あるいは筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、吸入ルートによってヒトに投与し得るものを含む、上記に記載のような、薬学的に許容される剤形で、哺乳類、好ましくはヒトに投与される。
疾患の予防または治療のために、抗体の適切な用量は、上記に定義するような、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度と経過、抗体が予防または治療目的で投与されるか否か、過去の治療、患者の既往歴と抗体に対する応答、担当医師の判断に基づいて決めることになる。抗体は、一時点または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。
疾患のタイプと重症度に基づき、例えば、１回以上の個別の投与または持続注入による、抗体約１μｇ・ｋｇ〜約５０ ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ）が、患者への投与のための初回の候補投与量である。典型的な日毎または週毎の用量は、上記に言及する理由に基づき、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲である。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、症状によって、疾患症状の所望する抑止が起こるまで治療が反復される。しかしながら、他の投与計画も有益であり得る。この治療の進行は、例えば、Ｘ線撮影を含む、従来の技術またはアッセイによって容易にモニターされる。治療用抗体に対する患者曝露を最適化するために、抗体を用いて体液または組織中のＬＰＡ濃度を測定する検出方法を使用することができる。
本発明による他の実施態様に従って、例えば、ＬＰＡ活性を妨害するモノクローナル抗体のような薬剤を含む組成物が単独療法として投与されるが、他の好ましい実施態様では、ＬＰＡ活性を妨害する薬剤を含む組成物が併用療法の一部として投与される。場合によっては、疾患の予防または治療における抗体の有効性は、抗体を連続投与、または癌治療のための化学療法剤のような、それらの目的のために有効である他の薬剤と併用投与することによって高められる場合もある。その他の場合、抗ＬＰＡ薬剤は、化学療法に対して細胞を亢進または感作することによって、低用量、すなわち低毒性で有効になる場合もある。好ましい併用療法は、ＬＰＡ活性を妨害する薬剤を含む組成物の投与に加えて、化学療法剤、放射線療法、外科手術、前記のいずれかの併用からなる群から選択される第二の治療法を行うことを含む。
かかる他の薬剤は、投与される組成物中に含まれていてもよいし、別に投与されてもよい。さらに、抗体は、適宜に連続投与、または、例えば、癌治療のための化学療法剤または放射線のような、その他の薬剤またはモダリティと併用投与される。
ｄ． 本発明による抗ＬＰＡ薬剤の研究および臨床診断薬を含む診断薬としての用途
本発明による抗ＬＰＡ薬剤（例えば、抗体）は、例えば、体液から、ＬＰＡを検出および／または精製するために使用され得る。
アフィニティ精製剤として抗ＬＰＡ抗体を使用する場合、抗体は、当該分野に公知の方法を用いて、ビーズ、またはセファデックス樹脂、またはフィルター紙のような固体支持体上に固定化される。固定化抗体は、精製されるべきＬＰＡを含む試料と接触させ、その後、固定化抗体に結合されているＬＰＡを除く、試料中の物質を実質的にすべて取り除く好適な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、抗体からＬＰＡを遊離させる、例えば、ｐＨ３〜５．０のグリシンバッファーのような、他の好適な溶媒で支持体を洗浄する。
抗ＬＰＡ抗体はまた、例えば、特定の細胞、または組織、または体液中のＬＰＡを検出するような、ＬＰＡの診断検査法にも有用であり得る。そのような診断方法は、例えば、増殖過剰疾患または障害の診断に有用であり得る。したがって、研究用途に加えて、臨床診断用途がある。これらの方法において、抗ＬＰＡ抗体は、例えば、ビーズ、カラム、プレート、ゲル、フィルター、膜などのような固体支持体に付着されることが好ましい。
診断的適用としては、抗体は、検出可能な成分で標識され得る。多くの標識が使用可能であり、一般的に以下のカテゴリーに分類することができる。
(ａ）35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、131Ｉなどの放射性同位元素。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における現在のプロトコル）第１巻と２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら編集Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｐｕｂｓ．(１９９１）に記載の技術を用いて、放射性同位元素で標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定され得る。
(ｂ）希有土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、テキサスレッドのような蛍光性の標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、前出のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における現在のプロトコル）に開示される技術を用いて、抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量し得る。
(ｃ）種々の酵素−基質標識が使用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号にそれらのいくつかが概説されている。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定できる発色基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の変色を触媒することがあり、これは分光測定法によって測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変し得る。蛍光の変化を定量するための技術は前述されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、（例えば、化学発光計を用いて）測定可能な光を発するか、蛍光受容体 にエネルギーを供与する光を発し得る。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼと細菌ルシフェラーゼ、米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタルアジネジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、 グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロサイクリック（複素環）オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．(酵素学方法）（Ｊ． ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ． Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ７３：１４７−１６６(１９８１）中の、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（酵素免疫アッセイ用途向けの酵素・抗体コンジュゲートの調製法）の項に記載されている。
酵素−基質の組み合せの例は、例えば、以下を含む。
(ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（例えば、オルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する。
(ii）発色基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ならびに（iii）発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
多数の他の酵素−基質の組み合せが当業者には使用可能である。これらの一般概要については、米国特許第 ４，２７５，１４９号および第４，３１８，９８０号を参照。
標識は、間接的に抗体とコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は、当業者には公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述の３つの大まかな分類のうちのいずれかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、したがって、標識は、この間接的な様式で抗体とコンジュゲートされ得る。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体を小さなハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートさせてから、前述した異なるタイプの標識のうち１つを、抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このようにして、標識と抗体の間接的コンジュゲートを実現することができる。
本発明による他の実施態様において、抗ＬＰＡ抗体は標識する必要がなく、例えば、抗ＬＰＡ抗体に結合する標識抗体を用いて、その存在を検出することができる。
本発明による抗体は、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイなど任意の公知のアッセイ方法に用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（モノクローナル抗体：技術マニュアル）， ｐｐ．１４７−１５８(ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）。
競合結合アッセイは、限定量の抗体の結合についてテストサンプル分析物と競合する標識された標準物質の能力に依拠する。テストサンプル中のＬＰＡの量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。結合する標準物質量の測定を容易にするために、一般的に、抗体を競合の前または後に不溶化して、抗体に結合する標準物質と分析物が、抗体に結合しないで残っている標準物質と分析物から都合よく分離するようにすることができる。
サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれ結合可能な２つの抗体の使用を伴う。サンドイッチアッセイでは、テストサンプル分析物は、固体支持体に固定される第一の抗体によって結合され、その後、第二の抗体が分析物に結合し、その結果、不溶性の３部分からなる複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照。第二の抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識されるか（直接サンドイッチアッセイ）、あるいは検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合には、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学的検査では、血液または組織試料は、新鮮なものでも凍結されたものでもよく、あるいはパラフィン包埋されていても、例えば、ホルマリンなどの防腐剤で固定されていてもよい。
また、抗体は、インビボ診断検査法にも使用され得る。一般には、結合された標的分子を免疫シンチグラフィを用いて局在化できるように、抗体を放射性核種（例えば１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ）で標識する。
ｅ．本発明による抗ＬＰＡ薬剤を組み込む診断用キット
便宜上、本発明による抗体は、例えば、診断検査法を実施するための取扱説明書を添付する、規定量の試薬を組み合わせてパッケージしたキット中に供給され得る。抗体が酵素で標識される場合、キットには、基質と、酵素よって必要とされる補助因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを生じる基質前駆体）が含まれることになる。さらに、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは溶解バッファー）などの他の添加物が含まれてもよい。様々な試薬の相対量は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液濃度が得られるように、広範に異なってもよい。特に、試薬は、溶解することによって適切な濃度の試薬溶液が得られるように、賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として供給され得る。
ｆ．製品
本発明の他の態様では、前述の疾患治療のために有効な物質を含む製品が供給される。この製品は、容器とラベルを具備する。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、試験管などを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを具備し得る（例えば、容器は、静脈内投与用溶液バッグ、または皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。組成物中の活性薬剤は、抗スフィンゴ脂質抗体である。容器上のラベル、または容器に付随するラベルは、組成物が選択する症状の治療用であることを示す。製品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第二の容器を具備してもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、使用に関する説明を記載した添付文書を含む、商業上およびユーザーの観点から望ましいその他の資材をさらに含んでもよい。
本発明は、以下の実施例を参照することによって深く理解されるであろうが、これらの実施例は、単に本発明の実施に関する現在知られている最良の形態を示すためのものである。本発明の範囲はそれに限定されるものではない。
本発明を以下の詳細な実施例を参照してさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとはみなされない。
Ｓ１Ｐの代表的なチオール化類似体を製造するための合成スキーム
本実施例で説明する合成的なアプローチでは、主に従来の有機化学を用いて構成要素を連続的に追加して抗原を調製する。本実施例で説明するアプローチのスキームを図１において提供するが、下記の合成の説明における化合物の番号は、図１において番号をふった各構造を示す。
この合成アプローチではまず、市販の１５−ヒドロキシペンタデシンである１を用意し、塩化メチルスルホニルによる１５−ヒドロキシ基の活性化でヒドロキシル置換を促進してそのスルホン酸塩である２を作成した。ｔ−ブチルチオールでスルホン酸塩を置換し、保護されたチオエーテルである３を得、それをガーナーアルデヒドと縮合することによって４を作成した。アルキン部分を軽度に還元してアルケン（５）とし、次いでオキサゾリデン環の酸触媒開環によってＳ保護およびＮ保護されたスフィンゴシン・チオール置換体である６を得た。この最後の工程において、二炭酸ｄｉ−ｔ−ブチルによる再誘導体化を用いることによって、酸触媒開環中のＮ−ＢＯＣ基の損失を緩和した。
なお、化合物６自体は、スフィンゴシンに対する抗体を生成するためのハプテン調製用抗原として、あるいは、チオール化Ｓ１Ｐ類似体を調製するための２つの異なった合成アプローチの原料として使用できる。一方のアプローチでは、リン酸トリメチルによる化合物６のリン酸化によって化合物７を得た。化合物７を臭化トリメチルシリルで処理することにより、リン酸塩から両方のメチル基が、また一級アミンからｔ−ブチルオキシカルボニル基が脱離すると、唯一の保護基として硫黄上にｔ−ブチル基を有する化合物８が残った。この基を除去するために、このｔ−ブチル基をＮＢＳで置き換え、その二硫化物である９を形成したのち、これを還元することによりチオール化Ｓ１Ｐ類似体である１０を形成した。
他方のアプローチでは、化合物６を直接ＮＢＳＣｌで処理的することによりその二硫化物である１１を形成したのち、それを還元することによりＮ保護されたチオール化Ｓ１Ｐ類似体である１２を形成した。この化合物を弱酸処理することによりチオール化スフィンゴシン類似体である１３を得、これを、例えば、スフィンゴシンキナーゼによって酵素学的にリン酸化すると、チオール化Ｓ１Ｐ類似体である１０を得ることができる。
記載した合成アプローチは、特に保護用および脱保護用の試薬の選択に関しては、例えば、実施例３に記載の二硫化トリメチル・トリフレートをチオールの脱保護に使用するなど、変更可能である。
（化合物２）
１を（１０．３ ｇ、４５．８９ ｍｍｏｌ）入れた５００ ｍＬのＲＢフラスコにＤＣＭ（４００ ｍＬ）を添加し、その溶液を０℃まで冷却した。次に、ＴＥＡ（８．３４ ｇ、８２．６０ ｍｍｏｌ、９．５ ｍＬ）を一度に全部添加したのち、１０分間かけてＭｓＣｌ（７．８８ ｇ、６８．８４ ｍｍｏｌ、５．３ ｍＬ）を滴下した。反応を室温で０．５時間または原料が消失するまで撹拌させた（Ｒf ＝ ０．６５、ヘキサン類／ＥｔＯＡｃ＝５：１）。反応をＮＨ4Ｃｌ（３００ ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（２ Ｘ ２００ ｍＬ）を抽出した。有機層をＭｇＳＯ4にて乾燥し、ろ過したろ液を蒸発固化した（１３．８６ ｇ、収率９９．８ ％）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）d ４．２０（ｔ、Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ、２Ｈ）、２．９８（ｓ、３Ｈ）、２．５９（ｔｄ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ、３ Ｈｚ、２Ｈ）、１．９１７（ｔ、Ｊ ＝ ３ Ｈｚ、１Ｈ）、１．７２（五重線、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ、２Ｈ）、１．５０５（五重線、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ、２Ｈ）、１．３７（ｂｒ ｓ、４Ｈ）、１．２７（ｂｒ ｓ、１４Ｈ）。13Ｃ｛1Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3-）d ８５．４５、７０．９０、６８．７２、４６．６９、３８．０４、３０．２２、３０．１５、３０．１４、３０．０７、２９．８１、２９．７６、２９．６９、２９．４２、２９．１７、２６，０９、１９．０６、９．３１。化合物２のＨＲＭＳ分析（ＥＳ−ＴＯＦ）において観察された主要イオンは、ｍ／ｚ ＝ ３２５．１８０４であった（Ｃ16Ｈ30Ｏ3Ｓとしての計算値：Ｍ＋Ｎａ+３２５．１８０８）。
（化合物３）
１Ｌの三つ首ＲＢフラスコにｔ−ブチルチオール（４．５４ ｇ、５０．４０ ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（２００ ｍＬ）を入れたのち、氷浴に入れた。３０分間かけてｎ−ＢｕＬｉ（１．６ Ｍのヘキサン類溶液３１．５ ｍＬ）を添加した。次に、化合物２（１３．８６ ｇ、４５．８２ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ ｍＬ）で溶解した溶液を２分間かけて添加した。反応を、１時間または原料が消失するまで撹拌する（Ｒf ＝ ０．７、ヘキサン類／ＥｔＯＡｃ＝１：１）。反応を飽和ＮＨ4Ｃｌ（５００ ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯ2（２ Ｘ ２５０ ｍＬ）によって抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、ろ過したろ液を蒸発させて黄色油（１１．６７ ｇ、収率８６％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）d ２．５２（ｔ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ、２Ｈ）、２．１８（ｔｄ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ、２．５ Ｈｚ、２Ｈ）、１．９３（ｔ、Ｊ ＝ ２．５ Ｈｚ、１Ｈ）、１．５５（五重線、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ、２Ｈ）、１．５１（五重線、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｂｒ ｓ、４Ｈ）、１．３３（ｓ、９Ｈ）、１．２６（ｓ、１４Ｈ）。13Ｃ｛1Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3-）d ８５．４２、６８．７１、６８．６７、５４．０７、４２．３７、３１．６８、３０．５８、３０．２８、３０．２６、３０．１９、３０．１７、２９．９８、２９．７８、２９．４４、２９．１９、２９．０２、１９．０８。
（化合物４）
化合物３（５．０ ｇ、１６．８５ ｍｍｏｌ）を入れた２５０ ｍＬのシュレンクフラスコを真空にして窒素を充填する作業を３回繰り返したのち、乾燥ＴＨＦ（１５０ ｍＬ）を添加した。得られた溶液を−７８℃まで冷却した。次に、２分間かけてｎ−ＢｕＬｉ（１．６Ｍのヘキサン類溶液１０．５ ｍＬ）を添加し、反応混合液を−７８℃で１８分間撹拌したのち、冷却浴を２０分間取り除いた。ドライアイス浴を戻した。１５分後、ガーナーアルデイド（３．３６ ｇ、１４．６５ ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ ｍＬ）溶液を５分間かけて添加した。２０分後に、冷却浴を取り除いた。２．７時間後の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）では、ガーナーアルデヒドが消失していることが確認された。反応を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（３００ ｍＬ）でクエンチし、Ｅｔ2Ｏ（２ Ｘ ２５０ ｍＬ）で抽出した。合わせたＥｔ2Ｏ相をＮａ2ＳＯ4にて乾燥し、ろ過したろ液を蒸発させることにより、粗化合物４およびそのシンジアステレオマー（図１に図示せず）を黄色油（９．０６ ｇ）として得た。この材料は、これ以上精製せず次の工程に使用した。
（化合物５）
化合物４の三重結合を還元するために、上記油を窒素下で乾燥Ｅｔ2Ｏ（１００ ｍＬ）に溶解した。水素ガス（Ｈ2）の発生を制御するために室温でゆっくりとその溶液にＲＥＤ−Ａｌ（６５％のトルエン溶液２０ ｍＬ）を添加した。反応を、一夜またはＴＬＣで原料（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類１：１でＲf ＝ ０．６）の消失が確認されるまで室温で撹拌し、Ｈ2の発生を制御するためにゆっくりとＭｅＯＨまたはＮＨ4Ｃｌ水溶液でクエンチした。得られた白色懸濁液をセリットパッドでろ過し、ろ液をＥｔＯＡｃ（２ Ｘ ４００ ｍＬ）で抽出した。合わせたEtOAｃ抽出液をＭｇＳＯ4にて乾燥し、ろ過したろ液を蒸発させると、粗化合物５およびそのシンジアステレオマー（図１に図示せず）が黄色油（７．５９ ｇ）として残った。
（化合物６）
化合物５が含まれている上記油をＭｅＯＨ（２００ ｍＬ）で溶解し、ＰＴＳＡ水和物（０．６３ ｇ）を添加し、その溶液を室温で１日間、その後５０oＣで２日間撹拌し、その時点で全原料（５）が消失していることがＴＬＣによって示唆された。しかしながら、いくらかの極性材料が存在していたため、酸がＢＯＣ基を一部切断したことが示唆された。反応を、飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（４００ ｍＬ）を添加してワークアップし、エーテル（３ ｘ ３００ ｍＬ）で抽出した。混合したエーテル相をＮａ2ＳＯ4にて乾燥し、ろ過したろ液を乾燥するまで蒸発させると、５．１４ ｇの油が残った。形成されたアミンを再度保護するため、上記粗産物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ ｍＬ）に溶解し、それにＢＯＣ2Ｏ（２．４４ ｇ）およびＴＥＡ（１．７ ｇ）を添加した。ＴＬＣ（ヘキサン類／ＥｔＯＡｃ＝１：１）によって、基線に材料が残っていないことが示されたら飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（２００ ｍＬ）を添加し、有機相を分離したのち、混合液をＣＨ2Ｃｌ2（３ Ｘ ２００ ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出をＮａ2ＳＯ4にて乾燥し、ろ液を乾燥するまで濃縮し、黄色油（７．７ ｇ）を得、これをヘキサン類／ＥｔＯＡｃの（１：１までの）勾配を用いたシリカカラムクロマトグラフィーにかけることによって上記ジアステレオマーを分離した。ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝ １：１を用いたＴＬＣにより、化合物６であるアンチ体のＲfは０．４５であった。シン体（図１に図示せず）のＲfは０．４０だった。化合物６の収率は２．４５ ｇ（ガーナーアルデヒドに基づいて総合的に３９ ％）だった。アンチ体の1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）d １．２６（ｂｒ ｓ、２０Ｈ）、１．３２（ｓ、９Ｈ）、１．４５（ｓ、９Ｈ）、１．５６（五重線、２Ｈ、Ｊ ＝ ８ Ｈｚ）、２．０６（ｑ、２Ｈ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）、２．５２（ｔ、２Ｈ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）、２．５５（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、３．６０（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、３．７２（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ ＝ １１．５ Ｈｚ、７．０ Ｈｚ、３．５ Ｈｚ）、３．９４（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ ＝ １１．５ Ｈｚ、３．５ Ｈｚ）、４．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ ＝ ４．５ Ｈｚ）、５．２８（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、５．５４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ ＝ １５．５ Ｈｚ、６．５ Ｈｚ）、５．７８（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ ＝ １５．５ Ｈｚ、６．５ Ｈｚ）。13Ｃ ｛1Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）d １５６．９５、１３４．８０、１２９．６６、８０．４７、７５．４６、６３．３３、５６．１７、４２．４４、３２．９８、３１．７０、３０．５８、３０．３２、３０．３１、３０．２８、３０．２０、３０．１６、３０．００、２９．８９、２９．８０、２９．０８、２９．０３。
元素分析値。Ｃ27Ｈ53ＮＯ4Ｓとしての計算値：Ｃ、６６．４８；Ｈ、１０．９５；Ｎ、２．８７。実測値：Ｃ、６５．９８；Ｈ、１０．４６；Ｎ、２．４８。
（化合物７）
化合物６（６０９．５ ｍｇ、１．２５ ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２ ｍＬ）で溶解したアルコール溶液にＣＢｒ4（６４７．２ ｍｇ、１．９５ ｍｍｏｌ、１．５６ 等量）を添加した。フラスコを氷浴で冷却し、２分間かけてＰ（ＯＭｅ）3（２８４．７ ｍｇ、２．２９ ｍｍｏｌ、１．８４ 等量）を滴下した。４分後に氷浴を取り除き１２時間後に混合液をエーテル（２０ ｍＬ）で希釈した。得られた混合液をＨＣｌ水溶液（１０ ｍＬ、２ Ｎ）で洗浄することによりエマルションを形成し、これを水（２０ ｍＬ）による希釈で分離した。水相をエーテル（２ ｘ １０ ｍＬ）、その後ＥｔＯＡｃ（２ ｘ １０ ｍＬ）で抽出した。該エーテル抽出液および第１のＥｔＯＡｃ 抽出液を合わせ、ＨＣｌ水溶液（１０ ｍＬ、２ Ｎ）、水（１０ ｍＬ）、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ ｍＬ）で洗浄した。最後のＥｔＯＡｃ抽出液を用いて洗浄水溶液を逆抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ4にて乾燥し、ろ過したろ液を濃縮すると、粗産物（１．１６ ｇ）が残ったため、これをＣＨ2Ｃｌ2、次いで ＣＨ2Ｃｌ2−ＥｔＯＡｃ（１：２０、１：６、１：３、および１：１ - 産物は、６：４、７：３で溶出し始めた）を用いたシリカ（３ ｘ ２２ ｃｍ カラム）フラッシュクロマトグラフィーにかけた。初期のフラクションは５６．９ ｍｇの油を含んでいた。後のフラクションでは、産物（化合物７、４７６．６ ｍｇ、６４％）が透明無色の油として得られた。
元素分析値。Ｃ29Ｈ58ＮＯ7ＰＳ（５９５．８２）としての計算値：Ｃ、５８．４６；Ｈ、９．８１；Ｎ、２．３５。実測値：Ｃ、５８．０９；Ｈ、９．６９；Ｎ、２．４１。
（化合物８）
化合物７（３３３．０ ｍｇ、０．５５９ ｍｍｏｌ）と撹拌棒を入れたフラスコを真空にして窒素を充填した。アセトニトリル（４ ｍＬ、ＣａＨ2から蒸留）を注射器で注入し、溶液が入ったフラスコを氷浴にて冷却した。注射器を用いて（ＣＨ3）3ＳｉＢｒ（４３８．７ ｍｇ、２．８７ ｍｍｏｌ、５．１３ 等量）を１分間かけて添加した。３５分後、フラスコの上部を追加分のアセトニトリル（１ ｍＬ）ですすぎ、氷浴を取り除いた。さらに８０分後、アリコートを取り出し、それに窒素ガスを吹き当てて溶液を乾燥し、残分をＣＤＣｌ3中1Ｈ ＮＭＲで分析したが、Ｐ−ＯＣＨ3部分に起因するピークはほんのわずかしかみられなかった。２０分後、反応混合液に水（０．２ ｍＬ）、次いで上記アリコートの分析に使うＣＤＣｌ3 溶液を添加し、混合液を回転蒸発器で約０．５ ｍＬの体積になるまで濃縮した。アセトン（３ ｍＬ）を分割して用い、風袋重量を測った試験管に残分を移すと、薄褐色溶液が形成された。水（３ ｍＬ）を分割して添加した。０．３ ｍＬを追加した時点で、濁りが確認された。全体で１ ｍＬになった時点で、ゴム状の沈殿物が形成された。さらに０．６ ｍＬの水を添加すると、さらに濁りとゴムが析出したが、最後の分の水を添加したところ、混合物の外観は変化しないようであった。この過程を終了するには全体で数時間かかった。試験管を遠心分離にかけ、ピペットで上清を除去した。もはやゴム状ではない固体をＰ4Ｏ10にて減圧乾燥すると、化合物８（２５８．２ ｍｇ、９５％）が一水和物として残った。
元素分析値。Ｃ22Ｈ46ＮＯ5ＰＳ＋Ｈ2Ｏ（４８５．６６）としての計算値：Ｃ、５４．４０；Ｈ、９．９６；Ｎ、２．８８。実測値：Ｃ、５４．５９；Ｈ、９．８４；Ｎ、２．９５。
（化合物９）
グローブボックスにおいて、撹拌棒、乾燥ＴＨＦ（３ ｍＬ）および氷ＨＯＡｃ（３ ｍＬ）が入っている試験管に化合物８（２０２．６ ｍｇ、０．４１７ ｍｍｏｌ）を添加した。ＮＢＳＣｌ（９０ ｍｇ、０．４７５ ｍｍｏｌ、１．１４ 等量）を添加し、０．５時間後に透明溶液を得た。全９時間後、アリコートを乾燥するまで蒸発させ、残分をＣＤＣｌ3中1Ｈ ＮＭＲで分析した。ＣＨ2ＳｔＢｕおよびＣＨ2ＳＳＡｒ と一致するピークによって反応が約７５％完了していることが示唆され、スペクトルをＣＤＣｌ3 中の純ＮＢＳＣｌのものと比較したところ、反応において試薬が残っていないことが示唆された。したがって、追加分（２４．７ ｍｇ、０．１３０ ｍｍｏｌ、０．３１ 等量）を添加し、その３時間後に追加分（１９．５ ｍｇ、０．１０３ ｍｍｏｌ、０．２５ 等量）を添加した。さらに１時間後、ＴＨＦ（２ ｍＬ）ですすぎながら混合液を新しい試験管に移し、水（１ ｍＬ）を添加した。
（化合物１０）
上記化合物９の透明溶液にＰＭｅ3（８２．４ ｍｇ、１．０８ ｍｍｏｌ、添加した塩化２−ニトロベンゼンスルフェニル総量の１．５２倍）を添加した。混合液は温かくなって白濁し、経時的に沈殿物を形成した。４．５時間後、メタノールを添加し、試験管を遠心分離にかけた。沈殿物は沈殿しにくく、試験管の下方１ ｃｍを占めた。ピペットを用いて透明黄色の上清を除去した。メタノール（５ ｍＬ、窒素で脱酸素化）を添加し、試験管を遠心分離にかけ、上清をピペットで除去した。このサイクルを３回繰り返した。濃縮すると、最後のメタノール洗浄液は４．４ ｍｇしか残らなかった。固体残分の大半をＰ4Ｏ10にて減圧乾燥すると、化合物１０（１１８．２ ｍｇ、６８％）が一塩酸塩として残った。
元素分析値。Ｃ18Ｈ38ＮＯ5Ｓ＋ＨＣｌ（４１７．０３）としての計算値：Ｃ、５１．８４；Ｈ、９．４３；Ｎ、３．３６。実測値：Ｃ、５２．１１；Ｈ、９．１２；Ｎ、３．３０。
（化合物１１）
化合物６（１．４５ ｇ、２．９７ ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ（２０ ｍＬ）で溶解し、ＮＢＳＣｌ（０．５６ ｇ、２．９７ ｍｍｏｌ）を一度に全部添加した。反応を、３時間あるいは原料が消失し産物の形成がＴＬＣ ［産物 Ｒf ＝ ０．６５、原料 Ｒf ＝ ０．４５、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン類＝１：１］によって観察されるまで撹拌させた。反応を高真空管で濃縮して乾燥させ、残分をＴＨＦ／Ｈ2Ｏ（１０：１を１００ ｍＬ）で溶解した。
（化合物１２）
化合物１１を含有する上記溶液にＰｈ3Ｐ（０．２．３３ ｇ、８．９１ ｍｍｏｌ）を一度に全部添加し、反応を３時間または原料が消失するまで撹拌させた。粗反応混合液を高真空管で濃縮して乾燥させると、化合物１２を含有する残分が残った。
（化合物１３）
化合物１２を含有する上記残分をＤＣＭ（５０ ｍＬ）およびＴＦＡ（１０ ｍＬ）で溶解した。混合液を室温で５時間撹拌し、濃縮して乾燥させた。残分をシリカゲル入りのカラムに注入し、純ＤＣＭ、次いで５％ ＭｅＯＨ 含有ＤＣＭ、その後に１０％ ＭｅＯＨでクロマトグラフィーを実施して最終産物である化合物１３（０．４５ ｇ、５からの収率４６％）を粘着性の白色固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）d １．２７（ｓ）、１．３３（ｂｒ ｍ，）、１．６１（ｐ、２Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、２．０３（ｂｒ ｄ、２Ｈ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）、２．５３（ｑ、２Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、３．３４（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、３．８７（ｂｒ ｄ、２Ｈ、Ｊ ＝ １２ Ｈｚ）、４．４８（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、４．５８（ｂｒ ｓ、２Ｈ）、５．４２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ ＝ １５ Ｈｚ、５．５ Ｈｚ）、５．８２（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ ＝ １５ Ｈｚ、５．５ Ｈｚ）、７．９１（ｂｒ ｓ、４Ｈ）。13Ｃ｛1Ｈ｝ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）d １３６．８５、１２６．２６、５７。０８、３４．７６、３２．９５、３０．４０、３０．３６、３０．３４、３０．２５、３０．１９、３０．０５、２９．８０、２９．６２、２９．０９、２５．３４。
チオール化脂肪酸を製造するための合成スキーム
本実施例に記載の合成アプローチでは、チオール化脂肪酸の調製を詳細に説明するが、これはより複雑な脂質構成に組み込まれ、任意にタンパク質または他の担体とさらに複合化され、免疫応答を誘導させるために動物に投与されるものである。本アプローチには、従来の有機化学を用いる。本実施例でとるアプローチを示すスキームを図２において提供し、下記の合成の説明における化合物番号は、図２において番号をふった各構造を示す。
二つの合成について説明する。最初のＣ−１２チオール化脂肪酸の合成ではまず、市販の１２−ドデカン酸である化合物１４を用意する。次に、臭素をｔ−ブチルチオールで置換して、保護されたＣ−１２チオール化脂肪酸である化合物１５を得る。二番目のＣ−１８チオール化脂肪酸の合成ではまず、市販の９−ブロモ−ノナノール（化合物１６）を用意する。化合物１６のヒドロキシル基をジヒドロイラン基の付加によって保護し、その結果得られた化合物である１７を、臭素化体の半分をグリニャール反応によって活性化し、次いで残りの半分の付加によって二量体化する。酸触媒によるジヒドロピラン保護基の脱離後、得られた１８−ヒドロキシオクタデカノール（化合物１８）を選択的に一臭素化して化合物１９を形成する。この反応の際、求核置換のためにアルコール基の約半分をメタンスルホン酸エステルの形成によって活性化する。次にアルコールを酸化させ１８−ブロモカルボン酸である化合物２０を形成したのち、それをｔ−ブチルチオールで処理することによって臭素を置換して、保護されたチオール化Ｃ−１８脂肪酸である化合物２１を形成する。
それぞれがｔ−ブチルチオエーテルである上記保護されたチオール化脂肪酸を複合脂質に組み込こむことができるが、例えば、実施例１および３に記載の脱保護化アプローチの一つを用いれば、保護基を脱離することができる。そして、得られた遊離チオールを用いてタンパク質または他の担体と複合化させた後、そのハプテンで動物に接種することができる。
Ａ．Ｃ−１２チオール化脂肪酸の合成
（化合物１５）
乾燥したシュレンクフラスコにｔ−ブチルチオール（１２．９３ ｇ、１４３ ｍｍｏｌ）を添加し、シュレンク法を用いて系を窒素下に置いた。脱気した乾燥ＴＨＦ（２５０ ｍＬ）を添加し、フラスコを氷浴において冷却した。１０分間かけてｎ−ＢｕＬｉ（２．５ Ｍのヘキサン類溶液５５ ｍＬ、１３７．５ ｍｍｏｌ）を注射器でゆっくりと添加した。混合液を、０oＣで一時間撹拌した。臭化酸である化合物１４（１０ ｇ、３６ ｍｍｏｌ）を固体として添加し、反応を加熱して６０oＣで２４時間撹拌した。反応を２ Ｍ ＨＣｌ（２５０ ｍＬ）でクエンチしてエーテル（２ ｘ ３００ ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過したろ液を回転蒸発により濃縮し、チオエーテル酸である化合物１５（１０ ｇ、収率９９％）をベージュ色粉末として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ ＭＨｚ）δ １．２５−１．３５（ｂｒ ｓ，１２ Ｈ）、１．３２（ｓ、９ Ｈ）、１．３５−１．４０（ｍ、２ Ｈ）、 １．５０−１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．６５（ｍ、２ Ｈ）、２．３５（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、２．５２（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ−ＴＯＦ）における主要イオンは、Ｍ＋Ｎａ+ ３１１．２０１５として計算した場合、ｍ／ｚ ３１１．２０２０で確認された。
Ｂ．Ｃ−１２チオール化脂肪酸の合成
（化合物１７）
乾燥したシュレンクフラスコに化合物１６（５０ ｇ、２２４．２ ｍｍｏｌ）を入れ、ナトリウム／ベンゾフェノンから蒸留した脱気した乾燥ＴＨＦ（２５０ ｍＬ）で溶解した。フラスコを氷浴において冷却したのちＰＴＳＡ（０．５ ｇ、２．６ ｍｍｏｌ）を添加した。次に、脱気した乾燥ＤＨＰ（３６ ｇ、４２．８ ｍｍｏｌ）を５分間かけてゆっくりと添加した。該混合液を室温まで温め、一夜撹拌し、ＴＬＣ（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝ １０：１）で臭化アルコールのスポットの完全消失によって反応終了とみなされるまで監視した。次に、ＴＥＡ（１ ｇ、１０ ｍｍｏｌ）を添加してＰＴＳＡをクエンチした。その後、混合液を冷重曹溶液で洗浄し、ＥｔＯＡｃ（３ Ｘ ２５０ ｍＬ）で抽出した。次いで、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して粗産物６８．２ ｇを得、これをカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝ １０：１）で精製することによって無色油６０ ｇ（収率９９％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ ＭＨｚ）δ １．３１（ｂｒ ｓ、６ Ｈ）、１．４１−１．４４（ｍ、２ Ｈ）、１．５１−１．６２（不明多胎、６ Ｈ）、１．６９−１．７４（ｍ、１ Ｈ）、１．８５５（五重線、Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ、２ Ｈ）、３．４１（ｔ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ、２ Ｈ）、３．４８−３．５２（ｍ、２ Ｈ）、３．７３（ｄｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）、３．８５−３．９０（ｍ、２ Ｈ）、４．５７（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ３ Ｈｚ）。
（化合物１８）
火力乾燥したシュレンクフラスコに削状マグネシウム（２．９８ ｇ、１２５ ｍｍｏｌ）並びにヨウ素結晶を添加した。次いで、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（２００ ｍＬ）を添加し、シュレンク技法によって系を脱気した。その後、１０分間かけて化合物１７（３０ ｇ、９７ ｍｍｏｌ）をゆっくりとマグネシウムに添加し、溶液を６５oＣの油浴に入れ一夜撹拌した。反応は、アリコートをアセトンでクエンチして、１０：１のＰＥ：ＥｔＯＡｃ混合液におけるＲＦの変化を観察することで、ＴＬＣにより完了とみなされた。その後、グリニヤール溶液をカニューレで追加の化合物１７（３０ ｇ、９７ ｍｍｏｌ）が入っている窒素下の三つ首フラスコに移した。その得られた混合液が入っているフラスコを氷浴において０oＣまで冷却した後、Ｌｉ2ＣｕＣｌ4溶液（１ Ｍを３ ｍＬ）を注射器で添加した。反応混合液は、数分以内で非常に濃い青色になった。この混合液を一夜撹拌させた。翌朝、反応はＴＬＣ（１０：１ ＰＥ：ＥｔＯＡｃ）によって完了とみなされ、飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液によってクエンチした後、エーテル（３ Ｘ ２５０ ｍＬ）に抽出した。該エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して粗産物（４０ ｇ）を得、これをＭｅＯＨに溶解した。その後、濃ＨＣｌ（０．５ ｍＬ）を添加した結果、白色のエマルションが形成され、それを３時間撹拌させた。そして前記白色のエマルションをろ過し、純ジオールである化合物１８を１６ ｇ（収率５８％）得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、２００ ＭＨｚ）δ １．２６（ｂｒ ｓ、２４ Ｈ）、１．４１−１．４２（ｍ、４ Ｈ）、１．５１−１．６８（ｍ、４ Ｈ）、３．６５（ｔ、４ Ｈ、Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）。
（化合物１９）
対称ジオールである化合物１８（１１ ｇ、３８．５ ｍｍｏｌ）を窒素下乾燥シュレンクフラスコに添加し、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（７００ ｍＬ）を添加した。系を脱気し、前記フラスコを氷浴に入れた。注射器でジイソプロピルエチルアミン（６．８２ ｍＬ、４２．３ ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＭｓＣｌ（３．９６ ｇ、３４．４ ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加、混合液を１時間攪拌させた。反応を飽和ＮａＨ2ＰＯ4 溶液（３００ ｍＬ）で停止したのち、ＥｔＯＡｃ（３ Ｘ ３００ ｍＬ）で抽出した。その後、有機層を合わせ、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮してジオール、モノメシレート、ジメシレートの混合物１４ ｇを得た。ＮＭＲは、１：０．８ のＣＨ2ＯＨ：ＣＨ2ＯＭｓプロトンの混合を示した。次いで該混合物を乾燥ＴＨＦ（５００ ｍＬ）で溶解し、脱酸素して、それにＬｉＢｒ（３．５ ｇ、４０．２３ ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を一夜還流させ、その時点で反応を水（１５０ ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３ Ｘ ２５０ ｍＬ）で抽出した。その後、有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮してブロム化産物の混合物を得、それをその後フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ）によって精製し、化合物１９（３．１ ｇ、収率２５％）を白色粉末として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、５００ ＭＨｚ）δ １．２６（ｂｒ ｓ、２６ Ｈ）、１．３８−１．４６（ｍ、２ Ｈ）、１．５５（五重線、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、１．８５（五重線、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、３．４０３（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）、３．６６（ｔ． ２ Ｈ、Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）。
（化合物２０）
化合物１９（２．０１ ｇ、５．７３ ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れ、固体を試薬グレードのアセトン（１５０ ｍＬ）に溶解した。同時に、ジョーンズ試薬を、硫酸（４ ｍＬ）にＣｒＯ3（２．２５ ｇ、２２ ｍｍｏｌ）を溶解し、冷水を１０ ｍＬゆっくりと添加し、溶液を１０分間撹拌させることによって調製した。次いで、冷やしたジョーンズ試薬を５分間かけて丸底フラスコにゆっくりと添加した後、その溶液を１時間撹拌した。その結果得られたオレンジ色の溶液は数分以内で緑色になった。次に、混合液を水（１５０ ｍＬ）でクエンチし、エーテル（３ Ｘ １５０ ｍＬ）にて２回抽出した。その後、エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して化合物２０（２．０８ ｇ、収率９８％）を白色粉末として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、２００ ＭＨｚ）δ １．２７（ｂｒ ｓ、２６ Ｈ）、１．５８−１．７１（ｍ、２ Ｈ）、１．７７−１．９７（ｍ、２Ｈ）、２．３６（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）、３．４２（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７ Ｈｚ）。
（化合物２１）
乾燥したシュレンクフラスコにｔ−ブチルチオール（１１．３２ ｇ、１２５ ｍｍｏｌ）を添加し、ナトリウムから蒸留した乾燥ＴＨＦ（４５０ ｍＬ）に溶解した。溶液に窒素を通気することによって脱酸素したのち、フラスコを氷浴に入れた。ｎ−ＢｕＬｉのヘキサン類溶液（１．６ Ｍを７０ ｍＬ）を１０分間かけて注射器でゆっくりと添加した。この混合液を１時間撹拌させた後、化合物２０（５．５ ｇ、１６．２ ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を６０oＣで一夜還流させた。翌朝アリコートをワークアップし、ＮＭＲで分析し、反応は完了したとみなされた。反応をＨＣｌ（２ Ｍを２００ ｍＬ）でクエンチし、エーテル（３ Ｘ ２５０ ｍＬ）で抽出した。次に、エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過したろ液を濃縮して、産物である化合物２１を白色固体として得た（５ ｇ、収率９０％）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、２００ ＭＨｚ）δ １．２６（ｂｒ ｓ、２６ Ｈ）、１．３２（ｂｒ ｓ、９ Ｈ）、１．４８−１．７０（ｍ、４ Ｈ）、２．３５（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）、２．５２（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）。13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、２００ ＭＨｚ）δ ２４．６９、２８．３５、２９．０５、２９．２１、２９．２８、２９．３９、２９．５５、２９．８９、３１．０２（３Ｃ）、３３．９８、４１．７５、１７９．６０。
ＬＰＡのチオール化類似体を作製するための合成スキーム
本実施例に記載の合成アプローチによってチオール化ＬＰＡが調製される。次いでこのＬＰＡ類似体は、さらに担体、例えば、タンパク質担体と複合化することができ、そしてそれを動物に投与してＬＰＡに対する免疫原性反応を誘導することができる。このアプローチでは、有機化学および酵素反応の両方を使っており、その合成スキームは図３に示す。下記の合成の説明における化合物番号は、図３において番号をふった各構造を示す。
原料は、実施例２の化合物１５および鏡像異性的純粋なグリセロホショコリン（化合物２２）であった。これら二つの化学物質を組み合わせ、ＤＣＣを用いてエステル化を促進させることによってジアセチル化産物である化合物２３を得た。一つの合成処理の変形例では、その結果得られたジアシル化グリセロホスホコリンをまずホスホリパーゼＡ２で処理して、グリセロール骨格のｓｎ−２ 位置から脂肪酸を除去して化合物２４を生成した。この物質を別の酵素であるホスホリパーゼＤでさらに処理することによりコリンを除去し、化合物２６を形成した。また別の合成処理の変形例では、ホスホリパーゼＤ処理をホスホリパーゼＡ２処理の先に行って化合物２５を得、ホスホリパーゼＤで化合物２５を処理することによって化合物２６を得た。変形例のどちらを実施しても、同じ生成物であるホスファチジン酸誘導体、化合物２６が得られる。その後、化合物２６のｔ−ブチル保護基を、まず二硫化トリメチル・トリフレートを用いて化合物２７を生成することによって除去し、次いでジスルフィドを還元して所望のＬＰＡ誘導体である化合物２８を生成した。当業者なら理解されるように、実施例１に記載のニトロベンジルスルフェニル反応のシーケンスを用いて化合物２８を生成することもできる。
（化合物２３）
火力乾燥したシュレンクフラスコにチオエーテル酸、化合物１５（１０ ｇ、３５．８ ｍｍｏｌ）、化合物２２（グリセロホスホコリン-ＣｄＣｌ２ 複合体、４．２５ ｇ、８．９ ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（７．３２ ｇ、３５．８ ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２．１８ ｇ、１７．８ ｍｍｏｌ）を添加した後、フラスコを真空にして窒素を充填した。最小量の脱気した乾燥ＤＣＭを添加したところ（１００ ｍＬ）、濁った混合液になった。フラスコにホイルを被せ、ＴＬＣ（シリカ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ＝１０：５：１）により完了するまで攪拌させた。化合物１６は不溶性のため、その消失をＴＬＣによりモニターすることはできなかったが、産物のスポットＲｆ ０．１の強度が増加しないと判断された時点で反応を終了させた。これには通常３、４日間かかり、ＤＣＣおよびＤＭＡＰを更に添加する必要がある場合もある。反応が完了したら、反応混合液をろ過してろ液を濃縮し、黄色油を得、それを上記の溶媒系を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、（ＣＨ３）３Ｎ部分、−ＣＨ２ＳｔＢｕ部分、-ＣＨ２ＣＯＯ部分のピークの積分を比較した計算によると化合物２３とモノアシル化産物の割合が５対１である混合物を含んでいる透明ワックスを３．６ ｇ得た（収率５０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）による油の分析では、Ｍ＋Ｎａ+ ＝ Ｃ40Ｈ80ＮＮａＯ8ＰＳ2 + ８２０．４９６０として計算した場合、顕著なイオンがｍ／ｚ ８２０．４９７２に得られた。
Ａ．合成変形例１：ホスホリパーゼ−Ａ２による処理
（化合物２４）
上記化合物２３とモノアセチル化産物の混合物（３．１ ｇ、３．９ ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ2Ｏ（４００ ｍＬ）とメタノール（３０ ｍＬ）に溶解した。ホウ酸塩緩衝液（１００ ｍＬ、ｐＨ ７．４ ０．１Ｍ、０．０７２ ｍＭの塩化カルシウム）、次いでホスホリパーゼＡ２（ハチ毒由来、１３０ 単位、シグマ）を添加した。得られた混合液を１０時間攪拌させ、その時点で、原料（Ｒｆ ＝ ０．７）の欠如と新しいスポット（Ｒｆ ＝ ０．２）の発現がＴＬＣ（シリカ、ＭｅＯＨ：水＝４：１-前記溶媒系ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ＝１０：５：１は効果なし）によって確認された。有機層および水層を分別し、水層をエーテル（２ ｘ ２５０ ｍＬ）で洗浄した。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（２：１、２ ｘ ５０ ｍＬ）の混合液によって、水層から産物を抽出した。その後、回転蒸発により有機層を濃縮し、産物を白色ワックス（１．９ ｇ、収率８６％）として得、ＮＭＲによって純産物であることが確認された（化合物２４）。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ ＭＨｚ）δ １．２５−１．２７（ｂｒ ｓ、１２ Ｈ）、１．３１（ｓ、９ Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ、２ Ｈ）、１．５２−１．６０（ｍ、４ Ｈ）、２．３１（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、２．５１（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、３．２８（ｂｒ ｓ、９ Ｈ）３．２５−３．３３（ｂｒ ｓ、２ Ｈ）、３．７８−３．８６（ｍ、１ Ｈ）、３．８８−３．９６（ｍ、２ Ｈ）、４．０４−４．１０（ｍ、２ Ｈ）、４．２６−４．３４（ｍ、２ Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）によるワックスの分析では、顕著なイオンが ｍ／ｚ ５５０．２９３６に、計算ではＭ＋Ｎａ+ ５５０．２９４３(Ｃ24Ｈ50ＮＮａＯ7ＰＳ2 +）、および ｍ／ｚ が５２８．３１１５に、計算ではＭＨ+ ５２８．３１２４(Ｃ24Ｈ51ＮＯ7ＰＳ2 +）が得られた。
元素分析値。Ｃ２４Ｈ５０ＮＯ７ＰＳ ＋ ２ Ｈ２Ｏ（５６３．７３）としての計算値：Ｃ、５１．１３；Ｈ、９．６６；Ｎ、２．４８。実測値：Ｃ、５０．９０；Ｈ、９．３７；Ｎ、２．７６。
（化合物２６）
リソ化合物２４（１．５ ｇ、２．７ ｍｍｏｌ）を ｓｅｃ−ブタノール（５ ｍＬ）とＥｔ2Ｏ（２００ ｍＬ）の混合液に溶解し、得られた白濁混合液を白濁がなくなるまで超音波処理した。緩衝液（２００ ｍＬ、ｐＨ ５．８、０．２ Ｍ ＮａＯＡｃ、０．０８ Ｍ 塩化カルシウム）、次いでキャベツ抽出液（サボイキャベツの抽出液（ホスホリパーゼ−Ｄを含有）８０ ｍＬ、タンパク質を９ ｍｇ／ｍＬ含有）を添加した。反応を１日間撹拌させ、ＴＬＣ（Ｃ１８ ＲＰ ＳｉＯ２、ＡＣＮ：水＝５：１）によって原料および産物をＲｆ＝０．３および０．０５でそれぞれモニターした。反応を完了させるために、必要に応じて追加のキャベツ抽出液（５０ ｍＬ）を添加し、反応をさらに１日間撹拌させた。このプロセスを必要に応じてさらに２回繰り返し、変換を完了させた。反応が完了したら、混合液を回転蒸発器で濃縮してエーテルを除去し、その後ＥＤＴＡ溶液（０．５ Ｍ、２５ ｍＬ）を添加し、産物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝５：４の混合液（３００ ｍＬ）に抽出した。有機層の濃縮、次いでＤＣＭおよびアセトンからの残分の再結晶化により純産物（０．９ ｇ、収率７５％）が得られた。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ ＭＨｚ）δ １．２５−１．２７（ｂｒ ｓ、１２ Ｈ）、１．３３（ｓ、９ Ｈ）、１．５２−１．６０（ｍ、４ Ｈ）、２．３４（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、２．５２（ｔ、２ Ｈ、Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）、３．６−３．８（ｂｒ ｓ、１ Ｈ）、３．８５−３．９７（ｂｒ ｓ、２ Ｈ）、４．０２− ４．１８（ｍ、２ Ｈ）。
（化合物２７）
保護されたＬＰＡ試料である化合物２６（０．１５０ ｇ、０．３４ ｍｍｏｌ）をメタノールで洗浄し、グローブボックス内のバイアルに添加した。その後これをＡｃＯＨ：ＴＨＦの混合液（１：１、１０ ｍＬ）に懸濁したが、１時間超音波処理した後でも完全に溶解することはなかった。その後、固体［Ｍｅ2ＳＳＭｅ］ＯＴｆ（０．１１４ ｇ、０．４４ ｍｍｏｌ）を添加した。これを１８時間撹拌させた。真空濃縮乾燥しつつ、アリコートを除去することによって反応をモニターし、硫黄と最も近くのＣＨ2 ピークの1Ｈ ＮＭＲ 交替を観察するために残分をＣＤ3ＯＤに再溶解または懸濁した。原料のピークが２．５２ ｐｐｍにあるのに対し、この時点で生成した非対称の二硫化物のピークは約２．７ ｐｐｍにあった。この材料（化合物２７）については、これ以上単離もキャラクテリゼーションもしなかった。
（化合物２８）
化合物２７が含まれている混合物を水（１００ μＬ）で、その直後にＰＭｅ３（０．１１ ｇ、１．４ ｍｍｏｌ）で処理した。３時間撹拌した後、溶媒を真空によって除去し、不溶性の白色固体を得た。メタノール（５ ｍＬ）を添加し、混合液を遠心分離にかけ、母液をデカントした。減圧濃縮によってベージュ色の固体である化合物２８を１２０ ｍｇ（収率９１％）得た。化合物２８はチオール化ＬＰＡハプテンであり、ジスルフィド結合形成を介して担体、例えば、アルブミンまたはＫＬＨとコンジュゲートすることができる。化合物２８のキャラクテリゼーション：1Ｈ ＮＭＲ（１：１ ＣＤ3ＯＤ：ＣＤ3ＣＯ2Ｄ、５００ ＭＨｚ）δ １．２５−１．３５（ｂｒ ｓ、１２ Ｈ）、１．３２−１．４（ｍ、２ Ｈ）、１．５５−１．６（ｍ、４ Ｈ）、２．３４（ｔ、２Ｈ、Ｊ ＝ ７）、２．４７（ｔ、２Ｈ、Ｊ ＝ ８．５）、３．８９−３．９７（ｂｒ ｓ、２ Ｈ）、３．９８−４．１５（ｍ、２ Ｈ）、４．２１（ｍ、１Ｈ）。メタノールに溶解した試料の負イオンＥＳでは、ｍ／ｚ ＝ ３８５．１にて顕著なイオンが得られた。
Ｓ１Ｐに対する抗体
治療抗体の一種は、望ましくないスフィンゴ脂質と特異的に結合して、例えば、（１）心毒性効果、腫瘍形成効果、血管新生効果などの望ましくない効果を促進させるような望ましくない有毒性スフィンゴ脂質の有効濃度（および／またはそれらの代謝前駆体の濃度）を低下させ、（２）望ましくない、有毒性の、または腫瘍形成性の、または血管新生のスフィンゴ脂質と細胞受容体との結合を抑制し、および／またはかかる受容体との結合に利用可能なスフィンゴ脂質の濃度を低下させるなどの有益な効果を上げる。かかる治療効果の例として、抗Ｓ１Ｐ抗体を使用してインビボで利用可能なＳ１Ｐの血清中濃度を低下させることによって、Ｓ１Ｐの腫瘍形成効果や血管新生効果および心筋梗塞後の心不全、または癌、または線維形成性疾患における役割を阻害または少なくとも抑えることが挙げられるが、これに限らない。
チオール化Ｓ１Ｐ（図１の化合物１０）は、Ｓ１Ｐの必須の構造的特徴をＫＬＨなどの担体部分に架橋できる反応基を含むように合成されている。免疫化の前に、通常の手順を用いて、チオＳ１Ｐ類似体を、ＩＯＡまたはＳＭＣＣでタンパク質担体（例えば、ＫＬＨ）と架橋化することによってコンジュゲートした。ＳＭＣＣは一級アミン類およびスルフヒドリル基と反応する異質二機能性の架橋剤であり、好ましい架橋剤である。
スイスウェブスターまたはＢＡＬＢ−Ｃマウスを、注射当たり５０μｇの免疫原（ＳＭＣＣで促進したチオール化Ｓ１ＰとＫＬＨのコンジュゲート）で２カ月間かけて４回免疫化した。２回目、３回目、４回目の免疫化の２週間後に血清試料を採取し、直接ＥＬＩＳＡによって抗Ｓ１Ｐ抗体の存在についてスクリーニングした。その後、抗体の高力価を示した動物の脾臓を使用し、通常の融合手順でハイブリドーマを生成した。得られたハイブリドーマを密集するまで培養した後、ＥＬＩＳＡ分析のために細胞上清を回収した。免疫化した５５匹のマウスのうち、８匹に好適な反応がみられ、Ｓ１Ｐに反応する有意な抗体の血清中力価が示された。引き続き、確立されている手順に従い、これらのマウスの脾臓および骨髄腫細胞を用いて融合を行った。次に得られた１，５００個のハイブリドーマを直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、２８７個の陽性ハイブリドーマを得た。直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされたこれら２８７個のハイブリドーマのうち、１５９個が有意な力価を示した。次いで１５９個のハイブリドーマのそれぞれを２４ウェルプレートまで拡大培養した。その後、拡大培養したハイブリドーマの細胞馴化培地を再スクリーニングし、対象の抗体を分泌できる安定なハイブリドーマを同定した。力価が最も高い安定ハイブリドーマの６０個に対して競合ＥＬＩＳＡを行った。
スクリーニングした５５匹のマウスと１，５００個近いハイブリドーマのうち、最終的に真のモノクローナル抗体を生成するために必要とされる限界希釈クローン化を行うのに見合う性能特性を示したハイブリドーマを１つ発見した。このプロセスにより、４７個のクローンを得、その大半がＳ１Ｐ抗体生産について陽性とみなされた。これら４７個のクローンのうち、６つを２４ウェルプレートまで拡大培養した後、競合ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。残った陽性の４つのクローンから、Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の大量生産を開始するために１つを選んだ。これらの細胞をＳＣＩＤ マウスに注射し、得られた腹水をプロテインＡによって精製し（収率５０％）、内毒素量について分析した（＜３ ＥＵ／ｍｇ）。腹水生産の１回につき、５０匹のマウスに注射し、合計１２５ｍＬの腹水を得た。抗体のアイソタイプはＩｇＧ１ κとされ、ＨＰＬＣによって＞９５％純粋とみなされた。抗体は、１５０ ｍＭ 塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ ７．２）にて調製し、−７０℃で保存した。
陽性ハイブリドーマクローン（クローン ３０６Ｄ３２６．２６と命名）は、ＡＴＣＣに寄託されたが（寄託番号ＳＤ−５３６２）、Ｓ１Ｐに対する最初のマウスモノクローナル抗体（ＳｐｈｉｎｇｏｍａｂTM）である。さらに、クローンには、「ヒト化」抗体変異体の生成に使用しうる抗体の軽鎖と重鎖可変部、並びにキメラ抗体を作成するために必要となる配列情報も含まれる。
Ｓ１Ｐ特異的抗体についての血清および細胞上清のスクリーニングは、実施例１に記載のチオール化ＳＩＰ類似体（すなわち、化合物１０）を抗原として用いる直接ＥＬＩＳＡによって行った。一次インキュベーション中に５０ｕｌの試料（血清または細胞上清）を同量のＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で希釈したこと以外は下記のようにして通常のＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、０．１ mｇの化学合成した化合物１０を結合緩衝液（３３．６ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．５）にてＢＳＡとコンジュゲートしたものでコーティングした９６ウェルの高結合型ＥＬＩＳＡプレート（コスター）で行った。ＥＬＩＳＡプレートウェルにおいてチオール化Ｓ１Ｐ−ＢＳＡを３７℃で１時間、４℃で一夜インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）で４回洗浄し、ＰＢＳＴによって室温で１時間ブロッキングした。一次インキュベーション工程では、７５ｕＬの試料（測定するＳ１Ｐを含める）を、ＰＢＳＴで希釈した０．１ｕｇ／ｍＬの抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体 ２５ｕＬとインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。各試料につき３つのウェルで行った。室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル当たり１００ｕｌの０．１ｕｇ／ｍＬ ＨＲＰヤギ抗マウス二次（ジャクソン・イミュノリサーチ）と室温で１時間インキュベートした。その後プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン（シグマ）に１〜１０分曝露した。同量の１Ｍ 硫酸の添加によって検出反応を停止した。ＥＬ− Ｘ−８００ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ）を用い、試料の吸光度を４５０ｎｍで測定することによって求めた。
交差反応性については、以下の変更以外は上記のようにして競合ＥＬＩＳＡを行った。一次インキュベーションは、競合体（Ｓ１Ｐ、ＳＰＨ、ＬＰＡなど）およびビオチンコンジュゲート化抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体で行った。精製したモノクローナル抗体のビオチン化は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ピアス）を用いて行った。ビオチンの取り込み量は、キットの手順に従って求め、抗体当たり７〜１１個のビオチン分子の範囲であった。競合体は、以下の通り調製した。脂質のストックを超音波処理し、アルゴン下で乾燥した後、ＤＰＢＳ／ＢＳＡ ［１ｍｇ／ｍｌ 無脂肪酸 ＢＳＡ（カルバイオケム）のＤＰＢＳ（インビトロゲン １４０４０−１３３）溶液］に再構成した。精製した抗Ｓ１Ｐ モノクローナル抗体を必要に応じてＰＢＳ／０．５％トリトンＸ−１００で希釈した。競合体溶液と抗体溶液を競合体３部に対して抗体１部となるように混合した。ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン二次抗体（ジャクソン・イミュノリサーチ）を用いて信号を発生させた。
競合ＥＬＩＳＡのデータのもう一つの形態は、データが、抗Ｓ１Ｐ モノクローナル抗体では競合実験において添加した天然Ｓ１Ｐとチオール化Ｓ１Ｐ類似体（化合物１０）との区別ができないことを示していることである。また、データは、類似体が二重結合を全く含まず構築された（実施例３記載のＬＰＡ類似体も同様）ため、抗体がいずれの酸化物も認識しないことも示している。抗Ｓ１Ｐ モノクローナル抗体は、４８時間室温で放置させた二重結合含有の天然産物に対しても検討された。天然Ｓ１Ｐの逆相ＨＰＬＣを、以前報告された方法（Ｄｅｕｔｓｃｈｍａｎら、（２００３年７月）、
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、１４６巻（１）：６２−８）に従って行ったが、結果では、保持時間における差異は示されなかった。さらに、検討された各種脂質に対するモノクローナル抗体の結合特性の比較によれば、抗体が認識するエピトープには、天然Ｓ１Ｐの炭化水素鎖領域に含まれている二重結合が関与していないことが示されている。一方、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、スフィンゴシン基本骨格のアミノアルコールを含む領域と遊離リン酸である。遊離リン酸をコリンと連鎖した場合（ＳＰＣの場合と同様）、結合はいくらか減少した。アミノ基を脂肪酸とエステル化した場合（Ｃ１Ｐの場合と同様）、抗体結合はみられなかった。スフィンゴシンアミノアルコール骨格をグリセリン骨格で置換した場合（ＬＰＡの場合と同様）、そこではＳＩＰ特異的モノクローナルは結合を示さなかった。これらエピトープマッピングのデータは、Ｓ１Ｐには、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープが１つだけあり、このエピトープがＳ１Ｐの唯一の極性頭部基によって定義されていることを示す。
同様のＥＬＩＳＡ測定を用いた実験において、この抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体がタンパク質担体または架橋剤のいずれも認識しないことを確実にするために適した対照材料を評価した。例えば、ＥＬＩＳＡの下地材料としてのチオール化Ｓ１ＰをＢＳＡとコンジュゲートするのに際して、通常の架橋剤であるＳＭＣＣをＩＯＡに置き換えた。ＩＯＡを用いても抗体の結合特性はＢＳＡ−ＳＭＣＣ−チオール化Ｓ１Ｐを用いたときとほぼ同じであった。同じく、下地材料としてのチオール化Ｓ１Ｐと複合化されるタンパク質として、ＫＬＨをＢＳＡに置き換えた。この実験においても、抗体の結合特性において有意差はなかった。
結合動態学：受容体または他の部分とのＳ１Ｐの結合動態学には、脂質の性質のため従来から問題があった。多くの問題が脂質の不溶性に関連していた。ＢＩＡｃｏｒｅ測定において、これらの問題は、Ｓ１Ｐを直接ＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定することによって克服した。そして、抗体をそのチップの表面上に流し、吸光度の変化を測定することによって抗体のＳ１Ｐとの結合特性を求めた。抗体の二価結合性質を回避するために、Ｓ１Ｐでチップを低密度に覆った。さらに、チップを様々な密度（７、２０、１０００ ＲＵ）のＳ１Ｐでコーティングすると、抗体結合データは１：１の相互作用モデルにほぼフィットした。吸光度の変化は、３つの異なったＳ１Ｐ密度でモノクローナル抗体がＳ１Ｐと結合したことによるものであった。全体的に、モノクローナル抗体のＳ１Ｐに対する親和性の判定は、結合データの解析に一価または二価のいずれの結合モデルを用いたかによって、約８８ピコモル（ｐＭ）から９９ ｎＭと高かった。
Ｓ１Ｐに対するキメラモノクローナル抗体
本明細書で使用する「キメラ」抗体（または「免疫グロブリン」）という用語は、特定種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である１本の重鎖および／または軽鎖を含み、それと同時に残りの鎖は他種に由来するまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同であり、ならびにそれらが所望する生物活性を提示する限りにおいては、かかる抗体のフラグメントを意味する（Ｃａｂｉｌｌｙら、上記参照、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１（１９８４））。抗体 配列は、哺乳類、トリ、軟骨魚類も含むサカナを含め、脊椎動物または無脊椎動物に由来してもよい。
Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体を、特定のハイブリドーマ（ＡＴＣＣ貸金庫格納庫番号ＳＤ−５３６２）由来のマウス抗体の活性のあるＳ１Ｐ結合領域を含む可変部（Ｆｖ）をヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域と使用して生成した。Ｆｃ領域はヒト抗体のＣＬ、ＣｈＬ、Ｃｈ３ドメインを含む。方法は特に限られないが、キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭのいずれかのＦｃ領域からも生成することはできる。「ヒト化」抗体は、ＩｇＧ１のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域（例えば、Ｆｒ１、Ｆｒ４など）とマウス抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば ＣＤＲ １〜４）を移植することによって生成することができることを当業者らは理解されよう。
直接ＥＬＩＳＡ実験において、Ｓ１Ｐに対するキメラ抗体は、全部がマウス由来のモノクローナル抗体と同様の結合特性を示した。ＥＬＩＳＡは、化学合成したチオール化Ｓ１ＰをＢＳＡとコンジュゲートしたもの０．１ｕｇで覆った９６ウェルの高結合型ＥＬＩＳＡプレート（コスター）において、結合緩衝液（３３．６ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．５）中で実施した。チオール化Ｓ１Ｐ−ＢＳＡを３７℃で１時間、あるいは４℃で一夜、ＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。その後プレートをＰＢＳで４回洗浄し（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１０．１４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）、ＰＢＳＴで１時間室温にてブロッキングした。一次インキュベーション工程では、７５ｕＬの試料（測定するＳ１Ｐを含んでいる）を０．１ mｇ／ｍＬのＰＢＳＴに希釈した抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体２５ mＬとインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートの１ウェルに添加した。各試料を三つのウェルで実施した。室温で１時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル当たり１００ｕｌの０．１ｕｇ／ｍＬ ＨＲＰヤギ抗マウス２次（ジャクソンイミュノリサーチ）と室温で１時間インキュベートした。その後プレートをＰＢＳで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン（シグマ）に１〜１０分間曝露した。検出反応は、同量の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止した。試料の吸光度は、ＥＬ−Ｘ−８００ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ）を用いて４５０ｎｍで測定することにより求めた。
免疫化動物の血清またはハイブリドーマなどの抗体産生細胞の細胞馴化培地（すなわち、上清）において抗体価を測定する好ましい方法として、ＢＳＡなどのタンパク質担体に共有結合された標的リガンド（例えば、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡのチオール化類似体など）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることが挙げられる。
ＬＰＡに対するモノクローナル抗体
抗体の産生
天然のＬＰＡに対するポリクローナル抗体は、文献（Ｃｈｅｎ ＪＨら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ． ２０００年８月７日、１０（１５）：１６９１−３）で報告されているが、モノクローナル抗体は記載されていない。実施例４に記載されたアプローチと同様のアプローチを用いて、Ｃ−１２チオＬＰＡ類似体（実施例３の化合物２８）を、架橋薬剤としてＩＯＡまたはＳＭＣＣを用いた標準的な化学架橋によって反応性ＳＨ基を介してタンパク質担体（ＫＬＨ）と類似体を架橋して形成されるハプテンの重要な成分として、ＬＰＡに対するモノクローナル抗体を生成した。そのために、実施例４に記載の抗Ｓ１Ｐモノクローナル抗体の生成に関する方法を用いてマウスをチオＬＰＡ−ＫＬＨハプテン（この場合、チオール化ＬＰＡ：ＳＭＣＣ：ＫＬＨ）によって免疫化した。ＬＰＡ類似体に対して免疫化した８０匹のマウスのうち、ＬＰＡに対して最高の力価を示した５匹のマウス（ＳＭＣＣを用いてハプテンに使用したものと同様のＬＰＡ類似体（化合物２８）をＢＳＡとコンジュゲートし、ＥＬＩＳＡプレートに敷いたＥＬＩＳＡを用いて判定した）をハイブリドーマの発生段階に進ませるために選んだ。
標準的な技法によってこれら５匹のマウスの脾臓を収穫し、ハイブリドーマを生成した。つまり、１匹のマウスからハイブリドーマ細胞株（５０４Ａと命名）を得た。プレートに播いた５０４Ａ系のハイブリドーマ全部のうち、前記スクリーニングＥＬＩＳＡよる測定により６６個が陽性抗体産生を示した。
異質二機能性架橋薬剤を用いてチオール化ＬＰＡ類似体をＫＬＨに架橋したＬＰＡ類似体ハプテンに反応した２匹のマウスの脾臓から作成したハイブリドーマの細胞上清における抗体価を以下の表１に示す。これらのデータは、抗ＬＰＡ抗体が架橋剤、タンパク質担体のいずれにも反応しないことを示している。なお、データではハイブリドーマが、Ｓ１ＰではなくＬＰＡに対する抗体を産生することが示されている。
表１：ＬＰＡハイブリドーマ
Figure 2010530218
マウスにおける抗ＬＰＡモノクローナル抗体の発生は、ＥＬＩＳＡ（１２：０と１８：１ ＬＰＡとの直接結合および競合ＥＬＩＳＡ）によってモニターした。少なくとも半分の免疫化マウスにおいて有意な免疫反応が確認され、最高抗体価のマウス５匹を選び、脾臓融合後にハイブリドーマ細胞株の発生を惹起した。
これら５個の融合より生成した２０００個を超えるハイブリドーマ細胞株を初期スクリーニングした後、合計２９個の抗ＬＰＡ分泌ハイブリドーマ細胞株が１８：１ ＬＰＡに対して高い結合を示した。これらハイブリドーマ細胞株のうち、２４個をさらにサブクローニングし、ＥＬＩＳＡ検定用パネル上でキャラクテリゼーションを行った。陽性を保持した２４個のクローンより６つのハイブリドーマクローンを選び、さらにキャラクテリゼーションを行った。これらクローンの選択は、それらの優れた生化学的および生物学的特性に基づいて行った。マウスハイブリドーマ細胞株５０４Ｂ３−６Ｃ２、５０４Ｂ７．１、５０４Ｂ５８／３Ｆ８、５０４Ａ６３．１、５０４Ｂ３Ａ６(本明細書でそれぞれＢ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、Ｂ３Ａ６と呼ぶクローンに対応する）は、ＬＰａｔｈ Ｉｎｃ．代理の特許寄託を目的として、２００７年５月８日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ特許保管所、ユニバーシティー通り１０８０１番地、マナッサス、バーモント州２０１１０）が受領し、それぞれ寄託番号ＰＴＡ−８４１７、ＰＴＡ−８４２０、ＰＴＡ−８４１８、ＰＴＡ−８４１９、ＰＴＡ−８４１６を付与された。
本明細書で言及する全ての抗ＬＰＡ抗体およびそれらの部分は、これらの細胞株に由来したものである。
直接結合動態
６つの抗ＬＰＡモノクローナル抗体（Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、Ｂ３Ａ６、Ｄ２２）の１２：０および１８：１ ＬＰＡ（０．１ ｕＭ）に対する結合をＥＬＩＳＡによって測定した。精製したモノクローナル抗体の増加する６つの濃度（０〜０．４ ｕｇ／ｍｌ）を用いて滴定曲線よりＥＣ50値を計算した。ＥＣ50は、最大結合量５０ ％での抗体の有効濃度を表す。Ｍａｘは、最大結合（ＯＤ４５０として表される）を示す。結果を表２に示す。
表２−抗ＬＰＡモノクローナル抗体の直接結合動態
Figure 2010530218
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ バイオセンサ器を用いて、６つの最有力候補につき動態パラメータであるｋa（会合速度定数）、ｋd（解離速度定数）、ＫD（会合平衡定数）を求めた。この研究では、ＬＰＡをセンサー表面上に固定し、抗ＬＰＡモノクローナル抗体を溶液として表面上に流した。表のとおり、６つのモノクローナル抗体の全てが０．３４〜３．８ ｐＭの範囲の同様のＫD値および同様の動力学パラメータでＬＰＡを結合した。
抗ＬＰＡマウスモノクローナル抗体はＬＰＡに対して高親和性を示す
ＬＰＡは、１５０共鳴単位範囲の密度でセンサーチップに固定した。各モノクローナル抗体を希釈したものを固定化ＬＰＡ上に流し、会合相・解離相の非線形回帰により動力学定数を得た。誤差は、二通りの実験で少なくとも３回判定し、標準偏差として示した。結果を表３に示す。見かけの親和性は、ＫD ＝ｋa／ｋdにより求めた。
ｋa ＝ Ｍ-1ｓ-1単位の会合速度定数 ｋd ＝ ｓ-1単位の解離速度定数
表 ３− ＬＰＡに対する抗ＬＰＡモノクローナル抗体の親和性
Figure 2010530218
６つの抗ＬＰＡモノクローナル抗体の特異性プロファイル
ＬＰＡは、多くのアイソフォームに生物学的に活性があることが確認されており、モノクローナル抗体がそれらの全てをある程度認識することが、治療関連上好ましい。抗ＬＰＡモノクローナル抗体の特異性は、抗体に固定化された脂質の混合物に競合体脂質を添加した競合的検定を用いて評価した。
６つのモノクローナル抗体で競合ＥＬＩＳＡ検定を行い、特異性を検討した。１８：１ ＬＰＡをＥＬＩＳＡプレート上で捕捉した。各競合体脂質（１０ ｕＭまで）をＢＳＡ（１ ｍｇ／ｍｌ）・ＰＢＳで連続希釈した後、モノクローナル抗体（３ ｎＭ）とインキュベートした。次いで混合液をＬＰＡでコーティングしたウェルに移し、結合した抗体の量を二次抗体によって測定した。データを最大信号（Ａ450）に規格化し、抑制％として表した。検定は三通りで行った。ＩＣ50：最大半減抑制濃度、ＭＩ：最大抑制（阻害剤の非存在下の結合％）、−−−：抑制が弱いため推測なし。抑制が高いという結果になった場合は、抗体が競合体脂質を認識しているということを示す。表４に示すように、全ての抗ＬＰＡモノクローナル抗体が各種ＬＰＡアイソフォームを認識した。
表４． ６つの抗ＬＰＡモノクローナル抗体の特異性プロファイル
Figure 2010530218
興味深いことに、抗ＬＰＡモノクローナル抗体は、１２：０（ラウリル）、１４：０（ミリストイル）、１６：０（パルミトイル）、１８：１（オレオイル）、１８：２（リノレオイル）、２０：４（アラキドノイル）のＬＰＡを区別することができた。ＥＣ50の順番は、不飽和脂質では１８：２＞ １８：１＞２０：４、飽和脂質では１４：０＞１６：０＞１８：０であった。最終的な薬物の発生には特異性が高い方が望ましい。ジステアロイルホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、Ｓ１Ｐ、セラミド、セラミド−１−リン酸などのＬＰＡ関連生物脂質の結合について、抗ＬＰＡモノクローナル抗体の特異性を評価した。６つの抗体のいずれも、ＬＰＡの直接の代謝前駆体であるジステアロイル ＰＡおよびＬＰＣに対する交雑反応性を示さなかった。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体の抗癌作用
癌細胞増殖
ＬＰＡは、ＧＰＣＲ受容体を介するＧi、Ｇq、Ｇ12/13の刺激および下流の情報伝達現象の活性化による細胞の残存および増殖を支援する強力な成長因子である。細胞株を、それらのＬＰＡ（０．０１ ｍＭ〜１０ ｍＭ）に対する増殖性応答について検討した。細胞増殖は、ケミコン社（テメクラ、カリフォルニア州）の細胞増殖分析キット（Ｐａｎｃ−１）、ピアス社のＣｅｌｌ−Ｂｌｕｅ力価（Ｃａｋｉ−１）によって分析した。各データ点は、３つの独立実験の平均とした。ＬＰＡは、ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）、Ｐａｎｃ−１（膵癌）、Ｃａｋｉ−１（腎癌細胞）、ＤＵ−１４５（前立腺癌）、Ａ５４９（肺癌）、ＨＣＴ−１１６（結腸直腸腺癌）の細胞を含む７つのヒト由来腫瘍細胞株および１つのラット由来の腫瘍細胞株であるＲＢＬ−２Ｈ３（ラット白血病細胞）の増殖を濃度依存的に増加させた。腫瘍由来細胞は通常増殖の基礎レベルが高いが、ＬＰＡは、ほとんどの腫瘍細胞株において増殖をさらに増大させるようにみられた。選択したヒト癌細胞株においてＬＰＡ誘導性増殖を抑制する能力について、抗ＬＰＡモノクローナル抗体（Ｂ７およびＢ５８）を検討した。ＬＰＡによる増殖誘導の増加は、抗ＬＰＡモノクローナル抗体の添加によって抑制されることが確認された。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体は腫瘍細胞を化学療法剤に対して感作させる
臨床的に意義のあるレベルの化学療法剤であるパクリタキセル（タキソール）に曝露した場合の、卵巣腫瘍細胞をアポトーシスから保護するＬＰＡの能力を研究した。ＳＫＶＯ３細胞を１％ ＦＢＳ（Ｓ）、タキソール（０．５ ｍＭ）、＋／−抗ＬＰＡモノクローナル抗体によって ２４時間処理した。ＬＰＡは、タキソール誘導のアポトーシスからＳＫＶＯ３細胞を保護した。アポトーシスは、製造元（プロメガ）の推薦通りカスパーゼ活性の測定によって分析した。予測通り、ＬＰＡは、試験した癌細胞株のほとんどをタキソール誘導の細胞死から保護した。選択したＬＰＡ応答性細胞に抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０００を添加すると、細胞毒性化学療法剤によって誘導された死亡から細胞を保護するＬＰＡの能力が遮断された。さらに、抗ＬＰＡ抗体は、血清によってもたらされた保護力を除去することもできた。血清は約５〜２０ ｕＭのＬＰＡを含有していると推定される。タキソールは、ＳＫＯＶ３細胞においてカスパーゼ−３，７活性化を誘導し、細胞へ血清を添加することにより、細胞がアポトーシスから保護された。タキソール誘導のカスパーゼ活性化は、ＬＴ３０００を培地に添加することによって促進された。これは、血清中に存在するＬＰＡの選択的な抗体による中和によって、ＬＰＡによる保護および抗アポトーシス効果が除去されたことを示唆する。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体はＬＰＡによる腫瘍細胞の転移を抑制する
転移性癌の重要な特徴は、腫瘍細胞が接触阻害を逃れ、由来する組織から離れて移動することである。ＬＰＡは、複数の癌細胞タイプにおいて転移の可能性を促進させることが示された。従って、細胞単層スクラッチアッセイを用いて、ＬＰＡ依存性細胞移動に対する抗ＬＰＡモノクローナル抗体の遮断能を複数のヒト癌細胞株において試験した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。２４時間の飢餓後、ウェルの中央をピペットの先端でスクラッチした。従来から許容されているこの「スクラッチアッセイ」では、細胞がスクラッチ領域へ移動して創傷を閉鎖することによって、細胞単層に付いたスクラッチ創傷に対して画一的に反応する。移動および創傷閉鎖の進行は所望の時点で倍率１０ｘのデジタル撮影によってモニターした。細胞は未処理（ＮＴ）であったか、Ａｂ Ｂ７（１０ μｇ／ｍｌ）アイソタイプが一致した非特異性抗体（ＮＳ）（１０ μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でＬＰＡ（２．５ ｍＭ）によって処理された。未処置細胞では、スクラッチ後の単層縁の間に大きい間隙が残存していた。それに対してＬＰＡ処理細胞では、同時点で小さい間隙が残存しているだけで、わずかな細胞が間隙を超えて接触していた。ＬＰＡと抗ＬＰＡ抗体Ｂ７の両方で処理した細胞では、この時点で間隙がＬＰＡのみの処理より数倍大きいものの、未処置の対照細胞ほど大きくはなかった。これは抗ＬＰＡ抗体がＬＰＡ刺激による腎細胞癌（Ｃａｋｉ−１）細胞の移動に対して抑制効果を有することを示す。同様なデータがモノクローナル抗体Ｂ３、Ｂ５８でも得られた。このことは、元は転移性癌に由来する細胞株のＬＰＡによる移動を抗ＬＰＡモノクローナル抗体が減少させられることを示す。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体は腫瘍細胞からの腫瘍形成促進性サイトカインの放出を抑制する
ＬＰＡは、増殖促進性の腫瘍微小環境を提供し、血管形成を促進することによって癌の成立および進行に関与している。特にＩＬ−８およびＶＥＧＦなどの成長促進因子の増加が癌細胞において観察された。ＩＬ−８は、癌の進行および予後に強く関係している。ＩＬ−８は、新血管形成を促進し、好中球および内皮細胞の走化性を誘導することによって、癌において効果を発揮し得る。さらに、ＩＬ−８の過剰発現は、多数のヒト癌タイプにおいて薬抵抗性表現型の発生と相関していた。
非特異性抗体（ＮＳ）に対して３つの抗ＬＰＡモノクローナル抗体（Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８）を、インビトロでＩＬ−８産生を減少させるそれらの能力について試験した。Ｃａｋｉ−１細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。一夜の血清飢餓後、細胞を抗ＬＰＡモノクローナル抗体 Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８またはＮＳ（非特異性）の存在または非存在で１８：１ ＬＰＡ（０．２ ｍＭ）で処理した。２４時間後、抗ＬＰＡモノクローナル抗体 Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８の増加する濃度の存在下、ＬＰＡの存在または非存在で処理した腎癌細胞（Ｃａｋｉ−１）の培養上清を採取し、市販の ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ システムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いてＩＬ−８量について分析した。抗ＬＰＡモノクローナル抗体で前処理した細胞において、ＩＬ−８発現は用量依存的に（０．１〜３０ μｇ／ｍＬ モノクローナル抗体より）有意に減少したが、ＬＰＡは、未処理細胞においてＩＬ−８の発現を平均で１００％増加させた。他の血管形成促進因子であるＶＥＧＦについても同様な結果を得た。抗ＬＰＡモノクローナル抗体によるＩＬ−８放出の抑制は、膵細胞株Ｐａｎｃ−１などの他の癌細胞株においても確認された。これらのデータは、血管形成促進因子の放出の遮断が、抗ＬＰＡモノクローナル抗体の追加効果であり潜在的に重要なものであることを示唆する。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体はインビボで血管形成を抑制する
マトリゲルプラグアッセイを用いて、抗ＬＰＡモノクローナル抗体のうち１つ（Ｂ７）を、インビボで血管形成を軽減させるその能力について試験した。このアッセイでは、マウス腫瘍に由来する基底膜を含めた腫瘍残遺物の専有混合物であるマトリゲルを使用する。マトリゲル、またはその由来物である低成長因子型（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ、ＧＦＲ）マトリゲルを動物に皮下注射すると、固体化して「プラグ」を形成する。配置前に血管形成促進因子をマトリックスと混ぜておくと、プラグが血管内皮細胞に侵入され、最終的に血管が形成される。マトリゲルは、単独で、または組み換え成長因子（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）あるいは腫瘍細胞と混合して調製し、６週齢メスヌード（ＮＣｒ Ｎｕ／Ｎｕ）マウスの脇腹に皮下注射することができる。本実施例では、Ｃａｋｉ−１（腎癌）細胞をマトリゲル内に導入して、ＶＥＧＦおよび／またはＩＬ８および十分なＬＰＡ量を産生している。マトリゲル移植１日前から３日ごとに食塩水または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡモノクローナル抗体−Ｂ７で処理したマウス由来のＣａｋｉ−１細胞を５ｘ１０5個含有しているマトリゲルプラグを作成した。プラグを内皮ＣＤ３１について染色した後、プラグ内に形成された微小脈管構造の定量化を行った。定量化データは、３つのプラグより１断面当たり少なくとも１６個の視界の平均＋／−ＳＥＭで行った。ＣＤ３１の内皮染色による検定から、抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ７で処理したマウスのプラグは、食塩水で処理したマウスのプラグと比較して、顕著な血管形成の減少を示した。染色した血管の定量化では、食塩水で処理した動物と比較して、モノクローナル抗体Ｂ７で処理した動物のＣａｋｉ−１含有プラグにおいて血管形成が５０％以上低下したことが示された。これは、抗ＬＰＡモノクローナル抗体処理の結果としての腫瘍細胞血管形成における統計的に有意な低下である（食塩水に対するモノクローナル抗体Ｂ７についてスチューデントのＴ検定による判定はｐ＜０．０５）。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体は腎・膵異種移植片において腫瘍の進行を減少させる
抗ＬＰＡ抗体は、ＬＰＡ誘導による腫瘍細胞の増殖、移動、細胞死に対する保護、サイトカイン放出を減少させる効果を持つことが多数のヒト腫瘍細胞株において（上記で）確認された。今度は、モノクローナル抗体Ｂ５８、Ｂ７を腎膵癌の異種移植片モデルにおいて試験した。抗ＬＰＡ抗体アプローチの潜在的な抗腫瘍形成効果を示す予備的結果を以下に記述する。
標準的な手順を用いてＣａｋｉ−１およびＰａｎｃ−１ヒト腫瘍細胞を４週齢のメスヌード（ＮＣｒ Ｎｕ／Ｎｕ）マウスの左脇腹に皮下注射して腫瘍を生じさせた。Ｃａｋｉ−１の場合は１０日後、Ｐａｎｃ−１の場合は３０日後、固形腫瘍が形成された（〜２００ｍｍ３）時点で、マウスを投与群に無作為化した。処理は２５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡモノクローナル抗体または媒体（食塩溶液）を腹腔内投与することによって開始した。抗体は研究期間中３日ごとに投与した。処理は、Ｃａｋｉ−１腫瘍には２５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ５８、Ｐａｎｃ−１にはモノクローナル抗体Ｂ７、または食塩水だった。データは、Ｃａｋｉ−１の研究では７匹の食塩水処理マウスおよび６匹のＢ５８処理マウス、Ｐａｎｃ−１の研究では４匹の食塩水処理マウスおよび５匹のＢ７処理マウスの平均 ＋／−ＳＥＭだった。腫瘍の体積は、一日おきに電子ノギスで測定し、腫瘍体積を式Ｗ2ｘＬ／２によって求めた。引き続き、食塩水群において腫瘍が１５００ｍｍ3に達した後に動物を殺した。腫瘍の最終体積、重量を記録した。
この予備段階の実験において、腫瘍の体積を減少させる抗ＬＰＡモノクローナル抗体の能力は、腫瘍が約４００〜５００ｍｍ3に達した後で明らかとなった。その時点で、対照動物の腫瘍は増殖し続けたが、抗ＬＰＡモノクローナル抗体で処理した動物の腫瘍は両方の異種移植片モデルにおいて増殖の速度が遅かった。さらに、データから、食塩水で処理した動物の腫瘍重量と比較して、Ｃａｋｉ−１、Ｐａｎｃ−１腫瘍の最終腫瘍重量が抗ＬＰＡモノクローナル抗体によって減少したことも示された。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体は腫瘍を有する動物において循環している血管形成促進性サイトカインの量を変調させる
抗ＬＰＡモノクローナル抗体（Ｂ５８、Ｂ７）は、循環している血管形成促進性サイトカインの量にも影響を及ぼした。抗ＬＰＡモノクローナル抗体７（Ｐａｎｃ−１）で処理した動物では、抗体で処理したいずれの動物においてもインターロイキン８（ＩＬ−８）の血清中の量は検出できなかったのに対して、Ｐａｎｃ−１、Ｃａｋｉ−１の異種移植片においては、それぞれ８５日後、６３日後にＩＬ−８の血清中の量が検出可能だった。より重要なことに、腫瘍の大きさとＩＬ−８量の間には強い相関（ｒ＝０．９８）があった。さらに、Ｃａｋｉ−１腫瘍を持つ動物においてヒトＩＬ−８の血清中の量が、食塩水による処理（ｒ＝０．５５）と比較して、抗ＬＰＡモノクローナル抗体５８の処理により減少した（ｒ＝０．３４）。上記のごとく、循環しているサイトカインの量の低下は、腫瘍細胞自体からのサイトカイン放出が直接抑制されていることに起因しているとされている。これらのデータにより、抗ＬＰＡモノクローナル抗体には腫瘍の進行を減少させるとともに、循環している血管形成促進性化合物の量も減少させる能力があることが示されている。
抗ＬＰＡモノクローナル抗体はマウス転移モデルにおいて腫瘍進行を減少させる
腫瘍進行の重要な特徴の一つは、腫瘍は、転移して二次的な腫瘍結節を遠隔部位に形成する能力を持っているということである。本明細書に記載のインビトロ研究では、腫瘍細胞が接触阻害を逃れるように誘導して移動を促進するＬＰＡの能力を細胞運動についてのスクラッチアッセイによって実証した。これらの研究において、抗ＬＰＡモノクローナル抗体はＬＰＡの腫瘍増殖を促進する作動体も抑制した。インビボで腫瘍転移を抑制する抗ＬＰＡモノクローナル抗体の効果も評価された。腫瘍転移の現象を動物モデルにおいて模倣するのは困難である。多くの研究者は、腫瘍細胞を直接血流中に注射する「実験」転移モデルを用いる。
血管数が増加することは、循環に到達するまで細胞がより短い距離を移動することを意味するため、血管形成は転移において不可欠な過程である。抗ＬＰＡモノクローナル抗体が転移過程における複数の不可欠なステップを遮断できるという所見に基づくと、抗ＬＰＡモノクローナル抗体は、インビボで腫瘍細胞転移を抑制すると思われる。
(研究）
高転移性マウス黒色腫（Ｂ１６−Ｆ１０）を用いて、３つの抗ＬＰＡモノクローナル抗体が転移に及ぼす治療効果をインビボで検討した。このモデルは、オートタキシンのｃＰＡ系阻害剤に対して高度な感受性を示した。４週齢のメス（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０マウスの黒色腫腫瘍細胞（動物当たり５ｘ １０4個の細胞を１００ｕＬ）を尾静脈経由で注射した。マウス（１群１０匹）に２５ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＡモノクローナル抗体（Ｂ３またはＢ７のいずれか）あるいは食塩水を３日おきに腹腔内注射で投与した。１８日後、肺を採取して分析した。肺器官は、黒色腫細胞にとって好ましい転移部位であるため、転移結節について精密に検討した。膨張と固定を同時に行うために、気管を経由して１０％緩衝ホルマリンで肺を膨らませ、転移巣が小さくても組織学的検査によって検出可能になるようにした。肺を５つの葉に分けて、解剖顕微鏡下で腫瘍を大きさによって分類して（大 ≧５ ｍｍ、中 １−４ ｍｍ、小 ＜１ ｍｍ）数えた。肺を検査してみると、腫瘍数は抗体で処理した動物において明らかに減少していた。モノクローナル抗体Ｂ３で処理した動物については、大きい腫瘍が２１％、中程度の腫瘍が１７％、小さい腫瘍が２２％減少していた。スチューデントのＴ検定による統計分析では、食塩水に対してモノクローナル抗体Ｂ３で処理した動物における小さい腫瘍の数についてｐ＜０．０５を得た。
上記実施例で示したように、ＬＰＡの腫瘍形成効果は、腎癌（例えばＣａｋｉ−１）および膵癌（Ｐａｎｃ−１）の細胞株に広がっていることが分かった。ＬＰＡは、腫瘍細胞の増殖、移動、さらにＶＥＧＦやＩＬ−８などの血管形成促進因子および／または転移促進作用因子の放出を、両方の細胞株において誘導する。３つの高親和性・特異性モノクローナル抗ＬＰＡ抗体が、一連のインビトロ細胞アッセイおよび血管形成や転移のインビボ腫瘍モデルにおいて効力を示すことが実証された。
マウス抗ＬＰＡ抗体のクローン化―概要
ハイブリドーマ由来の３つのマウス抗体のうち一つの、活性のあるＬＰＡ結合領域を含む可変領域（Ｆｖ）とヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域とを使用して、ＬＰＡに対するキメラ抗体を生成した。Ｆｃ領域はヒト抗体のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含んだ。方法は特に限定するわけではないが、キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭのいずれかのＦｃ領域から産生することもできる。「ヒト化」抗体は、ＩｇＧ１のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域（例えば、Ｆｒ１、Ｆｒ４など）とマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ、例えば ＣＤＲ１〜４）を移植することによって生成することができることは、当業者なら理解されよう。
ＬＰＡに対するマウスモノクローナル抗体のクローン化の全体的な戦略は、各抗体の軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）両方のマウス可変ドメインをクローン化することからなる。遺伝子の共通配列は、定常領域フラグメントがγアイソタイプと一致し、軽鎖がκアイソタイプと一致することを示す。マウス可変ドメインは、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を一緒にクローニングした結果、キメラ抗体構築物を得た。
抗ＬＰＡ抗体の可変ドメインは、ヒト抗体定常領域を有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ｐＣＯＮベクター（ロンザ社、アレンデール、ニュージャージー州）からなる発現系にクローニングした。この発現系は、抗体遺伝子の定常ドメインおよび選択可能なマーカーであるＧＳを担持する発現ベクターからなる。グルタミン合成酵素（ＧＳ）は、グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを生合成する役目を果たす酵素である。両方の抗体遺伝子および選択可能なマーカーを担持するベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株にトランスフェクションすると、外来グルタミンがなくとも細胞が残存するのに十分なグルタミンが提供される。さらに、特異的なＧＳ阻害剤であるメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を培地に添加することにより内生ＧＳ活動を抑制し、ベクターによってＧＳ活動が提供される細胞株のみが残存するようにした。トランスフェクションされた細胞は、ＭＳＸの存在下、グルタミン不含培地で増殖する能力によって選択した。
ｐＣＯＮベクターの定常領域遺伝子は、ヒト末梢血細胞のゲノムＤＮＡから単離された。ベクターｐＣＯＮγ１ｆはＩｇＧ１ｆ定常領域の重鎖を含み、ベクターｐＣＯＮκ２はκ軽鎖の定常ドメインを含む。
軽鎖および重鎖の可変ドメインは、ＰＣＲによって増幅した。増幅したフラグメントは、中間ベクター（ｐＴＯＰＯ）にクローニングした。配列を確認した後、可変ドメインをそれぞれの定常ドメインと組み合わせた。軽鎖のヒト化可変ドメインはｐＣＯＮκ２にクローニングし、重鎖のヒト化可変ドメインはｐＣＯＮγ１ｆにクローニングした。クローン化の手順には、シグナルペプチド配列、翻訳開始を促進するためにＡＴＧ開始コドンの前方にコザック共通配列、５’切断部位であるＨｉｎｄＩＩＩを含むようにした上流プライマ設計が含まれた。下流プライマは、重鎖でＡｐａＩを、軽鎖でＢｓｉＷＩを３’切断部位として含むように設計した。
それぞれの定常ドメインと一緒に可変ドメインを含んでいるベクターを、哺乳類細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしてから３日後、上清を採取し、ＬＰＡ結合についてＥＬＩＳＡによって分析した。キメラ抗体の結合特性を表５に示す。「ＨＣ」と「ＬＣ」は、それぞれ重鎖、軽鎖の識別を示す。
表５：キメラ抗ＬＰＡ抗体Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８の結合特性
Figure 2010530218
表５を見ると、別々のハイブリドーマ（すなわち、別々のクローン）由来の軽鎖と重鎖を組み換えてキメラ分子とすることによって、ＬＰＡに対する抗体結合を最適化できることが分かる。
抗ＬＰＡ抗体可変領域のクローン化、発現、キャラクテリゼーション用の材料および方法
ハイブリドーマ細胞株の可変領域のクローン化
抗ＬＰＡハイブリドーマ細胞株のクローンをＤＭＥＭ（ＧｌｕｔａＭＡＸTM Ｉ、４５００ｍｇ／ＬのＤグルコース、プルビン酸ナトリウム入りダルベッコのダルベッコ変法イーグル培地、ギブコ・インビトロジェン、カルスバッド、カリフォルニア州、１１１−０３５−００３）、１０％ ＦＢＳ（無菌胎児クローンＩ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１Ｘ グルタミン・ペニシリン・ストレプトマイシン（ギブコ・インビトロジェン）で増殖させた。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ・ヒルデン）に基づいた手順を用いて全ＲＮＡを１０7個のハイブリドーマ細胞から単離した。ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテック）の製造元による手順に従ってＲＮＡを用いて第１鎖ｃＤＮＡを生成した。
表６に示したプライマを用いて免疫グロブリン重鎖の可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。重鎖可変領域のＰＣＲ設定は次の通りに行った。ＭＨＣＧ１（既存のＩｇＧ１定常領域プライマー）を全５個の抗体のグループ１およびグループ２のＶ領域プライマと組み合わせた。ＴＯＰＯ−ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ (R) キットと配列を用いて、各反応産物をｐＣＲ２．１(R)−ＴＯＰＯ(R) ベクター（インビトロジェン、カリフォルニア州カルスバッド）内に連結した。
同様に、表７に示したプライマを用いて免疫グロブリン軽鎖の可変領域（ＶＫ）を増幅した。軽鎖可変領域のＰＣＲ設定は次の通りに行った。２つの定常領域プライマをそれぞれ全５個の抗体のグループ１、グループ２、グループ３のＶ領域プライマと組み合わせた。ＴＯＰＯ−ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ (R) キットと配列を用いて、各反応産物をｐＣＲ２．１(R)−ＴＯＰＯ(R) ベクター内に連結した。
オリゴヌクレオチドのリストは、文献に従って作成した（Ｄａｔｔａｍａｊｕｍｄａｒ、Ａ．Ｋ．、Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｄ．Ｐ．、Ｈｏｏｄ、Ｌ．Ｅ．およびＯｓｍａｎ、Ｇ．Ｅ．（１９９１）再構成した任意のマウス免疫グロブリン可変遺伝子の高速クローニング法［Ｒａｐｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｙ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ］ 免疫遺伝学［Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ］ ４３（３）：１４１−５１、Ｃｏｌｏｍａ、Ｍ．Ｊ．、Ｈａｓｔｉｎｇｓ、Ａ．、Ｗｉｍｓ、Ｌ．Ａ．および Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．（１９９２）ポリメラーゼ連鎖反応によって生成された可変領域を用いた抗体分子発現用新規ベクター［Ｎｏｖｅｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ］ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５２（１）：８９−１０４、Ｃｏｒｏｎｅｌｌａ、Ｊ．Ａ．、Ｔｅｌｌｅｍａｎ、Ｐ．、Ｔｒｕｏｎｇ、Ｔ．Ｄ．、Ｙｌｅｒａ、Ｆ．およびＪｕｎｇｈａｎｓ、Ｒ．Ｐ．（２０００）単ヒト形質細胞およびＢ細胞のＩｇＧ ＶＨおよびＶＬ（Ｆａｂ）の増幅 ［Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ＶＨ ａｎｄ ＶＬ(Ｆａｂ）ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ］ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８（２０）：Ｅ８５．）。
表６：抗ＬＰＡモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインのクローン化用オリゴヌクレオチドのリスト
Figure 2010530218
表７：抗ＬＰＡモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインのクローン化に使用したオリゴヌクレオチドのリスト
Figure 2010530218
重鎖および軽鎖の可変領域を含有するＴＯＰＯ２．１クローンの配列決定を行い、ＣＤＲ領域を決定した。その後、ロンザ社の軽鎖発現ベクターｐＣＯＮκ２にクローニングするためのロンザ社提案のリーダー配列と切断部位を追加して、軽鎖の可変ドメインをＰＣＲで増幅した（５’ ＨｉｎｄＩＩＩ、３’ ＢｓｉＷＩ、ＬＣリーダー配列 ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＧＴ、配列番号 ４８）。その後、ロンザ社の重鎖発現ベクターｐＣＯＮγ１ｆにクローニングするためのロンザ社提案のリーダー配列と切断部位を追加して、重鎖の可変ドメインをＰＣＲで増幅した（５’ ＨｉｎｄＩＩＩ、３’ ＡｐａＩ、ＨＣリーダー配列 ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＡＴ ＴＣＴ、配列番号 ４９）。次いで最終産物を、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ）、消化およびライゲーションで定常領域を含有する軽鎖または重鎖発現ベクターに挿入した。
重鎖および軽鎖プラスミドでＯｎｅ Ｓｈｏｔ(R) ＴＯＰ１０ 化学的コンピテント細菌細胞（インビトロジェン）を形質転換させ、グリセリンにて保存した。大規模のプラスミドＤＮＡを製造元の記載通り（キアゲン、内毒素不含ＭＡＸＩＰＲＥＰTM キット）調製した。ＤＮＡサンプルをキアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔまたはＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ／Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて精製し、蛍光信号をそれらに対応するヌクレオ塩基配列に翻訳もするＡＢＩ ３７３０ｘｌ 自動シーケンサーを用いて配列決定した。プライマの５’末端と３’末端は、得られた配列が重なるように設計した。
可変領域のＰＣＲ増幅
インビトロジェン社のＰｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ・キットを１０Ｘ 緩衝液、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４（カタログ番号１１７０８−０１３）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（インビトロジェン、カタログ番号１８４２７−０１３）と共に使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応混合液は、１０Ｘ ｐｆｘ 増幅用緩衝液を５ｕｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰを１．５ｕｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４を１ｕｌ、オリゴヌクレオチド１を１．５ｕｌ、オリゴヌクレオチド２を１．５ｕｌ、テンプレート（〜５０ｎｇ）を０．５ｕｌ、Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼを０．５ｕｌ、無菌水を３８．５ｕｌ含んだ。Ｐｆｘを除いた全ての試薬を添加した後、サーマルサイクラーを開始する直前にＰｆｘを添加した。テンプレートを９５℃で３分間変性した後、９５℃で３０秒間、５℃の ＋／−勾配で５８℃においてアニーリング、６８℃で３０秒間の伸展のサイクルを３５回行った。６８℃で５分間最終伸展した後、試料を４oＣに保った。
可変領域をクローニングするための制限消化およびライゲーション反応
ライゲーション用、または分子配列を確認する前のクローニング確認用のフラグメントを調製するためにＤＮＡに対して制限消化を行った。制限酵素はすべてインビトロジェンまたはニュー・イングランド・バイオラボより購入したが、各酵素には必要な対応緩衝液がついてくる。ＤＮＡ（通常、陽性クローンの確認には５〜１０ｕｌ、連結するＤＮＡには２０〜２６ｕｌ）を酵素緩衝液、制限酵素０．５〜１．０ｕｌ、無菌水と混合した（合計３０ｕｌの反応）。酵素に適した温度で反応を１時間インキュベートした。ほとんどの酵素が３７℃で活性があったが、酵素よってはインキュベーション温度が室温から５５℃の範囲で変動することもあった。適切に制限酵素消化した後、ＧｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いてアガロースゲルや酵素、緩衝液などから挿入フラグメントおよびベクターを除去した。ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡ ２Ｘ連結緩衝液、５Ｘ ＤＮＡ希釈緩衝液、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含有するロシュ社のＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号１１６３５３７９００１）を用いて行った。最良の結果を出すために３：１の最終モル比でインサートとベクターを結合した。効率的なライゲーションのために挿入フラグメントを適切に希釈した。反応の５〜７ｕｌ を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０ 化学的コンピテント細胞を形質転換させた。
定量的ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（コスター、カタログ番号３３６１）を３７oＣで１時間、１Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）で希釈したウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）2フラグメント特異性抗体（ジャクソン、３１５−００５−０４７）で覆った。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０で１時間、３７℃でブロッキングした。一次インキュベーションでは、非特異性のマウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧ、分子全体（検量線に使用）、測定する試料を希釈したものをウェルに添加した。プレートを洗浄し、ウェル当たり１００ ｕｌの１：５０，０００希釈のＨＲＰコンジュゲート化抗ヒト（ジャクソン １０９−０３５−００３）を１時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジン（シグマ、カタログ番号Ｔ０４４０）で検出し、１ Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸを用いて吸光度（ＯＤ）を４５０ ｎｍで測定した。生データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに移して分析した。
直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（コスター、カタログ番号３３６１）を１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）に希釈したＬＰＡ−ＢＳＡで１時間、３７℃でコーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ ｍＭ ＫＣｌ、１０．１ ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．７６ ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−２０により室温で１時間または４ oＣで一晩ブロッキングした。試験する試料を０．４ ｕｇ／ｍＬ、０．２ ｕｇ／ｍＬ、０．１ ｕｇ／ｍＬ、０．０５ ｕｇ／ｍＬ、０．０１２５ ｕｇ／ｍＬ、０ ｕｇ／ｍＬに希釈して、各ウェルに１００ ｕｌ 添加した。プレートを洗浄し、ウェル当たり１００ ｕｌの１：５０，０００希釈のＨＲＰ抗ヒト（ジャクソン １０９−０３５−００３）を１時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、酵素反応をテトラメチルベンジジン（シグマ、カタログ番号Ｔ０４４０）で検出し、１ Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸを用いて吸光度（ＯＤ）を４５０ ｎｍで測定した。生データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに移して分析した。
一時的発現
２９３フェクチンを用い、培養に２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍｅｄｉａを用いて、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｆをベクターでトランスフェクションした。トランスフェクションは、５ μｇ／ｍＬで、１０6細胞／ｍＬの細胞密度で行った。トランスフェクションより３日後に、１１００ ｒｐｍ、２５℃、５分間の遠心分離によって上清を採取した。発現量は定量的 ＥＬＩＳＡによって定量し、結合は上記のように結合 ＥＬＩＳＡにおいて測定した。
常法でマウスのＶHおよびＶLドメインを配列決定した。５つのマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンについて、マウスのＶHおよびＶLドメインの核酸およびアミノ酸配列を表８〜１７に示す。各ＣＤＲＨ１アミノ酸配列について、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲは、示された１０アミノ酸の配列である。Ｋａｂａｔ配列の太字で示された５アミノ酸の部分は、標準のＣＤＲＨ１配列である。
表８：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＢ３におけるマウスＶＨおよびＶＬドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲ核酸配列
Figure 2010530218
表９：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＢ３におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲアミノ酸配列
Figure 2010530218
表１０：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＢ７におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲ核酸配列
Figure 2010530218
表１１：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＢ７におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲアミノ酸配列
Figure 2010530218
表１２：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＢ５８におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲ核酸配列
Figure 2010530218
表１３:マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＢ５８におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲアミノ酸配列
Figure 2010530218
表１４：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローン３Ａ６におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲ核酸配列
Figure 2010530218
表１５：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローン３Ａ６におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲアミノ酸配列
Figure 2010530218
表１６：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＡ６３におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲ核酸配列
Figure 2010530218
表１７：マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体のクローンＡ６３におけるマウスＶ H およびＶ L ドメインのマウスＬＰＡ ＣＤＲアミノ酸配列
Figure 2010530218
表１８〜２７にＶHおよびＶL抗ＬＰＡ抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
表１８ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＢ３の核酸配列
Figure 2010530218
表１９ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＢ３のアミノ酸配列
Figure 2010530218
表２０ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＢ７の核酸配列
Figure 2010530218
表２１ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＢ７のアミノ酸配列
Figure 2010530218
表２２ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＢ５８の核酸配列
Figure 2010530218
表２３ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＢ５８のアミノ酸配列
Figure 2010530218
表２４ リーダー配列および切断部位を追加したクローン３Ａ６の核酸配列
Figure 2010530218
表２５ リーダー配列および切断部位を追加したクローン３Ａ６のアミノ酸配列
Figure 2010530218
表２６ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＡ６３の核酸配列
Figure 2010530218
表２７ リーダー配列および切断部位を追加したクローンＡ６３のアミノ酸配列
Figure 2010530218
Ｌｐａｔｈ社のリードマウス抗体 ＬｐａｔｈｏｍａｂTM（ＬＴ３０００）：概要
マウス抗体クローンＢ７は、リード化合物として選ばれ、ＬｐａｔｈｏｍａｂTMと改名され、ＬＴ３０００としても知られている。上記のように、このマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体は、タンパク質で誘導体化したＬＰＡ免疫原によるマウス免疫化後のハイブリドーマ細胞株に由来している。有利な特性を持つハイブリドーマ細胞株が同定されたため、これを使用して、標準的なハイブリドーマ培養法を用いてモノクローナル抗体を産生した。
本出願者は、抗ＬＰＡ抗体に基づいたアプローチの有用性を確認するための包括的な一連の前臨床薬効試験を行った。抗体による細胞外ＬＰＡの中和（例えば有効濃度の低下）によって、ヒトにおける疾患の進行は顕著に低下すると考えられている。癌については、ＬＰＡを中和すると、腫瘍の増殖活動および腫瘍の増殖を支援するのに必要な脈管構造の成長が抑制される。さらに、近年の研究によると、多くの血管形成阻害剤が抗侵入性・抗転移性化合物として作用し、癌が原発腫瘍から遠距離の部位に広がることを軽減し得ることも示唆されている。線維症については、ＬＰＡを中和することによって、組織傷害後の異常な創傷治癒応答に伴う炎症および線維症が軽減し得る。したがって、ＬｐａｔｈｏｍａｂTMは以下のような複数の作用機構を含み得る。
- 腫瘍細胞の増殖、移動、化学療法剤に対する感受性への直接的作用
- 抗血管形成作用による腫瘍への間接的作用
- さらに、相乗的な血管形成促進成長因子の放出妨害および中和による腫瘍への間接的作用
- 線維芽細胞の増殖、移動、筋線維芽細胞表現型への形質変換および筋線維芽細胞によるコラーゲン産生への直接的作用
- 相乗的な血管形成促進性、炎症促進性、線維促進性の成長因子の発現および放出を防ぐことによる組織線維症への間接的作用
Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００の生物物理学的特性
Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００は、情報伝達性脂質ＬＰＡ高親和性（１〜５０ ｐＭのＫD）を持ち、さらに、ＬＴ３０００はＬＰＡに対して高い特異性を示すが、１００個を超える様々な生理活性脂質および生理活性タンパク質には結合親和性を示さない（その一部は構造的に類似している）。マウス抗体は、２本の同じ軽鎖と２本の同じ重鎖により構成され、合計分子量が１４４ ｋＤａの全長ＩｇＧ１ｋのアイソタイプ抗体である。生物物理学的特性を表２８にまとめた。
表２８：Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）の一般的特性
Figure 2010530218
ＬＰＡに対するＬｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００の強力かつ特異的な結合の結果、細胞外ＬＰＡの利用能性が低くなり、癌、血管形成、線維性関連の疾患に対する潜在的な治療効果が生じる。Ｌｐａｔｈｏｍａｂ／ＬＴ３０００で行った研究の中からいくつかを選んで以下に記載する。
癌および血管形成モデルにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂTM
ＬＰＡの多面的効果は、細胞外ＬＰＡの利用能性（有効濃度）が低くなったことにより（ｉ）原発腫瘍の増殖、転移、血管形成を減少させること、（ｉｉ）ＬＰＡの腫瘍に対する保護的な抗アポトーシス効果の作用を中和することを示唆している。ＬｐａｔｈｏｍａｂTM／ＬＴ３０００のＬＰＡとの強力かつ特異的な結合により、癌の前臨床モデルにＬＴ３０００のインビボ処理を行うと、様々な治療上の利点が生まれるであろうと仮定した。
各種インビトロ系およびインビボ系を使用して前臨床試験を行った結果、ＬｐａｔｈｏｍａｂTM／ＬＴ３０００（３日ごとに１０〜５０ ｍｇ／ｋｇの用量を投与した）には、以下のような各種作用機構に一致する活性プロファイルを示すことが確認された。
- インビボでの種々のヒト腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍増殖の抑制、
- インビトロでのＬＰＡに依存するヒト腫瘍および内皮細胞株の細胞増殖や浸潤の低下、
- インビボでの腫瘍血管形成の減少に伴う、ＩＬ６、ＩＬ８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ２、ＶＥＧＦを含む腫瘍形成・血管形成成長因子の循環量の低下、
- 転移する可能性の低下、
- 腫瘍細胞死に対するＬＰＡ誘導保護の中和。
インビトロモデルにおいて
- ＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞の増殖の低下、
- インビトロでのＰａｎｃ−１（膵臓）、ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３（卵巣）腫瘍細胞によるＩＬ−８、ＩＬ−６、ＶＥＧＦのＬＰＡ誘導放出の中和、
- アポトーシスに対してＳＫＯＶ３、Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞を保護するＬＰＡの作用の軽減（このことは、標準の化学療法剤と併用すると効力が増大することを示唆している）、
- 腫瘍によるＩＬ−８、ＩＬ−６、ＶＥＧＦのＬＰＡ誘導放出の中和、
- ＬＰＡ誘導の腫瘍細胞の移動、増殖、化学療法剤からの保護の抑制、
- 各種インビトロアッセイにおけるＬＰＡ誘導の内皮細胞管形成、移動、細胞死からの保護の中和。
インビボモデルにおいて
- ヌードマウスに移植した、ＳＫＯＶ３（卵巣、下記実施例を参照）、ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸、下記実施例を参照）、ＤＵ１４５（前立腺）、Ｂ１６ Ｆ１０（マウス黒色腫、下記実施例を参照）、ルイス肺癌細胞（下記実施例を参照）を含む複数の同所性および皮下ヒト腫瘍の進行の抑制、
- 皮下ＳＫＯＶ３異種移植モデルおよび前立腺ＤＵ１４５癌細胞における腫瘍関連血管形成の劇的な減少、
- マウスマトリゲルプラグアッセイにおけるｂＦＧＦ誘導およびＶＥＧＦ誘導の血管形成の中和（下記実施例を参照）、
- 眼のレーザー誘導ブルーフ膜傷害モデルにおける脈絡膜の新血管形成の減少（下記実施例を参照）。
マトリゲルモデルにおけるＬＴ３０００の抗血管形成効果
ＬＴ３０００を腹腔内（ＩＰ）注射でｑ２ｄ投与したところ、メスＣ５７ＢＬ／６マウスに移植したマトリゲルプラグのＦＧＦ誘導およびＶＥＧＦ誘導の血管形成が減少した。この研究は、サザン研究所（アラバマ州バーミンガム）で実施された。
（目的）
メスC57/BL6マウスに移植したＦＧＦ添加およびＶＥＧＦ添加のマトリゲルプラグの血管形成を遅延させるＬＴ３０００の抗血管形成効果を評価すること。
（試験デザイン）
マトリゲルのみ、あるいはｂＦＧＦ、ＶＥＧＦのいずれかを添加したもの（Ｎ＝マウス５匹／投与群）を各マウスの脇腹に皮下（ＳＣ）注射した。マトリゲルプラグを移植する前の日に、１０ ｍｇ／ｋｇのＬＴ３０００または食塩水のＩＰ投与による処理を開始した。処理は１日おきに（ｑ２ｄ）行った。殺してから、マトリゲルプラグを採取し、ＣＤ−３１染色による微小血管密度（ＭＶＤ）分析用に処理した。
（結果）
食塩水で処理したマウスと比較してＬＴ３０００で処理したマウスでは、ｂＦＧＦ添加およびＶＥＧＦ添加のプラグにおいて微小血管密度が約４１％低下した。この低下は、統計的に有意（ｐ＜０．０００１）でありＣＤ３１染色により組織学的に確認された。
（結論）
この研究は、全身投与したＬＴ３０００の抗血管形成効果によって、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦを添加したマトリゲルプラグの新血管形成が有意に減少したことを示す。
ＣＮＶモデルにおけるＬＴ３０００の抗血管形成効果
ＬＴ３０００を硝子体内注射により投与したところ、メスＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるレーザー誘導ブルーフ膜傷害モデルで脈絡膜の新血管形成が減少した。この研究は、ゲインズビル、フロリダ大学（Ｍａｒｉａ Ｇｒａｎｔ医師の研究室）で実施された。
（目的）
脈絡膜の脈管構造中の新血管形成を制限するＬＴ３０００の効力を研究すること。
（試験デザイン）
マウスをレーザー誘導のブルーフ膜破裂に付した。マウスを抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０００ ０．５ μｇ、アイソタイプが一致した非特異性モノクローナル抗体（ＮＳＡ）０．５ μｇ、同量の食塩水のいずれかで処理した。
処理は、レーザー破裂後、研究期間中週１回（ｑ７ｄ）硝子体注射して行った。ブルーフ膜の破裂から２〜４週間後にマウスを殺し、眼球を採取した。ＲＰＥ・脈絡膜・強膜複合体を神経網膜から単離し、ローダミンコンジュゲート化トウゴマ凝集素Ｉで染色することによりＣＮＶを評価した。判定はすべて動物当たり２〜３回の焼却について行った。
（結果）
ＮＳＡ処理したマウス（ｎ＝４）と比較して、ＬＴ３０００で処理したマウス（ｎ＝５）においてＣＮＶ傷害の血管形成が２１８５０１４±３７７０１０（平均ＣＮＶ体積±ＳＥＭ）から６９７９２４±９２１８２に減少した。これは、ＮＳＡ処理したマウスと比較してＬＴ３０００処理したマウスでは６８％の減少である（ｐ≦０．０５）。
（結論）
この研究は、抗ＬＰＡ抗体の硝子体内投与が、傷害に応答した脈絡膜組織中での新血管形成を有意に低下させることを示す。
ＬＴ３０００の抗腫瘍形成効果
多数のヒト腫瘍異種移植モデルおよびげっ歯類同系モデルにおける研究により、ＬＴ３０００が抗腫瘍形成活性を示すことを確認した。
Ａ．ヒトＳＫＯＶ３卵巣癌
ＬＴ３０００をＩＰ注射により投与した（１０ ｍｇ／ｋｇ ｑ３ｄ）ところ、ヌードＮｃｒマウスにおける同所性ＳＫＯＶ３卵巣腫瘍モデルにおける腫瘍の進行が大いに抑制された。この研究は、Ｌｐａｔｈ社によって実施された。
（目的）
メス無胸腺症ヌードマウスの腹腔に移植したヒト卵巣（ＳＫＯＶ３）腫瘍の進行を遮断するＬＴ３０００の効果を評価すること。
（試験デザイン）
ヌードマウスの腹腔内にＳＫＯＶ３腫瘍細胞を移植した。腫瘍が成立したら、ＩＰで、１０ ｍｇ／ｋｇのＬＴ３０００をｑ３ｄで、ＰＢＳ（媒体）をｑ３ｄで、毎日１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル（タキソール）を４日間のいずれかでマウスを処理した。５２日目の研究終了時、血清および腹水液を採取して、サイトカイン量について分析した。腫瘍を収穫して腫瘍の最終重量を量った。
（結果）
この研究は、ＳＫＯＶ３腫瘍の進行を減少させるＬＴ３０００の能力を示す（表２９）。１０ｍｇ／ｋｇのＬＴ３０００によって、腫瘍組織量は統計的に有意に減少（５０％）した。予想どおり、ＰＢＳで処理した動物と比較して、パクリタキセルで処理した動物は、腫瘍組織量に大きな減少（８８％）を示した。本実験において、腹腔内に腹水液が確認された動物の数は、ＬＴ３０００群（６／１４）の方がＰＢＳ対照群（１１／１３）より少なかった。さらに、ＰＢＳで処理した動物と比較して、ＬＴ３０００群において腹水の蓄積容積に統計的に有意な減少が確認された。また、媒体で処理した動物と比較して、ＬＴ３０００は、血管形成促進性サイトカインＩＬ−８、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦの血清中濃度の低下を誘導した。最後に、ＬＴ３０００は、腹水中ＭＭＰ２（ヒトおよびマウス）の総量を低下させた。Ｈ＆ＥおよびＣＤ３１染色のために選択した腫瘍切片を認定病理学者に分析させた。ＬＴ３０００処理群において組織分裂（網、骨格筋、リンパ節）の低下、微小血管密度の低下が確認された。
（結論）
本研究は、抗ＬＰＡ抗体の全身投与が、ＳＫＯＶ３腫瘍進行に有意な抑制をもたらすことを示す。
表２９：ＬＴ３０００の抗腫瘍形成活性を評価するためのマウスＳＫＯＶ３モデルについての所見の数値のまとめ
Figure 2010530218
Ｂ．ヒトルイス肺癌転移モデル
ＬＴ３０００をＩＰ注射（ｑ３ｄで２０ ｍｇ／ｋｇ）により投与したところ、ヌードマウスでの静脈内ルイス肺腫瘍における腫瘍進行が大きく抑制された。この研究は、Ｌｐａｔｈ社によって実施された。
（目的）
ＬＴ３０００は、インビトロで腫瘍細胞移動を低下させること、インビボで内皮細胞の浸潤や血管形成を有意に減少させることが確認されている。この研究の目的は、ルイス肺癌細胞を静脈内（ＩＶ）接種されたメスＮｃｒ（ｎｕ／ｎｕ）マウスの肺において腫瘍の転移を遅延させるＬＴ３０００の効果を評価することである。
（試験デザイン）
肺に播種して腫瘍を発現させるためにルイス肺癌細胞をヌードマウスにＩＶ接種した。２０ ｍｇ／ｋｇのＬＴ３０００または媒体（食塩水）による処理を同日に開始した。１９日目の研究終了までマウスをｑ３ｄで処理した。研究終了時に生存動物を殺し、体重および肺重量を（腫瘍組織量の測定として）記録した。
（結果）
結果を体重対肺重量の比（ＬＷ／ＢＷ）として表した。食塩水対照群と比較して、ＬＴ３０００で処理した動物において腫瘍組織量は２６．５％減少し、体重は１６．５％増加していた。ＬＴ３０００動物のＬＷ／ＢＷ比は、食塩水対照群のものより３６．５％低かった（表３０）。これらのデータを分析すると、ＬＴ３０００で処理したマウスと食塩水のみを注射した対照群では、肺重量、ＬＷ／ＢＷ比、体重に有意差があることを示された。
（結論）
この研究は、抗ＬＰＡ抗体の全身投与が、肺腫瘍組織量の減少、体重の増加、低いＬＷ／ＢＷ比という結果をもたらすこと示す。
表３０：ＬＴ３０００の抗腫瘍形成活性を評価するためのマウスルイス肺モデルについての所見の数値のまとめ
Figure 2010530218
Ｃ．ヒトＣＯＬＯ２０５結腸直腸癌
ＬＴ３０００をＩＰ注射（ｑ３ｄで３０ ｍｇ／ｋｇ）により投与したところ、ヌードＮｃｒマウスにおいて皮下ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸）腫瘍異種移植片における腫瘍進行が抑制された。この研究は、サザン研究所（アラバマ州バーミンガム）によって実施された。
（目的）
メスＮｃｒ（ｎｕ／ｎｕ）マウスに皮下（ｓｃ）移植して成立させたヒト結腸直腸（ＣＯＬＯ２０５）癌腫瘍の進行を遅延するＬＴ３０００単独の効果を評価すること。
（試験デザイン）
ＣＯＬＯ２０５腫瘍片をヌードマウスにｓｃ移植し、腫瘍を成立させた。その後マウスを３０ ｍｇ／ｋｇのＬＴ３０００、４０ ｍｇ／ｋｇのアバスチン（商標）、１５ ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル（商標）、媒体（食塩水）のいずれかで処理した。ＬＴ３０００は３日ごとに（ｑ３ｄ）ＩＰ注射により投与し、アバスチン（商標）は７日ごとに（ｑ７ｄ）投与し、パクリタキセルは５日間毎日（ｑ１ｄｘ５）ｉｐ注射により投与した。研究中の腫瘍の増殖は、腫瘍を３軸に沿って測定し、重量を計算することによってモニターした。
（結果）
食塩水で処理した動物の腫瘍と比較して、ＬＴ３０００は有意に（ｐ＜０．０１２）腫瘍進行を２４％抑制した。研究終了時に、ＬＴ３０００は腫瘍の最終重量を低下させるのにアバスチンと同様の（ｐ＜０．００２）効果を示した（それぞれ３２％対２４％の減少）。陽性対照であるパクリタキセルは、すでに定着していた腫瘍を除去した。
（結論）
この研究は、抗ＬＰＡ抗体の全身投与によってＣＯＬＯ２０５腫瘍細胞の腫瘍進行が抑制できることを示唆した。
表３１：ＬＴ３０００の抗腫瘍形成活性を評価するためのマウスＣＯＬＯ２０５異種移植モデルについての所見の数値のまとめ
Figure 2010530218
Ｄ．同種移植黒色腫転移モデル
このモデルは、ＬＴ３０００を単独で５０ ｍｇ／ｋｇ 、ｑ３ｄで腹腔内注射により投与した処理に対するマウス黒色腫Ｃ５６Ｂｌ／６マウスの応答を測定した。この研究は、Ｌｐａｔｈ社により実施された。
（目的）
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０によって誘導された肺転移の進行を減少させるＬＴ３０００の効果を評価すること。
（試験デザイン）
Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞の懸濁液をＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より静脈内（ＩＶ）注射した。無作為化した後、動物を２群に分けて媒体（食塩水）または１０ｍｇ／ｋｇのＬＴ３０００をＩＰによってｑ３ｄで投与することによって処理し、細胞接種日を開始した。２０日後、動物を殺して、心臓穿刺により血漿試料を採取し、肺を単離した。肺の最終重量を量り、体重と相関させた。また、各動物の腹腔および器官（肝、胃、卵巣、腸など）も転移病巣の存在について分析した。
（結果）
表３２に示すように、食塩水で処理したマウスに対し、ＬＴ３０００で処理したマウスでは肺の転移容積が２７％減少した。
（結論）
この研究は、抗ＬＰＡ抗体の全身投与によってＢ１６−Ｆ１０肺転移の低減をもたらすことができることを示す。
表３２：ＬＴ３０００の抗転移活性を評価するためのマウス黒色腫モデルについての所見の数値のまとめ
Figure 2010530218
肺線維芽細胞におけるＬｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）の抗線維症活性
細胞培養および試薬
ＷＩ−３８ヒト肺線維芽細胞はＡＴＣＣ（バーモント州マナサス）より購入した。肺線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ 単位／ｍｌ）を添加した最小必須培地において３７0Ｃ、５％ ＣＯ2で保持した。a平滑筋アクチン（a−ＳＭＡ）およびＦＡＫ Ｙ３９７抗体はシグマ（ミズーリ州セイントルイス）より購入した。ＬＰＡはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバマ州アラバスター）より購入し、製造元の勧告に従って調製した。
ＰＣＲ
ＲＮＡ分離用に、単一のコンフルエントになったＴ１５０フラスコよりトリプシンを用いて細胞を取り出し、遠心によってペレット化して−８０oＣで凍結した。全ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）を用いて製造元の動物細胞における全ＲＮＡ単離手順に従い実施した。つまり、ＲＴ−ＰＣＲ用Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン、カリフォルニア州カルスバッド）を用い、製造元の手順に従ってランダムヘキサマーを第１鎖プライマーとして用いて、２マイクログラムの全ＲＮＡを使用して第１鎖ｃＤＮＡを作成した。ＬＰＡ1-3受容体用のオリゴを用いて２マイクロリッターの第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、各反応においてＧＡＰＤＨをコントロールとした。ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン、カリフォルニア州カルスバッド）を用いて設定した。その後ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロマイド用フィルターとＵＶＰ ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＥｐｉＣｈｅｍｉ3 Ｄａｒｋｒｏｏｍ（ＵＶＰ Ｉｎｃ、カリフォルニア州アップランド）を用いて撮影した。
細胞増殖、コラーゲン産生、細胞に基づいたＥＬＩＳＡによるα−ＳＭＡ発現
肺線維芽細胞を５ｘ１０3細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに一晩播いた。播いた細胞を４８時間基本培地（最小必須培地、０．１％脂肪酸フリーＢＳＡ、１００単位／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシン）で血清不足にした後、基本培地のみ（対照）または指示された濃度のＬＰＡを含んでいる基本培地で７２時間刺激した。細胞増殖は、製造元の手順に従ってＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ 細胞増殖アッセイ（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して測定した。吸光度は、ＯＤ４５０で測定し、データは対照に対する変化の倍数によって表した。吸光度の測定は４回実施した。コラーゲン産生については、Ｉ型コラーゲンのＣ末プロペプチド（ＰＩＣＰ）の馴化培地での濃度を、ＰＩＣＰ酵素免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）キット（タカラバイオケミカルズ、大阪、日本）によって製造元の手順に従って測定した。α−ＳＭＡ発現については、前記の｛Ｍｉｃｅｒａ、２００５ ＃８０９３｝のようにして細胞に基づいたＥＬＩＳＡを実施したが、以下の変更を加えた。細胞を１０％中性緩衝ホルマリンにて固定し、ＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００で透過化して、内生ペルオキシダーゼを０．３％ Ｈ2Ｏ2でクエンチした。細胞単層をＰＢＳ／１０％ ＦＢＳでブロッキングした後、α−ＳＭＡに対する一次抗体をＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈（１：１０００ 希釈）して細胞と４oＣで一晩インキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、プレートをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈（１：１０００ 希釈）したＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体と室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＴＭＢ比色溶液に１〜３分間インキュベートした。同量の１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を用いて反応を中止し、吸光度をプレートリーダーにより４５０ ｎｍで読み取った。細胞増殖、コラーゲン生成、α−ＳＭＡ発現のアッセイはすべて３回ずつ実施した。
細胞移動
肺線維芽細胞を１．５ ｘ １０4細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに一晩播いた。播いた細胞を２４時間、基本培地（最小必須培地、０．１％脂肪酸フリーＢＳＡ、１００単位／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシン）で同期化させた。０時間の時点で細胞をｐ２００ピペットチップで各ウェルの中央に沿ってスクラッチし、最少培地で洗浄し、処理する前に撮影した。その後細胞を濃度０．１〜１０ μＭのＬＰＡ（Ｃ１８：１）または陽性対照（１０％ ＦＢＳ）で処理した。５％ ＣＯ2インキュベーターにおいて細胞を３７oＣで１７時間刺激した。１７時間処理した後、再度撮影し、写真を同サイズに調節して０時間と１７時間でのスクラッチの幅を測ることによって傷の閉鎖率（％）を求めた。
ＬＰＡ1-3受容体の発現および肺内線維芽細胞内 肺線維芽細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析によってＬＰＡ1-3受容体の顕著な発現が明らかとなり、ＬＰＡ1、ＬＰＡ3受容体が最も高度に発現されていた。
ＬＰＡは肺線維芽細胞による増殖および移動を刺激する ＬＰＡは創傷治癒の制御に関与している。そのため、創傷の修復に寄与している細胞機構の２つである線維芽細胞の増殖および移動に対するＬＰＡの用量依存的な作用を検討した。ＬＰＡは線維芽細胞の増殖を用量依存的に刺激し、１０ μＭ ＬＰＡで最大の上昇が確認された。細胞移動に対するこのＬＰＡの作用は、インビトロ創傷治癒アッセイでも検討した。用量依存的な細胞増殖の上昇とは異なり、ＬＰＡは低い（０．１ μＭ）ＬＰＡ濃度で細胞移動を刺激するようであった。ＬＰＡ濃度を増加させると、細胞移動が用量依存的に基礎レベルまで低下することが確認された。このデータは、肺線維芽細胞の増殖に対するＬＰＡの濃度依存的作用と肺線維芽細胞の移動の間には反比例の関係があることを示唆している。
ＬＰＡは肺線維芽細胞による筋線維芽細胞形質転換およびコラーゲンＩ型産生を促進する
肺でＬＰＡの線維化促進性の可能性を評価するために、肺線維芽細胞による筋線維芽細胞形質変換およびコラーゲンＩ型産生のＬＰＡを介した刺激を、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学を用いて検討した。ＬＰＡはα−ＳＭＡ（筋線維芽細胞マーカー）の発現およびプロコラーゲンＩ型Ｃ末ペプチド（ＰＩＣＰ）の放出を用量依存的に促進し、１０ μＭ ＬＰＡ濃度で最大の刺激をもたらした。さらに、ＬＰＡは、α−ＳＭＡの細胞骨格張力繊維への取り込みを増加させ、接着斑キナーゼ（ＦＡＫY397）のリン酸化を刺激するが、これらは、筋線維芽細胞形質変換に必要とされる現象である。一貫して、これら形質変換した細胞は、ＬＰＡ刺激後にコラーゲンＩ型の細胞発現の増加も示しており、このことは線維化促進性の細胞表現型へ形質変換したことを示す。
ＬＴ３０００は動物においてブレオマイシン傷害後の炎症および線維症を減少させる
動物
２０〜２５ ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスをハーランより入手した。Ｂｉｏｑｕａｎｔ社（カリフォルニア州サンディエゴ）の研究機関における動物の管理および使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＩＡＣＵＣ）に従って動物を処理した。マウスを空調された１２時間の明暗周期の部屋に入れ、標準的な固形飼料と水道水へ自由にアクセスできるようにした。動物には通常の固形飼料（オートクレーブ済み）と水の不断給を提供した。
ブレオマイシンによる肺傷害の誘導
ケタミン（２０ ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（２ ｍｇ／ｋｇ）の混合でマウスに麻酔をかけ、２０ゲージの供給針を介して食塩水（０．９％）のみ、またはブレオマイシン（２．５ ｍｇ／ｋｇ）含有食塩水の気管内滴下（容積５０ μｌ）を１回行った。１４日間後にマウスを殺した。
実験群
マウスを無作為的に次の投与群に割り当てた。（ｉ）食塩水。マウスに食塩水を気管内（ＩＴ）滴下して、無菌ＰＢＳ（媒体）のｉ．ｐ注射を打った。（ｉｉ）ＢＬＥＯ群。マウスにブレオマイシンをＩＴ滴下して、無菌ＰＢＳ（媒体）のｉ．ｐ注射を打った。（ｉｉｉ）ＢＬＥＯ ＋ ２５ ｍｇ／ｋｇ群。マウスにブレオマイシンをＩＴ滴下して、ＬＴ３０００（２５ ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ注射を打った。（ｉｖ）２５ ｍｇ／ｋｇ群。マウスに食塩水をＩＴ滴下して、ＬＴ３０００（２５ ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ注射を打った。抗体処理はすべて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により２日ごとに行った。各処理の体重およびマウス死亡率に対する効果を研究期間中記録した。
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分離
マウスを殺した後、１ ｍｌの注射器に接続した２０ゲージの血管カテーテルでマウス挿管した。気管の周辺にナイロン糸を結ぶことによってカテーテルを固定した。肺を１．０ ｍｌの食塩水で一回洗浄した後、０．８ ｍｌの食塩水で再度洗浄した。洗浄液を合わせ、ＢＡＬＦを１２００ ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清を取り出し、後の分析用に−８０ oＣで凍結した。ペレットを０．３ ｍｌのＰＢＳ／２％ウシ胎児血清で再懸濁し、流動細胞計測法により細胞を分類して数えた。ＢＡＬＦ中のタンパク質量はＢＣＡタンパク質定量試薬（ピアス、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。
流動細胞計測法によるＢＡＬＦ細胞の分析
Ｔｒｕｃｏｕｎｔチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３４０３３４）を製造元の手順に従って用いて個々の炎症細胞集団を同定し、定量化した。つまり、単細胞の懸濁液を染色緩衝液（ＰＢＳ／２％ ＦＣＳ）で調製した。約３００ μｌの細胞懸濁液を１２ ｘ ７５ ポリプロピレンＴｒｕｃｏｕｎｔチューブに入れた。チューブを２５０〜３００ ｘ ｇ、４℃で５分間遠心分離にかけた。ピペットを用いてペレットを乱さないよう注意しながら液体を吸引した。各チューブに次のモノクローナル抗体を添加した。ＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ１６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５５４０７）、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５５３９７）、ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート化抗ＣＤ５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５５３５４）で３色カクテルを得た。抗体の量は製造元の指示に従った。チューブをボルテックスして蓋をしたバケツ内（暗所で）で氷上に約３０分間放置した。２ ｍｌの染色緩衝液を添加することによって懸濁液を洗浄した。懸濁液をボルテックスした後、２５０〜３００ ｘ ｇ、４℃で５分間遠心分離にかけて上清を削除した。工程６を２回繰り返した。その後ペレットを１ ｍｌの染色緩衝液で再懸濁し、個々の細胞集団を蛍光補助式細胞分得（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）分析によって分析した。ＦＡＣＳ分析については、染色した細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サンノゼ）を用いて１つのレーザー（４８８ ｎｍ アルゴン レーザー）と３つの検出器で流動細胞計測法により分析した。１０，０００個の細胞を収集し、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３ソフトウェアで分析した。
組織学的検討
肺を切除し、個々の葉に分離し、１０％緩衝ホルマリンにて室温で一晩固定した。個々の葉を３枚の水平切片に切断し、パラフィンに包埋した。葉は厚さ５ μｍに切断し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。切片はすべて光学顕微鏡（倍率１０ｘ）で観察し、線維症の重症度を前記したとおり（Ａｓｈｃｒｏｆｔら、（１９８８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ、４１：４６７−７０）Ａｓｈｃｒｏｆｔ法を用いて半定量的に評価した。つまり、各葉の水平切片における線維症の重症度を、０〜８の尺度でスコア化した。評価基準は以下の通りだった。程度０：正常な肺、程度１：肺胞壁または細気管支壁の極小線維性肥厚、程度３：構造に明確な損傷がない中等度の壁肥厚、程度５：肺構造に明確な損傷と線維性の帯または線維性の小塊の形成を伴う線維症の増加、程度７：構造の重度の歪みおよび大きい線維性領域、程度８：線維による視界の完全閉塞。各葉の個々の切片の値を平均し、すべての葉の値を平均することにより、各動物について代表的な線維症スコアを出した。
免疫組織化学
肺切片を各５分間のキシレン（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号９９００）洗浄３回によって脱パラフィン化した。スライドの再水和は、１００％アルコール（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８１０１）、９５％アルコール（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８２０１）、８０％アルコール（Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号８３０１Ｒ）の各５分間の一連のアルコール洗浄により実施した。再水和は、水道水の流水下、スライドを５分間洗浄することによって完了した。その後１３分間３％ Ｈ2Ｏ2（水にて３０％希釈、シグマ、カタログ番号Ｈ１００９）にて外来ペルオキシダーゼをクエンチした。水道水の流水下、スライドを１５分間洗浄することによってＨ2Ｏ2を削除した。一方、クエン酸緩衝液（１０ｍＭ クエン酸、ｐＨ ６．０（フィッシャー、カタログ番号Ａ９４０））を蒸し器（ブラック＆デッカー、Ｓｋｕ番号ＨＳ９００）に入れて４０分間９５℃に予熱した。抗原の回収には、スライドを予熱したクエン酸緩衝液に移し、蒸し器で３５分間９５℃で加熱した。引き続いて、スライドを５分間ＰＢＳ（セルグロ、カタログ番号２１−０４０−ＣＭ）にて２回洗浄した。α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）あるいは結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）に対してマウスＩｇＧベクタステインＡＢＣキット（ベクター社、カタログ番号 ６１０２）またはヤギＩｇＧベクタステインＡＢＣキット（ベクター社、カタログ番号 ＰＫ−６１０５）を製造元の手順に従って用い、スライドを染色した。緩衝液を必要とする工程のすべてにＰＢＳを使用した。製造元提案の手順に従ってアビジン・ビオチンブロッキングキット（ベクター社、カタログ番号 ＳＰ−２００１）をＡＢＣキットと併用し、内生ビオチン信号を遮断した。α平滑筋アクチンに対して誘導した一次抗体（シグマ、カタログ番号 Ａ２５４７）を１：５０００希釈したもの、またはＣＴＧＣを再度誘導した一次抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー、カタログ番号ｓｃ−１４９３９）を１：５０希釈したものを、指示に従って適用した。信号は、ペルオキシダーゼ基質キットＤＡＢ（ベクター社、カタログ番号 ＳＫ−４１００）を用い、生産者の指示通り調製し、スライドに２分間適用することにより検出した。スライドはｄｉＨ2Ｏで洗浄した。対比染色はヘマトキシリン（シグマ、カタログ番号ＨＨＳ３２）で３０秒間染色することにより実施した。スライドを水道水ですすぐことによりヘマトキシリンを除去した後、最初に水和用に使ったアルコールに対するキシレン類を逆にして脱水した。最後に、スライド当たり２０ μｌのパーマウント（フィッシャー、カタログ番号 ＳＰ１５−１００）を使用してスライドをガラス製のカバースリップでマウントした。
データ分析
試験は全データが揃うまでデータ収集・分析担当者全員に完全に盲検化されていた。データはＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて分析した。実験群間の差異の統計的有意性は、独立スチューデントｔ検定によって計算した。
結果
ＬＴ３０００はブレオマイシン傷害後の炎症および線維症を減少させる
マウスのブレオマイシンモデルを用いて、肺傷害後の肺炎症および線維症におけるＬＰＡの役割と、これらの作用を軽減する新規のモノクローナルマウスＬＰＡ抗体（ＬＴ３０００）の効果を検討した。ブレオマイシン滴下後のマウス肺の組織学的検討を行ったところ、肺胞中隔の肥厚、肺炎、肺実質の線維性閉塞など、肺組織への有意な損傷が明らかになった。ＬＴ３０００で処理したマウスでは、炎症、線維症の劇的な減少と正常な肺形態の保持が確認された。これらのマウスにおける肺炎症および線維症の半定量的分析を行ったところ、ＬＴ３０００処理をした場合、これらのパラメータにおいてそれぞれ５６％と４８％の低下が明らかになった。ＬＴ３０００単独で処理した健常マウスにおいては、炎症や線維症、正常な肺形態における変化は確認されなかった。
ＬＴ３０００はブレオマイシン肺傷害後のマウスにおいてＢＡＬ液の細胞充実度およびタンパク質量を減少させ、体重を維持する
組織の傷害度に合わせて、炎症細胞数は対照のほぼ２倍であり、ブレオマイシン滴下マウスのＢＡＬ液におけるタンパク質量は、約１０倍と有意に上昇した。対照およびブレオマイシン処理マウスの両方で、ＬＴ３０００の投与によりＢＡＬ液の細胞充実度が約 ９５％低下した。さらに、ＢＡＬ液中のタンパク質量はＬＴ３０００を投与されたブレオマイシン滴下マウスにおいて４０％低下した。対照マウスと比較すると、ブレオマイシン滴下マウスでは、肺傷害度と併せて、１６％の体重低下が１４日の時点で確認された。それに対して、ＬＴ３０００処理したマウスで処理したブレオマイシン滴下マウスの体重は対照との有意差を示さなかった。
ＬＴ３００はブレオマイシン傷害後の肺組織において大食細胞および筋線維芽細胞の密度を低下させる
肺炎症および線維症を減少させるＬＴ３０００の能力をさらに研究するために、マウス肺組織における大食細胞の浸潤および筋線維芽細胞の密度を検討した。同様に、α−ＳＭＡ染色により示される筋線維芽細胞の密度はブレオマイシン滴下マウスの線維性領域で増加していた。さらに、ＬＴ３０００処理により、ブレオマイシン滴下マウスの肺における筋線維芽細胞の密度も低下した。肺線維症および炎症に対する効果は、上述の方法を用いて、肺線維症（Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア）、炎症（炎症スコア）の半定量的評価に従って確認した。ＬＴ３０００処理によって、肺線維症および炎症はそれぞれ４８％、５６％低下した。
ＬＴ３０００は介入研究においてブレオマイシン傷害後の炎症および線維症を減少させる
上記実施例に概説した所見では、ブレオマイシン誘導肺線維症モデルにおいてＬＴ３０００の消炎性と抗線維性の両効果が示された。したがって、ブレオマイシン傷害後に肺線維症の進行に対するＬＴ３０００の予防能力または介入能力を評価するための追加研究を行った。この実験では、マウスをランダムで次の投与群に割り当てた（表３３）。（ｉ）食塩水。マウスに食塩水を気管内（ＩＴ）滴下して、無菌ＰＢＳ（媒体）のｉ．ｐ注射を打った。（ｉｉ）ＢＬＥＯ群。マウスにブレオマイシンをＩＴ滴下して、無菌ＰＢＳ（媒体）のｉ．ｐ注射を打った。（ｉｉｉ）予防群。マウスにブレオマイシンをＩＴ滴下して、ＬＴ３０００（５０ ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ注射をブレオマイシン滴下と同日から開始してｑ２ｄで６日間打った。（ｉｖ）介入群。マウスにブレオマイシンをＩＴ滴下して、ＬＴ３０００（５０ ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ注射をブレオマイシン滴下後から６日目に開始してｑ２ｄで打った。抗体処理はすべて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により行った。研究終了時（１４日目）に、マウスを殺し、ブレオマイシン誘導の肺炎症および線維症に及ぼすＬＴ３０００の効果を下記のように評価した。（ｉ）Ａｓｃｈｒｏｆｔらの方法（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ。１９８８ Ａｐｒ、４１（４）：４６７−７０）を用いて組織線維症をＨ＆Ｅ染色した肺切片において半定量的に評価した、（ｉｉ）流動細胞計測法を用いて肺洗浄液中の炎症細胞を測定した、（ｉｉｉ）ＢＣＡタンパク質定量試薬（ピアス、イリノイ州ロックフォード）を用いて肺洗浄液中のタンパク質量を評価した、（ｉｖ）ブレオマイシン滴下後１４日目に各マウスの体重を測定した。ブレオマイシン誘導肺炎症および線維症に及ぼすＬＴ３０００の効果の数値のまとめを表３４に示す。
表３３：投薬スケジュール
Figure 2010530218
表３４：病態生理学的所見のまとめ
Figure 2010530218
したがって、抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０００、Ｌｐａｔｈｏｍａｂ）は、広く受け入れられている肺線維症の動物モデルにおいて、予防的、介入的な両方の面で有効であることが確認された。これらの所見は、傷害後の細胞外基質生成および組織再構築における生理活性脂質ＬＰＡの著明な役割を示すものである。さらに、これらの研究でＬＰＡは、多くの疾患や器官系に関連している線維症の治療のための新規の治療ターゲットとされた。ＬＰＡに対するモノクローナル抗体は、線維症の治療のために臨床的に大きな可能性があると思われる。
ＬＴ３０００によるサイトカインおよび成長因子の変調
現在の標準治療となっている生検よりも低い侵襲性で線維症（特に肺および肝の線維症だがこれらに限定しない）をモニターできる方法が長い間望まれていた。研究者らは、疾患のマーカーのモニタリングにより、疾患の進行および／または治療効果をより低い侵襲性でモニターできるようにするために、サイトカインおよび成長因子の循環量と線維症の程度との相互の関連付けを試みた。Ｍｏｒａｉｓら、（２００６）Ｍｅｍ Ｉｎｓｔ Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ、Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ、第１０１巻（付録Ｉ）：３５３−３５４を参照。線維症を検出する方法は、ＬＰＡ量と一つ以上の線維形成マーカー（例えば、サイトカインまたは成長因子）の量を相互に関連付けることにより、患者試料であり、臨床の場において線維症をモニタリングするのに有用であると思われる。
ＬＴ３０００の抗炎症効果をさらに研究するため、経路特異的サイトカインタンパク質アレイ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ社、ジョージア州ノークロス）を使用してサイトカインおよび成長因子の量をＢＡＬ液において評価した。ＬＴ３０００による最大レベルの調節が示された炎症性サイトカインに関する予備的（ｎ＝３）所見を表３５にまとめた。
表３５：ＢＡＬ液中のサイトカイン発現量のまとめ
（ＮＤ＝ ブレオマイシン処置群と比較して有意差なし）
Figure 2010530218
表３５より明らかになように、ブレオマイシン肺傷害のマウスは、抗ＬＰＡ抗体Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）による処理後、ＩＬ−１３およびＴＩＭＰ−１量の低下、並びに他の関連成長因子の減少、そしてその結果として肺線維症の減少を示した。表３５に示すサイトカインおよび成長因子量のパターンは、処理に応じた線維症の減少を示すものと思われる。従って、表３５に示すものも含め、サイトカインおよび成長因子の変化のパネルは、例えば本発明の抗ＬＰＡ薬による、肺線維症を含めた線維症の有効的な治療に有用な臨床分析およびマーカーであると思われる。これは侵襲性を最小限に抑えた臨床分析になり得る上、組織生検よりコストやリスクが低い。
腎線維症におけるＬＰＡ
ＬＰＡは線維症や腎臓疾患に関与している多くの過程を仲介できるため、ＬＰＡとその受容体を腎線維症の動物モデルにおいて研究した。一側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルは、炎症、線維芽細胞の活性化、細胞外基質の蓄積を含め、腎線維症の進行を加速的に模倣する。Ｊ．Ｐ． Ｐｒａｄｅｒｅ ら、（２００７）Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １８：３１１０-３１１８、Ｊ．−Ｐ． Ｐｒａｄｅｒｅら、リゾホスファチジン酸と腎線維症［Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ］、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ(２００８）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｌｉｐ．２００８．０４．００１。
ＵＵＯ後にＬＰＡ1受容体の発現を誘導すると、腎臓ＬＰＡ産生が３．３倍増加した。このことは、ＵＵＯに起因する腎線維症におけるＬＰＡとＬＰＡ1受容体の役割を示す。これは、マウスにおける腎線維症の進行がＬＰＡ1 −／− 変異動物において減少したという所見により確認された。また別のより遅い腎線維症のモデルであって、ヒト疾患の緩徐な進行を厳密に模倣する腎毒性血清腎炎モデルでも、ＬＰＡ1発現が増加した。従って、このエビデンスは、腎線維症においてＬＰＡが役割を担っていることを示しており、本発明の抗ＬＰＡモノクローナル抗体などの抗ＬＰＡ薬は腎線維症の治療に適切な候補であると思われる。
Ｐｒａｄｅｒｅら、２００７に従い、マウスＵＵＯモデルにおいてＬｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）を試験した。対照と比較したＬＴ３０００処理後の炎症および細胞外基質の低下を組織学的に検討し定量化した。
Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（ＬＴ３０００）のヒト化
材料
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン液体基質（ＴＭＢ）はシグマ・アルドリッチ（ミズーリ州セイントルイス）から入手した。脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はカルバイオケム（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）から入手した。固定化プロテインＡ、固定化パパイン、タンパク質脱塩スピンカラムはピアス（イリノイ州ロックフォード）から入手した。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ 特異的）抗体はベチル（テキサス州モンゴメリー）より購入した。参照ＩｇＧ（非特異性ヒトＩｇＧおよびマウスＩｇＧ）、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートおよび抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートはジャクソン・イミュノリサーチ・ラボラトリーズ（ペンシルバニア州ウェストグローブ）より入手した。リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）および競合ＥＬＩＳＡで使用する他の脂質は、アバンティ・ポーラー・リピッズ（アラバマ州アラバスター）より購入した。ビオチン化ＬＰＡはエシェロン・バイオサイエンス（ユタ州ソルトレイクシティ）より購入した。
ＬＴ３０００のヒト化
マウスＣＤＲをヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することによってマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体ＬＴ３０００（Ｌｐａｔｈｏｍａｂ）の可変ドメインをヒト化した。Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ、（２００３）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ３１： ３０７−１０、 Ｍａｒｔｉｎ Ａ．Ｃ． およびＪ．Ｍ． Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、 １９９６． ２６３： ８００−１５、 Ｍｏｒｅａ Ｖ．、 Ａ．Ｍ． Ｌｅｓｋ およびＡ． Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ(２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ２０： ２６７−７９、 Ｆｏｏｔｅ Ｊ． およびＧ． Ｗｉｎｔｅｒ、（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、 ２２４： ４８７−９９、 Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ら、(１９８５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１８６：６５１−６３。
配列アラインメント・分析プログラム（ＳＲ ｖ７．６）を用い、ＬＴ３０００への相同性に基づいてＩＭＧＴデータベースおよびＫａｂａｔデータベースより適切な受容ヒトＦＲ配列を選択した。ＦＲ残基、バーニア残基、正準残基、ＶＨ−ＶＬ界面残基（ＶＣＩ）で同一性が高い配列をまず選択した。このサブセットより、最も非保存的なＶＣＩ置換、異常なプロリンまたはシステイン残基、体細胞変異を有する配列をヒト化から除外した。ヒト化ＶＬ・ＶＨ配列を含む三次元（３Ｄ）モデルを作成し、ＣＤＲを形成する残基と重なるＦＲ残基を同定した。これらＦＲ残基は、ＣＤＲループの構成および抗体の抗原に対する高親和性および特異性を保持する能力に影響する可能性がある。この分析に基づき、ＡＪ００２７７３の６つの残基およびＤＱ１８７６７９の３つの残基を同定し、ＬＴ３０００と有意に異なるとみなし、マウス配列においての変異と考えた。
哺乳類細胞における抗体の発現および産生
マウス抗体遺伝子をハイブリドーマよりクローニングした。ヒトフレームワーク配列およびマウスＣＤＲを含んでいる合成遺伝子を合成オリゴヌクレオチドより構築し、平滑な制限部位を用いてｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングした。配列決定して１００％の配列一致を確認した後、重鎖遺伝子にはｐＣｏｎγベクター、軽鎖遺伝子にはｐＣｏｎκベクター（ロンザバイオロジックス、ニューハンプシャー州ポーツマス）を用いて、軽鎖と重鎖をクローニングし、全長ＩｇＧ１キメラ抗体として発現させた。これらの各遺伝子の発現カセットには、プロモータ、コザック配列、転写終結区が含まれた。これらのプラスミドで大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞、インビトロジェン、カタログ番号Ｃ４０４０−１０）を形質変換させ、ＬＢ培地において増殖させ、グリセリンにて保存した。製造元の記載に応じて大規模なプラスミドＤＮＡを調製した（キアゲン、エンドトキシンフリーのＭＡＸＩＰＲＥＰTMキット、カタログ番号１２３６２）。２９３フェクチンを用い、２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍｅｄｉａを培養に用いてプラスミドをヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｆにトランスフェクションした。トランスフェクションされた培養は、約２〜１２ ｍｇ／Ｌのヒト化抗体を発現した。
抗体の精製
プロテインＡアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて培養上清よりモノクローナル抗体を精製した。０．５ ｍｌのＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ−Ｕｌｔｒａ樹脂（ミリポア、カタログ番号１１５１１５８２７）を含むアリコートを自然落下法用使い捨てカラム（ピアス、カタログ番号２９９２４）に添加し、１０〜１５ ｍｌの結合用バッファー（ピアス、カタログ番号２１００１）で平衡化した。一過性発現したヒト化抗体を含む培養上清を結合用バッファーで１：１に希釈し、樹脂に通過させた。カラムに保持された抗体を１５ ｍｌの結合用バッファーで洗浄し、低ｐＨの溶出用バッファー（ピアス、カタログ番号２１００４）で溶出し、ｐＨを中和するために１００ ｕｌの結合用バッファーを含む１ ｍｌのフラクションに収集した。吸光度（２８０ ｎｍ）＞０．１のフラクションを１リットルのＰＢＳ緩衝液（セルグロ、カタログ番号０２１−０３０）で一晩透析した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット、３５００ ＭＷＣＯ、ピアス、カタログ番号６６３８２）。透析した試料をセントリコンＹＭ５０（アミコン社、カタログ番号４２２５）濃縮器を用いて濃縮し、０．２２ ｕＭセルロースアセテート膜（コスター、カタログ番号８１６０）でろ過した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて各産生物の純度を評価した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動
各抗体試料を２−メルカプトエタノール（シグマ、カタログ番号Ｍ−３１４８）含有（還元型）または非含有（非還元型）のゲル添加用バッファー０．５ ｕｇ／ｕｌで希釈した。還元試料は９５ ｏＣで５分間加熱し、非還元試料は室温でインキュベートした。１レーン当たり２ ｕｇの抗体を４〜２％勾配ゲル（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０３２２）に添加し、室温で１Ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動用バッファー（インビトロジェン、カタログ番号ＮＰ０００１）にて１７０ボルトで１時間泳動した。泳動後、ゲルを５０％メタノール、１０％酢酸にて１０ 分ほど浸漬することにより抗体を固定した。その後ゲルを２００ ｍｌ 蒸留水で３回洗浄した。最後に、ゲルをＧｅｌＣｏｄｅ(R) Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（ピアス、カタログ番号２４９０）にて一晩染色し、水で脱染することによりバンドを可視化した。
定量的ＥＬＩＳＡ
定量的ＥＬＩＳＡを用いて抗体価を求めた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ベチル社Ａ８０−１０４Ａ、１ ｍｇ／ｍｌ）を炭酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ3、３３．６ ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ ９．５）にて１：１００希釈した。１００ ｕｌ／ウェルのコーティング溶液を３７℃で１時間インキュベートすることによりプレートをコーティングした。プレートをＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭトリス、０．１４ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ８．０）で４回洗浄し、２００ ｕｌ／ウェルＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭトリス、０．１４ Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、ｐＨ ８．０）によって３７℃で１時間ブロッキングした。試料および標準を２回に検定しても十分な容量で非結合型プレートにて調製した。標準はヒト標準血清（ベチル社 ＲＳ１０−１１０、４ ｍｇ／ｍｌ）をＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５０ ｍＭトリス、０．１４ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ８．０）において次の濃度に希釈することにより調製した。５００ ｎｇ／ｍｌ、２５０ ｎｇ／ｍｌ、１２５ ｎｇ／ｍｌ、６２．５ ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ ｎｇ／ｍｌ、７．８１２５ ｎｇ／ｍｌ、０．０ ｎｇ／ｍｌ。試料の吸光度（ＯＤ）が標準の範囲内になるようにＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで適切に希釈することによって試料を調製した。最も線形の範囲は１２５ ｎｇ／ｍｌ １５．６２５ ｎｇ／ｍｌであった。プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１００ｕｌの標準／試料調製液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次にプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００ ｕｌ／ウェルのＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで１：１５０，０００に希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ベチル社 Ａ８０−１０４Ｐ、１ ｍｇ／ｍｌ）によって３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、４℃に冷却した１００ ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて展開した。７分後に１Ｍ Ｈ2ＳＯ4（１００ｕｌ／ウェル）で反応を停止した。ＯＤを４５０ ｎｍで測定し、データをＧｒａｐｈｐａｄ Prizmソフトウェアで分析した。４つのパラメータの方程式を用いて検量線を当てはめ、これを使用して試料におけるヒトＩｇＧ含量を計算した。
直接結合ＥＬＩＳＡ
ヒト化抗体のＬＰＡ結合親和性を直接結合ＥＬＩＳＡ検定により求めた。３７℃で１時間０．１ Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）にて希釈したＩｍｊｅｃｔマリエイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ピアス社）とコンジュゲートした１．０ ｕｇ／ｍｌのＣ１２：０ ＬＰＡでマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（コスター）を一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１０．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．７６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ ７．４）で洗浄し、室温で１時間または４℃で一晩ＰＢＳ／ＢＳＡ／ｔｗｅｅｎ−２０によりブロッキングした。一次インキュベーション（室温で１時間）については、抗ＬＰＡ抗体（０．４ｕｇ／ｍＬ、０．２ｕｇ／ｍＬ、０．１ｕｇ／ｍＬ、０．０５ｕｇ／ｍＬ、０．０１２５ ｕｇ／ｍＬ、０ ｕｇ／ｍＬ）の希釈系列をミクロプレート（ウェル当たり１００ ｍｌ）に添加した。プレートを洗浄し、ウェル当たり１００ｕｌの１：２０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン、カタログ番号 １０９−０３５−００３）と１時間室温でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼをテトラメチルベンジジン基質（シグマ、カタログ番号Ｔ０４４０）で展開し、１ Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添加することにより停止した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸを用いて４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて４つのパラメータの方程式による用量反応曲線の最小二乗を当てはめることによりＥＣ50（半最大結合濃度）を求めた。
ＬＰＡ競合ＥＬＩＳＡ
ヒト化抗体の特異性を競合ＥＬＩＳＡによって求めた。Ｃ１８：０ ＬＰＡ コーティング材料を炭酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３３．６ ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ ９．５）で０．３３ ｕｇ／ｍｌに希釈した。プレートを１００ ｕｌ／ウェルのコーティング溶液でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２７ ｍＭ ＫＣｌ、１．３７ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）で４回洗浄し、１５０ ｕｌ／ウェルのＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、０．１％ ｔｗｅｅｎ−２０で室温で１時間ブロッキングした。５ ｕＭ、２．５ ｕＭ、１．２５ ｕＭ、０．６２５ ｕＭ、０．０ ｕＭの脂質競合体（１４：０ ＬＰＡ（アバンティ社、カタログ番号８５７１２０）、１８：１ ＬＰＡ（アバンティ社、カタログ番号８５７１３０）、１８：１ ＬＰＣ（アバンティ社、カタログ番号８４５８７５）、ｃＬＰＡ（アバンティ社、カタログ番号８５７３２８）、１８：１ ＰＡ（アバンティ社、カタログ番号８４０８７５）、ＰＣ（アバンティ社、カタログ番号８５０４５４）に対してヒト化抗ＬＰＡ抗体を試験した。抗体をＰＢＳ、０．１ ％ ｔｗｅｅｎ−２０にて０．５ ｕｇ／ｍｌに希釈し、非結合型プレート上で、試料対抗体の比率１：３で脂質試料と合わせた。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、１００ ｕｌ／ウェルの一次抗体・脂質の複合体と室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、１００ ｕｌ／ウェルのＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、０．１％ ｔｗｅｅｎ−２０において１：２０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト抗体と室温で１時間インキュベートした。再度プレートをＰＢＳで４回洗浄し、４℃でＴＭＢ基質（１００ ｕｌ／ウェル）を用いて展開した。８分後に反応を１００ｕｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４によって停止した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸを用いて４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。生データをＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに移して分析した。
耐熱性
加熱後のＬＰＡ結合親和性（ＥＣ５０）を、直接結合ＥＬＩＳＡを用いて測定することにより、ヒト化抗体の耐熱性を検討した。ＰＢＳ（セルゴ社、カタログ番号０２１−０４０）にて溶解した抗体を２５ ｕｇ／ｍｌに希釈し、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃で１０分間インキュベートした。温度を上昇させる前に各試料を１０ｕｌ取り出し、９０ ｕｌのＰＢＳで希釈して氷上保存した。その後試料を短時間ボルテックスし、１３，０００ ｒｐｍで１分間遠心分離することにより不溶材料を除去した。直接ＬＰＡ結合ＥＬＩＳＡを用いて上清の結合活性を求め、加熱処理なしの同試料である対照と比較した。
表面プラスモン共鳴
結合データはすべてＰｒｏｔｅＯｎ光学バイオセンサ（バイオラド、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で収集した。１２：０ ＬＰＡチオールおよび１８：０ ＬＰＡチオールをマレイミド修飾ＧＬＣセンサー・チップ（カタログ番号１７６−５０１１）とコンジュゲートした。まず、ＧＬＣチップをスルホＮＨＳ／ＥＤＣの同量混合で７分間活性化し、次いでエチルジアミンによる７分間のブロッキング工程を実施した。次にスルホＭＢＳ（ピアス社、カタログ番号２２３１２）をＨＢＳランニングバッファー（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ７．４）において０．５ ｍＭの濃度で表面上に流した。ＬＰＡチオールをＨＢＳランニングバッファーにおいて１０、１、０．１ ｕＭの濃度に希釈して７分間注入し、３つの異なった密度のＬＰＡ表面を得た（約１００、約３００、約１４００ ＲＵ）。次に、最高濃度として２５ ｎＭをはじめとして（元のストックをそれそれ１００対１に希釈した）、３倍希釈の系列を使用してヒト化抗体の結合データを収集した。１００ ｍＭ ＨＣｌの１０秒のパルスによって表面を復元した。データはすべて２５℃で収集した。対照は、標準表面を使用し、ブランクを注入することにより処理した。各表面の応答データは、複雑な結合挙動を示すが、これはおそらく様々な程度の多価結合に起因する。結合定数の推定値を抽出するために、様々な抗体濃度のデータを、１部位および２部位のモデルを用いて全体的に当てはめた。これにより二価部位（部位１）と一価部位（部位２）の親和性の推定値を得た。
ＬＰＡのモル結合能
置換アッセイを用いてＬＰＡ：モノクローナル抗体のモル比を求めた。乾燥窒素気流を用いてホウケイ酸チューブ（フィッシャーブランド社、カタログ番号１４−９６１−２６）を５ナノモルのビオチン化ＬＰＡ（５０ ｕｇの脂質（エシェロン・バイオサイエンヌ、カタログ番号Ｌ−０１２Ｂ、ロット番号Ｆ−６６−１３６を７０５ ｕｌのクロロホルム：メタノール＝１：１に懸濁して１００ ｕＭの溶液を得た）でコーティングした。コーティングしたチューブを７５ ｕｌ（１２５ピコモル）のＰＢＳ（セルグロ社、カタログ番号０２１−０３０）に溶解した抗体と室温でインキュベートした。インキュベーション３時間後、タンパク質脱塩カラム（ピアス、カタログ、番号８９８４９）を用いてＬＰＡ：モノクローナル抗体複合体を遊離脂質から分離し、ＨＡＢＡ／アビジン置換アッセイ（ピアス、カタログ番号２８０１０）を製造元の指示に従って使用し、結合したビオチン化ＬＰＡのモル濃度を求めた。
ＳＫＯＶ３細胞におけるＬＰＡ誘導性ＩＬ−８放出の測定
抗ＬＰＡ抗体はＳＫＯＶ３卵巣細胞馴化培養においてＬＰＡ依存のヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８放出を抑制する。ＳＫＯＶ３細胞（ロット番号４２５５５５８、継代 １４）を２ ｍｌの１ＸトリプシンＥＤＴＡ（メディアテック社、カタログ番号２５−０５３−ＣＶ）で収穫し、８ ｍｌの完全培地（１０％ ＦＢＳ、メディアテック社カタログ番号３５−０１１−ＣＶ）にて再懸濁した。細胞を５分間（１１，０００ ｒｐｍ）遠心分離にかけ、５ ｍｌの完全培地にて再懸濁した。血球計を用いて０．４％トリパンブルー（１０ ｕｌ細胞に９０ｕｌトリパンブルーを添加、インビトロジェン、カタログ番号１５２５０−０６１）で細胞を二回計数した。９６ウェルプレートにおいて、ウェル当たり１ｘ１０5個の細胞を播種した（最終容積１００ｕｌ／ウェル）。一晩３７°Ｃでインキュベートすることにより、細胞を定着させ、コンフルエントな単層を形成させた。翌日、細胞を最小培地（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡのＬ−グルタミン含有マッコイ培地、メディアテック社、カタログ番号１０−０５０−ＣＶ）で２回軽く洗浄した。培地を１％ペニシリン／ストレプトマイシン（メディアテック社、カタログ番号３０−００２ ＣＩ）２．２ ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社、カタログ番号２５−０３５−ＣＩ）に調整した。次に細胞を３７℃で正確に２４時間血清不足にし、次いで１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ＰＢＳ（カルバイオケム、カタログ番号１２６５７５）にて溶解した１００ ｕＭ Ｃ１８：１ ＬＰＡ（アバンティ社、カタログ番号８５７１３０）によりサイトカイン刺激をＬＰＡ抗体存在下・ＬＰＡ非存在下で行った。２２時間の刺激後、細胞を５分間（１３，５００ ｒｐｍ）４℃で遠心分離にかけ上清を収集した。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８キットを販売者の指示に従って使用し（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号Ｄ８０００Ｃ）、各上清のＣＸＣＬ８／ＩＬ−８量を測定した。
スクラッチアッセイにおける腫瘍細胞移動の測定
ＳＫＯＶ３細胞をウェル当たり１５，０００細胞で９６ウェルプレートに播いた。翌日、細胞を最少培地（Ｌグルタミン、２．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むように調整したマッコイ５ａ培地）で２４時間血清不足にさせた。０時間の時点で細胞をｐ２００ピペットチップで各ウェルの中央をスクラッチし、最少培地で洗浄し、処理する前に撮影した。その後、１５０ ｕｇ／ｍｌの抗体存在下・１５０ ｕｇ／ｍｌの抗体非存在下で１．０ ｕＭ ＬＰＡと３７oＣで予めインキュベートした０．２ ｕＭ、１．０ ｕＭ、１０ ｕＭの濃度のＬＰＡ（Ｃ１８：１）で細胞を処理した。陽性対照（１０％ＦＢＳ処理した細胞）と抗体単独も試験した。５％ ＣＯ2インキュベーターにおいて細胞を３７oＣで１７時間刺激した。１７時間処理した後、再度撮影し、写真を同サイズに調節して０時間と１７時間でのスクラッチの幅を定規で測ることによって傷の閉鎖率（％）を測定した。
マトリゲルアッセイ
約８〜１０週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（（ＢＤの）ニュージャージー州フランクリンレイクスより購入したマトリゲルマトリックス高濃度［Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ］を、血管形成刺激として５０ ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび５０ ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、ヘパリン３ ｎｇ／ｍｌと混合し、この研究に使った。マウス群は５つあり、０日目に１０個のマトリゲルプラグを各群の５匹のマウスに接種した。一つのマウス群を対照とし、他の４つは異なった４つの用量でｉｐ注射による薬剤処理を１日おきに受けた。処理はすべて−１日目に開始し、８日目に終了した。
適切な形状のマトリゲルプラグをマウス１匹当たり２つ使用して、２５匹の健常マウスを得るために、マトリゲルプラグを３０匹のＣ５７ｂｌ／６マウスに移植した。０日目に、マウスの左右の横腹に４０℃のマトリゲルを５００ｕｌ皮下注射し、注射領域を剪毛した。注射したマトリゲルの皮下組織への接触領域を増加させて丸い形状のプラグを形成するために、通常の皮下刺入後、針先を左右往復させることにより広い皮下ポケットを形成した。注射は、中身の全部が１つのプラグとして供給されるように妥当なサイズの針（２１Ｇ−２５Ｇ）ですばやく行った。注射したマトリゲルはすぐに単一の固体のゲルプラグになった。
動物を、マトリゲルプラグの移植の１日前から８ ｍｇ／ｋｇまたは２ ｍｇ／ｋｇの抗体または食塩水で、あるいは媒体で処理した。処理は、ｉｐにより、ｑ２ｄのスケジュールで行った。
１２日目に各群のプラグを収集した。マウスを安楽死させ、マウスの皮を引き下げてプラグを露出させた。切開してプラグを取り出し、組織学分析用に固定した。パラフィン包埋プラグの５μｍ切片を抗ＣＤ−３１抗体で染色した。各マトリゲルプラグの断面領域における血管密度を分析した。各投与群について、少なくとも６個以上のマトリゲルプラグを定量的に分析し、微小血管密度に関して群間に統計的有意差があるかどうか評価した。
結果
ＬＰＡに対する高親和性、特異性、結合能を保持する抗体を産生する目的でマウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体ＬＴ３０００の配列をヒト化した。
ヒト化変種の操作
ＬＴ３０００のＶＨおよびＶＬのＫａｂａｔ ＣＤＲを受容体ヒトフレームワークに移植することによってマウス抗ＬＰＡ抗体をヒト化した。７つのヒト化変種をＨＥＫ ２９３細胞において無血清条件下で一過性発現させ、精製した後、一連のアッセイによってキャラクテリゼーションを行った。各軽鎖および重鎖の配列を含むプラスミドを哺乳類細胞にトランスフェクションして産生した。培養５日間後に定量的ＥＬＩＳＡを用いてモノクローナル抗体の力価を求めた。軽鎖と重鎖のすべての組み合わせで細胞培養１ ｍｌ当たり２〜１２ ｕｇの抗体を得た。
ヒト化変種のキャラクテリゼーション
ヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体変種のいずれもがキメラ抗ＬＰＡ抗体（別名ＬＴ３０１０）およびマウス抗体ＬＴ３０００と同様の低ピコモル範囲の結合親和性を示した。ヒト化変種のいずれもがＬＴ３０００と同様またはそれ以上のＴMを示した。特異性に関しては、ヒト化変種はＬＴ３０００と同様の特異性プロファイルを示した。例えば、ＬＴ３０００は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸の各種アイソフォーム（１４：０および１８：１ ＬＰＡ、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して交差反応性を示さなかった。
ヒト化変種の活性
インビトロ細胞アッセイにより５つのヒト化変種をさらに評価した。ＬＰＡは、癌細胞からのインターロイキン８（ＩＬ−８）放出の誘導において重要な役割を果たしていることが知られている。ＬＴ３０００は、卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出を濃度依存的に低下させた。ＬＴ３０００と比較して、ヒト化変種は同様なＩＬ−８放出の低下を示した。
さらに、微小血管密度（ＭＶＤ）に対するそれらの効果について、ヒト化変種の一部を新血管形成用マトリゲルチューブ形成アッセイにおいて試験した。両方ともＭＶＤ形成を低下させることが確認された。
表３６：マトリゲルプラグにおいてＣＤ３１免疫染色とＨ＆Ｅ対比染色を用いた微小血管密度の定量化
Figure 2010530218
本開示によれば、本明細書において記載された、または請求された組成物および方法のすべてを、過度の実験を要することなく作成・実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施様態として記載したが、前記組成物および方法に変更を適用してもよいことは当業者には明らかであろう。当業者には明らかである、かかる同様の置き換えや変更はすべて、最後に追加する請求項に定義される本発明の趣旨および範囲に含まれるものとする。
本明細書において述べた特許、特許出願、文献のすべては、本発明に関連する当業者の技量を示すものである。優先権または他の利点が主張されるものも含め、特許、特許出願、文献のすべては、、それぞれの文献を個々に、参照により援用されるべく指示されている場合と同じレベルで、本明細書で参照することにより援用されている。
本明細書において例によって説明した本発明は、特に記載されていない限り、任意の要素（複数も可）なしで、実施してもよい。従って、例えば、本明細書における各例の、「を有する」、「から本質的になる」、「からなる」という用語のいずれも一つは、その他の２つの用語のいずれかで置き換えてもよい。用いられた用語および表現は、限定のためではなく、説明のための用語として用いられており、そのような用語および表現の使用には、提示され、説明された特徴と同等のもののいずれも、またはその一部を除外する意図はなく、むしろ請求する本発明の範囲内で多様な変更が可能であることを認識されたい。従って、本発明は好ましい実施様態および選択的な特徴によって具体的に説明したが、当業者が本明細書に記載の概念の変更および変形を行ってもよいこと、そのような変更や変形が、最後に追加する請求項に定義されるがごとく、本発明の範囲に含まれるとすることを理解されたい。

Claims (87)

  1. 生理学的条件下でリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を結合する薬剤であって、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６９、７０、７１、７２、７３、７４、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５％であるアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有する単離抗ＬＰＡ薬剤。
  2. 請求項１の抗ＬＰＡ薬剤であって、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６９、７０、７１、７２、７３、７４、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を持つ群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有する抗ＬＰＡ薬剤。
  3. 請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤であって、抗体および非抗体由来部分からなる群から選択される抗ＬＰＡ薬剤。
  4. 請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤であって、前記薬剤が、キメラ抗体、ヒト化抗体、全長抗体、親和性成熟抗体、抗体誘導体、抗体フラグメントのいずれかである抗ＬＰＡ薬剤。
  5. 請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤であって、前記薬剤が２本の重鎖と２本の軽鎖からなる抗体であって、各重鎖が独立して配列番号１１４、１１８、１２２、１２６、１３０からなる群から選択されたアミノ酸配列を有し、かつ各軽鎖が独立して配列番号１１５、１１９、１２３、１２７、１３１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤。
  6. 請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤であって、前記薬剤が、ポリマー、放射性核種、化学療法薬、検出薬からなる群から選択される部分と複合体を形成している抗ＬＰＡ薬剤。
  7. 請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤および担体を有し、その担体が任意に薬学的に許容される担体である組成物。
  8. 請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤であって、前記薬剤が第二の薬剤と組み合わされ、前記第二の薬剤は抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体変異体からなる群から任意に選択される抗ＬＰＡ薬剤。
  9. 請求項9に記載の抗ＬＰＡ薬剤であって、前記第二の薬剤がＬＰＡ以外の分子を結合する結合部分を含み、前記抗ＬＰＡ薬剤と前記第二の薬剤が任意に共有結合を介して任意に連結されている抗ＬＰＡ薬剤。
  10. 単離核酸分子であって、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つコードするヌクレオチド残基の配列を有する単離核酸分子。
  11. 請求項１０に記載の単離核酸分子であって、前記ＣＤＲペプチドが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離核酸分子。
  12. 請求項１０に記載の単離核酸分子であって、少なくとも２つのＣＤＲペプチドをコードし、各ＣＤＲペプチドが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離核酸分子。
  13. 請求項１０に記載の単離核酸分子であって、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドをコードし、前記第一、第二、第三のＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離核酸分子。
  14. 請求項１０に記載の単離核酸分子であって、免疫グロブリン重鎖のフラグメントまたは全長免疫グロブリン重鎖をコードする単離核酸分子。
  15. 請求項１０に記載の単離核酸分子であって、前記免疫グロブリン重鎖が、サカナ、トリ,
    哺乳類、任意に霊長類、任意にヒトに由来する単離核酸分子。
  16. 請求項１０に記載の核酸分子を含んでいるベクター。
  17. 請求項１０に記載の単離核酸分子によってトランスフェクションされた宿主細胞。
  18. 請求項１６に記載のベクターによってトランスフェクションされた宿主細胞。
  19. 配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つコードするヌクレオチド残基の配列を有する単離核酸分子。
  20. 請求項１９に記載の単離核酸分子であって、前記ＣＤＲペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離核酸分子。
  21. 請求項１９に記載の単離核酸分子であって、少なくとも２つのＣＤＲペプチドをコードし、各ＣＤＲペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択される単離核酸分子。
  22. 請求項１９に記載の単離核酸分子であって、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドをコードし、前記第一、第二、第三のＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離核酸分子。
  23. 請求項１９に記載の単離核酸分子であって、免疫グロブリン軽鎖のフラグメントまたは全長免疫グロブリン軽鎖をコードする単離核酸分子。
  24. 請求項１９に記載の単離核酸分子であって、前記免疫グロブリン軽鎖が、サカナ、トリ、哺乳類、任意に霊長類、任意にヒトの免疫グロブリン軽鎖に由来する単離核酸分子。
  25. 請求項１９に記載の核酸分子を含んでいるベクター。
  26. 請求項１９に記載の単離核酸分子によってトランスフェクションされた宿主細胞。
  27. 請求項２５に記載のベクターによってトランスフェクションされた宿主細胞。
  28. 請求項２５に記載のベクターであって、請求項１９に記載の単離核酸分子を更に含んでいるベクター。
  29. 請求項２６に記載の宿主細胞であって、更に請求項１０に記載の単離核酸分子または請求項１６に記載のベクターによってトランスフェクションされた宿主細胞。
  30. 単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、動物免疫グロブリン重鎖の可変ドメインの少なくとも１つのフレームワーク領域を含み、前記ポリペプチドが生理学的状況においてＬＰＡを結合し、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有するポリペプチド。
  31. 請求項３０に記載の単離ポリペプチドであって、前記ＣＤＲペプチドが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
  32. 請求項３０に記載の単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは少なくとも２つのＣＤＲペプチドを含み、各ＣＤＲペプチドが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
  33. 請求項３２に記載の単離ポリペプチドであって、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三のＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
  34. 請求項３０に記載の単離ポリペプチドであって、免疫グロブリン重鎖の全長可変ドメイン、または全長免疫グロブリン重鎖、または免疫グロブリン重鎖のフラグメントからなる群から選択される単離ポリペプチド。
  35. 単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、動物免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインの少なくとも１つのフレームワーク領域を含み、前記ポリペプチドがＬＰＡを結合し、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有するポリペプチド。
  36. 請求項３５に記載の単離ポリペプチドであって、前記少なくとも１つのＣＤＲペプチドの前記配列同一性が、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる群から選択される単離ポリペプチド。
  37. 請求項３５に記載の単離ポリペプチドであって、前記ＣＤＲペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
  38. 請求項３５に記載の単離ポリペプチドであって、少なくとも２つのＣＤＲペプチドを含み、各ＣＤＲペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
  39. 請求項３８に記載の単離ポリペプチドであって、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三のＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
  40. 請求項３５に記載の単離ポリペプチドであって、免疫グロブリン軽鎖の全長可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖のフラグメント、全長免疫グロブリン軽鎖からなる群から選択される単離ポリペプチド。
  41. 単離抗体分子であって、
    ａ. ２本の免疫グロブリン重鎖であって、各免疫グロブリン重鎖が生理学的状況においてＬＰＡを結合する動物免疫グロブリン重鎖であり、前記重鎖が、免疫グロブリン重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域を少なくとも１つ含み、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記２本の免疫グロブリン重鎖と機能的に関連しているＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む、前記２本の免疫グロブリン重鎖と、
    ｂ. ２本の免疫グロブリン軽鎖であって、各免疫グロブリン軽鎖が生理学的状況においてＬＰＡを結合する動物免疫グロブリン軽鎖であり、前記軽鎖が、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域を少なくとも１つ含み、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む、前記２本の免疫グロブリン軽鎖と、
    を有する単離抗体分子。
  42. 請求項４１に記載の単離抗体分子であって、前記免疫グロブリン重鎖のそれぞれの少なくとも１つのＣＤＲペプチドの前記配列同一性が、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択され、かつ、前記免疫グロブリン軽鎖のそれぞれの少なくとも１つのＣＤＲペプチドの前記配列同一性が、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される単離抗体分子。
  43. 請求項４２に記載の単離抗体分子であって、前記免疫グロブリン重鎖のそれぞれが、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三の免疫グロブリン重鎖ＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有し、前記免疫グロブリン軽鎖のそれぞれも、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三の免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離抗体分子。
  44. 単離ヒト化抗体分子であって、
    ａ. ２本の免疫グロブリン重鎖であって、各免疫グロブリン重鎖が生理学的状況においてＬＰＡを結合し、ヒト免疫グロブリン重鎖の可変ドメインのフレームワーク領域を少なくとも１つ含み、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記２本の免疫グロブリン重鎖と機能的に関連しているＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む、前記２本の免疫グロブリン重鎖と、
    ｂ.２本の免疫グロブリン軽鎖であって、各免疫グロブリン軽鎖が生理学的状況においてＬＰＡを結合し、ヒト免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域を少なくとも１つ含み、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含む、前記２本の免疫グロブリン軽鎖と、
    を含む単離ヒト化抗体分子。
  45. 請求項４４に記載の単離ヒト化抗体分子であって、前記免疫グロブリン重鎖のそれぞれの少なくとも１つのＣＤＲペプチドの前記配列同一性が、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択され、かつ、前記免疫グロブリン軽鎖のそれぞれの少なくとも１つのＣＤＲペプチドの前記配列同一性が、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される単離ヒト化抗体分子。
  46. 請求項４５に記載の単離ヒト化抗体分子であって、前記免疫グロブリン重鎖のそれぞれが、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三の免疫グロブリン重鎖ＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有し、前記免疫グロブリン軽鎖のそれぞれも、第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三の免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する単離ヒト化抗体分子。
  47. 少なくとも第一および第二のリガンド結合エレメントを含む多価結合性分子であって、前記第一のリガンド結合エレメントがＬＰＡを結合し、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性からなる群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有する多価結合性分子。
  48. 請求項４７に記載の多価結合性分子であって、前記ＣＤＲペプチドが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する多価結合性分子。
  49. 請求項４７に記載の多価結合性分子であって、少なくとも２つのＣＤＲペプチド、および任意に第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、前記第一、第二、第三のＣＤＲペプチドのそれぞれが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する多価結合性分子。
  50. 請求項４７に記載の多価結合性分子であって、全長免疫グロブリン重鎖あるいはそのフラグメント、または免疫グロブリン重鎖の全長可変ドメインあるいはそのフラグメントである多価結合性分子。
  51. 請求項４７に記載の多価結合性分子であって、前記第二のリガンド結合エレメントもＬＰＡを結合する多価結合性分子。
  52. 請求項４７に記載の多価結合性分子であって、前記リガンド結合エレメントが２つ以上あり、各リガンド結合エレメントがＬＰＡを結合する多価結合性分子。
  53. 少なくとも第一および第二のリガンド結合エレメントを含む多価結合性分子であって、前記第一のリガンド結合エレメントがＬＰＡを結合し、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性の群から選択される配列同一性のアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有する多価結合性分子。
  54. 請求項５３に記載の多価結合性分子であって、前記ＣＤＲペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する多価結合性分子。
  55. 請求項５３に記載の多価結合性分子であって、少なくとも２つのＣＤＲペプチド、および任意に第一、第二、第三のＣＤＲペプチドを含み、各ＣＤＲペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を有する多価結合性分子。
  56. 請求項５３に記載の多価結合性分子であって、全長免疫グロブリン軽鎖あるいはそのフラグメント、または免疫グロブリン軽鎖の全長可変ドメインあるいはそのフラグメントである多価結合性分子。
  57. 請求項５３に記載の多価結合性分子であって、前記第二のリガンド結合エレメントもＬＰＡを結合する多価結合性分子。
  58. 請求項５７に記載の多価結合性分子であって、前記リガンド結合エレメントが２つ以上あり、各リガンド結合エレメントがＬＰＡを結合する多価結合性分子。
  59. 少なくとも第一および第二のリガンド結合エレメントが連鎖されたスキャフォールドを含む多価結合性分子であって、前記第一のリガンド結合エレメントがＬＰＡを結合し、また機能的に関連する第一および第二のポリペプチドを含み、前記第一のポリペプチドが、配列番号５６、５７、５８、６２、６９、７０、７１、８１、８２、８３、９３、９４、９５、１０５、１０６、１０７、１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ含み、前記第二のポリペプチドが、配列番号５９、６０、６１、７２、７３、７４、８４、８５、８６、９６、９７、９８、１０８、１０９、１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲペプチドを少なくとも１つ有する多価結合性分子。
  60. 単離抗ＬＰＡ抗体重鎖であって、前記単離抗ＬＰＡ抗体重鎖が、配列番号１１４、１１８、１２２、１２６、１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを有する単離抗ＬＰＡ抗体重鎖。
  61. 単離抗ＬＰＡ抗体軽鎖であって、前記単離抗ＬＰＡ抗体軽鎖が、配列番号１１５、１１９、１２３、１２７、１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを有する単離抗ＬＰＡ抗体軽鎖。
  62. ２本の重鎖と２本の軽鎖を有する単離抗ＬＰＡ抗体であって、各免疫グロブリン重鎖が、配列番号１１４、１１８、１２２、１２６、１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変ドメインを含み、各免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１１５、１１９、１２３、１２７、１３１からなる群から選択される可変ドメインを有するアミノ酸配列を有する単離抗ＬＰＡ抗体。
  63. 請求項６２に記載の単離抗ＬＰＡ抗体であって、前記重鎖および前記軽鎖が、２つ以上のハイブリドーマ細胞に独立して由来する単離抗ＬＰＡ抗体。
  64. 請求項６２に記載の単離抗ＬＰＡ抗体と担体を有し、それが任意に薬学的に許容される担体である組成物。
  65. 異常なＬＰＡ量を伴う病気または疾患を治療または予防する方法であって、かかる治療を必要とする対象に対して、請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤、請求項３０、３５、４１、４４のいずれかに記載の単離ポリペプチドまたは抗体、請求項４７、５３、５９のいずれかに記載の多価結合性分子、請求項６２に記載の単離抗ＬＰＡ抗体からなる群から選択される薬剤を、インビボでＬＰＡの有効濃度を低下させるのに有効な量で投与することによって、病気または疾患の治療または予防を行うことを含む方法。
  66. 請求項６５に記載の方法であって、前記病気または疾患が、癌などの過剰増殖性疾患、自己免疫疾患・他移植片拒絶・移植片対宿主病などの免疫関連疾患、神経変性疾患、肥満、２型糖尿病、黄斑変性症などの眼疾患、疼痛、異常な血管形成や新血管新生に関連する疾患、アポトーシス、強皮症・肺線維症・腎線維症・皮膚線維症・心筋線維症・肝線維症などの線維形成または線維症、創傷の修復および治癒、クモ咬傷である方法。
  67. 動物において異常な過剰増殖、免疫応答、神経変性、血管形成、新血管新生、アポトーシス、線維形成または線維症を減少させる方法であって、請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤、請求項３０、３５、４１、４４のいずれかに記載の単離ポリペプチドまたは抗体、請求項４７、５３、５９のいずれかに記載の多価結合性分子、請求項６２に記載の単離抗ＬＰＡ抗体からなる群から選択される薬剤を、前記動物においてＬＰＡの有効濃度を低減させるのに有効な量で前記動物と接触させることによって、前記異常な過剰増殖、免疫応答、神経変性、血管形成、新血管新生、アポトーシス、線維形成または線維症を減少させること含む方法。
  68. 対象がヒトである請求項６５または６７に記載の方法。
  69. 患者において線維症を減少させる方法であって、前記患者においてＬＰＡの有効濃度を低下させるのに有効な量で抗ＬＰＡ抗体を前記患者に投与することを含む方法。
  70. 請求項６９の方法であって、前記線維症が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、心筋線維症、子宮線維症、皮膚線維症のいずれかである方法。
  71. 請求項６９の方法であって、前記対象の体液または組織試料においてＬＰＡを検出し、少なくとも１つの線維症マーカーを検出することを更に含む方法。
  72. 極性頭基および少なくとも１つの炭化水素鎖を含む誘導体化リゾホスファチジン酸を含む診断試薬であって、任意に保護されているペンダント反応基によって前記少なくとも１つの炭化水素鎖のうち少なくとも１つの中の炭素原子が誘導体化されている診断試薬。
  73. 請求項７２に記載の診断試薬であって、前記ペンダント反応基が、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシ基、アルケン、アルキン、酸塩化基、ハロゲン原子のいずれかである診断試薬。
  74. 請求項７２に記載の診断試薬であって、前記誘導体化リゾホスファチジン酸が、任意に固体支持体と共有結合されて、固体支持体に結合している診断試薬。
  75. 請求項７２に記載の診断試薬であって、前記誘導体化リゾホスファチジン酸が担体部分と複合体を形成し、その担体部分は任意にポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバント、ケイ素樹脂ビーズまたはタンパク質であり、前記タンパク質は任意にキーホール・リンペット・ヘモシアニン、アルブミン、ウシ・サイログロブリン、大豆トリプシン阻害剤のいずれかである診断試薬。
  76. 請求項７５に記載の診断試薬であって、前記担体部分が固体支持体に付着している診断試薬。
  77. 試料において抗ＬＰＡ薬剤を検出する方法であって、試料における抗ＬＰＡ薬剤と請求項７２の診断試薬との結合を、前記抗ＬＰＡ薬剤が存在する場合に前記診断試薬によって結合可能な条件下で検出することを含む方法。
  78. 請求項７７の方法であって、前記抗ＬＰＡ薬剤が、任意にヒト抗ＬＰＡ抗体である抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、非抗体由来の部分からなる群から選択される方法。
  79. 請求項７７の方法であって、前記試料が、任意にバイオプシー試料である組織試料、および、任意に全血、血漿、血清、尿水、精液、胆汁、房水、硝子体液、気管支肺胞上皮洗浄液、粘液、痰からなる群から選択される液状試料からなる群から選択される生体試料である方法。
  80. 試料においてリゾホスファチジン酸またはその代謝物を検出する方法であって、試料におけるリゾホスファチジン酸またはその代謝物と請求項１の抗ＬＰＡ薬剤との結合を、ＬＰＡが試料内に存在する場合に前記抗ＬＰＡ薬剤によって結合可能な条件下で検出することを含む方法。
  81. 請求項８０に記載の方法であって、前記試料が、任意にバイオプシー試料である組織試料、および、任意に全血、血漿、血清、尿、精液、胆汁、房水、硝子体液、粘液、気管支肺胞上皮洗浄液、痰からなる群から選択される体液試料からなる群から選択される動物由来の試料である方法。
  82. 請求項８０に記載の方法であって、前記抗ＬＰＡ薬剤が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体・モノクローナル抗体・キメラ抗体のいずれかのフラグメント、ポリクローナル抗体・モノクローナル抗体・キメラ抗体のいずれかの変種体、ポリクローナル抗体・モノクローナル抗体・キメラ抗体のいずれかの誘導体からなる群から選択される方法。
  83. 請求項８０に記載の方法であって、少なくとも１つの線維症マーカーを検出することを更に含み、前記抗ＬＰＡ薬剤が抗体である方法。
  84. 請求項８０に記載の方法であって、前記方法が動物由来の試料に対して実施され、
    ａ.基準値よりも高いＬＰＡ量の存在が、病気の存在と相関するように、前記試料におけるＬＰＡ量を同種の健常動物から得たＬＰＡの基準値と比較すること、または
    ｂ.動物におけるＬＰＡの有効濃度を調節するために、抗ＬＰＡ薬剤がＬＰＡの有効濃度を変化させるように、前記試料におけるＬＰＡ量を所望のＬＰＡ量と比較し、必要に応じて前記動物に投与する抗ＬＰＡ薬剤の治療用量を変更すること、
    を更に含む方法。
  85. 試料における抗ＬＰＡ薬剤を検出する方法であって、試料を、請求項７２に記載の診断試薬を保持している診断装置と、前記抗ＬＰＡ薬剤が存在する場合に前記診断試薬の誘導体化ＬＰＡによって結合可能な条件下で接触させることを含む方法。
  86. 請求項７２に記載の診断試薬および請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤を含むＬＰＡ検出法で使用するためのＥＬＩＳＡキット。
  87. 請求項８６のＥＬＩＳＡキットであって、請求項７２に記載の診断試薬がウシ血清アルブミンまたはキーホール・リンペット・ヘモシアニンと複合体化されたチオール化ＬＰＡであり、請求項１に記載の抗ＬＰＡ薬剤が抗ＬＰＡモノクローナル抗体であるＥＬＩＳＡキット。
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