JP2014521723A - リゾホスファチジン酸の阻害剤を使用する幹細胞治療 - Google Patents

Abstract

リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の阻害剤を使用する幹細胞治療のための方法が提供される。ＬＰＡの阻害は、直接または間接的であり得る。特に好ましいＬＰＡの直接阻害剤は、ＬＰＡに対するヒト化モノクローナル抗体を含む、ＬＰＡに対する抗体である。そのような阻害剤は、幹細胞治療による治療の影響を受けやすい損傷、疾患、または症状の治療のために、幹細胞と組み合わせて使用される。
【選択図】 図１

Description

本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の阻害剤を使用する幹細胞治療の方法に関する。そのような阻害剤は、直接または間接的にＬＰＡを阻害してもよい。ＬＰＡの好ましい阻害剤は、ＬＰＡに対する抗体、好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体である。

１．序論
以下の説明は、本発明を理解する上で有用であり得る情報を含む。任意のそのような情報が、本明細書の請求の範囲に記載されている発明に対する先行技術である、または本明細書の請求の範囲に記載されている発明に関連すること、あるいは具体的または暗示的に参照される任意の出版物が、本明細書の請求の範囲に記載されている発明に対する先行技術である、または本明細書の請求の範囲に記載されている発明に関連することは認められない。

２．背景
Ａ．幹細胞および幹細胞治療

幹細胞は、各自の細胞集団を新しくすること、または特殊な分化細胞に分化することのいずれかが可能である、未分化細胞である。幹細胞の種類は、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成人幹細胞（ＡＳＣ）、および臍帯幹細胞を含む。加えて、ヒトの体細胞からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， （２００６） Ｃｅｌｌ １２６：６６３−６７６）が、幹細胞治療に利用可能なツールを増加させてきた。ＥＳＣのように、ｉＰＳＣは、際限なく増殖する能力を有し、なおかつ、３つ全ての胚葉の誘導体に分化する潜在性を有する。

幹細胞移植は、現在、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄空洞症、およびその他等のいくつかのヒト神経変性障害において臨床試験中である。幹細胞治療に現在または潜在的に好適な疾患または症状の実施例は、関節欠損および損傷を含む骨の疾患および症状、筋損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および筋ジストロフィー等の神経筋疾患および症状、心筋梗塞および心不全を含む心臓疾患または症状、心臓の虚血状態を含む虚血状態、糖尿病を含む膵疾患または症状、外傷性脳損傷、脳または脊髄出血、脊髄損傷、脳卒中、ならびにパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および運動障害を引き起こす胃腸管の神経変性障害を含む神経変性疾患を含む、神経疾患または症状、肝疾患、肺疾患、ならびに放射線による傷害、創傷、および脱毛等の皮膚、毛髪、および爪の疾患および症状を含む。

幹細胞治療はまた、臓器移植用の臓器（例えば、肝臓）の可用性の不足がある状況で、有用な代替案でもあり得る。現在まで、幹細胞移植では、限定された臨床的成功しか見られていない。

幹細胞治療の成功への多くの課題は、（１）移植幹細胞のホーミングおよび分化転換を向上させること、および（２）いったん標的組織の中に定着すると、幹細胞の性能を増加させることを含む。組織傷害では、傷害組織の微小環境の変化が、移植細胞の生存に有利に働かない場合がある（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１０ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． １１２： １１２５−１１３８）。例えば、炎症カスケード、線維化、マクロファージおよび好中球活性、サイトカイン放出、免疫応答、出血等が、播種または常在幹細胞の両方の活性にとって「厳しい環境」を引き起こし得る。神経外傷の場合、これらのプロセスは、ヒト脳への損傷後の最大１２ヶ月まで継続した神経細胞死に寄与し得る（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ｅｔ ａｌ．， ２００１ Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １０２： ５８１−５９０）。心臓、肝臓、および脳等の組織では、細胞損失および再生の継続したプロセスがあり、加齢中の組織変性（すなわち、細胞損失）は、部分的に、組織が再生に失敗することであると示唆されている。したがって、幹細胞活性を妨げ得る組織中の中心的存在を識別し、おそらく中和させることが重要である。損傷微小環境は、この分化を誘導する必要があることが示唆されている。

ほとんどの研究者が、サイトカイン等のタンパクシグナル伝達分子に焦点を合わせているが、特に、しばしば未分化細胞が移植されるため、幹細胞が分化転換を受けなければならない場合において、生物活性脂質メディエータもまた、幹細胞が作用しなければならない厳しい環境で調節不全にされ得る。リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、神経幹／前駆細胞（ＮＳ／ＰＣ）を含む種々の幹細胞に作用する、炎症性脂質である。神経幹細胞分化におけるＬＰＡの役割について、より多くが現在知られているが、ＬＰＡは他の種類の幹細胞の分化で類似の役割を果たし得ると考えられ、したがって、ＬＰＡ活性または有効濃度の低減が、幹細胞の生存、ホーミング、移植、および分化を増進することによって、幹細胞治療の分野で長年にわたる必要性を満たすと考えられる。

Ｂ．ＬＰＡおよび他のリゾ脂質

リゾ脂質は、一方または両方の可能なアシル化位置にアシル基が存在しないことにより、極性頭部基および単一の炭化水素骨格を含有する低分子量脂質である。ｓｎ−３位にある極性頭部基に対して、炭化水素鎖は、ｓｎ−２および／またはｓｎ−１位（複数可）にあり得る（本来は溶血に関係する「リゾ」という用語は、ＩＵＰＡＣによって脱アシル化を指すように再定義されている）。これらの脂質は、シグナル伝達生物活性脂質の代表的なものであり、それらの生物学的および医学的重要性は、治療、診断／予防、または研究目的で脂質シグナル伝達分子を標的にすることによって、何を達成できるかを強調する（Ｇａｒｄｅｌｌ， ｅｔ ａｌ． （２００６）， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ １２： ６５−７５）。医学的に重要なリゾ脂質の２つの特定の実施例は、ＬＰＡ（グリセロール骨格）およびＳ１Ｐ（スフィンゴイド骨格）である。他のリゾ脂質は、スフィンゴシン、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、スフィンゴシルホスフォリルコリン（リゾスフィンゴミエリン）、セラミド、セラミド−１−リン酸、スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸、およびＮ−アセチル−セラミド−１−リン酸を含む。対照的に、Ｃ−１（ｓｎ１）にＯ−アルキル（−Ｏ−ＣＨ_２−）またはＯ−アルケニルエーテル、およびＣ−２にアシルを含有する、プラスマロゲンは、リゾ脂質類から除外される。選択されたＬＰＡ、Ｓ１Ｐ、およびジヒドロＳ１Ｐの構造が、以下で提示される。

ＬＰＡは、単一の分子的実体ではないが、様々な長さおよび飽和度の脂肪酸を伴う内因性構造変異体の集合である（Ｆｕｊｉｗａｒａ， ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ｖｏｌ． ２８０： ３５０３８−３５０５０）。ＬＰＡの構造骨格は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）等のグリセロール系リン脂質に由来する。Ｓ１Ｐ等のリゾスフィンゴ脂質の場合、ｓｎ−２におけるセラミド骨格の脂肪酸が欠落している。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）およびスフィンゴシルホスフォリルコリン（ＳＰＣ）の構造骨格は、スフィンゴミエリンに由来するスフィンゴシンに基づく。

ＬＰＡおよびＳ１Ｐは、同じ類の複数の膜貫通ドメインＧタンパク質共役（ＧＰＣＲ）受容体に結合することによって種々の細胞シグナル伝達経路を調節する、生物活性脂質（シグナル伝達脂質）である（Ｃｈｕｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ （２００６）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ， ｖｏｌ． １２： １６１−１７１、およびＭｏｏｌｅｎａａｒ， ＷＨ （１９９９）， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． ２５３： ２３０−２３８）。Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ_１、Ｓ１Ｐ_２、Ｓ１Ｐ_３、Ｓ１Ｐ_４、およびＳ１Ｐ_５（以前はＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−６、およびＥＤＧ−８）と指定され、ＬＰＡ受容体は、ＬＰＡ_１、ＬＰＡ_２、ＬＰＡ_３（以前はＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、およびＥＤＧ−７）と指定されている。ファミリーの４番目のＬＰＡ受容体が、ＬＰＡについて識別されており（ＬＰＡ_４）、他の推定受容体もまた、これらのリゾリン脂質について報告されている。

ＬＰＡは、真核および原核細胞の両方におけるリン脂質生合成の前駆体として長く知られてきたが、ごく最近では、ＬＰＡは、特定の細胞表面受容体に作用することによって標的細胞に影響を及ぼすように、活性化細胞、特に、血小板によって急速に産生および放出される、シグナル伝達分子として現れてきている（例えば、Ｍｏｏｌｅｎａａｒ， ｅｔ ａｌ． （２００４）， ＢｉｏＥｓｓａｙｓ， ｖｏｌ． ２６： ８７０−８８１、およびｖａｎ Ｌｅｅｗｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００３）， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ， ｖｏｌ ３１： １２０９−１２１２を参照）。小胞体内で合成され、より複雑なリン脂質に加工される以外に、ＬＰＡは、細胞活性化後に、既存のリン脂質の加水分解を通して生成することができる。例えば、ｓｎ−２位は、一般的に、脂肪酸とエステル結合したｓｎ−１ヒドロキシルのみを残して、脱アシル化により脂肪酸残基が欠けている。また、多くの腫瘍型が自家毒素を上方調節するため、ＬＰＡ産生における主要酵素である自家毒素（ｌｙｓｏＰＬＤ／ＮＰＰ２）は、癌遺伝子の産物であり得る（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ， Ｄ． （２００４）， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ｖｏｌ． ９２： ９００−１２）。高感度かつ特異的なＬＣ／ＭＳ手順を使用して行われた判定を含む、ヒト血漿および血清中のＬＰＡの濃度が報告されている（Ｂａｋｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ｖｏｌ ２９２： ２８７−２９５）。例えば、２５℃で１時間放置された、新たに調製したヒト血清では、ＬＰＡ濃度は、約１．２ｍＭであると推定され、ＬＰＡ類似体１６：０、１８：１、１８：２、および２０：４が優勢種であった。同様に、２５℃で１時間放置された、新たに調製したヒト血漿では、ＬＰＡ濃度は、約０．７ｍＭと推定され、１８：１および１８：２ＬＰＡが優勢種であった。

ＬＰＡは、細胞増殖の誘導、細胞移動および神経突起退縮の刺激、ギャップ結合の閉鎖、および粘菌の走化性にも及ぶ、広範囲の生物学的応答に影響を及ぼす（Ｇｏｅｔｚｌ， ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ， ｖｏｌ． ２： ３２４−３３８）。ＬＰＡの生物学に関する知識体系は、ますます多くの細胞系がＬＰＡ応答性について試験されるにつれて増大し続ける。例えば、細胞成長および増殖を刺激することに加えて、ＬＰＡは、創傷修復および再生において重要な事象である、細胞伸張および細胞表面フィブロネクチン結合を促進することが現在知られている（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ， ｅｔ ａｌ． （２００４）， ＢｉｏＥｓｓａｙｓ， ｖｏｌ． ２６： ８７０−８８１）。最近、抗アポトーシス活性も、ＬＰＡに起因するとされており、ペルオキシソーム増殖受容体ガンマはＬＰＡの受容体／標的であることが最近報告されている（Ｓｉｍｏｎ， ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ｖｏｌ． ２８０： １４６５６−１４６６２）。

ＬＰＡは、アストロサイト、脈絡叢細胞、および炎症細胞によって合成され、活性化時に放出される。その濃度は、炎症、凝固、および外傷の間に増加する。ＬＰＡは、神経、生殖器、胃腸、および血管系内の事象を制御し、また、癌、初期哺乳類胚発生、および幹細胞において重要な役割を有する、広範囲に及ぶ発生、生理学的、および病理学的作用を有することが明確に識別されている。ＣＮＳでは、例えば、ＬＰＡレベルは、血液脳関門の完全性が損傷される病的状態で増加し、神経外傷の間の炎症反応に寄与する重要因子になる。

Ｃ．ＬＰＡの阻害剤

ＬＰＡの阻害剤は、必然ではないが、典型的には、生理学的条件下で、ＬＰＡ活性を妨げるか、またはＬＰＡの有効濃度を低下させる作用物質である。ＬＰＡ活性は、直接および／または間接的方法によって阻止され得る。間接的方法は、受容体へのＬＰＡ作用を阻害する、ＬＰＡ生合成を阻害する、またはＬＰＡ分解を刺激する作用物質を採用する。ＬＰＡ合成に関与するオートタキシン（ＡＴＸ）等の酵素の阻害剤が、ＬＰＡの間接的阻害剤の実施例である。ＬＰＡ阻害の直接的方法は、ＬＰＡに直接結合し、ＬＰＡの活性または有効濃度を阻害する、作用物質を採用する。ＬＰＡに対する抗体が、ＬＰＡの直接阻害剤のうちにある。ＬＰＡ阻害剤の実施例は、米国特許および公開は、第７，４９４，７７５号、第７，４７０，５０９号、第５，９９４，１４１号、第２０１００２９１０６８号、第２０１０００３４８１４号、第２０１００００３６８２号、第２００９０１３６９６１号、第２００８００７１１１６号、第２００５０２１４８３１号、第２００４０１３７５４１号、第２００３０１１３９２８号、第２００３００８７２５０号、第２００２０１８２６１９号、第２００２０１５０９５５号、第２００２０１２３０８４号、第７，９４７，６６５号、第７，２１７，７０４号、第６，８７５，７５７号、第２０１００２６１６８１号、第２００９００２９９４９号、第２００８００９０７８３号、第２００７００７８１１１号、第２００６０２７０６３４号、第２００６０００９５０７号、第２００５０２６１２５２号、第２００４０２２０１４９号、第２００４０２０４３８３号、第２００３０１３０２３７号、第２００３００２７８００号、第７，８２０，７０３号、第７，１６９，８１８号、第２００５０１０７４４７号、第２００４０１２２２３６号、第２００９０１９７８３５号、第２００９００６２２３８号、第２００８０３１８９０１号、第７，４５９，２８５号、第７，９８９，６６３号、第２０１００３３０１４３号、第２０１００２６１６８１号、第２０１００２６０６８２号、第２００９００６８６９７号、第２００８００２５９５０号、第２００７０１２３４９２号、第２００４０１７１０９６号、第２０１１００８２１８１号、第２０１１００８２１６４号、第２０１００３１１７９９号、および第２０１００１５２２５７号で開示されている。

ｉ．ＬＰＡに対する抗体

自然発生ＬＰＡに対するポリクローナル抗体が文献で報告されている（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ． ２０００ Ａｕｇ ７；１０（１５）: １６９１−３）が、ＬＰＡに対するモノクローナル抗体は、その両方が、あらゆる目的でその全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、２００８年６月１９日に公開されたＳａｂｂａｄｉｎｉらの米国特許出願公開第２００８０１４５３６０号 （代理人整理番号ＬＰＴ−３１００−ＵＴ４）、および２００９年５月２８日に公開された米国特許出願公開第２００９０１３６４８３号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２００−ＵＴ）まで説明されていなかった。前者の公開は、ＬＰＡに対する一連のマウスモノクローナル抗体の産生および特性化を説明し、後者の公開は、ＬＰＡに対するヒト化モノクローナル抗体を説明する。ＬＰＡに対する付加的なヒト化モノクローナル抗体が、２０１０年４月１６日出願の米国特許出願第１２／７６１，５８４号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ）で開示されており、その内容も、それらの全体で本明細書に組み込まれる。これらの抗ＬＰＡ抗体は、ＬＰＡに高度に特異的である。タンパク質標的と異なって、ＬＰＡ等の生物活性脂質は、種にわたって同一である。したがって、動物モデルで効能および安全性を示す抗体は、より容易にヒトに変換される。抗体薬剤は、小分子薬剤よりも大幅に安全である。マウス抗ＬＰＡ ｍＡｂｓで行われた予備的な７日間の毒性研究は、抗体が生物活性脂質であるＬＰＡに高度に特異的であり、また、組織アレイのウェスタンブロット法またはＩＨＣでいかなるタンパクエピトープにも交差反応しないという事実に相応する、優れた安全性プロファイルを示す。

Ｄ．幹細胞分化および幹細胞治療におけるＬＰＡの役割
ｉ．神経幹細胞および治療

神経分化におけるＬＰＡの役割は、ＬＰＡが分化において役割を果たすと考えられる、種々の体系について最も良く研究されている。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン新生の領域中で見出され、神経損傷部位に移動することができる。したがって、ＮＳＣは、神経変性環境でニューロンを置換し、接続を回復する目的で研究されている。Ｄｏｔｔｏｒｉ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６（５）： １１４６−１１５４。

神経系の損傷、出血、または外傷に続いて、これらの組織内のＬＰＡのレベルが増加する。Ｔｉｇｙｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １９９５ Ｍａｙ；２６８（５ Ｐｔ ２）：Ｈ２０４８−５５、Ｓｔｅｉｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ） −Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ １５８２： １５４−１６０。損傷後に到達するレベルと同等のＬＰＡレベルが、ヒトＮＳＣのニューロン分化を阻害し得ることが示されており、損傷後のＣＮＳ内の高レベルのＬＰＡが、ＮＳＣのニューロンへの分化を阻害し、したがって、内因性ニューロン再生を阻害し得ることを示唆している。したがって、ＬＰＡシグナル伝達の変調は、神経系損傷に大きな影響を及ぼして、新しい潜在的治療アプローチを可能にし得る。

本発明は、幹細胞を包囲する環境内でＬＰＡのレベルを中和または減少させるために、幹細胞と併せて、または組み合わせてＬＰＡの阻害剤を投与することによって、神経系損傷の幹細胞治療を増進または向上させることに関する。

ＬＰＡは、神経損傷および／または損傷後の修復の成果における因果役割である。ＬＰＡは、ＴＢＩを含むいくつかの神経病態生理学に関連する可能性が非常に高い影響である、神経幹／前駆細胞（ＮＳ／ＰＣ）のニューロン分化の強力な阻害剤として識別されている。ＬＰＡは、（１）ＬＰＡが、損傷への初期応答に関与し、最終的に神経細胞壊死および神経膠症をもたらす、炎症性および血栓形成メディエータである、および（２）ＬＰＡが、ＮＳ／ＰＣ活性を妨げることによって神経組織再生反応を阻害するといった、不良な成果に寄与する２つの作用機構を有すると仮定される。ＬＰＡ受容体２（ＬＰＡＲ_２）の上方調節が、成体マウスＣＮＳおよびヒト脳における損傷後に示されている。Ｆｒｕｇｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３１：５６９−５７７。したがって、ＬＰＡ調節異常／上方調節は、損傷の進行に寄与し得る。

ＬＰＡは、生物活性脂質における幹細胞活性を活発に阻害する損傷、神経変性、および虚血の間に上方調節される主要シグナル伝達分子のうちの１つであると示唆されている。ＣＮＳでは、ＬＰＡレベルは、血液脳関門の完全性が損傷される病的状態で増加し、神経外傷の間の炎症反応、神経膠症、および神経細胞死に寄与する重要因子になる。これに関連するＬＰＡの役割は、ニューロン分化のモデル系を使用して解明されている。Ｄｏｔｔｏｒｉらを参照されたい。この研究は、ＬＰＡがＮＳ／ＰＣ活性を阻害し、ＬＰＡレベルが損傷後に上昇させられることを実証する。したがって、損傷部位におけるＬＰＡ放出がＮＳ／ＰＣのニューロン分化を阻害することが考えられる。

脊髄損傷に続いて、炎症性脂質であるＬＰＡのレベルが、中枢神経系（ＣＮＳ）内、および損傷部位で増加する。ＬＰＡは、ニューロンの非再生に強く寄与し、炎症を増加させ、ニューロンへの神経幹細胞分化を阻害する。これらの影響は、脊髄にとって高度に有害である。

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、頭部への殴打または衝撃、あるいは貫通性頭部損傷に起因する、脳の機能の崩壊である。米国では毎年１５０万件以上のＴＢＩがあり、これらのうちの１２５，０００件が永久身体傷害をもたらす。また、ＴＢＩは、戦場での軍事負傷者の主要な原因であり（現在までイラクおよびアフガニスタンから１５０，０００件）、退役軍人が苦しむ長期リハビリテーションの主要な問題源である。致命的ではないとき（中度ＴＢＩ患者の２２％および重度ＴＢＩ患者の３５％が損傷後の最初の１年以内に死亡する）、ＴＢＩは、長期健康管理を必要としている罹患者を残して、永久的かつ重度の身体、認知、および行動障害をもたらし得る。現在、ＴＢＩを標的にするＦＤＡ承認薬剤はない。幹細胞治療の一部として直接的または間接的にＬＰＡを妨げることが、例えば、外傷（ＴＢＩ）または脊髄損傷（ＳＣＩ）後に、修復を劇的に増進するであろうと考えられる。

神経幹細胞は、ニューロン分化、または非ニューロン性のグリア細胞形成であるグリア分化（グリア新生）に進むという選択肢を有する。大グリア細胞（グリア）は、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む。したがって、一般に、ニューロン分化が増加するにつれて、グリア分化が減少し、その逆も同様である。したがって、ニューロン分化の増加は、ニューロン形成の増加によって、またはグリア分化の減少によって判定され得る。ＮＳＣは、浮遊神経球として生体外で維持することができ、生体外でニューロンに分化することができる。これは、顕微鏡下で可視的である、神経球からのニューロンの外方成長を可視化して定量することによって、分析することができる。これは、ニューロン分化への抗ＬＰＡ抗体または他のＬＰＡ阻害剤の効果を観察するための的確なシステムを提供する。

抗ＬＰＡ阻害を組み込む幹細胞治療はまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびその他等の多数の神経変性症状で有効となるであろう。そのような実施形態の中には、広範囲の神経変性疾患で有用であり得る、併用療法がある。

ｉｉ．心臓幹細胞および治療

ａ．梗塞後の心筋再生：虚血性心筋梗塞は、心筋組織の損傷、ならびに相応する負の組織リモデリングおよび心臓機能の損失をもたらす。したがって、心筋梗塞後に心臓組織を再生するための幹細胞移植の使用は、熱心な研究の主題である（Ｓｈａｈ ａｎｄ Ｓｈａｌｉａ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ． ２０１１；２０１１：５３６７５８． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｍａｙ １１）。組織を再生するための幹細胞移植の多くの他の検討された使用の場合のように、心臓組織の中の外部から移植された細胞の保持および生存の成功を確保する方法を含む、移植の成功への多くの課題がある。細胞培養および後続の同種移植のために心臓、骨格筋、および脳等のほとんどの組織から幹細胞を収穫することが困難であるため、同種異系移植のための幹細胞源さえも、これらの組織にとって困難である。骨髄および脂肪組織等の容易に接近可能な組織に由来する幹細胞が使用されてもよい。加えて、幹細胞前駆体、または骨髄（ＢＭＣ）あるいは脂肪組織（ＡＳＣ）等の非心臓源に由来する幹細胞は、いったん移植および播種されると、最適な組織に分化しなければならない。脂肪組織由来幹細胞は、自家幹細胞移植に使用されており、これらの幹細胞の心筋細胞への分化転換の能力を例証する。しかしながら、これらの移植組織の生存は不良であった。生体高分子の同時投与が、ＭＩ後のラットにおける脂肪由来幹細胞の保持を向上させるために使用されてきた（Ｄａｎｏｖｉｚ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１０ Ａｕｇ １０；５（８）：ｅ１２０７７）。本発明に関連して、ＬＰＡの阻害が、心筋梗塞を含む心疾患の治療のための幹細胞治療の生存および有効性を増進させ得ると考えられる。

ｂ．癌化学療法または末期心不全後の心筋再生：幹細胞移植は、ＭＩによる心不全だけでなく、任意の原因（例えば、ウイルス性心筋炎、化学療法、特発性心不全）の末期心不全の治療でも想定される。例えば、ドキソルビシン、カンプトセシン、およびタプシガルギン等の癌化学療法剤は、心筋細胞の死により心不全をもたらす、心臓への周知の副作用を有する（Ｍａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２０１１ Ｓｅｐ；１１（３）：２５３−６２）。したがって、幹細胞治療は、心臓における化学療法誘発性細胞死と関連付けられる、負の心臓リモデリングを予防すると想定される。幹細胞へのＬＰＡを中和させるという有益な効果により、ＬＰＡの阻害は、心不全に対する幹細胞治療の有効性を増進させるであろうと考えられる。

ｃ．虚血心臓の治療としての幹細胞指向性血管新生：幹細胞は、心筋虚血後に治療的血管新生を誘発するために使用されてきた。心臓虚血後にラットに移植された間葉系幹細胞は、増進した心臓機能、および心筋細胞に分化した小数の幹細胞をもたらした。毛細血管密度もまた、対照よりも幹細胞移植心臓で高かった。Ｔａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｅｕｒ． Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ−ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇ．３０：３５３−３６１。本発明に関連して、例えば、内皮細胞前駆細胞（ＥＰＣ）もまた、例えば、ＭＩまたは非ＭＩ急性冠症候群（ＡＣＳ）後に、心臓において血管新生を推進するために使用することができる。

内皮細胞前駆細胞（ＥＰＣ）が、ＭＩまたは非ＭＩ急性冠症候群（ＡＣＳ）後に心臓内の血管新生を推進するために使用されてもよい。ＥＰＣは、単離して生体外で培養し、次いで、心臓カテーテル法によってブタ等の大型実験動物に同種移植することができる。動物は、全身投与ならびにカテーテルを用いたＥＰＣとの同時投与によって、抗ＬＰＡ ｍＡｂｓで治療することができる。次いで、播種ＥＰＣは、虚血性事象後に血流を向上させるように、新血管形成を推進するであろう。虚血は、外科的冠状動脈結紮、心臓カテーテルを使用する熱凝固によって、または収縮および後続の虚血を推進するように冠状血管の周囲に外科的に配置されたアメロイドリングの使用によってのいずれかで、誘発することができる。

ｉｉｉ．神経筋障害に対する幹細胞治療

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）等の筋ジストロフィーは、幹細胞治療の候補である（Ｎｅｇｒｏｎｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１１ Ｆｅｂ；１１（２）：１５７−７６によって論評されている）。ＤＭＤおよび関連遺伝障害に対する効果的な治療はない。筋芽細胞、中胚葉性血管芽細胞、周皮細胞、筋内皮細胞、ＣＤ１３３＋細胞、アルデヒドデヒドロゲナーゼ陽性細胞、間葉系幹細胞、胚幹細胞、および通常は筋組織に直接注入するための人工多能性幹細胞を含む、種々の幹細胞源が提案されている。マウスのｍｄｘ株が、ＤＭＤのモデルとして一般的に使用されている。いくつかの臨床試験が試行されてきたが、筋機能の回復および欠落したジストロフィンタンパク質の発現の回復においてほとんど成功していない（同節のＮｅｇｒｏｎｉらによって論評されている）。細胞注入点または全身のいずれかで、あるいは両方での抗ＬＰＡ阻害剤の同時投与は、埋め込まれた細胞の再生能を向上させ得ると考えられる。

ＡＬＳ患者用の脊髄由来幹細胞の第Ｉ相試験が、最近、Ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．の後援の下でＥｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで始まった。ＡＬＳに対する幹細胞治療の努力は、非常に予備的であるが、ＬＰＡの阻害を組み込む、この症状に対する幹細胞治療は、治療的に有用となるであろう。

ｉｖ．糖尿病および関連疾患の治療のための幹細胞治療：

Ｉ型糖尿病患者は、ランゲルハンス島の膵臓ベータ細胞の損失による、インスリン欠乏に罹患している。１型糖尿病の治療のための同種異系島細胞移植、および（膵炎の治療の場合等の）膵全切除術後の外科的糖尿病の予防のための自家島細胞移植が試行されており、これらのアプローチは、抗ＬＰＡ阻害の追加によって潜在的に増進させることができる。１型糖尿病患者のための幹細胞治療の課題および成功が、最近、論評されている（Ａｇｕａｙｅ−Ｍａｚｚｕｃａｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２０１０ Ｍａｒ；６（３）：１３９−４８）。一般的に幹細胞治療の場合のように、グルコース誘発性インスリン産生島細胞への前駆細胞の変換は、まだ完成されておらず、新しい方略が必要とされる。本明細書で提案される１つのそのような新しい方略は、例えば、分化転換等の分化の推進によって、幹細胞の効能を増進する、抗ＬＰＡ 阻害の同時投与である。１型糖尿病の好ましい動物モデルは、ストレプトゾトシン治療が島ベータ細胞の死および耐糖能異常の発生をもたらす、ＳＴＺラットである。島前駆細胞が、島細胞機能を回復させるために、このモデルで使用されてきた（Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ． ２０１０ Ｎｏｖ；３１（１１）：１４５４−６３． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｏｃｔ １８）。加えて、骨髄由来間葉系幹細胞の空洞内移植が、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの勃起機能を回復させるために使用されてきた（Ｊｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ． ２０１０ Ｓｅｐ；４２（７）：２７４５−５２）。

３．定義

本発明を詳細に説明する前に、本発明と関連して使用されるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、必要に応じて他の用語を本明細書の他の箇所で定義する。本明細書で別途明確に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語は、それらの当該技術分野で認められている意味を有する。

「同種移植」または「同種異系移植」は、受容側と同種の遺伝的に同一ではない構成員からの細胞、組織、または臓器の移植である。

「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、抗原またはエピトープに結合することが可能である、免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来する、それらに倣って作製される、またはそれらによってコードされる、任意の形態のペプチド、ポリペプチドを指す。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃ． Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｐ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｍ．， Ｗａｌｐｏｒｔ， Ｍ．Ｊ． Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｄ．， ｅｄ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （２００１）を参照されたい。

「抗体誘導体」は、免疫由来部分、すなわち、抗体に由来する分子である。これは、例えば、抗原に対して所望のレベルの結合活性を保持する、抗体変異体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、抗体複合体、および同等物を包含する。

本明細書で使用されるように、「抗体断片」は、インタクト抗体の抗原結合部位または可変領域を含む、インタクト抗体の一部分を指し、該部分は、インタクト抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含み得ない。代替として、定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）の複数部分を、「抗体断片」に含むことができる。抗体断片は、抗原結合能を保持し、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、Ｆｄ、およびＦｖ断片、ダイアボディ、トライアボディ、一本鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）、ミニボディ、ナノボディ、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を伴う、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および残留「Ｆｃ」断片を産生し、その名前は、容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することが可能である、Ｆ（ａｂ′）_２断片を生じる。一例として、Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する、最小限の抗体断片である。この領域は、緊密に非共有結合している１本の重鎖および１本の軽鎖可変ドメインの二量体から成る。各可変ドメインの３つの超可変領域が、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つの超可変領域が、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つだけの超可変領域を含むＦｖの半分）さえも、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して結合する能力を有する。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。概して、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）を参照されたい。

Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ′断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステイン（複数可）を含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少数の残基の追加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つ、Ｆａｂ′に対する本明細書での指定である。Ｆ（ａｂ′）_２抗体断片は、本来、それらの間にヒンジシステインを有する、複数対のＦａｂ′断片として産生された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

「抗体変異体」は、本明細書では、抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基（複数可）の追加、削除、および／または置換により、アミノ酸配列が天然抗体（例えば、抗ＬＰＡ抗体）アミノ酸配列とは異なり、かつ親抗結合抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持する、分子を指す。所望の活性は、抗原に特異的に結合する能力、生体外で増殖を阻害する能力、生体内で血管新生を阻害する能力、および生体外でサイトカインプロファイルを変化させる能力を含むことができる。抗体変異体におけるアミノ酸変化（複数可）は、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ_１ドメイン、ＣＨ_２ドメイン、ＣＨ_３ドメイン、およびヒンジ領域内を含む、軽鎖および／または重鎖の可変領域または定常領域内にあり得る。一実施形態では、変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域（複数可）における１つ以上のアミノ酸置換（複数可）を含む。例えば、変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域の中で、少なくとも１個、例えば、約１個〜約１０個、好ましくは約２個〜約５個の置換を含んでもよい。通常、変異体は、親抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有するであろう。この配列に対する同一性または相同性は、最大配列同一性割合を達成するように、配列を整合させ、必要であればギャップを導入した後に親抗体残基と一致する、候補配列中のアミノ酸残基の割合として本明細書で定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部の伸長、削除、あるいは抗体配列内への挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼさないものとして解釈されるものとする。変異体は、ＬＰＡに結合する能力を保持し、好ましくは、親抗体のものより優れた所望の活性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性、血管新生を低減させ、および／または腫瘍進行を停止させる増進した能力を有してもよい。そのような所望の特性（例えば、より低い免疫原性、より長い半減期、増進した安定性、増進した効力）を分析するために、例えば、抗スフィンゴ脂質抗体のフォーマットが、本明細書で開示される生物学的活性アッセイにおけるその活性に影響を及ぼすことが見出さされているため、Ｆａｂ形態の変異体をＦａｂ形態の親抗体と、または完全長形態の変異体を完全長形態の親抗体と比較するべきである。本明細書で特に目的とする変異体抗体は、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約５、２５、５９％、またはそれ以上の少なくとも１つの所望の活性を示すものであり得る。好ましい変異体は、親抗体と比較したときに、生体外で測定されるような優れた生物物理学的特性、または生体外あるいは生体内で測定されるような優れた生物学的活性を有するものである。

「抗原」という用語は、抗原に結合する抗体分子または免疫由来部分によって認識および結合される分子を指す。抗体によって結合される抗原の特定の部分は、「エピトープ」と呼ばれる。

「抗ＬＰＡ抗体」は、リゾホスファチジン酸に結合する任意の抗体または抗体由来分子を指す。「抗ＬＰＡ抗体」、「ＬＰＡに結合する抗体」、および「ＬＰＡと反応する抗体」という用語は、互換性がある。

「自家移植片」または「自家移植」は、概して、何らかの種類の治療後に、対象自身の細胞または組織（例えば、骨髄）を対象の中へ戻す移植を指す。

「生物活性脂質」は、脂質シグナル伝達分子を指す。生物活性脂質は、細胞外および／または細胞内シグナル伝達を仲介し、したがって、分化、移動、増殖、分泌、生存、および他のプロセスを変調することによって、多くの種類の細胞の機能を制御することに関与するという点で、構造脂質（例えば、膜結合リン脂質）とは区別される。

抗体または抗体断片あるいは変異体との関連で「生物学的に活性な」という用語は、所望のエピトープを結合し、いくつかの方法で生物学的効果を及ぼすことが可能である、抗体または抗体断片あるいは抗体変異体を指す。生物学的効果は、成長シグナルの変調、抗アポトーシスシグナルの変調、アポトーシスシグナルの変調、エフェクタ機能カスケードの変調、および他のリガンド相互作用の変調を含むが、それらに限定されない。

「バイオマーカー」は、疾患の進行または治療の効果を測定するために有用となる特定の分子特徴を有する、体内の特定の生化学である。

「キャリア」は、ハプテンに共役するために適合され、それにより、ハプテンに免疫原性を付与する部分を指す。代表的で非限定的な類のキャリアは、タンパク質であり、その実施例は、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルタニン、破傷風、およびジフテリアトキソイドを含む。本発明による使用に好適である、キャリアの他の類および実施例は、当技術分野で公知である。これらのキャリア、ならびに後に発見または発明される天然または合成キャリアを、本発明による用途のために適合することができる。

「化学療法剤」という用語は、抗癌剤および他の抗過剰増殖剤を意味する。したがって、化学療法剤は、一般的な治療剤の一部である。化学療法剤は、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ドノルビシン、エピルビシン）、アルキル化剤（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパ、およびトリエチレンメラミン）、白金誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、シスジアンミンジクロロ白金）、およびトポイソメラーゼ阻害剤（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）といった、ＤＮＡ傷害剤およびＤＮＡ合成を阻害する薬剤、カペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化型であるａｒａ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、６−チオグアニン）等の抗代謝物質、抗血管新生剤（ベバシズマブ、サリドマイド、スニチニブ、レナリドマイド、ＴＮＰ−４７０、２−メトキシエストラジオール、ラニビズマブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ペガプタニブ、エンドスタチン）、血管破壊剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、ＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａ等のコンブレタスタチン誘導体等）、抗体等の生物製剤（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｐａｎｏｒｅｘ、Ｒｉｔｕｘｉｎ、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｍｙｌｏｔａｒｇ、Ｃａｍｐａｔｈ、Ｂｅｘｘａｒ、Ｅｒｂｉｔｕｘ）、アロマターゼ阻害剤（４−ヒドロアンドロステンジオン、エキセメスタン、アミノグルテヒミド、アナストラゾール、レトゾール）、抗エストロゲン剤（タモキシフェン、トレミフィン、ラオキシフェン、Ｆａｓｌｏｄｅｘ）、デキサメタゾン等のステロイド剤といった内分泌療法剤、ＩＦＮ−ベータおよびＩＬ２等のサイトカイン、インテグリン、他の接着タンパク質、およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害剤といった免疫調節剤、スベロイルアニリドヒドロキサム酸のようなヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）のようなチロシンキナーゼの阻害剤等のシグナル伝達の阻害剤、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシンのような熱ショックタンパク質の阻害剤、全トランスレチノイン酸等のレチノイド、成長因子受容体または成長因子自体の阻害剤、タキソイド（パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール、ＢＡＹ ５９−８８６２）、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン等の抗有糸分裂化合物および／またはチューブリン脱重合化剤、ＣＯＸ阻害剤等の抗炎症剤および細胞周期調節剤、例えば、チェックポイント調節剤およびテロメラーゼ阻害剤を含むが、それらに限定されない。

「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）という用語は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である、重鎖および／または軽鎖を含む分子を指す一方で、残りの鎖（複数可）は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるとともに、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を指す（Ｃａｂｉｌｌｙ， ｅｔ ａｌ．，下記、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ｖｏｌ． ８１：６８５１ （１９８４））。

「併用療法」という用語は、指示された治療効果を達成するための少なくとも２つの明確に異なる治療の提供を伴う、治療計画を指す。例えば、併用療法は、２つ以上の化学的に明確に異なる活性成分、例えば、幹細胞組成物およびＬＰＡを阻害する薬剤（例えば、抗ＬＰＡ ｍＡｂまたはそのような抗体に由来するＬＰＡ結合抗原結合断片）の投与を伴ってもよい。代替として、併用療法は、放射線療法および／または外科手術等の別の治療の送達と併せて、抗ＬＰＡ剤および幹細胞組成物の投与を伴ってもよい。特に好ましい実施形態では、併用療法は、幹細胞、およびＬＰＡを結合して中和させる抗体（またはその断片に結合する抗原）の治療的投与を伴ってもよい。併用療法の投与に関連して、活性成分（すなわち、幹細胞組成物および抗ＬＰＡ剤）は、同一の組成物の一部として、または異なる組成物として投与されてもよいことが理解される。別個の組成物として投与されたとき、異なる活性成分を含む組成物が、特定の状況の要求に応じて、かつ担当医によって判定される通りに、同一または異なる時間に、同一または異なる投与回数で、同一または異なる経路によって、同一または異なる投与計画を使用して、投与されてもよい。同様に、１つ以上の抗ＬＰＡ剤、例えば、抗ＬＰＡ抗体が、幹細胞と、また場合によっては放射線および／または外科手術と組み合わせて使用されるとき、抗ＬＰＡ種は、幹細胞、外科手術、および／または放射線治療の前に、同時に、または後に送達されてもよい。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を伴う小型の抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ）。短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にしないリンカーを使用することによって、ドメインは、強制的に別の鎖の相補的ドメインと対合して、２つの抗原結合部位を作成させられる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７、ＷＯ ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）で、さらに十分に説明されている。

「有効濃度」は、例えば、ある望ましくない生物活性脂質の絶対的、相対的および／または利用可能な濃度および／または活性を指す。換言すれば、生物活性脂質の有効濃度は、その生物学的機能を果たすために利用可能な、および発揮することができる脂質の量である。例えば、（例えば、ＬＰＡ等の）生物活性脂質を対象にするモノクローナル抗体は、脂質に結合し、その生物学的機能を果たすことを不可能にすることによって、脂質の有効濃度を低減させることができる。この実施例では、脂質自体は依然として存在する（換言すれば、抗体によって分解されていない）が、その受容体または他の標的を結合して下流効果を引き起こすことがもはやできなくなるため、絶対濃度よりもむしろ「有効濃度」が適切な測定である。生物活性脂質の有効濃度を低減させることは、標的脂質を「中和させる」と言われてもよい。生物活性脂質の有効濃度を直接的および／または間接的に測定するための方法およびアッセイが存在する。

「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体に由来する抗体抗原結合部分と反応する、抗原の部分を指す。

「完全ヒト抗体」は、免疫原が与えられたときに、ＣＤＲ移植を必ずしも必要としないヒト抗体を産生することができる、遺伝子操作された（すなわち、トランスジェニック）マウス（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ製）において産生される抗体を指すことができる。これらの抗体は、非ヒト抗体遺伝子が抑制され、ヒト抗体遺伝子発現に置換されているマウス等の動物に由来する完全ヒト（１００％タンパク質配列）である。本出願者らは、関連ＣＤＲに対するヒトフレームワークを産生することが可能であり得る、これらの遺伝子操作されたマウスまたは他の動物に与えられた場合、生物活性脂質に対して抗体を生成できると考える。

「ハプテン」は、非免疫原性であるが、抗体または抗体に由来する抗原結合部分と反応することができる、物質である。換言すれば、ハプテンは、抗原性という特性を有するが、免疫原性を持たない。ハプテンは、概して、ほとんどの状況下で、キャリア、例えば、タンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コロイド金、シリコーンビーズ、または同等物に付着したときのみ免疫応答を誘発する（すなわち、抗原として作用する）ことができる、小分子である。キャリアは、同様に単独では免疫応答を誘発しないものであってもよい。

「ヘテロ共役抗体」という用語は、２つの共有結合した抗体を指すことができる。そのような抗体は、架橋剤の使用を含む、合成タンパク質化学で既知の方法を用いて調製することができる。本明細書で使用されるように、「共役」という用語は、１つ以上の抗体断片（複数可）または結合部分の１つ以上のポリマー分子（複数可）への共有結合によって形成される分子を指す。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ抗体である。または別の見方をすれば、ヒト化抗体は、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の選択された配列も含有する、ヒト抗体である。ヒト化抗体は、その結合および／または生物学的活性を有意に変化させない、同一または異なる種に由来する保存的アミノ酸置換または非天然残基を含むことができる。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、受容側の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ、またはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基に置換されている、ヒト免疫グロブリン（受容抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置換される。ＣＤＲは、所望のレベルの抗原結合が保持される限り、種々のフレームワークのうちのいずれかの中に配置することができる。

さらに、ヒト化抗体は、受容抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含むことができる。抗体の性能をさらに洗練して最大限可するように、このような修飾が行われる。したがって、一般に、ヒト化抗体は、全体または超可変ループの全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つの可変ドメイン、一態様では２つの可変ドメインの全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、随意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、またはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むであろう。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第 ４，８１６，３９７号、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ８６／０１５３３号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号、Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号、Ｗｉｎｔｅｒ，欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願公開第０，５１９，５９６ Ａ１号、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６：１００２９−１００３３を参照されたい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２：５９３−５９６（１９９２）、およびＨａｎｓｅｎ，ＷＯ ２００６１０５０６２を参照されたい。

「過剰増殖性障害」という用語は、限定されないが、癌および良性腫瘍をもたらす臓器および組織細胞の制御されていない成長を含む、細胞の制御されていない増殖と関連付けられる疾患および障害を指す。内皮細胞と関連付けられる過剰増殖性障害は、血管腫等の血管新生、子宮内膜症、肥満症、加齢性黄斑変性症および種々の網膜症、ならびにアテローム性動脈硬化症の治療でのステント挿入の結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖といった疾患をもたらし得る。線維芽細胞を伴う過剰増殖性障害（すなわち、線維形成）は、加齢性黄斑変性症等の過剰な瘢痕化（すなわち、線維化）、心筋梗塞と関連付けられる心臓リモデリングおよび心不全、外科手術または傷害の結果として一般的に生じるケロイド等の過剰な創傷治癒、ならびに類繊維腫およびステント挿入といった障害を含むが、それらに限定されない。

「免疫原」は、特定の免疫応答、特に、免疫原が投与された動物における抗体応答を誘発することが可能な分子である。本発明では、免疫原は、キャリアと共役した誘導体化生物活性脂質、すなわち、「誘導体化生物活性脂質共役」である。免疫原として使用される誘導体化生物活性脂質共役は、免疫原に応答して生成される抗体の検出のための捕捉物質として使用されてもよい。したがって、免疫原はまた、検出試薬として使用されてもよい。代替として、捕捉物質として使用される誘導体化生物活性脂質共役は、免疫原におけるものとは異なるリンカーおよび／またはキャリア部分を有してもよい。

特に生物学的現象との関連で「阻害する」ことは、減少させる、抑制する、または遅延させることを意味する。例えば、「腫瘍形成の阻害」をもたらす治療は、腫瘍が全く形成されないこと、または腫瘍が未治療対照よりもゆっくり形成されるか、あるいは数が少ないことを意味してもよい。

「ＬＰＡの阻害剤」または「ＬＰＡ阻害剤」は、必ずではないが典型的には生理学的条件下で、ＬＰＡ活性を妨げる、および／またはＬＰＡの有効濃度を低下させる薬剤である。同様に、「ＬＰＡの阻害」または「ＬＰＡ阻害」は、ＬＰＡ活性の妨害またはＬＰＡの有効濃度の低減を指す。ＬＰＡ阻害は、直接的および／または間接的方法によって達成されてもよい。ＬＰＡの「間接的阻害」は、受容体へのＬＰＡ作用を阻害する、ＬＰＡ生合成を阻害する、またはＬＰＡ分解を促す、薬剤を採用する。ＬＰＡ合成に関与するオートタキシン（ＡＴＸ）等の酵素の阻害剤が、ＬＰＡの間接的阻害剤の実施例である。ＬＰＡ阻害の「直接阻害」は、ＬＰＡに直接結合し、その活性または有効濃度を阻害する薬剤を採用する。ＬＰＡに対する抗体が、ＬＰＡの直接阻害剤の中にある。

「単離（された）」抗体は、その天然環境の構成要素から識別、分離および／または回収されたものである。その天然環境の汚染構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでもよい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって判定されるように抗体の９５重量％を上回るように、最も好ましくは９９重量％以上に、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性に、精製されるであろう。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないであろうから、単離抗体は、組み換え細胞内の原位置に抗体を含む。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。

本明細書で使用されるときの「標識」という語は、抗体に直接的または間接的に共役されるもの等の検出可能な化合物または組成物を指す。標識自体が、単独で検出可能であり得る（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）か、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。

本願の全体を通して使用されるときの「線状抗体」という語句は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）で説明されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。

本発明との関連で、「液体組成物」は、製造者から最終使用者（例えば、医師または看護師）に供給されるような、その充填または完成形態において、固体とは対照的に液体または溶液であるものを指す。ここで、「固体」は、液体または溶液ではない組成物を指す。例えば、固体は、凍結乾燥、冷凍乾燥、沈降、および類似手順によって調製される乾燥組成物を含む。

「代謝産物」という用語は、そこからＬＰＡが作製される化合物、ならびにＬＰＡの分解に起因する化合物、すなわち、リゾリン脂質代謝経路に関与する化合物を指す。「代謝前駆体」という用語は、そこからスフィンゴ脂質が作製される化合物を指すために使用されてもよい。

本明細書で使用されるような「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、または該抗体の集団を指す。集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生突然変異を除いて、本質的に同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を対象として、高度に特異的である。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるものとしての抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に説明されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）で説明されている技法を使用して、または当技術分野で公知の他の方法によって、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
本明細書のモノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスあるいはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方で、残りの鎖（複数可）が、別の種に由来するか、または他の抗体のクラスあるいはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を指す（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。

「単独療法」は、単回投与として投与されようと、経時的に複数回投与として投与されようと、１つの治療的に有効な化合物の送達に基づく治療計画を指す。

「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特性を有する、抗体またはモノクローナル抗体を指すことができる。一実施形態では、エピトープは、同じ抗原に由来する。別の実施形態では、エピトープは、２つ以上の異なる抗原に由来する。多重特異性抗体を作製するための方法が、当技術分野で公知である。多重特異性抗体は、二重特異性抗体（２つのエピトープに対する結合特性を有する）、三重特異性抗体（３つのエピトープ）等を含む。例えば、多重特異性抗体は、２つ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を使用して、組み換えによって作製することができる。代替として、多重特異性抗体は、化学結合を使用して調製することができる。当業者であれば、当技術分野で公知であり得るようなこれらまたは他の方法を使用して、多重特異性抗体を産生することができる。多重特異性抗体は、多重特異性抗体断片を含む。

「新生物」または「癌」は、異常な制御されていない細胞成長を指す。「新生物」、または腫瘍あるいは癌は、細胞成長の異常で調節されていない無秩序な増殖であり、概して、癌と呼ばれる。新生物は、良性または悪性であり得る。新生物が破壊的成長、侵襲性、および転移といった特性を有する場合、それは悪性または癌性である。侵襲性は、典型的には、組織の境界を画定する基底層を突破し、それにより、しばしば身体の循環系に進入する、周囲組織の浸潤または破壊によって、新生物の局所的拡大を指す。転移は、典型的には、リンパ管または血管による腫瘍細胞の播種を指す。転移はまた、漿膜腔、またはくも膜下腔あるいは他の空間を通した直接拡張による腫瘍細胞の移動も指す。転移のプロセスを通して、身体の他の領域への腫瘍細胞の移動は、最初の出現部位から離れた領域中で新生物を確立する。

「神経の」とは、神経に関するという意味である。神経は、ニューロンで構成される繊維束である。

「神経幹細胞」（ＮＳＣ）は、神経系の主要な表現型に分化する、自己再生性の多能性細胞である。ＮＳＣは、グリアおよび神経細胞を生じさせる。神経幹細胞は、神経細胞を生じさせる。神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、通常は生体内で限定数の複製サイクルを経る幹細胞分裂の子孫である。

「ニューロン」は、電気化学的シグナル伝達によって情報を処理および伝達する神経系内の興奮性細胞型を指す。ニューロンは、ＣＮＳ（脳および脊髄）および末梢神経の核となる構成要素である。「ニューロンの」は、「ニューロンに関する」という意味である。

「ニューロン分化」は、ニューロン、アストロサイト等の神経系の成熟細胞型に向かった神経幹細胞の変換である。そのような分化は、インビボで生じるが、ニューロスフェア等のモデル系において生体外で生じさせることができる。分化は、多重ステップまたは多段階プロセスであってもよく、したがって、分化の複数の段階またはステップを生体外で研究することができる。

本明細書での「親」抗体は、変異体の調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされるものである。親抗体は、天然抗体であってもよく、またはすでに、変異体、例えばキメラ抗体であってもよい。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。

本発明による「特許性のある」組成物、プロセス、機械、または製造品は、分析が行われるときに、対象物が特許性の全ての法的要件を満たすことを意味する。例えば、新規性、進歩性、または同等物に関して、１つ以上の請求項が、新規性、進歩性等を無効にするであろう１つ以上の実施形態を包含することを以降の調査が明らかにする場合、定義によって「特許性のある」実施形態に限定されている請求項（複数可）は、特許性のない実施形態（複数可）を特異的に除外する。また、本明細書に添付される請求項は、最も広い妥当な範囲を与えるとともに、それらの正当性を保護するように解釈されるものである。さらに、請求項は、本願が出願されるか、または特許として発行される時点から、添付の請求項のうちの１つ以上の正当性が疑問視される時点まで、特許性の法的要件のうちの１つ以上が改正された場合、または特許性の特定の法的要件が満たされているかどうかを評価するために基準が変化する場合の状況下で、（１）それらの正当性を保護する、および（２）最も広い妥当な解釈を与える方法で、解釈されるものである。

「薬学的に許容できる塩」という用語は、本発明の薬剤および化合物の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的または別様に望ましくない、製剤で使用される塩を指す。多くの場合、本発明の薬剤および化合物は、荷電基、例えば、荷電アミノおよび／またはカルボキシル基、あるいはそれらに類似する基の存在により、酸性および／または塩基性塩を形成することができる。薬学的に許容できる酸付加塩が、無機および有機酸から調製されてもよい一方で、薬学的に許容できる塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。薬学的に許容できる塩の論評については、Ｂｅｒｇｅ， ｅｔ ａｌ． （１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，ｖｏｌ．６６，１−１９を参照されたい。

「複数」は、２つ以上を意味する。

「分離（された）」、「精製（された）」、「単離（された）」という用語、および同等物は、試料入りの容器内に含有された試料の１つ以上の構成要素が、容器内に存在する１つ以上の他の試料構成要素から物理的に除去されるか、またはされている、あるいは容器内の１つ以上の他の試料構成要素の存在下で希釈されるか、またはされていることを意味する。分離または精製ステップ中に除去または希釈され得る試料構成要素は、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質、および未結合分子を含む。

「固相」によって、本発明の抗体が付着することができるもの等の非水性基質が意味される。本明細書に包含される固相の実施例は、部分的または完全にガラス（例えば、制御細孔ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンで形成されているものを含む。ある実施形態では、状況に応じて、固相は、アッセイプレートのウェルを備えることができ、他の実施形態では、それは、精製カラム（例えば、親和性クロマトグラフィカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号で説明されているもの等の離散粒子の不連続固相も含む。

「種」という用語は、本明細書において種々の文脈、例えば、化学療法剤の特定の種で使用される。各文脈において、本用語は、特定の文脈で参照される種類の化学的に不明瞭な分子の集団を指す。

抗体・抗原相互作用との関連での「特異的」または「特異性」という用語は、抗体とその標的エピトープと間の選択的な非ランダム相互作用を指す。ここで、「抗原」という用語は、抗体分子または他の免疫由来部分によって認識および結合される分子を指す。抗体によって結合される抗原の特定の部分は、「エピトープ」と称される。この相互作用は、分子間の適切な化学的または分子間相互作用を可能にする、構造的、疎水性／親水性、および／または静電特徴の存在に依存する。したがって、抗体は、一般的に、その標的抗原のエピトープに「結合する」（あるいは「特異的に結合する」）、またはそれ「と反応する」（あるいは「と特異的に反応する」）、または同等にそれ「に対して反応する」（あるいは「に対して特異的に反応する」と言われる。抗体は、一般的に当技術分野では、抗原への抗体結合の略記として、それらの抗原「に対する（ａｇａｉｎｓｔまたはｔｏ）」ものと表される。したがって、「ＬＰＡに結合する抗体」、「ＬＰＡに対して反応する抗体」、「ＬＰＡと反応する抗体」、「ＬＰＡに対する抗体」、および「抗ＬＰＡ抗体」は、全て同一の意味を有する。抗体分子は、所与の一式の条件下で、所望の抗原への結合を無関係な抗原または類似抗原あるいは抗原混合物への結合と比較することによって、結合の特異性について試験することができる。好ましくは、本発明に従って使用される抗体は、無関係な抗原、またはさらに標的抗原の類似体への有意な結合が欠けているであろう。

「幹細胞」は、時には不活性の長期間後に、細胞分裂を通して自身を再生することが可能な未分化細胞である。第２に、ある生理学的または実験条件下で、それらは、特殊機能を伴う組織または臓器特異的細胞に分化するように導入することができる。幹細胞の種類は、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成人幹細胞（ＡＳＣ）、臍帯幹細胞、および胚幹細胞様状態になるようにプログラムされた（成人）体細胞である人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。

「幹細胞治療」または「幹細胞移植」は、体内への健康な幹細胞の注入を指す。これらは、ドナーまたは他の発生源（異種移植）、あるいは受容側自身の細胞（自家移植）に由来する細胞であってもよい。後者の場合、受容側の細胞は、体内への再導入前に欠陥を補正するように、例えば、遺伝子治療、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスまたは他の治療で治療されてもよい。

「幹細胞治療域」は、ＬＰＡの阻害剤が幹細胞治療に良い影響を及ぼす期間を指す。

「対象」または「患者」は、本発明の分子によって達成され得る治療を必要としている動物を指す。本発明に従って治療することができる動物は、脊椎動物を含み、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）等の哺乳類が特に好ましい実施例である。「幹細胞治療対象」または「幹細胞治療患者」は、幹細胞治療を受けている、受けた、または受けようとしている対象または患者である。

「治療剤」は、限定されないが、ＣＯＸ阻害剤およびその他のＮＳＡＩＤＳを含む抗炎症薬、抗血管新生薬、上記で定義されるような化学療法薬、心血管剤、免疫調節剤、神経変性障害を治療するために使用される薬剤、点眼薬等を含む、治療効果を提供することを目的としている薬剤または化合物を指す。

「治療有効量」（または「有効量」）は、そのような治療を必要としている対象に投与したときに治療を達成するのに十分な活性成分、例えば、本発明による薬剤の量を指す。したがって、本発明による組成物の治療有効量を構成するものは、当業者によって容易に判定されてもよい。例えば、癌治療との関連で、「治療有効量」は、特定の癌と相関性がある１つ以上の遺伝子の発現の増加または減少、全身腫瘍組織量の低減、癌細胞溶解、生物試料（例えば、生検、全血、血漿、血清、尿等の体液のアリコート）中の１つ以上の癌細胞死マーカーの検出、アポトーシスまたは他の細胞死経路の誘導等を含む、癌細胞の生存または代謝と関連付けられる１つ以上のパラメーターの客観的に測定された変化を生じる量である。当然ながら、治療有効量は、治療される特定の対象および状態、対象の体重および年齢、病状の重症度、選択される特定の化合物、従うべき投与計画、投与のタイミング、投与方法、および同等物に応じて異なり、これらの全ては、当業者によって容易に判定されてもよい。併用療法との関連で、特定の活性成分の治療有効量を構成するものは、単独療法（すなわち、活性成分として１つだけの化学物質を採用する治療計画）として投与されるときに、その活性成分の治療有効量を構成するものとは異なり得ることが理解されるであろう。

本明細書で使用されるように、「治療」および「治療的」という用語は、疾患、障害、または身体的外傷に対する予防および／または治療の全領域を包含する。本発明の「治療」剤は、危険な状態にあるものとして識別することができる個人を標的にするように設計されている手順を組み込むものを含む、予防のためである、または予防的である方式で（薬理遺伝学）、あるいは本質的に寛解性または治癒的である方式で作用してもよく、あるいは治療されている疾患または障害の少なくとも１つの症状の進行の速度または程度を減速するように作用してもよく、あるいは疾患、障害、または身体的外傷からの回復と関連付けられる必要な時間、任意の不快感または疼痛の発生または程度、または身体的制限を最小限化するように作用してもよく、あるいは他の治療法および治療に対するアジュバントとして使用されてもよい。

「分化転換」という用語は、１つの成熟（分化）細胞表現型の別の表現型への直接転換を意味する。

「治療」または「治療すること」という用語は、疾患または障害に対して予防または防御すること（つまり、臨床症状を発現させないこと）、疾患または障害を阻害すること（つまり、臨床症状の発現を停止する、遅延させる、または抑制すること）、および／または疾患または障害を緩和すること（つまり、臨床症状の退行を引き起こすこと）を含む、疾患または障害の任意の治療を意味する。理解されるように、１つまたは複数の最終的な誘導事象が未知または潜在的であり得るため、疾患または障害を「予防すること」と「抑制すること」を区別することが常に可能であるとは限らない。「治療を必要としている」者は、すでに障害がある者、ならびに障害が予防される者を含む。したがって、「予防」という用語は、「予防すること」および「抑制すること」の両方を包含する、一種の「治療」を構成すると理解されるであろう。したがって、「防御」という用語は「予防」を包む。

「治療計画」という用語は、化学療法剤および細胞毒性剤、放射線療法、外科手術、遺伝子治療、ＤＮＡワクチンおよびＤＮＡ療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管新生療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマー、ならびに抗体および抗体変異体、受容体デコイおよび他のタンパク質ベースの治療剤等の他の生物製剤を使用する、疾患または障害の任意の治療を意味する。

（抗体の）「可変」領域という用語は、フレームワークを含み、相補性領域またはＣＤＲ（別様に超可変領域としても知られている）は、抗体間の配列が広範囲に異なり、かつ各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性で使用される、可変ドメインのある部分を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインの全体を通して均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方の超可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメント内に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主として、このβシート構造を接続し、場合によっては一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって接続された、βシート立体配置を採用する、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を備える。本明細書で使用されるときの「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））、および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって近接近して団結され、他の鎖由来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．， ａｂｏｖｅ， ｐａｇｅｓ ６４７−６６９を参照）。したがって、その抗原に結合するための抗体の独自性は、そこでＣＤＲ（超可変領域）を保持する特定のフレームワークよりもむしろ、ＣＤＲおよび空間内のそれらの配列によりもたらされる。ＣＤＲは、所望のレベルの抗原結合が保持される限り、種々のフレームワークのうちのいずれかの中に配置することができる。定常ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与等の種々のエフェクタ機能を示す。

本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の阻害剤の幹細胞治療域中に幹細胞治療対象に送達し、それにより、幹細胞治療を達成することを含む、幹細胞治療の方法を提供する。ＬＰＡの阻害剤は、ＬＰＡの直接阻害剤、例えば、リゾホスファチジン酸を結合して中和させる作用物質等のリゾホスファチジン酸の活性または有効濃度を低減させる作用物質であってもよい。ＬＰＡの好ましい阻害剤は、抗ＬＰＡ抗体、好ましくは、ヒト化抗体である。ＬＰＡの阻害剤は、リゾホスファチジン酸の間接的阻害剤、例えば、ＬＰＡ受容体拮抗薬、ＬＰＡ生合成の阻害剤、ＬＰＡ分解酵素、またはＬＰＡ分解酵素の活性剤あるいは作動薬等の、受容体へのＬＰＡ作用を阻害する、ＬＰＡ生合成を阻害する、ＬＰＡ分解を阻害または刺激する、作用物質であってもよい。ＬＰＡの好ましい間接的阻害剤は、オートタキシン阻害剤である。また、ＬＰＡ阻害剤の存在下で幹細胞を培養することを含む、幹細胞治療で使用するための該幹細胞を調製する方法も提供される。

本発明のこれらおよび他の態様および実施形態は、以下に続く節でさらに詳細に論議される。当業者であれば理解するように、以下の説明は、本発明のある好ましい実施形態を詳細に説明し、したがって、代表的であるにすぎず、本発明の実際の範囲を描写しない。本発明を詳細に説明する前に、説明される特定の分子、システム、および方法論は変化し得るため、本発明はこれらに限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、添付の請求項によって定義される本発明の範囲を限定することを目的としていないことも理解されたい。

本願は、１つの図をカラーで含有する。カラー図面を伴う本願の写しは、要請があれば、必要な料金を支払うことで提供されるであろう。図の簡単な概要が以下に提供される。
皮質損傷後のマウス脳を示す顕微鏡像である。左側のパネルＡは、皮質衝撃モデルにおけるＴＢＩ後に典型的には見られるような出血の領域を伴うマウス脳を示す。右側のパネルＢは、同一のモデルにおけるＴＢＩ後であるが、抗ＬＰＡ抗体で処置されたマウス脳を示す。このモデルで通常観察される出血は、大きく低減されている。

本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の阻害を組み込む、幹細胞治療の方法に関する。
１．ＬＰＡの阻害剤

ＬＰＡの阻害剤は、必然ではないが典型的には、生理学的条件下で、ＬＰＡ活性を妨げるか、またはＬＰＡの有効濃度を低下させる作用物質である。本発明の異なる実施形態では、ＬＰＡ活性は、直接および間接的方法によって阻止されてもよい。
Ａ．ＬＰＡの直接阻害剤：

直接的方法は、ＬＰＡに直接結合し、ＬＰＡの活性または有効濃度を阻害する、作用物質を採用する。そのような作用物質は、抗体または抗体様分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ）、ＬＰＡ受容体断片またはデコイ、およびアプタマーを含むが、それらに限定されない。
ｉ．抗体

抗体分子または免疫グロブリンは、通常は２つの異なる種類のポリペプチド鎖から成る、約１５０ｋＤａの分子量を伴う大型糖タンパク質分子である。重鎖（Ｈ）と称される、一方のポリペプチド鎖は、約５０ｋＤａである。軽鎖（Ｌ）と称される、他方のポリペプチドは、約２５ｋＤａである。各免疫グロブリン分子は、通常、２本の重鎖および２本の軽鎖から成る。２本の重鎖は、ジスルフィド結合によって相互に連結され、その数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結される。いかなる所与の自然発生抗体分子でも、２本の重鎖および２本の軽鎖は、２つの同一の抗原結合部位を持って同一であり、したがって、二価である、すなわち、同時に２つの同一の分子に結合する能力を有すると言われる。

任意の脊椎動物種に由来する抗体分子の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）といった、２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。２種類の軽鎖の比は、種によって異なる。一例として、平均的なκ対λの比は、マウスでは２０：１である一方で、ヒトでは２：１であり、ウシでは１：２０である。

任意の脊椎動物種に由来する抗体分子の重鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、アイソタイプと呼ばれる５つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。いくつかのアイソタイプは、いくつかのサブタイプを有する。免疫グロブリンの５つの主要なクラスは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。ＩｇＧは、最も豊富なアイソタイプであり、いくつかのサブクラス（ヒトではＩｇＧ１、２、３および４）を有する。Ｆｃ断片およびヒンジ領域は、異なるアイソタイプの抗体では異なり、したがって、それらの機能的特性を決定する。しかしながら、ドメインの全体的な構成は、全てのアイソタイプで類似している。

軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において、可変性が抗体の可変ドメインの全体を通して均一に分布していないが、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメント内に集中していることは注目すべきことである。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つのＣＤＲによって接続された４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接近して団結され、他の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）を参照）。集合的に、６つのＣＤＲが、抗体分子の結合特性に寄与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つだけのＣＤＲを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識して結合する能力を有する（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ， ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）内のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照）。

定常ドメインは、抗体重鎖または軽鎖のＣ末端領域を指す。概して、定常ドメインは、抗原に対する抗体分子の結合特性には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性の調製等の種々のエフェクタ機能を示す。ここで、「エフェクタ機能」は、Ｆｃドメインと免疫系のタンパク質との間の分子間相互作用による免疫細胞の動員によって仲介される、抗体の異なる生理作用（例えば、オプソニン化、細胞溶解、マスト細胞、好塩基球および好酸球の脱顆粒、ならびに他のプロセス）を指す。重鎖のアイソタイプは、抗体の機能的特性を決定する。それらの独特の機能的特性は、重鎖が軽鎖と関連付けられない、重鎖のカルボキシ末端部分によって付与される。

抗体分子は、所与の一式の条件下で、所望の抗原への結合を無関係な抗原または類似抗原あるいは抗原混合物への結合と比較することによって、抗原結合の特異性について試験することができる。好ましくは、本発明による抗体は、無関係な抗原、またはさらに標的抗原の類似体への有意な結合が欠けているであろう。

本発明との関連での「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性（例えば、抗体の各腕が同一または異なる抗原の異なるエピトープと反応する、二重特異性）抗体、ミニボディヘテロ共役、ダイアボディ、トライアボディ、キメラ抗体、および合成抗体、ならびに所望の結合特性および／または生物学的活性を伴う抗原と特異的に結合する抗体断片、誘導体、および変異体を包含する。

所望の活性は、抗原を特異的に結合する能力、特に、生体外で増殖を阻害する能力、生体内で血管新生を阻害する能力、および生体外でサイトカインプロファイル（複数可）を変化させる能力を含むことができる。

天然抗体（天然免疫グロブリン）は、通常、典型的には、２本の同一軽（Ｌ）鎖および２本の同一重（Ｈ）鎖から成る、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が、典型的には、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、いくつかの定常ドメインが続く、可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を一方の端に有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を、その反対側に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整合させられ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整合させられる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。

任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。

免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭといった、免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分割されてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が公知である。

ａ．ＬＰＡに対する抗体

天然ＬＰＡに対するポリクローナル抗体は、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ， ２０００ Ａｕｇ ７； １０（１５）：１６９１−３で説明されている。ＬＰＡに対するモノクローナル抗体は、その両方が、あらゆる目的でそれらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、２００８年６月１９日に公開されたＳａｂｂａｄｉｎｉらの米国特許出願公開第２００８０１４５３６０号（代理人整理番号ＬＰＴ−３１００−ＵＴ４）、および２００９年５月２８日に公開された米国特許出願公開第２００９０１３６４８３号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２００−ＵＴ）で説明されている。前者の公開は、ＬＰＡに対する一連のマウスモノクローナル抗体の産生および特性化を説明し、後者の公開は、ＬＰＡに対するヒト化モノクローナル抗体を説明する。ＬＰＡに対する付加的なヒト化モノクローナル抗体が、２０１０年４月１６日出願の米国特許出願第１２／７６１，５８４号（代理人整理番号ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ）で開示されており、その内容も、それらの全体で本明細書に組み込まれる。種々のＬＰＡアイソフォームに対するいくつかのマウス抗体の特異性が、以下の表１に示されている。ＩＣ_５０：半数阻害濃度、ＭＩ：最大阻害（阻害剤の非存在下での結合の％）；−−−：弱い阻害のため推定されていない。高い阻害結果は、抗体による競合脂質の認識を示す。

興味深いことに、抗ＬＰＡ ｍＡｂは、１２：０（ラウロイル）、１４：０（ミリストイル）、１６：０（パルミトイル）、１８：１（オレオイル）、１８：２（リノレオイル）および２０：４（アラキドノイル）ＬＰＡを区別することができた。最終的な薬物開発のための望ましいＥＣ_５０順位は、高い特異性とともに、不飽和脂質については１８：２＞１８：１＞２０：４であり、飽和脂質については１４：０＞１６：０＞１８：０である。抗ＬＰＡ ｍＡｂの特異性を、ジステアロイル−ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、Ｓ１Ｐ、セラミド、およびセラミド−１−リン酸等のＬＰＡ関連生体脂質へのそれらの結合について評価した。抗ＬＰＡ抗体のうちのいずれも、ＬＰＡの直接の代謝前駆体である、ジステアロイルＰＡおよびＬＰＣに対する交差反応性を実証しなかった。

Ｂ７抗体の生物物理学的特性

抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ７は、シグナル伝達脂質ＬＰＡに対する高い親和性を有し（ＢｉａＣｏｒｅアッセイでの表面プラズモン共鳴により、および直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて実証される、１〜５０ｐＭのＫ_Ｄ）、加えて、Ｂ７は、ＬＰＡに対する高い特異性を実証し、そのうちのいくつかがＬＰＡに構造的に類似している、２０以上の生物活性脂質を含む、１００以上の異なる生物活性脂質およびタンパク質に対して結合親和性を示していない。本マウス抗体は、１５５．５ｋＤａの総分子量を伴う２本の同一軽鎖および２本の同一重鎖から成る、完全長ＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体である。生物物理学的特性は、以下の表２で要約されている。

Ｌｐａｔｈｏｍａｂはまた、サイトカイン放出、移動および浸潤等の予備的な細胞ベースのアッセイにおいても生物学的活性を示しており、これらは、ＬＰＡアイソフォームおよび他の生物活性脂質に対するＢ７の特異性、およびＢ７の生体外生物学的効果を示すデータとともに、以下で要約されている。

ＬＰＡへのＢ７の強力かつ特異的な結合は、癌、血管新生、および線維症関連の障害に対する潜在的治療効果を伴う、細胞外ＬＰＡの可用性の低減をもたらす。

第２のマウス抗ＬＰＡ抗体であるＢ３もまた、以下の表４に示されるように、結合分析を受けた。

Ｂ７のヒト化

マウスＣＤＲをヒトフレームワーク領域（ＦＲ）内に移植することによって、Ｂ７マウス抗ＬＰＡモノクローナル抗体の可変ドメインをヒト化した。その内容が、あらゆる目的でそれらの全体で参照により本明細書に組み込まれる、２００９年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１７０，５９５号を参照されたい。ＣＤＲ移植技法の説明については、例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．Ｐ， （２００３）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３１： ３０７−１０、Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ （１９９６）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９６． ２６３： ８００−１５、Ｍｏｒｅａ， ｅｔ ａｌ． （２０００）， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０： ２６７−７９、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２２４： ４８７−９９、Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ．， （１９８５）． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １８６：６５１−６３を参照されたい。
配列アライメントおよび分析プログラム（ＳＲ ｖ７．６）を使用して、Ｂ７との相同性に基づき、ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔデータベースから好適なアクセプタヒトＦＲ配列を選択した。Ｌｅｆｒａｎｃ（２００３）、上記、Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．（１９９１）， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＮＩＨ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎ． Ｉｎｆｏｒｍ． Ｓｅｒｖｉｃｅ， ｐｐ． １−３２４２。ＦＲにおいて高い同一性を有する配列である、バーアニア、正準およびＶＨ−ＶＬ界面残基（ＶＣＩ）を最初に選択した。このサブセットから、最も非保存性のＶＣＩ置換、異常なプロリンまたはシステイン残基、および体細胞突然変異を伴う配列を除外した。したがって、ヒト化型のＢ７重鎖可変ドメインの基礎となるヒトフレームワークとして、ＡＪ００２７７３を選択し、したがって、ヒト化版のＢ７軽鎖可変ドメインの基礎となるヒトフレームワークとしてＤＱ１８７６７９を選択した。

ＣＤＲを形成する残基と並列するＦＲ残基を識別するように、ヒト化ＶＬおよびＶＨ配列を含有する３次元（３Ｄ）モデルを構築した。これらのＦＲ残基は、ＣＤＲループ構造ならびに抗体が抗原に対する高い親和性および特性を保持する能力に潜在的に影響を及ぼす。この分析に基づいて、ＡＪ００２７７３中の６つの残基およびＤＱ１８７６７９中の３つ残基が識別され、Ｂ７とは有意に異なると見なされ、マウス配列への突然変異復帰が考慮された。

マウス抗ＬＰＡ ｍＡｂ Ｂ７の配列を、ＬＰＡに対する高い親和性、特異性および結合能を保持する抗体を産生する目的でヒト化した。さらに、７つのヒト化変異体を無血清条件においてＨＥＫ２９３細胞内で一過性に発現させ、精製し、次いで、アッセイのパネルで特徴付けた。各軽鎖および重鎖の配列を含有するプラスミドを、産生のために哺乳類細胞内にトランスフェクトした。培養の５日後、定量的ＥＬＩＳＡを使用して、ｍＡｂ力価を判定した。重鎖および軽鎖の全ての組み合わせが、１ｍｌの細胞培養につき２〜１２ｕｇの抗体を生じた。

ヒト化変異体の特性化および活性

全てのヒト化抗ＬＰＡ ｍＡｂ変異体が、キメラ抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０１０としても知られている）およびマウス抗体Ｂ７に類似する低いピコモル範囲内で結合親和性を示した。全てのヒト化変異体が、Ｂ７のものと類似する、またはそれよりも高いＴ_Ｍを示した。特異性に関しては、ヒト化変異体は、Ｂ７のものと類似する特異性プロファイルを実証した。例えば、Ｂ７は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸の種々のアイソフォーム（１４：０および１８：１のＬＰＡ、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）、およびホスファチジルコリン（ＰＣ））との交差反応性を実証しなかった。

５つのヒト化変異体を生体外細胞アッセイでさらに評価した。ＬＰＡは、癌細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出を誘発することにおいて重要である。Ｂ７は、濃度依存的に卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出を低減させた。ヒト化変異体は、Ｂ７と比較してＩＬ−８放出の類似減少を示した。
２つのヒト化変異体もまた、血管新生についてのマトリゲル管形成アッセイにおいて、微小血管密度（ＭＶＤ）に対するそれらの作用についても試験した。両方ともＭＶＤ形成を減少させることが示された。

ＬＰＡに対するヒト化抗体

ＬＴ３０１５は、高い親和性で生物活性脂質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に結合する、組み換えヒト化モノクローナル抗体である。ＬＴ３０１５は、１５０ｋＤａの総分子量を伴う２本の同一軽鎖および２本の同一重鎖から成る、完全長ＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体である。重鎖は、Ｎ結合型糖鎖合成部位を含有する。２本の重鎖は、ヒトＩｇＧ１の構造と一致する、２つの分子間ジスルフィド結合を通して相互に共有結合される。

ＬＴ３０１５は、本来、ＬＰＡの免疫を持つマウスから生成されたハイブリドーマを使用して産生された、マウスモノクローナル抗体Ｂ７に由来した。マウス抗体のヒト化は、マウス親抗体へのその構造類似性について選択されたヒト抗体フレームワークのＣＤＲの代わりに、マウス抗体Ｂ７由来の６つのマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）の挿入を伴った。ヒト化抗体を設計するように、一連の置換がフレームワーク中で行われた。これらの置換は、復帰突然変異と呼ばれ、ヒト残基を、抗原との相互作用に関与するマウス残基と置換する。最終的なヒト化版は、重鎖（ｐＡＴＨ６０２）の可変ドメインのヒトフレームワークに６つのマウス復帰突然変異を、および軽鎖（ｐＡＴＨ５０２）の可変ドメインのヒトフレームワークに３つのマウス復帰突然変異を含有する。

ＬＴ３１１４は、高い親和性で生物活性脂質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に結合する、別の組み換えヒト化モノクローナル抗体である。ＬＴ３０１５とは対照的に、ＬＴ３１１４は、本来、マウスモノクローナル抗体Ｂ３に由来し、ＬＴ３１１４のＣＤＲがＢ３のＣＤＲと同一であることを意味する。

Ｂ．ＬＰＡの間接的阻害剤：

ＬＰＡシグナル伝達を阻害する間接的方法は、受容体へのＬＰＡ作用を阻害する、ＬＰＡ生合成を阻害する、またはＬＰＡ分解を刺激する作用物質を採用する方法を含む。ＬＰＡ活性を阻害するための間接的方法の多くが説明されており、Ｔｉｇｙｉ（Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１０ Ｓｅｐ；１６１（２）：２４１−７０）で要約されている。ＬＰＡ１−５、ＧＲＰ８７、Ｐ２Ｙ５、Ｐ２Ｙ１０、ＧＲＰ３５、およびＰＰＲガンマを含む、ＬＰＡに対する５〜７個の受容体がある。これらのＬＰＡ受容体のうちの１つ以上に対する拮抗薬である作用物質は、ＬＰＡ作用を阻止する際に使用することができ、幹細胞治療の有効性を向上させるように幹細胞と組み合わせて有用となるであろう。ＬＰＡ受容体拮抗薬のいくつかの具体的実施例としては、ＬＰＡ１特異的拮抗薬が、Ｓｗａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２０１１ Ｍａｒ；３３６（３）：６９３−７００）によって説明されており、ＬＰＡ１およびＬＰＡ３受容体の両方を阻止する拮抗薬が、Ｘｕ， ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２００６ Ａｕｇ ２４；４９（１７）：５３０９−１５）によって説明されている。

ＬＰＡ活性を阻害することへの別の間接的アプローチは、ＬＰＡ生合成の阻害である。ＬＰＡは、オートタキシン（ＡＴＸ、Ｌｙｓｏ ＰＬＤ）、ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＭＡＧ−キナーゼ、およびグリセロール−３リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）といった、酵素のうちの１つ以上によって産生される。ＬＰＡ生成において最も重要な酵素は、オートタキシンであるが、ａｔｘ ＋／−マウスは、依然として５０％の血中ＬＰＡレベルを有する。特定のオートタキシン阻害剤が、Ｇｕｐｔｅ， ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ． ２０１１ Ｍａｙ ２；６（５）：９２２−３５によって説明されている。この作用物質は、幹細胞とともに同時投与されたときに幹細胞活性を推進するのに有用であり得る。

付加的な間接的抗ＬＰＡ作用モードは、ＬＰＡの内因性分解経路を刺激し、したがって、ＬＰＡの濃度を低下させることであろう。ＬＰＡアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＴＴ）、脂質ホスファターゼ（ＬＰＰ）、および他の非特異的リゾリン脂質リパーゼを含む、ＬＰＡ分解に関与するいくつかの酵素経路がある。機能獲得（ＧＯＦ）モードで作用する、これらの酵素の小分子活性剤／作動薬は、ＬＰＡレベルの所望の低下をもたらすであろう。代替として、これらのＬＰＡ分解酵素のうちの１つ以上は、生物剤として有用となり得、単独で、または幹細胞治療の一部として、抗ＬＰＡ治療を達成するように、それら自体を投与することができる。

３．投与
ａ．投与の方法

部分的には、異なる製剤およびデバイスを採用する種々の経路によりＬＰＡ阻害剤を投与することによって、本明細書で説明される幹細胞治療を達成することができる。好適な薬学的に許容できる希釈剤、キャリア、および賦形剤が、当技術分野で周知である。当業者であれば、任意の特定の治療プロトコルのために投与される量を容易に判定できることを理解するであろう。好適な量は、１０ｕｇ／用量から１０ｇ／用量の範囲内、好ましくは１０ｍｇ／用量から１ｇ／用量の範囲内に入ると期待され得る。

薬剤物質は、限定されないが、吸引および局所性投与によるものを含む、全身、皮下、皮内、粘膜を含む、当技術分野で公知の技法によって投与されてもよい。粘膜は、身体の内部空洞の内側を覆う上皮組織を指す。例えば、粘膜は、口、食道、胃、腸、および肛門を含む消化管、鼻腔、気管、気管支、および肺を含む呼吸管、眼および生殖器の表面を含む。（全身投与とは対照的な）局所性投与は、潜在的な全身性副作用を制限するが、依然として治療効果を可能にすることができるため、このアプローチが有利であり得る。局所性投与はまた、幹細胞治療のための標的組織へ、または該組織を浸す流体への直接投与も含む。これは、組織または流体への直接注射によるもの、カテーテルまたは他の手段（例えば、心臓カテーテル法）によるものであり得る。

マウスについては、薬物動態学的および薬理学研究、典型的には、マウス抗体が使用され、静脈内で（ｉ．ｖ．）送達される。しかしながら、抗体はまた、皮下（ｓ．ｃ．）、血管内、または髄腔内（ｉ．ｔｈ．）等の他の経路によって送達することもできる。皮下投与されるとき、抗脂質抗体は、数時間以内に優れた生体内分布（＞８０％）を有することが示されている。Ｌｐａｔｈおよび協力者らは、静脈内およびくも膜下腔投与の両方を用いた神経障害性疼痛モデルにおける良好な効能データを有する。

４．応用

本発明は、幹細胞治療の方法を提供する。これらの方法は、幹細胞の近傍でＬＰＡの有効濃度または活性を低減させるために、幹細胞と組み合わせたＬＰＡの阻害剤の投与を含む。一実施形態では、ＬＰＡの阻害剤は、ＬＰＡを結合して中和させる抗体等の作用物質である。理論によって拘束されることを所望しないが、概して、ＬＰＡに対する抗体がＬＰＡに結合してＬＰＡ分子を吸収し（中和させ）、したがって、ＬＰＡの有効濃度を低下させると考えられる。高濃度のＬＰＡは、ＮＳＣのニューロン分化を阻害することが知られている。ＬＰＡ活性を妨げること、またはＬＰＡの有効濃度を低下させることは、幹細胞移植の分化、生存、移植、およびホーミングを推進するのに有用であると考えられる。

本発明はまた、ＬＰＡの阻害剤の存在下で幹細胞を培養することによって、対象に移植するための幹細胞を調製する方法も提供する。そのような阻害剤を添加することは、幹細胞の分化および生存を推進することが示されており、また、いったん患者に投与されると、細胞の移植およびホーミングに役立ち得る。

特定の理論によって拘束されることを所望しないが、幹細胞の分化を阻止するために十分である、ＬＰＡおよび／またはその代謝産物等の望ましくないほど高濃度の脂質は、種々の疾患および障害の発症または症状に寄与し得ると考えられる。そのような疾患は、例えば、不十分なニューロン分化による、ニューロンの正味の喪失がある、外傷性脳損傷、脊髄損傷、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病を含む）を含む、神経学的状態、脳卒中および血液がＣＮＳに接触する出血等の他の状態、ならびに脳癌を含むと考えられる。反応性アストロサイトおよび神経膠腫は、高レベルのＬＰＡを産生することができる。ＬＰＡは、ＮＳＣからのグリア分化を停止させない。Ｄｏｔｔｏｒｉ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｍａｙ； ２６（５）：１１４６−５４． Ｅｐｕｂ ２００８ Ｆｅｂ ２８。したがって、ＬＰＡの阻止は、幹細胞へのＬＰＡの異常、過剰、または不要な有効濃度の悪影響を阻止することによって、幹細胞治療の「利益」または効能を増加させるであろうと考えられる。

幹細胞治療が有用であると考えられ、かつ本発明の組成物および方法が幹細胞治療の効能を増進するのに有用であると考えられる、他の疾患または症状は、関節欠損および損傷を含む骨の疾患および症状、筋損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および筋ジストロフィー等の神経筋疾患および症状、心筋梗塞および心不全を含む心臓疾患または症状、心臓の虚血状態を含む虚血状態、糖尿病を含む膵疾患または症状、外傷性脳損傷、脳または脊髄出血、脊髄損傷、脳卒中、ならびにパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および運動障害を引き起こす胃腸管の神経変性障害を含む神経変性疾患を含む、神経疾患または症状、肝疾患、肺疾患、ならびに放射線による傷害、創傷、および脱毛等の皮膚、毛髪、および爪の疾患および症状を含む。

以下の詳細な実施例を参照することによって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、いかようにも本発明の範囲を限定すると見なされないものである。Ａｌｉｃｅ Ｐeｂａｙ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の研究室で、実施例１〜９が行われ、実施例１０が行われるであろう。

実施例１：ニューロスフェアの形成、処置、および分化

上記のＤｏｔｔｏｒｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（２００８）で説明されているように、ニューロスフェアを形成して培養した。簡潔には、ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、およびＨＥＳ−４、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、以前に公開された方法に従って培養した。公開された方法に従って、ノギンを使用したニューロン誘導を行い、成長および継代培養後、細胞を成長因子の存在下でニューロスフェアとして成長させた。ニューロスフェアは、ラミニンまたはフィブロネクチンで被覆されたディッシュ上で平板培養することができた。ラミニン上に平板培養され、神経基礎培地（ＮＢＭ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）で培養されたとき、ニューロスフェアは、典型的には、ニューロンに分化する。ニューロンの外方成長が可視的であった、ニューロスフェアの数を数えることによって、ニューロン形成スフィアの定量化（ニューロン分化の尺度）を行った。プレートに付着できなかったニューロスフェアは数えなかった。

平板培養したニューロスフェアを、ＬＰＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および／または抗体（示された濃度）の存在または非存在下で５日間インキュベートした。０．１％の無脂肪酸ウシ血清アルブミン（最終濃度０．０１％ＢＳＡ）中でＬＰＡの希釈物を作製した。

実施例２：ＬＰＡがニューロスフェア形成およびニューロン分化を阻害する

Ｄｏｔｔｏｒｉらによって示されるように、ＬＰＡは、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの存在下でさえも、ＮＳＣがニューロスフェアを形成する能力を阻害する。簡潔には、ノギン処置細胞を、ＮＢＭ中に懸濁させて継代培養しながら、ＬＰＡの存在または非存在下でｂＦＧＦおよびＥＧＦ（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）とともに１１〜１４日間インキュベートした。形成されたニューロスフェアの数を数え、１０μＭのＬＰＡの存在下では、ＬＰＡで処置されていない対照培養物の４８．６０％±８．１５％と比較して、１３．４７％±６．９４％の培養物がニューロスフェアを形成することが分かった。Ｄｏｔｔｏｒｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（２００８）、上記。

付加的な分化ステップである、成熟細胞に向かったＮＳＣの分化へのＬＰＡの効果も測定した。ＮＢＭ中のラミニン上で平板培養されたとき、ニューロスフェアは、典型的には、可視的なニューロン、伸長細胞形状および／またはβ−チューブリンに対する陽性染色法によって分析されるように、ニューロンに分化する。Ｄｏｔｔｏｒｉらは、未処置対照細胞におけるβ−チューブリンに陽性の伸長細胞の形成を観察し、ＬＰＡでインキュベートされたＮＳＣは、伸長細胞に分化せず、ニューロスフェア中にβ−チューブリン陽性細胞が存在してもわずかであった。一般に、１０μＭのＬＰＡの存在下で平板培養されたニューロスフェアは、神経細胞を生じなかった。

実施例３：抗ＬＰＡ抗体がニューロスフェア形成のＬＰＡ阻害を阻止する

実施例２でＬＰＡ処置のみに使用された条件を使用して、ノギン処置細胞を、ＮＢＭ中に懸濁させて継代培養しながら、ＬＰＡの存在または非存在下でｂＦＧＦおよびＥＧＦ（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）とともに５〜７日間インキュベートした。形成されたニューロスフェアの数を数え、１０μＭのＬＰＡの存在下では、以前のようにニューロスフェア形成が減少させられたことが分かった（ｎ≧３）。対照細胞が９０．４８２±５．３４６％のニューロスフェア形成を生じたのに対し、１０μＭのＬＰＡで処置された細胞は、わずか１３．５００±５．５９０％のニューロスフェア形成を生じた。対照的に、１μＭのＬＰＡで処置された細胞は、５０±１２．５０％のニューロスフェア形成を生じた。抗ＬＰＡ抗体Ｂ３のみは、対照に匹敵するニューロスフェア形成を生じた（０．１ｍｇ／ｍｌのＢ３については９１．６６７±８．３３３％、および１．０ｍｇ／ｍｌのＢ３については９１．６６７±４．１６７％）。顕著に、１ｍｇ／ｍｌのＢ３および１０μＭのＬＰＡの組み合せもまた、対照に匹敵するニューロスフェア形成を生じ（９５．８３３±４．１６７％）、ＬＰＡに対する抗体が、ＬＰＡの存在下で通常生じるニューロスフェア形成の阻害を阻止したことを示す。

ニューロスフェアのサイズも、上記と同一の条件下でＬＰＡ＋／−Ｂ３抗体処置（それぞれｎ＝３）後に測定した。Ｂ３抗体のみでの処置後のニューロスフェア面積は、未処置対照の９３．９４％±３．６１％であり、ＬＰＡ＋Ｂ３での処置後のニューロスフェア面積は、対照の７５．１８％±９．８９％であった。ＬＰＡのみでの処置後の測定は、ニューロスフェアが形成されないため不可能であった。統計は、処置群間のサイズの変動が有意ではないことを示す。

データは、（ＮＳＣによる内因性産生由来の）ＬＰＡの阻止がニューロスフェアのサイズを有意に増加させず、より重要なことには、ニューロスフェアの成長へのＬＰＡの効果がＢ３によって完全に無効にされる（すなわち、サイズが正常で対照に匹敵する）ことを示す。これは、ＬＰＡ活性の阻止におけるＢ３の有効性を明らかにする。

実施例４：ヒト化およびマウス抗ＬＰＡ抗体がニューロン分化のＬＰＡ阻害を阻止する

実施例２でＬＰＡ処置のみに使用された条件を使用して、平板培養したニューロスフェアを１０μＭのＬＰＡのみで、または抗ＬＰＡ抗体Ｂ３あるいはＢ７（１ｍｇ／ｍｌ）のみで、または１ｍｇ／ｍｌの抗体Ｂ３あるいはＢ７と組み合わせた１０μＭのＬＰＡで処置した。同様に、細胞を１０μＭのＬＰＡのみで、ヒト化抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５（１ｍｇ／ｍｌ）のみで、または１ｍｇ／ｍｌのＬＴ３０１５と組み合わせた１０μＭのＬＰＡで処置した。ニューロン形成ニューロスフェアの割合を実施例２のように定量化した（Ｄｏｔｔｏｒｉ， ｅｔ ａｌ（２００８）で説明されているようなベータ−チューブリン染色およびニューロン形成スフィアの定量化）。ＬＰＡのみは、ニューロン形成ニューロスフェアを未処置対照の約２５．００±６．４５％まで低減させた。Ｂ３抗体のみで処置されたニューロスフェア試料は、対照と同等のニューロン形成ニューロスフェア（１００％）を有した。ＬＰＡおよびＢ３抗体の組み合わせで処置されたニューロスフェアは、対照の８６．６６±５．６５％に等しいニューロン形成ニューロスフェアを有し、抗体が、ＬＰＡの存在下で通常生じるニューロン形成の阻害を阻止したことを示す。ＬＰＡおよびＬＴ３０１５ヒト化抗体の組み合わせで処置された細胞は、Ｂ３処置細胞とほぼ同一のニューロン形成（対照の８７．５％±１２．５０％）を示した。抗体Ｂ７は、類似条件下で、この実験において効果がほとんどまたは全くなかった（対照の３７．００±５．３１％）。

実施例５：ヒト化およびマウス抗ＬＰＡ抗体がニューロスフェア形成のＬＰＡ阻害を阻止する

前の実施例で説明される条件を使用して、ＬＰＡ（１０μＭ）を用いて、または用いずに、１ｍｇ／ｍｌでＬＰＡに対する抗体（ＬＰＡを用いて、または用いずに単独に試験される、Ｂ３、Ｂ７、またはヒト化抗体ＬＴ３０１５）を用いて、または用いずに、ＨＳＣをＮＢＭ培地にてニューロン分化のためにラミニン上で平板培養させた（３日間）。

以前のように、ニューロン形成スフィアの数は、１０μＭのＬＰＡの存在下で、対照の約２６％まで有意に減少させられた。抗体のうちのいずれも、単独で試験されたとき、ニューロン形成スフィアの数に影響を及ぼさなかった（全てが対照と同等であり、１００％であった）。しかしながら、抗ＬＰＡ抗体の全てが、ＬＰＡによるニューロン分化の阻害を阻止することができた。Ｂ３およびＬＰＡで、またはＬＴ３０１５およびＬＰＡで処置された細胞は、対照の７５％に等しいニューロン形成ニューロスフェアを有した。Ｂ７およびＬＰＡで処置された細胞は、対照の５０％に等しいニューロン形成ニューロスフェアを有した。ＬＰＡ：２５．００±６．４５％、Ｂ３＋ＬＰＡ：８６．６６±５．６５、Ｂ７＋ＬＰＡ：３７．００±５．３１％、ヒト化Ｂ７（ＬＴ３０１５）：８７．５±１２．５（しかしながら、たとえ分化が生じてもＢ３で観察されるよりも少ないニューロンがある）、Ｂ７についてはｎ＝２、Ｂ３およびＢ７についてはｎ＞３といった、データ結果のプールが類似する。したがって、ＬＰＡに対するヒト化抗体であるＬＴ３０１５を含む、３つ全てのＬＰＡ抗体は、ニューロスフェア形成によって測定されるように、ニューロン分化へのＬＰＡの効果を阻害する。Ｂ３およびＬＰＡで処置された細胞由来のニューロスフェアが、最大数のニューロンを有し（さらなる分化を示す）、その後にＬＴ３０１５処置細胞由来のニューロスフェアが続き、Ｂ７抗体で処置された細胞由来のニューロスフェアではさらに少ない数のニューロンがあったことに留意されたい。

実施例６：ＬＰＡに対するモノクローナル抗体を使用したＬＰＡの免疫組織化学染色

細胞内のＬＰＡの存在および場所を判定するために、免疫組織化学的方法を使用することができる。脊髄損傷を伴う、または伴わない動物由来の脊髄（成体（３ヶ月齢）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス）を損傷の４日後に免疫染色した。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２０〜３０ｇ）を、腹腔内注射されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のケタミンおよびキシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１６ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。下部胸椎から、腰膨大の高さに対応する高さＴ１２の上部腰部まで、脊髄を露出させた。椎骨の棘突起および層板を除去するために細い鉗子を使用し、Ｔ１２において左片側切断を行った。脊髄を切断するために細い外科用メスを使用し、脊髄の左側で病変が完成することを確実にするように、脊髄を２度切断し、次いで、上を覆う筋肉および皮膚を縫合した。これは、左後肢の麻痺をもたらした。２日または４日後に、動物を上記のように再び麻酔し、次いで、心臓の左心室を通してＰＢＳで、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で還流した。還流後、細い鉗子を使用して脊髄を静かに除去し、冷たい４％ＰＦＡ中で１時間にわたって後固定し、続いて、パラフィン包埋、または凍結切片用に４℃で一晩、ＰＢＳ中の２０％スクロースの中で凍結保存を行った。組織は損傷の２日および４日後に、ｎ＝３のマウスおよびｎ＝３の損傷マウスから採取した。Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ Ｙ， Ｇａｌｅａ ＭＰ， Ｗｉｓｅ Ｇ， Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＰＦ， Ｔｕｒｎｌｅｙ ＡＭ： Ａｘｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｃｋ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｇｌｉｏｓｉｓ ｉｎ ＥｐｈＡ４−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００４， ２４（４５）： １００６４−１００７３で説明されている通りである。

異なるＬＰＡ受容体の発現および局在を判定するために標準的な免疫組織化学的方法を使用して、ＩＨＣ凍結脊髄矢状切片（１０μｍ）を調べた。非特異的な抗血清相互作用を阻止するために、ＰＢＳ中に５％ヤギ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するブロッキング溶液中で、室温（ＲＴ）にて１時間阻止する前に、凍結切片を４％ＰＦＡで１０分間後固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。使用された一次抗体は、Ｂ３（０．１ｍｇ／ｍｌ）ウサギ抗ＬＰＡ_１（１：１００、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ＵＳＡ）、ウサギ抗ＬＰＡ_２（１：１００、Ａｂｅａｍ， ＵＫ）、およびマウス抗ＧＦＡＰ（１：５００、Ｄａｋｏ， Ｄｅｎｍａｒｋ）であった。ブロッキング溶液に一次抗体を加え、切片を４℃で一晩インキュベートした。次いで、これらを洗浄し、二次抗体中でＲＴにて１時間インキュベートし、続いてＤａｐｉ対比染色を行った。切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄａｋｏ）中のカバースリップで覆い、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲｃデジタルカメラおよびＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ３．１ソフトウェアキャプチャデジタルイメージとともにＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡を使用して調べた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２顕微鏡に装備されたＢｉｏｒａｄ ＭＲＣ１０２４共焦点走査型レーザーシステムを使用して、いくつかの二重標識切片も調べた。全ての画像を順番に並べ、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ６．０を使用して多色パネルを生成した。

損傷後、アストロサイトと呼ばれるＣＮＳ内の非神経グリア細胞が、多くの損傷および病状に反応して、「グリア反応」をもたらす。反応性アストロサイトは、通常のアストロサイトよりもはるかに強くＧＦＡＰ抗体で染色するため、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体が、この反応の一部を形成する反応性アストロサイトを見るために広く使用されている。ＬＰＡが、抗体Ｂ３（一晩で０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用した免疫組織化学によって明らかにされた。蛍光顕微鏡検査法は、反応性アストロサイトが損傷の４日後の脊髄中に存在し、これらの細胞がＬＰＡについて陽性に染色することを示した。対照的に、非損傷（対照）脊髄は、アストロサイトまたはＬＰＡについてほとんどまたは全く染色がない。したがって、ＬＰＡは、脊髄の反応性アストロサイト中に存在する。損傷および対照動物の両方で、中心管（幹細胞ニッチであると仮定される）は、ＬＰＡについて染色しない。

実施例７：抗ＬＰＡ抗体がニューロン分化のＬＰＡ阻害を阻止するという免疫組織化学的確認

上記の実施例のように成長および処置されたニューロスフェアを、上記の実施例で説明されるように、ＣＤ１３３（１／１０００、Ａｂｅａｍ，Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、β−チューブリン（１／５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）またはＬＰＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）について免疫染色した。β−チューブリン染色は、ニューロン分化を示す。対照的に、ＣＤ１３３染色は、分化時に損失される。ＬＰＡ処置では、ＣＤ１３３陽性細胞が、ニューロスフェアから外へ移動する細胞として観察される。対照細胞では、移動細胞は、弱くＣＤ１３３陽性であるか、またはＣＤ１３３染色に陰性であるかのいずれかである。ＣＤ１３３の発現がＬＰＡ抗体によって低減されることが分かった（定量せず）。

実施例８：外傷性脳損傷（ＴＢＩ）のマウス皮質衝撃モデルにおける抗ＬＰＡ抗体

ヒトＴＢＩの容認されたモデルがあり、マウスにおけるＩ型ＩＦＮ系がヒトのものに類似し、遺伝子標的マウスを生成する能力が、単なる相互関係よりもむしろ因果を解明することに役立つため、マウスは、ＴＢＩ研究にとって理想的なモデル生物である。成体マウスをケタミン／キシラジンの単回ｉｐ注射で麻酔し、頭頂骨より上側の頭皮の体毛をクリッパで剃った。各頭皮をクロルヘキシジン溶液で消毒し、右側頭頂骨を露出させるように切開した。次いで、右側頭頂骨の中心部に中心を合わせた薄い骨の直径３ｍｍの円形溝を作製するために、細いバーチップを伴う歯科医用ドリルを使用した。次いで、頭頂骨の３ｍｍの板をねじって除去し、下にある頭頂葉皮質を露出させるために、細い鉗子を使用した。除去された骨板を無菌生理食塩水に入れて保持した。マウスを定位ヘッドフレームに取り付け、インパクタ（直径２ｍｍ）の先端をバーホールの中心で皮質表面に対して直角に位置付け、皮質を覆う硬膜にちょうど触れるまで降下させた。コンピュータコントローラを使用して、単一の衝撃損傷（深さ１．５ｍｍ）を適用した。マウスをヘッドフレームから除去し、骨板を元の位置に戻した。板を定位置で密封および保持するように、板の縁の周囲に骨ろうを塗布した。次いで、皮膚切開を細い絹縫合糸で閉鎖し、該領域にクロルヘキシジン溶液を吹き付けた。次いで、マウスを加熱ランプ下の飼育箱に戻し、意識を回復させた（総麻酔時間＝３０〜４０分）。

処置：処置またはアイソタイプ対照を、ＴＢＩの前または後のいずれかの種々の時点で注射した。抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３またはその他）を尾部静注（０．５ｍｇ）によって注射した。２４〜４８時間後、動物を屠殺し、それらの脳を分析した。

分析：神経細胞死／生存（ＴＵＮＥＬ分析）、反応性アストログリオーシス（ＧＦＡＰで同時標識されたＫｉ６７陽性細胞によって明らかにされる）、およびＮＳ／ＰＣ応答（ＣＤ１３３／Ｋｉ６７による増殖、ＣＤ１３３による損傷部位への移動、および分化）が、分析される。ＣＤ１１ｂ免疫染色によって免疫応答が評価される。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用した密度測定によって定量化が行われる。

予備結果：このモデルにおける予備データは、この皮質衝撃モデルにおいて、抗ＬＰＡ抗体処置（Ｂ３）が、ＴＢＩ後のマウス脳で通常見られる出血の程度を低減させることを示す（図１）。

実施例９：ＬＰＡが成体マウスＮＳＣのニューロン分化を阻害する

マウス脳室下帯ＮＳＣから生成されたマウス成体ニューロスフェアでは、ＬＰＡ受容体の発現分析は、ＬＰＡ受容体ＬＰＡ_１、ＬＰＡ_３、およびＬＰＡ_４に対するｍＲＮＡ転写産物の存在、ならびにＬＰＡ受容体ＬＰＡ_２およびＬＰＡ_５に対するｍＲＮＡ転写産物の非存在または低レベルの発現を示し、成体ｍＮＳ／ＰＣもＬＰＡの潜在的な標的であることを示した。ヒトＮＳＣで観察されたものとは対照的に、ＬＰＡは、ニューロスフェア形成またはマウスＮＳＣの成長を修正しなかった。しかしながら、ヒトＮＳＣで得られたデータと同様に、通常はニューロン分化を誘導する条件で平板培養したときにＮＳＣとしてそれらを維持することによって、ＬＰＡは成体マウスＮＳＣのニューロン分化を阻害した。３日後、ＬＰＡ（１０μＭ）処置マウスＮＳＣのみが、分化ニューロンのマーカーである、βＩＩＩ−チューブリンの低レベルの発現を示し（全細胞の２６．２５±２．０８％）、未分化ＮＳＣのマーカーである、ネスチンについて主に陽性のままであった（全細胞の（８７．５５±３．２０％）。対照的に、未処置細胞は、より高いレベルの分化ニューロン（細胞の５７．１２±１８．４２％によって発現されたβＩＩＩ−チューブリン）およびより低いレベルの未分化ＮＳＣ（ネスチンが全細胞の５８．０１±６．２０によって発現された）を示した。これらの効果は、アポトーシスまたは増殖と無関係であった。

実施例１０：抗ＬＰＡ抗体および幹細胞移植の組み合わせ

ＣＮＳ内の幹細胞移植へのＬＰＡシグナル伝達の阻害の影響は、脊髄損傷の齧歯類モデルを使用して研究される。損傷後、抗ＬＰＡモノクローナル抗体が、ヒトＮＳ／ＰＣ（ｉＰＳＣまたはＥＳＣに由来し、好ましくは、ＧＦＰ発現幹細胞が使用されるであろう）とともに注射される。幹細胞移植と一致する抗体治療が、幹細胞移植の成果を向上させるであろうと予測される。未損傷および損傷脊髄内の幹細胞を用いた抗ＬＰＡ抗体同時投与の効果が、ＮＳ／ＰＣ移植および分化への影響を識別するため、および宿主細胞（ニューロン反応、グリア性瘢痕、免疫反応）ならびに動物の挙動への影響を識別するために評価されるであろう。これらの研究の有利な成果は、ＣＮＳ内に存在する内因性ＮＳ／ＰＣまたはＮＳ／ＰＣの外因性集団のいずれかを刺激することによって、ＣＮＳへの外傷後の神経再生を増加させることであろう。脂質遮断薬を用いた類似研究が、いかなる種類の幹細胞においても、または神経外傷および炎症に対する細胞応答においても、いかなる他の研究所によっても行われていないため、この研究は先駆的である。

脊髄損傷。生体マウスの脊髄が、第１１および第１２胸分節の高さで椎弓切除術を介して露出される（Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ Ｙ， （２００４） Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４（４５）：１００６４−１００７３）。簡潔には、腰椎の左片側切断が、第１２胸分節の高さで行われる。病変後の生存期間は、１および４日、ならびに６週間である。ＳＣＩＤマウスおよびシクロスポリンで処置されたマウスの両方が使用される。

幹細胞移植。分化前ＮＳ／ＰＣが、吻方および尾方に、損傷部位まで、２つの部位で脊髄注射される。注射は、ＳＣＩ後の種々の時間に与えられる。

抗体治療。生体外スクリーニングから選択された抗ＬＰＡ ｍＡｂｓまたはそれらのアイソタイプ対照が、以下のように注射される。
ａ）移植時：皮下／腹腔内に、または細胞移植とともに注射され、それに続いて、
ｂ）３日ごと、移植後は１日、４日、または２週間にわたって注射される。

評価：解剖学的評価のために、細胞移植後の種々の時点（１、２、および６週間）で動物を屠殺し、生存ヒト細胞の数を評価する。他の測定は、神経細胞死および／または生存、反応性神経膠症、ＮＳ／ＰＣ応答（増殖、損傷部位への移動、および分化）、および再生を含む。機能評価は、運動試験から成る。分化、再生、神経細胞死、およびグリア性瘢痕化における効率の比較が、複合抗体および幹細胞治療の効能を評価するように行われる。

実施例１１：実験的心筋梗塞における抗ＬＰＡモノクローナル抗体および脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）の同時投与

Ｄａｎｏｖｉｚ（Ｄａｎｏｖｉｚ， ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１０ Ａｕｇ １０；５（８）：ｅ１２０７７）に従って、ＡＳＣを鼠径皮下脂肪組織から単離し、説明されたように培養することができ、随意に、移植前に生存性を推進するように培養液への抗ＬＰＡ抗体の添加を伴う。冠血管系（例えば、ＬＡＤ）の外科的結紮によって、実験的心筋梗塞（ＭＩ）をラットに与えることができる。ＭＩの２４時間後、抗ＬＰＡ ｍＡｂの同時投与とともにＡＳＣの経心膜外注射を動物に与える。動物にはまた、循環ＬＰＡ、ならびに経心膜外注射で中和されるであろう組織ＬＰＡを中和するように、抗ＬＰＡ抗体治療が全身的に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内）与えられてもよい。心臓機能が手術の３０日後に心エコー検査によって評価され、基準と比較される。確立されたマーカーを使用して、または放射性標識ＡＳＣを使用することによって、幹細胞播種および分化転換の程度への抗ＬＰＡ抗体治療の効果を判定するために、動物を屠殺する。

実施例１２：虚血心臓の治療としての幹細胞指向性血管新生

幹細胞は、心筋虚血後の治療的血管新生を誘発するために使用されてきた。心臓虚血後にラットに移植された間葉系幹細胞は、増進した心臓機能、および心筋細胞に分化した少数の幹細胞をもたらした。毛細血管密度もまた、対照よりも幹細胞移植心臓で高かった。Ｔａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｅｕｒ． Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ−ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇ．３０：３５３−３６１。Ｔａｎｇらのシステムを使用して、幹細胞移植が抗ＬＰＡ抗体投与と組み合わせて行われる。この併用治療は、幹細胞移植の成功を増進し、したがって、治療的血管新生の効能を増進すると考えられる。

内皮前駆細胞（ＥＰＣ）もまた、ＭＩまたは非ＭＩ急性冠症候群（ＡＣＳ）後に心臓内の血管新生を推進するために使用されてもよい。心虚血は、外科的冠状動脈結紮、心臓カテーテルを使用する熱凝固によって、または収縮および後続の虚血を推進するように冠状血管の周囲に外科的に配置されたアメロイドリングの使用によって、ブタにおいて誘発される。ＥＰＣは、単離されて生体外で培養され、次いで、心臓カテーテル法によって動物に同種移植される。ＥＰＣ送達と組み合わせて、動物は、全身投与によって抗ＬＰＡ抗体で処置される。播種ＥＰＣは、血流を向上させるように新血管形成を推進すると期待され、幹細胞治療効能、したがって、新血管形成の効能は、抗ＬＰＡ抗体を用いた治療によって向上させられると考えられる。

実施例１３：糖尿病の治療のためのベータ細胞再生

１型糖尿病患者のための幹細胞治療の課題および成功が、最近、論評されている（Ａｇｕａｙｅ−Ｍａｚｚｕｃａｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２０１０ Ｍａｒ；６（３）：１３９−４８）。一般的に幹細胞治療の場合のように、グルコース誘発性インスリン産生島細胞への前駆細胞の変換は、まだ完成されておらず、新しい方略が必要とされる。本明細書で提案される１つのそのような新しい方略は、例えば、分化転換の推進によって、幹細胞の効能を増進する、抗ＬＰＡ抗体の同時投与である。１型糖尿病の好ましい動物モデルは、ストレプトゾトシン治療が島ベータ細胞の死および耐糖能異常の発生をもたらす、ＳＴＺラットである。島前駆細胞が、島細胞機能を回復させるために、このモデルで使用されてきた（Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ． ２０１０ Ｎｏｖ；３１（１１）：１４５４−６３． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｏｃｔ １８）。ＬＰＡに対する抗体を用いた併用治療を、このモデルに添加することができ、この組み合わせは、島細胞治療の増進した効能を生じるであろうと考えられる。
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本明細書で説明および主張される組成物および方法の全ては、本開示を踏まえて、必要以上の実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態という観点から説明されているが、変形例が本組成物および方法に適用されてもよいことが当業者に明白となるであろう。当業者に明白である、全てのそのような類似代替および修正は、添付の請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲内にあると見なされる。

本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および出版物は、本発明が関連する当業者のレベルを示す。優先権または別の利益が主張されているものを含む、全ての特許、特許出願、および出版物は、各個別出版物が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同一の程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で例証的に説明される本発明は、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素（複数可）の非存在下で好適に実践されてもよい。したがって、例えば、本明細書でいずれの場合でも、「〜を含む」、「本質的に〜から成る」、および「〜から成る」という用語のうちのいずれかが、他の２つの用語のうちのいずれか一方と置換されてもよい。採用されている用語および表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、示され、説明される特徴またはそれらの一部分のいかなる同等物も排除する意図はないが、種々の修正が主張される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正および変動が当業者により用いられてもよいこと、およびそのような修正および変動が添付の請求項によって定義されるような本発明の範囲内にあると見なされることが、理解されるべきである。

Claims (10)

1. 幹細胞治療域の間にリゾホスファチジン酸の阻害剤を幹細胞治療対象に送達し、それにより、幹細胞治療を達成することを含む、幹細胞治療の方法。
2. 前記リゾホスファチジン酸の阻害剤は、リゾホスファチジン酸の直接阻害剤である、請求項１に記載の方法。
3. 前記リゾホスファチジン酸の直接阻害剤は、リゾホスファチジン酸を結合して中和させる作用物質である、請求項２に記載の方法。
4. リゾホスファチジン酸を結合して中和させる前記作用物質は、抗体、抗体断片、抗体変異体、アプタマー、受容体断片、または受容体デコイである、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗体、抗体断片、または抗体変異体は、リゾホスファチジン酸を結合して中和させる、モノクローナル抗体、またはその断片あるいは変異体である、請求項４に記載の方法。
6. 前記モノクローナル抗体、またはその断片あるいは変異体は、ヒト化モノクローナル抗体、またはその断片あるいは変異体である、請求項５に記載の方法。
7. 前記リゾホスファチジン酸の阻害剤は、リゾホスファチジン酸の間接的阻害剤である、請求項１に記載の方法。
8. 前記リゾホスファチジン酸の間接的阻害剤は、リゾホスファチジン酸受容体拮抗薬、リゾホスファチジン酸生合成の阻害剤、リゾホスファチジン酸分解酵素、またはリゾホスファチジン酸分解酵素の活性剤あるいは作動薬である、請求項７に記載の方法。
9. 前記リゾホスファチジン酸生合成の阻害剤は、オートタキシン阻害剤である、請求項８に記載の方法。
10. リゾホスファチジン酸の阻害剤の存在下で幹細胞を培養することを含む、幹細胞治療で使用するための前記幹細胞を調製する方法。

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