CN113827605B - 甘油磷酸胆碱在制备预防和治疗结核病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了甘油磷酸胆碱(GPC)在制备预防和治疗结核病药物中的应用。本发明验证了GPC通过增强巨噬细胞中抗菌肽的表达，从而抑制结核分枝杆菌的胞内存活和体内存活，抑制了结核性肉芽肿的恶化，且无细胞毒性，可作为新的有效代谢分子用于制备预防和治疗结核病的药物，为治疗耐多药结核病提供新的策略。

Description

甘油磷酸胆碱在制备预防和治疗结核病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及甘油磷酸胆碱在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是严重危害人民群众健康的重大传染病，是全球十大死因之一，也是单一感染源导致的主要死因。全球约有四分之一的人口是结核潜伏感染者(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)，一旦机体免疫力低下，LTBI发展成为活动性结核病，成为新的感染源，感染更多人群。2019年，在全球范围内，约1,000万人患有TB，145万人因TB而死亡，近50万人患上了对利福平耐药结核病(RR-TB)，其中78％患有耐多药结核病(MDR-TB)，尤其是广泛耐药结核病已然成为一种新的不治之症。全球负担最大的三个国家是印度(27％)、中国(14％)和俄罗斯联邦(8％)。当前我国结核病流行形势仍然严峻，是全球30个结核病高负担国家之一。我国结核病防治工作还面临着诸多问题与挑战，其中耐多药结核病是目前结核病控制中的难点，急需开发新的治疗药物和手段，以实现国家降低结核病发病率、死亡率的迫切要求。

代谢组学采用高通量、高精确度的分析技术，对代谢产物进行精确的定量定性分析，从中筛选出具有统计学意义的潜在生物标记物，并将这些代谢信息与机体的反应、调控因素等信息进行有机结合，从而有助于研究者更好地了解疾病的病理变化，病原体的代谢特征，为通过干预相关代谢通路或人工添加具有保护作用的代谢产物等研究提供有效依据。越来越多的研究表明人工添加保护性代谢分子可以直接影响很多疾病的转归，有可能作为新的治疗方法应用于临床。但是代谢产物对结核病疾病进程以及其在抗结核预防和治疗中的应用还缺乏相关研究和报道。

肉芽肿是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染的典型病理特征，是宿主抑制Mtb的主要防御机制。由Mtb引起的肉芽肿，中央为干酪样坏死，含有多核巨噬细胞，被上皮样细胞及其他多种细胞围绕形成结核结节。Mtb被多种细胞一层一层的包裹，处于潜伏感染的状态，并伺机增殖促进肉芽肿恶化，形成活动性结核病。在肉芽肿形成过程中，细菌、细胞的能量代谢及物质代谢均发生剧烈变化。哪些代谢分子或者通路对肉芽肿功能发挥关键调控作用，都成为目前关注的焦点，有待于进一步的深入分析，为结核病的预防和根治提供策略依据。

前期我们通过Mtb感染肉芽肿小鼠的肺脏和外周血比较代谢组学分析，发现甘油磷酸胆碱(glycerophosphocholine，GPC)在小鼠肺脏肉芽肿和外周血中的含量都显著下调，提示GPC可能参与到结核性肉芽肿的发生和发展过程中，但其在肉芽肿进展中发挥的作用及机制尚不清楚，尤其是在制备预防和治疗结核药物中的应用未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了甘油磷酸胆碱在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供甘油磷酸胆碱在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

本发明的第二方面是提供甘油磷酸胆碱在制备抑制结核性肉芽肿恶化药物中的应用。

本发明的第三方面是提供甘油磷酸胆碱在制备促进巨噬细胞对Mtb的杀伤和清除作用的药物中的应用。

本发明的第四方面是提供甘油磷酸胆碱在制备促进巨噬细胞抗菌肽产生的药物中的应用。

进一步地，上述抗菌肽的相关基因包括Hamp、Defb3、Defb4、Cathelicidin中的一种或多种。

本发明的第五方面是提供一种预防和治疗结核病的药物，其包括甘油磷酸胆碱作为主要活性成分。

进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。其中，术语“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。“载体或赋形剂”包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。

进一步地，上述药物施用后，可以发挥以下功能：

a.降低Mtb感染肺脏中的荷菌量；

b.显著增强巨噬细胞抗菌肽的表达；和/或

c.抑制结核性肉芽肿恶化。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明验证了GPC通过增强巨噬细胞中抗菌肽的表达，从而抑制Mtb的胞内存活和体内存活，抑制了肉芽肿的恶化，且无细胞毒性，可作为新的有效代谢分子用于制备预防和治疗结核病的药物，为治疗耐多药结核病提供新的策略。

附图说明

图1是本发明一实施例中H37Rv感染小鼠经对照或GPC处理后肺荷菌量检测结果；

图2是本发明一实施例中H37Rv感染小鼠用对照或GPC处理后肺脏HE和抗酸染色结果；

图3是本发明一实施例中海分枝杆菌感染成鱼经对照或GPC处理后荷菌量检测结果；

图4是本发明一实施例中海分枝杆菌感染成鱼经对照或GPC处理后HE和抗酸染色结果；

图5是本发明一实施例中经对照或GPC处理后巨噬细胞感染H37Rv的胞内CFU结果；

图6是本发明一实施例中经对照或GPC处理后巨噬细胞感染H37Rv的抗菌肽基因表达结果；

图7是本发明一实施例中HEK293、SH-SY5Y、HePG2细胞用不同浓度GPC处理后OD₅₇₀吸光值。

具体实施方式

本发明发现了GPC显著抑制Mtb的胞内和体内存活，可以促进巨噬细胞对Mtb的杀伤和清除，因此提供了GPC在制备预防和治疗结核病药物中的应用。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例利用C57BL/6小鼠感染模型，分析GPC对结核病的作用，具体的实验过程和结果如下：

将6-8周雌性C57BL/6小鼠，每组6只，通过滴鼻途径感染H37Rv菌种，约200CFU/鼠。感染3周后，对照组在饮水中添加1％DMSO，GPC组在饮水中添加GPC(1％)，给药4周后处死小鼠。通过检测以下指标，分析GPC对结核病的作用：

(1)脏器荷菌量：无菌条件下收集部分肺脏，加入PBS匀浆，10倍稀释后接种于7H10琼脂培养基上，37℃培养4周，观察Mtb生长情况，计算肺脏荷菌量，结果发现饮用GPC的小鼠，感染H37Rv的肺脏荷菌量显著降低(图1)。

(2)肺部组织病理学检测：无菌条件下收集肺脏，取部分肺组织用4％多聚甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片，H&E及抗酸染色，显微镜观察肺部组织病理学变化，结果发现饮用GPC的小鼠肺部病理改变与对照组相比明显减轻，免疫细胞浸润和肺组织损伤也明显减少(图2)。

上述结果表明，GPC可以显著提高宿主抵抗Mtb的能力。

实施例2

本实施例利用斑马鱼感染模型，分析GPC对分枝杆菌病，尤其是肉芽肿的作用，具体的实验步骤和结果如下：

野生型斑马鱼(AB品系)从中国斑马鱼资源中心获得，在循环养殖系统中饲养，转移到毒理系统中进行感染实验，保证斑马鱼饲养及感染的标准条件为水温约28℃，pH约7.4，电导率约1,500μS。成年斑马鱼先用0.1％三卡因麻醉后，通过腹腔注射，感染海分枝杆菌，菌量约200CFU，1周后对照组口灌DMSO，GPC组口灌0.1mg/Fish的GPC。给药1周后处死，通过以下指标分析GPC对海分枝杆菌感染斑马鱼成鱼肉芽肿发生发展的作用：

(1)荷菌量：感染给药后斑马鱼在0.5％三卡因中进行终末麻醉后，在PBS中匀浆，10倍稀释后接种于7H10琼脂培养基上，37℃培养1-2周，观察不同组菌株生长情况，计算活菌CFU数，结果发现口灌GPC组的成鱼具有较低的荷菌量(图3)。

(2)组织病理学检测：斑马鱼在0.5％三卡因中进行终末麻醉，将全鱼在4％多聚甲醛溶液中固定72小时，脱钙、浸蜡、包埋、切片，H&E及抗酸染色，显微镜观察全鱼，主要是肾脏、肝脏组织肉芽肿病理学变化，结果发现口灌GPC组的成鱼肉芽肿数量明显减少，病变也显著减轻(图4)。

上述结果表明，GPC可以显著提高宿主抵抗分枝杆菌的能力，减少肉芽肿的生成和恶化。

实施例3

本实施例利用巨噬细胞体外感染模型，分析GPC对巨噬细胞胞内Mtb存活的影响，具体的实验步骤和结果如下：

取野生型小鼠腹腔原代巨噬细胞，用完全1640培养基(含10％FBS+1％青霉素-链霉素)37℃培养4小时，细胞贴壁后换全无1640培养基，加入GPC使其终浓度为1mM，12小时后感染H37Rv，MOI＝2。感染3小时后，去上清，PBS清洗细胞两次去除胞外菌，通过CFU计数进入细胞菌数。另一部分细胞清洗后，加入含DMSO或含1mM GPC的1640培养基继续培养24小时后，通过CFU计数检测胞内菌的存活情况。结果发现，GPC显著促进巨噬细胞对Mtb的胞内清除，见图5。

实施例4

本实施例利用巨噬细胞感染模型，分析GPC对巨噬细胞杀菌功能的影响，具体的实验过程和结果如下：

取野生型小鼠腹腔巨噬细胞，加入DMSO对照或终浓度为1mM的GPC处理12小时后，给予H37Rv感染，MOI＝2。分别感染0、3、6小时后，去上清，用1ml TRIZOL裂解细胞，提取RNA，通过qRT-PCR检测抗菌肽相关基因Hamp、Defb3、Defb4、Cathelicidin表达水平的变化，确定GPC对巨噬细胞抗菌肽产生的影响。结果发现GPC可以显著促进Hamp、Defb3、Defb4、Cathelicidin基因的表达，见图6。

实施例5

本实施例利用HEK293、SH-SY5Y、HePG2细胞模型，分析GPC对细胞毒性的影响，具体的实验过程和结果如下：

取HEK293、SH-SY5Y、HePG2细胞系进行体外培养，待细胞密度长到80％时，加入不同浓度的GPC(0、0.001、0.01、0.1、1、5、10、30、100、1000和10000μM)处理24h，利用MTT试剂盒，对细胞毒性的OD₅₇₀吸光度值进行测定，结果发现GPC对三种细胞系均没有明显毒性，见图7。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (2)

1.甘油磷酸胆碱在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

2.甘油磷酸胆碱在制备抑制结核性肉芽肿恶化药物中的应用。

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