ES2565083T3 - Biodefensas usando macrólidos que contienen triazol - Google Patents

Abstract

Un compuesto para uso en el tratamiento de una enfermedad causada, al menos en parte, por un organismo seleccionado de entre el grupo que consiste en Bacillus antracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis y Burkholderia mallei, y combinaciones de los mismos; donde el compuesto es de la fórmula **Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: R10 es hidrógeno o acilo; X es H; e Y es OR7; donde R7 es un monosacárido o disacárido, alquilo, arilo, heteroarilo, acilo o C(O)NR8R9, donde cada uno de R8 y R9 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido y carbamoílo; o X e Y se toman junto con el carbono al que están unidos para formar carbonilo; V es C(O), C(>=NR11), CH(NR12, R13), o N(R14)CH2, donde N(R14) está unido al carbono C-10; donde R11 es hidroxi o alcoxi, cada uno de R12 y R13 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido y carbamoílo; R14 es hidrógeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido o carbamoílo; W es H, F, Cl, Br, I u OH; A es CH2, C(O), C(O)O, C(O)NH, S(O)2, S(O)2NH, C(O)NHS(O)2; B es (CH2)n donde n es un número entero que varía en un rango de entre 0 y 10, o B es una cadena de carbono insaturada de 2-carbonos; y C es hidrógeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aminoarilo, alquilaminoarilo, acilo, aciloxi, sulfonilo, ureido o carbamoílo.

Description

DESCRIPCION

Biodefensas usando macrolidos que contienen triazol.

5 CAMPO TECNICO

La invencion descrita en el presente documento se refiere al tratamiento de la exposicion aguda y enfermedades causadas por patogenos de biodefensa. En particular, la invencion descrita en el presente documento se refiere al tratamiento de la exposicion aguda y enfermedades causadas por patogenos de biodefensa con antibioticos 10 macrolidos y cetolidos.

ANTECEDENTES Y RESUMEN DE LA INVENCION

Continua siendo un temido escenario del campo de batalla el uso de o ataques terroristas domesticos con 15 microorganismos en aerosol que conducen a infecciones masivas. Teniendo en cuenta la posibilidad anadida de resistencia a los tratamientos actuales a traves de la ingenierfa genetica o la aparicion natural, la identificacion de nuevos antibioticos eficaces es fundamental para contrarrestar un ataque de este tipo. Es necesario un agente terapeutico efectivo contra un espectro de patogenos inhalados en el arsenal de los productos terapeuticos para combatir el bioterrorismo y la guerra biologica. Se ha descubierto sorprendentemente que los macrolidos que 20 contienen triazol y los cetolidos muestran una alta actividad en diversos organismos que plantean una potencial amenaza de bioterrorismo y/o de guerra biologica.

En una realizacion, se describen en el presente documento compuestos, composiciones, metodos y medicamentos para tratar enfermedades que surgen de uno o mas agentes bioterroristas y/o de guerra biologica seleccionados de 25 entre B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei. Se ha descubierto sorprendentemente en el presente documento que los compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento son altamente activos en F. tularensis. En otra realizacion, los compuestos, composiciones y medicamentos son utiles como agentes profilacticos postexposicion, tales como contramedidas medicas, tras una exposicion o inhalacion de uno o mas agentes bioterroristas y/o de guerra biologica seleccionados de entre el grupo que consiste en Bacillus antracis, Yersinia 30 pestis, Francisella tularensis y Burkholderia mallei.

En una realizacion ilustrativa, los compuestos de Formula (I) se describen en el presente documento

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incluyendo sales farmaceuticamente aceptables, hidratos, solvatos y esteres de los mismos.

En un aspecto, R10 es hidrogeno o acilo. En otro aspecto, X es H; e Y es OR7; donde R7 es un monosacarido o disacarido, alquilo, arilo, heteroarilo, acilo o C(O)NRsR9, donde cada uno de R8 y R9 se selecciona 40 independientemente de entre el grupo que consiste en hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido y carbamoflo; o X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar carbonilo.

V es C(O), C(=NRii), CH(NRi2, R13), o N(Ri4)CH2, donde N(Ri4) esta unido al carbono C-10; donde R11 es hidroxi o 45 alcoxi, cada uno de R12 y R13 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido

y carbamoflo; R14 es hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido o carbamoflo.

W es H, F, Cl, Br, I u OH.

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A es CH2, C(O), C(O)O, C(O)NH, S(O)2, S(O)2NH, C(O)NHS(O)2, B es (CH2)n donde n es un numero entero que varfa en un rango de entre 0 y10, o B es una cadena de carbono insaturada de 2-10 carbonos. C es hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, aminoarilo, alquilaminoarilo, acilo, aciloxi, sulfonilo, ureido o carbamoflo.

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En otra realizacion, las composiciones incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos de formula (I) descritos en el presente documento. Las composiciones farmaceuticas pueden incluir vehfculos, diluyentes y/o excipientes farmaceuticamente aceptables adicionales.

15 El documento US2003/0176327 divulga diferentes antibioticos para su uso contra los patogenos mencionados en las reivindicaciones.

El documento US2006/0100164 divulga los compuestos de formula (I) para su uso contra patogenos distintos de los mencionados en las reivindicaciones.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Los estudios preliminares in vivo en modelos animales de enfermedad tambien demuestran proteccion contra estos patogenos.

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Figura 2. Se muestran distribuciones de la concentracion inhibitoria minima de CEM-101 en forma de grafico de barras.

Figura 3. Susceptibilidades comparativas de S. aureus ATCC 25923 y L. monocytogenes EGD a CEM-101, TEL, 30 AZI, y CLR, basandose en las determinaciones de MIC en caldo de cultivo con pH ajustado.

Figura 4. Efecto de mortalidad en el tiempo a corto plazo de CEM-101 y AZI en S. aureus (ATCC 25923) en caldo de cultivo (paneles izquierdos; pH 7,4) o despues de la fagocitosis por macrofagos THP-1 (paneles derechos). Ambos farmacos se usaron a una concentracion extracelular de 0,7 (paneles superiores) o 4 (paneles inferiores) mg/litro. 35 Las MIC de CEM-101 y AZI fueron 0,06 y 0,5 mg/litro, respectivamente. Todos los valores son la media + desviaciones estandar (DE) de tres experimentos independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los sfmbolos).

Figura 5. Relaciones de concentracion-efecto para CEM-101, TEL, CLR y AZI hacia S. aureus (ATCC 25923) en 40 caldo de cultivo (paneles izquierdos) y despues de la fagocitosis por macrofagos THP-1 (paneles derechos). La ordenada muestra el cambio en UFC (A log UFC) por ml (caldo de cultivo) o por mg de protefna celular (macrofagos THP-1) en 24 h en comparacion con el inoculo inicial. La abscisa muestra la concentracion de los antibioticos como se indica a continuacion: (i) paneles superiores, concentraciones en peso (en mg/litro) en caldo de cultivo (izquierda) o en el medio de cultivo (derecha) y (ii) paneles inferiores, multiplos de la MIC que se determinan en caldo de cultivo 45 a pH 7,4. Todos los valores son la media + desviaciones estandar (DE) de tres experimentos independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los sfmbolos). Analisis estadfstico basado en el analisis global de los parametros de ajuste de curva (analisis de varianza unidireccional); la unica diferencia significativa se encuentra entre CEM-101 y AZI en caldo de cultivo (P = 0,04). Los valores numericos de los descriptores farmacologicos pertinentes y el analisis estadfstico de sus diferencias se muestran en la Tabla 1.

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Figura 6. Relaciones de concentracion-efecto para CEM-101 y AZI hacia L. monocytogenes intrafagocftica (cepa EGD, paneles izquierdos) y L. pneumophila (cepa ATCC 33153, paneles derechos). La ordenada muestra el cambio en UFC (A log UFC) por mg de protefna celular en 24 h (L. monocytogenes) o 48 h (L. pneumophila) en comparacion con el inoculo de postfagocitosis. La abscisa muestra la concentracion de los antibioticos como se indica a 55 continuacion: (i) paneles superiores, concentraciones en peso (en mg/litro); (ii) paneles inferiores, multiplos de la MIC que se determinan en caldo de cultivo a pH 7,4. Todos los valores son la media + desviaciones estandar (DE) de tres experimentos independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los sfmbolos).

Figura 7. Acumulacion de CEM-101 frente a comparadores en celulas THP-1 a 37 °C (todos los farmacos a una 60 concentracion extracelular de 10 mg/litro). (A) Cinetica de acumulacion (AZI); Cc, concentracion intracelular; Ce, concentracion extracelular); (B) influencia del pH del medio de cultivo en la acumulacion (30 min) de CEM-101 (sfmbolos con relleno en color negro y lfnea continua) y AZI (sfmbolos con relleno en color blanco y lfnea

discontinua); (C) influencia de la monensina (50 pM; 2 h de incubacion), verapamilo (150 pM; 24 h de incubacion), o gemfibrozilo (250 pM; 24 h de incubacion) en la acumulacion celular de AZI y CEM-101. Todos los valores son la media + desviaciones estandar (DE) de tres determinaciones independientes (cuando no son visibles, las barras de DE son mas pequenas que los sfmbolos).

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Figura 8. Actividad intracelular: Estudios comparativos con otros agentes anti-estafilococicos. Respuesta estatica a la dosis comparativa de antibioticos contra Staphylococcus aureus intracelulares (cepa ATCC 25923) en macrofagos THP-1. Las barras representan las MIC (en mg/l) o la dosis estatica extracelular.

10 Figura 9. Actividad intracelular de CEM-101 en comparacion con AZI, CLR y TEL, expresada como una curva dosis- respuesta de A log UFC desde el momento 0 a 24 horas frente a la dosis logarftmica.

DESCRIPCION DETALLADA

15 En una realizacion, se describen en el presente documento compuestos que son activos intracelularmente. Tambien se ha descubierto en el presente documento que la acumulacion intracelular y la actividad intracelular de los macrolidos que contienen triazol no se vio afectada por inhibidores de Pgp o de protefnas de resistencia a multiples farmacos (MRP). Por consiguiente, se cree que los compuestos descritos en el presente documento no son sustratos o son sustratos deficientes de la glicoprotefna P (glicoprotefna plasmatica o de permeabilidad, Pgp). Se 20 aprecia que la Pgp es un mecanismo de eflujo que puede conducir a la resistencia mediante algunos organismos frente a ciertos antibioticos, tal como se ha indicado para AZI y ERY en macrofagos en los que los antibioticos son sustratos de la glicoprotefna P. Por consiguiente, se ha descubierto sorprendentemente que los compuestos descritos en el presente documento se acumulan intracelularmente. Ademas de la acumulacion intracelular, se ha descubierto sorprendentemente que los compuestos macrolidos que contienen triazol y cetolidos descritos en el 25 presente documento tienen alta actividad intracelular. Tambien se ha descubierto sorprendentemente en el presente documento que los compuestos descritos en el presente documento tienen una union a protefnas inferior que es tfpica para los macrolidos a bajo pH, tal como el pH que se encuentra en las infecciones bacterianas, incluyendo, pero sin limitacion, los abscesos. Se aprecia que la falta de actividad intracelular observada tfpicamente con los agentes antibacterianos, incluyendo otros macrolidos y cetolidos, puede deberse a una elevada union a protefnas, 30 y/o al pH relativamente inferior de los compartimentos intracelulares, tal como esta presente en los abscesos.

Sin embargo, incluso cuando no se elimina por eflujo activo, la concentracion de otros agentes antibacterianos, incluyendo otros macrolidos o cetolidos, en macrofagos puede no ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad debido al bajo pH del compartimento lisosomal. Por ejemplo, el entorno acido que predomina en los fagolisosomas 35 (donde uno o mas de B. antracis, Y. pestis, F. tularensis, y/o B. mallei pueden permanecer durante su fase intracelular) puede afectar a la actividad de los antibioticos, tal como AZI, CLR y TEL. Se ha descubierto inesperadamente que los compuestos descritos en el presente documento conservan su actividad antibacteriana a un bajo pH. Se aprecia que la actividad intracelular de los compuestos descritos en el presente documento puede ser un determinante importante para una rapida y completa erradicacion y, probablemente tambien, para la 40 prevencion de la resistencia en el organismo diana.

La falta de terapia antimicrobiana efectiva da como resultado la supervivencia intracelular de bacterias, que sigue siendo una causa principal de propagacion bacteriana, fallos terapeuticos mortales, y el establecimiento de infecciones recidivantes cronicas. Estas situaciones se observan durante el transcurso de infecciones causadas por 45 muchos organismos de biodefensa, incluyendo B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei.

Aunque se ha indicado que la acumulacion intracelular de un antibiotico es indicativa de una actividad eficiente frente a bacterias, la evaluacion farmacodinamica de una gran serie de antibioticos usados comunmente ha revelado que tambien son importantes otros parametros tales como la biodisponibilidad intracelular y la modulacion de la actividad 50 en el compartimento infectado. Las observaciones descritas en el presente documento confirman y extienden las observaciones previas hechas con macrolidos en este contexto debido al sorprendente comportamiento diferencial mostrado por los macrolidos que contienen triazol descritos en el presente documento, en comparacion con macrolidos y cetolidos conocidos, tales como TEL, AZI y CLR.

55 Se ha descubierto sorprendentemente que los macrolidos que contienen triazol se acumulan en una medida considerablemente mayor que los comparadores, incluyendo AZI, y expresan sistematicamente mayor potencia (valores disminuidos de E50 y Cs) aunque muestran una eficacia maxima similar (Emax) a los comparadores. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que esto indica que las mejoras resultantes de las modificaciones estructurales introducidas en CEM-101 se refieren a la modulacion de las propiedades farmacocineticas y la actividad intrfnseca 60 (incluyendo su reducida susceptibilidad a las condiciones fisicoqufmicas que predominan en el compartimento infectado) en lugar de a un cambio en su modo de accion. Por lo tanto, los macrolidos que contienen triazol muestran el caracter basicamente bacteriostatico de los macrolidos, pero lo expresan mejor en el medio intracelular

y a concentraciones extracelulares considerablemente inferiores que los comparadores.

Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que la acumulacion celular de macrolidos que contienen triazol, tal como CEM- 101, es resultado del mecanismo general de la captura de protones de bases organicas debiles prevista para todos 5 los macrolidos ya que la acumulacion se suprime casi completamente, de forma paralela a AZI, mediante la exposicion a pH acido o al ionoforo de proton monensina. Basandose en el modelo general de difusion/segregacion de bases debiles en compartimentos unidos a membrana acidos, la acumulacion se determina por el numero de grupos ionizables y las relaciones entre los coeficientes de permeabilidad de membrana de las formas no ionizadas e ionizadas del farmaco. Aunque CEM-101 tiene dos funciones ionizables, se calcula que la pKa del aminofeniltriazol 10 sera menor de 4, lo que sugiere que la molecula es en gran medida monocationica (similar a CLR y TEL) a pH neutro neutral e incluso a pH lisosomal (~5). Por el contrario, AZI tiene dos funciones ionizables con pKas >6 y, por lo tanto, es dicationica intracelularmente. Sin embargo, CEM-101, posee un sustituyente fluor en la posicion 2, que deberfa hacerla mas lipofila que CLR o TEL. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que la relacion de las constantes de permeabilidad de las formas no ionizadas e ionizadas de CEM-101 en comparacion con LR o TEL puede ser tan 15 importante como el numero de funciones ionizables para determinar el nivel de acumulacion celular de bases organicas debiles. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que la mayor acumulacion celular de CEM-101 puede deberse parcialmente a su falta de susceptibilidad al eflujo mediado por Pgp (que se expresa por los macrofagos THP-1 en estas condiciones de cultivo) a diferencia de la azitromicina y otros antibioticos macrolidos y cetolidos.

20 Se ha observado que muchos macrolidos conocidos tienen un gran volumen de distribucion, lo que se cree que se refiere a su capacidad para acumularse en el interior de las celulas eucariotas por difusion/segregacion en compartimentos acidos, concretamente lisosomas y vacuolas relacionadas. En consecuencia, los macrolidos conocidos se han considerado candidatos para el tratamiento de infecciones localizadas en estos compartimentos. Por lo tanto, puede asumirse que los macrolidos son adecuados para tratar infecciones causadas por patogenos 25 intracelulares tfpicos, tales como B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei. Sin embargo, las comparaciones cuantitativas directas entre actividades intracelulares y extracelulares usando patogenos intracelulares facultativos, tales como S. aureus o L. monocytogenes, sugieren que los macrolidos conocidos expresan unicamente una fraccion minima de su potencial antibacteriano intracelularmente, especialmente considerando su gran acumulacion intracelular. Se cree que este potencial antibacteriano minimizado frente a organismos replicantes en fagolisosomas 30 y vacuolas relacionadas esta relacionado con un pH acido que se sabe que reduce la actividad de los macrolidos conocidos. Otro factor es que algunos organismos, tales como B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei, pueden replicarse realmente en otros compartimentos subcelulares. Ademas, ciertos macrolidos, tal como AZI, estan sometidos al eflujo activo de los macrofagos, lo que contribuye adicionalmente una actividad intracelular suboptima.

35 Por el contrario, la acumulacion celular y la actividad intracelular de los compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento, usando los modelos que se han desarrollado para el estudio de la farmacodinamica intracelular de los antibioticos, se mejora sustancialmente sobre los macrolidos conocidos, incluyendo los cetolidos. Por lo tanto, los compuestos descritos en el presente documento mantienen la eficacia maxima de sus MIC, y muestran mayor potencia frente a formas intracelulares de, por ejemplo, B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. 40 mallei en comparacion con TEL, AZI y CLR. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que esta potencia intracelular mejorada de los compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento es resultado de la combinacion de su mayor actividad intrfnseca frente a B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei junto con la actividad conservada a bajo pH, y la capacidad de distribuir a una gran diversidad de compartimentos intracelulares.

45 En otra realizacion, los compuestos de macrolidos que contienen triazol y cetolidos tienen actividad intracelular, tal como actividad intracelular frente a B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei. La supervivencia de estos organismos en las celulas eucariotas es crftica para la persistencia de la infeccion. Se aprecia que las pruebas rutinarias de susceptibilidad se determinan normalmente frente a bacterias extracelulares unicamente y, por lo tanto, pueden ser enganosas en su prediccion de la eficacia frente a organismos intracelulares.

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Los compuestos y medicamentos descritos en el presente documento incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad efectiva para mostrar la actividad antibacteriana intracelular.

55 Se describen en el presente documento compuestos que son bactericidas. En otra realizacion, los compuestos y medicamentos descritos en el presente documento incluyen una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad efectiva para mostrar actividad bactericida, incluyendo actividad bactericida in vivo. Se ha indicado que los macrolidos son generalmente bacteriostaticos. Los compuestos bacteriostaticos no matan las bacterias, sino que, en 60 su lugar, por ejemplo, inhiben el crecimiento y la reproduccion de bacterias sin matarlas; la muerte se realiza por agentes bactericidas. Se entiende que los agentes bacteriostaticos deben trabajar con el sistema inmune para eliminar los microorganismos del cuerpo. Los antibioticos bascteriostaticos pueden limitar el crecimiento de bacterias

a traves de varios mecanismos, tal como interfiriendo con la produccion de protefnas bacterianas, la replicacion del ADN, u otros aspectos del mecanismo celular bacteriano. Por el contrario, los antibioticos bactericidas matan las bacterias; los antibioticos bacteriostaticos unicamente ralentizan su crecimiento o reproduccion. Se han indicado varios mecanismos bactericidas, incluyendo la interrupcion del precursor de pared celular que conduce a lisis, la 5 union irreversible a 30 subunidades ribosomales, la reduccion de la fidelidad de traduccion que conduce a una sfntesis proteica imprecisa, y la inhibicion de la sfntesis de protefnas debido a una separacion prematura del complejo entre ARNm y protefnas ribosomales. El resultado final es la muerte celular bacteriana.

Los compuestos, composiciones y medicamentos descritos en el presente documento incluyen una cantidad 10 terapeuticamente efectiva de uno o mas compuestos descritos en el presente documento, donde la cantidad terapeuticamente efectiva es una cantidad efectiva para mostrar actividad bactericida frente a uno o mas de B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree en el presente documento que el tratamiento de dichas enfermedades usando agentes bacteriostaticos puede fracasar en dos aspectos. En primer lugar, simplemente la detencion del avance de la enfermedad con un agente bacteriostatico puede ser insuficiente 15 dado que el sistema inmune puede no intervenir para facilitar la curacion de la enfermedad a un nivel necesario. Por ejemplo, algunos organismos bacterianos no son eliminados por el sistema inmune puesto que residen en compartimentos intracelulares. Por lo tanto, una vez que el transcurso del tratamiento ha finalizado, puede da como resultado una rapida reaparicion de la enfermedad. En segundo lugar, dado que cierta porcion de la poblacion bacteriana probablemente sera eliminada, la poblacion restante puede seleccionarse para el desarrollo de la 20 resistencia. Se cree en el presente documento que un agente intracelularmente activo, y/o un agente intracelularmente activo y bactericida, sera eficaz en el tratamiento de dichas enfermedades. En una realizacion ilustrativa, los compuestos descritos en el presente documento que consiguen una concentracion intracelular de 20 veces la MIC de las bacterias diana. Se ha indicado que la mayor parte, si no todos, los antibioticos macrolidos, aunque bactericidas in vitro, son unicamente bacteriostaticos in vivo. Por ejemplo, como se describe en el presente 25 documento, cuando el tiempo entre la ultima dosis del compuesto se extendio, los niveles de reduccion de biocarga siguieron siendo los mismos para los compuestos que contienen triazol descritos en el presente documento, indicando una respuesta bactericida. Por el contrario, los grupos de dosis de TEL y CLR demostraron aumentos de biocarga cuando se extendio el intervalo de tiempo. Por lo tanto, estos ultimos dos agentes macrolidos/cetolidos demostraron una respuesta bacteriostatica mas clasica.

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Tambien se descubrio que CEM-101 tiene una potente actividad in vitro frente a B. antracis que se compara favorablemente con la de los antibioticos aprobados actualmente (ciprofloxacina, MIC90 0,031 ug/ml) o propuestos (cetromicina, MIC90 0,063 ug/ml) para indicaciones postexposicion a antrax.

35 Como se muestra en la figura 1, se observa la actividad dependiente de la dosis (porcentaje de supervivencia) frene a B antracis en aerosol durante 14 dfas de dosificacion oral. De especial importancia es el hecho de que las dosis protectoras mostradas aquf (por ejemplo, 2,5-20,00 mg/kg) tambien proporcionan altos niveles sericos y tisulares de CEM-101 en modelos de roedor, niveles que pueden conseguirse con regfmenes de dosificacion segura en ensayos humanos. Basandose en los datos de toxicologfa de GLP acumulados, deberfa ser posible administrar CEM-101 40 durante mayores intervalos (por ejemplo, 30-60 dfas) como se recomienda para la gestion del antrax de inhalacion postexposicion. (Drusano, y col., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Nov, 2008, pag. 3973-3979, Vol 52, N° 11). Estos regfmenes profilacticos prolongados se requieren para erradicar las celulas vegetales tras la germinacion de esporas latentes, que se sabe que existen durante una duracion variable y potencialmente extendida en tejidos pulmonares de sujetos expuestos antes del desarrollo de los sfntomas clfnicos (Inglesby, y col., JAMA 2002; 287(17) 45 2236-2252). Ademas, dadas las incertidumbres sobre la duracion de la latencia de las esporas despues de la exposicion o incluso despues de la interrupcion de un regimen profilactico de 30-60 dfas, puede requerirse terapia aguda con una formulacion oral en sujetos sintomaticos seleccionados en este escenario de biodefensa.

En los modelos celulares, CEM-101 es significativamente mas activa que otros agentes antibacterianos frente a 50 organismos localizados intracelularmente. Es activa frente a bacterias resistentes, incluyendo, bacterias de resistencia a multiples farmacos. Se observa prueba de la resistencia bacteriana a CEM-101 in vitro. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que aquellos ejemplos que se vuelven resistentes es probable que no tengan una ventaja en la supervivencia ya que tendran multiples mutaciones que disminuiran la viabilidad y la virulencia.

55 La capacidad de CEM-101 para acumularse en tejidos y para conseguir altas concentraciones intracelulares, con potencia antimicrobiana, es una caracterfstica farmacologica, ya que el parasitismo intracelular es la base de la patofisiologfa de la enfermedad debido a los agentes de amenaza biologica de preocupacion aquf. La figura 6 muestra que la captacion de macrofagos y la muerte intracelular de L. egionella pneumophila (compartimento lisosomal) y Listeria monocytogenes (citoplasma) por CEM-101 son incluso mas activas que mediante otros agentes 60 macrolidos ensayados (Lemaire, y col., Antimicrob. Agents. Chemother. 53: 3734-3743, 2009). Se facilitan concentraciones intracelulares que son 20-200 veces mayores que las conseguidas en plasma mediante la captacion rapida en la celula y la evasion de la bomba de eflujo glicoprotefna P, permitiendo de este modo una

erradicacion efectiva de la replicacion de patogenos intracelulares. CEM-101, a diferencia de la azitromicina y la cetromicina, no es un sustrato para la glicoprotema P.

Varios protocolos in vivo donde CEM-101 se dosifico repetidamente en estudios de toxicologfa en roedores y 5 primates no humanos han demostrado niveles tisulares de CEM-101 ~17-100 veces mayores que los niveles plasmaticos maximos. La CEM-101 acumulada en los tejidos y las concentraciones fueron mayores en el hngado, el bazo, el pulmon y la glandula salival. Esta relacion se confirmo en estudios ADME en roedores usando CEM-101 radiomarcada. Cuando se administro por via oral a 100 mg/kg, se observaron relaciones de radioactividad del tejido pulmonar con respecto al plasma de ~13:1 en animales macho y hembra. Despues de una dosificacion iV a 10 20 mg/kg, los datos fueron mas variables y se observaron relaciones pulmon/plasma de 17,6 para machos y 6,2 para hembras. Cmax y AUC variaron de 0,022 pg/ml y 0,04 pgh/ml a 1,96 pg/ml y 28,60 pgh/ml a traves del intervalo de dosis. El tmax de CEM-101 medio aumento de 1,5 a 6,0 horas y la semivida terminal media aumento de 2,2 a 7,9 horas para el intervalo de dosis de 50 a 1600 mg.

15 En otra realizacion ilustrativa, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar un grupo C(O). En otra realizacion, X es H, Y es OR7, donde R7 cladinosilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde W es fluor. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde A y B se toman juntos para formar propileno, butileno y pentileno. En otra realizacion, se describen en el presente documento 20 compuestos de Formula (I), donde A y B se toman juntos para formar butileno. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde A y B se toman juntos para formar pentileno. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde A y B se toman juntos para formar butilenos y C es 2-piridinilo o aminofenilo, tal como 3-aminofenilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde A y B se toman juntos para formar propilenos, butilenos o 25 pentilenos; y C es aminofenilo, tal como 3-aminofenilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde A y B se toman juntos para formar pentileno y C es 3-piridinilo o benzotriazol. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde C es un grupo arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos de Formula (I), donde V es un grupo carbonilo. En otra realizacion, se describen en el presente documento compuestos 30 de Formula (I), donde R10 es hidrogeno. En otra realizacion, X es H, Y es OR7, donde R7 es un radical monosacarido, tal como cladinosilo, y C es 3-piridinilo o benzotriazolilo.

En otra realizacion, C esta opcionalmente sustituido fenilo, tales como fenilo, halofenilo, haloalquilfenilo, aminofenilo, y similares, piridinilo opcionalmente sustituido, tal como 2-piridinilo y 3-piridinilo, benzotriazol opcionalmente 35 sustituido, y similares.

En otra realizacion, A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno, y X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar un grupo C(O).

40 En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde V es C(O). En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde W es H o F. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde A es CH2, B es (CH2)n, y n es un numero entero de 2-4. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde C es arilo o heteroarilo. En otra realizacion, se describen 45 compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde C es 3-aminofenilo o 3-piridinilo. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde R10 es hidrogeno. En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las realizaciones anteriores donde A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno, y X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar un grupo C(O). En otra realizacion, se describen compuestos descritos en cualquiera de las 50 realizaciones anteriores donde A y B se toman juntos para formar butileno o pentileno, y X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar un grupo C(O), y W es F.

En el presente documento se describe una composicion antibacteriana, donde la composicion incluye una cantidad efectiva de uno o mas compuestos mencionados en las reivindicaciones, y un vehfculo, excipiente o diluyente 55 farmaceuticamente aceptable para los mismos, o una combinacion de los mismos.

Como se usa en este documento, el termino "composicion" se refiere generalmente a cualquier producto que comprende los ingredientes espedficos en las cantidades especificadas, asf como cualquier producto que sea resultado, directamente o indirectamente, de combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades 60 especificadas. De forma ilustrativa, las composiciones pueden incluir uno o mas vehfculos, diluyentes y/o excipientes. Los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse en una cantidad terapeuticamente efectiva en formas de dosificacion convencionales para los metodos descritos en el presente

documento, incluyendo uno o mas vehfculos, diluyentes y/o excipientes para los mismos. Dichas composiciones de formulacion pueden administrarse por una gran diversidad de rutas convencionales para los metodos descritos en el presente documento en una gran diversidad de formatos de dosificacion, utilizando productos reconocidos en la tecnica. Vease, generalmente, Remington's Pharmaceutical Sciences, (16a ed. 1980). Debe apreciarse que las 5 composiciones descritas en el presente documento pueden prepararse a partir de compuestos aislados descritos en el presente documento o a partir de sales, soluciones, hidratos, solvatos, y otras formas de los compuestos descritos en el presente documento. Tambien debe apreciarse que las composiciones pueden prepararse a partir de diversas formas amorfas, no amorfas, parcialmente cristalinas, cristalinas y/u otras formas morfologicas de los compuestos descritos en el presente documento.

10

La expresion "cantidad terapeuticamente efectiva" como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de compuesto activo o agente farmaceutico que provoca la respuesta biologica o medicinal en un sistema tisular, animal o ser humano que se espera por un investigador, veterinario, medico u otro especialista, que incluye el alivio de los sfntomas de la enfermedad o trastorno que se trata. En un aspecto, la cantidad terapeuticamente efectiva es 15 aquella que puede tratar o aliviar la enfermedad o los sfntomas de la enfermedad en una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico. Sin embargo, se entendera que el uso diario total de los compuestos y composiciones que se describen en el presente documento puede decidirse por el doctor tratante dentro del alcance del juicio medico razonable. El nivel de dosis terapeuticamente efectiva especffico para cualquier paciente particular dependera de una diversidad de factores, incluyendo el trastorno que se trata y la gravedad del 20 trastorno; la actividad del compuesto especffico empleado; la composicion especffica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el genero y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la ruta de administracion, y la velocidad de excrecion del compuesto especffico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o casualmente con el compuesto especffico empleado; y factores similares ya conocidos en las tecnicas medicas.

25

En una realizacion, los compuestos descritos en el presente documento se administran a un ser humano por via oral a una dosis de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mg/kg, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal del paciente. En otra realizacion, la dosis diaria para un ser humano adulto es de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 mg, que puede 30 administrarse una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa, y similares. En otra realizacion, la dosis diaria para un ser humano adulto es de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 mg, que puede administrarse una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa, y similares. Dichas dosis pueden administrarse una, dos o tres veces al dfa. Las dosis unitarias orales ilustrativas son 50, 100, 200 y 400 mg (individuales o divididas). Sin quedar ligado a la teorfa, se cree que dichas dosificaciones ilustrativas son suficientes para conseguir niveles plasmaticos de 35 aproximadamente 1 pg/ml, que pueden ser suficientes para observar la actividad bactericida de los compuestos descritos en el presente documento, tal como, para uno o mas de B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei. Se aprecia que, como se describe en el presente documento, los compuestos descritos en el presente documento, incluyendo CEM-101, alcanzan una alta concentracion en los tejidos, tal como tejidos pulmonares. Sin quedar ligado a la teorfa, se cree en el presente documento que los compuestos descritos en el presente documento, incluyendo 40 CEM-101, pueden conseguir niveles tisulares que son al menos aproximadamente 10 veces la MIC para las cepas, incluyendo cepas resistentes a macrolidos, tales como, pero sin limitacion, B. antracis, Y. pestis, F. tularensis y B. mallei, incluyendo cepas resistentes de los mismos.

Los compuestos descritos en el presente documento pueden prepararse como se describe en el presente 45 documento, o de acuerdo con la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006/0100164 y en la Publicacion Internacional PCT N° WO 2009/055557.

En resumen, la sfntesis de cetolidos que contienen triazol comienza con la preparacion de dos etapas conocida del intermedio de 12-acil-imidazol 4 (Esquema I) de claritromicina (2). El intermedio 4 se convierte en los carbamatos 50 11,12-cfclicos 5a-c por la reaccion con los aminoalcoholes unidos a 3-, 4- o 5-carbono correspondientes. El tratamiento de 5a-c con cloruro de tosilo proporciona los tosilatos 6a-c. El desplazamiento del grupo tosilo con NaN3 da los compuestos azido 7a-c correspondientes. La escision del azucar de cladinosa de 7a-c a 8a-8c se realiza por el tratamiento con HCl en MeOH. La oxidacion de Swern del grupo 3-hidroxi de 8a-c da los cetolidos protegidos correspondientes 9a-c que estan desprotegidos posteriormente con metanol para proporcionar los cetolidos azido 55 requeridos 10a-c, respectivamente. Estos compuestos azido se hicieron reaccionar con alquinos sustituidos terminalmente en presencia de yoduro de cobre en tolueno a 60 °C para proporcionar regio-selectivamente los 4- sustituido-[1,2,3]-triazoles correspondientes 11a-18a, 11 b-18b y 11c-18c.

La azida de los intermedios 10a-c se convierte en los 4-sustituido-[1,2,3]-triazoles a traves de una reaccion de 60 cicloadicion con acetilenos sustituidos. Pueden formarse anillos triazol a traves de una reaccion de cicloadicion 1 + 3 de Huisgen entre una azida y un alquino que da como resultado una mezcla de regioisomeros 1,4 y 1,5 como se representa en la Ruta A del Esquema II. Como alternativa, el procedimiento de Rostovtsev y col.8 puede seguirse

usando la adicion de un catalizador de CuI a la reaccion para producir selectivamente o exclusivamente el regioisomero 1,4 como se representa en la Ruta B del Esquema II.

La cadena lateral del anillo triazol tambien se incorpora en el sistema anular de claritromicina. En una realizacion, se 5 escoge una cadena lateral de butil alquilo. Se aprecia que muchos analogos de la cadena lateral de butilo en la serie de cetolidos han mejorado la actividad antibacteriana basandose en los resultados de la MIC in vitro. El intermedio 7b se convierte directamente en el 4-sustituido-[1,2,3]-triazol a traves de la ciclacion catalizada por cobre con acetilenos terminalmente sustituidos, como se muestra en el Esquema III. Los grupos protectores acetato de 19a-e se retiran con LiOH en metanol para proporcionar los 4-sustituido-[1,2,3]-triazoles correspondientes 20a-e.

10

La sustitucion del hidrogeno de la posicion 2 con un fluor se realiza mediante la fluoracion electrofila de 9b (Esquema IV) usando Selectfluor®. El grupo azido del intermedio 22 se convierte en una serie de 4-sustituido-[1,2,3]-triazoles 23a-b a traves de las condiciones estandar.

15

Esquema 1

imagen2

imagen3

Esquema 3

5

imagen4

Esquema 4

imagen5

10 En otra realizacion, se describen los siguientes compuestos:

imagen6

Concentracion inhibitoria minima (|ig/ml)a

Entrada

R n S. aureus S. pneumoniae H. influenzae

29213 Ery-S

96:11480 Ery- R (MLSb) 49619 Ery-S 163 Ery-R (MefA) 303 Ery-R (ermB) 49247 Ery- S

TEL

<0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 4

AZI

<0,125 >64 <0,125 >64 >64 2

11a

,P 3 1 1 <0,125 <0,125 >64 >64

11b

4 <0,125 0,25 <0,125 <0,125 2 8

11c

5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 0,25 16

12a

Br P 3 0,25 0,5 <0,125 <0,125 8 64

12b

4 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 8 8

12c

5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 1 16

13a

P 3 1 2 <0,125 <0,125 16 >64

13b

4 0,25 0,25 <0,125 <0,125 8 8

13c

5 0,5 1 <0,125 0,5 2 64

14a

P 3 2 2 <0,125 0,5 >64 >64

14b

4 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 4

14c

5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 0,25 64

15a

P 3 2 2 <0,125 1 >64 >64

15b

4 <0,125 4 <0,125 2 64 64

15c

5 <0,125 0,25 <0,125 0,25 4 16

16a

3 0,5 nt <0,125 <0,125 >64 16

16b

4 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 2

16c

5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 0,25 8

17a

"H 3 1 1 <0,125 <0,125 >64 >64

17b

4 <0,125 <0,125 <0,12 <0,12 1 16

17c

5 0,25 0,5 <0,125 <0,125 2 32

18a

cu 3 1 2 <0,125 0,5 >64 >64

18b

4 1 2 <0,125 4 64 32

18c

5 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 64 8

a National Committee tor Clinical Laboratory Standards. Methods tor Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 6a ed.; Estandar aprobado: NCCLS Documento M7-A6, 2003.

En otra realizacion, se describen los siguientes compuestos:

imagen7

Entrada

R S. aureus S. pneumoniae H. influenzae

25923 Ery- S

RN220 49619 Ery- S 163 Ery-R (MefA) 303 Ery-R (ermB) 49247 Ery- S

TEL

<0,25 2 <0,125 <0,125 <0,125 4

20a

P 0,25 8 <0,0625 0,125 2 NT

20b

P 0,25 8 <0,0625 <0,06 1 NT

20c

1 8 <0,0625 0,5 2 NT

20d

"P V3 ° 1 8 <0,0625 0,5 2 NT

20e

CO <0,25 8 <0,0625 0,5 2 NT

En otra realizacion, se describen los siguientes compuestos: 5

imagen8

Entrada

R S. aureus S. pneumoniae H. influenzae

29213 Ery-S

96:11480 Ery R (MLSb) 49619 Ery-S 163 Ery-R (MefA) 303 Ery-R (ermB) 49247 Ery- S

TEL

<0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 4

AZI

ND <0,125 >64 <0,125 >64 >64

23a

P <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 2

23b (CEM- 101)

<0,06 <0,125 <0,125 <0,125 <0,125 2

En cada una de las realizaciones anteriores, el panel de exploracion principal consistfa en los Staph. aureus, S. 5 pyogenes, S. pneumoniae pertinentes (incluyendo cepas resistentes a azitromicina y telitromicina). Las MIC frente a todos los patogenos se determinaron usando un procedimiento de microdilucion el caldo de cultivo segun las directrices de NCCLS. Se descubrio que los compuestos descritos en el presente documento, tal como CEM-101 eran altamente potentes que tenfan una MIC frente a S. pneumoniae (3773) de <0,125 pg/ml y S. pyogenes (1850) de 0,5 pg/ml, en comparacion con 1 y 8 pg/ml, respectivamente para Telitromicina. Se descubrio que CEM-103 10 (20c), un analogo de CEM-101 que contenfa la 3-O-cladinosa, era menos activo. Los cetolidos que contenfan triazol sustituido no heteroaromatico eran menos activos.

Los cetolidos se ensayaron frente a cepas sensibles a eritromicina (Ery-S) y resistentes a eritromicina (Ery-R) de S. aureus (29213 (Ery-S) y 96:11480 (Ery-R)), S. pneumoniae (49619 (Ery-S) y 163 y 303 (Ery-R)) y H. influenzae 15 (49247 (Ery-S)) (Tablas 1-3). El procedimiento de microdilucion en caldo de cultivo se uso para determinar las concentraciones inhibitorias mfnimas (MIC) frente a todos los patogenos segun el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

La longitud de cadena de la cadena lateral alquilo tenia una actividad afectada (Tabla 1). Por ejemplo, el triazol fenilo 20 sustituido unido a 3-carbono 11a era menos activo frente a Ery-S y Ery-R S. aureus y estaba inactivo frente a Ery-R S. pneumoniae 303 (ermB) a las concentraciones ensayadas, mientras que los triazoles fenilo sustituidos unidos a 4- y 5-carbono correspondientes 11b y 11c eran mas activos frene a estos organismos. Se observo una tendencia similar para los triazoles 2-piridilo sustituidos 14a-c, los triazoles 3-amino-fenilo sustituidos 16a-c, y los triazoles 2,5- diclorofenoxi sustituidos 17a-c.

25

El triazol 2-piridilo sustituido unido a 4-carbono 14b y el triazol 3-amino-fenilo sustituido 16b posefan la mayor potencia frente a S. pneumoniae 303, y ambos tenfan valores de MIC (<0,125 pg/ml) comparables a telitromicina. El cetolido que contenfa el triazol 3-piridilo sustituido unido a 4-carbono 15b era menos inactivo frente a esta cepa (MIC de 64 pg/ml). Dentro de esta serie, la actividad antibacteriana se mejoro extendiendo el enlazador de carbono a 5 30 atomos, por ejemplo la MIC frente a S. pneumoniae 303 para el compuesto 15c mejoro de 64 a 4 pg/ml. Tambien se

observo un efecto similar para el cetolido que contenfa benzo-triazol 18c frente a S. aureus pero 18c aun estaba inactivo frente a S. pneumoniae 303. Se aprecia que un equilibrio entre la longitud del enlazador y la naturaleza de la sustitucion aromatica del triazol puede afectar a la actividad total frente a S. pneumonia y S. aureus resistentes a macrolidos.

5

Tambien se observo una correlacion entre la longitud del enlazador y la actividad para H. influenzae (49247), donde la serie de cetolidos mas potente tenia el triazol sustituido unido a traves de una cadena de 4-carbono (11b-14b, 16b, 17b) o una cadena 5-carbono (15c, 18c). De forma interesante, la serie aromatica mas potente frente a H. influenzae era el 3-amino-fenilo con un enlazador 3-, 4- o 5-carbono (16a, 16b, 16c) que tenia MIC de 16, 2 y 10 8 pg/ml, respectivamente.

Los macrolidos que contenfan una cladinosa en la posicion 3 eran todos altamente activos frente a S. pneumoniae Ery-S (49619) (Tabla 2). Sin embargo, estos analogos eran menos potentes que la telitromicina frente a cepas de Ery-R. Las MIC eran significativamente mas altas para los analogos que contenfan cladinosa con sustituyentes de 215 piridilo, 2-aminofenilo o 2,6-diclorofenilo triazol que para los cetolidos correspondientes (20a, 20c y 20d frente a 14b, 16b y 17b). Por el contrario, la actividad antibacteriana se establecio de nuevo para los analogos de cetolidos 15b (3- piridilo) y 18b (benzo-triazol) reemplazando el ceto con el grupo de cladinosa en los analogos 20b (3-piridilo) y 20e (benzo-triazol). Las MIC mejoraron de 64 pg/ml para 15b y 18b a 1 y 2 pg/ml para 20b y 20e, respectivamente. Tambien se observo una tendencia de actividad similar para S. pneumoniae Ery-R 163 (MefA).

20

EJEMPLOS DE COMPUESTOS

imagen9

25 Una mezcla de 11-N-(4-Azido-butil)-6-O-metil-5-(3-dimetilamina-4-desoxi-6-O-acetil-glucopiranosil)-2-fluoro-3-oxo- eritronolida A, 11,12-carbamato (15 mg, 0,019 mmol), 6-Etinil-piridin-2-ilamina (4,7 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 ml) se calento a 70 °C. Despues de 16 h, la mezcla se concentro y se sometio directamente a cromatograffa sobre gel de sflice (9:1, cloroformo:metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 14 mg del compuesto deseado. MS: C44H66FN7O12 calculado M+ = 903,5. Observado: M+H+ = 904,5.

30

imagen10

11-N-4-(3-aminofenil)-[1,2,3]triazol-1-il]-butil}-5-desosaminil-3-oxo-2-fluoro-eritronolida A, 11,12-carbamato cfclico (CEM-101). Una mezcla de 11-N-(4-azido-butil)-6-O-metil-5-desosaminil-3-oxo-2-fluoro-eritronolida A, 11,1235 carbamato (17 mg, 0,023 mmol), 3-Etinil-fenilamina (5,4 mg, 0,046 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 ml) se calento a 70 °C. Despues de 16 h, la mezcla se concentro y se sometio directamente a cromatograffa sobre gel de sflice (9:1, cloroformo:metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 17 mg del compuesto deseado, MS

C43H65FN6O10 calculado M+ = 844,47. Observado: M+H+ = 845,5

imagen11

5 11-N-{4-[4-(6-Amino-piridin-2-il)-[1,2,3]triazol-l-il]-butil}-5-desosaminil-3-oxo-2-fluoro-eritronolida A, -11,12-carbamato cfclico. Una mezcla de 11-N-(4-azido-butil)-6-O-metil-5-desosaminil-3-oxo-2-fluoro-eritronolida A, 11,12-carbamato (15 mg, 0,02 mmol), 6-etinil-piridin-2-ilamina (4,7 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 ml) se calento a 70 °C. Despues de 16 h, la mezcla se concentro y se sometio directamente a cromatograffa sobre gel de sflice (9:1, cloroformo:metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 14 mg de el compuesto deseado OP1357, 10 MS: C42H64FN7O10 calculado M+ = 845,5. Observado: M+H+ = 846,5.

imagen12

11 -N-[4-(4-Benzotriazol-1 -ilmetil-[1,2,3]triazol-1 -il)-butil]-6— O-metil-5-O-dasosaminil-3-oxo-eritronolida A, 11,1215 carbamato. Una mezcla de 11-N-(4-Azido-butil)-6-O-metil-5-O-desosaminil-3-oxo-eritronolida A, 11,12-carbamato (3 mg, 0,0039 mmol), 1-Prop-2-inil-1H-benzotriazol (3 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 ml) se calento a 80 °C. Despues de 16 h, la mezcla se concentro y se sometio directamente a cromatograffa sobre gel de sflice (9:1, cloroformo:metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 3 mg del compuesto deseado. MS: C44H66N8O10 calculado M+ = 866,5. Observado: M+H+ 867,5,

20

imagen13

11-N-[4-(4-Benzotriazol-1-ilmetil-[1,2,3]triazol-1-il)-butil]-6-O-metil-5-micaminosil-3-oxo-eritronolida A, 11,12- carbamato. Una mezcla de 11-N-(4-azido-butil)-6-O-metil-5-micaminosil-3-oxo-eritronolida A, 11,12-carbamato (3 mg, 0,004 mmol), 1-Prop-2-inil-1H-benzotriazol (3 mg, 0,4 mmol), Cul (1 mg, 0,005 mmol) y tolueno (0,2 ml) se 5 calento a 80 °C. Despues de 16 h, la mezcla se concentro y se sometio directamente a cromatograffa sobre gel de sflice (9:1, cloroformo:metanol mas hidroxido de amonio al 1 %) para dar 3 mg del compuesto deseado. MS: C44H66N8O11 calculado M+ = 882,5. Observado: M+H+ = 883,5.

EJEMPLOS DE PROCEDIMIENTO

10

EJEMPLO. Eficacia pivotal de CEM-101 frente a una exposicion con B. antracis de inhalacion letal en macacos Cynomolgus que evalua la eficacia de CEM-101 frente a una exposicion en aerosol letal. Se hicieron pruebas en cuarenta y dos (21 machos, 21 hembras) macacos Cynomolgus sin tratar de aproximadamente 2,5-5,0 kg, ~2-5 anos (disponibles en Covance) (40 para el estudio y 2 adicionales). Se hacen pruebas a los monos y se verifica que den 15 negativo para tuberculosis y tambien se criban previamente 30 dfas antes de la recepcion para confirmar que son seronegativos para el virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), Virus linfotropico T de simio de tipo 1 (STLV- 1), y herpesvirus cercopitecina 1 (virus Herpes B) y negativos para retrovirus del simio (SRV1 y SRV2) por PCR. Vease la Tabla 7.

20 Tabla 7: Diseno de Estudio Propuesto

Identificacion del Grupo

Monos/Grupo Antibiotico o Vehfculo Dosis (mg/kg) Regimen de Dosificacion Tiempo hasta la 1a Dosis (h PE) Duracion del Tratamiento (dfas)

1

10 CEM-101 5 Una vez al dfa 24 14

2

10 CEM-101 10 Una vez al dfa 24 14

3

10 CEM-101 15 Una vez al dfa 24 14

4

10 Agua esteril para inyeccion 2 ml/kg Una vez al dfa 24 14

Los animales se pesan en los dfas de estudio - / y 0. Los monos que mueren o se someten a eutanasia en el estudio se pesan antes de la necropsia. Pueden tomarse pesos adicionales si un animal parece estar perdiendo peso 25 durante el transcurso del avance de la enfermedad. Las observaciones clfnicas de todos los monos se realizan dos veces al dfa durante el periodo de exposicion previa. Se toman muestras sangufneas de una arterfa o vena femoral, vena safena, u otra vena apropiada en los dfas especificados en la Tabla 8. Las muestras de sangre recogidas el dfa de la exposicion se recogen antes de la exposicion. Las temperaturas corporales se controlan a traves de un chip transpondedor de temperatura programable implantable (tal como IPTT-300 BMDS, Seaford, DE) dos veces al dfa a 30 partir de la implantacion (~dfa -7) al dfa 28.

Tabla 8: Programacion de Extraccion de Sangre

Punto Temporal

Bacteriemia (Cultivo) CBC/CRP Qmm. Clmica Det. Nivel Antibiotico Ensayo de Coagulacion

Dfa -7

X X X X

Dfa 0 (antes de la exposicion)

X X X

24 horas PE (Antes del tratamiento)

X X X X

28 horas PE (~4 horas PT)

X

48 horas PE

X X X X X

72 horas PE

X X X X

96 horas PE

X X X X

Dfa 7 (~4 horas PT)

X X X X X

Dfa 8

X

Dfa 14 (~4 horas PT)

X X X X X

Dfa 15

X

Dfa 21

X X X X

Dfa 28

X X X X

Dfa 30

X

Dfa 32

X

Terminal

X CRP

PT = post-tratamiento, PE = post-exposicion

5 Los monos se transportan al BL (nivel de bioseguridad de laboratorio 3)-~5-10 dfas antes de la exposicion para dejar un tiempo de aclimatacion. Los monos de cada grupo del dfa de la exposicion se asignan de forma aleatoria por el orden de exposicion antes de la exposicion. El dfa 0, los monos se anestesian con Telazol (1-6 mg/kg, IM) y se ponen en una camara de pletismograffa y un sistema de cabina de Clase III para el agente de exposicion diana aerosolizado por un nebulizador Collison y administrado a traves de una camara de exposicion para inhalacion solo 10 para la cabeza.

Las concentraciones de aerosol del material de exposicion se cuantifican por la determinacion de unidades formadoras de colonias (ufc). Las corrientes de efluyente se recogen directamente de un puerto de exposicion del animal por un borboteador de vidrio en lmea. Las diluciones seriadas de muestras del borboteador se ponen en 15 placas y se cuentan.

Tras la exposicion, los monos se observan dos veces al dfa durante un mmimo de 28 dfas en condiciones BL-3 para evaluar la supervivencia y signos clmicos de enfermedad. Los animales supervivientes pueden retirarse del BL-3 despues del dfa 28 posterior a la demostracion de tres cultivos sangumeos negativos consecutivos.

20

Las muestras de sangre de los puntos temporales indicados en la Tabla 8 se cultivan para determinar la presencia o ausencia de bacterias. Tambien se realiza una evaluacion hematologica (CBC). El analisis por CRP se realiza en el plasma residual recogido de cada muestra de sangre total despues del procesamiento. El analisis por CRP tambien se realiza en muestras de sangre terminal recogidas en tubos EDTA si el plasma puede aislarse. Los ensayos de 25 coagulacion incluyen el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), el fibrinogeno y el dfmero D.

Analisis Estadfstico: Se usan pruebas exactas de Fisher para comparar las tasas de supervivencia entre cada grupo de tratamiento de antibiotico y el grupo de control. Se realiza un analisis de tiempo hasta la muerte sobre estos datos 30 determinando si hay diferencias en la proteccion para los diferentes grupos en base a la longitud del modelo de supervivencia. Se trazan las estimaciones de Kaplan-Meier de las probabilidades de supervivencia. La prueba de rango logantmico o de Wilcoxon o la regresion de riesgos proporcionales de Cox se usan para determinar si hay diferencias significativas entre los grupos, y si las hubiera, que grupos son significativamente diferentes. Los datos de cultivo de bacteriemia se analizan por separado en cada punto temporal. Se producen estadfsticas de resumen 35 con intervalos de confianza al 95 por ciento para cada grupo y punto temporal. Se usa la prueba exacta de Fisher para ensayar si hay cualquier diferencia significativa en los datos de cultivo de bacteriemia entre los grupos. Para hematologfa, qrnmica clmica, coagulacion, temperatura, niveles de antibiotico maximos y mmimos; se producen estadfsticas de resumen e intervalos de confianza al 95 % para cada grupo. El analisis de los modelos de varianza (ANOVA) puede ajustarse a cada parametro en cada punto temporal para determinar si hay diferencias

estadfsticamente significativas entre los grupos de tratamiento. Se espera que sobrevivan pocos animales de control, pueden usarse valores iniciales para los animales tratados en estas comparaciones, sirviendo cada animal como su propio control. Los cambios medios en los parametros de temperatura, qufmica clfnica y hematologfa se comparan con cero, para evaluar cualquier cambio en el estado de salud.

5

La eficacia de CEM-101 frente a una exposicion a F. tularensis, Y. pestis y B. mallei por inhalacion letal en NHP y la eficacia piloto de CEM-101 frente a una exposicion de B. antracis por inhalacion letal en NHP se determinan usando los metodos que se han descrito anteriormente.

10 EJEMPLO. Farmacocinetica de Conejo y Estudio de Tolerabilidad

Tabla 1. Grupos

Grupo de Tratamiento

Producto N° de Animales por Sexo (Total) Nivel de Dosis (Ing/kg)

1

CEM-101 5(10) 5

2

CEM-101 5(10) 10

3

CEM-101 5(10) 15

4

Control ___________5(10)___________ NA

15

Tabla 2. Programacion de Extraccion de Sangre

Punto Temporal

Niveles de Antibiotico Qufmica Clfnica Hematologfa Clfnica

Dfa -7

X X X

Dfa -3

X X X

*1 h

X X X

*2 h

X X X

*4 h

X X X

*6 h

X X X

*12 h

X X X

*18 h

X X X

*24 h

X X X

*48

X X X

*72

X X X

*96

X X X

*Dfa 10

X X X

*Dfa 20

X X X

*Dfa 30

X X X

*Extracciones sangufneas recogidas despues del tratamiento

Los niveles sangufneos de CEM-10 se determinan a partir de muestras sangufneas recogidas de conejos tratados y de control en el tiempo indicado antes y durante la administracion de CEM-101.

20

EJEMPLO. Farmacocinetica (PK) en primates no humanos. Los datos de PK se recogen en tres fases. Ocho monos (4 machos, 4 hembras) participan en cada fase (Tabla 3). Cada fase se sigue de un periodo de lavado mfnimo de 7 dfas antes del inicio de la siguiente fase.

25

Tabla 3. Diseno de Estudio

Fase

# por Fase Dosis de CEM-101 (mg/kg) Recogida de Sangre

1

8 5 Dfa 1: 0a, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48 h, 96 h

2

8 10 Dfa 1: 0a, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48 h, 96 h

3

8 15 Dfa 1: 0a, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48 h, 96 h

EJEMPLO. Caracterizacion del material de exposicion de Burkholderia mallei y administracion en el gran sistema de exposicion animal. La cepa de Burkholderia mallei se estrfa para el aislamiento en medios de cultivo apropiados (tal 30 como agar de caldo de cultivo Lisogenia (LB) con glicerol al 4 por ciento o medio de Ashdown). Tras la confirmacion de la pureza y morfologfa de las colonias (considerando que las colonias morfologicamente variantes son comunes para B. mallei), todas las colonias se retiran y se suspenden en un medio de almacenamiento bacteriano apropiado y se congelan a <-70 °C. Se prepara una coleccion de colonias en lugar de una unica colonia aislada (se aprecia que el aislamiento de un unico tipo de colonia puede seleccionar inadvertidamente una variante con propiedades de 35 virulencia alteradas). Las colonias recogidas constituyen el banco de celulas maestras. El procedimiento se repite

mediante la estriacion del banco de celulas maestras para preparar el banco de celulas de trabajo.

Todos los cultivos preparados en medios agar en la preparacion de los bancos de celulas maestras y de trabajo se examinan para comprobar la morfologfa y pureza de las colonias. El examen morfologico macroscopico incluye 5 descripciones de la forma, tamano, elevacion, margen, color, aspecto superficial, densidad y consistencia de las colonias. Si se determina un banco de celulas que contiene los contaminantes, este se obtiene de nuevo a partir del banco de celulas maestras.

El material de cultivo de los bancos de celulas maestras y de trabajo se tine en Gram. Los resultados de la tincion de 10 Gram y la morfologfa celular macroscopica se observan y se comparan con los resultados previos en la bibliograffa publicada. El material del banco de celulas de trabajo se usa para inocular los cultivos de caldo de cultivo; los matraces se incuban diversas veces y la densidad optica de los cultivos medidos. Se preparan multiples cultivos de caldo de cultivo. Cada cultivo se cultiva a una densidad optica diana y despues los numeros de UFC/ml del cultivo se determinan mediante enumeracion por extension en placas. Una relacion del numero de UFC/ml se determina 15 promediando los resultados de multiples cultivos para una densidad de cultivo. Se realiza PCR cualitativa en tiempo real (+/- PCR) para determinar, a nivel de acido nucleico, que cada banco de celulas de trabajo es, de hecho, la cepa de B. mallei proporcionada. La concentracion de bacterias en los bancos de celulas maestras y de trabajo para todas las cepas se determina mediante enumeracion por extension en placas, o una tecnica comparable.

20 Se preparan suspensiones frescas de B. mallei a partir de muestras de reserva. Se prepara un lote fresco para cada dfa y se realizan ensayos en aerosol. Las soluciones de B. mallei de partida (nebulizador) para aerosolizacion diluidas en una solucion salina tamponada con fosfato esteril (PBS) que contiene gelatina al 0,01 % (p/vol) con trehalosa al 9,7 % (p/vol) (BSGT) y aproximadamente 8 ml se ponen en el nebulizador para cada ensayo. Se recogen muestras en aerosol de la camara de exposicion usando borboteadores de vidrio (por ejemplo, modelo 7541 25 Ace Glass, Inc.) rellenado con ~20 ml de una solucion salina tamponada con fosfato esteril (PBS) que contiene gelatina al 0,01 % (p/vol) (BSG) y anti-espuma A al 0,01 % hasta la colocacion en placas para recuentos de ufc. La distribucion del tamano de parbculas de aerosol se muestrean del sistema de exposicion y se miden usando un dimensionador de partfculas aerodinamico.

30 Se realizan una serie de pruebas de caracterizacion del sistema de exposicion en aerosol para cuantificar la concentracion de aerosol de B. mallei viable (es decir UFC) y la reproducibilidad de la generacion de aerosol. La Tabla 4 ilustra una matriz de prueba que puede usarse para ensayar la reproducibilidad del sistema de aerosol. Las pruebas de caracterizacion se repiten para generar cuatro concentraciones en aerosol diana diferentes cada dfa durante 3 dfas. La generacion de cada concentracion de aerosol diana se repite tres veces cada dfa. Las muestras 35 de aerosol se recogen y se enumeran en UFC a traves de la tecnica de extension en placas. Ademas, la temperatura, la humedad relativa y el tamano de partfcula de aerosol durante cada ensayo se controla para al menos un punto temporal.

Tabla 4. Ensayo de Caracterizacion de Aerosol

40

Numero de

Concentracion de Aerosol Diana Numero de repeticiones del ensayo por concentracion

Ensayo

(UFC/l de aire) de aerosol diana

Ensayo 1

A 3

Ensayo 2

B 3

Ensayo 3

C 3

Ensayo 4

D 3

La matriz de ensayo completa (Ensayos 1-4) se repite durante 3 dfas separados.

Para los ensayos de caracterizacion de aerosol, los modelos ANOVA estadfsticos se ajustan a los datos de ensayo 45 para el sistema de aerosol. Estos datos consisten en cuatro concentraciones de aerosol ensayadas tres veces cada dfa repitiendose todo el experimento en tres dfas diferentes. Se ensaya una hipotesis estadfstica si el resultado del sistema medido (por ejemplo, el factor de pulverizacion) es reproducible (es decir, diferencias no estadfsticamente significativo un dfa en comparacion con otro). Un resultado negativo (es decir, no estadfsticamente significativo) concluira la reproducibilidad. Tambien se realizaran analisis de potencia para determinar la sensibilidad minima del 50 ensayo para la identificacion de diferencias reales.

EJEMPLO. Desarrollo del sistema de aerosol de raton para la generacion, administracion y recogida de B. mallei. Se realizo una serie de pruebas de caracterizacion del sistema de exposicion de aerosol para cuantificar la concentracion de aerosol de B. mallei viable (es decir UFC) y la reproducibilidad del sistema de exposicion. La Tabla 55 4 ilustra la matriz de ensayo provisional propuesta que se usa para ensayar la reproducibilidad del sistema de aerosol. Las pruebas de caracterizacion se repiten para generar cuatro concentraciones de aerosol diana diferentes

cada dfa durante 3 dfas. La generacion de concentracion de aerosol diana se repite tres veces cada dfa. Las muestras de aerosol se recogen como se ha descrito anteriormente y se enumeran para las unidades formadoras de colonias (ufc) a traves de una tecnica de extension en placas.

5 Para los ensayos de caracterizacion de aerosol, los modelos estadfsticos ANOVA se ajustan a los datos de ensayo para el sistema de aerosol. Como se ha descrito anteriormente, estos datos consisten en cuatro concentraciones de aerosol ensayadas tres veces cada dfa repitiendose todo el experimento tres dfas diferentes. Se ensaya una hipotesis estadfstica si el resultado del sistema medido (por ejemplo, el factor de pulverizacion) es reproducible (es decir, diferencia no estadfsticamente significativa una dfa en comparacion con otro). Un resultado negativo (es decir, 10 no estadfsticamente significativo) concluye la reproducibilidad. El analisis de potencia tambien se realiza para determinar la sensibilidad minima del ensayo para identificar diferencias reales.

EJEMPLO. Determinacion de la dosis letal media inhalada (LD50) de B. mallei en ratones. La determinacion de la LD50 inhalada para B. mallei se realiza en fases. Cada fase de este estudio consiste en un periodo posterior a la 15 exposicion que se extendera hasta el Dfa 28. El dfa que un animal se expone se designa como Dfa 0 del estudio. La Fase I consiste en 5 grupos, la fase II en cuatro grupos y las fases III y IV consisten en tres grupos cada una. En base a los resultados de mortalidad de las fases anteriores, se determinan nuevas dosis de exposicion diana. Este procedimiento por fases permite un aumento de la confianza en el valor de LD50 inhalada.

20 Tabla 6. Enfoque en Fases para Determinar la LD50 en Ratones

Fase

Grupos por Fase Ratones Totales

I

5 grupos de 4 20

II

4 grupos de 8 32

III

3 grupos de 8 24

IV

3 grupos de 8 24

Los ratones se exponen a traves de la ruta de inhalacion con B. mallei el Dfa 0 del estudio (para cada Fase). Se utiliza un sistema de exposicion en aerosol solo para la nariz (por ejemplo, una CH Technologies Tower) para 25 administrar las dosis de aerosol deseadas a los ratones. El sistema de CH Technologies Tower usado para los ensayos de exposicion de aerosol en ratones es capaz de exponer hasta 30 ratones a la vez con la adicion de muestreadores de borboteador, un analizador del tamano de partfculas de aerosol, control de la temperatura y la humedad, y medidores del flujo masico (MFM) y controladores del flujo masico (MFC) para controlar y/o supervisar los flujos del aerosol. En resumen, el aire forzado entra en el sistema a traves de filtros de aire en partfculas de alta 30 eficiencia (HEPA) y se divide en una corriente de aire continua (aire continuo) y una corriente de aire que fluye en el nebulizador Collison (durante la generacion de aerosol) o lo deriva (entre generaciones de aerosol). El MFC regula el flujo para cada una de las corrientes de aire. El aerosol de B. mallei, creado por el nebulizador, se mezcla con aire continuo antes de la administracion a la torre de exposicion. Los parametros de exposicion de aerosol requeridos para administrar estas dosis se basan en los resultados del estudio de caracterizacion del sistema de aerosol de 35 raton propuesto que se ha descrito anteriormente.

Las concentraciones de aerosol de B. mallei se cuantifican por la determinacion de unidades formadoras de colonias (ufc). Las corrientes de efluyente se recogen directamente de un puerto de exposicion animal mediante un borboteador de vidrio en lfnea. Las diluciones seriadas de muestras del borboteador se colocan en placas y se 40 enumeran.

Los ratones se observan dos veces al dfa durante un total de 29 dfas, que incluyen Dfa del Estudio 0 a Dfa del Estudio 28, para determinar la aparicion de los signos clfnicos de enfermedad y supervivencia.

45 Para determinaciones de LD50 (dosis letal media inhalada) en ratones, los experimentos se realizan en fases (Feder, 1992). Los modelos de dosis-respuesta de probit se ajustan a los datos de mortalidad de la dosis para ratones usando el procedimiento de probabilidad maxima (Finney, 1971 y Feder, 1991). Los parametros estimados de los modelos de dosis-respuesta de probit se usan para computar la LD50. Se usa el procedimiento de Fieller (Finney, 1971) u otros metodos apropiados para computar un intervalo de confianza al 95 por ciento para la LD50.

50

Se registra el tiempo hasta la aparicion de cada uno de los signos clfnicos hasta la muerte, la eutanasia, o el final del periodo de observacion clfnica del animal. Se determinan la proporcion de animales que muestran cada uno de los signos clfnicos y el tiempo hasta la aparicion de cada signo. La mortalidad se registra en el momento observado. Los modelos de riesgos proporcionales de Cox se ajustan a los datos del tiempo hasta la aparicion y el tiempo hasta la 55 muerte, con una dosis como una variable explicativa. Dado que los signos mas graves pueden enmascarar signos menos graves, los signos pueden agruparse para este analisis. El tiempo medio hasta los signos y el tiempo medio hasta la muerte se calcula a la LD50.

EJEMPLO. Historia Natural/Determinacion de LD50 de enfermedad por Burkholderia mallei por inhalacion en macacos Cynomolgus. La determinacion de la dosis letal (LD50) de B. mallei y la caracterizacion de la historia natural de la melioidosis por inhalacion en macacos cynomolgus se determina controlando los signos clfnicos de la 5 enfermedad, incluyendo observaciones clfnicas, hematologfa, qufmica clfnica, parametros telemetricos, ensayos de coagulacion, bacteriemia y el numero de bacterias en los organos seleccionados.

Se obtienen veintidos (11 machos, 11 hembras) de macacos cynomolgus sin tratar (monos, NHP) de aproximadamente 2,5-5,0 kg (~2-5 anos) (disponibles en Covance). Dos de los NHP serviran como reemplazos, si 10 es necesario, durante las Fases I, II y III. Se hacen pruebas a los monos y se verifica que den negativo para tuberculosis y tambien se criban previamente 30 dfas antes de la recepcion para confirmar que son seronegativos para el virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), Virus linfotropico T de simio de tipo 1 (STLV-1), y herpesvirus cercopitecina 1 (virus Herpes B) y negativos para retrovirus del simio (SRV1 y SRV2) por PCR. Los monos se ponen en cuarentena durante un mfnimo de cinco semanas antes de ponerse en el estudio. Antes de la 15 colocacion en el estudio, a todos los monos se les implanta quirurgicamente transmisores de telemetrfa (por ejemplo, artfculo D70-PCTP, adquirido en Data Sciences International, DSI).

Diez grupos de monos se expusieron a diversas dosis de B. mallei administradas a traves de aerosol durante un periodo de cuatro fases (vease la Tabla 7). Basandose en los resultados de mortalidad de las fases anteriores, se 20 determinan nuevas dosis de exposicion diana para la fase sucesiva. Este procedimiento por fases permite un aumento de la confianza en el valor de la LD50 inhalada estimado. Las primeras tres fases se usan para determinar la LD50 de B. mallei en NHP. En la fase final, los 4 NHP restantes se estimulan con una alta exposicion que se espera que sea letal en una gran parte de los animales basandose en los resultados de las primeras tres fases (es decir, se dirigen a una dosis de exposicion alrededor de la LD90). Si los NHP de reemplazo no se usan en las Fases 25 I, II o III, entonces tambien se exponen en la Fase IV. La informacion recogida en la Fase IV apoya la informacion de la historia natural recogida en las primeras 3 fases y aumenta el entendimiento del avance de la enfermedad en animales estimulados con elevadas dosis similares a las que pueden utilizarse en estudios de eficacia. Los resultados obtenidos de la Fase IV tambien pueden aumentar la precision de una estimacion de la LD90.

30 Tabla 7. Enfoque en Fases para Determinar la LD50 en Macacos Cynomolgus

Fase

Grupo Dosis de UFC Numero de NHP

I

1 10.000 2

2

100.000

2

3

1.000.000 2

4

10.000.000 2

II

5 TBD 2

6

TBD 2

III

7 TBD 2

8

TBD 2

IV*

9 TBD 2

10

TBD 2

*Se incluyen dos NHP adicionales en esta fase si no se usan como reemplazos en las Fases I, II o III.

Los animales se pesan durante la cuarentena y los Dias de Estudio -7 y 0. Los monos que mueren o se someten a eutanasia en el estudio se pesan antes de la necropsia. Pueden tomarse pesos adicionales si un animal parece estar

35 perdiendo peso durante el transcurso del avance de la enfermedad. Las observaciones clfnicas de todos los monos se realizan dos veces al dfa durante el periodo previo a la exposicion. Tras la exposicion en aerosol, los monos se controlan tres veces al dfa durante 28 dfas despues de la exposicion para evaluar la supervivencia y signos clfnicos de enfermedad: agonfa, dificultad respiratoria, apetito, actividad (yaciente, debil o insensible), convulsiones, y otras observaciones clfnicas (descritas por el observador).

40

Se toman muestras de sangre de una arterfa o vena femoral, vena safena, u otra vena apropiada los dfas especificados en la Tabla 8. Las muestras de sangre recogidas el dfa de la exposicion tendran lugar antes de la exposicion.

45 Telemetrfa: Los datos iniciales y post-exposicion para la temperatura corporal; ECG; actividad; y funcion cardiovascular (frecuencia cardiaca, presion sistolica/diastolica, presion de pulso, presion media y presion respiratoria) se recogen durante al menos 30 segundos cada 15 minutos a lo largo de todo el estudio. Los datos iniciales se recogen durante al menos 10 dfas antes de la exposicion. Los detalles sobre la operacion especffica y la recogida de datos se encuentran en SOP BBRC.VI-087, SOP BBRC.VI-093 y SOP BBRC.VI-096.

5

10

15

20

25

Tabla 8. Programacion de Extraccion de Sangre de Historia Natural

Punto Temporal

Bacteriemia CBC/CRP Qmmica Clmica Ensayos de Coagulacion QPCR

Dfa -7

X X X X X

Dfa 0

X X X

Dfa 1 PE

X X X X X

Dfa 2 PE

X X X X X

Dfa 3 PE

X X X X X

Dfa 4 PE

X X X X X

Dfa 5 PE

X X X X X

Dfa 6 PE

X X X X X

Dfa 7 PE

X X X X X

Dfa 14 PE

X X X X X

Dfa 21 PE

X X X X X

Dfa 28 PE

X X X X X

Terminal

X CRP unicamente X

Los monos se transportan al BL-3 ~14 dfas antes de la exposicion para dejar un tiempo de aclimatacion. El Dfa 0, los monos se anestesian con Telazol (1-6 mg/kg, IM) y se ponen en una camara de pletismograffa y un sistema de cabina de Clase III y se exponen a la dosis diana de B. mallei aerosolizado por un nebulizador Collison y administrado a traves de una camara de exposicion para inhalacion solo para la cabeza. Las concentraciones de aerosol de B. mallei se cuantifican por la determinacion de UFC. Las corrientes de efluyente se recogen directamente de un puerto de exposicion animal mediante un borboteador de vidrio en lmea. Las diluciones seriadas de muestras del borboteador se colocan en placas y se enumeran.

Los monos que sobreviven al periodo de 28 dfas posterior a la exposicion se someten a eutanasia y se examinan como se describe a continuacion. Debido al potencial de los monos supervivientes para desarrollar una infeccion cronica, todos los animales han de anestesiarse. Ademas, la cuantificacion de la carga bacteriana en los tejidos de animales en estudios de eficacia posteriores puede proporcionar un criterio de valoracion secundario para el analisis (es decir, si el tratamiento no reduce significativamente la mortalidad, este puede reducir significativamente la carga bacteriana).

Las muestras de sangre de los puntos temporales indicados en la Tabla 8 se cultivan para determinar la presencia o ausencia de B. mallei. Ademas, en cada uno de estos puntos temporales se recogen aproximadamente 100 |il se sangre total cuyo ADN se afsla y se realiza el analisis por QPCR.

Se realiza la evaluacion hematologica (CBC) que incluye, pero sin limitacion, los siguientes parametros:

Recuento de globulos blancos (WBC)

Recuento diferencial de leucocitos (% y absoluto) Relacion de Neutrofilos:Linfocitos (Relacion N/L) Hemoglobina (HGB)

Hematocrito (HcT)

Recuento de globulos rojos (RBC)

Volumen corpuscular medio (MCV)

Hemoglobina corpuscular media (MCH) Concentracion de hemoglobina corpuscular media Amplitud de distribucion eritrocitaria (RDW) Recuento plaquetario (PLT)

Volumen plaquetario medio (MPV)

5

10

15

La evaluacion de la qufmica clfnica se realiza e incluye, pero sin limitacion, los siguientes parametros:

Alanina aminotransferasa (ALT) Aspartato aminotransferasa (AST) Fosfatasa Alcalina (ALP) Gamma-Glutamil Transferasa (GGT) Lactato deshidrogenasa (LDH) Sorbitol Deshidrogenasa (SDH) Bilirrubina total Protefna total Albumina Globulina

Relacion de Albumina/Globulina (A/G) Nitrogeno ureico en sangre (BUN) Creatinina

Relacion de BUN/Creatinina

Glucosa

Sodio

Potasio

Cloruro

Calcio

Fosforo

Las muestras sangufneas para el analisis de los factores de coagulacion se recogen en tubos que contienen citrato sodico. El analisis de protefna C reactiva (CRP) se realiza en el plasma residual recogido de cada muestra de sangre total despues del procesamiento. El analisis de CRP tambien se realiza en muestras de sangre terminal recogidas en tubos EDTA si el plasma puede aislarse.

La necropsia macroscopica se realiza en todos los monos que mueren o se someten a eutanasia. Las porciones de tejidos diana que incluyen, pero sin limitacion, los pulmones, el bazo y el hfgado, se homogeneizan, el ADN se afsla, y el analisis por qPCR se realiza para determinar las cargas bacterias en estos organos. Las secciones de tejidos diana que incluyen, pero sin limitacion, el cerebro, los pulmones, el rinon, el hfgado, el bazo, el mediastino y los nodulos linfaticos bronquiales, asf como todas las lesiones macroscopicas, se conservan en formalina tamponada neutra al 10 %. La histopatologfa se realiza en todos los animales, incluyendo los supervivientes sometidos a eutanasia el dfa del estudio 28.

Los modelos de dosis-respuesta de probit se ajustan a los datos de mortalidad de la dosis para monos usando el 20 procedimiento de probabilidad maxima (Finney, 1971 y Feder, 1991). Los parametros estimados de los modelos de dosis-respuesta de probit se usan para computar la LD50 y LD90. Se usa el procedimiento de Fieller (Finney, 1971) u otros metodos apropiados para computar un intervalo de confianza del 95 por ciento para la LD50 y LD90.

Se registra el tiempo hasta la aparicion de cada uno de los signos clfnicos hasta la muerte, la eutanasia, o el final del 25 periodo de observacion clfnica del animal. Se determinan la proporcion de animales que muestran cada uno de los signos clfnicos y el tiempo hasta la aparicion de cada signo. Los modelos de riesgos proporcionales de Cox se ajustan a los datos del tiempo hasta la aparicion y el tiempo hasta la muerte, con una dosis como una variable explicativa. Dado que los signos mas graves pueden enmascarar signos menos graves, los signos pueden agruparse para este analisis. El tiempo medio hasta los signos de enfermedad y el tiempo medio hasta la muerte se 30 calculan a la LD50.

Analisis Estadfstico de los Resultados de Hematologfa, Qufmica Clfnica, Coagulacion y qPCR: Estos parametros se evaluan con respecto al inicio para el mismo animal calculando el cambio del nivel de exposicion previa medio en cada punto temporal de recogida de datos. Si es necesario, los datos hematologicos y de qufmica clfnica se 35 transforman en primer lugar mediante el logaritmo para producir una respuesta distribuida mas normalmente. En este caso, los resultados finales se devuelven a sus unidades originales a traves de exponenciacion. Las estadfsticas de resumen se proporcionan para los datos. En cada punto temporal, el desplazamiento medio desde el inicio para todos los animales se evalua usando pruebas t para determinar si el desplazamiento parametrico es estadfsticamente diferente significativamente de un desplazamiento nulo. Para cada uno de los parametros de 40 telemetrfa, los datos recogidos inmediatamente antes de la exposicion se promedian para cada animal, dando como resultado promedios de partida. Despues, los resultados telemetricos en el periodo posterior a la exposicion se ajustan para cada animal restante el promedio de partida. Puede emplearse el suavizado adicional de los datos moviendo medias o mediante otro procedimiento apropiado. La tendencia temporal en las mediciones de datos ajustados y alisados de partida, asf como la suma acumulativa de los ajustes para cada parametro de telemetrfa se 45 trazan para todos los animales.

Se establecen criterios especfficos para la aparicion de la enfermedad usando los datos telemetricos. Se determinan ensayos estadfsticos para evaluar el punto temporal especffico para el cual se produce un criterio de enfermedad en determinada porcion de la poblacion y/o proporcionar un intervalo temporal alrededor de una cierta manifestacion media de la enfermedad. Siempre que sea posible y relevante, los datos adicionales del tiempo hasta la muerte, 5 hematologfa, bacteriologfa y observaciones clfnicas tambien pueden incorporarse en este analisis para determinar el momento optimo de inicio de la terapia.

10

EJEMPLO. Eficacia de CEM-101 frente a una exposicion a F. tularensis, Y. pestis y B. mallei por inhalacion letal en ratones BALB/c.

Tabla 9 Diseno del Estudio

Grupo

Dosis de CEM-101 (mg/kg) Numero de Ratones Duracion del Tratamiento (dfas)

1

50 20 14

2

100 20 14

3

150 20 14

4

200 20 14

5

Control 20 14

Se usan ciento diez (110) ratones BALB/c en este procedimiento (100 se van a colocar en el estudio y 10 15 adicionales). El dfa 0, los ratones se ponen en un sistema de exposicion de aerosol solo para la nariz y se exponen a un agente aerosolizado por un nebulizador Collison. Las concentraciones de aerosol de agente se cuantifican por la determinacion de unidades formadoras de colonias (ufc). Las corrientes de efluyente se recogen directamente de un puerto de exposicion mediante un borboteador de vidrio en lfnea. Las diluciones seriadas de muestras del borboteador se colocan en placas y se enumeran.

20

Tras la exposicion, los ratones se observaron dos veces al dfa durante 28 dfas para evaluar la supervivencia y signos clfnicos de enfermedad. La carga bacteriana en los pulmones, el bazo y la sangre periferica se determinan por la PCR cuantitativa de todos los ratones que se encuentran muertos o bajo eutanasia. Todos los animales que sobreviven al periodo de observacion posterior a la exposicion de 28 dfas se anestesian, y se recoge una muestra de 25 sangre terminal seguida de eutanasia inmediata. Tras la eutanasia tambien puede recogerse un especimen de pulmon y bazo para el analisis de carga bacteriana.

Se usan pruebas exactas de Fisher para comparar las tasas de supervivencia entre cada grupo de tratamiento de antibiotico y el grupo de control. Se realiza un analisis del tiempo hasta la muerte sobre estos datos para determinar 30 si hay diferencias en la proteccion para los diferentes grupos en base a una longitud del modelo de supervivencia.

Eficacia Piloto y Eficacia Pivotal de CEM-101 frente a una Exposicion a B. antracis por Inhalacion Letal en Conejos (vease el estudio de eficacia de conejo general descrito a continuacion).

35 Usando los metodos que se han descrito anteriormente la eficacia de CEM-101 frente a una estimulacion por inhalacion de conejos con aerosol de B. antracis

Tabla 12. Estudios de Eficacia Post-Exposicion de Conejo (usados para B. antracis).

Grupo

Dosis de CEM- 101 (mg/kg) Numero de animales Duracion del Tratamiento (dfas) Analisis de Hematologfa/Qufmica Clfnica/Bacteriemia (con respecto al dfa de la exposicion)

1

5 10 14 -7, 1,2, 3, 4, 7, 14, 21, 28

2

10 10 14 -7, 1,2, 3, 4, 7, 14, 21,28

3

15 10 14 -7, 1,2, 3, 4, 7, 14, 21, 28

4

Control 10 14 -7, 1,2, 3, 4, 7, 14, 21, 28

40

Los animales se tratan entre 18-24 horas despues de la exposicion. Todos los animales se controlan durante 28 dfas despues de la exposicion. Las extracciones de sangre para los niveles maximos y mfnimos de CEM-101 se recogen despues del primer, central y ultimo tratamiento con antibiotico.

45 EJEMPLO. Las MIC se determinaron por el procedimiento de microdilucion en placas de 96 pocillos de acuerdo con Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI formalmente NCCLS) (1). Los antibioticos se diluyeron en serie dos veces en 50 pl de caldo de cultivo de Mueller-Hinton ajustado por cationes (CAMHB). Para las determinaciones de F. tularensis, el CAMHB se complemento con Isovitalex al 2 % (Becton Dickinson). El intervalo de antibiotico era de 16

5

10

15

20

25

30

35

40

a 0,008 pg/ml en base a un volumen de pocillo final de 100 pi despues de la inoculacion.

Se prepararon inoculos suspendiendo colonias de una placa de sangre de oveja (SBA) de 18-24 h (B. antracis, B. mallei o B. pseudomallei) o 48 h (Y. pestis, F. tularensis) o agar de chocolate (de acuerdo con CLSI). Los cultivos suspendidos se diluyeron con CAMHB a una densidad celular bacteriana de 106 UFC/ml. A cada pocillo de la placa de 96 pocillos se le anadieron 50 pl de esta dilucion para un inoculo final de aproximadamente 5 x 104 UFC/pocillo. Las placas se incubaron a 35 °C. Las MIC se determinaron visualmente en 24 y 48 h y leyendo las placas a 600 nm (SpectroMax M2, Molecular Devices).

La preparacion del inoculo y la microdilucion de antibiotico se realizaron de acuerdo con los metodos de CLSI. Las MlC de cada agente se determinaron por el procedimiento de microdilucion en placas de 96 pocillos, despues de 18 o 42 h de incubacion a 35 °C, para 30 capas que representan la diversidad genetica y geografica de cada especie bacteriana.

El control de calidad de las reservas de antibioticos se establecio usando Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Escherichia coli ATCC 25922.

# de Cepas Intervalo ug/ml MIC50 ug/ml MIC90 ug/ml

B. antracis

30 <0,008 - 0,015 <0,008 <0,008

Y. pestis

30 0,25 - 2 1 2

F. tularensis

30 <0,08 - 4 0,03 2

B. mallei

30 0,25 - 2 1 1

B. pseudomallei

30 16 16 16

Las pruebas de susceptibilidad a antibioticos indicaron que todas las especies bacterianas en este estudio con la excepcion de B. pseudomallei estan en intervalos que pueden conseguirse terapeuticamente para CEM-101. B. pseudomallei tienen un sistema de eflujo multi-farmaco demostrado que esta activo frente a macrolidos (2) y los datos que indican la resistencia a CEM-101 son consistentes. La distribucion de F. tularensis refleja el solapamiento de los biovares distintos "A" y "B" de esta especie. Las cepas B se distribuyen a las mayores MlC mientras que las cepas A se distribuyen al extremo inferior. Las cepas A son las mas virulentas y plantean la mayor amenaza de guerra biologica/bioterrorista constituyendo su mayor susceptibilidad fortuita.

Dado que muchos de estos agentes bacterianos son intracelulares durante la infeccion, la capacidad observada de muchos macrolidos para acumularse preferencialmente en las celulas puede mejorar la eficacia entre los individuos expuestos a agentes de guerra biologica/bioterroristas (BW/BT) en aerosol. La actividad de amplio espectro demostrada frente a una diversidad de agentes bacterianos BW/BT potenciales junto con la biodisponibilidad oral hace a CEM-101 un candidato atractivo para el tratamiento despues de las exposiciones y las infecciones. La eficacia de CEM-101 en los modelos de infeccion animal para estos agentes deberfa evaluarse.

EJEMPLO. Se usaron macrofagos THP-1 humanos. La acumulacion se midio mediante un ensayo microbiologico. La actividad intracelular se determino frente a S. aureus fagocitado (ATCC 25923; MIC: CEM-101, 0,125 mg/l; AZI, 0,5 mg/l) usando un procedimiento de dosis-respuesta (AAC 2006; 50: 841-51). Se usaron Verapamilo (100 pM) y gemfibrozilo (250 pM) como inhibidores de glicoprotefna P y MRP, respectivamente (AAC, 2007; 51: 2748-57).

Las acumulaciones y actividades despues de 24 h de incubacion, con y sin inhibidores de transportadores de eflujo, se muestran en la siguiente Tabla, donde Cc/Ce es la relacion de la concentracion celular-extracelular aparente, y Emax es el descenso maximo de las ufc intracelulares en comparacion con el inoculo post-fagocitosis (calculado a partir de la regresion no lineal [sigmoidea] de experimentos de respuesta dosis-efecto).

Condicion

AZI CEM-101

Cc/Ce1 (24 h)

Actividad intracelular (A log ufc en 24 h) Cc/Ce1 (24 h) Actividad intracelular (A log ufc en 24 h)

Dosis estatica (mg/l)

F ■ 2 Emax Dosis estatica (mg/l) F ■ 2 Emax

control

127,7 + 23,5 ~ 7,0 0,10 + 0,09 268,1 + 7,1 ~ 0,02 -0,85 + 0,23

Verapamilo

216,37 + 46,6 (a) ~ 0,2 - 0,37 + 0,15 290,2 + 12,9 ~ 0,03 - 0,59 + 0,22 (b)

Gemfibrozilo

129,12 + 2,69 ~ 3,8 -0,12 + 0,20 308,2 + 47,8 ~ 0,03 -0,73 + 0,20 ____(b)_____

(a)Estadfsticamente significativo a partir de caldo de cultivo de control y Gemfibrozilo; (b)no estadfsticamente significativo._________________________________________________________________________________

EJEMPLO. Actividad intracelular de los antibioticos. La determinacion de la actividad antibiotica frente a la cepa de S. aureus intrafagocftico ATCC 25923 se determino. Se realizaron estudios completos de dosis-respuestas para 5 evaluar el impacto del eflujo activo en la modulacion de la actividad intracelular de CEM-101 y AZI frente a S. aureus intrafagocftico (cepa ATcC 25923 [MIC: CEM-101, 0,125 mg/l; AZI, 0,5 mg/l]. Los antibioticos se compararon en 24 h para comprobar: (i) su concentracion estatica relativa (Cs), y (ii) su eficacia maxima relativa (E). Aunque verapamilo (pero no gemfibrozilo) aumenta la actividad intracelular de AZI, ningun inhibidor tiene un efecto significativo en la actividad de CEM- 101, lo que sugiere que el ultimo, a diferencia de AZI, no es un sustrato de los transportadores 10 eucariotas correspondientes.

EJEMPLO. Acumulacion celular de antibioticos. El contenido celular en los macrolidos se midio en macrofagos THP- 1 mediante ensayo microbiologico, usando S. aureus ATCC 25923 como organismo de ensayo. Se ensayaron protefnas celulares en paralelo usando el procedimiento de Folin-Ciocalteu/Biuret. El contenido asociado a la celula 15 en los macrolidos se expreso por referencia al contenido de protefna celular total, y se convirtio en concentraciones aparentes usando un factor de conversion de 5 pl por mg de protefna celular (como se usa comunmente para las celulas cultivadas).

La acumulacion celular de CEM-101 en comparacion con la de AZI en celulas THP-1 se midio en primer lugar en la 20 figura 7 (panel A). A las 24 h, ambos antibioticos se concentran en gran medida en las celulas, pero con un valor mayor (Cc/Ce) para CEM-101. En una segunda fase, se investiga si CEM-101 es un sustrato de los transportadores de eflujo de Pgp o MRP en la figura 7 (panel B). Usando un inhibidor de Pgp (verapamilo) o MRP (gemfibrozilo), no se observa ninguna variacion significativa de la acumulacion celular de CEM-101, aunque verapamilo aumenta significativamente la acumulacion celular de AZI.

25

La captacion de CEM-101 fue lineal con el tiempo, alcanzando niveles de acumulacion aproximadamente de 375 veces en 24 h (AZI, 160 x, CLR, 30 x, TEL, 21 x). La acumulacion se suprimio por pH acido o la adicion del ionoforo de protones monensina, pero no se modifico mediante verapamilo o gemfibrozilo (inhibidores preferentes de Pgp y MRP, respectivamente). El panel B muestra que la acumulacion tanto de CEM-101 como de AZI se redujo 30 cuando se realizaron los experimentos a pH acido, produciendose el cambio casi completamente cuando el pH se llevo de 7 a 6. El panel C muestra que la monensina, que se sabe que disminuye la acumulacion celular de muchas bases organicas debiles, tambien suprimio casi completamente la acumulacion tanto de CEM-101 como de AZI. Por el contrario, verapamilo, un inhibidor del transportador de eflujo de glicoprotefna P (Pgp, tambien conocido como MDR1), aumento la acumulacion de AZI sin afectar a la de CEM-101, mientras que gemfibrozilo, un inhibidor de 35 protefnas de resistencia a multiples farmacos (MRP) y otros transportadores anionicos organicos no afectaron al compuesto. Ni verapamilo ni gemfibrozilo afectaron a la acumulacion de TEL o CLR (datos no mostrados). Se examino el eflujo de CEM-101 de las celulas incubadas con 10 mg/l de CEM-101 durante 1 h y despues transferido en medio libre de farmaco. El eflujo avanzo de manera bimodal, liberandose la mitad del farmaco asociado a las celulas en aproximadamente 10 min, seguido de una fase de liberacion inferior de varias horas (datos no 40 mostrados).

EJEMPLO. Los macrolidos se acumulan en las celulas eucariotas y se consideran ventajosos para el tratamiento de infecciones intracelulares. Los cetolidos son activos frente a organismos resistentes a eritromicina. La acumulacion celular y la actividad intracelular de CEM-101 hacia las formas intracelulares de Staphylococcus aureus (S. a.), 45 Listeria monocytogenes (L. m.), y Legionella pneumophila (L. p.) en comparacion con AZI, CLR y TEL se muestra en la siguiente tabla.

MICa Csb F ' c Emax

CEM-101

S. a.

0,06 0,022 -0,86

L. m.

0,004 0,11 -0,66

L. p.

0,004 0,018 -1,03

AZI

S. a.

0,5 > 50 0,04

L. m.

1 11,6 -0,81

L. p.

0,016 2,90 -0,83

CLR

S. a.

0,5 0,84 -0,18

L. m.

L. p.

0,007 0,12 -0,71

TEL

S. a.

0,25 0,63 -0,29

L. m.

_L_pj____________________________________

0,007 0,06 -0,63

a mg/l; b concentracion estatica (mg/l) a las 24 h; c Una UFC logi0 a las 24 h en comparacion con el inoculo post- fagocitosis

EJEMPLO. Las MIC y las actividades extracelulares de los antibioticos se determinaron en MHB tanto a pH neutro como acido. La actividad intracelular se determino frente a S. aureus (ATCC 25923) fagocitado por macrofagos THP- 1 como se ha descrito previamente (AAC, 2006, 50: 841-851). Los resultados se expresaron como un cambio de 5 eficiencia en comparacion con el momento 0 h.

5

10

15

20

25

Condiciones

CEM-101 AZI CLR TEL

MIC (mg/l) (i) pH 7,4

0,125 0,5 0,5 0,5

(ii) pH 5,5

1-2 256 16 8

Actividad extracelular (24 h): A log ufc desde el momento 0 h (i) pH del caldo de cultivo 7,4 Emax1

-1,4 + 0,1 -1,2 + 0,6 -1,4 + 0,2 -1,0 + 0,4

Dosis

~ 0,06 ~ 3,63 ~ 1,41 ~ 0,28

estatica2 R2

0,964 0,860 0,965 0,868

(ii) pH del caldo de cultivo 5,5 Emax1

-1,6 + 0,4 + 2,1 + 0,1 -1,5 + 0,8 -1,4 + 0,9

Dosis

~ 1,48 / ~ 10,47 ~ 9,33

estatica2 R2

0,915 / 0,911 0,879

Actividad intracelular (24 h): A log ufc desde el momento 0 h Emax1

- 0,8 + 0,2 0,10 + 0,0 - 0,1 + 0,1 -0,4 + 0,2

Dosis

~ 0,02 ~ 7,8 ~ 0,98 ~ 0,23

estatica2 R2

0,906 0,980 0,974 0,935

THP-1 Emax1

-0,8 + 0,2 0,1 + 0,1 -0,1 + 0,1 -0,4 + 0,1

Dosis

~0,02 ~10 ~0,98 ~0,28

estatica2

1 - Descenso maximo de ufc intracelulares en comparacion con el inoculo post-fagocitosis inicial (calculado a partir de una regresion no lineal [sigmoidea] de respuesta dosis-efecto) realizado en caldo de cultivo (extracel.) o con macrofagos infectados (intracel.) 2 - Concentracion extracelular (Cs en mg/l) que produce un efecto estatico aparente. Descriptores farmacologicos comparativos (Emax y concentraciones estaticas [Cs]) obtenidos de los estudios de dosis-respuesta. Estudios de dosis-respuesta en caldo de cultivo Mueller-Hinton. Frente a S. aureus ATCC 25923 y en caldo de cultivo, a pH 7,4, CEM-101 es mas activa sistematicamente que AZI, CLR y TEL; a pH 5,5, AZI, CLR y TEL muestran un descenso significativo de sus potencias, aunque CEM-101 muestra menos cambio.

En comparacion con AZI, CLR y TEL, la actividad de CEM-101 se vio menos afectada por el pH acido del caldo de cultivo y mostro mayor potencia (dosis estatica inferior) y mayor eficacia maxima (Emax) frente a S. aureus intracelular.

EJEMPLO. Lfneas celulares. Los experimentos se realizaron con celulas THP-1 (ATCC TIB-202; American Tissue Culture Collection, Manassas, VA), una lfnea celular mielomonocftica humana que muestra actividad tipo macrofago (vease, por ejemplo, Barcia-Macay y col., Antimicrob. Agents Chemother. 50: 841-851 (2006)). Ensayo de los macrolidos asociados a las celulas y el calculo de las relaciones de concentracion celular-extracelular aparente. Los macrolidos se ensayaron mediante un procedimiento microbiologico, usando S. aureus ATCC 25923 como organismo de ensayo. Las protefnas celulares se midieron en paralelo usando el procedimiento de Folin- Ciocalteu/biuret. El contenido asociado a las celulas en los macrolidos se expreso por referencia al contenido de protefnas celulares total y se convirtio en concentraciones aparentes usando un factor de conversion de 5 pl por mg de protefna celular, un valor medio encontrado para muchas celulas de cultivo.

Cepas bacterianas, ensayos de susceptibilidad y estudios de la curva dosis-respuesta de 24 h con caldo de cultivo. En el presente estudio se usaron S. aureus ATCC 25923 (sensible a la meticilina [meticilina]), L. monocytogenes cepa EGD, y L. pneumophila cepa ATCC 33153. Las determinaciones de MIC se realizaron el caldo de cultivo Mueller-Hinton (para S. aureus) y caldo de cultivo de soja trfptico (para L. monocytogenes) despues de 24 h de incubacion, o en caldo de cultivo de extracto de levadura tamponado con a-cetoglutarato (para L. pneumophila) despues de 48 h de incubacion. Para los estudios de S. aureus, se realizaron experimentos de concentracion- respuesta de 24 h en medio acelular en caldo de cultivo Mueller-Hinton.

Infeccion celular y evaluacion de las actividades intracelulares de los antibioticos. La infeccion de celulas THP-1 y la

evaluacion de la actividad intracelular de los antibioticos se realizaron usando metodos convencionales para S. aureus y L. monocytogenes, o con adaptaciones menores para L. pneumophila usando (i) una multiplicidad de infeccion de 10 bacterias por macrofago y (ii) gentamicina (50 mg/litro) durante 30 a 45 min para la eliminacion de las bacterias no fagocitadas.

5

Analisis estadfsticos. Los analisis estadfsticos de ajuste de curva se realizaron con GraphPad Prism version 4.03 y GraphPad Instat version 3.06 (GraphPad Software, San Diego, CA).

EJEMPLO. Susceptibilidad hacia S. aureus ATCC 25923, Listeria monocytogenes EGD, y Legionella pneumophila 10 ATCC 33153. CEM-101 mostro MIC inferiores que AZI frente a los tres organismos seleccionados (S. aureus, 0,06 y 0,5 mg/litro; L. monocytogenes, 0,004 y 1 mg/litro; y L. pneumophila, 0,004 y 0,016 mg/litro) en ensayos de susceptibilidad convencionales. Las MIC de CEM-101, TEL, AZI y CLR frente a S. aureus y L. monocytogenes se midieron en caldo de cultivos ajustados a valores de pH que variaban de 5,5 a 7,4. El intervalo se selecciono para incluir los valores a los que los antibioticos podrfan exponerse en el medio extracelular o intracelularmente para los 15 dos organismos considerados. Como se ilustra en la figura 3, los cuatro farmacos mostraron un descenso marcado de la potencia frente a ambos organismos cuando el pH se disminuyo de 7,4 a 5,5, demostrando AZI la perdida mas significativa de actividad. CEM-101 conservo la mayor actividad, mostrando uniformemente las menores MIC a lo largo de todo el intervalo de pH investigado, con valores (mg/litro) que variaban de 0,06 (pH 7,4) a 0,5 (pH 5,5) para S. aureus (ATCC 25923) y de 0,0039 (pH 7,4) a 0,25 (pH 5,5) para L. monocytogenes (EdG). Para L. pneumophila 20 (datos no mostrados), la MIC de CeM-101 aumento de 0,005 a 0,01 y la de AZI de aproximadamente 0,01 a 0,25 mg/litro cuando el pH del caldo de cultivo se redujo de 7,4 a 6,5 (no pudo hacerse ninguna determinacion a valores de pH inferiores debido a la ausencia de crecimiento).

EJEMPLO. Efectos temporales y de concentracion frente a S. aureus extracelular e intrafagocftico. Se obtuvieron las 25 curvas del tiempo hasta la muerte a corto plazo (6 h) para CEM-101 en comparacion con las de AZI frente a S. aureus (ATCC 25923) en caldo de cultivo y despues de la fagocitosis por macrofagos THP-1 usando dos concentraciones fijas individuales de 0,7 y 4 mg/litro. La concentracion inferior se escogio para ser relevante a la concentracion serica de AZI y CEM-101, y la mayor concentracion se selecciono para estar por encima de la MIC de AZI para los organismos de interes. Los resultados presentados en la figura 5 muestran que en estas condiciones, 30 unicamente CEM-101 fue capaz de disminuir significativamente las UFC en caldo de cultivo, asf como en los macrofagos THP-1 a la concentracion de 0,7 mg/litro. A la concentracion de 4 mg/litro en caldo de cultivo, AZI consiguio eventualmente el mismo efecto antibacteriano que CEM-101, pero a una menor velocidad (5 h en comparacion con 1 h). En los macrofagos THP-1, no se detecto ninguna actividad consecuente para AZI, ni siquiera a la concentracion de 4 mg/litro, mientras que CEM-101 consiguio de nuevo una reduccion de aproximadamente 1,5 35 UFC log 10, similar a la magnitud observada a la concentracion de 0,7 mg/litro. En todas las situaciones con CEM- 101, el descenso maximo de UFC se obtuvo en 1 h y se mantuvo posteriormente.

Despues, se realizaron experimentos de concentracion-respuesta en un punto temporal fijo (24 h) para obtener los descriptores farmacologicos pertinentes de la actividad de CEM-101 (potencia relativa [concentracion efectiva al 40 50 % {EC50}], concentracion estatica aparente [Cs], y eficacia maxima relativa [Emax] en comparacion con la actividad de CLR, AZI y TEL (se describen detalles adicionales en Barcia-Macay y col., Pharmacodynamic evaluation of the intracellular activities of antibiotics against Staphylococcus aureus in a model of THP-1 macrophages Antimicrob. Agents Chemother. 50: 841-851 (2006)). Los datos se presentan en la figura 4 en funcion de (i) las concentraciones en peso (mg/litro) y (ii) multiplos de las MIC (como se determina en caldo de cultivo a pH 7,4). Los valores numericos 45 de los descriptores farmacologicos correspondientes se muestran en la Tabla. Parametros de regresion pertinentes3 (con intervalos de confianza [Cl]), y analisis estadfstico de las curvas dosis-respuesta ilustradas en la figura 4.

caldo de cultivo +

antibiotico

Emax* (CI) EC50° (Cl) Cs°° R2

CEM-101

-1,37 mg/l 0,03 0,06 0,973

(-1,67 a -1,08) (0,02 a 0,06)

a; A a; A

x MIC 0,48 0,88

(0,26 a 0,91)

a; A

TEL

-1,00 mg/l 0,12 0,29 0,892

(-1,78 a -0,22) (0,03 a 0,52)

a; A b; A

x MIC 0,46 0,96

(0,11 a 2,06)

a; A

AZI

-1,23 mg/l 1,78 3,4 0,872

(-2,55 a 0,083) (0,45 a 7,02)

a; A c; A

x MIC 3,55 6,87

(0,90 a 14,0)

b; A

CLR

-1,41 mg/l 0,80 1,32 0,956

(-1,95 a -0,87) (0,41 a 1,56)

a; A c; A

x MIC 1,59 2,65

(0,81 a 3,1)

a, b; A

macrofagos THP-1 ++

antibiotico

Emax* (CI) EC50° (Cl) C5°° R2 (CI)

CEM-101

-0,86 mg/l 0,0068 0,022 0,927

(-1,36 a -0,37) (0,0023 a 0,020)

a; B a; B

x MIC 0,11 0,35

(0,037 a 0,32)

a; B

TEL

-0,29 mg/l 0,024 0,63 0,954

(-0,70 a 0,12) (0,007 a 0,088)

b; B b; B

x MIC 0,097 1,04

0,027 a 0,35

a; B

AZI

0,04 mg/l 0,11 > 50 0,983

(-0,23 a 0,32) (0,05 a 0,22)

b; B c; B

x MIC 0,22 > 100

0,11 a 0,45

a; B

CLR

-0,18 mg/l 0,046 0,84 0,974

(-0,52 a 0,16) (0,018 a 0,12)

b; B b, c; B

x MIC 0,093 1,68

0,035 a 0,25

a; B

a usando todos los puntos de datos mostrados en la figura 6 (datos de muestras sin antibiotico cuando la

concentracion extracelular de un antibiotico es inferior a 0,01 x MIC (5)

+ inoculo original [tiempo

= 0 h]: 0,97 + 0,24 x 106 UFC/ml (n = 3)

++ inoculo original (post-fagocitosis) [tiempo = 0 h]: 2,74 + 0,55 x 106 UFC/mg de protefna (n = 3)

* Descenso de UFC (en

unidades log10) en tiempo = 24 h del inoculo original correspondiente, como se extrapola

para la concentracion de antibiotico = <»; las muestras que produjeron menos de 5 recuentos se consideraron por debajo del nivel de deteccion.

◊concentracion (en mg/l o en x MIC) que causa una reduccion del inoculo a medio camino entre los valores iniciales (Eo) y maximos (Emax), como se obtiene a partir de la ecuacion de Hill (usando un factor de pendiente de 1);

◊◊concentracion (en mg/l o en x MIC) que da como resultado un crecimiento bacteriano nulo aparente (numero de UFC identicas al inoculo original), como se determina por intrapolacion grafica; Analisis Estadfsticos. Analisis de las diferencias entre antibioticos (por columna para las filas correspondientes; ANOVA unidireccional con prueba de Tuckey para multiples comparaciones entre cada parametro para todos los farmacos): Las figuras con letras minusculas diferentes son diferentes significativamente entre si (p < 0,05). Analisis de las diferencias entre el caldo de cultivo y los macrofagos THP-1 (por fila para las columnas correspondientes; prueba t bilateral independiente): Las figuras con diferentes letras en mayusculas son significativamente diferentes entre si (p < 0,05)._______________________________________________________________________________________

Las actividades tanto en caldo de cultivo como en los macrofagos THP-1 se desarrollaron de manera dependiente de la concentracion, como se representa por la forma sigmoidea de cada funcion de mejor ajuste (ecuacion de Hill). En el caldo de cultivo, la eficacia relativa de CEM-101 (Emax de -1,37 logi0) fue similar a la de los demas farmacos 5 (valores de Emax de -1,00 a -1,41 logi0). En los macrofagos THP-1, la eficacia relativa de CEM-101 se disminuyo significativamente en comparacion con la del caldo de cultivo (Emax de -0,86 log10), pero no en la misma medida que la de los demas farmacos, que se volvieron basicamente bacteriostaticos unicamente (valores de Emax de 0,04 a - 0,29 log10). En una base en peso, CEM-101 tenfan mayores potencias relativas (valores E50 inferiores) y menores concentraciones estaticas (valores Cs inferiores) que los tres farmacos comparadores tanto en caldo de cultivo como 10 en macrofagos THP-1. Cuando los datos se analizaron en funcion de la concentracion equipotente (multiplos de la MIC), estas diferencias en los valores de EC50 se redujeron, indicando que la MIC era el parametro impulsor principal en este contexto. En el caldo de cultivo, incluso al analizarse como multiplos de la MIC, CEM-101 y CLR aun mostraron significativamente EC50 inferiores que TEL y AZI.

15 Ejemplo. Actividad frente a L. monocytogenes y L. pneumophila intrafagocfticos. Se uso el mismo procedimiento que para S. aureus para evaluar las actividades de CEM-101 y AZI frente a L. monocytogenes y L. pneumophila fagocitados para obtener informacion sobre las relaciones de concentracion-efecto y sobre los descriptores farmacologicos pertinentes correspondientes. Como se muestra en la figura 6, se observo una relacion compatible con la ecuacion de Hill en todos los casos, aunque el crecimiento limitado de L. pneumophila hizo el ajuste de las 20 funciones algo mas incierto. Cuando los datos se trazaron frente a la concentracion en peso, parecfa que CEM-101 tenia una potencia relativa mayor (EC50 inferior) que AZI tanto para L. monocytogenes como para L. pneumophila. Esta diferencia se redujo pero, sin embargo, siguio siendo significativa cuando se trazaron los datos para L. pneumophila frente a multiplos de la MIC, indicando que la MIC era un impulsor importante pero no el impulsor exclusivo de la actividad intracelular contra este organismo. Por el contrario, no se observo ninguna diferencia en las 25 respuestas para L. monocytogenes cuando se expresaron los datos como multiplos de la MIC. Los valores numericos de los descriptores farmacologicos pertinentes y el analisis estadistico de sus diferencias se muestran en la Tabla.

Parametros de regresion pertinentes3 (con intervalos de confianza [Cl]), y analisis estadistico de las curvas dosis- 30 respuesta ilustradas en la figura 6.

L. monocytogenes EGD +

antibiotico

Emax* (CI) EC50 ◊(Cl) Cs^ R2

-0,66 mg/l 0,020 0,11 0,934

CEM-101

(-1,28 a -0,037) (0,005 a 0,073)

a A

X MIC 5,00 0,88

(1,36 a 18,5)

A

AZI

-0,81 mg/l 2,66 11,6 0,953

(-2,11 a 0,48) (0,91 a 7,73)

a B

X MIC 2,66 11,6

(0,81 a 3,1)

A

L. pneumophila ATCC 33153 ++

antibiotico

Emax* (CI) EC50° (CI) Cs°° R2

-1,03 mg/l 0,052 0,018 0,920

CEM-101

(-1,34 a -0,72) (0,012 a 0,23)

a A

x MIC 13,1 4,56

(3,02 a 57,0)

A

AZI

-0,83 mg/l 2,86 2,90 0,903

(-2,00 a 0,34) (0,17 a 48,6)

a B

x MIC 179,0 181

(10,5 a 3038)

B

a usando todos los puntos de datos mostrados en la figura 6 (no se usaron datos de muestras sin antibiotico debido a la evidencia de crecimiento extracelular cuando la concentracion extracelular de un antibiotico es inferior a 0,01 x MIC (5) + inoculo original (post-fagocitosis) [tiempo = Oh; UFC/mg de protefnaj): L. monocytogenes, 1,67 + 0,22 x 106 (n = 3); L. pneumophila, 0,94 + 0,60 x 106. ♦ Descenso de UFC (en unidades logarftmicas) en tiempo = 24 h (L. monocytogenes) o 48 h (L. pneumophila) del inoculo original correspondiente, como se extrapola para la concentracion de antibiotico = <»; las muestras que produjeron menos de 5 recuentos se consideraron por debajo del nivel de deteccion; ^concentracion (en mg/l o en x MIC) que causa una reduccion del inoculo a medio camino entre los valores iniciales (E0) y maximos (Emax), como se obtiene a partir de la ecuacion de Hill (usando un factor de pendiente de 1); 00concentracion (en mg/l o en x MIC) que da como resultado un crecimiento bacteriano nulo aparente (numero de UFC identicas al inoculo original), como se determina por intrapolacion grafica; Analisis Estadfsticos. Analisis de las diferencias entre los dos antibioticos (por columna para las filas correspondientes; prueba t bilateral independiente): Las figuras con letras minusculas diferentes son significativamente diferentes entre sf (p < 0,05).

5

EJEMPLO. Estudios de dosis-respuesta en macrofagos THP-1 infectados frente a S. aureus intrafagocftico ATCC 25923. CEM-101 es mas potente que AZI, CLR y TEL (Cs inferior). Ademas, CEM-101 es capaz de reducir el inoculo intracelular (Emax ~1 log), que no se observa con ninguno de AZI, CLR y TEL.

Captacion de CEM-101 en las celulas (ii): funcion del tipo celular

Celulas

THP-1 (macrofagos humanos) J774 (macrofagos murinos) MDCK (celulas epit. caninas) MDCK que sobreexpresa los transportadores de eflujo de MDR1

Cc/Ce en 5 h

~50 - 150 ~ 60 ~45 ~ 30

EJEMPLO. Estudios de dosis respuesta ejemplares de CEM-101 frente a los comparadores (AZI, CLR y TEL) contra 10 S. aureus intracelular ATCC 25923 (macrofagos THP-1). Veanse la figura 9 y la Tabla.

CEM-101 AZI CLR TEL

Emax

-0,80 + 0,11 0,04 + 0,11 -0,18 + 0,13 -0,29 + 0,16

Cs (mg/l)

~0,01 >50 ~ 0,86 ~ 0,27

EJEMPLO. Actividad intracelular: Estudios comparativos con otros agentes anti-estafilococicos. Se midio la respuesta estatica a la dosis comparativa de los antibioticos frente a Staphylococcus aureus intracelular (cepa ATCC 15 25923) en macrofagos THP-1. Vease la figura 8, las barras representan las MIC (en mg/l) o la dosis estatica extracelular.

PROCEDIMIENTO. Macrofagos peritoneales de raton se infectaron con M. leprae viable, los farmacos se anadieron y se incubaron a 33 °C durante 3 dfas. Despues de 3 dfas, los macrofagos se lisaron para liberar el M. leprae 20 intracelular, y despues se ensayaron para comprobar la viabilidad por radiorespirometrfa y tincion de viabilidad. CEM-101 muestra eficacia frente a la viabilidad de M. leprae intracelular.

El aislado Thai-53 de M. leprae, mantenido por pases seriados en almohadillas de ratones nu/nu atfmicos, se uso para todos los experimentos. Para ensayos axenicos, se incubaron M. leprae viables recien cosechados en medio 25 junto con diferentes concentraciones de los farmacos (CEM-101, CLR y rifampicina) durante 7 dfas a 33 °C. Al final de esta incubacion, M. leprae tratados con farmaco se sometieron a radiorespirometrfa para evaluar la viabilidad basada en la oxidacion de palmitato y tincion con colorantes de viabilidad para evaluar la extension del dano de la

membrana. Para los ensayos intracelulares, se infectaron macrofagos peritoneales de ratones suizos con M. leprae viable recien cosechados a una MOI de 20:1 durante 12 horas. Al final de la infeccion, las bacterias extracelulares se lavaron y los farmacos se anadieron a diferentes concentraciones y se incubaron durante 3 dfas a 33 °C. Al final de los 3 dfas, las celulas se lisaron para obtener M. leprae intracelular para radiorespirometrfa y tincion de viabilidad.

5

CEM-101 a 0,15 pg/ml fue capaz de reducir significativamente (P<0,001) la viabilidad de M. leprae tanto en cultivos axenicos como intracelulares en comparacion con los controles. La inhibicion por CEM-101 no fue estadfsticamente diferente de la inhibicion obtenida con CLR en condiciones identicas y a la misma concentracion.

10 EJEMPLO. La alta potencia de CEM-101 frente a Streptococcus pneumoniae, estreptococos del grupo p-hemolftico y viridans, Staphylococcus spp. y enterococos se ha documentado en estudios de cribado anteriores realizados usando los metodos de referencia del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Dado que los mecanismos y casos de resistencia estan aumentando rapidamente, lo que puede comprometer la clase de MLSB-cetolidos, se evaluo la actividad bactericida (MBC y curvas de eliminacion) de CEM-101 con cinco clases seleccionadas de 15 agentes antimicrobianos al ensayar subconjuntos de organismos resistentes de tipo salvaje (WT) y definidos fenotfpica/genotfpicamente. Las determinaciones de MBC para CEM-101, TEL y CLR usaron los metodos de CLSI para 40 cepas (6 grupos de especies). KC usaron 8 cepas (6 grupos de especies). PAE se ensayo (5 cepas) a una concentracion 4 x durante 1 o 2 horas de exposicion; control de tEl.

20 Estudios de MBC y curvas de eliminacion: Un total de 40 cepas (10 S. pneumoniae, 10 S. aureus, y 5 cada una de estreptococos p-hemolfticos, estreptococos del grupo viridans, estafilococos negativos a coagulasa [CoNS] y enterococos) se ensayaron por MIC seguidos de determinaciones de MBC usando procedimientos del CLSI (MIC e intervalo de MBC, 0,008-16 pg/ml). La concentracion inferior de un agente ensayado que elimino >99,9 % del inoculo inicial se definio como el criterio de valoracion de MBC (Tablas 2 y 3). La actividad bactericida del tiempo hasta la 25 muerte se realizo para CEM-101, TEL, CLR y AZI en ocho cepas seleccionadas de acuerdo con los metodos descritos por Moody & Knapp, NCCLS M21-A3 y M26-A. Los compuestos se ensayaron a una MIC 2 x, 4 x, 8 x; y se realizaron recuentos de colonias en T0, T2, T4, T8 y T24.

CEM-101 mostro bajas proporciones de MBC/MIC (<4) para BSA, SA y estafilococos negativos a coagulasa; y una 30 potencia 2 veces mayor que TEL. SA, los enterococos y algunas cepas resistentes a macrolidos/CLN (R) tuvieron proporciones mayores. Los resultados de KC mostraron una actividad cidal mas rapida y mayor (dependiente de la concentracion) para CEM-101 en comparacion con TEL. CEM-101 mostro actividad cidal frente a varias especies Gram-positivas a velocidades y una extension mayores que TEL.

35 Distribucion de aislados de acuerdo con la proporcion MBC/MIC para CEM-101, TEL, CLR y AZI

Organismo/Agente antimicrobiano (N° ensayado)

N° de cepas con valor MBC/MIC de:

1

2 4 8 16 >32

S. pneumoniae (10)

CEM-101

3 5 0 0 0 2

Telitromicina

2 6a 0 0 0 2

Claritromicina

2 3 1 0 0 -b

Azitromicina

2 4 0 0 0 -b

Estreptococos P-hemolfticos (5)

CEM-101

0 1 2 0 0 2

Telitromicina

0 1 1 1 0 2

Claritromicina

0 0 1 1 0 2b

Azitromicina

0 0 0 0 2 2b

Estreptococos del grupo viridans (5)

CEM-101

3 0 1 0 0 1

Telitromicina

2 1 0 0 1

Claritromicina

0 0 1 0 0 3b

Azitromicina

0 0 0 0 1 3b

S. aureus (10)

CEM-101

1 0 0 0 1 8

Telitromicina

0 0 0 0 0 10

Claritromicina

0 0 0 0 0 6b

Azitromicina

0 0 0 0 0 6b

Estafilococos neg. a coagulasa (5)

CEM-101

1 1 0 3 0 0

Telitromicina

0 0 0 0 2 3

Claritromicina

0 0 0 0 0 4b

Azitromicina

0 0 0 0 0 4b

Enterococcus spp. (5)

CEM-101

0 0 0 0 0 5

Telitromicina

0 0 0 0 0 5

Claritromicina

0 0 0 0 0 2b

Azitromicina

0 0 0 0 0 2b

a. Incluye seis aislados con una MIC de <0,008 |ig/ml y una MBC de 0,015 |ig/ml (comparaciones fuera de escala).

b. MBC no se evaluo en aislados con resultados de MIC de nivel resistente.

CEM-101 mostro una rapida actividad bactericida (reduccion de >3 log 10 UFC/ml) frente a cepas susceptibles a macrolidos de S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae, S. pyogenes (unicamente a MIC 8 x) y estreptococos del grupo viridans, asf como S. pyogenes resistentes a macrolidos. CEM-101 produjo una mayor reduccion de UFC/ml y 5 una eliminacion mas rapida en comparacion con TEL o los macrolidos CLR y AZI.

Resumen de resultados de la curva de tiempo hasta la muerte.

Organismo

Agente antimicrobiano Actividad antimicrobiana

S. aureus

CEM-101 Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

(ATCC 29213)

Telitromicina Cidal a 8 x unicamente

Claritromicina Cidal a 8 x unicamente

Azitromicina Cidal a 8 x unicamente

S. epidermidis

CEM-101 Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

(095-2777A)

Telitromicina Estatica

Claritromicina Estatica

Azitromicina Estatica

E. faecalis

CEM-101 Estatica

(ATCC 29212)

Telitromicina Estatica

Claritromicina Estatica

Azitromicina Estatica

S. pneumoniae

CEM-101 Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

(ATCC 49619)

Telitromicina Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

Claritromicina Cidal a 2 x, 4 x, 8 x (muerte lenta)

Azitromicina Cidal a 2 x, 4 x, 8 x (muerte lenta)

S. pneumoniae

CEM-101 Estatica

(075-241B)

Telitromicina Estatica

S. pyogenes

CEM-101 Cidal a 8 x unicamente

(117-1612A)

Telitromicina Cidal a 8 x unicamente (muerte lenta)

Claritromicina Cidal a 8 x unicamente (muerte lenta)

Azitromicina Cidal a 8 x unicamente (muerte lenta)

S. pyogenes

CEM-101 Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

(088-11708A)

Telitromicina Cidal a 2 x, 4 x, 8 x (muerte lenta)

S. mitis

CEM-101 Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

(112-1885A)

Telitromicina Cidal a 2 x, 4 x, 8 x

Claritromicina Cidal a 8 x unicamente (muerte lenta)

Azitromicina Cidal a 4 x y 8 x (muerte lenta)

10 CEM-101 mostro actividad bactericida al ensayarse frente a estreptococos susceptibles a macrolidos, CoNS y S. pneumoniae susceptibles a CLN y resistentes a macrolidos. Las proporciones de MBC/MIC para CEM-101 pueden ser altas para S. aureus, pero algunas cepas mostraron resultados de MBC que permanecieron dentro del intervalo susceptible de las concentraciones.

15 EJEMPLO. Actividad sobre Chlamydia. Se proporcionaron CEM-101, TEL, AZI, CLR y doxiciclina en forma de polvos y solubilizadas de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las suspensiones de farmacos se fabricaron frescas cada vez que se realizo el ensayo.

C. pneumoniae: Los aislados de C. pneumoniae ensayados inclufan una cepa de referencia (TW 183), 9 aislados de 20 ninos y adultos con neumonfa de Estados Unidos (AR39, T2023, T2043, W6805, CWL 029, Cm-1), un aislado de un nino con neumonfa de Japon (J-21), y 2 cepas de especimenes de lavado broncoalveolar de pacientes con infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana y neumonfa de Estados Unidos (BAL15 y BAL16).

C. trachomatis: 10 aislados de C. trachomatis, incluyendo aislados estandares de la ATCC (E-BOUR, F-IC-CAL3, C- HAR32, J-UW-36, L2434, D-UW-57kx, B- HAR-36) y aislados clmicos recientes (N18 (cervical), N19 (cervical), 7015 (ojo de infantil))

Ensayos de susceptibilidad in vitro: El ensayo de susceptibilidad de C. pneumoniae y C. trachomatis se realizo en cultivo celular usando celulas HEp-2 cultivadas en placas de microtitulacion de 96 pocillos. Cada pocillos se inoculo con 0,1 ml de la cepa de ensayo diluida para producir de 103 a 104 IFU/por ml, se centrifugo a 1.700 x g durante 1 h y se incubo a 35 °C durante 1 h. Los pocillos se aspiraron y se revistieron con 0,2 ml de medio que contema 1 pg de 10 cicloheximida por ml y diluciones seriadas dos veces del farmaco de ensayo.

Se inocularon placas duplicadas. Despues de la incubacion a 35 °C durante 48-72 h, los cultivos se fijaron y se tineron para inclusiones con anticuerpo conjugado con fluorescema para el antfgeno del genero lipopolisacarido (Pathfinder, Kallestad Diagnostics, Chaska, Minn). La concentracion inhibitoria minima (MIC) es la concentracion de 15 antibioticos inferior a la que no se observo ninguna inclusion. La concentracion bactericida minima (MBC) se determino aspirando el medio que contema el antibiotico, lavando los pocillos dos veces con solucion salina tamponada con fosfato y anadiendo medio sin antibiotico. Los cultivos se congelaron a -70 °C, se descongelaron, se pasaron sobre nuevas celulas, se incubaron durante 72 h, despues se fijaron y se tineron como anteriormente. La MBC es la concentracion de antibioticos inferior que no da como resultado ninguna inclusion despues del pase. 20 Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Actividades de CEM-101 y otros antibioticos frente a 10 aislados de C. pneumoniae

Farmaco

MIC (pg/ml) MBC (pg/ml)

Intervalo

50 % 90 % Intervalo 90 %

CEM 101

0,25-1,0 0,25 0,25 0,25-1,0 0,25

Telitromicina

0,015-0,25 0,06 0,06 0,015-0,25 0,06

Azitromicina

0,015-0,125 0,125 0,125 0,015-0,125 0,125

Claritromicina

0,015-0,125 0,06 0,06 0,015-0,125 0,06

Doxiciclina

0,015-0,06 0,06 0,06 0,015-0,06 0,06

25 Actividades de CEM-101 y otros antibioticos frente a 10 aislados de C. trachomatis

Farmaco

MIC (pg/ml) MBC (pg/ml)

Intervalo

50 % 90 % Intervalo 90 %

CEM 101

0,125-0,5 0,25 0,25 0,125-0,5 0,25

Telitromicina

0,015-0,25 0,06 0,06 0,015-0,25 0,06

Azitromicina

0,015-0,125 0,125 0,125 0,015-0,125 0,125

Claritromicina

0,015-0,125 0,06 0,06 0,015-0,125 0,06

Doxiciclina

0,015-0,06 0,06 0,06 0,015-0,06 0,06

Los resultados de este estudio demostraron que CEM-101 tiene una actividad in vitro frente a C. trachomatis y C. pneumoniae comparable a otros macrolidos y cetolidos.

30

EJEMPLO. Distribucion tisular. CEM-101 se absorbio bien y se distribuyo al tejido. En la rata a 250 mg/kg/d, las concentraciones medias en pulmon e hngado de CEM-101 fueron 17 y 15 veces mayores que en plasma. Las concentraciones en pulmon e hngado fueron 503 y 711 veces mayores que las concentraciones en plasma a la dosis de 200 mg/kg/d en monos. Las concentraciones de CEM-101 en el corazon fueron significativamente inferiores que 35 los niveles encontrados en el pulmon o el tngado con niveles 5 y 54 veces mayores que las concentraciones en plasma en rata y mono, respectivamente.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto para uso en el tratamiento de una enfermedad causada, al menos en parte, por un

   organismo seleccionado de entre el grupo que consiste en Bacillus antracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis y 5 Burkholderia mallei, y combinaciones de los mismos; donde el compuesto es de la formula

   imagen1

   o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, donde:

   10

   R10 es hidrogeno o acilo;

   X es H; e Y es OR7; donde R7 es un monosacarido o disacarido, alquilo, arilo, heteroarilo, acilo o C(O)NR8R9, donde cada uno de R8 y R9 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en hidrogeno, hidroxi, alquilo, 15 aralquilo, alquilarilo, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido y carbamoflo; o X e Y se toman junto con el carbono al que estan unidos para formar carbonilo;

   V es C(O), C(=NR11), CH(NR12, R13), o N(R14)CH2, donde N(R14) esta unido al carbono C-10; donde R11 es hidroxi o alcoxi, cada uno de R12 y R13 se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en hidrogeno, 20 hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido y carbamoflo; R14 es hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo, heteroarilo, dimetilaminoalquilo, acilo, sulfonilo, ureido o carbamoflo;

   W es H, F, Cl, Br, I u OH;

   25

   A es CH2, C(O), C(O)O, C(O)NH, S(O)2, S(O)2NH, C(O)NHS(O)2;

   B es (CH2)n donde n es un numero entero que varfa en un rango de entre 0 y10, o B es una cadena de carbono insaturada de 2-10 carbonos; y 30

   C es hidrogeno, hidroxi, alquilo, aralquilo, alquilarilo, alcoxi, heteroalquilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aminoarilo, alquilaminoarilo, acilo, aciloxi, sulfonilo, ureido o carbamoflo.
2. 2. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, donde X e Y se toman junto con el carbono al que 35 estan unidos para formar carbonilo.
3. 3. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, donde X es H e Y es OR7, donde R7 es cladinosilo.
4. 4. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, donde A y B se toman juntos para formar propileno,

   40 butileno o pentileno.
5. 5. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, donde A y B se toman juntos para formar butileno.
6. 6. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, donde C es arilo opcionalmente sustituido o

   45 heteroarilo opcionalmente sustituido.

   10

   15

   20
7. 
   7. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
8. 
   8. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
9. 
   9. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1

   (CH2)n, y n es un numero entero de 2-4.
10. 10. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde C es 3-aminofenilo o

    donde V es -C(O)-. donde W es H o F. a 8, donde A es CH2, B es

    3-piridinilo.
11. 11. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R10 es hidrogeno.
12. 12. El compuesto para el uso de la reivindicacion 8, donde W es F.
13. 13. El compuesto para el uso de la reivindicacion 10, donde C es 3-aminofenilo.
14. 14. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, donde R10 es hidrogeno, X e Y se toman junto con el

    carbono al que estan unidos para formar C(O), V es C(O), W es F, A es CH2, B es (CH2)n, n es 3, y C es 3- aminofenilo.
15. 15. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en el tratamiento de la

    exposicion aguda de un paciente expuesto a uno o mas organismos seleccionados de entre el grupo que consiste en Bacillus antracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis y Burkholderia mallei, y combinaciones de los mismos.