ES2556270T3 - Anticuerpos que se fijan a los receptores de la adrenomedulina y sus usos como medicamento - Google Patents

Abstract

Mezcla de al menos tres anticuerpos y/o fragmentos de dichos anticuerpos que se fijan a las proteínas CRLR, RAMP2 y RAMP3 que forman los receptores de la adrenomedulina, en donde cada anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo se fija a una proteína diferente, y en donde cada anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo es un antagonista de uno de dichos receptores de la adrenomedulina, para ser utilizado como medicamento.

Description

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Las demás estirpes celulares proceden de la American Type Culture Collection (Rockville MD, EE. UU.). Las células que proceden de los tumores o biopsias se mantienen en un medio adecuado según el tipo celular (consulte la tabla 1 que viene a continuación) en atmósfera húmeda que contiene CO2 al 5% y aire al 95% a 37 ºC.

Tabla 1: Células utilizadas que proceden de tumores o biopsias

Nombre

Procedencia Localización Ensayo en ratones Medio de cultivo

A498 (tumor)

N.º ATCC: HTB 44 DSMZ (Alemania) Hombre (52 años) Riñón + MEM Glutamina a 2 mM Bicarbonato de sodio a 1,5 g/l Piruvato de sodio a 1 mM SBF al 10%

A549 (tumor)

N.º ATCC: CCL-185 Hombre (58 años) Pulmón + DMEM Glutamina a 2 mM SBF al 10%

BIZ (metástasis)

Dr. Gogusev INSERM U507-Hospital Necker, París Riñón Sin comprobar RPMI Glutamina a 2 mM Bicarbonato de sodio a 2,2 g/l SBF al 10%

Caki1 (metástasis)

N.º ATCC: HTB-46 Hombre (49 años) Riñón + 5a de McCoy's Glutamina a 2 mM Bicarbonato de sodio a 2,2 g/l SBF al 10%

Caki2 (tumor)

N.º ATCC: HTB-47 Hombre (69 años) Riñón + 5a de McCoy Glutamina a 2 mM Bicarbonato de sodio a 2,2 g/l SBF al 10%

IGR-37 (tumor)

N.º DSMZ: ACC 237 Hombre (59 años) Piel + MEM Glutamina a 2 mM SBF al 10%

HT29 (tumor)

N.º ATCC: HTB-38 Mujer (44 años) Colon + DMEM Glutamina a 2 mM SBF al 10%

MCF-7 (metástasis) Hormonosensible

N.º ATCC: HTB-22 Mujer (69 años) Mama + DMEM/F-12 Glutamina a 2 mM

10

16 ng/ml de insulina SBF al 10%

MDA-MB231 (metástasis) Hormonoindependiente

N.º ATCC: HTB-26 Mujer (51 años) Mama + L-15 5 μg/ml de insulina Glutamina a 2 mM SBF al 10%

U87 (tumor)

N.º ATCC: HTB-14 Hombre (68 años) Glioblastoma + MEM Glutamina a 2 mM Piruvato de sodio a 1 mM SBF al 10%

Los medios se renuevan cada dos días; cuando las células alcanzan el 90% de confluencia, se desprenden con una solución de tripsina (0,25%) en un tampón de Tris (Gibco) durante algunos minutos a 37 ºC. La acción de la enzima se detiene al añadirle medio que contiene suero. Las células se siembran en tubos de 75 cm2, o bien en placas

5 multipocillo en sus medios adecuados.

I.3. Especificidad de la fijación de la adrenomedulina a sus propios receptores mediante experimentos de fijación

Los neurogliocitos tumorales U87 se siembran en placas de 24 pocillos (40.000 células/pocillo) y se mantienen en MEM en presencia del 10% de suero bovino fetal (SBF) durante 48 horas. Se lavan en PBS a 1× y se incuban previamente 30 min con MEM con SAB (seroalbúmina bovina) al 0,1% que contiene adrenomedulina radioyodada 10 (Amersham, Biosciences GE) a razón de 100.000 cpm en presencia de una mezcla de anticuerpos compuesta por anticuerpos anti-CRLR, anti-RAMP2 y anti-RAMP3. Los anticuerpos anti-CRLR, anti-RAMP2 y anti-RAMP3 se han desarrollado en el conejo por inyección, respectivamente, de las secuencias peptídicas de SEQ ID n.º 2, 3 y 5. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las células se colocan sobre hielo y se enjuagan dos veces con una solución de PBS a 1×-SAB al 0,1% mantenida a 4 ºC. Las células se solubilizan con sosa a 0,2 N. La

15 125I-AM fijada se cuenta en un contador γ Riastar (Packard Instrument Company).

I.4. Estudios in vivo

Modelos animales

Se han utilizado ratonas hembra Balb/C atímicas (nu/nu) y ratonas C57BL/6 (Harlan, Francia) de 4-5 semanas de edad. Se han mantenido en condiciones estériles, temperatura estable y alimentación adaptada. Los experimentos in

20 vivo comenzaron una vez acabado el periodo de adaptación de los animales a su nuevo ambiente (10-15 días después de la recepción).

Desarrollo de los xenotrasplantes y tratamientos de los animales

Las diferentes estirpes tumorales U87, A549, HT29 se han inyectado por vía subcutánea en el costado de las ratonas atímicas (nu/nu) a razón de 2,5 × 106 células por animal. Los animales se pesan con regularidad y el

25 volumen tumoral se mide 3 veces a la semana y se calcula según la fórmula de la elipsoide V = longitud × anchura × grosor × 0,5236 mm3.

Cuando los tumores alcanzan un volumen tumoral de 500 a 1000 mm3 (de 12 a 15 días después de la inyección de las células), los animales se tratan por vía intratumoral o intraperitoneal con los anticuerpos anti-CRLR, anti-RAMP2, anti-RAMP3 o una mezcla compuesta de los anticuerpos anti-CRLR, anti-RAMP2 y anti-RAMP3 cuya concentración

30 final es de 330 μg/animal, y esto a razón de 3 inyecciones/semana. Los anticuerpos anti-CRLR, anti-RAMP2 y anti-RAMP3 se han desarrollado en el conejo por inyección de las secuencias peptídicas de SEQ ID n.os 2, 3 y 5, respectivamente. Los grupos de animales que sirven de control se tratan de la misma manera con un anticuerpo irrelevante o un suero preinmunitario.

Los animales se sacrifican en tiempos variables en el transcurso del tratamiento (j2, j7, j11, j16 y j21), los tumores se

35 extraen inmediatamente y se fijan en formol. A continuación se incluyen en parafina para los estudios inmunohistoquímicos.

Un grupo de animales tratados durante 21 días recibe una inyección de lectina biotinilada (lectina de Lycopersicon

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Claims (1)

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