JP2011529479A - アドレノメデュリン受容体と結合する抗体及びその薬剤としての使用 - Google Patents
アドレノメデュリン受容体と結合する抗体及びその薬剤としての使用 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図1
Description
腫瘍細胞だけでなく、腫瘍微小環境に存在する炎症細胞、マクロファージ、リンパ球及び筋線維芽細胞も血管新生因子を分泌する。
このペプチドはまた、虚血に応答しての血管リモデリングの間、女性の生殖系において、胚の血管発生の間並びに胎盤の発達及び血管形成(vascularization)の間の血管新生の調節において正の役割を演じ得る。
インビボ及びインビトロの血管新生試験により、アドレノメデュリンが、VEGFに依存しない、細管への内皮細胞の再組織化からなる新生血管形成の最終ステップの1つに対して作用することが示されている(Fernandez-Sauzeら, 2004, 前出)。
− 受容体決定:RAMPタンパク質の基本的役割は、細胞表面で直接相互作用するリガンドの特異性を規定することである。RAMP1は、CGRP受容体を形成するように、CRLRを成熟糖タンパク質として提示する。同様に、RAMP2及びRAMP3は、アドレノメデュリン受容体を形成するように、CRLRを成熟糖タンパク質として提示する。よって、或る細胞タイプに存在するRAMPタンパク質の性質、種々のパートナー(CRLR、RAMP1、RAMP2、RAMP3)間で確立されるタンパク質相互作用及び各タンパク質の割合により、細胞は、種々のニューロペプチドに特異的に応答するようになる(Buhlmannら, FEBS Lett., 2000, 486:320-4;Chakravartyら, Br J Pharmacol., 2000, 130:189-95)。
したがって、腫瘍成長をブロックし若しくは阻害さえし及び/又は腫瘍サイズを退縮させることを狙いとする効果的な治療が依然として必要なままである。
よって、Fernandez-Sauzeら(2004, 前出)は、インビトロにおいて、一方では抗CRLR/抗RAMP2ポリクローナル抗体の混合物が、他方では抗CRLR/抗RAMP3ポリクローナル抗体の混合物が、アドレノメデュリンとその幾つかの細胞タイプ上の受容体との特異的結合を阻害し血管形成をブロックすることを示している。より最近では、国際出願WO2007/045927に、RAMP2又はRAMP3ヒトタンパク質と特異的に結合する抗体を含む医薬組成物が、例えば血管新生又は癌細胞増殖の阻害を介して、癌の治療又は予防に有用であり得ることについて記載されている。
上記の抗体又は抗体フラグメントは、アドレノメデュリン受容体アンタゴニストである。すなわち、これらは、アドレノメデュリンとその受容体との結合を用量依存的様式でブロック(又は阻害)する。
用語「合成抗体」は、酵素及び/又は化学合成により生成される抗体を意味するものとする。
−hCRLRタンパク質のフラグメントS27〜K51及びP89〜R119にそれぞれ由来するペプチド:
SPEDSIQLGVTRNKIMTAQYEAYQK (配列番号1)、
PDYFQDFDPSEKVTKIADQDGNWFRHPASNR (配列番号2)、
−hRAMP2タンパク質のフラグメントK59〜K81及びR91〜R118にそれぞれ由来するペプチド:
KNYETAVQFAWNHYKDQMDPIEK (配列番号3)、
RPYSTLRDALEHFAELFDLGFPNPLAER (配列番号4)、
−hRAMP3タンパク質のフラグメントL34〜K55及びG91〜E112にそれぞれ由来するペプチド:
LERLPLAGKAFADMMGKVDVWK (配列番号5)、
GFITGIHRQFFSNATVDRVHLE (配列番号6)。
本発明による抗体及び/又は抗体フラグメントの混合物は、上記で規定されるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を共に含むことができる。
上記混合物において、上記抗体及び/又は抗体フラグメントは、互いに任意の比で存在してもよく、例えば0.1〜10の比である。好ましい比は1の比である。
「充実性腫瘍」との用語は、例えば、神経膠腫(例えば膠芽腫)のような中枢神経系腫瘍、又は前立腺、肝臓、骨、肺、結腸、皮膚若しくは腎臓の腫瘍を意味するものとする。
本発明はまた急速成長腫瘍を包含し、療法逃避期にある腫瘍をも包含する。
医薬的に許容され得るビヒクルの非限定的な例として、分散剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤などを挙げることができる。(液体及び/又は注射用及び/又は固体)製剤に使用できる医薬的に許容され得るビヒクルは、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート80、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物性又は動物性の油、アカシアなどである。
上記医薬又は医薬組成物は、任意の医薬的に許容され得る形態、例えば注射用懸濁液、必要に応じてガレヌス形態により又は持続及び/若しくは遅延放出を提供するデバイスにより用いられる、ゲル、オイル、錠剤、坐剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤などの形態に処方できる。このタイプの製剤のためには、セルロース、カーボネート又はデンプンのような物質が有利に用いられる。
一般に、化合物の日用量は、治療効果を得るための最小限の用量である。この用量は上記の種々の要因に依存する。用量は、一般には、ヒトについて0.1〜100mg/kg/日であり、好ましくは4〜25mg/kg/日であり、さらにより有利には7〜14mg/kg/日である。
必要であれば、日用量は、1日あたり2回、3回、4回、5回、6回若しくはそれより多い回数の摂取で、又は1日のうちに適切な間隔で投与される複数回のより低用量(subdose)で投与することができる。
本発明による医薬又は医薬組成物は、単独で又は少なくとも1つの他の治療上活性な化合物、例えば別の抗ガン化合物との組合せで用いることができる。上記医薬又は医薬組成物と上記治療上活性な化合物との使用は、特に癌に罹患した個体の治療の間に、同時、別々又は時間的に逐次であり得る。
本発明の主題はまた、配列番号3及び配列番号4の配列のペプチドから選択されるペプチド(好ましくは配列番号4のペプチド)で動物を免疫にする工程を含むことを特徴とする、RAMP2の細胞外ドメインに結合する抗体を取得する方法である。
本発明の主題はまた、配列番号5及び配列番号6の配列のペプチドから選択されるペプチド(好ましくは配列番号5のペプチド)で動物を免疫にする工程を含むことを特徴とする、RAMP3の細胞外ドメインに結合する抗体を取得する方法である。
I:材料及び方法
I.1.抗アドレノメデュリン受容体抗体の取得
免疫化
抗CRLRポリクローナル抗体は、配列番号1又は配列番号2の配列のペプチドをウサギに注射することにより生じさせた。抗RAMP2ポリクローナル抗体は、配列番号3又は配列番号4配列のペプチドをウサギに注射することにより作製した。抗RAMP3ポリクローナル抗体は、配列番号5又は配列番号6の配列のペプチドをウサギに注射することにより作製した。
配列番号1:SPEDSIQLGVTRNKIMTAQYEAYQK、
配列番号2:PDYFQDFDPSEKVTKIADQDGNWFRHPASNR、
配列番号3:KNYETAVQFAWNHYKDQMDPIEK、
配列番号4:RPYSTLRDALEHFAELFDLGFPNPLAER、
配列番号5:LERLPLAGKAFADMMGKVDVWK、
配列番号6:GFITGIHRQFFSNATVDRVHLE。
対照として用いる非免疫血清(免疫前)は、注射開始前に同じ動物から回収した。
ポリクローナル抗体を、プロテインAに結合したセファロースビーズのゲル(GE Healthcare)に通し、100mMグリシン(pH3)で溶出することにより精製した。抗体中のエンドトキシンの存在は、LAL試験(Limulus Amebocyte Lysate, Chambrex)を用いて検証した。結果は、種々の抗体調製物及び免疫前血清におけるエンドトキシンの許容可能なレベル(<1.25U)を示す。免疫グロブリン濃度はPierce法により算出した(ビシンコニン酸(BCA)プロテインアッセイ;Smithら, Anal Biochem, 1985, 150:76-85)。
A498及びBIZ系統は、それぞれDSMZ(Germany)及びGogusev博士の研究室(Necker Hospital-Paris)からのものである。BIZ系統は腎臓癌に由来する。これは、3p13-pter領域の欠失及び他の遺伝子改変、例えばder(1) dup(1)(q21 qter)×2、der(1) t(1;15)×2、der(13) t(1;13)×2を有する。その他の細胞系統は、American Type Culture Collection(Rokville MD, USA)からのものである。腫瘍又は生検からの細胞は、細胞タイプに応じた適切な培地中で(下記の表1を参照)、5% CO2及び95%空気で構成される湿潤環境において37℃にて維持する。
U87神経膠腫瘍細胞を24ウェルプレートに播種し(40000細胞/ウェル)、MEM中で10%胎仔ウシ血清(FBS)の存在下に48時間維持する。これらを1×PBS中で洗浄し、放射性ヨウ素化アドレノメデュリン(Amersham Biosciences GE)を100000cpmの割合で含有するMEM 0.1% BSA(ウシ血清アルブミン)と、抗CRLR抗体と抗RAMP2抗体と抗RAMP3抗体とで構成される抗体混合物の存在下でプレインキュベートする。抗CRLR抗体、抗RAMP2抗体及び抗RAMP3抗体は、それぞれ配列番号2、3及び5の配列のペプチドを注射することにより、ウサギで作製した。周囲温度にて1時間のインキュベーション後、細胞を氷上に置き、4℃に維持した1×PBS-0.1% BSA溶液で2回濯ぐ。0.2N水酸化ナトリウムで細胞を可溶化する。Riastarガンマカウンタ(Packard Instrument Company)中で結合した125I-AMをカウントする。
動物モデル
4〜5週齢の無胸腺(nu/nu) Balb/C雌性マウス及びC57BL/6マウス(Harlan, France)を用いた。これらは、滅菌条件下で、安定温度及び適切な飼料で維持する。インビボ実験は、動物の新たな環境への適応期間が経過して初めて開始する(受け入れ後10〜15日)。
種々の腫瘍系統U87、A549及びHT29を、動物あたり2.5×106細胞の割合で無胸腺(nu/nu)マウスの側腹部に皮下注射した。動物を定期的に秤量する。腫瘍容積は、1週間に3回測定し、楕円体の式V=長さ×幅×厚さ×0.5236 mm3に従って算出する。
21日間処置した1つの動物群に、麻酔下に、ビオチン化レクチン(ビオチン化リコペルシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum)(トマト)レクチン、CliniSciences)を注射する。動物を4%パラホルムアルデヒド溶液で灌流し、これにより組織をインビボで固定することができる。腫瘍及び幾つかの器官(脳、肺、心臓及び腎臓)を取り出し、組織学及び免疫組織化学研究用に液体窒素中で凍結させる。
3群のC57BL/6マウスに、成長因子を含まないMatrigelの溶液(BD Biosciences)を皮下移植する。
* 群(1) Matrigel単独。
* 群(2) 500ngのVEGF165(R&D Systems, France)を含有するMatrigel。
* 群(3) 500ngのアドレノメデュリン(Bachem)を含有するMatrigel。
並行して、第4の亜群の動物を、500μg/動物の用量の免疫前血清(IgG)で処置する。
タンパク質抽出物の調製
U87神経膠腫瘍細胞を起源とする細胞ペレット及びヌードマウスに異種移植した神経膠腫瘍から又は膠芽腫に罹患した患者の腫瘍から得たホモジネートを、溶解バッファー(20mM HEPES、pH7.9、10mM NaCl、1mM MgCl2、10%グリセロール、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、1%プロテアーゼ阻害剤及び0.35% Triton X-100)中に取り、4℃にてホモジナイズする。12000×gにて10分間の遠心分離後、タンパク質を含む上清を回収し、タンパク質をPierce法により定量する。
細胞溶解物(50μg)を、12%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、変性及び還元条件下で分離する。1.92Mグリシン及び1% SDSを含有する0.25M Tris塩基バッファー中での泳動の最後に、1時間30分間、1mA/cm2にてタンパク質をPVDFメンブレン上に移す。メンブレンを1時間、周囲温度にてPBS-5%スキムミルク中で飽和させる。2回の洗浄(PBS-0.2% Tween 20)後、メンブレンを撹拌しながら一晩4℃にてPBS-1%スキムミルク中1/400に希釈した抗CRLR抗体、抗RAMP2抗体又は抗RAMP3抗体の存在下でインキュベートする。3回の洗浄(PBS-0.2% Tween 20)後、メンブレンを周囲温度にて1時間30分間ペルオキシダーゼ標識二次抗体(ECL kit, GE Healthcare, Amersham)とインキュベートする。シグナルを、化学発光キット(ECL kit, GE Healthcare, Amersham)を用いて可視化する。
種々の組織学的分析を、腫瘍の6μm凍結切片(クリオスタット)又は腫瘍のパラフィン包埋切片(ミクロトーム)で行った。この切片は、ビオチン化レクチンを注射したマウスの腫瘍について30〜50μmである。
全ての実験は3〜4回繰り返した。統計解析はAnova検定/S検定により行った。結果は、P<0.05から有意とみなす。
II.1.抗AMR抗体(抗CRLR抗体、抗RAMP2抗体及び抗RAMP3抗体の混合物)は、神経膠細胞の増殖をインビトロで阻害する
抗アドレノメデュリン受容体抗体の特徴付けの間に、これら抗体は用量依存的様式で腫瘍細胞を起源とする膜調製物への放射活性アドレノメデュリン「125I-AM」の結合を阻害できることが示された(図1A)。
これらインビトロ実験により、腫瘍細胞の増殖にアドレノメデュリン並びにその受容体CRLR、RAMP2及びRAMP3を関与させるオートクリン及び/又はパラクリンループの存在を示すことも可能になる(図1B)。これらデータはまた、抗CRLR抗体、抗RAMP2及び抗RAMP3抗体の混合物がアドレノメデュリン受容体を認識し、結果として、これら細胞の増殖を同じ細胞により分泌されるアドレノメデュリンの作用に起因にしてブロックすることを示す。
細胞系統(U87)の皮下注射後に無胸腺マウスにおいて発生した腫瘍は、腫瘍微小環境の全ての構成成分を考慮した実験モデルである。
抗CRLR抗体、抗RAMP2抗体及び抗RAMP3抗体の混合物の腫瘍内投与は、21日間の処置後に、異種移植片腫瘍成長の60〜70%阻害を誘導する(図2A)。16日間の処置後、抗AMR抗体で処置した動物の腫瘍は色が淡く、半透明で血管形成が少ないように見えることが観察された(図2B)。対照的に、対照動物は、高度に血管形成された大きい腫瘍を示す。インビボで観察されたこれら重要な効果は、腫瘍細胞増殖に対する作用に加えて、抗AMR抗体での処置が、腫瘍成長に必須の基本機序を妨害することを示唆する。
腫瘍成長に対する抗AMR抗体の治療効果をインビボで評価するために、抗AMR抗体を腹腔内投与した。
各8匹のマウスからなる4群を、対照IgG(330μg)及び抗AMR(100、200、330μg)で1週間あたり3回処置した(図3A)。
腹腔内処置は、神経膠腫瘍成長の非常に大きな阻害及び対照IgG処置マウスと比較して抗AMR抗体処置マウスの遥かに長い生存を示す(図3B)。
腹腔内処置もまた、神経膠腫瘍成長の非常に大きな阻害及び単一の抗CRLR抗体、抗RAMP2抗体又は抗RAMP3抗体処置マウスと比較して3つの抗CRLR抗体、抗RAMP2抗体及び抗RAMP3抗体の混合物での処置マウスの遥かに長い生存を示す(図3C)。
抗AMR(抗CRLR/抗RAMP2/抗RAMP3)抗体での処置後の腫瘍退縮に関与する機構をよりよく理解するために、腫瘍切片で組織学的分析を行った。CD31又はvon Willebrand(vWF)因子のような内皮マーカーの使用は、血管サイズの減少をもたらす血管構造の著しい組織崩壊又は不安定化さえ示す。
C57BL/6マウスに皮下注射された、成長因子を含まずアドレノメデュリンのみが補われたMatrigelを用いるインビボ血管新生試験は、種々の細胞タイプの動員に対するこの因子の存在の影響を研究するための良好なモデルである。組織学的切片をヘマトキシリン/エオシンで染色することにより、因子を有さないMatrigelと比較して、アドレノメデュリン含有Matrigel内の細胞浸潤が示される。更に、細胞密度は、VEGF含有Matrigelと比較した場合に、より高い(図6A)。循環細胞の動員に対する抗AMR抗体(抗CRLR/抗RAMP2/抗RAMP3)の役割を評価するために、これら抗体を用いる腹腔内処置の影響を試験した。結果は、抗AMR抗体での処置が、Matrigel移植片における循環細胞の動員の減少を、用量依存的様式で誘導することを示す(図6A及びB)。抗AMR抗体の特異性は、免疫前IgGを用いる処置との比較で示される。
アドレノメデュリンを随意に含有するMatrigelを皮下に与えたC57BL/6マウスにおける、犠牲30分前のデキストラン-FITCの注射は、インビボでの血管新生に対するアドレノメデュリンの影響の研究を可能にする。蛍光FITCアッセイは、対照と比較して、アドレノメデュリン含有Matrigel中の大量のデキストランを示す。このことは、アドレノメデュリンの効果の下で機能的血管新生が確立されたことを証明している(図7A)。FITC-デキストランの量は、抗AMR抗体処置マウスにおいて用量依存的様式で、対照IgG処置マウスと比較して減少する。
得られた種々の結果は、腫瘍血管新生に関与する因子としてアドレノメデュリンを規定する。
抗癌療法を確立することを狙いとして、他の腫瘍モデル、例えば肺癌、結腸癌、腎臓癌、胸部癌及び皮膚癌に対する抗AMR(抗CRLR/抗RAMP2/抗RAMP3)抗体での処置の影響を検証した。
HT29(図8C)及びA549(図8D)系統を異種移植したマウスにおける抗AMR抗体での腹腔内処置は、免疫前血清で処置したマウスと比較して、腫瘍増殖のかなりの阻害を示す。この最初の知見は、抗AMR抗体での処置の良好な全身耐性を示唆する(処置マウスの体重曲線及び全身状態)。処置マウスの腫瘍は、対照腫瘍より容積が3倍小さく、血管形成も少ないようである。この結果は、アドレノメデュリンが悪性腫瘍の発達で果たしているにちがいない重要な役割を示す。内皮細胞について第VIII因子及びCD31での、周皮細胞についてα-SMA及びデスミンでの標識による結腸異種移植片の切片における予備的免疫組織化学研究は、腫瘍血管新生に対する抗AMR抗体の非常に本質的な効果を示す。
各10匹のマウスからなる3群に1百万のU87細胞を脳内注射した。10日後、疾患のために衰弱したマウスは、細胞の注射を受けなかった正常マウス(20g±2)と比較して体重の減少を経験する(14g±2)。マウスを幾つかの群に分け、1週間に3回腹腔内に330μgの対照IgG又は抗アドレノメデュリン(抗AM)抗体又は抗アドレノメデュリン受容体(抗AMR)抗体を与える(図9A)。
他方で、抗AM抗体又は抗AMR抗体で処置したマウス群では、処置の数日後にマウスの60〜70%で体重増加が観察され、生存は230日を超えて延長した(図9B)。
最後に、処置マウスでは、動物を犠牲にした後の器官に転移は観察されなかった。
Claims (15)
- 医薬として使用するための、アドレノメデュリン受容体を形成する3つのタンパク質と結合し、各抗体及び/又は抗体フラグメントが異なるタンパク質と結合する、少なくとも3つの抗体及び/又は該抗体のフラグメントの混合物。
- 前記医薬が、腫瘍、好ましくは充実性腫瘍の予防処置用又は治療的処置用であることを特徴とする請求項1に記載の混合物。
- 3つのタンパク質が、CRLR、RAMP2及びRAMP3タンパク質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の混合物。
- 前記抗体が、前記タンパク質の各々の細胞外ドメインと結合することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の混合物。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の混合物。
- CRLRの細胞外ドメインと結合する抗体が、配列番号1及び配列番号2の配列から選択されるペプチドで動物を免疫にすることにより得ることができることを特徴とする請求項3〜5のいずれか1項に記載の混合物。
- RAMP2の細胞外ドメインと結合する抗体が、配列番号3及び配列番号4の配列から選択されるペプチドで動物を免疫にすることにより得ることができることを特徴とする請求項3〜6のいずれか1項に記載の混合物。
- RAMP3の細胞外ドメインと結合する抗体が、配列番号5及び配列番号6の配列から選択されるペプチドで動物を免疫にすることにより得ることができることを特徴とする請求項3〜7のいずれか1項に記載の混合物。
- 請求項1〜8のいずれか1項で規定される少なくとも3つの抗体及び/又は抗体フラグメントと、少なくとも1つの医薬上許容され得るビヒクルとを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 配列番号1の配列のペプチドで動物を免疫にすることにより得ることができることを特徴するCRLRの細胞外ドメインと結合する抗体。
- 配列番号3の配列のペプチドで動物を免疫にすることにより得ることができることを特徴するRAMP2の細胞外ドメインと結合する抗体。
- 配列番号6の配列のペプチドで動物を免疫にすることにより得ることができることを特徴するRAMP3の細胞外ドメインと結合する抗体。
- 配列番号1及び配列番号2の配列のペプチドから選択されるペプチドで動物を免疫にする工程を含むことを特徴とするCRLRの細胞外ドメインと結合する抗体を取得する方法。
- 配列番号3及び配列番号4の配列のペプチドから選択されるペプチドで動物を免疫にする工程を含むことを特徴とするRAMP2の細胞外ドメインと結合する抗体を取得する方法。
- 配列番号5及び配列番号6の配列のペプチドから選択されるペプチドで動物を免疫にする工程を含むことを特徴とするRAMP3の細胞外ドメインと結合する抗体を取得する方法。
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