ES2545963T3 - Terapéutica con ARNi multidirigidos para la cicatrización de heridas de la piel sin cicatriz - Google Patents

Terapéutica con ARNi multidirigidos para la cicatrización de heridas de la piel sin cicatriz Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende al menos tres moléculas de ARNip diferentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que al menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen TGF-β1, al menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen Cox-2 y por lo menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen Hoxb13, en la que dichas moléculas de ARNip diferentes inhiben la expresión de dichos genes tanto en células humanas como de ratón, en donde dicha composición comprende una nanopartícula que comprende un copolímero de histidina-lisina y en donde dichas moléculas de ARNip diferentes comprenden los siguientes oligonucleótidos: (1) hmTF-2: sentido, 5'-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3' (SEC ID Nº 11) antisentido, 5'AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3' (SEC ID Nº 12); (2) hmCX-1: sentido, 5'-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3' (SEC ID Nº 9) antisentido, 5'-ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3' (SEC ID Nº 10); y (3) hmHX-1: sentido, 5'-GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3' (SEC ID Nº 7) antisentido, 5'- AACACAUCUGGCUGUUCCAGCCACC-3' (SEC ID Nº 8).

Description

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secuencias diferentes en una sola molécula de ARNm. La RT-PCR se llevó a cabo para la detección de disminución de ARNm por ARNip in vitro. El ARN citoplasmático se aisló mediante RNAwiz (Ambion, # 9736) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con tratamiento adicional con ADNasa y se sometió a RT-PCR con los cebadores especialmente preparados. Los cebadores inversos específicos de ARNm para la reacción de RT fueron todos 5 oligonucleótidos de 47 unidades con las 30 unidades del extremo 5 de secuencia única (denominada secuencia "TS1", indicado en mayúsculas más adelante) unido a una secuencia de 17 unidades única para cada molécula de ARNm (en minúsculas más adelante). Eran (de 5 'a 3'): 1) mVEGFA Dn: GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg; 2): mVEGFR1 Dn: GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattccgc; 3) mVEGFR2 Dn: GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATaggtcactgaca gaggcg. Los ensayos de PCR para todos los genes analizados, que siguen Al ensayo de RT, utilizan un mismo cebador inverso, TS1: GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA. Sin embargo, los cebadores directos para PCR, todos eran oligonucleótidos de 30 unidades, único para cada gen: VEGFA hasta: GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG; 2) mVEGFR1 hasta:
15 GTCAGCTGCTGGGACACCGCGGTCTTGCCT; 3) mVEGFR2 hasta: GGCGCTGCTAGCTGTCGCTCTGTGGT TCTG. La RT-PCR del gen doméstico GAPDH se usó como control para la cantidad de ARN usada en RS-PCR. Se usó un cebador de oligonucleótido dT (19 unidades) para el ensayo de RT de GAPDH. Los cebadores utilizados para la PCR seguida fueron oligonucleótidos de 20 unidades: 1) GAPDH Up: CCTGGTCACCAGGGCTGCTT; 2) GAPDH Descendente: CCAGCCTTCTCCATGGTGGT. La RT-PCR también se utilizó de acuerdo con el protocolo descrito previamente. Para la detección de la expresión de mVEGF-A, los cebadores utilizados fueron 5'-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3' (sentido) y 5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3' (antisentido). La Figura 7 muestra que los tres pares de ARNip disminuyen de forma eficaz la expresión del gen diana. Para evaluar la potencia del cóctel de ARNip con tres pares de dúplex de ARNip, se utilizó un modelo de neovascularización ocular de ratón con liberación de nanopartículas del polímero histidina -lisina in vivo.
25
Ejemplo 7. Inhibición de la angiogénesis mediante liberación local de cóctel de ARNip
Un estudio previo demostró que el nucleótido oligonucleótido que contiene CpG encapsulado en pastillas de hidrón induce la angiogénesis mediada por dVEGF cuando se inserta en microbolsas corneanas. Este sistema se utilizó para medir el efecto inhibidor de la administración local de las preparaciones de ARNip preparadas para dirigir al VEGF, así como dos de sus receptores (VEGFR1 y VEGFR2). En todos los casos se usó una sola dosis de 10 µg de ARNip con nanopartículas de polímeros de histidina-lisina. Esta se administró mediante inyección subconjuntival 24 horas después del establecimiento de las microbolsas que contienen ODN CpG. Los ARNip se analizaron individualmente, así como una mezcla 1: 1 :1 de los tres (siVEGFA, siVEGFR1 y siVEGFR2). La formación de
35 nuevos vasos sanguíneos en el limbo corneal se monitorizó a los días 4 y 7 después de la implantación de las pastillas. Como se muestra en la Figura 8, la inhibición significativa de la neovascularización corneal tuvo como resultado los tres ARNip de ensayo en comparación con los proporcionados con control de siLacZ el día 4 después de la implantación de la pastilla (P <0,05). La combinación de los tres ARNip analizados fue el inhibidor más eficaz, proporcionando una reducción del 60% en la neovascularización (P <0,01). La liberación local de ARNip se llevó a cabo con nanopartículas de polímero-lisina histidina aunque la administración se subconjuntival. El beneficio sinérgico del cóctel de ARNip multidirigidos se demostró en este modelo de angiogénesis ocular. Los datos proporcionan un fuerte apoyo a la utilización de cócteles de ARNip multidirigidos como se divulga en el presente documento para mejorar la cicatrización de heridas de la piel de adultos con menos formación de tejido cicatricial y una resistencia a la tracción más fuerte.
45
Ejemplo 8. ARNip de veinticinco unidades dirigido a los genes tanto humanos como de ratón
Se preparan secuencias de ARNip de 25 unidades dirigidas a las secuencias homólogas de humanos y de ratón en los genes ortólogos. Por ejemplo, la secuencia dúplex de ARNip dirigida a HoxB 13 es capaz de dirigirse a los genes de HoxB13 humanos y de HoxB13 de ratón. La Tabla 1 proporciona secuencias identificadas para la terapéutica con ARNip (36-37). Cada secuencia se dirige al gen correspondiente de ser humano y de ratón. Por lo tanto, las secuencias potentes definidas a partir de las células de ratón se pueden confirmar de nuevo utilizando células humanas. Si el ARNip dúplex particular es potente en ambas pruebas, la actividad de silenciamiento revelada en el modelo animal de ratón podría suponer que es activa en el ser humano. Con este enfoque, los inventores pueden
55 abordar una preocupación general acerca de la especificidad de especie de este tipo de inhibidores, tales como el anticuerpo monoclonal, que se han encontrado. Además, para los candidatos terapéuticos de dúplex de ARNip, los datos de eficacia y toxicidad obtenidos a partir del estudio utilizando el modelo de ratón pueden traducirse fácilmente al entorno humano.
Ejemplo 9. El polímero HK potencia la liberación local de ARNip
La liberación local mediada por nanopartículas de ARNip–polímero de HK ha logrado una potente actividad antiangiogénica. En un estudio separado utilizando polímero HK para mejorar la liberación de ARNip intratumoral, las curvas de crecimiento tumoral han mostrado una eficacia antitumoral significativa con una clara regulación por 65 disminución de la expresión del gen diana. A los 10 días después de la inyección de células MDA-MB-435 en la almohadilla de grasa mamaria, los ratones con tumores visibles se separaron en grupos de tratamiento. Cada grupo
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de polímero dendrítico PAMAM-ARNip (50 µl). Cada grupo tiene cuatro animales. A los análisis de los niveles de ARNm y proteínas les siguen otros estudios in vivo. Los resultados proporcionan una formulación óptima del cóctel de ARNip multidirigidos para un protocolo clínicamente viable.
5 Silenciamiento del gen diana in vivo a niveles de ARNm y de proteínas
Las muestras de piel se escinden de ratón tanto SV como KO para HoxB13, ya sea en heridas de la piel de la espalda o heridas por cirugía labial y se sumergieron en DMEM rico en glucosa que contiene 10 % de FBS y antibióticos / fungizona, la superficie se esterilizó en etanol al 70 %, se diseccionó en secciones de '5-mm2 y se digirieron en dispasa en DMEM (5 mg / ml) durante la noche a 4 °C. Las muestras de ARN total de tejidos y células se transcriben de forma inversa utilizando el kit y el protocolo RETROscript (Ambion). Para la tinción de anticuerpos, las muestras de piel fijadas con paraformaldehído de adulto SV y KO para HoxB13 deberán procesarse, incluirse en parafina, seccionarse (6 m), y cocer durante la noche a 55 °C. El método similar de aislamiento de ARN y preparación de muestras para inmunohistoquímica se puede utilizar para las detecciones de COX-2 y TGF-β1 in
15 vivo. El criterio para la formulación cóctel de ARNip más potente debe realizarse teniendo en cuenta el modelo de herida en la piel, el genotipo de HoxB13 y la relación de cada dúplex de ARNip. El mismo principio se debe considerar que disminución del nivel de ARNm es la indicación clave de la potencia del cóctel de ARNip multidirigidos.
Los potenciales beneficios terapéuticos del cóctel de ARNip multidirigidos
Para tener una evaluación inicial de los posibles beneficios terapéuticos del cóctel de ARNip, los inventores van a llevar a cabo dos análisis: Análisis histológico y HA. Las muestras de piel fijadas con paraformaldehído se procesan, incluyen en parafina y se seccionaron (6 m). Los portaobjetos se introducirán en horno a 55 °C y se teñirán con
25 hematoxilina y eosina o con tinción tricrómica de Masson para el colágeno, utilizando protocolos estándar. Para la detección de HA, secciones de piel se bloquean en 2 % de FBS, se incuban con proteína de unión a HA biotinilada (bHABP, 1 µg/ml en PBS, Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA) durante la noche a 4 °C, se aclaran en PBS, se incuban con Cy-3-estreptavidina (1: 500; Jackson Immunoresearch Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se aclaran en PBS y se montan como se ha descrito anteriormente. Como control negativo, el tejido debe incubarse en PBS solo. La inmunofluorescencia debe verse con un microscopio Leica DMLB y las imágenes se capturarán utilizando un Sistema Digital DEI-750D Optronics. El análisis histológico proporciona información gráfica acerca de la diferencia morfológica entre las heridas de la piel tratadas y no tratadas y las intensidades de la presencia de la proteína HA.
35 Ejemplo 13. Desarrollo de un protocolo clínico viable para el cóctel de ARNip multidirigidos
Una proporción adecuada de dúplex de ARNip en la formulación de un cóctel se define con una formulación de polímero optimizada, y se correlaciona con un modelo concreto de ARNip de ratón y cócteles de los mismos, se ensaya en el modelo de cirugía labial.
La curva dependiente de la dosis de la formulación cóctel de ARNip multidirigidos
Para definir la dosis adecuada de las formulaciones de cóctel de ARNip candidatos terapéuticos definidos, se analizan 6 dosis diferentes en el modelo de cirugía labial de ratón. Los grupos de ensayo van a ser G1: aplicar 2 µg /
45 50 µl sobre la herida; G2: aplicar 10 µg / 50 µl sobre la herida; G3: aplicar 20 µg / 50 µl sobre la herida; G4: aplicar 30 µg / 50 µl sobre la herida; G5: aplicar 40 µg / 50 µl sobre la herida y G6: aplicar 60 µg / 50 µl sobre la herida. Cada grupo tiene cuatro animales. Las lecturas bioquímicas y de biología molecular deben medirse junto con la evaluación histológica y morfológica.
Análisis histológico y HA
Las muestras de piel fijadas con paraformaldehído se procesan, incluyen en parafina y se seccionaron (6 m). Los portaobjetos se introducen en horno a 55 °C y se teñirán con hematoxilina y eosina o con tinción tricrómica de Masson para el colágeno, utilizando protocolos estándar. Para la detección de HA, secciones de piel se bloquean en
55 2 % de FBS, se incuban con proteína de unión a HA biotinilada (bHABP, 1 µg/ml en PBS, Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA) durante la noche a 4 °C, se aclaran en PBS, se incuban con Cy-3-estreptavidina (1: 500; Jackson Immunoresearch Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se aclaran en PBS y se montan como se ha descrito anteriormente. Como control negativo, el tejido debe incubarse en PBS solo. La inmunofluorescencia debe verse con un microscopio Leica DMLB y las imágenes se capturarán utilizando un Sistema Digital DEI-750D Optronics. El análisis histológico proporciona información gráfica acerca de la diferencia morfológica entre las heridas de la piel tratadas y no tratadas y las intensidades de la presencia de la proteína HA.
Cuantificación del contenido en colágeno
65 Contenido en colágeno se determina midiendo el contenido en hidroxiprolina de las muestras. En pocas palabras, las muestras de espesor completo de piel dorsal (≈16 mg) cosechadas de ratones adultos de 8 a 16 semanas de
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8 gcaagaucucggcagccaccagccu
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cgccagauuaccaucugguuucaga
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ccaucugguuucagaaccgccgggu
COX-2 ser humano ratón, de 5' a 3'
1 gauguuugcauucuuugcccagcac
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caucaguuuuucaagacagaucaua
3
guuuuucaagacagaucauaagcga
4
gucuuuggucuggugccuggucuga
5
ggucuggugccuggucugaugaugu
6
gugccuggucugaugauguaugcca
7
gagcaccauucuccuugaaaggacu
8
caccauucuccuugaaaggacuuau
9
ccucaauucagucucucaucugcaa
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caauucagucucucaucugcaauaa
TGF-beta ser humano ratón, de 5' a 3'
1 gcgggcagauccugagcaagcugaa
2
ggcagauccugagcaagcugaagcu
3
cagauccugagcaagcugaagcuca
4
ccccggaggugauuuccaucuacaa
5
ccggaggugauuuccaucuacaaca
6
cuccgaaaaugccaucccgcccacu
7
gaaaaugccaucccgcccacuuucu
8
cgcccacuuucuacagacccuacuu
9
cacuuucuacagacccuacuucaga
10
ccaguggugaucagaaaacuauaaa
Las secuencias que figuran en las Tablas 2 -9 son las secuencias de codificación de ARNm diana que pueden usarse para las secuencias de ARNip cambiando la "t" por "u", tales como las secuencias enumeradas en la Tabla 1.
Tabla 2. Secuencias para el factor transformante de crecimiento beta 1:
Organismo Gen Homología Longitud Nº Ser humano TGF-b1 Ser humano 21 unidades 1 Ratón Ratón 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Secuencias sentido ggtcacccgcgtgctaatggt cacccgcgtgctaatggtgga ccaactattgcttcagctcca gcggcagctgtacattgactt ccacgagcccaagggctacca gcccaagggctaccatgccaa ccaagggctaccatgccaact cgcaagcccaaggtggagcag cgctcctgcaagtgcagctga caagggctaccatgccaactt
23 unidades 1
gaggtcacccgcgtgctaatggt
2
gtcacccgcgtgctaatggtgga
3
gtgcggcagctgtacattgactt
4
cgagcccaagggctaccatgcca
5
gcccaagggctaccatgccaact
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7 gaaaatgccatcccgcccactttct 8 cgcccactttctacagaccctactt 9 cactttctacagaccctacttcaga 10 ccagtggtgatcagaaaactataaa
Tabla 4. Secuencias para COX-2:
Organismo Gen
Homología Longitud Nº Secuencias sentido
Ser humano COX-2 Ratón
Ser humano 21 unidades 1 caaaagctgggaagccttctc Ratón 2 gatgtttgcattctttgccca 3 cattctttgcccagcacttca 4 catcagtttttcaagacagat 5 cagtttttcaagacagatcat 6 gtttttcaagacagatcataa 7 ctgcgccttttcaaggatgga 8 gtctttggtctggtgcctggt 9 ctttggtctggtgcctggtct 10 ggagcaccattctccttgaaa 23 unidades 1 gatgtttgcattctttgcccagc 2 catcagtttttcaagacagatca 3 cagtttttcaagacagatcataa 4 ctgcgccttttcaaggatggaaa 5 gtctttggtctggtgcctggtct 6 ctttggtctggtgcctggtctga 7 ggtctggtgcctggtctgatgat 8 ctggtgcctggtctgatgatgta 9 gcctggtctgatgatgtatgcca 10 gagcaccattctccttgaaagga
25 unidades 1 gatgtttgcattctttgcccagcac 2 catcagtttttcaagacagatcata 3 gtttttcaagacagatcataagcga 4 gtctttggtctggtgcctggtctga 5 ggtctggtgcctggtctgatgatgt 6 gtgcctggtctgatgatgtatgcca 7 gagcaccattctccttgaaaggact 8 caccattctccttgaaaggacttat 9 cctcaattcagtctctcatctgcaa 10 caattcagtctctcatctgcaataa
Tabla 5. Secuencias para HoxB13:
Ser humano
HoxB13 Ser humano 21 unidades 1 ggctccatggagcccggcaat
Ratón
Ratón 2 3 4 ccagcctatggccagttacct ccatggagcccggcaattatg gcccggcaattatgccacctt
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5 caaggatatcgaaggcttgct 6 gatatcgaaggcttgctggga 7 gtggctggaacagccagatgt 8 gctggaacagccagatgtgtt 9 gatctcggcagccaccagcct 10 cgccagattaccatctggttt
23 unidades 1 ggctccatggagcccggcaatta 2 catggagcccggcaattatgcca 3 ggagcccggcaattatgccacct 4 gtggctggaacagccagatgtgt 5 cgccagattaccatctggtttca 6 ccagattaccatctggtttcaga 7 atctggtttcagaaccgccgggt 8 aagatctcggcagccaccagcct 9 ccagattaccatctggtttcaga 10 cgccagattaccatctggtttca
25 unidades 1 ggctccatggagcccggcaattatg 2 ccatggagcccggcaattatgccac 3 ggagcccggcaattatgccaccttg 4 caaggatatcgaaggcttgctggga 5 ggtggctggaacagccagatgtgtt 6 gctggaacagccagatgtgttgcca 7 ggacaagaggcgcaagatctcggca 8 gcaagatctcggcagccaccagcct 9 cgccagattaccatctggtttcaga 10 ccatctggtttcagaaccgccgggt
Tabla 6. Secuencias para PDGF a:
Organismo Gen Homología Longitud Nº
Secuencias sentido
Ser humano PDGF a Ser humano 21 unidades Ratón Ratón
1 caccctcctccgggccgcgct 2 ctcctccgggccgcgctccct 3 gtactgaatttcgccgccaca 4 ctgaatttcgccgccacagga 5 ggagcgcccgccccgcggcct 6 ctgctgctcctcggctgcgga 7 gctgctcctcggctgcggata 8 gatccacagcatccgggacct 9 ccacagcatccgggacctcca 10 catccgggacctccagcgact
23 unidades
1 gccaccctcctccgggccgcgct 2 ccctcctccgggccgcgctccct 3 gatggtactgaatttcgccgcca 4 ctggagcgcccgccccgcggcct 5 gcgcccgccccgcggcctcgcct 6 gcctcgggacgcgatgaggacct
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7 ggcttgcctgctgctcctcggct 8 gcctgctgctcctcggctgcgga 9 cagatccacagcatccgggacct 10 gaccaggacggtcatttacgaga
25 unidades 1 gcgccaccctcctccgggccgcgct 2 caccctcctccgggccgcgctccct 3 gggatggtactgaatttcgccgcca 4 gatggtactgaatttcgccgccaca 5 ggtactgaatttcgccgccacagga 6 ggctggagcgcccgccccgcggcct 7 gagcgcccgccccgcggcctcgcct 8 ccagcgcctcgggacgcgatgagga 9 gcgcctcgggacgcgatgaggacct 10 gcctgctgctcctcggctgcggata
Tabla 7. Secuencias para Lamina B1:
Ser humano Lamina B1 Ser humano 21 unidades 1 Ratón Ratón 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ggagacggagaacagcgcgct ggagaacagcgcgctgcagct gaacagcgcgctgcagctgca gaacagcgcgctgcagctgca gaggctgggagatgatcagaa ggctgggagatgatcagaaaa gagccttactgaggacttgga cagttagcagatgaaacttta gttagcagatgaaactttact caatgggaggctgggagatga
23 unidades 1
ctggagacggagaacagcgcgct
2
gagaacagcgcgctgcagctgca
3
gagccttactgaggacttggagt
4
gggaggctgggagatgatcagaa
5
cagagccttactgaggacttgga
6
cgacacggcccgcgagcgcgcca
7
cagttagcagatgaaactttact
8
gttagcagatgaaactttactta
9
ccaatgggaggctgggagatgat
10
gaagatgtgaaggttatattgaa
25 unidades 1
gcctggagacggagaacagcgcgct
2
cggagaacagcgcgctgcagctgca
3
gagccttactgaggacttggagttt
4
gggaggctgggagatgatcagaaaa
5
gtcagagccttactgaggacttgga
6
gacgacacggcccgcgagcgcgcca
7
gacacggcccgcgagcgcgccaagc
8
cagttagcagatgaaactttactta
9
gatcaaccaatgggaggctgggaga
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10
ccaatgggaggctgggagatgatca
Tabla 8. Secuencias para VEGF A:
Organismo Gen Homología Longitud Nº Ser humano VEGFA Ser humano 21 unidades 1 Ratón Ratón 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Secuencias sentido gtgtgcgcagacagtgctcca ccaccatgccaagtggtccca cctggtggacatcttccagga gcacataggagagatgagctt caagatccgcagacgtgtaaa ggcgaggcagcttgagttaaa cttgagttaaacgaacgtact ggaaggagcctccctcagggt cactttgggtccggagggcga cagtattcttggttaatattt
23 unidades 1
gcctccgaaaccatgaactttct
2
ctccaccatgccaagtggtccca
3
cctggtggacatcttccaggagt
4
cagcacataggagagatgagctt
5
gcttgagttaaacgaacgtactt
6
gttaaacgaacgtacttgcagat
7
ggaaggagcctccctcagggttt
8
ctccctcagggtttcgggaacca
9
ctaatgttattggtgtcttcact
10
gagaaagtgttttatatacggta
25 unidades 1
cctccgaaaccatgaactttctgct
2
ccaccatgccaagtggtcccaggct
3
ccctggtggacatcttccaggagta
4
gatccgcagacgtgtaaatgttcct
5
cgcagacgtgtaaatgttcctgcaa
6
gtaaatgttcctgcaaaaacacaga
7
cagcttgagttaaacgaacgtactt
8
gttaaacgaacgtacttgcagatgt
9
ccatgccaagtggtcccaggctgca
10
ccctggtggacatcttccaggagta
Tabla 9. Secuencias para FGF-2:
Organismo Gen Homología Longitud Nº
Secuencias sentido
Ser humano FGF-2 Ser humano 21 unidades 1
cttcaaggaccccaagcggct
Ratón Ratón 2
ggccacttcaaggaccccaag
3
ggcttcttcctgcgcatccat
4
caagcagaagagagaggagtt
5
cagaagagagaggagttgtgt
6
gagaggagttgtgtctatcaa
7
gaagagagaggagttgtgtct
8
gaatctaataactacaatact
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9
cagttggtatgtggcactgaa
10
cactgaaacgaactgggcagt
23 unidades 1
cacttcaaggaccccaagcggct
2
caagcagaagagagaggagttgt
3
gcagaagagagaggagttgtgtt
4
cagaagagagaggagttgtgtct
5
gaagagagaggagttgtgtctat
6
gagagaggagttgtgtctatcaa
7
ggaatctaataactacaatactt
8
ggtatgtggcactgaaacgaact
9
gttggtatgtggcactgaaacga
10
gtggcactgaaacgaactgggca
25 unidades 1
gccacttcaaggaccccaagcggct
2
caagcagaagagagaggagttgtgt
3
gaagagagaggagttgtgtctatca
4
cagaagagagaggagttgtgtctat
5
gaagagagaggagttgtgtctatca
6
ggaatctaataactacaatacttac
7
ctaataactacaatacttaccggtc
8
cagttggtatgtggcactgaaacga
9
gtggcactgaaacgaactgggcagt
10
tcttccaatgtctgctaagagctga

Ejemplo 15. Método para la preparación del cóctel de ARNip
La presente invención proporciona el cóctel terapéutico de ARNip dirigidos a múltiples genes de control de
5 enfermedades en el mismo tratamiento. La presente invención proporciona agentes de ARNi, tales como oligonucleótidos de ARNip, que son químicamente similares a la misma fuente de suministro y el mismo proceso de fabricación, y están compuestos por cuatro tipos de nucleótidos con secuencias diferentes. La invención proporciona un medicamento en cóctel de ARNip mejorar de la cicatrización de heridas sin cicatrices dirigiendo los genes implicados en el proceso de cicatrización de heridas, incluidos TGF-β, COX-2, HoxB13 y otros.
10 En una realización preferida, el cóctel de ARNip tiene las siguientes características:
(1) El cóctel de ARNip contiene al menos tres dúplex de ARNip dirigidos al menos a tres genes diferentes (no tres secuencias del mismo gen) a una proporción necesaria para la terapia.
15 (2) Los cócteles de ARNip para cada combinación están dirigidos a las funciones de cada gen en un fondo de una red de biología de sistemas, en la que estos genes están funcionando ya sea en la misma vía o en una diferente.
Combinaciones de cóctel de ARNip (secuencias de ARNip)

Tabla A. El cóctel de ARNip dirigidos a HoxB13, COX-2 y TGF-β1 20
HoxB 13 COX-2 TGF-β1 Cóctel 1
HoxB13 COX-2 TGF-β1 Homólogos humanos y de ratón 5'-caaggauaucgaaggcuugcuggga-3' 5'-gucuuuggucuggugccuggucuga-3' 5'-ccccggaggugauuuccaucuacaa-3'
Cóctel 2
HoxB 13 5'-caaggauaucgaaggcuugcuggga-3'
24
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