ES2537001T3 - Anticuerpos específicos para protofibrillas solubles de péptido beta amiloide y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a protofibrillas de Aß42 de tipo silvestre y a protofibrillas de Aß42 con baja reactividad cruzada del monómero Aß42 donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se puede obtener mediante el uso de protofibrillas de Aß42Arc o Aß42wt con una pureza superior al 95 % para inmunización y detección selectiva.

Description

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14-05-2015

El AcMo 258 se unió a las protofibrillas wtAβ42 y un poco menos a las protofibrillas Aβ42Arc. No se observó unión a monómeros de wtAβ40. La ligera de unión a fibrillas wtAβ42 se debe probablemente a una ligera contaminación con protofibrillas wtAβ42 (véase la Figura 1 D).

5. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustración y no están destinados a limitar la invención a los ejemplos específicos proporcionados.

Ejemplo: 1 Síntesis de péptido beta amiloide humano (Aß) de diferentes conformaciones

Las formas silvestre o mutante sintéticas humanas de los péptidos Aβ1-42 o Aβ1-40 se adquirieron en Polypeptide Laboratories GmbH. Los péptidos fueron sintetizados mediante un procedimiento de síntesis de péptidos en fase sólida estándar. Los péptidos se purificaron posteriormente con RP-HPLC hasta una pureza en el intervalo de 90-95 %. También es posible usar proveedores alternativos que producen péptidos Aß con pureza similar.

Síntesis de monómeros Aß1-40 humanos de tipo silvestre

Un péptido sintético wtAβ1-40 se disolvió en 1 volumen de NaOH 10 mM pH> 10, y 1 volumen de 2 x PBS frío (pH 78) hasta una concentración de 50 uM. La preparación del monómero wtAβ1-40 se centrifugó a 17. 900 g a + 4 °C durante 5 minutos antes del análisis (Figura 1).

Síntesis de protofibrillas Aβ1-42 humanas de tipo silvestre

Un péptido sintético wtAβ1-42 se disolvió en 9 volúmenes de NaOH 10 mM pH> 10, se agitó en vórtex durante 2 minutos y se diluyó con 1 volumen de 10 x PBS (pH 7-8). La concentración final del péptido era, en este punto, 443 uM. El péptido se incubó adicionalmente durante la noche a 37 °C. Después de la incubación durante la noche, el péptido se diluyó adicionalmente con PBS a 50 uM. La muestra se centrifugó durante 17. 900 x g durante 5 minutos antes del análisis y la inmunización.

Síntesis de protofibrillas Aβ1-42Arc humanas

Un péptido sintético Aβ1-42Arc (E22G) se disolvió en 1 volumen de NaOH 10 mM pH> 10, y 1 volumen de 2 x PBS frío (pH 7-8) hasta una concentración final del péptido de 50 uM. Las protofibrillas Aβ1-42Arc se formaron inmediatamente y las protofibrillas Aβ1-42Arc se estabilizaron manteniendo la solución a 0-4 °C antes del análisis o la inmunización. La muestra se centrifugó a 17. 000 xg durante 5 minutos a + 4 °C antes del análisis. Formas alternativas para estabilizar las protofibrillas Aβ1-42Arc eran añadir glicerol hasta una concentración final de 5-50 %

o agregar Tween-20 a una concentración final de 0,6 %.

Síntesis de protofibrillas Aβ1-42 humanas de tipo silvestre

Un péptido sintético wtAβ1-42 se disolvió en 1 volumen de agua destilada doble, se agitó en vórtex durante 2 minutos y se diluyó con 1 volumen de 10 x PBS (pH 7-8) y de nuevo se agitó en vórtex durante 2 minutos. La concentración final del péptido era, en este punto, 50 uM. La preparación de protofibrillas wtAβ1-42 se incubó a 37 °C, durante 48 horas antes del análisis. La muestra se centrifugó a 17.900 x g durante 5 minutos a antes del análisis SEC. Se analizó el sobrenadante después de la centrifugación. No se realizó centrifugación cuando se analizaron 142 preparaciones de fibrillas mediante ELISA o transferencia de puntos.

Análisis de la preparación de Aß mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Se usó un sistema Merck Hitachi D-7000 HPLC LaChrom, que tiene un detector de diodos de matriz (DAD) modelo L-7455 y una bomba modelo L-7100, para el análisis cromatográfico de preparaciones de protofibrillas en combinación con una columna Superdex 75 PC3. 2 / 30 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). El sistema cromatográfico separa los monómeros Aß de las protofibrillas, que se eluyen en el volumen vacío de la columna. La columna se equilibró con Na2HPO4·50 mM NaH2PO4(PH 7,4) con NaCl 0,15 M (PBS) y 0,6 % de Tween 20 y se eluyó con el mismo tampón a un caudal de 0,08 ml / min (la presión fue 5-6 bares) a temperatura ambiente (22 °C). Diez (10 ul) de una muestra de 50 uM-100 uM de Aß se sometió análisis utilizando un barrido de longitud de onda entre 200-400 nm. Se añadió Tween-20 a la muestra para dar una concentración final de 0,6 % antes de la cromatografía. Los datos se extrajeron a partir de mediciones a 214 y 280 nm. Áreas de los picos se integraron utilizando el modelo de Merck Hitachi D-7000 Chromatography Data Station Software. La figura 1 muestra cromatogramas del monómero wtAβ1-40, wtAβ1-42 protofibrilla, Aβ1-42Arc protofibrilla y preparaciones de fibrillas wtAβ1-42.

Cada preparación fue esencialmente libre (< 3 %) de otras formas conformacionales contaminantes de Aß excepto la preparación monómero wtAβ1-40 que contenía 6,4 % de protofibrillas (tiempo de elución 12-13 minutos).

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Claims (1)

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