ES2461522T3

ES2461522T3 - Procedimiento para la extracción de pectina

Info

Publication number: ES2461522T3
Application number: ES12712623T
Authority: ES
Inventors: Søren Vodstrup Jensen; Susanne Oxenbøll Sørensen; Claus Rolin
Original assignee: CP Kelco ApS
Current assignee: CP Kelco ApS
Priority date: 2011-06-06
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2032-03-27
Also published as: PL2718330T3; JP2014516108A; CN103596986B; DE12712623T1; CN103596986A; US8592575B2; DK2718330T3; BR112013031364A2; JP5740530B2; EP2718330A1; KR101411273B1; US20120309946A1; MX2013013819A; KR20140007014A; MX335964B; RU2541377C1; ES2461522T1; EP2718330B1; WO2012167963A1; CO6870025A2

Abstract

Un procedimiento para extraer pectina que tiene un alto grado de polimerización, que comprende; añadir ácido oxálico y/o oxalato hidrosoluble a una suspensión acuosa de una piel en una cantidad suficiente para proporcionar una mezcla que tiene un pH entre 3,0 y 3,6 y una molaridad total de oxalato mayor que la molaridad total del calcio (II); calentar la mezcla hasta una temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 80ºC durante un tiempo suficiente para extraer una pectina; y separar la pectina extraída de la mezcla precipitando la pectina extraída de la mezcla, en el que la pectina extraída tiene un grado de esterificación (GE) de al menos 72 y un alto grado de polimerización caracterizado por una viscosidad intrínseca mayor que aproximadamente 6,5 dl/g.

Description

DESCRIPCION

Procedimiento para la extraccion de pectina

Campo tecnico

Las realizaciones de la presente descripcion se refieren a metodos para la extraccion de pectinas de alta calidad. En particular, la presente descripcion se refiere a procedimientos a baja temperatura para la extraccion de pectina de pieles de cftricos que evitan la degradacion significativa de la pectina durante el procedimiento de extraccion.

Antecedentes

La pectina es un polisacarido complejo asociado a las paredes de las celulas vegetales. Consiste en una estructura de acido poligalacturonico unida por enlaces alfa 1-4 con restos de ramnosa interpuestos y modificado con cadenas laterales de azucar neutras y componentes que no son azucar, tales como grupos acetilo, metilo y acido ferulico. Las cadenas laterales de azucar neutras, que incluyen arabinano y arabinogalactanos, estan unidas a los restos de ramnosa en la estructura.

Se ha llevado a cabo una gran cantidad de investigaciones sobre las pectinas debido a su importancia como producto alimentario, fibra de la dieta y componente de las paredes celulares en plantas superiores, y a la cada vez mayor conciencia de una serie de actividades farmacologicas. No obstante, los metodos actuales de extraccion de pectina no producen pectinas de suficiente calidad para todos estos usos.

Los metodos convencionales de extraccion de pectina requieren prolongar el calentamiento de los materiales vegetales que contienen pectina a temperaturas por debajo de la ebullicion (aproximadamente 65-85°C) en un medio acido (pH inferior a 2,2) durante 1 a 10 horas. No obstante, estos procedimientos tienen tiempos de residencia y requisitos de energfa altos, y pueden proporcionar unicamente un rendimiento moderado de pectina (20-30%) usando un procedimiento de contracorriente (es decir, un procedimiento que usa un numero, n, de etapas de extraccion con las que la materia prima original pasa a la etapa de extraccion n° 1, el agua pura original pasa a la etapa numero n, y para cualquier etapa n° i, suponiendo 1<i<n, el lfquido proviene de la etapa i+1 mientras que los solidos provienen de la etapa i-1). Por tanto, dado que la condicion acida es agresiva y dado que una gran parte de la pectina queda expuesta a la condicion acida de forma repetida, las pectinas a menudo se degradan durante los procedimientos de extraccion convencionales.

Como los expertos en la tecnica apreciaran, es deseable extraer una pectina que tenga un grado de polimerizacion (DP, de sus siglas en ingles) lo mas elevado posible para los costes mas bajos posibles. La seleccion de las condiciones de produccion como la proporcion solido/lfquido, acidez, temperatura, etc., afectan todas estas consideraciones en conflicto. Por ejemplo, para conseguir un rendimiento incluso moderadamente alto usando procedimientos convencionales, las condiciones de extraccion deben ser agresivas. Ademas, tras la extraccion, la separacion solidos-lfquido debe ser lo mas completa posible porque el lfquido retenido por los solidos tras la separacion quedara expuesto a las condiciones de extraccion agresivas por segunda vez (debido a la configuracion de extraccion a contracorriente). Sin embargo, para que la separacion sea lo mas completa posible, la viscosidad del lfquido debe ser preferiblemente baja, lo que se consigue bien separando a temperaturas altas, separando con una baja proporcion solidos/lfquido, o bien por una combinacion de ambos. No obstante, el uso de una temperatura alta en combinacion con un pH bajo es perjudicial para la calidad de la pectina (p. ej., su grado de polimerizacion). Por el contrario, una proporcion solidos/lfquido baja es costosa porque se necesitan eliminar grandes cantidades de agua de la pectina, bien por evaporacion o bien por destilacion de alcohol. Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento rentable para extraer pectinas sin comprometer la calidad de las pectinas extrafdas. La Patente US 4.016.351 describe sustancias pectmicas con diferente contenido de metoxilo y procedimientos correspondientes. Yuldasheva (1994) Chemistry of Natural Compounds, Vol. 30, N° 4, describe la extraccion de sustancias pectmicas a partir de la pulpa de remolacha. La Patente US 6.855.363 describe metodos para obtener fracciones pectmicas seleccionadas, tales fracciones y su uso.

Ademas, tambien es importante que la pectina final carezca de contaminantes indeseados, incluyendo la presencia de residuos del acido (y sus sales) que se uso para extraer la pectina. Por tanto, tambien existe la necesidad en la industria de fabricacion de pectina de formas rentables de reducir la presencia residual de los acidos que se anadieron para la extraccion.

En la siguiente descripcion se expondran en parte aspectos adicionales, y en parte seran obvios a partir de la descripcion, o se pueden aprender mediante la practica de los aspectos que se describen mas adelante. Las ventajas descritas mas adelante se realizaran y conseguiran por medio de los elementos y combinaciones destacadas particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que, tanto la descripcion general anterior como la descripcion detallada siguiente, son solo ejemplos y explicaciones, y no son restrictivas.

Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 es una ilustracion esquematica de un sistema para extraer pectina segun una realizacion concreta.

La Fig. 2 es una ilustracion esquematica de un sistema convencional para extraer pectina.

La FIG. 3 es un grafico que ilustra el contenido en calcio de la pectina en funcion de la dosis de acido oxalico. La FIG. 4 es un grafico que ilustra el efecto del pH sobre el rendimiento de extraccion de pectina.

La FIG. 5 es un grafico que ilustra la viscosidad intrrnseca de la pectina extrafda en funcion del pH.

La FIG. 6 es un grafico que ilustra la dosis de acido oxalico y el rendimiento de la pectina en el porcentaje de la piel. La FIG. 7 es un grafico que ilustra el producto (rendimiento en pectina por la viscosidad intrrnseca de la pectina) en funcion de la dosis de acido oxalico.

Descripcion detallada

Las realizaciones de la presente invencion se refieren a metodos para la extraccion de pectinas de alta calidad a partir de materiales vegetales que contienen pectina usando acido oxalico para la extraccion del material que contiene pectina de acuerdo con las reivindicaciones. Generalmente se describe, un procedimiento para extraer pectina que tiene un elevado grado de polimerizacion que comprende: anadir acido oxalico y/o oxalato soluble en agua a una suspension acuosa de una cascara en una cantidad suficiente para proporcionar una mezcla que tenga un pH de entre 3,0 y 3,6 y una molaridad total de oxalato superior a una molaridad total de calcio (II) en la cascara; calentar la mezcla a una temperatura de aproximadamente 50 a aproximadamente 80°C durante 0,5 horas a 5 horas; poner en contacto la mezcla que contiene la pectina extrafda con una resina de intercambio cationico, y separar la pectina extrafda de la mezcla mediante la precipitacion de la pectina extrafda de la mezcla, en donde la pectina extrafda tiene un grado de esterificacion (DE, de sus siglas en ingles) de al menos 72 medido mediante valoracion, y un alto grado de polimerizacion como se caracteriza mediante una viscosidad intrrnseca mayor de aproximadamente 6,5 dL/g como se determina empleando una cromatograffa de exclusion por tamano (SEC).

Los materiales vegetales que contienen pectina son bien conocidos en la tecnica e incluyen materiales frescos y procesados, asf como restos vegetales. Deseablemente, el material vegetal que contiene pectina es una fruta, ejemplos no limitantes de las cuales incluyen frutas con hueso, tales como melocotones, pomaceas, tales como manzanas, y cftricos, tales como limas, limones, naranjas y pomelos. El material se puede preparar para la extraccion usando cualquier medio adecuado y cualquier porcion adecuada del material vegetal que contiene pectina, por ejemplo, mediante extraccion de zumo, pelado, picado en trozos, trituracion o molienda del material vegetal o porciones del mismo que contiene pectina. El material vegetal que contiene pectina es la piel de la fruta. La piel de la fruta de un cftrico, como se usa en la presente memoria, quiere decir el exocarpo, el mesocarpio y los sacos de zumo (sacos de pulpa) que quedan despues de extraer el zumo de la fruta. En realizaciones alternativas, el material vegetal que contiene pectina es una o mas porciones de la piel de la fruta (p. ej., el mesocarpio, las fracciones del mesocarpio, los sacos de zumo, o combinaciones de los mismos).

El acido oxalico y/o el oxalato soluble en agua se anaden a una disolucion acuosa de los materiales vegetales que contienen pectina. Los materiales vegetales que contienen pectina generalmente estan presentes en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 5% en peso de la mezcla. El acido oxalico y/o el oxalato soluble en agua estan presentes en una cantidad de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 g por kg de material seco del material vegetal que contiene pectina. La mezcla tiene un pH entre 3,0 y 3,6, un pH entre 3,1 y 3,4, o un pH entre 3,2 y 3,3. La mezcla tambien tiene la molaridad total de oxalato superior a la molaridad total de calcio (II). Los expertos en la tecnica apreciaran que junto con el acido oxalico y/o el oxalato soluble en agua, el pH de la mezcla se puede modificar con la adicion de cantidades minoritarias de bases adecuadas (p. ej, NaOH) o acidos (p. ej., acido mtrico) usando metodos conocidos en la tecnica.

A continuacion, se extrae la pectina de los materiales vegetales que contienen pectina calentando la mezcla a una temperatura de aproximadamente 50 a aproximadamente 80°C. Durante la extraccion de la pectina, la mezcla, deseablemente, se agita suavemente y/o se agita usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica. En realizaciones concretas, la mezcla se calienta hasta una temperatura de aproximadamente 60 a aproximadamente 80°C o a una temperatura de aproximadamente 70 a aproximadamente 80°C. Aunque el rendimiento aumenta generalmente con el tiempo de extraccion, preferiblemente el tiempo se minimiza para reducir cualquier perdida en el grado de polimerizacion en la pectina que se esta extrayendo. El tiempo para extraer la pectina es de 0,5 horas a 5 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 3 horas, o de aproximadamente 1,5 horas a aproximadamente 2,5 horas.

Tras la extraccion de la pectina de los materiales vegetales que contienen pectina, los solidos insolubles (es decir, el residuo del material vegetal que contiene pectina) se puede eliminar de la mezcla de la pectina extrafda usando cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante una o mas etapas de filtracion (p. ej., filtracion gruesa y/o filtracion fina). La pectina extrafda puede precipitarse despues de la mezcla, por ejemplo, vertiendo el extracto en una cantidad eficaz de alcohol. Alcoholes utiles incluyen, pero no se limitan a, cualquier alcohol que sea compatible con aplicaciones alimentarias y que precipite de forma eficaz las pectinas y disuelva los materiales solubles en alcohol. En realizaciones concretas, los alcoholes son alcohol isopropflico, propanol, etanol o metanol. Tras la precipitacion, la pectina extrafda se puede separar de la disolucion y lavar con alcohol para eliminar todas las impurezas solubles en alcohol posibles. Despues, la pectina se puede desecar y procesar en un polvo o modificar adicionalmente (p. ej., desesterificar y/o amidar) usando metodos conocidos en la tecnica.

Los residuos se pueden eliminar de la pectina extrafda bien antes o despues de su separacion de la mezcla alcoholagua. Dichos residuos incluyen, por ejemplo, cantidades pequenas de los residuos de acido oxalico y de oxalato que se usaron para la extraccion. Aunque generalmente se acepta una presencia moderada de acidos convencionales (p. ej., acido mtrico) usados en los procedimientos de extraccion, es probable que los residuos de acido oxalico solo se permitan en cantidades muy bajas debido a la falta de uso regulador previo y de evaluacion en la produccion de pectina comercial. Por tanto, es deseable eliminar los residuos de acido oxalico y de oxalato calcico de la pectina extrafda. Por consiguiente, el procedimiento comprende ademas exponer la disolucion de pectina extrafda a una resina de intercambio cationico antes de separar la pectina extrafda de la disolucion, reduciendo de este modo significativamente los residuos de oxalato y de calcio en la pectina extrafda final. Ejemplos no limitantes de resinas de intercambio cationico adecuadas incluyen Lewatit® S1668 y Lewatit® S1468 (Lanxess Deutschland GmbH, Leverkusen, Alemania), Purolite® C100E (Purolite International Ltd., Llantrisant, Reino Unido), y Amberlite® SR1L Na (Rohm and Haas, Filadelfia, Pensilvania). La disolucion de pectina extrafda puede estar a cualquier temperatura adecuada y se puede calentar o enfriar segun sea necesario. Por ejemplo, en realizaciones la disolucion de pectina extrafda esta a una temperatura de aproximadamente 55 a aproximadamente 70°C.

Las pectinas obtenidas usando los procedimientos proporcionados en la presente memoria tienen un mayor grado de esterificacion (DE) y un mayor grado de polimerizacion (DP) de acuerdo con las reivindicaciones mientras que se extraen en un rendimiento mas alto que en los procedimientos convencionales. Deseablemente, la pectina extrafda tiene un grado de esterificacion superior o igual a 75, y un grado de polimerizacion que se caracteriza por una viscosidad intrmseca mayor de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9 dL/g. En realizaciones concretas, la pectina extrafda tiene un grado de esterificacion de al menos 76, al menos 77, o al menos 78, y un grado de polimerizacion que se caracteriza por una viscosidad intrmseca de al menos 7,0 dL/g, al menos 7,5 dL/g, al menos 7,8 dL/g, o al menos 8,0 dL/g.

No obstante, los expertos en la tecnica apreciaran que las propiedades de la pectina dependen de la especie de material vegetal, la madurez del material vegetal, y del plazo antes del procesamiento del material vegetal. Por ejemplo, en una realizacion la pectina extrafda de una piel de limon de alta calidad tiene un grado de esterificacion de aproximadamente 75-78 y una viscosidad intrmseca de aproximadamente 9 dL/g (en comparacion con un grado de esterificacion de 74-76, y una viscosidad intrmseca de aproximadamente 7,5 dL/g cuando se extrae usando procedimientos convencionales). No obstante, en otra realizacion, la pectina extrafda de un material vegetal de baja calidad tiene un grado de esterificacion superior a 73 y una viscosidad intrmseca superior de aproximadamente 6,5 dL/g.

Los procedimientos proporcionados en la presente memoria deseablemente tambien proporcionan un rendimiento mas alto por piel que los procedimientos convencionales de extraccion de la pectina. En realizaciones concretas, el rendimiento por piel es superior a aproximadamente 23, superior a aproximadamente 25, o superior a aproximadamente 27. Los expertos en la tecnica apreciaran, no obstante, que el rendimiento previsto depende de la calidad de la materia prima y de las variaciones naturales de la materia prima.

El rendimiento por piel puede aproximarse con la formula siguiente:

Yp % = 0,1- ys ■ M/Wp

en la que Yp es el rendimiento por piel en %, ys el rendimiento de la disolucion (extracto lfquido) en g/kg, M es la masa total de la mezcla de extraccion justo antes de la filtracion, y W^pes el peso de la piel que se uso para la mezcla de extraccion. Los expertos en la tecnica apreciaran que este calculo del rendimiento por piel solo es una aproximacion porque ignora que una parte minoritaria de la masa total de la mezcla de extraccion no se disuelve y, por tanto, representa un volumen dentro del cual la pectina disuelta no se distribuye.

En realizaciones concretas, el valor de los procedimientos proporcionados en la presente memoria se caracteriza por el producto del rendimiento por piel y la viscosidad intrmseca. Deseablemente, el producto del rendimiento por piel y la viscosidad intrmseca de las pectinas obtenidas mediante los procedimientos proporcionados en la presente memoria es superior al del producto del rendimiento por piel y la viscosidad intrmseca de las pectinas obtenidas mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, en realizaciones concretas el producto del rendimiento por piel y la viscosidad intrmseca de las pectinas es superior a aproximadamente 160, superior a aproximadamente 165, superior a aproximadamente 175, o superior a aproximadamente 185.

El procedimiento anterior mejora los procedimientos de extraccion de pectina de la tecnica anterior proporcionando un procedimiento que (1) consigue una viscosidad baja durante la filtracion reduciendo, ademas, la perdida del grado de polimerizacion de pectina; (2) elimina el Ca++ reduciendo, ademas, la necesidad de regenerar la resina de intercambio ionico; (3) aumenta el rendimiento de pectina en comparacion con la cantidad de materia prima gastada reduciendo, ademas, el grado de polimerizacion; (4) reduce la cantidad de agua que necesita eliminarse de la pectina extrafda; y (5) reduce los residuos en el producto final del acido anadido para la extraccion.

Sin desear estar sujeto a teona alguna, se cree que el procedimiento proporcionado en la presente memoria consigue estos resultados deseables en parte mediante un equilibrio espedfico de la seleccion del medio de extraccion (acido oxalico), el pH y la temperatura. Ademas, se cree que la precipitacion de una porcion mayoritaria de los iones de Ca++ como oxalato calcico reduce la tendencia de la pectina disuelta a hacerse viscosa en presencia de iones de Ca++, reduciendo de este modo la viscosidad de la mezcla durante la filtracion y reduciendo el acido oxalico residual en el producto final. La combinacion de un buen rendimiento y una baja viscosidad hace tambien posible operar con una concentracion de pectina relativamente alta en el ffquido filtrado, reduciendo de este modo la cantidad de agua que debe retirarse de la pectina. Por ultimo, la presencia de acido oxalico residual en la pectina final se reduce adicionalmente exponiendo el extracto ffquido de la pectina a una resina de intercambio cationico antes de precipitar la pectina de la disolucion.

Realizaciones de la presente descripcion se ilustran adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse de ningun modo como que imparten limitaciones del alcance de la misma. A menos que se especifique de otra manera, las cantidades a las que se hace referencia en porcentajes (%) son en peso (% en peso).

Ejemplos

Los protocolos siguientes se usaron para analizar el grado de esterificacion (DE), la viscosidad intrmseca (IV), la fuerza, el contenido en calcio residual, y el contenido en oxalato residual en los siguientes Ejemplos.

Protocolo 1: Determinacion del grado de esterificacion

El grado de esterificacion se midio usando el procedimiento establecido en FAO JECFA Monograffas 4 (2007). A 2,00 g de pectina se anadieron 100 mL del alcohol acido (100 mL de IPA al 60% 5 mL de HCl fumante al 37%) en agitacion con un agitador magnetico durante 10 minutos. La mezcla se paso a traves de un embudo Buchner con un papel de filtro y el vaso de precipitacion se aclaro con 90 mL de alcohol acido, y se paso tambien a traves del embudo Buchner con un papel de filtro. Despues, el filtrado se lavo primero con 1.000 mL de IPA al 60% y, despues, con aproximadamente 30 mL de IPA al 100%. Despues, la muestra se seco durante aproximadamente 15 minutos en el embudo Buchner con succion de vado.

Las muestras de pectina que pesaban aproximadamente 0,40 g se midieron para la determinacion por duplicado (la desviacion entre determinaciones duplicadas no debe superar el 1,5% absoluto, en caso contrario se repitio la prueba). Las muestras de pectina se humedecieron primero con aproximadamente 2 mL de IPA al 100%. Despues, a las muestras humedecidas se anadieron aproximadamente 100 mL de agua desionizada en agitacion con un agitador magnetico. Despues, las muestras se evaluaron mediante titulacion, bien por medio de un indicador o usando un pHfmetro/autobureta.

Titulacion usando un indicador. A la muestra se anadieron 5 gotas del indicador fenolftalema y se titulo con NaOH 0,1 M hasta que se observo un cambio de color (regfstrese como fftulo V1). Se anadieron 20,0 mL de NaOH 0,5 M mientras se agitaba y cubna con papel de aluminio durante exactamente 15 minutos. Se anadieron 20,0 mL de HCl 0,5 M en agitacion hasta que desaparecio el color. Se anadieron 3 gotas del indicador fenolftalema y se titulo con NaOH 0,1 M hasta que se observo un cambio de color (regfstrese como tftulo V2). Para compensar las posibles inexactitudes de equilibrar las dos porciones de 20 mL de NaOH 0,5 M y HCl 0,5M, respectivamente, se realizo la denominada "medicion enmascarada" (es decir, 100 mL de agua desionizada se trato del mismo modo que la disolucion de la muestra, incluidas las titulaciones). El ultimo resultado de titulacion se registro despues como tftulo B1. El grado de esterificacion se caracterizo despues mediante los calculos siguientes.

Vt = V1 (V2 -B1)

% DE (grado de esterificacion) = [(V2 - B1)/Vt] * 100

Protocolo 2: Determinacion de la viscosidad intrmseca

Las muestras se prepararon usando un modulo disolvente/muestra Viscotek GPC max VE 2001 GPC o muestreador automatico AS 3500 a menos que se supiera que las muestras conteman material no soluble (en cuyo caso, las muestras se prepararon manualmente). Se determino despues el peso molecular, la viscosidad intrmseca, y la distribucion del peso molecular de la pectina en las muestras usando cromatograffa de exclusion por tamano (SEC). Las moleculas se separaron segun su tamano mediante cromatograffa de permeacion en gel, pasando el efluente de la columna cromatografica tres detectores (RI, RALLS y un detector de la viscosidad). El programa informatico Viscotek convirtio las senales del detector en peso molecular y viscosidad intrmseca, y calculo los promedios ponderados para toda la poblacion.

Equipo: Viscotek TDA 302 triple detector o TDA 305; modulo disolvente/muestra Viscotek GPC max VE 2001 GPC o muestreador automatico AS 3500; modulo para preparacion de muestras; balanza Metler Toledo y Microlab. 500 dispensador; modulo de calentamiento/agitacion Pierce Reacti-Therm III; Columnas: BioBasis SEC60 (300 x 7,8), SEC120 (300 x 7,8), SEC300 (300 x 7,8), SEC1000 (300 x 7,8), todas de Thermo, o Shodex guard SB400 G-8B, SB401-8F, SB402,5-8F, SB403-8F, SB404-8F; o en FIPA fijadas con CPkelco Special (SuperDex Peptid de GE Health Care) o BioBasis SEC60 (150 x 7,8) de Thermo; detector RALLS (detector de la dispersion de la luz laser en angulo recto); detector LALLS (detector de la dispersion de la luz laser en angulo bajo); detector RI (mdice de refraccion); Detector viscosfmetro; programa informatico: OmniSEC.

Preparacion manual de la muestra: Las muestras que se sabfa que conteman material no soluble se disolvieron a mano y se centrifugaron (10.000 G durante 10 minutos) y el sobrenadante se transfirio a un nuevo vial antes de la inyeccion.

Preparacion de la muestra usando el modulo de preparacion de muestras, la balanza Metier Toledo y Mikrolab. Dispensador 500 y el modulo de calentamiento/agitacion Pierce Reacti-Therm III: En el programa informatico omniSEC se uso el programa SASP para preparar las muestras antes del analisis. La proporcion cantidad/capacidad fue aproximadamente 30 mg de polvo a 15 ml de eluyente (2 mg por ml) en viales de 20 ml. Despues de preparar la muestra, los viales se introdujeron durante 30 minutos a 70°C en el modulo de agitacion y calentamiento.

Preparacion de la muestra usando la balanza y el modulo de calentamiento/agitacion usando el muestreador automatico 3500: Se peso aproximadamente 2,0 mg de pectina en un vial del muestreador automatico y se introdujo en la gradilla del muestreador automatico. Usando el molde 4 del muestreador automatico AS3500, se usaron las siguientes unidades: Ciclos de dilucion: 3; Calentador: ON de encendido; Temp 70°C; Cargar 20 pl de disolvente S-1 (S-1 = etanol al 96%); Anadir 10 pl a la muestra; Cargar 1.500 pl de disolvente S-2 (S-2 = tampon de Li-acetato 0,3 M); Anadir 1.300 pl a la muestra (disolucion de 0,1% de pectina -1 mg/ml); Mezclar durante 9,9 minutos; Mezclar durante 9,9 minutos; Esperar durante 10,0 minutos; Activar recubrimiento: Sf (inicia la siguiente preparacion de la muestra antes del final del analisis para pasar la muestra). El tiempo de recorrido en el muestreador automatico se fijo en 50 minutos y se usaron 100 pl de inyeccion de bucle completo. Cuando se uso el muestreador automatico, la muestra se filtro automaticamente con un filtro en lmea de 0,5 pm colocado despues del bucle del muestreador automatico.

Protocolo 3: Determinacion de la fuerza de la pectina (metodo de YogSimBuf)

Tampon YOG SIM BUF a pH 3,75 (2.000 mL). Se preparo un tampon disolviendo 13,03 g de lactato calcico (C⁶H-i⁰O⁶Ca, 5*H2O), 2,79 g de hidrogenofosfato dipotasico (K²HPO⁴), 2,00 g de benzoato sodico, 2,03 g de dihidroxido fosfato potasico (KH²PO⁴), 40,00 g de lactosa (C¹²H²²O¹¹), 300,00 g de sacarosa (C¹²H²²O¹¹). Se pesaron 7,23 g de acido lactico (90%) y se anadieron a la disolucion, y el vaso de precipitados se aclaro con agua de intercambio ionico. Por ultimo, se disolvieron 0,43 g de hidroxido sodico (NaOH) en el matraz y la disolucion se diluyo hasta 2.000 ml con agua desionizada. El pH de la disolucion tampon se ajusto anadiendo acido cftrico hasta obtener una lectura de pH de 3,68 ± 0,02, que tuvo como resultado un pH de 3,75 ± 0,05 en el sistema tamponpectina final. Esta disolucion tampon fue estable hasta la precipitacion.

Disolucion madre de pectina (1,2%) (100 mL). Se preparo una disolucion madre de pectina humedeciendo 1,20 g de pectina con 5,00 ml de IPA al 100% en un matraz. Mientras se agitaba, al matraz se anadieron 95 ml de agua desionizada hirviendo (>85°C) y la mezcla se introdujo en un bano de agua/calentador de bloque a 75°C durante 30 minutos en agitacion. La disolucion se enfrio a temperatura ambiente y se anadio agua desionizada para diluir la disolucion hasta 100,0 g.

La disolucion tampon, la disolucion madre de pectina y el agua desionizada se mantuvieron a una temperatura de 23 ± 2°C. La disolucion madre de pectina se diluyo con agua desionizada segun la siguiente tabla.

A la disolucion de pectina diluida se anadieron 15 ml del tampon mientras se agitaba a una velocidad suficiente para proporcionar un vortice de aproximadamente 1 cm durante un total de 25 segundos. Despues de 1 minuto, la disolucion se analizo usando un Brookfield LVT con un adaptador a 6 rpm (factor 1). La disolucion pectina-tampon tambien se evaluo visualmente para caracterizar su aspecto (es decir, presencia o ausencia de grumos de gel, aspecto no homogeneo, etc.). El procedimiento se repite a varias diluciones hasta que se identifican los siguientes puntos de datos: (1) una concentracion con una viscosidad entre 18-25 mPas, y (2) una concentracion entre 25 y 35 mPas. La lectura era valida si el pH de las disoluciones entre 25 y 35 mPas estaba entre 3,70 y 3,80.

El resultado en bruto despues de seguir el procedimiento anterior consistio en dos puntos de datos (c-i, n-i) y (c², n²) con los que 18 mPas < n < 25 mPas y 25 mPas < n²< 35 mPas. El resultado del metodo, c-f, se calculo del siguiente modo, siempre que las viscosidades se introdujeran en la unidad mPas:

c f = c1 (c2-c1)(ln(25/ n1))/(ln(n2 /n1))

Protocolo 4: Determinacion del contenido de calcio residual

Se usaron aproximadamente 0,5 g de pectina extrafda para evaluar la presencia de calcio residual. Las muestras se digirieron con acido mtrico (65%) y peroxido de hidrogeno (30) en un digestor de horno microondas como se prescribe en el manual. Despues de la digestion, los recipientes de reaccion se dejaron enfriar en una campana extractora. Despues, las muestras se transfirieron a un matraz de medicion de 50 mL. Al medir el calcio residual, fue necesario anadir cloruro de cesio para evitar interferencias (1 mL de disolucion de CsCl al 2,5% por 10 mL de disolucion para preparar la disolucion de aproximadamente 2.000 ppm en Cs). La concentracion del acido (HNO³) en las disoluciones de medicion fue de 3% a 10%. La intensidad de emision de las muestras se midio despues. Si no estaban dentro de la intensidad de emision de los estandares, las muestras se diluyeron adecuadamente.

Protocolo 5: Determinacion del contenido de oxalato residual

Se usaron aproximadamente 0,2 g de pectina extrafda para evaluar la presencia de oxalato residual. A la pectina extrafda se anadio 2-propanol (1 mL) y la mezcla se agito hasta que se humedecio la pectina. Despues se anadio agua desionizada Milli-Q (40 mL) mientras se agitaba. Las muestras se calentaron a 90°C en un frasco cerrado durante entre 30 y 60 minutos, y despues se enfriaron a temperature ambiente. Despues, las muestras se evaluaron empleando cromatograffa HPLC (Aparato: Waters TM600 con detector del mdice de refraccion y detector de conductividad; Flujo: 1,4 mL/minuto; Temperatura: 40°C; Inyeccion: 100 o 200 mL de bucle completo; Eluyente: NaHCO³0,85 mM Na²CO³0,9 mM en agua desionizada).

La respuesta cuantitativa del detector de conductividad al acido oxalico que pasa por el detector se cuantifico como el area (la "respuesta del detector integrada") en un diagrama (eje x = tiempo, eje y = respuesta del detector). La respuesta del detector integrada se delimito por una lrnea basal recta antes y despues del pico de acuerdo con las practicas y convenios habituales en la tecnica. Las respuestas del detector integradas de las muestras desconocidas se compararon despues con una curva de calibracion lineal de las respuestas del detector integradas de muestras conocidas de dihidrato de acido oxalico en agua desionizada (eje x = concentracion, eje y = respuesta del detector integrada), y la correspondiente concentracion de acido oxalico se dedujo a partir de la curva de calibracion lineal. Ejemplo 1

Se extrajo pectina de limon de una piel de limon desecada de la provincia argentina de Tucuman. La fruta se recolecto en 2009, tras lo cual la fruta se abrio y se uso para la produccion de zumo de cftricos y de aceite de cascara de cftricos. Despues los restos de la fruta se trituraron y se lavaron varias veces en agua para extraer una gran parte de los materiales solubles naturales, como sacarosa, y despues se secaron. Estas operaciones rutinarias fueron realizadas por el proveedor de la cascara.

La cascara de limon se uso despues en un procedimiento de extraccion de ejemplo (ilustrado en la Figura 1) para extraer pectina de la cascara de limon. La cascara de limon seca (1.000 g) se suspendio en una mezcla de 20 L de agua, 30,0 g de acido oxalico dihidrato, y 2,90 g de NaOH. Esta mezcla se incubo con agitacion muy suave durante 60 minutos a 72,5°C (“Mezcla A”). Despues, la mezcla A se diluyo con una suspension de 400 g de celulosa de madera (un adyuvante de filtracion insoluble) en 20 L de agua caliente, y se continuo la incubacion y la agitacion suave durante 60 minutos a 75,0°C (“Mezcla B”). Despues la Mezcla B se vertio en un embudo Buchner a traves de una tela filtrante para separar la disolucion (“Disolucion C”) de los materiales que no se disolvieron (que junto con la disolucion que no se pudo separar se denomina como “Mezcla D”).

Despues, la Disolucion C se filtro adicionalmente a traves de un lecho de Filtercel 450 (un adyuvante de filtracion para eliminar la turbidez) y se agito con resina de intercambio ionico Lewatit. La disolucion obtenida despues de drenar la resina (“Disolucion E”) se vertio en aproximadamente tres partes (es decir, tres veces su propio volumen) de 80% de 2-propanol. El precipitado se prenso para eliminar la mayor cantidad posible de alcohol gastado, y despues se lavo en una mezcla de 60% de 2-propanol y 40% de agua antes de volverlo a prensar. El volumen de la mezcla usado para lavar el precipitado fue aproximadamente el mismo que el volumen de la Disolucion E. Tras los lavados, el precipitado se seco, se molio y se tamizo a traves de un tamiz de polvo de 250 p de tamano de poro. El pH de una aftcuota de la Mezcla B fue 3,52 despues de enfriar a 25°C. La cantidad de pectina seca que se pudo aislar por kg de Disolucion E fue 5,71 g. En el presente ejemplo, la masa total de la mezcla de extraccion justo antes de la filtracion, el peso de la piel usada para la mezcla de extraccion, y el rendimiento por piel se calcularon del siguiente modo:

M = 1+20+0,03+0,0029+0,400+20 kg = 41,4 kg.

Wp = 1 kg.

Yp % = 0,15,71 41,4/1 = 23,6

La pectina tambien se analizo en el laboratorio para determinar el grado de esterificacion (DE) y la viscosidad intrmseca (IV) (Protocolos 1 y 2 descritos anteriormente, respectivamente). La pectina terna un DE = 76,4 y IV= 7,83 dL/g. El producto del rendimiento por la viscosidad intrmseca, que proporciona una metrica mas relevante para el valor, fue 186.

Ademas, la fuerza de la pectina se midio usando el metodo YogSimBuf, que expresa la concentracion de pectina a la que la disolucion alcanza una viscosidad de 25 mPas. (Protocolo 3 descrito anteriormente). El YogSimBuf (YSB) para la pectina extrafda de la piel de limon fue 2,51 g/L.

Ejemplo 2 (Comparativo)

La misma piel de limon descrita en el Ejemplo 1 se uso en un procedimiento de extraccion de pectina convencional (ilustrado en la Figura 2). La piel de limon seca (1.000 g) se suspendio en una mezcla de 30 L de agua y 15 mL de 62% de acido nftrico, y se incubo con agitacion muy suave durante 30 minutos a 72,5°C (“Mezcla F”). A la Mezcla F se anadieron 50 ml adicionales de 62% de acido nftrico y la incubacion a 72,5°C se continuo durante 120 minutos (“Mezcla G”). La Mezcla G se diluyo con 10 L de agua caliente mas 400 g de celulosa de madera y se incubo durante 30 minutos a 75°C (“Mezcla H”). Despues la Mezcla H se vertio en un embudo Buchner a traves de una tela filtrante para separar la disolucion (“Disolucion I”) de los materiales que no se disolvieron (que junto con la disolucion que no se pudo extraer por prensado de los materiales se denomina “Mezcla J”).

Despues, la Disolucion I se filtro adicionalmente a traves de un lecho de Filtercel 450 (un adyuvante de filtracion para eliminar la turbidez) y se agito con resina de intercambio ionico Lewatit. La disolucion obtenida despues de drenar la resina (“Disolucion K”) se vertio en aproximadamente tres partes (es decir, tres veces su propio volumen) de 80% de 2-propanol. El precipitado se prenso para eliminar la mayor cantidad posible de alcohol gastado, y despues se lavo en una mezcla de 60% de 2-propanol y 40% de agua antes de volverlo a prensar. El volumen de la mezcla usado para lavar fue aproximadamente el mismo que el volumen de la Disolucion K. Tras los lavados, el precipitado se seco, se molio y se tamizo a traves de un tamiz de polvo de 250 p de tamano de poro.

El pH de una alfcuota de la Mezcla H fue 2,05 despues de enfriar a 25°C. La cantidad de pectina seca que se pudo aislar por kg de Disolucion K fue 5,95 g. Usando los mismos sfmbolos y formula que en el Ejemplo 1, la masa total de la mezcla de extraccion justo antes de la filtracion y el rendimiento por piel se calcularon del siguiente modo:

M = 30+1+0,015+0,050+0,4+10 = 41,5

Yp = 24,7.

Tanto el DE como la IV se midieron usando los mismos protocolos descritos anteriormente. La pectina tema un DE = 74,6 y una IV = 6,59 dL/g. El producto del rendimiento por la viscosidad intrmseca fue 163 (solo el 88% del Ejemplo 1). El YogSimBuf se calculo como 3,24 g/L, lo que sugiere que la fuerza de la pectina extrafda usando el procedimiento convencional era solo el 77% de la del Ejemplo 1 (teniendo en cuenta que “bajo” significa “fuerte”). Ejemplo 3

Se uso el mismo metodo descrito en el Ejemplo 1 para evaluar el efecto de la dosis de acido oxalico, el pH y la temperatura durante la extraccion de la piel de limon. Se realizo una serie de 24 experimentos similares en los que la dosis de acido oxalico dihidrato se modifico a cuatro niveles (15, 20, 25, y 30 g por kg de piel desecada) y el pH previsto se modifico a tres niveles (2,70, 3,00 y 3,30) anadiendo bien acido nftrico o hidroxido sodico junto con el acido oxalico. Sin embargo, los valores de pH que realmente se consiguieron fueron ligeramente diferentes de los valores previstos (vease mas adelante). Ademas, la temperatura se modifico a dos niveles (70 y 80°C).

En todos los experimentos, 1.000 g de la piel desecada obtenida de la misma fuente que en los Ejemplos 1 y 2 se suspendieron con las cantidades especificadas de otros ingredientes en 20 L de agua durante 60 minutos a la temperatura estipulada. La mezcla se diluyo con 20 L mas de agua y se incubo durante 60 minutos a la misma temperatura y, por ultimo, se filtro y analizo como se describe en el Ejemplo 1, excepto que el extracto no se puso en contacto con una resina de intercambio ionico (es decir, que la pectina producida en el Ejemplo 3 contema mas calcio residual que la de los Ejemplos 1 y 2). El calcio total, mg/g, en la pectina se determino usando el Protocolo 4, descrito anteriormente.

Las condiciones experimentales y los resultados se resumen a continuacion:

Estos resultados se pueden entender mejor en forma grafica, como se expone en las Figuras 3-7 y como se describe mas adelante.

La Figura 3 muestra el contenido en calcio de las muestras de pectina experimentales en funcion de la dosis de acido oxalico en g de (COOH⁾²■ 2 H²O, M = 126,1 por kg de piel. Sin desear quedar ligado a ninguna teona, se cree que porque la piel contema 8,0 mg de Ca++ por gramo de piel, el equilibrio estequiometrico entre acido oxalato y calcio debe ocurrir en la dosis de 25,2 g de dihidrato de acido oxalico. Lo que se observo fue que cuanto mas acido oxalico se uso para la extraccion, menos calcio residual se encontro en las correspondientes muestras de pectina hasta el equilibrio despues de superar un equilibrio estequiometrico. En particular, se encontro menos calcio en la pectina extrafda a 80°C, probablemente porque el rendimiento en pectina fue mayor a esta temperatura en comparacion con 70°C y, por lo tanto, el calcio residual se mezclo con una cantidad relativa mayor de pectina a la temperatura mas alta.

La Figura 4 muestra el efecto del pH sobre el rendimiento de extraccion en curvas individuales para las ocho posibles combinaciones de las cuatro dosis de acido oxalico y las dos temperaturas. Como se puede observar en la ilustracion grafica, el rendimiento no dependfa mucho del pH de extraccion dentro de los intervalos de pH y la dosis de acido oxalico que se ensayaron en esta serie de experimentos. No obstante, hubo una tendencia pronunciada a que el rendimiento sea superior a 80°C que a 70°C. El rendimiento tambien tendfa a ser mayor a mayores dosis de acido oxalico en comparacion con las menores. Por ejemplo, el rendimiento para la extraccion con 30 mg/g de acido oxalico a 70°C fue superior al rendimiento para 15 mg/g a 80°C.

La Figura 5 muestra la viscosidad intrmseca como funcion del pH con curvas individuales para cada una de las ocho combinaciones de las cuatro dosis y las dos temperaturas. Como se puede ver en la ilustracion grafica, los resultados de viscosidad intrmseca mas altos se obtuvieron a la temperatura de extraccion mas baja. Ademas, de media, las muestras extrafdas al pH mas bajo teman una viscosidad intrmseca menor que las extrafdas al pH mas alto. No obstante, cuando estos datos se interpretan sin considerar los datos de otras investigaciones, la relacion entre el pH y la viscosidad intrmseca es incierta y se puede interpretar de mas de una manera. Sin desear quedar ligada a ninguna teona, se cree que la viscosidad intrmseca puede verse influida por un deterioro termico gradual de la pectina disuelta, asf como por posibles diferencias entre la pectina que se libera voluntariamente y la pectina que solo se libera en las extracciones con un rendimiento alto, respectivamente.

La Figura 6 muestra como parametro independiente la dosis de acido oxalico y como parametro dependiente el rendimiento de la pectina en el porcentaje de piel. El rendimiento mas alto se obtuvo a la dosis de acido oxalico mas alta. No obstante, los datos de la Figura 4 parecen sugerir que el rendimiento es mas un efecto del medio de extraccion (es decir, acido oxalico) que un efecto de acidez (pH).

La Figura 7 muestra el producto del rendimiento por la viscosidad intrmseca en funcion de la dosis de acido oxalico.

El valor del rendimiento aumento con la dosis de acido oxalico y se hizo menos dependiente de la temperatura de extraccion.

Ejemplo 4

Se realizaron otros experimented para evaluar la reduccion del oxalato en la pectina final poniendo en contacto el extracto acuoso con la resina de intercambio cationico. Se empleo el mismo procedimiento como el que se describe en el Ejemplo 1, a excepcion de que la Diolucion C filtrada por Filtercel se dividio en dos porciones aproximadamente iguales, tratandose una porcion con una resina de intercambio ionico Lewaitit como se describe en el Ejemplo 1, y una porcion en la que se omitio el tratamiento con Lewaitit. Ambas disoluciones se trataron despues como se describe para la Disolucion E en el Ejemplo 1. El contenido en calcio y el contenido en oxalato de la pectina final se analizaron posteriormente empleando los Protocolos 4 y 5, respectivamente, cada uno descrito anteriormente.

Como se puede ver en lo anterior, el uso de la resina de intercambio ionico elimino eficazmente el residuo de oxalato de la pectina final.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para extraer pectina que tiene un alto grado de polimerizacion, que comprende: anadir acido oxalico y/o oxalato soluble en agua a una suspension acuosa de una cascara en una cantidad suficiente para proporcionar una mezcla que tenga un pH de entre 3,0 y 3,6 y una molaridad total de oxalato superior a la molaridad total de calcio (II) en la cascara;

calentar la mezcla a una temperatura de aproximadamente 50 a aproximadamente 80°C durante 0,5 horas a 5 horas;

poner en contacto la mezcla que contiene la pectina extrafda con una resina de intercambio cationico, y separar la pectina extrafda de la mezcla precipitando la pectina extrafda de la mezcla, en donde la pectina extrafda tiene un grado de esterificacion (DE) de al menos 72 medido mediante valoracion, y un alto grado de polimerizacion caracterizado por una viscosidad intrmseca superior a aproximadamente 6,5 dL/g como se determina empleando la cromatograffa de exclusion por tamano (SEC).

2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde el pH de la mezcla antes de separar la pectina extrafda de la mezcla esta entre 3,1 y 3,4.

3. El procedimiento segun la reivindicacion 2, en donde la mezcla se calienta a una temperatura de aproximadamente 70 a aproximadamente 80°C durante la separacion de la pectina extrafda.

4. El procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas filtrar la mezcla para eliminar los solidos insolubles despues de extraer la pectina y antes de separar la pectina extrafda.

5. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde la pectina extrafda tiene un contenido de oxalato total inferior a 2,0 mg por 1 g de pectina.

6. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde la pectina extrafda tiene un contenido de calcio total inferior a 1 mg /g.

7. El procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas una o mas de las etapas de lavado, prensado, secado y molienda de la pectina extrafda despues de separar la pectina extrafda para obtener un producto final de pectina.

8. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde el rendimiento por piel (Yp) es superior a aproximadamente 23%, en donde Yp = 0,1ysM/Wp y ys es el rendimiento de la disolucion (extracto lfquido) en g/kg, M es la masa total de la mezcla antes de separar la pectina extrafda, y W^pes el peso de la piel usada en la suspension acuosa.

9. El procedimiento segun la reivindicacion 8, en donde el producto del rendimiento por piel y la viscosidad intrmseca es superior a aproximadamente 165% dL/g.

10. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde la pectina extrafda tiene un grado de esterificacion (DE) de al menos 75.

11. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde la pectina extrafda tiene una viscosidad intrmseca (IV) de al menos 7,8 dL/g.

12. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde la pectina extrafda tiene una viscosidad intrmseca (IV) de al menos 8,5 dL/g.

13. Una pectina producida mediante el procedimiento de la reivindicacion 1, en donde la pectina tiene un grado de esterificacion de al menos 75% y una viscosidad intrmseca de al menos 6,0 dL/g.