JP5740530B2 - ペクチンの抽出方法 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、高品質のペクチンを抽出する方法に関する。具体的には、本発明は、柑橘類の皮からペクチンを抽出するための、抽出中のペクチンの顕著な分解を防止することができる低温抽出方法に関する。

ペクチンは、植物の細胞壁と関連する複合多糖類である。ペクチンは、ラムノース残基によって介在され、中性の糖側鎖並びに非糖成分、例えば、アセチル基、メチル基及びフェルラ酸基にて変性されたα‐１，４結合ポリガラクツロン酸の主査骨格を有する。中性の糖側鎖（例えば、アラビナン及びアラビノガラクタン）は、主査骨格において、ラムノース残基に結合されている。

食品製品、食物繊維及び高等植物の細胞壁の成分としてのペクチンの重要性並びに多くの薬理活性に対する意識の高まりから、ペクチンに関する多大な研究がなされてきた。しかし、現在のペクチンの抽出方法では、そうした用途に足る品質のペクチンを生成することができない。

従来のペクチンの抽出方法では、酸性媒質中で、ペクチン含有植物材料を、亜沸騰温度（約６５−８５℃）で１〜１０時間もの長時間加熱する必要がある。しかし、そうした方法は、滞留時間及びエネルギー所要量が多大であり、また、向流法（すなわち、ｎ個の抽出段階を用いて、生成元の原材料を抽出段階♯１に供し、生成元の純水を段階♯ｎに供し、１＜ｉ＜ｎとすると、任意の段階♯ｉについて、液体はｉ＋１段階から、固体はｉ−１段階から生じる、という方法）を用いて得られるペクチンの収率が中程度（２０〜３０％）にすぎない。上述したように、従来の抽出方法では、酸性条件が攻撃的であり、ペクチンの大部分は酸化条件に繰返し晒されるため、ペクチンはしばしば分解されてしまう。

当業者には理解されるように、コストをなるべく低く抑えるためには、なるべく重合度（ＤＰ）の高いペクチンを抽出することが好適である。固体／液体比率、酸性度、温度等の生成条件の選択は全て、そうした競合する考慮点を生じさせる。例えば、従来方法を用いた場合、抽出条件を攻撃的なものにしない限り、適度に高い収率さえも達成できない。また、抽出後の固体及び液体はなるべく完全に分離する必要がある。なぜなら、分離後も固体に維持されたままの流体は、（向流抽出の手順により）攻撃的な抽出条件に再び晒されることになるためである。一方、なるべく完全に分離するためには、液体の粘度を好適には低下させる必要があり、これは、高温分離、低い固体／液体比率での分離又はそれら両方の組合せにより実現できる。しかし、低ｐＨと高温とを組合せた使用は、ペクチン品質（例えば、重合度）に不利な影響を与える。また、アルコール蒸発又はアルコール蒸留によって、より大量の水をペクチンから除去する必要が生じるため、低い固体／液体比率は逆にコストがかかる。したがって、抽出ペクチンの品質を損なうことなくペクチンを抽出するための費用効果的な方法が今なお必要とされている。

また、最終的に得られるペクチンに、ペクチン抽出に用いた酸（及びその塩）のあらゆる残留物を含む不要な混入物質が含まれないことも重要である。したがって、ペクチン製造業界では、抽出のために加えた酸の残留物を低減する費用効果的な方法も必要とされている。

さらなる態様について、以下、本明細書で部分的に説明する。ただし、これらの態様は、本明細書の記載から明らかであるか、又は、以下に説明する態様の実施から理解されるだろう。以下に説明する利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に記載された要素及び組合せを用いて実現及び実施することができる。上述した一般的な説明及び後述する詳細な説明はいずれも、例示及び説明だけを目的としており、限定を意図するものではない。

一実施形態に従った、ペクチン抽出システムを示す概略図である。 従来のペクチン抽出システムを示す概略図である。 ペクチンのカルシウム含有量を、シュウ酸の用量の関数として示すグラフである。 ペクチンの抽出収率に及ぼすｐＨの作用を示すグラフである。 抽出ペクチンの固有粘度をｐＨの関数として示すグラフである。 シュウ酸の用量と、皮の百分率で示されるペクチンの収率とを示すグラフである。 （ペクチン収率とペクチン固有粘度との）積をシュウ酸用量の関数として示すグラフである。

本発明の実施形態は、シュウ酸を用いてペクチン含有材料を抽出することにより、ペクチン含有植物材料から高品質のペクチンを抽出する方法に関する。概略的には、高重合度のペクチンを単一段階抽出にて抽出する方法は、ペクチン含有植物材料の水性懸濁液を調製するステップと、上記水性懸濁液に、シュウ酸及び／又は水溶性シュウ酸塩を、ｐＨが３．０〜３．６であり、シュウ酸塩の全モル濃度がカルシウム（ＩＩ）の全モル濃度より高い混合物を得るのに十分な量で加えるステップと、上記混合物を、上記ペクチン含有植物材料からペクチンを抽出するのに十分な時間、約５０〜約８０℃の温度まで加熱するステップと、上記混合物から上記抽出ペクチンを分離するステップとを含む。好適には、上記抽出ペクチンは、エステル化度（ＤＥ）が７２以上であり、約６ｄＬ／ｇ超の固有粘度により特徴付けられる高重合度のペクチンである。

ペクチン含有植物材料は、当技術分野で周知であり、生鮮材料及び加工材料並びに植物残渣を含む。好適には、ペクチン含有植物材料は、果実であり、限定的ではないが、例として、桃といった核果類、林檎といった仁果類並びにライム、レモン、オレンジ及びグレープフルーツといった柑橘類が挙げられる。この材料は、任意の適切な手法及びペクチン含有植物材料の任意の適切な部分を用いて、例えば、ペクチン含有植物材料又はその一部の汁を絞る、皮を剥く、粗く切断する、粉砕する又は研削することにより、抽出用に調製される。具体的な実施形態において、ペクチン含有植物材料は果実の皮である。なお、本実施形態で用いられる柑橘果実の果皮は、果実の汁を絞った後に残るフラベド、アルベド及び果汁の袋（果肉の袋）を意味する。他の実施形態において、ペクチン含有植物材料は果皮の１つ又は複数の部分（例えば、アルベド、アルベドのいくつかの部分、果汁の袋又はそれらの組合せ）である。

実施形態においては、シュウ酸及び／又は水溶性シュウ酸塩をペクチン含有植物材料の水溶液に加える。ペクチン含有植物材料は、概して、混合物の約２〜５質量％の量で存在する。シュウ酸及び／又は水溶性シュウ酸塩は、ペクチン含有植物材料の乾燥材料１ｋｇあたり約２０〜５０ｇの量で存在する。好適には、混合物は、３．０〜３．６、３．１〜３．４又は３．２〜３．３のｐＨを有する。また、好適には、混合物は、カルシウム（ＩＩ）の全モル濃度より高いシュウ酸塩の全モル濃度を有する。当業者には理解されるように、シュウ酸及び／又は水溶性シュウ酸塩と同様に、混合物のｐＨは、当技術分野で知られた方法を用いて、適切な塩基（例えば、ＮａＯＨ）又は酸（例えば、硝酸）を少量加えることによって変化させることができる。

それから、混合物を、ペクチンを抽出するのに十分な時間、約５０〜約８０℃の温度まで加熱することによって、ペクチン含有植物材料からペクチンを抽出する。ペクチン抽出中、当技術分野で知られた方法を用いて徐々に混合物を攪拌及び／又は混合することが好適である。ある実施形態においては、約６０〜約８０℃の温度又は約７０〜約８０℃の温度まで混合物を加熱する。一般的に、収率は抽出時間と共に増加するが、抽出中のペクチンの重合度の低下を低減するために、抽出時間を最小限とすることが好適である。したがって、ある実施形態においては、ペクチンを抽出するのに十分な時間は、約０．５〜約５時間、約１〜約３時間又は約１．５〜約２．５時間である。

ペクチン含有植物材料からペクチンを抽出後、任意の適切な手法、例えば、１つ又は複数のろ過ステップ（例えば、粗ろ過及び／又は精密ろ過）を用いて、抽出ペクチンの混合物から不溶性固形物（すなわち、ペクチン含有植物材料の残渣）を除去することができる。それから、例えば、抽出物を有効量のアルコールに注入することによって、抽出ペクチンを混合物から沈殿させる。有用なアルコールとして、以下に限定されないが、食品用途に適合性があり、かつ、ペクチンが効果的に沈殿すること及びアルコール溶性材料を溶解することが可能な任意のアルコールが挙げられる。ある実施形態においては、アルコールは、イソプロピルアルコール、プロパノール、エタノール又はメタノールである。沈殿後、抽出ペクチンを溶液から分離し、アルコール洗浄して、なるべく多くのアルコール溶解性不純物を除去することができる。それから、当技術分野で知られた方法を用いて、ペクチンを、乾燥、粉末加工、又はさらに変性（例えば、脱エステル化及び／又はアミド化）することができる。

さらに別のある実施形態においては、抽出ペクチンをアルコール‐水混合物から分離する前又は分離した後に、抽出ペクチンから残留物を除去することができる。そうした残留物は、例えば、抽出に用いたシュウ酸及びシュウ酸塩の少量の残留物を含み得る。抽出方法で用いる通常の酸（例えば、硝酸）が適度に存在することは通常許容できるが、市販のペプチド製品に関する重要な規定の用法及び評価が存在しないため、シュウ酸残留物は、極少量でなければ許容できないと考えられる。したがって、抽出ペクチンからシュウ酸及びカルシウムシュウ酸塩の残留物を除去することが好適である。このため、ある実施形態においては、上記方法はさらに、抽出ペクチンを溶液から分離する前に、抽出ペクチンの溶液を陽イオン交換樹脂に晒すステップを含む。これにより、最終的な抽出ペクチンのシュウ酸塩及びカルシウムの残留物を大幅に減少することができる。適切な陽イオン交換樹脂の非限定的な例としては、レバチット（登録商標）Ｓ１６６８及びレバチット（登録商標）Ｓ１４６８（会社名：ＬＡＮＸＥＳＳ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、本社：ドイツ・レバクーゼン）、ピュロライト（登録商標）Ｃ１００Ｅ（会社名：Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ.、本社：イギリス・ラントリサイト）及びアンバーライト（登録商標）ＳＲ１Ｌ Ｎａ（会社名：Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、本社：ペンシルバニア州フィラデルフィア）が挙げられる。抽出ペクチンの溶液は、任意の適切な温度で保つことができ、必要に応じて加熱又は冷却してもよい。例えば、実施形態においては、抽出ペクチン溶液は、約５５〜約７０℃の温度で保たれる。

本明細書に記載の方法を用いて得られるペクチンは、従来方法に比べて、高いエステル化度（ＤＥ）と高い重合度（ＤＰ）とを有すると共に、高い収率で抽出される。好適には、抽出ペクチンは、７５以上のエステル化度と、約６．５〜約９ｄＬ／ｇの固有粘度により特徴付けられる重合度とを有する。ある実施形態においては、抽出ペクチンは、７６以上、７７以上又は７８以上のエステル化度と、７．０ｄＬ／ｇ以上、７．５ｄＬ／ｇ以上、７．８ｄＬ／ｇ以上又は８．０ｄＬ／ｇ以上の固有粘度により特徴付けられる重合度とを有する。

ただし、当業者には理解されるように、ペクチンの性質は、植物材料の種、植物材料の成熟度及び植物材料を処理するまでの遅延に依存する。例えば、一実施形態において、高品質のレモンの皮から抽出されたペクチンは、（従来方法を用いて抽出された場合の７４〜７６のエステル化度と、約７．５ｄＬ／ｇの固有粘度とに比べて）約７５〜７８のエステル化度と、約９ｄＬ／ｇの固有粘度とを有する。一方、別の実施形態において、低品質の植物材料から抽出されたペクチンは、７３超のエステル化度と、約６．５ｄＬ／ｇの固有粘度とを有する。

好適には、本明細書に記載の方法はさらに、従来のペクチン抽出方法に比べて高い皮あたりの収率を実現する。ある実施形態においては、皮あたりの収率は、約２３超、約２５超又は約２７超である。ただし、当業者には理解されるように、期待収率は、原材料の質及び原材料の天然の多様性に依存する。

皮あたりの収率は、以下の式から近似的に求めることができる。

Ｙ_Ｐ％＝０．１・ｙ_Ｓ・Ｍ／Ｗ_Ｐ

ここで、Ｙ_Ｐは、％で示される皮あたりの収率、ｙ_Ｓは、ｇ／ｋｇで示される溶液（抽出液）の収率、Ｍは、ろ過直前の抽出混合物の総質量、Ｗ_Ｐは、抽出混合物に用いた皮の重量である。当業者に理解されるように、上記の皮あたりの収率の算出は、抽出混合物の総質量のうち少量は溶解しないという点を無視しており、したがって、溶解ペクチンが分布していない量を表すため、近似にすぎない。

ある実施形態において、本明細書に記載の方法の価値は、皮あたりの収率と固有粘度との積により特徴付けられる。好適には、本明細書に記載の方法により得られるペクチンの皮あたりの収率と固有粘度との積は、従来方法により得られるペクチンの皮あたりの収率と固有粘度との積よりも大きい。例えば、ある実施形態において、ペクチンの皮あたりの収率と固有粘度との積は、約１６０超、約１６５超、約１７５超又は約１８５超である。

上述した方法は、（１）ろ過時の低粘性を実現すると共に、ペクチンの重合度の低下を低減すること、（２）Ｃａ^＋＋を除去して、イオン交換樹脂の再生の必要性を低減すること、（３）原材料の使用量に比したペクチンの収率を増加させると共に、ペクチンの重合度の低下を低減すること、（４）抽出ペクチンから除去しなければならない水の量を低減すること及び（５）最終製品において、抽出のために加えた酸の残留物を低減することができる方法を提供することにより、従来技術によるペクチン抽出方法を改良するものである。

理論的な制約を意図するものではないが、本明細書に記載の方法は、抽出媒質の選択（シュウ酸）、ｐＨ及び温度の特定のバランスによって、上述した所望の結果を部分的に実現すると考えられる。また、Ｃａ^＋＋イオンの大部分がカルシウムシュウ酸塩として沈殿することによって、溶解ペクチンがＣａ^＋＋イオンの存在下で粘性を帯びる傾向を抑制することができ、これにより、ろ過時の混合物の粘性と最終製品に残留するシュウ酸とを低減することができる。良好な収率及び低粘性の組合せはさらに、ろ過後の液体のペクチン濃度が比較的高い状態で作業することを可能にするため、ペクチンから除去しなければならない水の量を低減することができる。また、ペクチンを溶液から沈殿させる前に、液体ペクチン抽出物を陽イオン交換樹脂に晒すことによって、最終的なペクチンのシュウ酸の残留物をさらに抑制することができる。

本明細書の実施形態について、以下の例を挙げてさらに説明するが、それらの例は本発明の範囲を何らかの形で限定するものとして解釈されてはならない。それどころか、種々の他のそれらの実施形態、変形及び等価物を考慮することができ、これらは、本明細書を読めば、本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく当業者に提示されることは明確に理解されたい。特に明記しない限り、百分率（％）で表される量は、質量（質量％）である。

以下のプロトコル（実験の手順及び条件等）を用いて、後述する実施例で、エステル化度（ＤＥ）、固有粘度（ＩＶ）、強度、残留カルシウム含有量及び残留シュウ酸塩含有量を分析した。

プロトコル１：エステル化度の測定

エステル化度は、国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）食品添加物専門家委員会（ＪＥＣＦＡ）によるモノグラフ第４巻（２００７年度）に規定の方法を用いて測定した。１００ｍＬの酸アルコール（１００ｍＬ・６０％のイソプロピルアルコール［ＩＰＡ］＋５ｍＬのＨＣＩ［塩酸］発煙 ３７％）を、マグネチックスターラーを用いて１０分間攪拌しながら、２．００ｇのペクチンに加えた。混合物を、ろ紙を装着したブフナー漏斗に通して、ビーカーを９０ｍＬの酸アルコールで水洗い、さらにろ紙を装着したブフナー漏斗に通した。それから、ろ液をまず１０００ｍＬ・６０％のＩＰＡで洗浄し、その後、約３０ｍＬ・１００％のＩＰＡで洗浄した。そして、試料を、真空吸引を用いたブフナー漏斗で約１５分間乾燥した。

二重反復測定のために、重さ約０．４０ｇペクチン試料を測定した（二重反復測定の偏差は、１．５％絶対値を超えてはならず、超えた場合は、テストを繰り返した）。ペクチン試料をまず、約２ｍＬ・１００％のＩＰＡで湿らせた。それから、約１００ｍＬの脱イオン水を、マグネチックスターラーを用いて攪拌しながら、湿らせた試料に加えた。そして、指示薬又はｐＨ測定器／オートビュレットを用いて、試料を滴定法で評価した。

指示薬を用いた滴定
フェノールフタレン指示薬を５滴、試料に加え、色の変化が観測されるまで０．１Ｍ ＮａＯＨで滴定した。２０．０ｍＬの０．５Ｍ ＮａＯＨを、厳密に１５分間、攪拌しながら、ホイルで覆われた状態で加えた。そして、色がなくなるまで攪拌しながら２０．０ｍＬの０．５Ｍ ＨＣｌを加えた。それから、フェノールフタレン指示薬を３滴加え、色の変化が観測されるまで０．１Ｍ ＮａＯＨで滴定した（Ｖ２力価として記録した）。２０ｍＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ及びＨＣｌ２つの各部分のバランスに生じうる誤差を補償するために、いわゆる「ブラインド測定」を行った（すなわち、１００ｍＬの脱イオン水に対して、試料溶液と同様の滴定等の処理を行った）。最終的な滴定結果をＢ１力価として記録した。それから、以下の計算式によって、エステル化度を表した。

Ｖｔ＝Ｖ１＋（Ｖ２−Ｂ１）
％ＤＥ（エステル化度）＝［（Ｖ２−Ｂ１）／Ｖｔ］*１００

プロトコル２：固有粘度の測定

試料に不溶性物質が含まれていることが判明した場合（この場合は、試料を手動で調製した）を除いて、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社製のＧＰＣ ｍａｘ ＶＥ ２００１ ＧＰＣ 溶媒／試料モジュール（ｓｏｌｖｅｎｔ／ｓａｍｐｌｅ ｍｏｄｕｌｅ）又はＡＳ ３５００オートサンプラを用いて試料を調製した。それから、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて、試料中のペクチンの分子量、固有粘度及び分子量分布を測定した。ゲル浸透クロマトグラフィからの廃液を３つの検出器（ＲＩ、ＲＡＬＬＳ及び粘度検出器）に通過させながら、当該クロマトグラフィによって、分子をサイズに応じて分離した。Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社製ソフトウェアによって、検出信号を分子量及び固有粘度に変化し、個体群全体の秤量平均を算出した。

器具類： Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社製ＴＤＡ ３０２トリプル検出器又はＴＤＡ ３０５；Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社製ＧＰＣ ｍａｘ ＶＥ ２００１ ＧＰＣ溶媒／試料モジュール又はＡＳ ３５００ オートサンプラ；試料調製モジュール；Ｍｅｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ社製天秤及びＭｉｃｒｏｌａｂ．５００ディスペンサ；Ｐｉｅｒｃｅ社製Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ ＩＩＩ加熱／攪拌モジュール；カラム：ＢｉｏＢａｓｉｓ ＳＥＣ６０（３００ｘ７．８）、ＳＥＣ１２０（３００ｘ７．８）、ＳＥＣ３００（３００ｘ７．８）及びＳＥＣ１０００ （３００ｘ７．８）（いずれもサーモ社製）又はＳｈｏｄｅｘ社製ガード ＳＢ４００ Ｇ−８Ｂ、ＳＢ４０１−８Ｆ、ＳＢ４０２，５−８Ｆ、ＳＢ４０３−８Ｆ及びＳＢ４０４−８Ｆ；又はＣＰｋｅｌｃｏ社製Ｓｐｅｃｉａｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ社製ＳｕｐｅｒＤｅｘ Ｐｅｐｔｉｄ）あるいはサーモ社製ＢｉｏＢａｓｉｓ ＳＥＣ６０（１５０ｘ７．８）を備えた、ＦＩＰＡに従ったセットアップ；ＲＡＬＬＳ検出器（直角レーザ光散乱検出器）；ＬＡＬＬＳ検出器（低角レーザ光散乱検出器）；ＲＩ検出器（屈折率検出器）；粘度計検出器；及びコンピュータソフトウェア：ＯｍｎｉＳＥＣ。

手動での試料調製：不溶性物質を含んでいることが判明した試料は、手動で溶解及び遠心分離（１０．０００Ｇで１０分間）し、注入前に、上澄み液を別のバイアルに移した。

試料調製モジュール、Ｍｅｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ社製天秤及びＭｉｃｒｏｌａｂ．５００ディスペンサ並びにＰｉｅｒｃｅ社製Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ ＩＩＩ 加熱／攪拌モジュールを用いた試料調製：ｏｍｎｉＳＥＣソフトウェアでは、分析前の試料の調製にＳＡＳＰプログラムを用いた。量／容量比は、２０ｍＬのバイアル中、１５ｍＬの溶離液に対して約３０ｍｇの粉末（１ｍＬあたり２ｍｇ）であった。試料調製後、バイアルを加熱・攪拌モジュールに３０分間、７０℃で放置した。

ＡＳ ３５００オートサンプラを用いた場合の、天秤及び加熱／攪拌モジュールを用いた試料調製：約２．０ｍｇのペクチンをオートサンプラのバイアルで計量し、オートサンプラ・ラックに置いた。ＡＳ３５００オートサンプラのテンプレート４を用いて、以下のユニットを使用した。希釈サイクル：３；ヒータ：ＯＮ 温度：７０℃；２０μＬの溶媒Ｓ−１（Ｓ−１＝９６％エタノール）をロードする；１０μＬを試料に加える；１５００μＬの溶媒Ｓ−２（Ｓ−２＝０．３Ｍ酢酸リチウム緩衝液）をロードする；１３００μＬを試料に加える（０．１％のペクチン溶液‐１ ｍｇ／ｍＬ）；９．９分間混合する；９．９分間混合する；１０．０分間待つ；オーバーレイ作動：ＹＥＳ（実行中の試料分析の終了前に次の試料調製を開始する）。オートサンプラの動作時間は、５０分に設定し、１００μＬのフルループ注入を用いた。オートサンプラを用いた場合、オートサンプラループの後に設置した０．５μｍのインラインフィルタによって、試料を自動的にろ過した。

プロトコル３：ペクチン強度の測定（ＹｏｇＳｉｍＢｕｆ法）

ＹＯＧ ＳＩＭ ＢＵＦ ｐＨ３．７５ 緩衝液（２０００ｍＬ） １３．０３ｇの乳酸カルシウム（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_６Ｃａ、５*Ｈ_２Ｏ）、２．７９ｇのリン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）、２．００ｇの安息香酸ナトリウム、２．０３ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、４０．００ｇのラクトース（Ｃ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１）及び３００．００ｇのスクロース（Ｃ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１）を溶解して、緩衝液を調製した。７．２３ｇの乳酸（９０％）を計量して溶液に加え、ビーカーをイオン交換水で水洗いした。また、０．４３ｇの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）をフラスコ中で溶解して、溶液を脱イオン水で２０００ｍＬに希釈した。緩衝溶液のｐＨは、３．６８±０．０２のｐＨ表示が得られるまでクエン酸を加えることによって調整した。これにより、最終的なペクチン‐緩衝液システムで、３．７５±０．０５のｐＨが得られた。緩衝溶液は、沈殿まで安定であった。

ペクチン原液（１．２％）（１００ｍＬ） フラスコ中で、１．２０ｇのペクチンを５．００ｍＬ・１００％のＩＰＡで湿らせて、ペクチン原液を調製した。攪拌中、９５ｍＬの沸騰脱イオン水（＞８５℃）をフラスコに加えて、混合物を水浴／防水ヒータに置いて、７５℃で３０分間攪拌した。そして、溶液を室温まで冷却し、脱イオン水を加えて溶液を１００．０ｇに希釈した。

緩衝溶液、ペクチン原液及び脱イオン水を、２３±２℃の温度で維持した。以下の表に従って、ペクチン原液を脱イオン水で希釈した。

１５ｍＬの緩衝液を、約１ｃｍの渦を形成するのに十分な速度で合計２５秒間攪拌しながら希釈後のペクチン溶液に加えた。１分後、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶＴを用いて、アダプタを６ｒｐｍにして溶液を分析した（ファクター１）。さらに、ペクチン緩衝溶液を視覚的に評価して、その外観（すなわち、ゲル塊の有無及び不均質な外観等）を記述した。この処理を、（１）１８〜２５ｍＰａ・ｓの粘度を有する濃度及び（２）２５〜３５ｍＰａ・ｓの濃度の標本値群（ｄａｔａ ｐｏｉｎｔｓ）が特定されるまで様々な希釈度で繰り返した。２５〜３５ｍＰａ・ｓの溶液のｐＨが３．７０〜３．８０であれば表示は有効であるものとした。

上述した手順に従った後の未加工（生）の結果は、２つの標本値群、（ｃ_１，η_１）及び（ｃ_２，η_２）から成り、これらは、１８ｍＰａ・ｓ≦η_１≦２５ｍＰａ・ｓかつ２５ｍＰａ・ｓ≦η_２≦３５ｍＰａ・ｓであった。粘度はｍＰａ・ｓ単位で入力されたことを前提として、方法結果ｃ_†を以下の通りに算出した。

ｃ_†＝ｃ_１＋（ｃ_２−ｃ_１）・（ｌｎ（２５／η_１））／（ｌｎ（η_２／η_１））

プロトコル４：残留カルシウム含有量の測定

約０．５ｇの抽出ペクチンを用いて、残留カルシウムの有無を評価した。マニュアルに記載されているように、マイクロ波炉消化槽で、硝酸（６５％）及び過酸化水素（３０）を用いて試料を消化した。消化後、反応器を換気フードに放置して冷却した。それから、試料を５０ｍＬのメスフラスコに移した。残留カルシウムを測定する際には、干渉防止のために、塩化セシウムを加えなければならない（Ｃｓが約２０００ｐｐｍの溶液の作製に、溶液１０ｍＬあたり１ｍＬの２．５％ＣｓＣｌ溶液）。測定用溶液の酸濃度（ＨＮＯ_３）は、３％〜１０％であった。それから、試料の発光強度を測定した。標準の発光強度の範囲でなかった場合は、試料を適切に希釈した。

プロトコル５：残留シュウ酸塩含有量の測定

約０．２ｇの抽出ペクチンを用いて、残留シュウ酸塩の有無を評価した。２‐プロパノール（１ｍＬ）を抽出ペクチンに加えて、ペクチンが湿るまで混合物を攪拌した。その後、混合しながらＭｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水（４０ｍＬ）を加えた。サンプルを密閉ボトル中で３０〜６０分間、９０℃まで加熱してから、室温まで冷却した。それから、ＨＰＬＣクロマトグラフィ（装置：Ｗａｔｅｒｓ社製 屈折率検出器及び電導度検出器を備えたＴＭ６００；流量：１．４ｍＬ／分；温度：４０℃；注入：１００又は２００ｍＬのフルループ；溶離液：脱イオン水中０．８５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３＋０．９ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３）を用いて試料を評価した。

電導度検出器を通過するシュウ酸に対する当該検出器の量的反応は、図中の面積（「統合量的反応」）として量化した（ｘ軸＝時間、ｙ軸＝検出反応）。当技術分野の通常の慣行及び慣習に従って、ピークの前後の統合検出器反応の境界を直線基線により定めた。それから、未知の試料の統合検出反応と、脱イオン水に含まれるシュウ酸二水和物の同定試料の統合検出器反応の線形検量曲線とを比較して（ｘ軸＝濃度、ｙ軸＝統合検出反応）、線形検量曲線から対応するシュウ酸の濃度を推定した。

乾燥させたアルゼンチン・ツクマン地方産のレモンの皮からレモンのペクチンを抽出した。果実は２００９年に収穫され、その後、カットされて柑橘ジュース及び柑橘皮油の製造に利用されたものである。果実の残りを切り刻み、水中で数回洗浄して、スクロース等の天然水溶性物質の大部分を浸出させ、その後乾燥させた。これらの通常行われる処理は、ピールサプライヤを用いて行った。

その後、レモンの皮を（図１に示された）例示的な抽出方法に用いて、レモンの皮からペクチンを抽出した。乾燥させたレモンの皮（１０００ｇ）は、２０Ｌの水、３０．０ｇのシュウ酸二水和物及び２．９０ｇのＮａＯＨの混合物に懸濁させた。この混合物を非常に穏やかに攪拌しながら、７２．５℃で６０分間インキュベートした（「混合物Ａ」）。それから、４００ｇの木材セルロース（不溶性のろ過助剤）の懸濁液を用いて２０Ｌの湯中で混合物Ａを希釈して、インキュベーション及び穏やかな攪拌を７５．０℃で６０分間続けた。（「混合物Ｂ」）。それから、混合物Ｂをブフナー漏斗のろ布に流し込み、溶解しなかった物質から溶液（「溶液Ｃ」）を分離した（ここで、分離できなかった物質は溶液と共に「混合物Ｄ」と言う）。

それから、溶液ＣをＦｉｌｔｅｒｃｅｌ ４５０（濁りを除去するために用いるろ過助剤）のベッドでさらにろ過して、レバチット（登録商標）イオン交換樹脂と共に攪拌した。樹脂を抜き出した後に得られた溶液（「溶液Ｅ」）を、約３パーツ（すなわち、溶液量の３倍）の８０％の２‐プロパノールに注入した。沈殿物を圧搾して、なるべく大量の使用済みアルコールを除去し、それから、６０％の２‐プロパノール及び４０％の水の混合物中で洗浄してから再び圧搾した。沈殿物の洗浄に用いた混合物の量は、溶液Ｅの量と略同じであった。洗浄後、沈殿物を乾燥、粉砕及び２５０μ孔サイズの粉末シーブを用いて篩がけした。

混合物ＢのアリコートのｐＨは、２５℃まで冷却した後で３．５２であった。単離可能な乾燥ペクチン量は、溶液Ｅ１ｋｇあたり５．７１ｇであった。本実施例において、ろ過直前の抽出混合物の全質量、抽出混合物に用いた皮の重量及び皮あたりの収率は、以下の通りに算出した。

Ｍ＝１＋２０＋０．０３＋０．００２９＋０．４００＋２０ｋｇ＝４１．４ｋｇ．
Ｗ_Ｐ＝１ｋｇ．
Ｙ_Ｐ％＝０．１・５．７１・４１．４／１＝２３．６

また、実験室でペクチンを分析し、エステル化度（ＤＥ）及び固有粘度（ＩＶ）を測定した（上述したプロトコル１及び２をそれぞれ参照のこと）。ペクチンは、ＤＥ＝７６．４及びＩＶ＝７．８３ｄＬ／ｇを有した。値の、より適切な測定基準を示す、収率と固有粘度との積は、１８６であった。

また、ＹｏｇＳｉｍＢｕｆ法を用いてペクチン強度を測定した。これは、溶液の粘度が２５ｍＰａ・ｓに達するペクチン濃度を示す（上述したプロトコル３を参照のこと）。レモンの皮から抽出されたペクチンのＹｏｇＳｉｍＢｕｆ（ＹＳＢ）は、２．５１ｇ／Ｌであった。

実施例１で説明したレモンの皮と同じものを、（図２に示す）従来のペクチン抽出方法で用いた。乾燥させたレモンの皮（１０００ｇ）を３０Ｌの水及び１５ｍＬの６２％硝酸の混合物に懸濁させて、非常に穏やかに攪拌しながら、７２．５℃で３０分間インキュベートした（「混合物Ｆ」）。５０ｍＬの６２％硝酸をさらに混合物Ｆに加えて、７２．５℃でのインキュベーションを１２０分間継続した（「混合物Ｇ」）。混合物Ｇを、１０Ｌの湯及び４００ｇの木材セルロースを用いて希釈し、７５℃で３０分間インキュベートした（「混合物Ｈ」）。それから、混合物Ｈをブフナー漏斗のろ布に流し込み、溶解しなかった物質から溶液（「溶液Ｉ」）を分離した（ここで、物質から絞り出せなかったものは溶液と共に「混合物Ｊ」と言う）。

それから、溶液ＩをＦｉｌｔｅｒｃｅｌ ４５０（濁りを除去するために用いるろ過助剤）のベッドでろ過して、レバチット（登録商標）イオン交換樹脂と共に攪拌した。樹脂を抜き出した後に得られた溶液（「溶液Ｋ」）を、約３パーツ（すなわち、溶液量の３倍）の８０％の２‐プロパノールに注入した。沈殿物を圧搾して、なるべく大量の使用済みアルコールを除去し、それから、６０％の２‐プロパノール及び４０％の水の混合物中で洗浄してから再び圧搾した。洗浄に用いた混合物の量は、溶液Ｋの量と略同じであった。洗浄後、沈殿物を乾燥、粉砕及び２５０μ孔サイズの粉末シーブを用いて篩がけした。

混合物ＨのアリコートのｐＨは、２５℃まで冷却した後で２．０５であった。分離可能な乾燥ペクチン量は、溶液Ｋ１ｋｇあたり５．９５ｇであった。実施例１と同じ符号及び式を用いて、ろ過直前の抽出混合物の全質量及び皮あたりの収率を、以下の通りに算出した。
Ｍ＝３０＋１＋０．０１５＋０．０５０＋０．４＋１０＝４１．５
Ｙ_Ｐ＝２４．７．

ＤＥ及びＩＶはいずれも、上述したプロトコルと同じものを用いて計測した。ペクチンは、ＤＥ＝７４．６及びＩＶ＝６．５９ｄＬ／ｇを有した。収率と固有粘度との積は１６３であった（実施例１の８８％にすぎない）。ＹｏｇＳｉｍＢｕｆは３．２４ｇ／Ｌと算出された。これは、従来方法を用いて抽出したペクチンの強度が実施例１で抽出したペクチンの強度の７７％にすぎないことを示唆している（なお、「小さい」と「強度が高い」ことに留意されたい）。

実施例１で説明したのと同じ方法を用いて、シュウ酸の用量、ｐＨ及び温度がレモンの皮を用いた抽出に及ぼす影響を評価した。硝酸又は水酸化ナトリウムをシュウ酸と共に加えることによって、シュウ酸二水和物の用量を４つのレベル（乾燥させた皮１ｋｇあたり１５、２０、２５及び３０ｇ）に変化させ、目標ｐＨを３つのレベル（２．７０、３．００及び３．３０）に変化させる、一連の２４の同様の実験を行った。ただし、実際に得られたｐＨ値は、目標値とはわずかに異なるものであった（以下を参照のこと）。また、温度は２つのレベル（７０及び８０℃）に変化させた。

全ての実験で、実施例１及び２と同じ原料から採った１０００ｇの乾燥皮を、他の特定量の材料と共に、２０Ｌの水に規定温度で６０分間懸濁させた。混合物を２０Ｌ超の水で希釈して、同一温度で６０分間インキュベートし、最後に、抽出物をイオン交換樹脂と接触させなかった点を除いて実施例１で説明したとおりにろ過及び分析した（つまり、実施例３で生成したペクチンは、実施例１及び２で生成したペクチンより多くの残留カルシウムを含んでいた）。ペクチン中の総カルシウムｍｇ／ｇを、上述したプロトコル４を用いて測定した。

実験条件及び実験結果を以下に要約する。

上記の結果は、図３〜７に示し、以下に説明するように、グラフの形にすることで、より良く理解されるだろう。

図３は、実験用ペクチン試料のカルシウム含有量を、皮１ｋｇあたり（ＣＯＯＨ）_２・２Ｈ_２Ｏ，Ｍ＝１２６．１のシュウ酸用量の関数としてｇで示す図である。理論的な制約を意図するものではないが、皮は、１ｇあたり８．０ｍｇのＣａ^＋＋を含んでいたため、シュウ酸とカルシウムとの化学量論バランスは、シュウ酸二水和物の用量が２５．２ｇの時点で生じると考えられる。観察によれば、化学量論バランスを超過後安定するまでは、抽出に大量のシュウ酸を用いるほど、結果として生じるペクチン試料には少量のカルシウム残留物が見られた。具体的には、８０℃で抽出したペクチンには少量のカルシウムが見られた。これはおそらく、ペクチン収率が７０℃の場合に比べて８０℃では高いため、高温でカルシウム残留物が比較的大量のペクチンと混合されたことが原因であろう。

図４は、抽出収率に対するｐＨの影響を、４つのシュウ酸用量と２つの温度との８つの可能な組合せそれぞれの曲線を用いて示す図である。グラフ図から見て取れるように、一連の実験でテストされたｐＨの範囲及びシュウ酸用量の範囲内での収率は、抽出時ｐＨに強く依存していたわけではなかった。しかし、７０℃の場合より８０℃の場合の方が収率が高くなる、という顕著な傾向があった。また、収率は、シュウ酸用量が低い場合より高い場合の方が高くなる傾向にあった。例えば、３０ｍｇ／ｇのシュウ酸を用いて７０℃で抽出した場合の収率は、１５ｍｇ／ｇのシュウ酸を用いて８０℃で抽出した場合の収率より高かった。

図５は、４つのシュウ酸用量と２つの温度との８つの可能な組合せそれぞれの曲線を用いて、固有粘度をｐＨの関数として示す図である。グラフ図から見て取れるように、最低抽出温度で最高固有粘度が得られた。また、平均して、最低ｐＨで抽出した試料は、最高ｐＨで抽出したものより低い固有粘度を有した。ただし、このデータを他の調査データを考慮することなく解釈する場合は、ｐＨと固有粘度との関係は不明確であり、複数の解釈が可能であると考えられる。理論的な制約を意図するものではないが、固有粘度は、溶解ペクチンの漸次的な熱崩壊と、自発的に放出されるペクチン及び高収率の場合のみ抽出中に放出されるペクチンの間に生じ得る差とに影響され得る。

図６は、独立パラメータとしてのシュウ酸用量と、従属パラメータとしての、皮の百分率で示されるペクチン収率とを示す図である。最高収率は、最高シュウ酸用量で得られた。一方、図４のデータに関して言えば、収率は、酸性（ｐＨ）の結果物というよりむしろ抽出媒質（すなわち、シュウ酸）の結果物であることが示唆されていると考えられる。

図７は、収率と固有粘度との積をシュウ酸用量の関数として示す図である。収率値は、シュウ酸用量と共に増加し、抽出温度への依存性が低下した。

さらなる実験を行って、水性の抽出物を陽イオン交換樹脂と接触させることによって、最終的に得られたペクチン中のシュウ酸塩の減少を評価した。Ｆｉｌｔｅｒｃｅｌを用いてろ過した溶液Ｃを略同量の２つの部分に分けて、一方の部分は実施例１で説明したようにレバチット（登録商標）イオン交換樹脂で処理し、他方の部分はレバチット（登録商標）による処理を省略した点を除いて、実施例１で説明したのと同じ方法を用いた。その後、それらの溶液両方を、実施例１の溶液Ｅで説明したように処理した。その後、上述したプロトコル４及び５を用いて、最終的に得られたペクチンのカルシウム含有量及びシュウ酸塩含有量をそれぞれ分析した。

以上より分かるように、イオン交換樹脂の使用によって、最終的に得られるペクチンからシュウ酸塩の残渣を効果的に除去することができる。

ここまで特定の実施形態に関して本発明を詳細に説明したが、前述の理解によれば、これらの実施形態に対して当業者が容易に代替、変更、及び同等を想起できるであろうことを理解されたい。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる同等の範囲として査定されたい。

Claims (20)

1. 果物の皮からペクチンを抽出する方法であって、
   果物の皮の水性懸濁液に、シュウ酸及び／又は水溶性シュウ酸塩を、ｐＨが３．０〜３．６であり、シュウ酸塩の全モル濃度が前記果物の皮中のカルシウム（ＩＩ）の全モル濃度より高い混合物を得るのに十分な量で加えるステップと、
   前記混合物を、０．５〜５時間、５０℃〜８０℃の温度まで加熱するステップと、
   前記混合物から前記抽出ペクチンを沈殿させて、当該混合物から当該抽出ペクチンを分離するステップと
   を含み、
   前記抽出ペクチンは、エステル化度（ＤＥ）が７２以上であり、６．０ｄＬ／ｇ超の固有粘度により特徴付けられるペクチンである、方法。
2. 前記混合物から前記抽出ペクチンを分離する前記ステップの前の当該混合物のｐＨは、３．１〜３．４である、請求項１記載の方法。
3. 混合物を加熱する前記ステップ中、前記混合物を、７０℃〜８０℃の温度まで加熱する、請求項２記載の方法。
4. 前記ペクチン抽出する前記ステップの後かつ前記抽出ペクチンを分離する前記ステップの前に、前記混合物をろ過して、不溶性固形物を除去するステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
5. 前記抽出ペクチンを分離する前記ステップの前に、当該抽出ペクチンを含む前記混合物をイオン交換樹脂と接触させるステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
6. 前記イオン交換樹脂は、シュウ酸塩、カルシウム塩又はそれらの組み合わせを、前記抽出ペクチンから除去するのに有効な陽イオン交換樹脂を含む、請求項５記載の方法。
7. 前記抽出ペクチンの総シュウ酸塩含有量は、ペクチン１ｇあたり２．０ｍｇ未満である、請求項５記載の方法。
8. 前記抽出ペクチンの総カルシウム含有量は、１ｍｇ／ｇ未満である、請求項５記載の方法。
9. 前記抽出ペクチンを分離する前記ステップの後に、当該抽出ペクチンを洗浄、圧搾、乾燥及び粉砕するステップのうち１つ又は複数のステップをさらに含み、最終ペクチン生成物を得る、請求項１記載の方法。
10. 果物の皮あたりの収率（Ｙ_Ｐ）は２３％超で、Ｙ_Ｐ＝０．１・ｙ_Ｓ・Ｍ／Ｗ_Ｐであり、ここで、ｙ_Ｓは、ｇ／ｋｇで示される溶液（抽出液）の収率、Ｍは、前記抽出ペクチンを分離する前記ステップの前の前記混合物の総質量、Ｗ_Ｐは、前記水性懸濁液に用いられる前記果物の皮の重量である、請求項１記載の方法。
11. 果物の皮あたりの前記収率と前記固有粘度との積は、１６５％・ｄＬ／ｇ超である、請求項１０記載の方法。
12. 前記抽出ペクチンのエステル化度（ＤＥ）は、７５以上である、請求項１記載の方法。
13. 前記抽出ペクチンの固有粘度（ＩＶ）は、７．８ｄＬ／ｇ以上である、請求項１記載の方法。
14. 前記抽出ペクチンの固有粘度（ＩＶ）は、８．５ｄＬ／ｇ以上である、請求項１記載の方法。
15. 果物の皮からペクチンを抽出する方法であって、
    果物の皮の水性懸濁液に、シュウ酸及び／又は水溶性シュウ酸塩を、ｐＨが３．０〜３．６であり、シュウ酸塩の全モル濃度が前記果物の皮中のカルシウム（ＩＩ）の全モル濃度より高い混合物を得るのに十分な量で加えるステップと、
    前記混合物を、０．５〜５時間、５０℃〜８０℃の温度まで加熱するステップと、
    任意選択的に、前記混合物をろ過して、不溶性固形物を除去するステップと、
    当該抽出ペクチンを含む前記混合物を陽イオン交換樹脂と接触させるステップと、
    前記混合物から前記抽出ペクチンを沈殿させて、当該混合物から当該抽出ペクチンを分離して、２３％超の果物の皮あたりの収率（Ｙ_Ｐ）、ここで、Ｙ_Ｐ＝０．１・ｙ_Ｓ・Ｍ／Ｗ_Ｐで、ｙ_Ｓは、ｇ／ｋｇで示される溶液（抽出液）の収率、Ｍは、前記抽出ペクチンを分離する前記ステップの前の前記混合物の総質量、Ｗ_Ｐは、前記水性懸濁液に用いられる前記果物の皮の重量である、を得るステップと
    から実質的に成り、
    前記抽出ペクチンは、エステル化度（ＤＥ）が７２以上であり、６．０ｄＬ／ｇ超の固有粘度数により特徴付けられるペクチンである、方法。
16. 前記抽出ペクチンの総シュウ酸塩含有量は、ペクチン１ｇあたり２．０ｍｇ未満である、請求項１５記載の方法。
17. 前記抽出ペクチンの総カルシウム含有量は、１ｍｇ／ｇ未満である、請求項１５記載の方法。
18. 前記混合物を加熱する前記ステップ中、前記混合物を、１時間〜３時間加熱する、請求項１５記載の方法。
19. 前記抽出ペクチンのエステル化度（ＤＥ）は、７５以上である、請求項１５記載の方法。
20. 前記抽出ペクチンの固有粘度（ＩＶ）は、７．８ｄＬ／ｇ以上である、請求項１５記載の方法。

Images