ES2436011T3

ES2436011T3 - Métodos para prevenir la transición de la permeabilidad mitocondrial

Info

Publication number: ES2436011T3
Application number: ES04707809T
Authority: ES
Inventors: Hazel H. Szeto; Kesheng Zhao; Peter W. Schiller
Original assignee: Clinical Research Institute of Montreal; Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Clinical Research Institute of Montreal; Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2013-12-26
Anticipated expiration: 2024-02-03
Also published as: US20120021970A1; JP2013249313A; JP6166312B2; US20230293624A1; JP2019089773A; US20070027087A1; HK1209652A1; CA2515080A1; EP1599216B9; US20200038472A1; WO2004070054A3; EP1599216A2; JP5775285B2; HK1204999A1; EP2656854B1; EP3479838A1; US7718620B2; DK2656854T3; US20150359838A1; HK1190930A1

Abstract

Un péptido catiónico aromático para su uso en la reducción del número de mitocondrias que experimentan transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT) o para evitar la transición de la permeabilidad mitocondrial en un mamífero que lo necesita, donde el péptido catiónico aromático tiene la fórmula D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NHz.

Description

Métodos para prevenir la transición de la permeabilidad mitocondrial.

Antecedente de la invención

Las mitocondrias existen en prácticamente todas las células eucariotas, y son esenciales para la supervivencia celular produciendo trifosfato de adenosina (ATP) mediante la fosforilación oxidativa. La interrupción de esta función vital puede conducir a la muerte celular.

Las mitocondrias juegan también un papel principal en la regulación del calcio intracelular acumulando calcio (Ca2+). La acumulación de calcio se produce en la matriz mitocondrial a través de un monoportador impulsor del potencial de membrana.

La captación del calcio activa las deshidrogenasas mitocondriales, y puede ser importante para el sostenimiento de la producción de energía y la fosforilación oxidativa. Además, la mitocondria sirve como un sumidero del Ca2+ citosólico en exceso, protegiendo de esta manera la célula de la sobrecarga de Ca2+ y de la muerte necrótica.

La isquemia o la hipoglicemia pueden conducir a la disfunción mitocondrial, incluyendo la hidrólisis del ATP y la sobrecarga de Ca2+. La disfunción produce transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT). MPT se caracteriza por un desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, pérdida del potencial de membrana mitocondrial, aumento de la permeabilidad de la membrana interna e hinchazón.

Además, el espacio intermembrana de las mitocondrias es un depósito de proteínas apoptogénicas. Por tanto, la pérdida del potencial mitocondrial y de la MPT puede conducir a la liberación de proteínas apoptogénicas en el citoplasma. No resulta sorprendente que exista una acumulación de evidencias de que MPT está implicada en la muerte celular necrótica y apoptótica (Crompton, Biochem J. 341: 233-249, 1999). Formas más leves de daños celulares pueden conducir a la apoptosis en lugar de a la necrosis.

La ciclosporina puede inhibir MPT. El bloqueo de MPT por la ciclosporina A puede inhibir la apoptosis en algunos tipos de células, incluyendo las células que experimentan isquemia, hipoxia, sobrecarga de Ca2+ y estrés oxidativo (Kroemer y col., Annu Rev Physiol. 60:619-642, 1998).

Ciclosporina A, es menos que óptimo como fármaco de tratamiento frente a la muerte celular y apoptótica. Por ejemplo, ciclosporina A no se dirige de forma específica en la mitocondria. Además, se libera mal en el cerebro. Además, la utilidad de ciclosporina A está reducida por su actividad inmunosupresora. Rigobello M P, y col., en un artículo titulado "Effect of polycation peptides on mitochondrial permeability transition" publicado en Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 217, nº 1, 1995, páginas 144-149, describe tetrapéptidos catiónicos y su efecto en la hinchazón mitocondrial y la liberación de glutatión. Wu D y col., en un artículo titulado "A highly potent peptide analgesic that protects against ischemia-reperfusiuninduced myocardial stunning, publicado en "American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology, The American Physiological Society, US, vol. 283, 9 de mayo de 2002 (2002-05-09), páginas H783-H791, describe DMT- DALDA y su actividad protectora frente al aturdimiento miocárdico inducido por isquemia. Berezowska I y col., en un artículo titulado "Highly potent fluorescent analogues of the opioid peptide [Dmt1] DALDA", publicado en Peptides, Elsevier, Amsterdam, vol. 24, 1 de enero de 2003 (2003-01-01), páginas 11951200, describe análogos fluorescentes de Dmt1-DALDA. Zhao K, y col., en un artículo titulado "Transcellular transport of a highly polar 3+ net charge opioid tetrapeptide, publicado en "The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol. 304, nº 1, de enero de 2003 (200301), páginas 425-432, describe la translocación de Dmt1-DALDA a través de las monocapas de células Caco-2 y el papel de los transportadores peptídicos PEPT1 y PEPT2.

El tetrapéptido [Dmt1] DALDA (2’,6’-dimetiltirosina-D-Arg-Phe-Lys-NH2; SS-02) tiene un peso molecular de 640 y transporta tres cargas positivas netas a pH fisiológico. [Dmt1] DALDA penetra fácilmente la membrana plasmática de algunos tipos de células de mamíferos de una manera dependiente de la energía (Zhao y col., J Pharmacol Exp Ther. 304: 425-432, 2003) y atraviesa la barrera hematoencefálica (Zhao y col., J Pharmacol Exp Ther. 302: 188196, 2002). Aunque se ha demostrado que [Dmt1] DALDA es un potente agonista del receptor mu-opiode, su utilidad no se ha ampliado para incluir la inhibición de MPT.

De esta manera, existe la necesidad de inhibir MPT en condiciones tales como reperfusión por isquemia, hipoxia, hipoglucemia, y otras enfermedades y dolencias que dan como resultado cambios patológicos como resultado de la transición de la permeabilidad de las membranas mitocondriales. Dichas enfermedades y dolencias incluyen muchas de las enfermedades neurodegenerativas comunes. La presente invención se refiere a:

-: un péptido catiónico aromático para su uso en la reducción del número de mitocondrias que experimentan transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), o evitar la transición de permeabilidad mitocondrial en un mamífero que lo necesita, donde el péptido catiónico aromático tiene la fórmula D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2;

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde el péptido se formula para su administración por vía oral, intranasal, sistémica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracerebroventricular, intratecal, o transdérmica;

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde el mamífero padece una lesión de isquemia o reperfusión;

-: el péptido para uso en un mamífero como anteriormente, donde la isquemia es debida a ictus, isquemia intestinal o isquemia del tejido muscular;

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde el tejido muscular es un tejido del músculo cardiaco, un tejido del músculo esquelético, o un tejido del músculo liso;

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde el mamífero padece hipoxia;

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde el mamífero padece una enfermedad o dolencia neurodegenerativa;

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde la enfermedad o dolencia degenerativa es una enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica (ELA);

-: el péptido para el uso anteriormente citado, donde el mamífero padece MPT inducida por fármacos;

-: un péptido que tiene la secuencia de D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 ;

-: una composición que comprende un péptido que tiene la secuencia de D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Internalización celular y acumulación de [Dmt1] DALDA (SS-02) en mitocondrias. (A) La captación mitocondrial de SS-19 se determinó utilizando espectofotometría de fluorescencia (ex/em = 320/420 nm). La adición de mitocondrias de hígado de ratón aisladas (0,35 mg/ml) dio como resultado una detención inmediata de la intensidad de la fluorescencia de SS-19 (línea gris). El pretratamiento de mitocondrias con FCCP (1,5 µM) redujo la detención inmediata en < 20 % (línea negra). (B) Se incubaron mitocondrias aisladas con [3H] SS-02 a 37° C durante 2 min. Se detuvo la captación mediante centrifugación (16000 x g) durante 5 min a 4º C, y se determinó la radiactividad en el aglomerado. El pretratamiento de las mitocondrias con FCCP inhibió la captación de [3H] SS-02 en ~20 %. Se muestran los datos como promedio ± s.e.; n = 3.*, P < 0,05 mediante el test de la t de Student. La captación de TMRM por las mitocondrias aisladas se pierde tras la hinchazón mitocondrial inducida por alameticina, mientras que la captación de SS-19 queda retenida en gran medida. Línea negra, TMRM, línea roja, SS-19. (D) La adición de SS-0 (200 µM) a mitocondrias aisladas no altera el potencial mitocondrial, tal como se midió por fluorescencia de TMRM. La adición de FCCP (1,5 µM) produjo la inmediata despolarización mientras que Ca2+ (150 µM) dio como resultado la despolarización y el comienzo progresivo de MPT.

Figura 2. [Dmt1] DALDA (SS-02) protege contra la transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT) inducida por sobrecarga de Ca2+ y ácido 3-nitropropiónico (3NP). (A) El pretratamiento de mitocondrias aisladas con 10 µM de SS-02 (adición indicada por la flecha que apunta hacia abajo) evitó el inicio de MPT producido por sobrecarga de Ca2+ (flecha apuntando hacia arriba). Línea negra, tampón; línea roja, SS-02. (B) El pretratamiento de mitocondrias aisladas con SS-02 aumentó la tolerancia mitocondrial de múltiples adiciones de Ca2+ antes del inicio de MPT. La flecha indica la adición del tampón de SS-02. Línea 1, tampón, línea 2, 50 µM de SS-02; línea 3, 100 µM de SS-02.

(C) SS-02 retrasó de forma dependiente de la dosis el inicio de MPT producido por 1 mM de 3NP. La flecha indica la adición de tampón o de SS-02. Línea 1, tampón, línea 2, 0,5 µM de SS-02; línea 3, 5 µM de SS-02, línea 4, 50 µM de SS-02.

Figura 3. [Dmt1] DALDA (SS-02) inhibe la hinchazón mitocondrial y la liberación del citocromo c. (A) El pretratamiento de mitocondrias aisladas con SS-02 de forma dependiente de la dosis inhibió la hinchazón mitocondrial inducida por 200 µm de Ca2+ de una manera dependiente de la dosis. La hinchazón se midió por la absorbancia a 540 nm. (B) SS-02 inhibió la liberación inducida por Ca2+ del citocromo c a partir de mitocondrias aisladas. La cantidad de citocromo c liberado se expresó como porcentaje del citocromo c en mitocondrias. Los datos se presentan como promedio ± s.e., n = 3. (C) SS-02 inhibió también la hinchazón mitocondrial inducida por MPP+ (300 µM).

Figura 4. D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) inhibe la hinchazón mitochondrial y la liberación del citocromo c. (A) El pretratamiento de mitocondrias aisladas con SS-31 (10 µM) evita el inicio de MPT inducida por Ca2+. Línea gris, tampón; línea roja, SS-31. (B) El pretratamiento de mitocondrias con SS-31 (50 µM) inhibió la hinchazón mitocondrial inducida por 200 mM de Ca2+. Se midió la hinchazón mediante la dispersión de luz medida a 570 nm. (C). Comparación de SS-02 y SS-31 con ciclosporina (CsA) en la inhibición de la hinchazón mitocondrial y la liberación del citocromo C inducida por Ca2+. La cantidad de citocromo C liberado se expresó como porcentaje del total del citocromo c en mitocondrias. Los datos se presentan como promedio ± s.e., n = 3.

Figura 5. [Dmt1] DALDA (SS-02) y D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) protegen la fuerza contráctil del miocardio durante la reperfusión por isquemia en el corazón de cobaya perfundido aislado. Los corazones se perfundieron con tampón o tampón que contenía SS-02 (100 nM) o SS-31 (1 nM) durante 30 min y se sometieron a continuación a 30 min de isquemia global. La reperfusión se llevó a cabo utilizando la misma disolución de perfusión. Se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de tratamiento (ANOVA bilateral, P < 0,001). Figura 6. La adición de [Dmt1] DALDA a una solución cardioplégica mejoró significativamente la función contráctil después de una isquemia prolongada en el corazón de cobaya perfundido aislado. Después de 30 min de estabilización, los corazones se sometieron a perfusión con la solución cardioplégica de St. Thomas (CPS) o CPS que contenía [Dmt1] DALDA a 100 nM durante 3 min. A continuación se indujo la isquemia global mediante la interrupción completa de la perfusión coronaria durante 90 min: Se llevó a cabo posteriormente la reperfusión durante 60 min., con solución de Krebs-Henseleit oxigenada. La fuerza contráctil posterior a la isquemia fue significativamente mejorada en el grupo que recibía [Dmt1] DALDA (P < 0,001).

Descripción detallada de la invención

La invención se basa en el sorprendente descubrimiento de los inventores de que determinados péptidos catiónicos aromáticos reducen significativamente el número de mitocondrias que experimentan, o incluso evitan completamente, la transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT). Reducir el número de mitocondrias que experimentan, y evitan, MPT es importante, debido a que MPT está asociada con algunas enfermedades y dolencias comunes en mamíferos. Además, un órgano extraído de un mamífero es susceptible a MPT. Estas enfermedades y dolencias son de particular importancia clínica ya que afectan a una proporción grande de la población humana en alguna etapa durante su lapso de vida.

Péptidos

Los péptidos catiónicos aromáticos útiles son solubles en agua y muy polares. A pesar de estas propiedades, los péptidos pueden penetrar fácilmente las membranas celulares.

Los péptidos catiónicos aromáticos útiles incluyen un mínimo de tres aminoácidos, e incluyen preferentemente un mínimo de cuatro aminoácidos, unidos de forma covalente mediante enlaces peptídicos.

El número máximo de aminoácidos presentes en los péptidos catiónicos aromáticos es aproximadamente de veinte aminoácidos unidos de forma covalente mediante enlaces peptídicos. Preferentemente, el número máximo de aminoácidos es aproximadamente de doce, de forma más preferible aproximadamente nueve, y lo más preferibleaproximadamente seis. Óptimamente, el número de aminoácidos presentes en los péptidos es cuatro.

Los aminoácidos útiles de los péptidos catiónicos aromáticos pueden ser cualquier aminoácido. Tal como se usa en

el presente documento, el término “aminoácido” se usa para referirse a cualquier molécula que contiene al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxilo. Preferentemente, al menos un grupo amino está en la posición α relativa al grupo carboxilo.

Los aminoácidos pueden producirse naturalmente. Los aminoácidos que se producen naturalmente incluyen, por ejemplo, los veinte aminoácidos levorotatorios (L) más comunes normalmente encontrados en las proteínas de mamíferos, es decir, alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Glu), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ileu), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano, (Trp), tirosina (Tyr), y valina (Val).

Otros aminoácidos que se producen naturalmente incluyen, por ejemplo, los aminoácidos que se sintetizan en procesos metabólicos no asociados con síntesis de proteínas. Por ejemplo, los aminoácidos ornitina y citrulina se sintetizan en el metabolismo de los mamíferos durante la producción de urea.

Los péptidos útiles pueden contener uno o más aminoácidos que no se producen naturalmente. Los aminoácidosque no se producen naturalmente pueden ser L, dextrotatorios (D), o sus mezclas. Óptimamente, el péptido no tiene aminoácidos que se produzcan naturalmente.

Los aminoácidos que no se producen naturalmente son aquellos aminoácidos que normalmente no se sintetizan en procesos metabólicos normales en organismos vivos, y no se encuentran de una forma natural en proteínas. Además, los aminoácidos que no se producen naturalmente útiles preferentemente tampoco son reconocidos por las proteasas habituales.

El aminoácido que no se produce naturalmente puede estar presente en cualquier posición del péptido. Por ejemplo, el aminoácido que no se produce naturalmente puede estar en el extremo N, el extremo C, o en cualquier posición entre el extremo N y el extremo C.

Los aminoácidos no naturales pueden, por ejemplo, comprender grupos alquilo, arilo, o alquilarilo. Algunos ejemplos de alquil aminoácidos incluyen ácido α-aminobutírico, ácido β-aminobutírico, ácido y-aminobutírico, ácido 8aminovalérico, y ácido s-aminocaproico. Algunos ejemplos de aril aminoácidos incluyen ácido orto-, meta- y paraaminobenzoico. Algunos ejemplos de alquilaril aminoácidos incluyen ácido orto-, meta-, y para-aminofenilacético, y ácido y-fenil-β-aminobutírico.

Los aminoácidos que no se producen naturalmente incluyen también derivados de los aminoácidos que se producen naturalmente. Los derivados de aminoácidos que se producen naturalmente pueden, por ejemplo, incluir la adición de uno o más grupos químicos a los aminoácidos que se producen naturalmente.

Por ejemplo, pueden añadirse uno o más grupos químicos a uno o más de la posición 2’, 3’, 4’, 5’, o 6’ del anillo aromático de un resto de fenilalanina o tirosina, o a la posición 4’, 5’, 6’, o 7’ del anillo benzo de un resto triptófano. El grupo puede ser cualquier grupo químico que se pueda añadir a un anillo aromático. Algunos ejemplos de dichos grupos incluyen alquilo C1-C4 ramificado o no ramificado, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,

o t-butilo, alquiloxi C1-C4 (es decir, alcoxi), amino, alquilamino C1-C4 y dialquilamino C1-C4 (por ejemplo, metilamino, dimetilamino), nitro, hidroxilo, halo (es decir, flúor, cloro, bromo, o yodo). Algunos ejemplos específicos de derivados que no se producen naturalmente de aminoácidos que se producen naturalmente incluyen norvalina (Nva), norleucina (Nle), e hidroxiprolina (Hyp).

Otro ejemplo de una modificación de un aminoácido en un péptido es la derivatización de un grupo carboxilo de un resto de ácido aspártico o un ácido glutámico del péptido. Un ejemplo de derivatización es la amidación con amoníaco o con una amina primaria o secundaria, por ejemplo, metilamina, etilamina, dimetilamina o dietilamina. Otro ejemplo de derivatización incluye la esterificación con, por ejemplo, alcohol metílico o etílico.

Otra de dichas modificaciones incluye la derivatización de un grupo amino de un resto de lisina, arginina, o histidina. Por ejemplo, dichos grupos amino se pueden acilar. Algunos grupos acilo adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo benzoílo o un grupo alcanoílo que comprende cualquiera de los grupos alquilo C1-C4 mencionados anteriormente, tales como un grupo acetilo o propionilo.

Los aminoácidos que no se producen naturalmente son preferentemente resistentes, y de forma más preferible insensibles, a las proteasas habituales. Los ejemplos de aminoácidos que no se producen naturalmente que son resistentes o insensibles a las proteasas incluyen la forma dextrorotatoria (D) de cualquiera de los aminoácidos L que se producen naturalmente anteriormente mencionados, así como los aminoácidos L y/o D que no se producen naturalmente. Los aminoácidos D no se encuentran normalmente en proteínas, aunque se encuentran en determinados péptidos antibióticos que se sintetizan por medios diferentes que los de la maquinaria ribosómica normal de la célula destinada a la síntesis de proteínas. Tal como se usa en el presente documento, se considera que los aminoácidos D son aminoácidos que no se producen naturalmente.

A fin de minimizar la sensibilidad a las proteasa, los péptidos útiles deben tener menos de cinco, preferentemente menos de cuatro, de forma más preferible menos de tres, y lo más preferible, menos de dos aminoácidos L contiguos reconocidos por proteasas comunes, sin tener en cuenta si los aminoácidos se producen naturalmente ono se producen naturalmente. Óptimamente, el péptido tiene solo aminoácidos D, y no aminoácidos L.

Si el péptido contiene secuencias de aminoácidos sensibles a las proteasas, al menos uno de los aminoácidos es preferentemente un aminoácido D que no se produce naturalmente, confiriendo de esta forma resistencia a las proteasas. Un ejemplo de secuencia sensible a la proteasa incluye dos o más aminoácidos básicos contiguos que se escinden fácilmente por las proteasas habituales, tales como endopeptidasas y tripsina. Los ejemplos de aminoácidos básicos incluyen arginina, lisina e histidina.

Es importante que los péptidos catiónicos aromáticos tengan un número mínimo de cargas positivas netas a pH fisiológico en comparación con el número total de los restos de aminoácidos en el péptido. El número mínimo de cargas positivas netas a pH fisiológico se denominará en lo sucesivo (pm). El número total de restos de aminoácidos en el péptido se denominará en los sucesivo (r).

El número mínimo de cargas positivas netas descritas a continuación están todas a pH fisiológico. El término “pH fisiológico” tal como se usa en el presente documento se refiere al pH normal en las células de los tejidos y órganos del cuerpo del mamífero. Por ejemplo, el pH fisiológico de un ser humano es normalmente de aproximadamente 7,4, pero el pH fisiológico normal en mamíferos puede ser cualquier pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,8.

“Carga neta” tal como se usa en el presente documento se refiere al balance entre el número de cargas positivas y el número de cargas negativas transportadas por los aminoácidos presentes en el péptido. En esta memoria descriptiva, se entiende que las cargas netas se miden a pH fisiológico. Los aminoácidos que se producen naturalmente que están positivamente cargados a pH fisiológico incluyen L-lisina, L-arginina, y L-histidina. Los aminoácidos que se producen naturalmente que están cargados negativamente a pH fisiológico incluyen ácido Laspártico y ácido L-glutámico.

Normalmente, un péptido tiene un grupo amino en el extremo N cargado positivamente y un grupo carboxilo en el extremo C cargado negativamente. Las cargas se cancelan entre sí a pH fisiológico. Como un ejemplo para calcular la carga neta, el péptido Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg tiene un aminoácido cargado negativamente (es decir, Glu) y cuatro aminoácidos cargados positivamente (es decir, dos restos Arg, un resto Lys, y uno His). Por tanto, el péptido anterior tiene una carga positiva neta de tres.

Los péptidos catiónicos aromáticos pueden tener una relación entre el número mínimo de cargas positivas netas a pH fisiológico (pm) y el número total de restos de aminoácidos (r) donde 3pm es el número más grande que es menor

o igual a r + 1. La relación entre el número mínimo de cargas positivas netas (pm) y el número total de restos de aminoácidos (r) es, por tanto, de la siguiente forma:

(r): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(pm): 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

Los péptidos catiónicos aromáticos pueden tener una relación entre el número mínimo de cargas positivas netas (pm) y el número total de restos de aminoácidos (r) donde 2pm es el número más grande que es menor o igual a r + 1. La relación entre el número mínimo de cargas positivas netas (pm) y el número total de restos de aminoácido (r) es, por tanto, de la siguiente forma:

(r): 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(pm): 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10

El número mínimo de cargas positivas netas (pm) y el número total de restos de aminoácidos (r) pueden ser iguales. Los péptidos pueden tener tres o cuatro restos de aminoácidos y un mínimo de una carga positiva neta, preferentemente, un mínimo de dos cargas positivas netas y de forma más preferible un mínimo de tres cargas positivas netas.

Es también importante que los péptidos catiónicos aromáticos tengan un número mínimo de grupos aromáticos en comparación con el número total de cargas positivas netas (pt). El número mínimo de grupos aromáticos se denominará en los sucesivo (a).

Los aminoácidos que se producen naturalmente que tienen un grupo aromático incluyen los aminoácidos histidina, triptófano, tirosina, y fenilalanina. Por ejemplo, el hexapéptido Lys-Gln-Tyr-Arg-Phe-Trp tiene una carga positiva neta de dos (a la que contribuyen los restos de lisina y arginina) y tres grupos aromáticos (a los que contribuyen los restos de tirosina, fenilalanina y triptófano).

Los péptidos catiónicos aromáticos útiles pueden tener una relación entre el número mínimo de grupos aromáticos

(a): y el número total de cargas positivas netas a pH fisiológico (pt) donde 3 a es el número más grande que es menor

: o igual a pt + 1, excepto en que cuando pt es 1, a puede ser también 1. La relación entre el número mínimo de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) es, por tanto, de la siguiente forma:

(pt): 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(a): 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

Los péptidos catiónicos aromáticos pueden tener una relación entre el número mínimo de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) donde 2a es el número más grande que es menor o igual a pt + 1. La relación entre el número mínimo de restos de aminoácidos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) es, por tanto, de la siguiente forma:

(pt): 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

(a): 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10

El número de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) pueden ser iguales.

Los grupos carboxilo, especialmente el grupo carboxilo final de un aminoácido del extremo C están preferentemente amidados con, por ejemplo, amoníaco para formar la amida del extremo C. De forma alternativa, el grupo carboxilo final del aminoácido del extremo C puede estar amidado con cualquier amina primaria o secundaria. La amina primaria o secundaria puede ser, por ejemplo, un alquilo, especialmente un alquilo C1-C4 ramificado o no ramificado,

o una aril amina. De acuerdo con esto, el aminoácido en el extremo C del péptido puede convertirse en un grupo amido, N-metilamido, N-etilamido, N,N-dimetilamido, N,N-dietilamido, N-metil-N-etilamido, N-fenilamido o N-fenil-Netilamido.

Los grupos carboxilato libres de los restos de asparagina, glutamina, ácido aspártico, y ácido glutámico que no se encuentran en el extremo C de los péptidos catiónicos aromáticos pueden estar también amidados dondequiera que se encuentren en el péptido. La amidación en estas posiciones internas puede ser con amoníaco o con cualquiera de las aminas primarias o secundarias descritas anteriormente.

Un péptido catiónico aromático útil es un tripéptido que tiene dos cargas positivas netas y al menos un aminoácido aromático. Un péptido catiónico aromático es un tripéptido que tiene dos cargas positivas netas y dos aminoácidos aromáticos.

Los péptidos catiónicos aromáticos útiles incluyen, pero no se limitan a, los siguientes ejemplos de péptidos:

Lys-D-Arg-Tyr-NH2, Phe-D-Arg-His, D-Tyr-Trp-Lys-NH2, Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2, Tyr-His-D-Gly-Met, Phe-Arg-D-His-Asp, Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2, Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg, D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg, Lys-D-Gln-Tyx-Arg-D-Phe-Trp-NH2, Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His, Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2, Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2, Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys, Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2, Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys, Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg- D-Gly-Lys-NH2, D-His-Lys-Tyr- D-Phe-Glu- D-Asp- D-His- D-Lys-Arg-Trp-NH2, Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe, Tyr-D-His-Phe- D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe, Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2, Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr, Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys, Glu-Arg-D-Lys-Tyr- D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2, Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly, D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2, Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-D-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe, His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2, Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp y Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-NH2.

Los péptidos útiles tienen actividad agonista del receptor mu-opioide (es decir, activan el receptor mu-opioide). La activación del receptor mu-opioide estimula normalmente un efecto analgésico.

Se prefiere un péptido catiónico aromático que tenga actividad para el receptor mu-opioide. Por ejemplo, durante el tratamiento a corto plazo, tal como en una enfermedad o dolencia aguda, puede ser beneficioso usar un péptido catiónico aromático que active el receptor mu-opiode. Dichas enfermedades y dolencias agudas están asociadas a menudo con un dolor moderado o severo. En estos ejemplos, el efecto analgésico del péptido catiónico aromático puede ser beneficioso en la pauta terapéutica del paciente u otro mamífero, aunque puede utilizarse también un péptido catiónico aromático no active el receptor mu-opioide con o sin un analgésico de acuerdo con los requerimientos clínicos.

Los efectos potenciales adversos pueden incluir sedación, estreñimiento y depresión respiratoria.

Los ejemplos de dolencias agudas incluyen ataque al corazón, ictus y lesión traumática. La lesión traumática puede incluir lesión cerebral y de la médula espinal traumática.

Los ejemplos de enfermedades o dolencias crónicas incluyen enfermedad de la arteria coronaria y cualquier trastorno degenerativo tal como los descritos a continuación.

Los péptidos útiles que tienen actividad del receptor mu-opioide son normalmente aquellos péptidos que tienen un resto tirosina o un derivado de tirosina en el extremo N (es decir, la posición del primer aminoácido). Los derivados de tirosina preferidos incluyen 2’-metiltirosina (Mmt); 2’,6’-dimetiltirosina (2’6’Dmt); 3’,5’-dimetiltirosina (3’5’Tmt); N,2’,6’-tri.metiltirosina (Tmt); y 2’-hidroxi-6’-metiltirosina (Hmt).

Un péptido que tiene actividad del receptor mu-opioide tiene la fórmula Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (representada por conveniencia por el acrónimo: DALDA, que se denomina en el presente documento SS-01). DALDA tiene una carga neta positiva de tres, a la que contribuyen los aminoácidos tirosina, arginina, y lisina y tiene dos grupos aromáticos a los que contribuyen los aminoácidos fenilalanina y tirosina. La tirosina de DALDA puede ser un derivado modificado de la tirosina, tal como en 2’,6’-dimetiltirosina, para producir el compuesto que tiene la fórmula 2’,6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (es decir, Dmt1-DALDA, que se denomina en el presente documento SS-02)

Los péptidos que no tienen actividad del receptor mu-opioide generalmente no tienen un resto de tirosina o un derivado de tirosina en el extremo N (es decir, el aminoácido en la posición uno). El aminoácido en el extremo N puede ser cualquier aminoácido que se produzca naturalmente o no naturalmente diferente de la tirosina.

De acuerdo con la invención, la secuencia de aminoácidos de Dmt1-DALDA (SS-02) se redispone de tal manera que 5 Dmt no está en el extremo N. Un ejemplo de dicho péptido catiónico aromático que no tiene actividad del receptor mu-opioide tiene la fórmula D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2 (denominada en esta memoria descriptiva SS-31).

DALDA, Phe1-DALDA, SS-31, y sus derivados pueden incluir adicionalmente análogos funcionales. Un péptido se considera un grupo funcional de DALDA, Phe1-DALDA, o SS-31 si el análogo tiene la misma función que DALDA, 10 Phe1-DALDA, or SS-31. El análogo puede ser, por ejemplo, una variante de sustitución de DALDA, Phe1-DALDA, o SS-31, donde uno o más aminoácidos se sustituyen por otro aminoácido.

Las variantes de sustitución adecuadas de DALDA, Phe1-DALDA, o SS-31 incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con sus características fisicoquímicas como sigue: 15

(a): Aminoácidos no polares: Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G);

(b): Aminoácidos ácidos: Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);

(c): Aminoácidos básicos: His(H) Arg(R) Lys(K);

(d) Aminoácidos hidrófobos: Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); y 20 (e) Aminoácidos aromáticos: Phe(F) Tyr(Y) Trp(W) His (H).

Las sustituciones de un aminoácido en un péptido por otro aminoácido del mismo grupo se denominan sustituciones conservativas y pueden preservar las características fisicoquímicas del péptido original. En contraste, la sustitución de un aminoácido en un péptido por otro aminoácido de un grupo diferente es generalmente más probable que altere

25 las características del péptido original.

Los ejemplos de análogos útiles que activan los receptores mu-opiodes incluyen, pero no se limitan, a los péptidos catiónicos aromáticos que se muestran en la Tabla 1

30 TABLA 1

Aminoácido en la Aminoácido en Aminoácido en Aminoácido en Aminoácido en la posición 5 (si está Modificación en la posición 1 la posición 2 la posición 3 posición 4 presente) el extremo C

Tyr: D-Arg Phe Lys NH2

Tyr: D-Arg Phe Orn NH2

Tyr: D-Arg Phe Dab NH2

Tyr: D-Arg Phe Dap NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Lys NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Lys Cys NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Lys-NH

(CH2)2-NH-dns

2’6’Dmt: D-Arg Phe Lys-NH NH2

(CH2)2-NH-atn

2’6’Dmt: D-Arg Phe dnsLys NH2

2’6’Dmt: D-Cit Phe Lys NH2

2’6’Dmt: D-Cit Phe Ahp NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Orn NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Dab NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Dap NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Ahp (ácido 2- NH2

aminoheptanoico)

Bio-2’6’Dmt: D-Arg Phe Lys NH2

3’5’Dmt: D-Arg Phe Lys NH2

3’6’Dmt: D-Arg Phe Om NH2

3’5’Dmt: D-Arg Phe Dab NH2

3’5’Dmt: D-Arg Phe Dap NH2

Tyr: D-Arg Tyr Lys NH2

Tyr: D-Arg Tyr Om NH2

Tyr: D-Arg Tyr Dab NH2

Tyr: D-Arg Tyr Dap NH2

2’6’Dmt: D-Arg Tyr Lys NH2

2’6’Dmt: D-Arg Tyr Om NH2

2’6’Dmt: D-Arg Tyr Dab NH2

2’6’Dmt: D-Arg Tyr Dap NH2

Aminoácido en la

Aminoácido en
Aminoácido en
Aminoácido en: Aminoácido en la posición 5 (si está Modificación en

la posición 1: la posición 2 la posición 3 posición 4 presente) el extremo C

2’6’Dmt: D-Arg 2’6’Dmt Lys NH2

2’6’Dmt: D-Arg 2’6’Dmt Om NH2

2’6’Dmt: D-Arg 2’6’Dmt Dab NH2

2’6’Dmt: D-Arg 2’6’Dmt Dap NH2

3’5’Dmt: D-Arg 3’5’Dmt Arg NH2

3’5’Dmt: D-Arg 3’5’Dmt Lys NH2

3’5’Dmt: D-Arg 3’5’Dmt Om NH2

3’5’Dmt: D-Arg 3’5’Dmt Dab NH2

Tyr: D-Lys Phe Dap NH2

Tyr: D-Lys Phe Arg NH2

Tyr: D-Lys Phe Lys NH2

Tyr: D-Lys Phe Orn NH2

2’6’Dmt: D-Lys Phe Dab NH2

2’6’Dmt: D-Lys Phe Dap NH2

2’6’Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

2’6’Dmt: D-Lys Phe Lys NH2

3’5’Dmt: D-Lys Phe Om NH2

3’5’Dmt: D-Lys Phe Dab NH2

3’5’Dmt: D-Lys Phe Dap NH2

3’5’Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

Tyr: D-Lys Tyr Lys NH2

Tyr: D-Lys Tyr Om NH2

Tyr: D-Lys Tyr Dab NH2

Tyr: D-Lys Tyr Dap NH2

2’6’Dmt: D-Lys Tyr Lys NH2

2’6’Dmt: D-Lys Tyr Om NH2

2’6’Dmt: D-Lys Tyr Dab NH2

2’6’Dmt: D-Lys Tyr Dap NH2

2’6’Dmt: D-Lys 2’6’Dmt Lys NH2

2’6’Dmt: D-Lys 2’6’Dmt Om NH2

2’6’Dmt: D-Lys 2’6’Dmt Dab NH2

2’6’Dmt: D-Lys 2’6’Dmt Dap NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe dnsDap NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe atnDap NH2

3’5’Dmt: D-Lys 3’5’Dmt Lys NH2

3’5’Dmt: D-Lys 3’5’Dmt Om NH2

3’5’Dmt: D-Lys 3’5’Dmt Dab NH2

3’5’Dmt: D-Lys 3’5’Dmt Dap NH2

Tyr: D-Lys Phe Arg NH2

Tyr: D-Orn Phe Arg NH2

Tyr: D-Dab Phe Arg NH2

Tyr: D-Dap Phe Arg NH2

2’6’Dmt: D-Arg Phe Arg NH2

2’6’Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

2’6’Dmt: D-Orn Phe Arg NH2

2’6’Dmt: D-Dab Phe Arg NH2

3’5’Dmt: D-Dap Phe Arg NH2

3’5’Dmt: D-Arg Phe Arg NH2

3’5’Dmt: D-Lys Phe Arg NH2

3’5’Dmt: D-Orn Phe Arg NH2

Tyr: D-Lys Tyr Arg NH2

Tyr: D-Orn Tyr Arg NH2

Tyr: D-Dab Tyr Arg NH2

Tyr: D-Dap Tyr Arg NH2

2’6’Dmt: D-Arg 2’6’Dmt Arg NH2

2’6’Dmt: D-Lys 2’6’Dmt Arg NH2

2’6’Dmt: D-Orn 2’6’Dmt Arg NH2

2’6’Dmt: D-Dab 2’6’Dmt Arg NH2

3’5’Dmt: D-Dap 3’5’Dmt Arg NH2

3’5’Dmt: D-Arg 3’5’Dmt Arg NH2

3’5’Dmt: D-Lys 3’5’Dmt Arg NH2

3’5’Dmt: D-Orn 3’5’Dmt Arg NH2

Aminoácido en Aminoácido en: Aminoácido en Aminoácido en la Aminoácido en la Modificación en

la posición 1 la posición 2: la posición 3 posición 4 posición 5 (si está el extremo C

presente)

Mmt D-Arg: Phe Lys NH2

Mmt D-Arg: Phe Om NH2

Mmt D-Arg: Phe Dab NH2

Mmt D-Arg: Phe Dap NH2

Tmt D-Arg: Phe Lys NH2

Tmt D-Arg: Phe Om NH2

Tmt D-Arg: Phe Dab NH2

Tmt D-Arg: Phe Dap NH2

Hmt D-Arg: Phe Lys NH2

Hmt D-Arg: Phe Om NH2

Hmt D-Arg: Phe Dab NH2

Hmt D-Arg: Phe Dap NH2

Mmt D-Lys: Phe Lys NH2

Mmt D-Lys: Phe Om NH2

Mmt D-Lys: Phe Dab NH2

Mmt D-Lys: Phe Dap NH2

Mmt D-Lys: Phe Arg NH2

Tmt D-Lys: Phe Lys NH2

Tmt D-Lys: Phe Orn NH2

Tmt D-Lys: Phe Dab NH2

Tmt D-Lys: Phe Dap NH2

Tmt D-Lys: Phe Arg NH2

Hmt D-Lys: Phe Lys NH2

Hmt D-Lys: Phe Om NH2

Hmt D-Lys: Phe Dab NH2

Hmt D-Lys: Phe Dap NH2

Hmt D-Lys: Phe Arg NH2

Mmt D-Lys: Phe Arg NH2

Mmt D-Orn: Phe Arg NH2

Mmt D-Dab: Phe Arg NH2

Mmt D-Dap: Phe Arg NH2

Mmt D-Arg: Phe Arg NH2

Tmt D-Lys: Phe Arg NH2

Tmt D-Orn: Phe Arg NH2

Tmt D-Dab: Phe Arg NH2

Tmt D-Dap: Phe Arg NH2

Tmt D-Arg: Phe Arg NH2

Hmt D-Lys: Phe Arg NH2

Hmt D-Orn: Phe Arg NH2

Hmt D-Dab: Phe Arg NH2

Hmt D-Dap: Phe Arg NH2

Hmt D-Arg: Phe Arg NH2

Dab = diaminobutírico

Dap = ácido diaminopropiónico

Dmt = dimetiltirosina

Mmt = 2’-metiltirosina

Tmt = N, 2’,6’-trimetiltirosina

Hmt = 2’-hidroxi,6’-metiltirosina

dnsDap =ácido β-dansil-L-α,β-diaminopropiónico

atnDap = ácido β-antraniloil-L-α,β-diaminopropiónico

Bio = biotina

Los aminoácidos de los péptidos que se muestran en la tabla 1 y 2 pueden estar en cualquiera de la configuración L

o la configuración D.

5 El péptido catiónico aromático descrito anteriormente es útil en el tratamiento de cualquier enfermedad o dolencia que se asocia con MPT. Dichas enfermedades y dolencias incluyen, pero no se limitan a, isquemia y/o reperfusión de un tejido u órgano, hipoxia y cualquiera de numerosas enfermedades degenerativas. Los mamíferos que necesitan de tratamiento o prevención de MPT son aquellos mamíferos que padecen de estas enfermedades o

10 dolencias.

Isquemia en un tejido u órgano de un mamífero es una dolencia patológica multifacetada que está producida por privación del oxígeno (hipoxia) y/o privación de glucosa (por ejemplo, sustrato). La privación del oxígeno y/o la glucosa en las células de un tejido u órgano conduce a una reducción o la pérdida total de capacidad de generación de energía y la consiguiente pérdida de función del transporte de iones activos a través de las membranas celulares. La privación de oxígeno y/o glucosa conduce también a cambios patológicos en otras membranas celulares, que incluyen la transición de la permeabilidad en las membranas mitocondriales. Además, otras moléculas, tales como las proteínas apoptóticas normalmente compartimentadas en el interior de la mitocondria, pueden perderse en el citoplasma y producir muerte celular apoptótica. La isquemia profunda puede conducir a muerte celular necrótica.

La isquemia o hipoxia en un tejido u órgano concreto puede ser producida por una pérdida o reducción severa en el suministro de sangre al tejido o al órgano. La pérdida o la reducción severa en el suministro de sangre puede, por ejemplo, deberse a ictus tromboembólico, ateroesclerosis coronaria, o enfermedad vascular periférica. El tejido afectado por isquemia o hipoxia es normalmente el músculo, tal como el cardiaco, esquelético, o músculo liso.

El órgano afectado por isquemia o hipoxia puede ser cualquier órgano que está sujeto a isquemia o hipoxia. Los ejemplos de órganos afectados por isquemia o hipoxia incluyen cerebro, corazón, riñón, y próstata. Por ejemplo, la isquemia o hipoxia del músculo cardiaco está producida comúnmente por bloqueos ateroescleróticos o trombóticos que conducen a la reducción o a la disminución del aporte de oxígeno a los tejidos cardiacos desde el suministro de sangre procedente de las arterias cardiacas y de los capilares . Dicha isquemia o hipoxia cardiaca puede producir dolor y necrosis del músculo cardiaco afectado, y en último extremo puede conducir a la insuficiencia cardiaca.

La isquemia o la hipoxia en el músculo esquelético o el músculo liso puede surgir de causas similares. Por ejemplo, la isquemia o la hipoxia en el músculo liso intestinal o el músculo esquelético de las extremidades pueden estar producidos también por bloqueos ateroescleróticos o trombóticos.

La reperfusión es la restauración del flujo sanguíneo a cualquier órgano o tejido donde el flujo de sangre está disminuido o bloqueado. Por ejemplo, el flujo de sangre puede restaurarse en cualquier órgano o tejido afectado por isquemia o hipoxia. La restauración del flujo sanguíneo (reperfusión) puede producirse mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, la reperfusión de los tejidos cardiacos isquémicos puede deberse a angioplastia, injerto con derivación de la arteria coronaria, o el uso de fármacos trombolíticos.

El péptido de la presente invención se puede usar también en el tratamiento o la profilaxis de las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la MPT. Las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la MPT incluyen, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrófica (ELA, conocida también como enfermedad de Lou Gherig) Se puede usar el péptido de la presente invención para retrasar el inicio o ralentizar la progresión de estas y otras enfermedades neurodegenerativas asociadas con la MPT. El péptido de la presente invención es particularmente útil en el tratamiento de los seres humanos que padecen de las etapas iniciales de las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la MPT y en los seres humanos predispuestos a estas enfermedades.

El péptido de la presente invención puede utilizarse también para preservar un órgano de un mamífero antes del trasplante. Por ejemplo, un órgano extraído puede ser susceptible a la MPT debido a la carencia de flujo sanguíneo. Por tanto, el péptido puede utilizarse para evitar la MPT en el órgano extraído.

El órgano extraído se puede colocar en una solución tampón normalizada, tal como aquella comúnmente utilizada en la técnica. Por ejemplo, un corazón extraído se puede colocar en una solución cardioplégica que contiene los péptidos descritos anteriormente. El técnico experto puede determinar fácilmente la concentración del péptido en la solución tamponada normalizada. Dichas concentraciones pueden ser, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente y aproximadamente 10 µM, preferentemente aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 µM.

El péptido puede también administrarse a un mamífero que toma un fármaco para tratar una dolencia o enfermedad. Si un efecto secundario del fármaco incluye la MPT, los mamíferos que toman dichos fármacos tendrían grandes beneficios procedentes del péptido de la invención.

Un ejemplo de un fármaco que induce toxicidad celular afectando la MPT es el fármaco de terapia Adriamicina.

Síntesis de los péptidos

El péptido de la presente invención puede sintetizarse químicamente mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Dichos métodos para sintetizar la proteína incluyen, por ejemplo, los descritos por Stuart y Young en “Solid Phase Peptide Synthesis," Segunda Edición, Pierce Chemical Company (1984), y en "Solid Phase Peptide Synthesis," Methods Enzymol. 289, Academic Press, Inc, Nueva York (1997).

Modos de administración

El péptido de la presente invención se administra a un mamífero en una cantidad eficaz para reducir el número de mitocondrias que experimentan, o que evitan, la MPT. La cantidad eficaz se determina durante los ensayos preclínicos y los ensayos clínicos mediante métodos con los que están familiarizados los médicos y otros profesionales sanitarios.

Una cantidad eficaz de un péptido de la presente invención, preferentemente en una composición farmacéutica, puede administrarse a un mamífero que necesita la misma mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos para administrar los compuestos farmacéuticos.

El péptido puede administrarse sistémica o localmente. En una realización, el péptido se administra de forma intravenosa. Por ejemplo, el péptido catiónico aromático de la presente invención puede administrarse mediante inyección rápida de bolo intravenoso. Preferentemente, sin embargo, el péptido se administra a una velocidad constante de infusión intravenosa.

El péptido se puede inyectar directamente en la arteria coronaria durante, por ejemplo, angioplastia o cirugía de derivación coronaria, o aplicarse en las prótesis endovasculares coronarias.

El péptido puede administrase por vía oral, tópica, intranasal, intramuscular, subcutánea, o transdérmica. En una realización preferida, la administración transdérmica de los péptidos catiónicos aromáticos mediante los métodos de la presente invención es mediante iontoforesis, donde el péptido cargado se libera a través de la piel mediante una corriente eléctrica.

Otras vías de administración incluyen la intracerebroventricular o la intratecal. Intracerebroventricularmente se refiere a la administración en el sistema ventricular del cerebro. Intratecal se refiere a la administración en el espacio bajo la membrana aracnoide de la médula espinal. De esta manera, la administración intracerebroventricular o intratecal puede preferirse para aquellas enfermedades y dolencias que afectan los órganos o tejidos del sistema nervioso central. En una realización preferida, se usa la administración intratecal para la lesión traumática de la médula espinal.

El péptido de la invención puede también administrarse a mamíferos mediante liberación continua, como se conoce en la técnica. La administración mediante liberación continua es un método de administración del fármaco para conseguir un determinado nivel del fármaco durante un periodo de tiempo concreto. El nivel se mide normalmente mediante la concentración en suero o plasma.

Cualquier formulación conocida en la técnica de farmacia es adecuada para la administración del péptido catiónico aromático de la presente invención. Para la administración oral, se pueden utilizar formulaciones líquidas o sólidas. Algunos ejemplos de formulaciones incluyen comprimidos, cápsulas de gelatina, píldoras, comprimidos gruesos, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, chicles y similares. El péptido se puede mezclar con un vehículo farmacéutico adecuado (portador) o excipiente tal como entienden los expertos en la materia. Los ejemplos de vehículos y excipientes incluyen almidón, leche, azúcar, determinados tipos de arcillas, gelatina, ácido láctico, ácido esteárico o sus sales, que incluyen estearato de magnesio o de calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas y glicoles.

Para la administración sistémica, intracerebroventricular, intratecal, tópica, intranasal, subcutánea, o transdérmica, las formulaciones del péptido catiónico aromático de la presente invención pueden utilizar diluyentes, portadores o excipientes convencionales, etc., tales como se conocen en la técnica que se pueden emplear para administrar los péptidos. Por ejemplo, las formulaciones pueden comprender uno o más de las siguientes: un estabilizante, un tensioactivo, preferentemente un tensioactivo no iónico, y opcionalmente una sal y/o un agente tamponante. El péptido puede administrarse en la forma de una disolución acuosa, o en una forma liofilizada.

El estabilizante puede ser, por ejemplo, un aminoácido, tal como por ejemplo, glicina; o un oligosacárido, tal como por ejemplo, sacarosa, trehalosa, lactosa o dextrano. De forma alternativa, el estabilizante puede ser un alcohol azucarado, tal como por ejemplo, manitol, o una de sus combinaciones. Preferentemente el estabilizante o la combinación de estabilizantes constituye entre aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % en peso para el peso del péptido.

El tensioactivo es preferentemente un tensioactivo no iónico, tal como un polisorbato. Algunos ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen Tween20, Tween80; un polietilenglicol o un polioxietilen polioxipropilenglicol, tal como Pluronic F-68 a entre aproximadamente 0,001 % (p/v) a aproximadamente 10 % (p/v).

La sal o agente tamponante puede ser cualquier sal o agente tamponante, tal como por ejemplo, cloruro de sodio, o fosfato de sodio/potasio, respectivamente. Preferentemente, el agente tamponante mantiene el pH de la composición farmacéutica en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5. La sal y/o el agente tamponante es también útil para mantener la osmolalidad a un nivel adecuado para la administración a un ser humano o un animal. Preferentemente la sal o el agente tamponante está presente en una concentración aproximadamente isotónica de aproximadamente 150 mum a aproximadamente 300 mM.

Las formulaciones del péptido de la presente invención pueden contener adicionalmente uno o más aditivos convencionales. Algunos ejemplos de dichos aditivos incluyen un solubilizante tal como, por ejemplo, glicerol; un antioxidante tal como por ejemplo, cloruro de benzalconio (una mezcla de compuestos de amonio cuaternario, conocidos como “quats”), alcohol bencílico, cloretona o clorobutanol; agente anestésico tal como por ejemplo un derivado de morfina, o un agente isotónico, etc, tal como se ha descrito anteriormente. Como una precaución adicional frente a la oxidación u otro deterioro, las composiciones farmacéuticas pueden almacenarse con nitrógeno gas en viales cerrados herméticamente con retenedores impermeables.

El mamífero puede ser cualquier mamífero, incluyendo, por ejemplo, animales de granja, tales como ovejas, cerdos, y caballos, mascotas, tales como perros y gatos, animales de laboratorio, tales como ratas, ratones y conejos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.

Ejemplos

Ejemplo 1: [Dmt1] DALDA penetra la membrana celular.

Se estudió la captación celular de [3H][Dmt1] DALDA utilizando una línea de células epiteliales intestinales humanas (Caco-2), y se confirmó con SH-ST5Y (célula de neuroblastoma humano), HEK293 (células de riñón embriónico humano) y células CRFK (células epiteliales de riñón). Se hicieron crecer monocapas de células en placas de 12 pocillos (5x105 células/pocillo) revestidas con colágeno durante 3 días. En el día 4, las células se lavaron dos veces con HBSS precalentado, y a continuación se incubaron con 0,2 ml de HBSS que contienen cualquiera de 250 nM [3H][Dmt1] DALDA a 37°C o 4°C durante varias veces hasta 1 h.

[3H][Dmt1] DALDA se observó en el lisado celular tan pronto como en 5 min, y se consiguieron niveles a estado estacionario en 30 min. La cantidad total de [3H][Dmt1] DALDA recuperado en el lisado celular tras 1 h de incubación representó aproximadamente un 1 % del fármaco total. La captación de [3H][Dmt1] DALDA fue más lenta a 4º C en comparación con 37º C, pero alcanzó un 76,5 % en 45 min y un 86,3 % en 1 h. La internalización [3H][Dmt1] DALDA no se limitó a células Caco-2, sino que se observó también en células SH-SY5Y, HEK293 y CRFK. Se estimó que la concentración intracelular de [Dmt1] DALDA era aproximadamente 50 veces más que la concentración extracelular.

En un experimento separado, se incubaron las células con una gama de concentraciones de [Dmt1] DALDA (1 µM – 3mM) durante 1 h a 37º C. Al término del periodo de incubación, se lavaron las células 4 veces con HBSS, y se añadieron 0,2 ml de NaOH 0,1 N con SDS al 1 % a cada pocillo. A continuación los contenidos celulares se transfirieron a viales de centelleo y se contó la radiación. Para distinguir entre la radioactividad internalizada procedente de la radioactividad asociada a la superficie, se incluyó una etapa de lavado ácido. Antes de la lisis celular, se incubaron las células con 0,2 ml de ácido acético 0,2 M / NaCl 0,05 M durante 5 min en hielo.

Se confirmó la captación [Dmt1] DALDA en células Caco-2 mediante microscopio de barrido de laser confocal (CSLM) utilizando un análogo fluorescente de [Dmt1] DALDA (Dmt-D-Arg-Phe-dnsDap-NH2; donde dnsDap = ácido β-dansil-1-α,β-diaminopropiónico). Se hicieron crecer las células tal como se ha descrito anteriormente y se plaquearon en placas de fondo de vidrio (35 mm) (MatTek Corp., Ashland, MA) durante 2 días. A continuación se retiró el medio y se incubaron las células con 1 ml de HBSS que contenía de 0,1 µM a 1,0 µM del análogo de péptido fluorescente a 37º C durante 1 h: A continuación, las células se lavaron tres veces con HBSS enfriado en hielo y se cubrieron con 200 µl de PBS, y se llevó a cabo la microscopía en un lapso de tiempo de 10 min a temperatura ambiente utilizando un microscopio Nikon de barrido de laser confocal con objetivo C-Apochromat 63x/1,2W corregido. Se llevó a cabo la excitación a 340 nm por medio de un láser de UV, y se midió la emisión a 520 nm: Para el seccionamiento óptico en la dirección z, se prepararon 5-10 marcos con 2,0 µm.

El CLSM confirmó la captación de Dmt-D-Arg-Phe-dnsDap-NH2 fluorescente en células Caco-2 tras la incubación con 0,1 µM de [Dmt1,DnsDap4] DALDA durante 1 h a 37º C. la captación del péptido fluorescente fue similar a 37º C y 4º C. La fluorescencia apareció difusa a lo largo del citoplasma pero se excluyó completamente del núcleo.

Ejemplo 2: Direccionamiento de [Dmt1] DALDA hacia la mitocondria

Para examinar la distribución subcelular de [Dmt1]DALDA, se preparó el análogo fluorescente, [Dmt1,AtnDap4]DALDA (Dmt-D-Arg-Phe-atnDap-NH2; donde atn = ácido β-antraniloil-1-α,β-diamino-propiónico. El análogo contenía ácido β-antraniloil-1-α,β-aminopropiónico en lugar del resto de lisina en la posición 4. Las células se hicieron crecer tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se plaquearon en placas de fondo de vidrio (35 mm) (MatTek Corp., Ashland, MA) durante 2 días. A continuación se retiró el medio y se incubaron las células con 1 ml de HBSS que contenía 0,1 µM de [Dmt1,AtnDap4] DALDA a 37º C durante 15 min a 1 h.

Se incubaron también células con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM, 25 nM), un colorante para teñir mitocondrias, durante 15 min a 37º C. A continuación las células se lavaron tres veces con HBSS enfriado con hielo y se cubrieron con 200 µl de PBS, y se llevó a cabo la microscopía en un lapso de tiempo de 10 min a temperatura ambiente utilizando un microscopio Nikon de barrido de láser confocal con un objetivo C-Apochromat 63x/1,2W

corregido. Para [Dmt1,AtnDap4]DALDA, se llevó a cabo la excitación a 350 nm por medio de un láser de UV, y se midió la emisión a 520 nm. Para el TMRM, se llevó a cabo la excitación a 536 nm y se midió la emisión a 560 nm.

El CLSM mostró la captación de [Dmt1,AtnDap4]DALDA fluorescente en células Caco-2 tras la incubación durante tan poco como 15 min a 37º C. Se excluyó completamente la captación del colorante del núcleo, pero el colorante azul mostró una distribución listada en el citoplasma. Las mitocondrias se marcaron en rojo con TMRM. La distribución de [Dmt1,AtnDap4]DALDA en las mitocondrias se demostró por el solapamiento de la distribución de [Dmt1,AtnDap4]DALDA y la distribución de TMRM.

Ejemplo 3: Captación de [Dmt1] DALDA en las mitocondrias.

Para aislar las mitocondrias a partir del hígado de ratón, se sacrificaron los ratones mediante decapitación. Se extrajo el hígado y se colocó rápidamente en medio de homogeneización de hígado enfriado. El hígado se dividió finamente utilizando tijeras y a continuación se homogeneizó manualmente utilizando un homogeneizador de vidrio.

El homogenado se centrifugó durante 10 min a 1000xg a 4º C. El sobrenadante se aspiró y se transfirió a tubos de policarbonato y se centrifugó de nuevo durante a 3000xg, 4º C. El sobrenadante resultante se retiró, y los lípidos grasos sobre la pared lateral se limpiaron cuidadosamente.

El aglomerado se volvió a suspender em medio de homogenado de hígado y la homogeneización se repitió dos veces. El aglomerado mitocondrial purificado final se volvió a suspender en el medio. La concentración de proteínas en la preparación mitocondrial se determinó mediante el procedimiento Bradford.

Aproximadamente 1,5 mg de mitocondrias en 400 µl de tampón se incubaron con [3H][Dmt1]DALDA durante 5-30 min a 37° C. A continuación, las mitocondrias se extrajeron mediante centrifugación y se determinó la cantidad de radioactividad en la fracción mitocondrial y la fracción de tampón. Suponiendo un volumen de matriz mitocondrial de 0,7 µl/mg de proteínas (Lim y col., J Physiol 545: 961-974, 2002), se encontró que la concentración de [3H][Dmt1] DALDA era 200 veces mayor que en el tampón. Por tanto, [Dmt1] DALDA se concentró en las mitocondrias.

Basándose en estos datos, se puede estimar la concentración de [Dmt1] DALDA en mitocondrias cuando los

corazones de cobaya aislados se perfundieron con [Dmt1] DALDA

Concentración de [Dmt1] DALDA en perfusato coronario Concentración de [Dmt1] DALDA en miocitos Concentración de [Dmt1] DALDA en mitocondrias: 0,1 µM 5 µM 1,0 mM

Ejemplo 4: Acumulación de [Dmt1] DALDA en mitocondrias aisladas (Fig. 1)

Para demostrar adicionalmente que [Dmt1] DALDA se distribuye de forma selectiva en mitocondrias, los inventores examinaron la captación de [Dmt1, AtnDap4] DALDA y [3H][Dmt1] DALDA en mitocondrias aisladas de hígado de ratón. La rápida captación de [Dmt1, AtnDap4] DALDA se observó como una detención inmediata de su fluorescencia tras la adición de mitocondrias (Figura 1A). El pretratamiento de las mitocondrias con FCCP (carbonil cianuro de p(trifluorometoxi)-fenilhidrazona), un desacoplador que da como resultado una despolarización inmediata de las mitocondrias, redujo solo la captación de [Dmt1, AtnDap4] DALDA solamente en <20 %. Por tanto, la captación de [Dmt1, AtnDap4] DALDA no es dependiente de potencial.

Para confirmar que el direccionamiento mitocondrial no era un artefacto del fluoróforo, los inventores examinaron también la captación mitocondrial de [3H][Dmt1] DALDA. Las mitocondrias aisladas se incubaron con [3H][Dmt1] DALDA y se determinó la radiactividad en el aglomerado mitocondrial y el sobrenadante. La cantidad de radioactividad en el aglomerado no cambió entre 2 min y 8 min. El tratamiento de las mitocondrias con FCCP disminuyó la cantidad de [3H][Dmt1]DALDA asociada con el aglomerado mitocondrial solamente en ~ 20 % (Figura 1B).

El efecto mínimo de FCCP sobre la captación de [Dmt1] DALDA sugirió que [Dmt1] DALDA estuvo probablemente asociado con las membranas mitocondriales o en el espacio intermembrana más bien que en la matriz. Los inventores examinaron a continuación el efecto de la hinchazón mitocondrial sobre la acumulación de [Dmt1, AtnDap4] DALDA en las mitocondrias utilizando alameticina para inducir la hinchazón y la ruptura de la membrana externa. A diferencia de TMRM, la captación de [Dmt1, AtnDap4] DALDA se invirtió solo parcialmente por la hinchazón mitocondrial (Fig. 1C). de esta manera, [Dmt1] DALDA se asoció con las membranas mitocondriales.

Ejemplo 5: [Dmt1] DALDA no altera la respiración o el potencial mitocondrial (Fig. 1D)

La acumulación de [Dmt1] DALDA en mitocondrias no altera la función mitocondrial. La incubación de las mitocondrias de hígado de ratón aisladas con 100 µM de [Dmt1] DALDA no altera el consumo de oxígeno durante el estado 3 o el estado 4, o la relación respiratoria (estado 3/estado 4) (6,2 frente a 6,0). El potencial de membrana mitocondrial se midió utilizando TMRM (Fig. 1D). La adición de mitocondrias dio como resultado la detención inmediata de la señal de TMRM, que se invirtió fácilmente mediante la adición de FCCP, indicando la despolarización mitocondrial. La adición de Ca2+ (150 µM) dio como resultado una inmediata despolarización seguida por la pérdida progresiva de detención indicativa de MPT. La adición de [Dmt1] DALDA solo, incluso a 200 µM, no produce la despolarización mitocondrial o la MPT.

Ejemplo 6: [Dmt1] DALDA protege frente a la MPT inducida por Ca2+ y ácido 3-nitropropiónico. (Fig. 2)

Además de no tener efecto directo sobre el potencial mitocondrial, [Dmt1] DALDA fue capaz de proteger frente a la MPT inducida por sobrecarga de Ca2+. El pretratamiento de las mitocondrias aisladas con [Dmt1] DALDA (10 µM) durante 2 min antes de la adición de Ca2+ dio como resultado solo una despolarización transitoria y evitó el inicio de la MPT (Figura 2A). [Dmt1] DALDA aumentó de manera dependiente de la dosis la tolerancia de las mitocondrias a los estímulos acumulativos de Ca2+. La Figura 2B muestra que [Dmt1] DALDA aumentó el número de adiciones de Ca2+ que las mitocondrias aisladas podrían tolerar antes de MPT.

Ácido 3-nitropropiónico (3NP) es un inhibidor irreversible de la succinato deshidrogenasa en el complejo II de la cadena de transporte de electrones. La adición de 3NP (1 mM) a las mitocondrias aisladas produjo la disipación del potencial mitocondrial y el inicio de la MPT (Figura 2C). El pretratamiento de las mitocondrias con [Dmt1] DALDA dependiente de la dosis retrasó el inició de la MPT inducida por 3NP (Figura 2C).

Para demostrar que [Dmt1] DALDA puede penetrar las membranas celulares y proteger frente a la despolarización mitocondrial estimulada por 3NP, se trataron células Caco-2 con 3NP (10 mM) en ausencia o presencia de [Dmt1] DALDA (0,1 µM) durante 4 h, y a continuación se incubaron con TMRM y se examinaron con LSCM. En las células del control, las mitocondrias se visualizaron como vetas finas a lo largo del citoplasma. En las células tratadas con 3NP, la fluorescencia de TMRM fue mucho más reducida sugiriendo una despolarización generalizada. En contraste, el tratamiento concurrente con [Dmt1] DALDA protegió frente a la despolarización mitocondrial producida por 3NP.

Ejemplo 7: [Dmt1] DALDA protege frente a la hinchazón mitocondrial y la liberación del citocromo c

La apertura de poros debida a la MPT da como resultado la hinchazón mitocondrial. Los inventores examinaron los efectos de [Dmt1] DALDA sobre la hinchazón mitocondrial midiendo la reducción en la absorbancia a 540 nm (A540). La suspensión mitocondrial se centrifugó a continuación y el citocromo c en el aglomerado mitocondrial y el sobrenadante se determinó mediante un kit ELISA comercialmente disponible. El pretratamiento de mitocondrias aisladas con SS-02 inhibió la hinchazón (Fig. 3A) y la liberación del citocromo c (Fig. 3B) inducida por sobrecarga de Ca2+. Además de evitar la MPT inducida por sobrecarga de Ca2+, SS-02 evitó también la hinchazón mitocondrial inducida por MPP+ (ion 1-metil-4-fdenilpiridinio), un inhibidor del complejo I de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (Fig. 3C).

Ejemplo 8: D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) puede proteger frente a la MPT, la hinchazón mitocondrial y la liberación del citocromo c.

El péptido no opioide SS-31 tiene la misma capacidad de proteger frente a la MPT (Fig. 4A), la hinchazón mitocondrial (Fig. 4B), y la liberación del citocromo c (Fig. 4C), inducidos por Ca2+. Los métodos para el estudio son los que se han descrito anteriormente para SS-02. En este ejemplo, se midió la hinchazón mitocondrial utilizando dispersión de luz controlada a 570 nm.

Ejemplo 9: [Dmt1] DALDA (SS-02) y D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) protege frente al aturdimiento miocárdico inducido mediante reperfusión por isquemia.

Se aislaron rápidamente corazones de cobaya, y se canuló la aorta in situ y se perfundió de una manera retrógrada con una solución de Krebs-Henseleit oxigenada (pH 7,4) a 34º C. A continuación el corazón se extirpó, se montó sobre un aparato de perfusión de Langendorff modificado, y se perfundió a presión constante (40 cm de H2O, 3923 Pa). Se midió la fuerza contráctil con un aro pequeño insertado en el ápice del ventrículo izquierdo y se conectó fuertemente la sutura de seda a un transductor del desplazamiento de fuerza. Se midió el flujo coronario mediante una recogida cronometrada del efluente de la arteria pulmonar.

Los corazones se perfundieron con tampón [Dmt1] DALDA (SS-02) (100 nM) o D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) (1 nM) durante 30 min y a continuación se sometieron a 30 min de isquemia global. Se llevó a cabo la reperfusión con la misma solución utilizada antes de la isquemia.

El análisis ANOVA bilateral desveló significativas diferencias en la fuerza contráctil (P < 0,001), la frecuencia cardiaca (P = 0,003) y el flujo coronario (P < 0,001) entre los tres grupos de tratamiento. En el grupo del tampón, la fuerza contráctil fue significativamente menor durante la reperfusión en comparación con antes de la isquemia (Fig. 5). Los corazones tratados con SS-02 y SS-31 toleraron la isquemia mucho mejor que los corazones tratados con tampón (Fig. 5). En particular, SS-31 proporcionó una completa inhibición del aturdimiento cardiaco. Además, el flujo coronario se mantuvo bien durante la reperfusión y no hubo disminución de la frecuencia cardiaca.

Ejemplo 10: [Dmt1] DALDA (SS-02) potencia la preservación del órgano

Para el trasplante de corazón, el corazón del donante se preserva en una solución cardioplégica durante el

5 transporte. La solución de preservación contiene niveles elevados de potasio que detienen eficazmente el latido del corazón y conservan la energía. Sin embargo, el tiempo de supervivencia del corazón aislado sigue siendo muy limitado.

Los inventores examinaron si [Dmt1] DALDA prolonga la supervivencia de órganos. En este estudio, [Dmt1] DALDA

10 se añadió a una solución cardioplégica comúnmente utilizada (St. Thomas) para determinar si [Dmt1] DALDA potencia la supervivencia del corazón tras isquemia prolongada (modelo de supervivencia de órganos ex vivo).

Se sometieron a perfusión corazones de cobaya aislados de una manera retrógrada con una solución de Krebs-Henseleit oxigenada a 34º C. Después de 30 min de estabilización, los corazones se sometieron a perfusión con una

15 solución CPS cardioplégica (St. Thomas) con o sin [Dmt1] DALDA a 100 nM durante 3 min. A continuación se indujo la isquemia global mediante la interrupción completa de la perfusión coronaria durante 90 min. Se llevó a cabo posteriormente la reperfusión durante 60 min, con solución de Krebs-Henseleit oxigenada. Se controlaron la fuerza contráctil, la frecuencia cardiaca y el flujo coronario de forma continua a lo largo del experimento.

20 La adición de [Dmt1] DALDA a la solución cardioplégica potenció de forma significativa la función contráctil (Fig. 6) tras la isquemia prolongada.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un péptido catiónico aromático para su uso en la reducción del número de mitocondrias que experimentan transición de la permeabilidad mitocondrial (MPT) o para evitar la transición de la permeabilidad mitocondrial en un mamífero que lo necesita, donde el péptido catiónico aromático tiene la fórmula D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NHz.
2.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido se formula para la administración tópica, intranasal, sistémica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracerebroventricular, intratecal, o transdérmica.
3.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mamífero padece de lesión de isquemia o reperfusión.
4.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la isquemia es debida a ictus, isquemia intestinal o isquemia de tejido muscular.
5.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el tejido muscular es tejido del músculo cardiaco, tejido del músculo esquelético, o tejido del músculo liso.
6.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mamífero padece hipoxia.
7.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mamífero padece una enfermedad o dolencia neurodegenerativa.
8.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la enfermedad o dolencia degenerativa es enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
9.

El péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mamífero padece MPT inducida por fármaco.
10.

Un péptido que tiene la secuencia de D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2.
11.

Una composición que comprende un péptido que tiene la secuencia de D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.