PT1599216E - Métodos de prevenção da transição de permeabilidade mitocondrial - Google Patents

Description

ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos de prevenção da transição de permeabilidade mitocondrial"

ANTECEDENTES DO INVENTO

As mitocôndrias existem em praticamente todas as células eucarióticas e são essenciais para a sobrevivência celular através da produção de trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa. A interrupção desta função vital pode conduzir a morte celular.

As mitocôndrias também desempenham um papel importante na regulação do cálcio intracelular através da acumulação de cálcio (Ca2+) . A acumulação de cálcio tem lugar na matriz mitocondrial através de um uniporter accionado pelo potencial de membrana. A captação de cálcio activa as desidrogenases mitocondriais e poderá ser importante para manter a produção de energia e a fosforilação oxidativa. Além disso, as mitocôndrias funcionam como um reservatório para o Ca2+ citosólico em excesso, protegendo assim a célula de uma sobrecarga de Ca2+ e de morte necrótica. A isquemia ou a hipoglicemia podem conduzir a disfunção mitocondrial, incluindo hidrólise do ATP e sobrecarga de Ca2+. A disfunção causa transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). A TPM é caracterizada por desacoplamento da fosforilação oxidativa, perda do potencial de membrana mitocondrial, aumento da permeabilidade da membrana interna e intumescimento.

Adicionalmente, o espaço intermembranar da mitocôndria é um reservatório de proteínas apoptogénicas. Deste modo, a perda do potencial mitocondrial e a TPM podem levar a uma libertação de proteínas apoptogénicas para o citoplasma. Sem surpresa, existem indícios crescentes de que a TPM está envolvida na morte celular necrótica e apoptótica (Crompton, Biochem J. 341:233-249, 1999). As formas mais moderadas de 2 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ injúria celular poderão conduzir a apoptose em vez de necrose. A ciclosporina pode inibir a TPM. 0 bloqueio da TPM pela ciclosporina A pode inibir a apoptose em vários tipos de células, incluindo as células submetidas a isquemia, hipoxia, sobrecarga de Ca2+ e stress oxidativo (Kroemer et al., Annu Rev Physiol. 60:619-642, 1998). A ciclosporina A, contudo, é tudo menos ideal como medicamento para tratamento contra a morte celular necrótica e apoptótica. Por exemplo, a ciclosporina A não visa especificamente as mitocôndrias. Além disso, é fracamente entregue no cérebro. Adicionalmente, a utilidade da ciclosporina A é reduzida pela sua actividade imunossupressora.

Rigobello Μ P et al., num artigo intitulado "Effect of polycation peptides on mitochondrial permeability transition", publicado em Biochemical & Biophysical Research Communications, vol. 217, no. 1, 1995, pp. 144-149, descrevem tetrapéptidos catiónicos e o seu efeito no intumescimento mitocondrial e na libertação de glutationa.

Wu D et al., num artigo intitulado "A highly potent peptide analgesic that protects against ischemia-reperfusion-induced myocardial stunning", publicado em American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology, The American Physiological Society, US, vol. 283, 9 May 2002 (2002-05-09), pp. H783-H791, descrevem DMT-DALDA e a sua actividade protectora contra o atordoamento do miocárdio induzido por isquemia.

Berezowska I et al., num artigo intitulado "Highly potent fluorescent analogues of the opioid peptide [Dmt1]DALDA", publicado em Peptides, Elsevier, Amsterdam, vol. 24, 1 January 2003 (2003-01-01), pp. 1195-1200, descrevem análogos fluorescentes de Dmtl-DALDA.

Zhao K et al., num artigo intitulado "Transcellular transport of a highly polar 3+ net charge opioid tetrapeptide", publicado em The Journal of Pharmacology and 3 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Experimental Therapeutics, vol. 304, no. 1, January 2003 (2003-01), pp. 425-432, descrevem a translocação de Dmtl-DALDA através de monocamadas de células Caco-2 e o papel dos transportadores de péptidos PEPT1 e PEPT2. O tetrapéptido [Dmt1]DALDA (2',6'-dimetiltirosina-D-Arg-Phe-Lys-NH2; SS-02) possui um peso molecular de 640 e transporta uma carga efectiva 3+ a pH fisiológico. O péptido [Dmt1]DALDA atravessa facilmente a membrana plasmática de vários tipos de células de mamífero de uma forma independente de energia (Zhao et al., J Pharmacol Exp Ther. 304:425-432, 2003) e atravessa a barreira sangue-cérebro (Zhao et al., J Pharmacol Exp Ther. 302:188-196, 2002). Embora tenha sido demonstrado que o péptido [Dmt1] DAL DA é um agonista potente dos receptores opióides mu, a sua utilidade não foi ampliada para incluir a inibição da TPM.

Assim, há necessidade de inibir a TPM em condições como a isquemia-reperfusão, a hipoxia, a hipoglicemia e outras doenças e condições que originam alterações patológicas em resultado da ocorrência da transição de permeabilidade das membranas mitocondriais. Tais doenças e condições incluem muitas das doenças neurodegenerativas comuns. O presente invento refere-se a: - um péptido aromático catiónico para utilização na redução do número de mitocôndrias submetidas a transição de permeabilidade mitocondrial (TPB), ou na prevenção da ocorrência da transição de permeabilidade mitocondrial, num mamífero de tal necessitado, em que o péptido aromático catiónico possui a fórmula D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Nth; - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que o péptido é formulado para administração oral, tópica, intranasal, sistémica, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebroventricular, intratecal ou transdérmica; - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que o mamífero sofre de lesão de isquemia ou de reperfusão; 4 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ - ο péptido para utilização num mamífero da forma indicada acima, em que a isquemia deve-se a um acidente vascular cerebral, uma isquemia intestinal ou uma isquemia de um tecido muscular; - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que o tecido muscular é um tecido muscular cardíaco, um tecido muscular esquelético ou um tecido muscular liso; - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que o mamífero sofre de hipoxia; - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que o mamífero sofre de uma doença ou condição neurodeqenerativa; - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que a doença ou condição neurodeqenerativa é a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, a doença de Huntington ou a esclerose lateral amiotrófica (ELA); - o péptido para utilização da forma indicada acima, em que o mamífero sofre de TPM induzida por medicamento; - um péptido possuindo a sequência D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2; - uma composição compreendendo um péptido com a sequência D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Internalização e acumulação celular de [Dmt1]DALDA (SS-02) em mitocôndrias. (A) A captação mitocondrial de SS-19 foi determinada utilizando espectrofotometria de fluorescência (ex/em = 320/420 nm) . A adição de mitocôndrias isoladas do fígado de ratinhos (0,35 mg/ml) resultou em supressão (quenching) imediata da intensidade de fluorescência de SS-19 (linha cinzenta). O pré-tratamento das mitocôndrias com FCCP (1,5 μΜ) reduziu a supressão em <20% (linha preta). (B) As mitocôndrias isoladas foram incubadas com [3H]SS-02 a 37°C durante 2 min. A captação foi parada por centrifugação (16000 x g) durante 5 min a 4°C e a radioactividade foi determinada no depósito. 0 5 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ pré-tratamento das mitocôndrias com FCCP inibiu a captação de [3H]SS-02 em -20%. Os resultados são apresentados como média ± e.p.; n = 3. *, P< 0,05 pelo teste t de Student. (C) A captação de TMRM pelas mitocôndrias isoladas é perdida com o intumescimento mitocondrial induzido por alameticina, enquanto a captação de SS-19 é, em larga medida, conservada. Linha preta, TMRM; linha vermelha, SS-19. (D) A adição de SS-02 (200 μΜ) a mitocôndrias isoladas não alterou o potencial mitocondrial medido através da fluorescência de TMRM. A adição de FCCP (1,5 μΜ) causou uma despolarização imediata, ao passo que o Ca2+ (150 μΜ) resultou em despolarização e inicio progressivo da TPM.

Figura 2. [Dmt1]DALDA (SS-02) protege contra a transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) induzida pela sobrecarga de Ca2+ e pelo ácido 3-nitropropiónico (3NP) . (A) O pré-tratamento das mitocôndrias isoladas com SS-02 10 μΜ (adição indicada pela seta descendente) preveniu o inicio da TPM causada pela sobrecarga de Ca2+ (seta ascendente). Linha preta, tampão; linha vermelha, SS-02. (B) O pré-tratamento das mitocôndrias isoladas com SS-02 aumentou a tolerância mitocondrial a múltiplas adições de Ca2+ antes do início da TPM. A seta indica a adição de tampão ou de SS-02. Linha 1, tampão; linha 2, SS-02 50 μΜ; linha 3, SS-02 100 μΜ. (C) O SS-02 atrasou de uma forma dose-dependente o início da TPM causada por 3NP 1 mM. A seta indica a adição de tampão ou de SS-02. Linha 1, tampão; linha 2, SS-02 0,5 μΜ; linha 3, SS-02 5 μΜ; linha 4, SS-02 50 μΜ.

Figura 3. [Dmt1]DALDA (SS-02) inibe o intumescimento mitocondrial e a libertação de citocromo c. (A) O pré-tratamento das mitocôndrias isoladas com SS-02 inibiu de uma forma dose-dependente o intumescimento mitocondrial induzido por Ca2+ 200 μΜ de uma forma dose-dependente. O intumescimento foi medido através da absorvância a 540 nm. (B) O SS-02 inibiu a libertação de citocromo c induzida por Ca2+ a partir das mitocôndrias isoladas. A quantidade de citocromo c libertada foi expressa como uma percentagem do citocromo c total nas mitocôndrias. Os resultados são apresentados como média ± e.p., n = 3. (C) O SS-02 também inibiu o intumescimento mitocondrial induzido por MPP+ (300 μΜ) . 6 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Figura 4. D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) inibe o intumescimento mitocondrial e a libertação de citocromo c. (A) 0 pré-tratamento das mitocôndrias isoladas com SS-31 (10 μΜ) previne o inicio da TPM induzida por Ca2+. Linha cinzenta, tampão; linha vermelha, SS-31. (B) O pré-tratamento das mitocôndrias com SS-31 (50 μΜ) inibiu o intumescimento mitocondrial induzido por Ca2+ 200 mM. O intumescimento foi medido por dispersão de luz medida a 570 nm. (C) Comparação de SS-02 e de SS-31 com a ciclosporina (CsA) na inibição do intumescimento mitocondrial e da libertação de citocromo c induzidos por Ca2+. A quantidade de citocromo c libertada foi expressa como uma percentagem do citocromo c total nas mitocôndrias. Os resultados são apresentados como média ± e .p., n = 3 .

Figura 5. [Dmt1]DALDA (SS-02) e D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) protegem a força contráctil do miocárdio durante a isquemia-reperfusão do coração perfundido e isolado de porquinhos-da-índia. Os corações foram perfundidos com tampão ou com tampão contendo SS-02 (100 nM) ou SS-31 (1 nM) durante 30 min e depois foram submetidos a isquemia global durante 30 min. A reperfusão foi efectuada utilizando a mesma solução da perfusão. Obtiveram-se diferenças significativas entre os três grupos de tratamento (ANOVA com dois factores, P<0,001).

Figura 6. A adição de [Dmt1]DALDA a solução cardioplégica aumentou significativamente a função contráctil após isquemia prolongada do coração perfundido e isolado de porquinhos-da-índia. Após uma estabilização de 30 min, os corações foram perfundidos com solução cardioplégica de St. Thomas (SCP) ou com SCP contendo [Dmt1] DALDA a 100 nM durante 3 min. A isquemia global foi depois induzida por interrupção total da perfusão coronária durante 90 min. A reperfusão foi subsequentemente realizada durante 60 min com solução de Krebs-Henseleit oxigenada. A força contráctil pós-isquémica foi significativamente melhorada no grupo que recebeu [ Dmt1 ]DALDA (P<0,001).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O invento baseia-se na constatação surpreendente efectuada pelos inventores de que determinados péptidos 7 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ aromáticos catiónicos reduzem significativamente o número de mitocôndrias submetidas a transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), ou previnem mesmo totalmente a ocorrência da transição de permeabilidade mitocondrial. A redução do número de mitocôndrias submetidas a TPM, e a prevenção da ocorrência da TPM, é importante, uma vez que a TPM está associada a várias doenças e condições comuns nos mamíferos. Além disso, um órgão removido de um mamífero é sensível a TPM. Estas doenças e condições têm uma importância clínica particular, pois atingem uma grande proporção da população humana em algum momento das suas vidas. Péptidos

Os péptidos aromáticos catiónicos úteis são solúveis em água e altamente polares. Apesar destas propriedades, os péptidos podem atravessar facilmente as membranas celulares.

Os péptidos aromáticos catiónicos úteis incluem um mínimo de três aminoácidos, de preferência incluem um mínimo de quatro aminoácidos, unidos covalentemente por ligações peptídicas. 0 número máximo de aminoácidos presentes nos péptidos aromáticos catiónicos é de cerca de vinte aminoácidos unidos covalentemente por ligações peptídicas. Preferencialmente, o número máximo de aminoácidos é de cerca de doze, mais preferencialmente de cerca de nove, ainda mais preferencialmente de cerca de seis. Em condições óptimas, o número de aminoácidos presentes nos péptidos é igual a quatro.

Os aminoácidos úteis dos péptidos aromáticos catiónicos podem ser qualquer aminoácido. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" é usado para designar qualquer molécula orgânica que contenha pelo menos um grupo amina e pelo menos um grupo carboxilo. De preferência, pelo menos um grupo amina encontra-se na posição α em relação ao grupo carboxilo.

Os aminoácidos poderão ser naturais. Os aminoácidos naturais incluem, por exemplo, os vinte aminoácidos levógiros (L) mais comuns encontrados normalmente nas proteínas de 8 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ mamíferos, isto é, a alanina (Ala), a arginina (Arg), a asparagina (Asn), o ácido aspártico (Asp), a cisteína (Cys), a glutamina (Glu), o ácido glutâmico (Glu), a glicina (Gly), a histidina (His), a isoleucina (Ileu), a leucina (Leu), a lisina (Lys), a metionina (Met), a fenilalanina (Phe), a prolina (Pro), a serina (Ser), a treonina (Thr), o triptofano, (Trp), a tirosina (Tyr) e a valina (Vai).

Outros aminoácidos naturais incluem, por exemplo, os aminoácidos que são sintetizados em processos metabólicos que não estão associados à síntese de proteínas. Por exemplo, os aminoácidos ornitina e citrulina são sintetizados no metabolismo dos mamíferos durante a produção de ureia.

Os péptidos úteis podem conter um ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais poderão ser L, dextrógiros (D) ou misturas destes. Em condições óptimas, o péptido não possui aminoácidos naturais.

Os aminoácidos não naturais são aqueles aminoácidos que não são tipicamente sintetizados nos processos metabólicos normais dos organismos vivos e não existem naturalmente nas proteínas. Além disso, os aminoácidos não naturais úteis preferencialmente também não são reconhecidos pelas proteases comuns. 0 aminoácido não natural pode estar presente em qualquer posição no péptido. Por exemplo, o aminoácido não natural pode estar na extremidade N-terminal, na extremidade C-terminal ou em qualquer posição entre a extremidade N-terminal e a extremidade C-terminal.

Os aminoácidos não naturais poderão compreender, por exemplo, grupos alquilo, arilo ou alquilarilo. Alguns exemplos de alquilaminoácidos incluem o ácido a-aminobutírico, o ácido β-aminobutírico, o ácido γ-aminobutírico, o ácido δ-aminovalérico e o ácido ε-aminocapróico. Alguns exemplos de arilaminoácidos incluem o ácido orto-, meta- e para-aminobenzóico. Alguns exemplos de alquilarilaminoácidos incluem o ácido orto-, meta- e para-aminofenilacético e o ácido γ-fenil-3-aminobutírico. 9 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Os aminoácidos não naturais também incluem os derivados de aminoácidos naturais. Os derivados de aminoácidos naturais poderão incluir, por exemplo, a adição de um ou mais grupos químicos ao aminoácido natural.

Por exemplo, um ou mais grupos químicos podem ser adicionados a uma ou mais das posições 2', 3', 4', 5' ou 6' do anel aromático de um resíduo de fenilalanina ou de tirosina ou à posição 4', 5', 6' ou 7' do anel benzo de um resíduo de triptofano. 0 grupo pode ser qualquer grupo químico passível de ser adicionado a um anel aromático. Alguns exemplos destes grupos incluem alquilo em C1-C4 ramificado ou não ramificado, como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo ou t-butilo, alquiloxi em C1-C4 (isto é, alcoxi), amino, alquilamino em C1-C4 e dialquilamino em C1-C4 (por exemplo, metilamino, dimetilamino), nitro, hidroxilo e halogéneo (isto é, flúor, cloro, bromo ou iodo). Alguns exemplos específicos de derivados não naturais de aminoácidos naturais incluem a norvalina (Nva), a norleucina (Nle) e a hidroxiprolina (Hyp).

Outro exemplo de uma modificação de um aminoácido num péptido é a derivatização de um grupo carboxilo de um resíduo de ácido aspártico ou de ácido glutâmico do péptido. Um exemplo de derivatização é a amidação com amoníaco ou com uma amina primária ou secundária, por exemplo, a metilamina, a etilamina, a dimetilamina ou a dietilamina. Outro exemplo de derivatização inclui a esterificação com, por exemplo, álcool metílico ou etílico.

Outra destas modificações inclui a derivatização de um grupo amina de um resíduo de lisina, arginina ou histidina. Por exemplo, tais grupos amina podem ser acilados. Alguns grupos acilo adequados incluem, por exemplo, um grupo benzoílo ou um grupo alcanoílo compreendendo qualquer um dos grupos alquilo em C1-C4 mencionados acima, como seja um grupo acetilo ou propionilo.

Os aminoácidos não naturais são preferencialmente resistentes, e mais preferencialmente insensíveis, às proteases comuns. Os exemplos de aminoácidos não naturais que são resistentes ou insensíveis às proteases incluem a forma 10 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ dextrógira (D-) de qualquer um dos L-aminoácidos naturais acima mencionados, assim como os L- e/ou D-aminoácidos não naturais. Os D-aminoácidos não surgem normalmente nas proteínas, embora sejam encontrados em determinados antibióticos peptídicos que são sintetizados por meios distintos da maquinaria sintética ribossómica normal das proteínas da célula. Tal como aqui utilizados, os D-aminoácidos são considerados aminoácidos não naturais.

De modo a minimizar a sensibilidade às proteases, os péptidos úteis deverão ter menos de cinco, preferencialmente menos de quatro, mais preferencialmente menos de três, e ainda mais preferencialmente menos de dois L-aminoácidos contíguos reconhecidos por proteases comuns, independentemente de os aminoácidos serem naturais ou não naturais. Em condições óptimas, o péptido possui apenas D-aminoácidos e nenhum L-aminoácido.

Caso o péptido contenha sequências de aminoácidos sensíveis às proteases, pelo menos um dos aminoácidos é preferencialmente um D-aminoácido não natural, conferindo assim resistência às proteases. Um exemplo de uma sequência sensível às proteases inclui dois ou mais aminoácidos básicos contíguos que são prontamente clivados por proteases comuns, como as endopeptidases e a tripsina. Os exemplos de aminoácidos básicos incluem a arginina, a lisina e a histidina. É importante que os péptidos aromáticos catiónicos possuam um número mínimo de cargas efectivas positivas a pH fisiológico em comparação com o número total de resíduos de aminoácidos no péptido. 0 número mínimo de cargas efectivas positivas a pH fisiológico será designado abaixo por (pm) . O número total de resíduos de aminoácidos no péptido será designado abaixo por (r). O número mínimo de cargas efectivas positivas discutido abaixo é sempre a pH fisiológico. O termo "pH fisiológico" como aqui utilizado refere-se ao pH normal nas células dos tecidos e órgãos do corpo dos mamíferos. Por exemplo, o pH fisiológico de um ser humano é normalmente cerca de 7,4 11 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ embora ο ρΗ fisiológico normal nos mamíferos possa ser qualquer pH compreendido entre cerca de 7,0 e cerca de 7,8. O termo "carga efectiva", como aqui utilizado, refere-se ao balanço do número de cargas positivas e do número de cargas negativas transportadas pelos aminoácidos presentes no péptido. Neste fascículo, entende-se que as cargas efectivas são medidas a pH fisiológico. Os aminoácidos naturais que estão carregados positivamente a pH fisiológico incluem a L-lisina, a L-arginina e a L-histidina. Os aminoácidos naturais que estão carregados negativamente a pH fisiológico incluem o ácido L-aspártico e o ácido L-glutâmico.

Tipicamente, um péptido possui um grupo amina N-terminal carregado positivamente e um grupo carboxilo exterminai carregado negativamente. As cargas anulam-se mutuamente a pH fisiológico. Como um exemplo de cálculo da carga efectiva, o péptido Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg possui um aminoácido carregado negativamente (isto é, Glu) e quatro aminoácidos carregados positivamente (isto é, dois resíduos Arg, um Lys e um His) . Deste modo, o péptido acima possui uma carga efectiva positiva igual a três.

Os péptidos aromáticos catiónicos podem ter uma relação entre o número mínimo de cargas efectivas positivas a pH fisiológico (pm) e o número total de resíduos de aminoácidos (r), em que 3pm é o maior número que é inferior ou igual a r + 1. A relação entre o número mínimo de cargas efectivas positivas (pm) e o número total de resíduos de aminoácidos (r) é pois da seguinte forma: (r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (Pm) 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

Os péptidos aromáticos catiónicos podem ter uma relação entre o número mínimo de cargas efectivas positivas (pm) e o número total de resíduos de aminoácidos (r) , em que 2pm é o maior número que é inferior ou igual a r + 1. A relação entre o número mínimo de cargas efectivas positivas (pm) e o número total de resíduos de aminoácidos (r) é pois da seguinte forma: 12 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ (r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (Pm) 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 Ο número mínimo de cargas efectivas positivas (pm) e o número total de resíduos de aminoácidos (r) podem ser iguais. Os péptidos podem ter três ou quatro resíduos de aminoácidos e um mínimo de uma carga efectiva positiva, preferencialmente, um mínimo de duas cargas efectivas positivas, mais preferencialmente, um mínimo de três cargas efectivas positivas.

Também é importante que os péptidos aromáticos catiónicos possuam um número mínimo de grupos aromáticos em comparação com o número total de cargas efectivas positivas (pt) . 0 número mínimo de grupos aromáticos será designado abaixo por (a).

Os aminoácidos naturais que possuem um grupo aromático incluem os aminoácidos histidina, triptofano, tirosina e fenilalanina. Por exemplo, o hexapéptido Lys-Gln-Tyr-Arg-Phe-Trp tem uma carga efectiva positiva de dois (contribuições dos resíduos de lisina e de arginina) e três grupos aromáticos (contribuições dos resíduos de tirosina, fenilalanina e triptofano).

Os péptidos aromáticos catiónicos úteis podem ter uma relação entre o número mínimo de grupos aromáticos (a) e o número total de cargas efectivas positivas a pH fisiológico (pt) , em que 3a é o maior número que é inferior ou igual a pt + 1, com a excepção de que quando pt é 1, a também poderá ser 1. A relação entre o número mínimo de grupos aromáticos (a) e o número total de cargas efectivas positivas (pt) é pois da seguinte forma: (Pt) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (a) 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7

Os péptidos aromáticos catiónicos úteis podem ter uma relação entre o número mínimo de grupos aromáticos (a) e o número total de cargas efectivas positivas (pt) , em que 2a é o maior número que é inferior ou igual a pt + 1. A relação 13 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ entre ο número mínimo de resíduos de aminoácidos aromáticos (a) e o número total de cargas efectivas positivas (pt) é pois da seguinte forma: (Pt) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (a) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 O número de grupos aromáticos (a) e o número total de cargas efectivas positivas (pt) podem ser iguais.

Os grupos carboxilo, especialmente o grupo carboxilo terminal de um aminoácido C-terminal, são preferencialmente amidados com, por exemplo, amoníaco para formar a amida C-terminal. Em alternativa, o grupo carboxilo terminal do aminoácido C-terminal poderá ser amidado com qualquer amina primária ou secundária. A amina primária ou secundária poderá ser, por exemplo, uma alquilamina, especialmente uma alquilamina em Ci-C4 ramificada ou não ramificada, ou uma arilamina. Por conseguinte, o aminoácido na extremidade C-terminal do péptido poderá ser convertido num grupo amida, N-metilamida, N-etilamida, N,N-dimetilamida, N,N-dietilamida, N-metil-N-etilamida, N-fenilamida ou N-fenil-N-etilamida.

Os grupos carboxilato livres dos resíduos de asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico que não surgem na extremidade C-terminal dos péptidos aromáticos catiónicos também podem ser amidados sempre que surgem no interior do péptido. A amidação nestas posições internas poderá ser com amoníaco ou com qualquer uma das aminas primárias ou secundárias descritas acima.

Um péptido aromático catiónico útil é um tripéptido possuindo duas cargas efectivas positivas e pelo menos um aminoácido aromático. Um péptido aromático catiónico útil é um tripéptido possuindo duas cargas efectivas positivas e dois aminoácidos aromáticos.

Os péptidos aromáticos catiónicos úteis incluem, embora não estejam limitados a estes, os seguintes exemplos de péptidos: 14 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Lys-D-Arg-Tyr-NH2,

Phe-D-Arg-His, D-Tyr-Trp-Lys-NH2,

Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2,

Tyr-His-D-Gly-Met,

Phe-Arg-D-His-Asp,

Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2,

Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg, D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg,

Lys-D-Gln-Tyx-Arg-D-Phe-Trp-NH2,

Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His,

Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2,

Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2,

Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys,

Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2,

Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys,

Asp~D—Trp—Ly s—Tyr—D—Hi s—Phe—Arg—D—Gly—Lys—NH2, D“His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2,

Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe,

Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe,

Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2,

Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr,

Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys,

Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-

Met-NH2,

Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-

Arg-Gly, D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-

Arg-His-Phe-NH2,

Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-D-Trp-D-His-

Tyr-D-Phe-Lys-Phe,

His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-

Lys-Tyr-His-Ser-NH2,

Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp e

Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-NH2.

Os péptidos úteis possuem actividade agonista do receptor opióide mu (isto é, activam o receptor opióide mu). A activação do receptor opióide mu desencadeia tipicamente um efeito analgésico. 15 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Um péptido aromático catiónico possuindo actividade para o receptor opióide mu é preferido. Por exemplo, durante um tratamento de curta duração, como acontece com uma doença ou uma condição aguda, poderá ser benéfico utilizar um péptido aromático catiónico que active o receptor opióide mu. Tais doenças e condições agudas estão muitas vezes associadas a dor moderada ou intensa. Nestes casos, o efeito analgésico do péptido aromático catiónico poderá ser benéfico no regime de tratamento do doente ou de outro mamífero, embora um péptido aromático catiónico que não active o receptor opióide mu também possa ser utilizado, com ou sem um analgésico de acordo com os requisitos clínicos.

Os potenciais efeitos adversos poderão incluir sedação, obstipação e depressão respiratória.

Os exemplos de condições agudas incluem o ataque cardíaco, o acidente vascular cerebral e as lesões traumáticas. As lesões traumáticas poderão incluir a lesão traumática do cérebro e da medula espinal.

Os exemplos de doenças ou condições crónicas incluem a doença das artérias coronárias e quaisquer distúrbios neurodegenerativos, como aqueles descritos abaixo.

Os péptidos úteis que possuem actividade para o receptor opióide mu são normalmente aqueles péptidos que têm um resíduo de tirosina ou um derivado de tirosina na extremidade N-terminal (isto é, a primeira posição de aminoácido). Os derivados de tirosina preferidos incluem a 2'-metiltirosina (Mmt); a 2',6'-dimetiltirosina (2'6'Dmt); a 3',5'-dimetiltirosina (3'5'Tmt); a N, 2',6'-trimetiltirosina (Tmt); e a 2'-hidroxi-6'-metiltirosina (Hmt).

Um péptido que tem actividade para o receptor opióide mu possui a fórmula Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Nfb (representada por conveniência pelo acrónimo DALDA, que é aqui designado por SS-01). 0 péptido DALDA tem uma carga efectiva positiva igual a três, contribuições dos aminoácidos tirosina, arginina e lisina, e possui dois grupos aromáticos, contribuições dos aminoácidos fenilalanina e tirosina. A tirosina de DALDA pode ser um derivado modificado de tirosina, como em 2',6'- 16 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ dimetiltirosina, para produzir o composto com a fórmula 2 ' , 6 ' -Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (isto é, Dmt1-DALDA, que é aqui designado por SS-02).

Os péptidos que não possuem actividade para o receptor opióide mu geralmente não têm um resíduo de tirosina ou um derivado de tirosina na extremidade N-terminal (isto é, a posição de aminoácido um) . 0 aminoácido na extremidade N- terminal pode ser qualquer aminoácido natural ou não natural diferente de tirosina.

De acordo com o invento, a sequência de aminoácidos de Dmt1-DALDA (SS-02) é rearranjada de modo que Dmt não esteja na extremidade N-terminal. Um exemplo de um tal péptido aromático catiónico que não possui actividade para o receptor opióide mu tem a fórmula D-Arg-2'6'Dmt-Lys-Phe-NH2 (designado neste fascículo por SS-31).

Os péptidos DALDA, Phe1-DALDA, SS-31 e os seus derivados podem incluir ainda análogos funcionais. Um péptido é considerado um análogo funcional de DALDA, Phe1-DALDA ou SS-31 caso o análogo tenha a mesma função que DALDA, Phe1-DALDA ou SS-31. 0 análogo poderá ser, por exemplo, uma variante de substituição de DALDA, Phe1-DALDA ou SS-31, em que um ou mais aminoácidos são substituídos por outro aminoácido.

As variantes de substituição adequadas de DALDA, Phe1-DALDA ou SS-31 incluem substituições conservativas de aminoácidos. Os aminoácidos poderão ser agrupados de acordo com as suas características físico-químicas da seguinte forma: (a) Aminoácidos não polares: Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G); (b) Aminoácidos acídicos: Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q); (c) Aminoácidos básicos: His(H) Arg(R) Lys(K); (d) Aminoácidos hidrofóbicos: Met(M) Leu(L) Ile(I) Vai(V); e (e) Aminoácidos aromáticos: Phe(F) Tyr(Y) Trp(W) His (H).

As substituições de um aminoácido por outro aminoácido do mesmo grupo num péptido são designadas por substituições conservativas e poderão preservar as características físico- 17 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ químicas do péptido original. Em contraste, as substituições de um aminoácido por outro aminoácido de um grupo diferente num péptido são geralmente mais propensas a alterar as características do péptido original.

Os exemplos de análogos úteis que activam os receptores opióides mu incluem, embora não estejam limitados a estes, os péptidos aromáticos catiónicos apresentados na Tabela 1. TABELA 1

Posição de Posição de aminoácido aminoácido 1 2 Tyr D-Arg Tyr D-Arg Tyr D-Arg Tyr D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Cit 2'6'Dmt D-Cit 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt D-Arg

Tyr Tyr Tyr

Posição de Posição de aminoácido aminoácido 3 4 Phe Lys Phe Orn Phe Dab Phe Dap Phe Lys Phe Lys Phe Lys-NH(CH2) NH-dns Phe Lys-NH(CH2): NH-atn Phe dnsLys Phe Lys Phe Ahp Phe Orn Phe Dab Phe Dap Phe Ahp (ácido 2-amino- heptanóico) Phe Lys Phe Lys Phe Om Phe Dab Phe Dap Tyr Lys Tyr Om Tyr Dab

Bio-2'6'Dmt D-Arg 3'5'Dmt D-Arg 3'6'Dmt D-Arg 3'5'Dmt D-Arg 3'5'Dmt D-Arg D-Arg D-Arg D-Arg

Posição de Modificação aminoácido C-terminal 5 (caso presente) nh2 nh2 nh2 nh2 nh2

Cys NH2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 nh2 18 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Tyr D-Arg Tyr Dap NH: 2'6'Dmt D-Arg Tyr Lys NH: 2'6'Dmt D-Arg Tyr Om NH: 2'6'Dmt D-Arg Tyr Dab NH; 2'6'Dmt D-Arg Tyr Dap NH; 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt Lys NH; 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt Om NH; 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt Dab NH; 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt Dap NH; 3'5'Dmt D-Arg 3'5'Dmt Arg NH; 3'5'Dmt D-Arg 3'5'Dmt Lys NH; 3'5'Dmt D-Arg 3'5'Dmt Om NH; 3'5'Dmt D-Arg 3'5'Dmt Dab NH; Tyr D-Lys Phe Dap NH; Tyr D-Lys Phe Arg NH; Tyr D-Lys Phe Lys NH; Tyr D-Lys Phe Orn NH; 2'6'Dmt D-Lys Phe Dab NH; 2'6'Dmt D-Lys Phe Dap NH; 2'6'Dmt D-Lys Phe Arg NH; 2'6'Dmt D-Lys Phe Lys NH; 3'5'Dmt D-Lys Phe Om NH; 3'5'Dmt D-Lys Phe Dab NH; 3'5'Dmt D-Lys Phe Dap NH; 3'5'Dmt D-Lys Phe Arg NH; Tyr D-Lys Tyr Lys NH; Tyr D-Lys Tyr Om NH; Tyr D-Lys Tyr Dab NH; Tyr D-Lys Tyr Dap NH; 2'6'Dmt D-Lys Tyr Lys NH; 2'6'Dmt D-Lys Tyr Om NH; 2'6'Dmt D-Lys Tyr Dab NH; 2'6'Dmt D-Lys Tyr Dap NH; 2'6'Dmt D-Lys 2'6'Dmt Lys NH; 2'6'Dmt D-Lys 2'6'Dmt Om NH; 2'6'Dmt D-Lys 2'6'Dmt Dab NH; 2'6'Dmt D-Lys 2'6'Dmt Dap NH; 2'6'Dmt D-Arg Phe dnsDap NH; 2'6'Dmt D-Arg Phe atnDap NH; 3'5'Dmt D-Lys 3'5'Dmt Lys NH; 19 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ 3'5'Dmt D-Lys 3'5'Dmt Om NH: 3'5'Dmt D-Lys 3'5'Dmt Dab NH: 3'5'Dmt D-Lys 3'5'Dmt Dap NH: Tyr D-Lys Phe Arg NH; Tyr D-Orn Phe Arg NH; Tyr D-Dab Phe Arg NH; Tyr D-Dap Phe Arg NH; 2'6'Dmt D-Arg Phe Arg NH; 2'6'Dmt D-Lys Phe Arg NH; 2'6'Dmt D-Orn Phe Arg NH; 2'6'Dmt D-Dab Phe Arg NH; 3'5'Dmt D-Dap Phe Arg NH; 3'5'Dmt D-Arg Phe Arg NH; 3'5'Dmt D-Lys Phe Arg NH; 3'5'Dmt D-Orn Phe Arg NH; Tyr D-Lys Tyr Arg NH; Tyr D-Orn Tyr Arg NH; Tyr D-Dab Tyr Arg NH; Tyr D-Dap Tyr Arg NH; 2'6'Dmt D-Arg 2'6'Dmt Arg NH; 2'6'Dmt D-Lys 2'6'Dmt Arg NH; 2'6'Dmt D-Orn 2'6'Dmt Arg NH; 2'6'Dmt D-Dab 2'6'Dmt Arg NH; 3'5'Dmt D-Dap 3'5'Dmt Arg NH; 3'5'Dmt D-Arg 3'5'Dmt Arg NH; 3'5'Dmt D-Lys 3'5'Dmt Arg NH; 3'5'Dmt D-Orn 3'5'Dmt Arg NH; Mmt D-Arg Phe Lys NH; Mmt D-Arg Phe Om NH; Mmt D-Arg Phe Dab NH; Mmt D-Arg Phe Dap NH; Tmt D-Arg Phe Lys NH; Tmt D-Arg Phe Om NH; Tmt D-Arg Phe Dab NH; Tmt D-Arg Phe Dap NH; Hmt D-Arg Phe Lys NH; Hmt D-Arg Phe Om NH; Hmt D-Arg Phe Dab NH; Hmt D-Arg Phe Dap NH; Mmt D-Lys Phe Lys NH; 20 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Mmt D-Lys Phe Om NH Mmt D-Lys Phe Dab NH Mmt D-Lys Phe Dap NH Mmt D-Lys Phe Arg NH Tmt D-Lys Phe Lys NH Tmt D-Lys Phe Orn NH Tmt D-Lys Phe Dab NH Tmt D-Lys Phe Dap NH Tmt D-Lys Phe Arg NH Hmt D-Lys Phe Lys NH Hmt D-Lys Phe Om NH Hmt D-Lys Phe Dab NH Hmt D-Lys Phe Dap NH Hmt D-Lys Phe Arg NH Mmt D-Lys Phe Arg NH Mmt D-Orn Phe Arg NH Mmt D-Dab Phe Arg NH Mmt D-Dap Phe Arg NH Mmt D-Arg Phe Arg NH Tmt D-Lys Phe Arg NH Tmt D-Orn Phe Arg NH Tmt D-Dab Phe Arg NH Tmt D-Dap Phe Arg NH Tmt D-Arg Phe Arg NH Hmt D-Lys Phe Arg NH Hmt D-Orn Phe Arg NH Hmt D-Dab Phe Arg NH Hmt D-Dap Phe Arg NH Hmt D-Arg Phe Arg NH Dab = Dap = Dmt = Mmt = Tmt = Hmt = dnsDap atnDap Bio = diaminobutírico ácido diaminopropiónico dimetiltirosina 2'-metiltirosina N, 2 ' ,6'-trimetiltirosina 2'-hidroxi-6'-metiltirosina ' = ácido β-dansil-L-a,β-diaminopropiónico ' = ácido β-antraniloí1-L-a,β-diaminopropiónico biotina 21 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Os aminoácidos dos péptidos apresentados na Tabela 1 e 2 poderão estar na configuração L ou D. 0 péptido aromático catiónico descrito acima é útil no tratamento de qualquer doença ou condição que esteja associada à TPM. Tais doenças e condições incluem, embora não estejam limitadas a estas, a isquemia e/ou a reperfusão de um tecido ou um órgão, a hipoxia e qualquer uma de várias doenças neurodegenerativas. Os mamíferos necessitados de tratamento ou de prevenção da TPM são aqueles mamíferos que sofrem destas doenças ou condições. A isquemia de um tecido ou de um órgão de um mamífero é uma condição patológica multifacetada que é causada por privação de oxigénio (hipoxia) e/ou privação de glucose (por exemplo, substrato). A privação de oxigénio e/ou glucose nas células de um tecido ou órgão conduz a uma redução ou uma perda total da capacidade de geração de energia e à consequente perda da função de transporte activo de iões através das membranas celulares. A privação de oxigénio e/ou glucose também conduz a alterações patológicas em outras membranas celulares, incluindo a transição de permeabilidade nas membranas mitocondriais. Além disso, outras moléculas, como as proteínas apoptóticas normalmente compartimentalizadas no interior das mitocôndrias, poderão sofrer fugas para o citoplasma e causar morte celular apoptótica. A isquemia profunda pode conduzir a morte celular necrótica. A isquemia ou hipoxia de um tecido ou de um órgão particular poderá ser causada por uma perda ou uma diminuição importante do suprimento sanguíneo para o tecido ou o órgão. A perda ou diminuição importante do suprimento sanguíneo poderá dever-se, por exemplo, a acidente vascular cerebral tromboembólico, a aterosclerose coronária ou a doença vascular periférica. 0 tecido afectado por isquemia ou hipoxia é tipicamente o músculo, como o músculo cardíaco, esquelético ou liso. 0 órgão afectado por isquemia ou hipoxia poderá ser qualquer órgão que esteja sujeito a isquemia ou hipoxia. Os exemplos de órgãos afectados por isquemia ou hipoxia incluem 22 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ ο cérebro, ο coração, ο rim e a próstata. Por exemplo, a isquemia ou hipoxia do músculo cardíaco é habitualmente causada por bloqueios ateroscleróticos ou trombóticos que conduzem a uma redução ou perda do aporte de oxigénio aos tecidos cardíacos pelo suprimento de sangue arterial e capilar cardíaco. Esta isquemia ou hipoxia cardíaca poderá causar dor e necrose do músculo cardíaco afectado e, no final, poderá conduzir a falência cardíaca. A isquemia ou hipoxia do músculo esquelético ou do músculo liso poderá resultar de causas similares. Por exemplo, a isquemia ou hipoxia do músculo liso intestinal ou do músculo esquelético dos membros também poderá ser causada por bloqueios ateroscleróticos ou trombóticos. A reperfusão é a restauração do fluxo sanguíneo para qualquer órgão ou tecido em que o fluxo de sangue esteja diminuído ou bloqueado. Por exemplo, o fluxo sanguíneo pode ser restaurado para qualquer órgão ou tecido afectado por isquemia ou hipoxia. A restauração do fluxo sanguíneo (reperfusão) pode ocorrer por qualquer método conhecido pelos peritos. Por exemplo, a reperfusão dos tecidos cardíacos isquémicos poderá resultar de angioplastia, bypass da artéria coronária com enxerto ou a utilização de fármacos trombolíticos. 0 péptido do presente invento também pode ser utilizado no tratamento ou na profilaxia de doenças neurodegenerativas associadas à TPM. As doenças neurodegenerativas associadas à TPM incluem, por exemplo, a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, a doença de Huntington e a esclerose lateral amiotrófica (ELA, também conhecida como doença de Lou Gherig). 0 péptido do presente invento pode ser utilizado para atrasar o início ou retardar a progressão destas e de outras doenças neurodegenerativas associadas à TPM. 0 péptido do presente invento é particularmente útil no tratamento de seres humanos que sofrem das fases precoces de doenças neurodegenerativas associadas à TPM e nos seres humanos com predisposição para estas doenças. 0 péptido do presente invento também poderá ser utilizado na conservação de um órgão de um mamífero antes do 23 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ transplante. Por exemplo, um órgão removido pode ser sensível à TPM devido à ausência de fluxo sanguíneo. Por conseguinte, o péptido pode ser utilizado para prevenir a ocorrência de TPM no órgão removido. 0 órgão removido pode ser colocado numa solução tamponada padrão, como aquelas habitualmente utilizadas na técnica. Por exemplo, um coração removido pode ser colocado numa solução cardioplégica contendo os péptidos descritos acima. A concentração do péptido na solução tamponada padrão pode ser facilmente determinada pelos peritos. Tais concentrações poderão estar, por exemplo, entre cerca de 0,1 nM e cerca de 10 μΜ, preferencialmente entre cerca de 1 μΜ e cerca de 10 μΜ. O péptido também poderá ser administrado a um mamífero que está a tomar um medicamento para tratar uma condição ou uma doença. Caso um efeito secundário do medicamento inclua a TPM, os mamíferos que tomam tais medicamentos beneficiariam grandemente do péptido do invento.

Um exemplo de um medicamento que induz toxicidade celular ao causar TPM é o medicamento de quimioterapia Adriamicina. Síntese dos péptidos O péptido do presente invento poderá ser sintetizado quimicamente por quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica. Os métodos adequados para sintetizar a proteína incluem, por exemplo, aqueles descritos por Stuart e Young em "Solid Phase Peptide Synthesis," Second Edition, Pierce Chemical Company (1984) e em "Solid Phase Peptide Synthesis" Methods Enzymol. 289, Academic Press, Inc, New York (1997).

Modos de administração O péptido do presente invento é administrado a um mamífero numa quantidade eficaz para reduzir o número de mitocôndrias submetidas a TPM, ou prevenir a ocorrência de TPM. A quantidade eficaz é determinada durante os ensaios 24 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ pré-clínicos e os ensaios clínicos por métodos familiares aos médicos e aos clínicos.

Uma quantidade eficaz de um péptido do presente invento, preferencialmente numa composição farmacêutica, poderá ser administrada a um mamífero dele necessitado por meio de qualquer um de vários métodos de administração de compostos farmacêuticos bem conhecidos. 0 péptido poderá ser administrado sistémica ou localmente. Numa concretização, o péptido é administrado intravenosamente. Por exemplo, o péptido aromático catiónico do presente invento poderá ser administrado via injecção intravenosa rápida em bolus. De preferência, contudo, o péptido é administrado como uma infusão intravenosa a velocidade constante. 0 péptido pode ser injectado directamente na artéria coronária durante, por exemplo, a angioplastia ou a cirurgia de bypass coronário, ou pode ser aplicado em stents coronários. 0 péptido também poderá ser administrado oralmente, topicamente, intranasalmente, intramuscularmente, subcutaneamente ou transdermicamente. Numa concretização preferida, a administração transdérmica dos péptidos aromáticos catiónicos por métodos do presente invento é por iontoforese, em que o péptido carregado é entregue através da pele por uma corrente eléctrica.

Outras vias de administração incluem as vias intracerebroventricular ou intratecal. A administração intracerebroventricular refere-se à administração no sistema ventricular do cérebro. A administração intratecal refere-se à administração no espaço sob a membrana aracnóide da medula espinal. Assim, a administração intracerebroventricular ou intratecal poderá ser preferida para aquelas doenças e condições que afectam os órgãos ou os tecidos do sistema nervoso central. Numa concretização preferida, a administração intratecal é utilizada para as lesões traumáticas da medula espinal. 25 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ Ο péptido do invento também poderá ser administrado aos mamíferos por libertação prolongada, como é conhecida na técnica. A administração por libertação prologada é um método de entrega de medicamentos que permite obter um determinado nível do medicamento ao longo de um período de tempo particular. 0 nível é normalmente medido através da concentração sérica ou plasmática.

Qualquer formulação conhecida na técnica da farmácia é adequada para administração do péptido aromático catiónico do presente invento. No caso da administração oral, é possível utilizar formulações líquidas ou sólidas. Alguns exemplos de formulações incluem as pastilhas, as cápsulas de gelatina, os comprimidos, os trociscos, os elixires, as suspensões, os xaropes, as hóstias, a pastilha elástica e similares. 0 péptido pode ser misturado com um veículo ou um excipiente farmacêutico adequado conforme entendido pelos executantes na técnica. Os exemplos de veículos e excipientes incluem o amido, o leite, o açúcar, determinados tipos de argila, a gelatina, o ácido láctico, o ácido esteárico ou seus sais, incluindo o estearato de magnésio ou de cálcio, o talco, os óleos ou gorduras vegetais, as gomas e os glicóis.

No caso da administração sistémica, intracerebroventricular, intratecal, tópica, intranasal, subcutânea ou transdérmica, as formulações do péptido aromático catiónico do presente invento poderão utilizar diluentes, veículos, excipientes, etc. convencionais, conforme conhecidos na técnica, para entregar os péptidos. Por exemplo, as formulações poderão compreender um ou mais dos seguintes elementos: um agente de estabilização, um tensioactivo, preferencialmente um tensioactivo não iónico, e opcionalmente um sal e/ou um agente tampão. 0 péptido poderá ser entregue na forma de uma solução aquosa ou numa forma liofilizada. 0 agente de estabilização poderá ser, por exemplo, um aminoácido como, por exemplo, a glicina; ou um oligossacárido como, por exemplo, a sacarose, a tetralose, a lactose ou um dextrano. Em alternativa, o agente de estabilização poderá ser um açúcar-álcool como, por exemplo, o manitol; ou uma combinação destes. Preferencialmente, o agente de 26 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ estabilização ou a combinação de agentes de estabilização constitui cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso por peso do péptido. O tensioactivo é preferencialmente um tensioactivo não iónico, tal como um polissorbato. Alguns exemplos de tensioactivos adequados incluem o Tween20, o Tween80; ou um polietilenoglicol ou polioxietileno-polioxipropilenoglicol, como o Pluronic F-68, numa quantidade entre cerca de 0,001% (p/v) e cerca de 10% (p/v). O sal ou agente tampão poderá ser qualquer sal ou agente tampão como, por exemplo, o cloreto de sódio ou o fosfato de sódio/potássio, respectivamente. De preferência, o agente tampão mantém o pH da composição farmacêutica no intervalo entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5. O sal e/ou o agente tampão também é útil para manter a osmolalidade num nivel apropriado para administração a um ser humano ou um animal. Preferencialmente, o sal ou o agente tampão está presente numa concentração aproximadamente isotónica de cerca de 150 mM a cerca de 300mM.

As formulações do péptido do presente invento poderão conter adicionalmente um ou mais aditivos convencionais. Alguns exemplos destes aditivos incluem um agente de solubilização como, por exemplo, o glicerol; um antioxidante como, por exemplo, o cloreto de benzalcónio (uma mistura de compostos de amónio quaternário conhecidos como "quats"), o álcool benzílico, a cloretona ou o clorobutanol; um agente anestésico como, por exemplo, um derivado de morfina; ou um agente isotónico, etc. como descrito acima. Como precaução adicional contra a oxidação ou outro tipo de degradação, as composições farmacêuticas poderão ser armazenadas sob azoto em frascos selados com rolhas impermeáveis. O mamífero pode ser qualquer mamífero, incluindo, por exemplo, animais de quinta, como ovelhas, porcos, vacas e cavalos; animais domésticos, como cães e gatos; e animais de laboratório, como ratos, ratinhos e coelhos. Numa concretização preferida, o mamífero é um ser humano. 27 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

EXEMPLOS

Exemplo 1: [Dmt1]DALDA atravessa a membrana celular. A captação celular de [3H] [Dmt1 ] DAL DA foi estudada utilizando uma linha celular de epitélio intestinal humano (Caco-2) e confirmada com as células SH-SY5Y (célula de neuroblastoma humano), HEK293 (célula de rim embrionário humano) e CRFK (célula epitelial renal). As monocamadas das células foram crescidas em placas de 12 poços (5xl05 células/poço) revestidas com colagénio durante 3 dias. No 4o dia, as células foram lavadas duas vezes com solução HBSS previamente aquecida e depois foram incubadas com 0,2 ml de solução HBSS contendo [3H] [Dmt1 ] DALDA 250nM a 37°C ou a 4°C, durante períodos de tempo variáveis até 1 h. O péptido [3H] [Dmt1] DALDA foi observado no lisado celular logo aos 5 min, e os níveis de estado estacionário foram obtidos aos 30 min. A quantidade total de [3H] [Dmt1] DALDA recuperada no lisado celular após 1 h de

incubação representou cerca de 1% do fármaco total. A captação de [3H] [Dmt1] DALDA foi mais lenta a 4°C em comparação com 37°C, mas atingiu 76,5% aos 45 min e 86,3% à 1 h. A internalização de [3H] [Dmt1] DALDA não ficou limitada às células Caco-2, tendo sido também observada nas células SH-SY5Y, HEK293 e CRFK. A concentração intracelular de [Dmt1] DALDA foi estimada como sendo cerca de 50 vezes mais elevada que a concentração extracelular.

Numa experiência separada, as células foram incubadas com uma gama de concentrações de [Dmt1] DALDA (1 μΜ - 3 mM) durante lha 37°C. No final do período de incubação, as células foram lavadas 4 vezes com solução HBSS e adicionaram-se 0,2 ml de NaOH 0,1N contendo SDS a 1% a cada poço. Os conteúdos celulares foram depois transferidos para frascos de cintilação e a radioactividade foi contada. Para distinguir a radioactividade internalizada da radioactividade associada à superfície, incluiu-se um passo de lavagem ácida. Antes da lise celular, as células foram incubadas com 0,2 ml de ácido acético 0,2 M/NaCl 0,05 M durante 5 min em gelo. 28 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ A captação de [Dmt1]DALDA para o interior das células Caco-2 foi confirmada por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) utilizando um análogo fluorescente de [Dmt1] DALDA (Dmt-D-Arg-Phe-dnsDap-NH2; em que dnsDap = ácido β-dansil-l-a,β-diaminopropiónico). As células foram crescidas da forma descrita acima e foram plaqueadas em placas de fundo de vidro (35 mm) (MatTek Corp., Ashland, Massachusetts) durante 2 dias. 0 meio foi depois removido, e as células foram incubadas com 1 ml de solução HBSS contendo 0,1 μΜ a 1,0 μΜ do análogo fluorescente do péptido a 37°C durante 1 h. As células foram depois lavadas três vezes com solução HBSS gelada e cobertas com 200 μΐ de PBS. A microscopia foi efectuada no espaço de 10 min à temperatura ambiente, utilizando um microscópio confocal de varrimento laser Nikon com uma objectiva C-Apochromat 63x/1.2W Corr. A excitação foi realizada a 340 nm por meio de um laser UV e a emissão foi medida a 520 nm. Para o seccionamento óptico na direcção z, efectuaram-se 5-10 planos com 2,0 μιη. A microscopia confocal de varrimento laser confirmou a captação de Dmt-D-Arg-Phe-dnsDap-NH2 fluorescente para o interior das células Caco-2, após incubação com [Dmt1, DnsDap4] DALDA 0,1 μΜ durante lha 37°C. A captação do péptido fluorescente foi similar a 37°C e a 4°C. A fluorescência mostrou-se difusa em todo o citoplasma mas foi completamente excluída do núcleo.

Exemplo 2: Direccionamento de [Dmt1] DALDA para as mitocôndrias.

Para analisar a distribuição subcelular de [Dmt1]DALDA, preparou-se o análogo fluorescente [Dmt1, AtnDap4] DALDA (Dmt- D-Arg-Phe-atnDap-NH2; em que atn = ácido β-antraniloíl-l-a,β-diaminopropiónico). O análogo continha ácido β-antraniloí1-1-a,β-diaminopropiónico em vez do resíduo de lisina na posição 4. As células foram crescidas da forma descrita no Exemplo 1 e foram plaqueadas em placas de fundo de vidro (35 mm) (MatTek Corp., Ashland, Massachusetts) durante 2 dias. O meio foi depois removido, e as células foram incubadas com 1 ml de solução HBSS contendo [Dmt1, AtnDap4] DALDA 0,1 μΜ a 37°C, durante 15 min até 1 h. 29 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

As células foram também incubadas com éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM, 25 nM) , um corante usado para corar as mitocôndrias, durante 15 min a 37°C. As células foram depois lavadas três vezes com solução HBSS gelada e cobertas com 200 μΐ de PBS. A microscopia foi efectuada no espaço de 10 min à temperatura ambiente, utilizando um microscópio confocal de varrimento laser Nikon com uma objectiva C-Apochromat 63x/1.2W Corr.

No caso de [Dmt1, AtnDap4] DALDA, a excitação foi realizada a 350 nm por meio de um laser UV e a emissão foi medida a 520 nm. No caso de TMRM, a excitação foi realizada a 536 nm e a emissão foi medida a 560 nm. A microscopia confocal de varrimento laser mostrou a captação de [Dmt1, AtnDap4] DALDA fluorescente para o interior das células Caco-2, após incubação durante um período de apenas 15 min a 37°C. A captação do corante foi completamente excluída do núcleo, mas o corante azul revelou uma distribuição raiada no citoplasma. As mitocôndrias foram marcadas a vermelho com TMRM. A distribuição de [Dmt1, AtnDap4] DALDA para as mitocôndrias foi demonstrada pela sobreposição da distribuição de [Dmt1, AtnDap4] DALDA com a distribuição de TMRM.

Exemplo 3: Captação de [Dmt1] DALDA para o interior das mitocôndrias.

Para isolar as mitocôndrias do fígado de ratinhos, os ratinhos foram sacrificados por decapitação. O fígado foi removido e colocado rapidamente em meio para homogeneização de fígado gelado. O fígado foi cortado em pequenos pedaços com uma tesoura e depois foi homogeneizado à mão utilizando um homogeneizador de vidro. O homogenato foi centrifugado durante 10 min a lOOOxg, a 4°C. O sobrenadante foi aspirado, transferido para tubos de policarbonato e novamente centrifugado durante 10 min a 3000xg, 4°C. O sobrenadante resultante foi removido, e os lípidos gordos na parede lateral do tubo foram cuidadosamente limpos. 30 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ Ο depósito foi ressuspenso em meio de homogenato de figado e a homogeneização foi repetida duas vezes. O depósito mitocondrial purificado final foi ressuspenso em meio. A concentração de proteína na preparação mitocondrial foi determinada pelo procedimento de Bradford.

Aproximadamente 1,5 mg de mitocôndrias em 400 μΐ de tampão foram incubadas com [3H] [Dmt1 ]DALDA durante 5-30 min a 37°C. As mitocôndrias foram depois depositadas por centrifugação, e a quantidade de radioactividade foi determinada na fracção mitocondrial e na fracção do tampão. Assumindo um volume da matriz mitocondrial de 0,7 μΐ/mg de proteína (Lim et al., J Physiol 545:961-974, 2002), verificou-se que a concentração de [3H] [Dmt1]DALDA nas mitocôndrias foi 200 vezes mais elevada que no tampão. Assim, [Dmt1]DALDA está concentrado nas mitocôndrias.

Com base nestes resultados, é possível estimar a concentração de [Dmt1]DALDA nas mitocôndrias quando os corações isolados de porquinhos-da-índia foram perfundidos com [Dmt1]DALDA:

Concentração de [Dmt1]DALDA no perfusado coronário 0,1 μΜ Concentração de [Dmt1]DALDA no miócito 5 μΜ Concentração de [Dmt1]DALDA nas mitocôndrias 1,0 mM

Exemplo 4: Acumulação de [Dmt1]DALDA por mitocôndrias isoladas (Fig. 1).

Para demonstrar adicionalmente que [Dmt1]DALDA é distribuído selectivamente para as mitocôndrias, analisou-se a captação de [Dmt1, AtnDap4] DALDA e de [3H] [Dmt1] DALDA para o interior de mitocôndrias isoladas do figado de ratinhos. A captação rápida de [Dmt1, AtnDap4] DALDA foi observada como supressão (quenching) imediata da sua fluorescência com a adição das mitocôndrias (Figura IA) . O pré-tratamento das mitocôndrias com FCCP (p-(trifluorometoxi)fenil-hidrazona do cianeto de carbonilo), um desacoplador que resulta na despolarização imediata das mitocôndrias, só reduziu a captação de [Dmt1, AtnDap4] DALDA em <20%. Deste modo, a 31 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ captação de [Dmt1, AtnDap4] DALDA não foi dependente do potencial.

Para confirmar que o direccionamento para as mitocôndrias não foi um artefacto do fluoróforo, analisou-se também a captação mitocondrial de [3H] [Dmt1] DALDA. As mitocôndrias isoladas foram incubadas com [3H] [Dmt1] DALDA e a radioactividade foi determinada no depósito e no sobrenadante mitocondrial. A quantidade de radioactividade no depósito não variou dos 2 min aos 8 min. 0 tratamento das mitocôndrias com FCCP só diminuiu a quantidade de [3H] [Dmt1]DALDA associada ao depósito mitocondrial em -20% (Figura 1B). O efeito mínimo de FCCP na captação de [Dmt1] DALDA sugeriu que o péptido [Dmt1]DALDA estaria provavelmente associado às membranas mitocondriais ou no espaço intermembranar e não na matriz. Em seguida, analisou-se o efeito do intumescimento mitocondrial na acumulação de [Dmt1,AtnDap4] DALDA nas mitocôndrias, utilizando alameticina para induzir o intumescimento e a ruptura da membrana externa. Ao contrário do TMRM, a captação de [Dmt1, AtnDap4] DALDA foi só parcialmente revertida pelo intumescimento mitocondrial (Fig. 1C). Assim, o péptido [Dmt1]DALDA está associado às membranas mitocondriais.

Exemplo 5: [Dmt1]DALDA não altera a respiração nem o potencial mitocondrial (Fig. 1D) . A acumulação de [Dmt1]DALDA nas mitocôndrias não alterou a função mitocondrial. A incubação das mitocôndrias isoladas do fígado de ratinhos com [Dmt1] DALDA 100 μΜ não alterou o consumo de oxigénio durante o estado 3 ou o estado 4 nem a razão de controlo respiratório (estado 3/estado 4) (6,2 versus 6,0) . 0 potencial de membrana mitocondrial foi medido utilizando TMRM (Fig. 1D). A adição das mitocôndrias resultou na supressão (quenching) imediata do sinal de TMRM, que foi prontamente revertida pela adição de FCCP, indicando uma despolarização mitocondrial. A adição de Ca2+ (150 μΜ) resultou em despolarização imediata, seguida de perda progressiva da supressão (quenching) indicativa de TPM. A adição de [Dmt1] DALDA sozinho, mesmo a 200 μΜ, não causou despolarização mitocondrial nem TPM. 32 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Exemplo 6: [Dmt1]DALDA protege contra a TPM induzida por Ca2+ e por ácido 3-nitropropiónico (Fig. 2).

Além de não ter qualquer efeito directo sobre o potencial mitocondrial, o péptido [Dmt1]DALDA foi capaz de proteger contra a TPM induzida pela sobrecarga de Ca2+. 0 pré-tratamento das mitocôndrias isoladas com [Dmt1]DALDA (10 μΜ) , durante 2 min antes da adição de Ca2+, resultou apenas em despolarização momentânea e preveniu o inicio da TPM (Figura 2A) . O péptido [Dmt1]DALDA aumentou de forma dose-dependente a tolerância das mitocôndrias a provocações cumulativas de Ca2+. A Figura 2B mostra que o péptido [Dmt1] DALDA aumentou o número de adições de Ca2+ que as mitocôndrias isoladas conseguiam tolerar antes da TPM. O ácido 3-nitropropiónico (3NP) é um inibidor irreversível da succinato-desidrogenase no complexo II da cadeia de transporte de electrões. A adição de 3NP (1 mM) a mitocôndrias isoladas causou a dissipação do potencial mitocondrial e o início da TPM (Figura 2C). O pré-tratamento das mitocôndrias com [Dmt1] DALDA atrasou de forma dose- dependente o início da TPM induzida por 3NP (Figura 2C) .

De modo a demonstrar que o péptido [Dmt1] DALDA pode atravessar as membranas celulares e proteger contra a despolarização mitocondrial desencadeada por 3NP, as células Caco-2 foram tratadas com 3NP (10 mM) na ausência ou na presença de [Dmt1] DALDA (0,1 μΜ) durante 4 h e, em seguida, foram incubadas com TMRM e examinadas sob microscopia confocal de varrimento laser. Nas células de controlo, as mitocôndrias são distintamente visualizadas como listras finas em todo o citoplasma. Nas células tratadas com 3NP, a fluorescência de TMRM foi grandemente reduzida, sugerindo uma despolarização generalizada. Em contraste, o tratamento simultâneo com [Dmt1]DALDA protegeu contra a despolarização mitocondrial causada por 3NP.

Exemplo 7: [Dmt1]DALDA protege contra o intumescimento mitocondrial e a libertação de citocromo c. A abertura de poros de TPM resulta em intumescimento mitocondrial. Os efeitos de [Dmt1] DALDA no intumescimento 33 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ mitocondrial foram analisados por medição da diminuição da absorvância a 540 nm (A54o) . A suspensão mitocondrial foi depois centrifugada, e o citocromo c no depósito e no sobrenadante mitocondrial foi determinado por um kit de ELISA disponível comercialmente. O pré-tratamento das mitocôndrias isoladas com SS-02 inibiu o intumescimento (Fig. 3A) e a libertação de citocromo c (Fig. 3B) induzidos pela sobrecarga de Ca2+. Além de prevenir a TPM induzida pela sobrecarga de Ca2+, o péptido SS-02 também preveniu o intumescimento mitocondrial induzido por MPP+ (ião l-metil-4-fenilpiridinio), um inibidor do complexo I da cadeia de transporte de electrões mitocondrial (Fig. 3C).

Exemplo 8: D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) pode proteger contra a TPM, o intumescimento mitocondrial e a libertação de citocromo c. O péptido não opióide SS-31 possui a mesma capacidade de protecção contra a TPM (Fig. 4A) , o intumescimento mitocondrial (Fig. 4B) e a libertação de citocromo c (Fig. 4C) induzidos por Ca2+. Os métodos para o estudo são conforme descritos acima para SS-02. Neste exemplo, o intumescimento mitocondrial foi medido utilizando a dispersão de luz monitorizada a 570 nm.

Exemplo 9: [ Dmt1]DALDA (SS-02) e D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) protegem contra o atordoamento do miocárdio induzido por isquemia-reperfusão.

Os corações de porquinhos-da-índia foram isolados rapidamente, e a aorta foi canulada in situ e perfundida de forma retrógrada com uma solução de Krebs-Henseleit oxigenada (pH 7,4) a 34°C. O coração foi depois excisado, montado num sistema modificado de perfusão de Langendorff e perfundido a pressão constante (40 cm H20) . A força contráctil foi medida com um pequeno gancho inserido no vértice do ventrículo esquerdo e uma ligadura de seda firmemente ligada a um transdutor de deslocamento-força. O fluxo coronário foi medido através da recolha cronometrada do efluente da artéria pulmonar. 34 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ

Os coraçoes foram perfundidos com tampão, [Dmt1]DALDA (SS-02) (100 nM) ou D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (SS-31) (1 nM) durante 30 min e depois foram submetidos a 30 min de isquemia global. A reperfusão foi efectuada com a mesma solução utilizada antes da isquemia. A ANOVA com dois factores revelou diferenças significativas na força contráctil (P<0,001), na frequência cardíaca (P=0,003) e no fluxo coronário (P<0,001) entre os três grupos de tratamento. No grupo de tampão, a força contráctil foi significativamente mais baixa durante a reperfusão em comparação com antes da isquemia (Fig. 5) . Os corações tratados com ambos os péptidos SS-02 e SS-31 toleraram a isquemia muito melhor do que os corações tratados com o tampão (Fig. 5) . Em particular, SS-31 proporcionou uma inibição total do atordoamento cardíaco. Além disso, o fluxo coronário é bem mantido ao longo da reperfusão e não ocorreu diminuição da frequência cardíaca.

Exemplo 10: [Dmt1]DALDA (SS-02) aumenta a conservação de órgãos.

No caso de transplante cardíaco, o coração do dador é conservado numa solução cardioplégica durante o transporte. A solução de conservação contém uma quantidade elevada de potássio que, na realidade, impede o coração de bater e conserva a energia. Contudo, o tempo de sobrevivência do coração isolado ainda é bastante limitado.

Analisou-se se o péptido [Dmt1]DALDA prolonga ou não a sobrevivência dos órgãos. Neste estudo, o péptido [Dmt1]DALDA foi adicionado a uma solução cardioplégica usada habitualmente (St. Thomas) para determinar se [Dmt1] DALDA aumenta a sobrevivência do coração após isquemia prolongada (modelo de sobrevivência de órgão ex vivo) .

Os corações isolados de porquinhos-da-índia foram perfundidos de forma retrógrada com uma solução de Krebs-Henseleit oxigenada a 34°C. Após 30 min de estabilização, os corações foram perfundidos com uma solução cardioplégica SCP (St. Thomas) com ou sem [Dmt1] DALDA a 100 nM durante 3 min. A isquemia global foi depois induzida através de interrupção 35 ΕΡ 1 599 216/ΡΤ completa da perfusão coronária durante 90 min. A reperfusão foi subsequentemente realizada durante 60 min com solução de Krebs-Henseleit oxigenada. A força contráctil, a frequência cardíaca e o fluxo coronário foram monitorizados continuamente ao longo de toda a experiência. A adição de [Dmt1]DALDA à solução cardioplégica aumentou significativamente a função contráctil (Fig. 6) após isquemia prolongada.

Lisboa, 2013-12-10

Claims (11)

1. ΕΡ 1 599 216/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido aromático catiónico para utilização na redução do número de mitocôndrias submetidas a transição de permeabilidade mitocondrial (TPM), ou na prevenção da ocorrência da transição de permeabilidade mitocondrial, num mamífero de tal necessitado, em que o péptido aromático catiónico possui a fórmula D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2.
2. 2. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o péptido é formulado para administração oral, tópica, intranasal, sistémica, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebroventricular, intratecal ou transdérmica.
3. 3. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero sofre de uma lesão de isquemia ou de reperfusão.
4. 4. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a isquemia deve-se a um acidente vascular cerebral, uma isquemia intestinal ou uma isquemia de um tecido muscular.
5. 5. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o tecido muscular é um tecido muscular cardíaco, um tecido muscular esquelético ou um tecido muscular liso.
6. 6. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero sofre de hipoxia.
7. 7. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero sofre de uma doença ou condição neurodegenerativa.
8. 8. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a doença ou condição neurodegenerativa é a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, a doença de Huntington ou a esclerose lateral amiotrófica (ELA). ΕΡ 1 599 216/ΡΤ 2/2
9. 9. Péptido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero sofre de TPM induzida por medicamento.
10. 10. Péptido possuindo a sequência D-Arq-Dmt-Lys-Phe-NH2.
11. 11. Composição compreendendo um péptido possuindo a sequência D-Arg-Dmt-Lys-Phe-Ntp e um veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 2013-12-10