CN104922653A - 治疗或预防哺乳动物对象中骨骼肌衰弱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗或预防哺乳动物对象中骨骼肌衰弱的方法。本发明提供了一种治疗或预防哺乳动物对象中骨骼肌衰弱的方法，所述方法包括将治疗有效量的肽D-Arg-2’,6’Dmt-Lys-Phe-NH₂或其药学上可接受的盐给药至所述哺乳动物对象。

Description

治疗或预防哺乳动物对象中骨骼肌衰弱的方法

本申请是申请日为2011年02月25日、申请号为“201180018573.1”、发明名称为“保护免受机械通气诱导的膈膜功能障碍和骨骼肌萎缩的线粒体靶向的抗氧化剂”的发明专利申请的分案申请。

政府支持

本发明是在美国国家卫生研究院授予的基金R01HL08783下由政府支持完成的。美国政府对本发明具有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年2月26日递交的第61/308508号美国临时申请的优先权，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本文公开了用于预防和治疗骨骼肌衰弱(例如无力、功能障碍和/或肌肉萎缩)的方法和包括芳香族阳离子肽的组合物。具体地，本文公开了用于预防和治疗机械通气(MV)诱导的膈膜衰弱及废用-诱导的骨骼肌衰弱的方法和组合物。

背景技术

提供以下描述来便于读者理解。所提供的信息或者所引用的参考资料都不能看作是本发明的现有技术。

在临床上，对不能维持充足的肺泡通气的对象采用机械通气(MV)来实现足够的肺换气。MV的常见适应症包括呼吸衰竭、心力衰竭、手术、服药过量和脊髓损伤。尽管对于患有呼吸衰竭的对象而言，MV是一项救命措施，但是与机械通气撤机的患者相关的并发症是常见的。事实上，撤机困难是重要的临床难题；20％-30％的机械通气对象经历撤机困难。“撤机失败”可能由于若干个因素，包括膈膜(骨骼肌)的呼吸肌无力。

骨骼肌无力源自于肌肉纤维萎缩和功能障碍。在这点上，对于身体固定或肢体固定的单独的对象而言，肌肉废用呈现为一普遍问题，例如由于骨折固定或长期MV导致的肌肉约束。然而，这样的肌肉废用并没有在细胞层次上说明肌肉纤维退化的病因。为此，氧化应激，例如通过黄嘌呤氧化酶激活产生活性氧簇(ROS)，可提供关于骨骼肌退化和骨骼肌收缩功能障碍的机理。然而，抑制黄嘌呤氧化酶活性并不能完全防御骨骼肌废用诱导的氧化应激或MV-诱导的氧化应激的作用(伴行的萎缩和无力)。因此，在开发用于预防或治疗这些疾病的新策略中，考虑确定与肌肉功能障碍和肌肉萎缩相关的另外的因素。

发明内容

本文公开了用于预防和治疗骨骼肌衰弱(如机械通气(MV)-诱导的膈膜衰弱，功能障碍和/或萎缩)的方法和组合物。总体来讲，所述方法和组合物包括一种或多种芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)，且在一些实施方式中，将治疗有效量的一种芳香族阳离子肽或多种芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至需要所述芳香族阳离子肽的对象，以治疗或预防或治疗骨骼肌衰弱，例如无力、功能障碍和/或萎缩。

本文公开了用于预防和治疗骨骼肌衰弱(例如机械通气(MV)-诱导的膈膜无力、功能障碍和/或萎缩和/或废用-诱导的肌肉衰弱)的方法和组合物。总体来讲，所述方法和组合物包括一种芳香族阳离子肽或多种芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)，并且在一些实施方式中，将治疗有效量的一种芳香族阳离子肽或多种芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至需要所述芳香族阳离子肽的对象，以治疗或预防骨骼肌衰弱。

在一些方面，提供了用于治疗或预防哺乳动物对象中的骨骼肌衰弱的方法。通常，该方法包括将治疗有效量的肽D-Arg-2’,6’Dmt-Lys-Phe-NH₂或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至哺乳动物对象。在一些实施方式中，所述肽可以口服给药、局部给药、全身给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药。

在一些实施方式中，骨骼肌包括膈肌，且骨骼肌衰弱由机械通气(MV)引起。在一些实施方式中，提供了一种用于治疗或预防哺乳动物对象中MV-诱导的膈膜功能障碍的方法。在一些实施方式中，所述MV的持续时间为至少10小时，且在一些实施方式中，在MV之前、在MV期间、或在MV之前和在MV期间，将所述肽给药至所述对象。在一些实施方式中，所述肽可以口服给药、局部给药、全身给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药。

另外地或可替选地，在一些实施方式中，提供了治疗或预防哺乳动物对象中废用-诱导的骨骼肌萎缩的方法。通常，这类方法包括将治疗有效量的肽D-Arg-2’,6’Dmt-Lys-Phe-NH₂或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至哺乳动物对象。在一些实施方式中，骨骼肌包括比目鱼肌或跖肌，或比目鱼肌和跖肌。在一些实施方式中，在废用之前或在废用期间将所述肽给药至所述对象。在一些实施方式中，所述肽可以口服给药、局部给药、全身给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药。

另外地或可替选地，在一些实施方式中，提供了治疗哺乳动物对象的骨骼肌中以增加的氧化损伤为特征的疾病或病症的方法。通常，这类方法包括将治疗有效量的肽D-Arg-2’,6’Dmt-Lys-Phe-NH₂或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至哺乳动物对象。在一些实施方式中，在增加的氧化损伤之前或在增加的氧化损伤期间将所述肽给药至所述对象。在一些实施方式中，所述氧化损伤与一种生物标记物或多种生物标记物的基因表达或蛋白水平、蛋白活性或蛋白降解与对照水平相比的变化相关。在一些实施方式中，，所述对照水平为来自不患有废用-诱导的骨骼肌萎缩或不患有MV-诱导的膈膜功能障碍的健康个体的一种生物标记物或多种生物标记物的水平。在一些实施方式中，所述生物标记物选自钙蛋白酶、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-12、20S蛋白酶、E3连接酶、atrogin-1/MAFbx、MuRF-1、αII-血影蛋白、肌小节蛋白、4-HNE-结合胞质蛋白和肌原纤维蛋白中的蛋白羰基。在一些实施方式中，以增加的氧化损伤为特征的所述疾病或所述病症包括废用-诱导的骨骼肌萎缩或MV-诱导的膈膜功能障碍。在一些实施方式中，所述肽可以口服给药、局部给药、全身给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药或肌肉内给药。

一方面，本发明提供一种治疗或预防MV-诱导的膈膜功能障碍的方法，该方法包括将治疗有效量的芳香族阳离子肽给药至需要该芳香族阳离子肽的哺乳动物对象。在一些实施方式中，所述芳香族阳离子肽是包括以下的肽：

至少一个净正电荷；

最少四个氨基酸；

最多约20个氨基酸；

净正电荷的最小数目(p_m)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系为：3p_m是小于或等于r+1的最大数；以及芳香族基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(p_t)之间的关系为：除了当a为1时，p_t也可为1之外，2a是小于或等于p_t+1的最大数。在一些实施方式中，所述哺乳动物对象为人。

在一个实施方式中，2p_m是小于或等于r+1的最大数，且a可以等于p_t。所述芳香族阳离子肽可以是具有最少两个正电荷或最少三个正电荷的可溶于水的肽。

在一个实施方式中，所述肽包括一种或多种非自然存在的氨基酸，例如一种或多种D型氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸的在C-末端的C-末端羧基被酰胺化。在某些实施方式中，所述肽最少具有4个氨基酸。肽可以最多有约6个、最多约9个或者最多约12个氨基酸。

在一个实施方式中，所述肽包括在N-末端的酪氨酸残基或2',6'-二甲基酪氨酸(Dmt)残基。例如，所述肽可以具有分子式Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH₂(SS-01)或2',6'-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH₂(SS-02)。在另一实施方式中，所述肽包括在N-末端的苯丙氨酸残基或2',6'-二甲基苯丙氨酸残基。例如，所述肽可以具有分子式Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂(SS-20)或2',6'-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH₂。在特定的实施方式中，所述芳香族阳离子肽具有分子式D-Arg-2',6'-Dmt-Lys-Phe-NH₂(SS-31)。

在一个实施方式中，所述肽由下式I定义：

其中R¹和R²各独立地选自：

(i)氢；

(ii)线性或支链的C₁-C₆的烷基；

(iii)

其中m＝1-3；

(iv)

(v)

R³和R⁴各独立地选自：

(i)氢；

(ii)线性或支链的C₁-C₆的烷基；

(iii)C₁-C₆的烷氧基；

(iv)氨基；

(v)C₁-C₄的烷基氨基；

(vi)C₁-C₄的二烷基氨基；

(vii)硝基；

(viii)羟基；

(ix)卤素，其中“卤素”包括氯、氟、溴和碘；

R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹各独立地选自：

(i)氢；

(ii)线性或支链的C₁-C₆的烷基；

(iii)C₁-C₆的烷氧基；

(iv)氨基；

(v)C₁-C₄的烷基氨基；

(vi)C₁-C₄的二烷基氨基；

(vii)硝基；

(viii)羟基；

(ix)卤素，其中“卤素”包括氯、氟、溴和碘；且

n为1到5的整数。

在特定的实施方式中，R¹和R²是氢；R³和R⁴是甲基；R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹都是氢；且n为4。

在一个实施方式中，所述肽由下式II定义：

其中R¹和R²各独立地选自：

(i)氢；

(ii)线性或支链的C₁-C₆的烷基；

(iii)

其中m＝1-3；

(iv)

(v)

R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²各独立地选自：

(i)氢；

(ii)线性或支链的C₁-C₆的烷基；

(iii)C₁-C₆的烷氧基；

(iv)氨基；

(v)C₁-C₄的烷基氨基；

(vi)C₁-C₄的二烷基氨基；

(vii)硝基；

(viii)羟基；

(ix)卤素，其中“卤素”包括氯、氟、溴和碘；且

n为1到5的整数。

在特定的实施方式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²均为氢；且n为4。在另一实施方式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹¹均为氢；R⁸和R¹²为甲基；R¹⁰为羟基；且n为4。

所述芳香族阳离子肽可以以各种方式给药。在一些实施方式中，所述肽可以口服给药、局部给药、鼻内给药、腹腔内给药、静脉内给药或皮下给药。

附图说明

图1A和图1B为示出从对照大鼠、机械通气(MV)大鼠和机械通气且用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31(MVSS)处理的大鼠的膈膜中分离出的线粒体释放的过氧化氢的速率的图。图1A示出态-3线粒体呼吸。图1B示出态-4线粒体呼吸；

图2A和图2B为示出在对照大鼠、MV大鼠和机械通气且用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31(MVSS)处理的大鼠的膈膜中的氧化修饰蛋白的含量的图。图2A示出在该三个实验组的膈膜中的4-羟基壬烯醛结合蛋白的含量。在直方图上方的图像为来自该三个实验组的数据的典型蛋白质印迹。图2B示出该三个实验组的膈膜中蛋白质羰基的含量。在直方图上方的图像为来自该三个实验组的数据的典型蛋白质印迹；

图3为证实在对照大鼠、在存在和不存在线粒体靶向的抗氧化剂的情况下的机械通气大鼠中，长期MV对膈肌力-频率响应(体外)的作用的图；

图4为示出来自对照大鼠和利用MVSS的机械通气的大鼠的膈肌纤维中的纤维横断面面积(CSA)的图；

图5A至图5C为示出蛋白酶活性的图。图5A示出20S蛋白酶体的活性。图5B示出atrogin-1的mRNA水平和蛋白水平。图5C示出MuRF-1的mRNA水平和蛋白水平。在图5B和图5C的直方图上方的图像为来自三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹；

图6A和图6B为来自对照动物、在存在和不存在线粒体靶向的抗氧化剂(MVSS)的情况下的机械通气的动物的膈膜中的钙蛋白酶1和半胱天冬酶-3的活性的图。图6A示出在完成12小时MV时膈肌中钙蛋白酶1的活性形式。图5B示出在完成12小时MV时膈肌中半胱天冬酶-3的分裂且活性的带。在直方图的上方的图像为来自三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹；

图7A和图7B为示出来自对照动物、在存在和不存在线粒体靶向的抗氧化剂(MV)的机械通气的动物的膈膜中的钙蛋白酶和半胱天冬酶-3的活性的图。图7A示出在12小时的MV后膈肌中145kDaα-II-血影蛋白裂解产物(SBPD)的含量。图7B示出在12小时的MV后膈肌中120kDaα-II-血影蛋白裂解产物(SBPD 120kDa)的含量。在直方图的上方的图像为来自三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹；

图8为示出来自对照动物、在存在和不存在线粒体靶向的抗氧化剂(MV)的机械通气的动物的膈膜中的肌动蛋白与全部肌小节蛋白的比率的图。在直方图的上方的图像为来自三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹；

图9A至图9D为示出线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对正常的肌肉中的比目鱼肌重量(图9A)、呼吸控制率(RCR)(图9B)、线粒体态3呼吸(图9C)、或线粒体态4呼吸(图9D)不产生影响的图；

图10A至图10C为示出线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对正常的比目鱼肌中的比目鱼肌类型I(图10A)、类型IIa(图10B)、或类型IIb/x(图10C)的纤维尺寸(横断面面积)不产生影响的图；

图11A至图11D为示出线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对正常的肌肉中的跖肌重量(图11A)、呼吸控制率或RCR(图11B)、线粒体态3呼吸(图11C)、或线粒体态4呼吸(图11D)不产生影响的图；

图12A至图12B为示出线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对正常的跖肌中的跖肌类型IIa(图12A)或类型IIb/x(图12B)的纤维尺寸(横断面面积)没有影响的图；

图13A至图13D为示出石膏固定7天导致比目鱼肌重量(图13A)的显著下降的图，通过SS-31可防止该下降。石膏固定还显著降低了线粒体态3(图13C)呼吸，但对态4(图13D)呼吸没有影响，从而导致RCR(图13B)的显著下降。通过SS-31可防止所有的前述的缺陷；

图14A和图14B为示出石膏固定7天显著增加了从比目鱼肌分离出的线粒体的H₂O₂的产量的图，通过SS-31防止该增加(图14A)。图14B示出SS-31防止三种所示出的纤维类型横断面面积的损失。

图15A至图15D为示出石膏固定7天显著增加了比目鱼肌中氧化损伤的图，如通过脂质过氧化所测量(图15A)，通过SS-31可抑制该损伤。石膏固定还显著地增加了比目鱼肌中的钙蛋白酶-1(图15B)、半胱天冬酶-3(图15C)和半胱天冬酶-12(图15D)的蛋白酶活性，通过SS-31可防止该增加。

图16A至图16D为示出石膏固定7天降低了比跖肌重量(图16A)和比跖肌中的线粒体RCR(图16B)的图，通过SS-31可防止该降低。图16C示出态3呼吸，且图16D示出态4呼吸。

图17A为示出石膏固定7天显著增加了从跖肌分离出的线粒体的H₂O₂的产量的图，通过SS-31防止该增加(图17A)。图17B示出SS-31预防两种所示出的纤维类型横断面面积的损失。

图18A至图18D为示出石膏固定7天显著增加了跖肌中氧化损伤的图，如通过脂质过氧化所测量(图18A)，通过SS-31可抑制该增加。石膏固定还显著地增加了跖肌中的钙蛋白酶-1(图18B)、半胱天冬酶-3(图18C)和半胱天冬酶-12(图18D)的蛋白酶活性，通过SS-31可防止该增加。

具体实施方式

应当明白，为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

在实施本发明的过程中，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术。这些技术是熟知的，并且分别在例如以下的文献中进行了说明：Current Protocols in MolecularBiology,第I-III卷,Ausubel,Ed.(1997)；Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY,1989)。本文引用的所有参考文献的全部内容以引用方式并入本文。

除非内容清楚指明，否则本说明书和所附的权利要求中使用的单数形式“一”和“该”包括复数的引用对象。例如，所提及的“一种肽”包括两种肽或更多肽的组合等。

本文中使用的例如要素A与要素B“相关联”的措辞意味着：存在两种要素，但不应当解释为意味着一个要素必须有原因地连接至另一个要素。

本文中使用的将制剂、药物或肽“给药”至对象包括将化合物引入到或给送至对象以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径来执行“给药”，包括口服、鼻内、肠胃外(通过静脉内、肌内、腹腔内或皮下)或者局部给药。“给药”包括自己给药和由其他人给药。

本文中使用的术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸(左旋氨基酸、右旋氨基酸)和合成的氨基酸以及氨基酸类似物和以类似于天然存在的氨基酸的形式作用的氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是通过遗传密码编码的氨基酸以及后来被改性的那些氨基酸，比如羟(基)脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如，所述的基本化学结构即结合至氢的α-碳、羧基、氨基和R基，所述氨基酸类似物比如为高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有改性的R基(例如正亮氨酸)或改性的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指的是具有与氨基酸的通用化学结构不同的结构、但以类似于天然存在的氨基酸的方式作用的化学化合物。本文中可按照IUPAC-IUB生化命名委员会建议的通常已知的三字母符号或者一字母符号指代氨基酸。

本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”指的是足以获得所需的治疗和/或预防效果的量，例如引起预防或减轻肌肉功能障碍或肌肉萎缩或者与肌肉功能障碍或肌肉萎缩关联的一种或多种病症的量。在治疗应用或预防应用的上下文中，给药至对象的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的性质，比如平常健康情况、年龄、性别、体重和对药物的耐受力。所述量还取决于疾病的程度、严重性和类型。专业的技术人员将能够根据这些因素和其他因素来确定合适的剂量。所述组合物还可结合一种或多种其他的治疗化合物来给药。在本文描述的方法中，芳香族阳离子肽可以给药至具有与肌肉废用性、MV执行等相关的影响的一种或多种症状或症候的对象。例如，一种或多种芳香族阳离子肽的“治疗有效量”是指足以最小程度地减轻MV-诱导的或废用诱导的肌肉萎缩、功能障碍、退化、收缩功能障碍、损伤等的量。

本文中使用的术语“医学病症”包括但不限于任何表现为一个或多个身体病症和/或心理病症的状况或疾病，对于这些病症治疗和/预防是期望的，和包括先前和最近确认的疾病和其他异常。例如，医学病症可为MC-诱导的或废用-诱导的骨骼肌萎缩或功能障碍或收缩功能障碍或任何相关的病症或并发症。

“分离的”或“纯化的”多肽或肽基本上不具有源自细胞源或组织源(试剂来自于该源)的细胞材料或其它受污染的多肽，或者当化学合成时基本上不具有化学前体或其它的化学物质。例如，分离的芳香族阳离子肽将不具有会干扰试剂的诊断用途或治疗用途的材料。这样的干扰材料可以包括酶、激素和其他蛋白质的溶解物和非蛋白质的溶解物。

本文中使用的术语“净电荷”指的是存在于肽中的氨基酸所携带的正电荷的数目和负电荷的数目的之间的相抵余数。在本说明书中，应当理解，净电荷是在生理pH条件下测定的。在生理pH条件下带正电的天然存在的氨基酸包括左旋赖氨酸、左旋精氨酸和左旋组氨酸。在生理pH条件下带负电的天然存在的氨基酸包括左旋天冬氨酸和左旋谷氨酸。

本文中使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中是可互换的，以表示包括通过肽键或改性的肽键而互相连接的两个或更多个氨基酸的聚合物，例如肽电子等排体。多肽指的是短链(通常称为肽、糖肽或低聚物)以及较长的链(通常称为蛋白质)。多肽可以包括与20个基因编码的氨基酸不同的氨基酸。多肽包括通过诸如翻译后加工的天然进程或本领域熟知的化学改性技术改性的氨基酸序列。

本文中使用的“预防”失调或病症指的是，在统计样本中，化合物相对于未治疗的对照样本降低治疗的样本的失调或病症的发生，或者相对于未治疗的对照样本延迟失调或病症的一种或多种症候的发生或者减轻失调或病症的一种或多种症候的严重程度。在本文中，预防骨骼肌功能障碍包括预防骨骼肌功能障碍的开始、延迟骨骼肌功能障碍的开始、预防骨骼肌功能障碍的发展或进展、减缓骨骼肌功能障碍的发展或进展、延迟骨骼肌功能障碍的发展或进展以及使骨骼肌功能障碍的发展从严重阶段逆转为较不严重的阶段。

在本文中使用的关于肌无力或肌肉功能障碍或肌肉萎缩的起因或相关性的术语“长期”或“长期MV”或“长期废用”包括从至少大约0.5小时、大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约15小时、大约20小时、大约30小时、大约50小时或大约100小时到至少大约1小时、大约10小时、大约20小时、大约50小时、大约75小时、大约100小时或更多小时、天或年的时间。

本文中使用的术语“同时”治疗应用指的是通过相同的途径且在同一时间或基本上在同一时间将至少两种活性成分给药。

本文中使用的术语“单独”治疗应用指的是在同一时间或者基本上相同的时间通过不同的途径将至少两种活性成分给药。

术语“重叠”治疗应用指的是在不同但重叠的时间将一种或多种活性成分给药。重叠治疗应用包括通过不同的途径或通过相同的途径将活性成分给药。

本文中使用的术语“顺序”治疗应用指的是在不同的时间将至少两种活性成分给药，给药途径相同或不同。更具体地，顺序应用指的是在其它活性成分给药开始之前，将所述活性成分中的一种活性成分完全给药。因此，可以在将其它的活性成分给药之前的若干分钟、若干小时或若干天之前，将一种活性成分给药。在这种情况下没有进行同时治疗。

本文中使用的术语“对象”指的是任何脊椎动物物种中的一员。本发明公开的主体的方法特别地有用于温血脊椎动物。本文所提供的为哺乳动物的治疗，例如人类，以及那些对于人类具有由于濒临灭绝导致的重要性、经济重要性(在农场饲养动物用于人类消费)和/或社会重要性(作为宠物或动物园中的动物)的哺乳动物。在特定的实施方式中，该对象为人。

本文中使用的“肌肉衰弱”指的是减弱的肌肉功能或异常的肌肉功能，并且包括例如一种或多种肌肉无力、肌肉功能障碍、萎缩、废用、退化、收缩性功能障碍或损伤。肌肉衰弱的一个示例为机械通气(MV)导致的膈肌无力。肌肉衰弱的另一示例为肌肉废用例如固定肢体导致的肌肉无力。一个或多个原因可导致、得到或形成肌肉衰弱，该原因包括但不限于年龄、遗传性、疾病(例如感染)、机械或化学的原因。一些可引起肌肉衰弱的非限定示例包括衰老、延长的卧床休养、与失重状态(例如在太空飞行中)相关的肌肉无力、药物引起的肌肉无力(例如由于他汀类(statins)、抗病毒药物和噻唑霉素的作用)和由于癌症或其他疾病导致的恶病质。在一些情况下，例如骨骼肌病症的肌肉衰弱来自于酶(例如黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶)产生的活性氧(“ROS”)和/或肌肉细胞范围内的线粒体产生的活性氧所导致的氧化应激。这类ROS可在任何情况下产生，包括上文所列的那些情况。通过评估一个或多个身体的参数和/或生理参数可确定肌肉衰弱或肌肉衰弱的程度。

本文中使用的术语“治疗”或“减轻”指的是治疗处理措施和预防或防止措施，其中，目的是防止或减缓(减轻)目标病症或失调。如果在使用了根据本文所述的方法的治疗量的芳香族的阳离子肽后，对象显示出MV-诱导的或废用-诱导的病症(例如MV-诱导的或废用-诱导的肌肉萎缩、功能障碍、退化、收缩性功能障碍、损失等)的一种或多种症状和症候的可以观察到的和/或测定到的减少和消失，则对象的MV-诱导的或废用-诱导的肌肉衰弱得到成功地“治疗”。还应当理解，本文描述的治疗或预防医学病症的各种模式意在表示“显著”，其包括完全治疗或者预防以及小于完全治疗或者预防，其中达到了某种生物学相关或医学相关的结果。本文中使用的治疗肌肉衰弱也指任何一种或多种肌肉功能障碍、萎缩、废用、退化、收缩性功能障碍、损伤等。

I.芳香族阳离子肽

在一个方面中，提供了用于治疗或预防骨骼肌疾病(例如无力、萎缩、功能障碍等)的组合物和方法。在一些实施方式中，该组合物和方法包括将某些芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(例如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药。所述芳香族阳离子肽可溶于水并且强极性。除了这些性质之外，所述肽能够容易地穿过细胞膜。芳香族阳离子肽通常最少包括通过肽键而共价键连接的三个氨基酸或最少包括通过肽键而共价键连接的四个氨基酸。芳香族阳离子肽中存在的氨基酸的最大数目为通过肽键而共价键连接的大约二十个氨基酸。合适地，氨基酸的最大数目为约12个、更优选地为约9个且最优选地为约6个。

芳香族阳离子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。本文中使用的术语“氨基酸”用来指包括至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。通常，至少一个氨基相对于羧基在α位。所述氨基酸可以是天然存在的。例如，天然存在的氨基酸包括通常在哺乳动物蛋白中发现的二十种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，天门冬酰胺(Asn)，天门冬氨酸(Asp)，半胱氨酸(Cys)，谷氨酰胺(Gln)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，蛋氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)，和缬氨酸(Val)。其它天然存在的氨基酸包括诸如与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，氨基酸—鸟氨酸和瓜氨酸是在哺乳动物新陈代谢的产生尿素期间合成的。天然存在的氨基酸的另一示例包括羟(基)脯氨酸(Hyp)。

所述肽可选地包括一种或多种非天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，所述肽不具有天然存在的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸可以是左旋(L-)氨基酸、右旋(D-)氨基酸或其混合物。非天然存在的氨基酸是这样的氨基酸：通常不是在生物体的天然代谢过程中合成的，且非天然地出现在蛋白质中。此外，非天然存在的氨基酸合适地也不会由普通的蛋白酶识别。非天然存在的氨基酸可以存在于肽的任何位置中。例如，非天然存在的氨基酸可以在N-末端、C-末端或者在N-末端和C-末端之间的任何位置。本发明中的肽的药学上可接受的盐形式可用在本发明中上文所提供的方法中(例如但不限于肽的醋酸盐或三氟醋酸盐)。

例如，非天然的氨基酸可以包括天然氨基酸中不存在的烷基、芳基或烷基芳基。非天然烷基氨基酸的一些示例包括α-氨基丁酸，β-氨基丁酸，γ-氨基丁酸，δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。非天然的芳基氨基酸的一些示例包括邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸和对氨基苯甲酸。非天然的烷基芳基氨基酸的一些示例包括邻氨基苯乙酸、间氨基苯乙酸和对氨基苯乙酸、以及γ-苯基-β-氨基丁酸。非天然存在的氨基酸包括天然存在的氨基酸的衍生物。所述天然存在的氨基酸的衍生物可以包括诸如对天然存在的氨基酸添加一种或多种化学基团。

例如，可以将一种或多种化学基团添加至苯基丙氨酸残基或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’或6’位置或者至色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’或7’位置。所述基团可以是可以添加到芳香环的任何化学基团。这样的基团的一些示例包括：支链的或者无支链的C₁-C₄的烷基，比如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基；C₁-C₄的烷氧基(即烷氧基)；氨基；C₁-C₄的烷基氨基和C₁-C₄的二烷基氨基(例如，甲氨基、二甲氨基)；硝基；羟基；卤素(即氟、氯、溴或碘)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特定示例包括正缬氨酸(Nva)和正亮氨酸(Nle)。

肽中氨基酸的改性的另一示例是将肽中的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基衍生化。衍生化的一个示例是与氨或伯胺或仲胺(例如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺)的酰胺化。衍生化的另一示例包括与诸如甲醇或乙醇进行酯化。另一种这样的改性包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基的衍生化。例如，这些氨基可以被酰化。例如，一些合适的酰基包括苯甲酰基或者包括以上提及的C₁-C₄的烷基中的任一烷基的烷酰基，比如乙酰基或丙酰基。

非天然存在的氨基酸对常见的蛋白酶适宜地为抵抗性的和/或为不敏感的。对蛋白酶抵抗性的或者不敏感的非天然存在的氨基酸的示例包括以上提及的任一种自然存在的左旋(L-)氨基酸的右旋(D-)形式以及左旋和/或右旋的非天然存在的氨基酸。尽管右旋氨基酸存在于通过与细胞的常规的核糖体蛋白合成方法不同的方法而合成的某些肽抗生素中，但右旋氨基酸通常不存在于蛋白质中。本文中使用的右旋氨基酸被认为是非天然存在的氨基酸。

为了使蛋白酶灵敏度最小，肽可具有小于5个、优选地小于4个、更优选地小于3个、且最优选地小于2个的由普通蛋白酶识别的连续左旋氨基酸，而与氨基酸是否为天然存在无关。最适宜地，肽仅具有右旋氨基酸，而不具有左旋氨基酸。如果肽具有蛋白酶敏感的氨基酸序列，则所述氨基酸中的至少一个氨基酸优选地为非天然存在的右旋氨基酸，由此提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的示例包括可以由常见的蛋白酶(比如肽链内切酶和胰蛋白酶)容易地切割的两个或更多个连续的碱性氨基酸。碱性氨基酸的示例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

与肽中的氨基酸残基的总数目相比，在生理pH条件下，芳香族阳离子肽应当具有最小数目的净正电荷。生理pH条件下的净正电荷的最小数目将在下文称为(p_m)。肽中的氨基酸残基的总数目将在下文称为(r)。下文讨论的净正电荷的最小数目都是在生理pH条件下。本文中使用的术语“生理pH”指的是哺乳动物体的组织和器官的细胞中的正常pH。例如，人的生理pH通常为约7.4，而哺乳动物中的正常生理pH可以为从约7.0至约7.8的任一pH。

通常地，肽具有带正电的N-末端氨基和带负电的C-末端羧基。所述电荷在生理pH下相互抵消。作为计算净电荷的示例，肽Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-D-Arg具有一个带负电的氨基酸(即Glu)和四个带正电的氨基酸(即，两个Arg残基、一个Lys和一个His)。因此，以上的肽具有3个净正电荷。

在一个实施方式中，芳香族阳离子肽的在生理pH条件下的净正电荷的最小数目(p_m)和氨基酸残基的总数目(r)之间具有如下关系：其中，3p_m是小于或等于r+1的最大数。在该实施方式中，净正电荷的最小数目(p_m)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系如下：

表1.氨基酸数目和净正电荷(3p_m≤p+1)

(r)	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
																			(pm)	1	1	2	2	2	3	3	3	4	4	4	5	5	5	6	6	6	7

在另一实施方式中，芳香族阳离子肽的净正电荷的最小数目(p_m)和氨基酸残基的总数目(r)之间具有如下关系：其中，2p_m是小于或等于r+1的最大数。在该实施方式中，净正电荷的最小数目(p_m)和氨基酸残基的总数目(r)之间的关系如下：

表2.氨基酸数目和净正电荷(2p_m≤p+1)

(r)	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
																			(pm)	2	2	3	3	4	4	5	5	6	6	7	7	8	8	9	9	10	10

在一个实施方式中，净正电荷的最小数目(p_m)和氨基酸残基的总数目(r)相等。在另一实施方式中，肽具有三个或四个氨基酸残基，其净正电荷的最小数目为1、适宜地净正电荷的最小数目为2且更优选地净正电荷的最小数目为3。

还重要的是，芳香族阳离子肽相比于净正电荷的总数目(p_t)具有最小数目的芳香基团。芳香基团的最小数目在下文将称为(a)。具有芳香基团的天然存在的氨基酸包括氨基酸—组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。例如，六肽Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-Trp具有2个净正电荷(由赖氨酸残基和精氨酸残基提供)以及三个芳香基团(由酪氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基提供)。

芳香族阳离子肽还应当在芳香基团的最小数目(a)和在生理pH条件下的净正电荷的总数目(p_t)之间具有如下关系：其中，除了当p_t为1时a也可为1之外，3a是小于或等于p_t+1的最大数。在该实施方式中，芳香基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(p_t)之间的关系如下：

表3.芳香基团和净正电荷(3a≤p_t+1或a＝p_t＝1)

(pt)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
																					(a)	1	1	1	1	2	2	2	3	3	3	4	4	4	5	5	5	6	6	6	7

在另一实施方式中，芳香族阳离子肽在芳香基团的最小数目(a)和净正电荷的总数目(p_t)之间具有如下关系：其中，2a是小于或者等于p_t+1的最大数。在该实施方式中，芳香氨基酸残基的最小数目(a)和净正电荷的总数目(p_t)之间的关系如下：

表4.芳香基团和净正电荷(2a≤p_t+1或a＝p_t＝1)

(pt)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
																					(a)	1	1	2	2	3	3	4	4	5	5	6	6	7	7	8	8	9	9	10	10

在另一实施方式中，芳香基团的数目(a)和净正电荷的总数目(p_t)相等。

羧基且尤其是C-末端氨基酸的末端羧基优选地与诸如氨进行酰胺化，以形成C端酰胺。可选地，C-端氨基酸的末端羧基可以与任一伯胺或仲胺进行酰胺化。所述伯胺或仲胺可以是诸如烷基、尤其是支链的或无支链的C₁-C₄的烷基或者芳香胺。因此，在肽的C末端的氨基酸可以转化为酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N,N-二甲基酰胺基、N,N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。未出现在芳香族阳离子肽的C末端的天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基和天冬氨酸残基和谷氨基酸残基的游离的羧酸基也可被酰胺化，不论它们是否存在于肽内。这些内部位置的酰胺化可以与氨或以上所述伯胺或仲胺中的任何一者进行。

在一个实施方式中，芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷以及至少一个芳香族氨基酸的三肽。在特定的实施方式中，所述芳香族阳离子肽是具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。

芳香族阳离子肽包括但不限于以下肽的示例：

Lys-D-Arg-Tyr-NH₂

Phe-D-Arg-His

D-Tyr-Trp-Lys-NH₂

Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH₂

Tyr-His-D-Gly-Met

Phe-Arg-D-His-Asp

Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH₂

Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg

D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg

Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH₂

Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His

Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH₂

Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH₂

Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys

Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH₂

Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys

Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH₂

D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH₂

Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe

Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe

Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH₂

Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr

Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys

Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH₂

Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly

D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH₂

Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe

His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH₂

Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp

Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH₂

在一个实施方式中，肽具有μ型阿片(mu-opioid)受体激动剂活性(即肽激活μ型阿片受体)。具有μ型阿片受体激动剂活性的肽通常为那些在N-末端(即第一氨基酸位置)具有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物的肽。酪氨酸的合适的衍生物包括2’-甲基酪氨酸(Mmt)、2’,6’-二甲基酪氨酸(2’6’-Dmt)、3’,5’-二甲基酪氨酸(3’5’-Dmt)、N,2’,6’-三甲基酪氨酸(Tmt)和2’-羟基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。

在一个实施方式中，具有μ型阿片受体激动剂活性的肽具有式Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH₂(本文中称为“SS-01”)。SS-01具有氨基酸酪氨酸、精氨酸和赖氨酸所贡献的三个净正电荷和氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸所贡献的两个芳香基。SS-01的酪氨酸可以为酪氨酸的改性衍生物，例如2’,6’-二甲基酪氨酸，以制备具有式2’,6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH₂(本文中称为“SS-02”)的化合物。该肽SS-02具有640的分子量，且在生理pH条件下携带三个净正电荷。该肽以能量非依存的方式易于穿过若干哺乳动物细胞类型的细胞质膜(Zhao等，JPharmacol Exp Ther.,304:425-432,2003)。

可替选地，在其他情况下，芳香族阳离子肽不具有μ型阿片受体激动剂活性。例如，在长期治疗中，例如在慢性疾病状况或病症中，使用激活μ型阿片受体的芳香族阳离子肽可能是禁忌的。在这些情况下，该芳香族阳离子肽潜在不利的或令人上瘾的效应可排除在人类患者或其他哺乳动物的治疗方案中使用激活μ型阿片受体的芳香族阳离子肽。潜在不利的效应可包括镇静、便秘和呼吸抑制。在这类情况下，不激活μ型阿片受体的芳香族阳离子肽可能是合适的治疗。不具有μ型阿片受体激动剂活性的肽通常在N-末端(即氨基酸位置1)上不具有酪氨酸残基或不具有酪氨酸衍生物。在N-末端上的氨基酸可以为不同于酪氨酸的任何天然存在的或非天然存在的氨基酸。在一实施方式中，N-末端上的氨基酸为苯丙氨酸或苯丙氨酸的衍生物。苯丙氨酸的示例性衍生物包括2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’,6’-二甲基苯丙氨酸(2’,6’-Dmp)、N,2’,6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2’-羟基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。

不具有μ型阿片受体激动剂活性的芳香族阳离子肽的示例具有式Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH₂(本文中称为“SS-20”)。可替选地，N-末端的苯丙氨酸可为苯丙氨酸的衍生物，例如2’,6’-二甲基苯丙氨酸(2’6’-Dmp)。在氨基酸位置1处具有2’,6’-二甲基苯丙氨酸的肽SS-01具有式2’,6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH₂。在一个实施方式中，肽SS-02的氨基酸序列重排使得Dmt不在N-末端。这类不具有μ型阿片受体激动剂活性的芳香族阳离子肽的示例具有式D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH₂。

本文列出的肽的合适的取代变型包括保守的氨基酸取代物。氨基酸可以根据其物理化学性质而进行如下分组：

(a)非极性氨基酸：Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G)Cys(C)；

(b)酸性氨基酸：Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q)；

(c)碱性氨基酸：His(H)Arg(R)Lys(K)；

(d)疏水性氨基酸：Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V)；以及

(e)芳香族氨基酸：Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H)。

肽中的氨基酸被同一组中的另一种氨基酸取代称为保守取代，且可以保留原始肽的物理化学性质。相反，肽中的氨基酸被不同组中的另一种氨基酸取代通常更有可能改变原始肽的物理化学性质。

激活μ型阿片受体的肽的示例包括但不限于表5中所示的芳香族阳离子肽。

表5 具有μ型阿片活性的肽类似物

氨基酸位置1	氨基酸位置2	氨基酸位置3	氨基酸位置4	C-末端改性
					Tyr	D-Arg	Phe	Lys	NH2
Tyr	D-Arg	Phe	Orn	NH2
					Tyr	D-Arg	Phe	Dab	NH2
Tyr	D-Arg	Phe	Dap	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Lys	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Lys-NH(CH2)2-NH-dns	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Lys-NH(CH2)2-NH-atn	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Phe	dnsLys	NH2
					2’6’Dmt	D-Cit	Phe	Lys	NH2

2’6’Dmt	D-Cit	Phe	Ahp	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Orn	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Dab	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Dap	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Ahp(2-氨基庚酸)	NH2
					Bio-2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Lys	NH2
3’5’Dmt	D-Arg	Phe	Lys	NH2
					3’5’Dmt	D-Arg	Phe	Orn	NH2
3’5’Dmt	D-Arg	Phe	Dab	NH2
					3’5’Dmt	D-Arg	Phe	Dap	NH2
Tyr	D-Arg	Tyr	Lys	NH2
					Tyr	D-Arg	Tyr	Orn	NH2
Tyr	D-Arg	Tyr	Dab	NH2
					Tyr	D-Arg	Tyr	Dap	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Tyr	Lys	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Tyr	Orn	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Tyr	Dab	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Tyr	Dap	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	2’6’Dmt	Lys	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	2’6’Dmt	Orn	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	2’6’Dmt	Dab	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	2’6’Dmt	Dap	NH2
3’5’Dmt	D-Arg	3’5’Dmt	Arg	NH2
					3’5’Dmt	D-Arg	3’5’Dmt	Lys	NH2
3’5’Dmt	D-Arg	3’5’Dmt	Orn	NH2
					3’5’Dmt	D-Arg	3’5’Dmt	Dab	NH2
Tyr	D-Lys	Phe	Dap	NH2
					Tyr	D-Lys	Phe	Arg	NH2
Tyr	D-Lys	Phe	Lys	NH2
					Tyr	D-Lys	Phe	Orn	NH2
2’6’Dmt	D-Lys	Phe	Dab	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	Phe	Dap	NH2
2’6’Dmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	Phe	Lys	NH2
3’5’Dmt	D-Lys	Phe	Orn	NH2
					3’5’Dmt	D-Lys	Phe	Dab	NH2
3’5’Dmt	D-Lys	Phe	Dap	NH2
					3’5’Dmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
Tyr	D-Lys	Tyr	Lys	NH2
					Tyr	D-Lys	Tyr	Orn	NH2
Tyr	D-Lys	Tyr	Dab	NH2
					Tyr	D-Lys	Tyr	Dap	NH2

2’6’Dmt	D-Lys	Tyr	Lys	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	Tyr	Orn	NH2
2’6’Dmt	D-Lys	Tyr	Dab	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	Tyr	Dap	NH2
2’6’Dmt	D-Lys	2’6’Dmt	Lys	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	2’6’Dmt	Orn	NH2
2’6’Dmt	D-Lys	2’6’Dmt	Dab	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	2’6’Dmt	Dap	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Phe	dnsDap	NH2
					2’6’Dmt	D-Arg	Phe	atnDap	NH2
3’5’Dmt	D-Lys	3’5’Dmt	Lys	NH2
					3’5’Dmt	D-Lys	3’5’Dmt	Orn	NH2
3’5’Dmt	D-Lys	3’5’Dmt	Dab	NH2
					3’5’Dmt	D-Lys	3’5’Dmt	Dap	NH2
Tyr	D-Lys	Phe	Arg	NH2
					Tyr	D-Orn	Phe	Arg	NH2
Tyr	D-Dab	Phe	Arg	NH2
					Tyr	D-Dap	Phe	Arg	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	Phe	Arg	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
2’6’Dmt	D-Orn	Phe	Arg	NH2
					2’6’Dmt	D-Dab	Phe	Arg	NH2
3’5’Dmt	D-Dap	Phe	Arg	NH2
					3’5’Dmt	D-Arg	Phe	Arg	NH2
3’5’Dmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
					3’5’Dmt	D-Orn	Phe	Arg	NH2
Tyr	D-Lys	Tyr	Arg	NH2
					Tyr	D-Orn	Tyr	Arg	NH2
Tyr	D-Dab	Tyr	Arg	NH2
					Tyr	D-Dap	Tyr	Arg	NH2
2’6’Dmt	D-Arg	2’6’Dmt	Arg	NH2
					2’6’Dmt	D-Lys	2’6’Dmt	Arg	NH2
2’6’Dmt	D-Orn	2’6’Dmt	Arg	NH2
					2’6’Dmt	D-Dab	2’6’Dmt	Arg	NH2
3’5’Dmt	D-Dap	3’5’Dmt	Arg	NH2
					3’5’Dmt	D-Arg	3’5’Dmt	Arg	NH2
3’5’Dmt	D-Lys	3’5’Dmt	Arg	NH2
					3’5’Dmt	D-Orn	3’5’Dmt	Arg	NH2
Mmt	D-Arg	Phe	Lys	NH2
					Mmt	D-Arg	Phe	Orn	NH2
Mmt	D-Arg	Phe	Dab	NH2
					Mmt	D-Arg	Phe	Dap	NH2

Tmt	D-Arg	Phe	Lys	NH2
					Tmt	D-Arg	Phe	Orn	NH2
Tmt	D-Arg	Phe	Dab	NH2
					Tmt	D-Arg	Phe	Dap	NH2
Hmt	D-Arg	Phe	Lys	NH2
					Hmt	D-Arg	Phe	Orn	NH2
Hmt	D-Arg	Phe	Dab	NH2
					Hmt	D-Arg	Phe	Dap	NH2
Mmt	D-Lys	Phe	Lys	NH2
					Mmt	D-Lys	Phe	Orn	NH2
Mmt	D-Lys	Phe	Dab	NH2
					Mmt	D-Lys	Phe	Dap	NH2
Mmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
					Tmt	D-Lys	Phe	Lys	NH2
Tmt	D-Lys	Phe	Orn	NH2
					Tmt	D-Lys	Phe	Dab	NH2
Tmt	D-Lys	Phe	Dap	NH2
					Tmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
Hmt	D-Lys	Phe	Lys	NH2
					Hmt	D-Lys	Phe	Orn	NH2
Hmt	D-Lys	Phe	Dab	NH2
					Hmt	D-Lys	Phe	Dap	NH2
Hmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
					Mmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
Mmt	D-Orn	Phe	Arg	NH2
					Mmt	D-Dab	Phe	Arg	NH2
Mmt	D-Dap	Phe	Arg	NH2
					Mmt	D-Arg	Phe	Arg	NH2
Tmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
					Tmt	D-Orn	Phe	Arg	NH2
Tmt	D-Dab	Phe	Arg	NH2
					Tmt	D-Dap	Phe	Arg	NH2
Tmt	D-Arg	Phe	Arg	NH2
					Hmt	D-Lys	Phe	Arg	NH2
Hmt	D-Orn	Phe	Arg	NH2
					Hmt	D-Dab	Phe	Arg	NH2
Hmt	D-Dap	Phe	Arg	NH2
					Hmt	D-Arg	Phe	Arg	NH2

Cha＝环己基丙氨酸

Dab＝二氨丁基

Dap＝二氨基丙酸

Dmt＝二甲基酪氨酸

Mmt＝2’-甲基酪氨酸

Tmt＝N,2’,6’-三甲基酪氨酸

Hmt＝2’-羟基-6’-甲基酪氨酸

dnsDap＝β-丹磺酰-L-α,β-二氨基丙酸

atnDap＝β-邻氨基苯甲酰-L-α,β-二氨基丙酸

Bio＝生物素

不激活μ型阿片受体的肽的示例包括但不限于表6中所示的芳香族阳离子肽。

表6.缺少μ型阿片活性的肽类似物

氨基酸位置1	氨基酸位置2	氨基酸位置3	氨基酸位置4	C-末端改性
					D-Arg	Dmt	Lys	Phe	NH2
D-Arg	Dmt	Phe	Lys	NH2
					D-Arg	Phe	Lys	Dmt	NH2
D-Arg	Phe	Dmt	Lys	NH2
					D-Arg	Lys	Dmt	Phe	NH2
D-Arg	Lys	Phe	Dmt	NH2
					Phe	Lys	Dmt	D-Arg	NH2
Phe	Lys	D-Arg	Dmt	NH2
					Phe	D-Arg	Phe	Lys	NH2
Phe	D-Arg	Dmt	Lys	NH2
					Phe	D-Arg	Lys	Dmt	NH2
Phe	Dmt	D-Arg	Lys	NH2
					Phe	Dmt	Lys	D-Arg	NH2
Lys	Phe	D-Arg	Dmt	NH2
					Lys	Phe	Dmt	D-Arg	NH2
Lys	Dmt	D-Arg	Phe	NH2
					Lys	Dmt	Phe	D-Arg	NH2
Lys	D-Arg	Phe	Dmt	NH2
					Lys	D-Arg	Dmt	Phe	NH2
D-Arg	Dmt	D-Arg	Phe	NH2
					D-Arg	Dmt	D-Arg	Dmt	NH2
D-Arg	Dmt	D-Arg	Tyr	NH2
					D-Arg	Dmt	D-Arg	Trp	NH2
Trp	D-Arg	Phe	Lys	NH2
					Trp	D-Arg	Tyr	Lys	NH2
Trp	D-Arg	Trp	Lys	NH2
					Trp	D-Arg	Dmt	Lys	NH2
D-Arg	Trp	Lys	Phe	NH2
					D-Arg	Trp	Phe	Lys	NH2
D-Arg	Trp	Lys	Dmt	NH2
					D-Arg	Trp	Dmt	Lys	NH2
D-Arg	Lys	Trp	Phe	NH2
					D-Arg	Lys	Trp	Dmt	NH2
Cha	D-Arg	Phe	Lys	NH2
					Ala	D-Arg	Phe	Lys	NH2

表5和表6中显示的肽的氨基酸可以是左旋结构或右旋结构。

可通过本领域熟知的任何方法来合成肽。例如，用于以化学方式合成肽的合适方法包括诸如Stuart和Young在以下文献中描述的方法：Solid Phase PeptideSynthesis,第二版,Pierce Chemical Company(1984)；以及Methods Enzymol.289,Academic Press公司,纽约(1997)。

II.芳香族阳离子肽的用途

升高的ROS排放已经示出成为氧化应激和伴随的在MV-诱导和废用-诱导的骨骼肌无力中的肌肉衰弱(例如无力、萎缩、功能障碍)的致病物。肌肉细胞中的线粒体表现为主要ROS制造者，且如下文在实验性示例中所示，线粒体的ROS排放在MV-诱导和废用-诱导的氧化应激中起作用，该氧化应激导致骨骼肌(例如膈膜、比目鱼肌和跖肌)衰弱。尽管NADPH活化和黄嘌呤氧化酶活化也在ROS产生中起作用，但是NADPH活性最小(即5％)且黄嘌呤氧化酶活性的抑制并不能完全保护免受骨骼肌废用-诱导或MV-诱导的氧化应激以及伴随的萎缩和无力。此外，在膈膜和其他骨骼肌中，线粒体的ROS排放为对于MV-诱导的或废用-诱导的蛋白酶活化的上游信号，所述蛋白酶例如钙蛋白酶、半胱天冬酶-3和/或半胱天冬酶-12。

因此，本发明描述了包括线粒体靶向的抗氧化剂-芳香族阳离子肽的方法和组合物，该芳香族阳离子肽能够减少长期MV期间在膈膜中的线粒体ROS产生或通常在肢体固定或肌肉废用期间的其他骨骼肌(例如比目鱼肌和跖肌)中的线粒体ROS产生。

在一个方面，本发明提供一种线粒体靶向的抗氧化剂，即D-Arg-2’,6’Dmt-Lys-Phe-NH₂或“SS-31”或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐。例如，在一些实施方式中，SS-31用作患有线粒体产生的ROS导致的肌肉衰弱(例如无力、萎缩、功能障碍等)的对象或处于患线粒体产生的ROS导致的肌肉衰弱(例如无力、萎缩、功能障碍等)的危险中的对象的治疗剂和/或预防剂。在一些实施方式中，SS-31减少了肌肉中线粒体ROS的排放。另外地或可替选地，在一些实施方式中，SS-31选择性地集中在骨骼肌的线粒体中，且提供H₂O₂、OH^-和ONOO^-的自由基清除，并且在一些实施方式中，自由基清除在剂量相关的基础上进行。

在一些实施方式中，描述了治疗肌肉衰弱(例如无力、萎缩、功能障碍等)的方法。在这类治疗应用中，将包括芳香族阳离子肽(如SS-31)或其药学上可接受的盐(如醋酸盐或三氟醋酸盐)的组合物或药剂以一定量给药至疑似患有或已经患有肌肉衰弱的对象，该量足以预防、减轻、缓解或至少部分地抑制肌肉衰弱的症状，包括肌肉衰弱的并发症和肌肉衰弱发展中的中间病理表现型。就这点而论，本发明提供了治疗患有或疑似患有本文中描述的肌肉衰弱的个体的方法。在一个实施方式中，将芳香族阳离子肽SS-31或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐给药。

在另一方面，本发明提供了通过将预防或降低肌肉衰弱的发生或发展的可能性的芳香族阳离子肽给药至对象，来预防或降低本文所描述的肌肉衰弱的可能性的方法。处于形成肌肉衰弱风险中的对象可以易于确认，例如，准备或将要经历MV或相关的膈肌废用或可被医生料想的任何其他的骨骼肌废用(例如固定肢体)的对象。在一个实施方式中，该芳香族阳离子肽包括SS-31或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐。

在这样预防性的应用中，将包括一种或多种芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(如醋酸盐或三氟醋酸盐)的药用组合物或药剂以一定的量给药至易于肌肉衰弱或正处于肌肉衰弱的对象，该量足以消除或降低肌肉衰弱的风险、降低肌肉衰弱的严重程度或延迟肌肉衰弱发病，包括肌肉衰弱的生物化学的、组织学的和/或行为学的病症、肌肉衰弱的并发症和肌肉衰弱的发展期间存在的中间病理表型。将本文所公开的一种或多种芳香族阳离子肽给药可在异常特征的症状表现之前发生，从而预防或可选地延迟该疾病的发展。合适的化合物可基于上文描述的筛选分析或现有技术中已知的筛选试验进行确定。在一个实施方式中，药学组合物包括SS-31或其药学上可接受的盐，例如醋酸盐或三氟醋酸盐。

在各种实施方式中，进行合适的体外或体内分析来确定基于特定的芳香族阳离子肽的治疗的效果和是否需要给药该芳香族阳离子肽以用于治疗。在各种实施方式中，可采用代表性动物模型进行分析，以确定给定的基于芳香族阳离子肽的治疗是否在预防或治疗肌肉无力(例如萎缩、功能障碍等)中起到了所期望的效果。在人类对象中测试之前，治疗中所用的化合物可以在合适的动物模型系统中进行测试，所述动物模型系统包括但不局限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴子、兔子等。类似地，对于体内测试而言，在给药至人类对象之前，可以使用本领域所知的任何动物模型系统。

在一些实施方式中，需要保护免受肌肉衰弱或治疗肌肉衰弱的对象也包括经受与氧化损伤相关的疾病、病症或治疗的对象。通常，氧化损伤由自由基所导致，例如活性氧簇(ROS)和/或活性氮簇(RNS)。ROS和RON的示例包括羟自由基(HO·)、超氧阴离子自由基(O₂·^-)、一氧化氮(NO·)、过氧化氢(H₂O₂)、次氯酸(HOCl)和过氧亚硝基阴离子(ONOO^-)。

呼吸性肌肉衰弱可由长期MV(例如大于12小时)引起。在一些实施方式中，呼吸性肌肉衰弱是由于收缩性功能障碍和/或萎缩造成的。然而，这种长期MV并不限于任何特定的时长。例如，在一些实施方式中，长期MV包括从至少大约0.5小时、大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约15小时、大约20小时、大约30小时、大约50小时或大约100小时至从至少大约1小时、大约10小时、大约20小时、大约50小时、大约75小时、大约100小时或更多小时、天或年的时间。在另外的实施方式中，长期MV包括从至少大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时或大约10小时至从至少大约10小时、大约20小时或大约50小时的时间。在一些实施方式中，长期MV从大约至少10-12小时至大于10-12小时段的任何时间。在一些实施方式中，本文中描述的该芳香族阳离子肽的给药在MV或肌肉固定期间的任何时间进行。在一些实施方式中，在MV之前、在紧随MV发生后、在MV期间、和/或在紧随MV后将一种或多种剂量的阳离子肽组合物给药。

肌肉废用性萎缩也是试图在肌肉固定之后重建肌肉功能的对象的恢复的障碍。关于这点，芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(如醋酸盐或三氟醋酸盐)如本文所述，提供了治疗患有骨骼肌相关的衰弱或处于患有骨骼肌相关的衰弱的风险中的对象的预防和治疗方法。这类肌肉衰弱来自于或包括但不限于肌肉废用或MV，其中肌肉废用或MV导致细胞凋亡、氧化应激、氧化损伤、收缩性功能障碍、肌肉萎缩、肌肉蛋白质降解、蛋白酶活化、线粒体产生的ROS排放、线粒体H₂O₂释放、线粒体解偶联、受损害的线粒体解偶联、受损害的态-3线粒体呼吸、受损害的态-4线粒体呼吸、下降的呼吸控制率(RCR)、减少的脂质过氧化作用、或它们的任何组合。

本文所公开的用于治疗或预防与肌肉固定相关的肌肉衰弱(例如由于固定或其他废用)的包含阳离子肽的组合物，可以在固定或废用之前、固定或废用期间或固定或废用之后的任何时间进行给药。例如，在一些实施方式中，在肌肉固定或肌肉废用之前、紧随肌肉固定或肌肉废用之后、在肌肉固定或肌肉废用的过程期间、和/或在肌肉固定或肌肉废用之后(如在固定去除后)将一种或多种剂量的阳离子肽给药。在一些实施方式中，通过示例的方式，而不是通过限制的方式，将阳离子肽(例如SS-31或其药学上可接受的盐，如醋酸盐或三氟醋酸盐)一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天六次或更多次进行给药，用于持续的固定或废用。在其他实施方式中，将阳离子肽(例如SS-31或其药学上可接受的盐，如醋酸盐或三氟醋酸盐)每天、每隔一天、每星期两次、每星期三次、或每星期四次、或每月一次、每月两次、每月三次、每月四次、每月五次、或每月六次进行给药，用于持续的固定或废用。

在一些实施方式中，还公开了与肌肉质量损失和肌肉强度损失相关的、由肌肉废用或废用萎缩导致的肌肉衰弱的治疗或预防方法。萎缩指与组织(例如肌肉纤维组织)再吸收和降解相关的生理过程，包括细胞水平的细胞凋亡。当由于营养支持缺失或其他疾病的萎缩发生时，这称为病理性萎缩。这类萎缩或病理性萎缩可由以下引起或与以下相关：四肢固定、长期肢体固定、肢体石膏固定、MV、长期MV、扩展的卧床恶病质、充血性心力衰竭、肝病、骨骼肌衰老、消瘦、营养不良、血液循环不良、激素不规律、神经功能缺失等。因此，本发明的方法提供了通过将有效量的芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至需要该芳香族阳离子肽的对象来预防和/或治疗对象中的肌肉衰弱，包括骨骼肌萎缩。

可以通过给药本文所公开的组合物和配方来治疗、预防或减轻的肌肉衰弱的附加示例包括但不限于年龄相关的肌肉衰弱、与长期卧床相关的肌肉衰弱、与失重状态(如在太空飞行中)相关的肌肉衰弱(例如无力和萎缩)、与某种药物(例如他汀类、抗病毒药物和噻唑霉素(TZD))的作用相关的肌肉衰弱、和例如恶病质的肌肉衰弱，例如由于癌症或其他疾病导致的恶病质。

III.给药模式和剂量

可以使用本领域的技术人员所知的任何方法来将细胞、器官或组织与肽接触。合适的方法包括体外、先体外后体内、或体内方法。体内方法通常包括将例如上文所述的芳香族阳离子肽给药至哺乳动物，合适地人。当使用体内方法治疗时，将有效量(即具有期望的治疗效果的量)的芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐给药至对象。剂量和给药疗程将取决于对象中肌肉衰弱的程度、所使用的特定的芳香族阳离子肽的特征例如其治疗指数、对象和对象历史。

可以在临床前试验和临床试验期间利用内科医生和临床医生熟悉的方法来测定有效量。在该方法中有用的肽的有效量可以通过用于给药药物组合物的多种已知方法中的任一方法来给药至需要该肽的哺乳动物。该肽可全身给药或局部给药。

该肽可被表达为药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”意味着由碱或酸制得的、对给药至患者(例如哺乳动物)而言可接受的盐(例如，对于给定的给药方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应该理解，盐没有必须为药学上可接受的盐，例如不用于给药病患的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可以从药学上可接受的无机碱或有机碱、以及从药学上可接受的无机酸或有机酸得到。此外，当肽含有碱性部分，例如胺、嘧啶或咪唑，和酸性部分例如羧酸或四唑时，可形成两性离子且该两性离子包括在本文使用的术语“盐”的范围之内。从药学上可接受的无机碱衍生得出的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、正铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。从药学上可接受的有机碱衍生得出的盐包括伯胺盐、仲胺盐和叔胺盐，该盐包括取代胺、环胺、天然存在的胺等，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶(piperadine)、聚胺树酯、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺等。从药学上可接受的无机酸衍生得出的盐包括硼酸盐、碳酸盐、氢卤酸盐(氢溴酸盐、盐酸盐、氢氟酸盐或氢碘酸盐)、硝酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐和硫酸盐。从药学上可接受的有机酸衍生得出的盐包括脂肪族羟基酸盐(例如柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐和酒石酸盐)、脂肪族单羧酸盐(例如醋酸盐、丁酸盐、甲酸盐、丙酸盐和三氟醋酸盐)、氨基酸盐(例如天冬氨酸盐和谷氨酸盐)、芳香族羧酸盐(例如苯甲酸盐、对-氯苯甲酸盐、二苯基乙酸盐、龙胆酸盐、马尿酸盐和三苯基乙酸盐)、芳香族羟酸(例如邻-羟基苯甲酸盐、对-羟基苯甲酸盐、1-羟基萘-2-羧酸盐和3-羟基萘-2-羧酸盐)、抗坏血酸盐、二羧酸盐(例如富马酸盐、马来酸盐、草酸盐和琥珀酸盐)、葡糖糖醛酸盐、苦杏仁酸盐、粘酸盐、烟酸盐、乳清酸盐、帕莫酸盐、泛酸盐、磺酸盐(苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、乙二磺酸盐(edisylic)、乙磺酸盐、羟乙基磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、萘-1,5-二磺酸盐、萘-2,6-二磺酸盐和对-甲苯磺酸盐)、辛那酸(xinafoicacid)盐等。在一些实施方式中，药学上可接受盐包括醋酸盐或三氟醋酸盐。

本文描述的芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐，可以单独地或组合地加入到药物组合物以给药至对象来治疗或预防本文中描述的疾病。所述组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载体。本文中使用的术语“药学上可接受的载体”包括与给药药物可配伍的生理盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。辅助性的活性化合物也可以加入到所述组合物中。

通常将药物组合物配制成与其计划给药途径相符。给药途径的示例包括注射(例如，静脉注射、皮内、腹腔或皮下)、口服、吸入、经皮肤(局部)、眼内、离子电渗疗法的和经粘膜给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：诸如注射用水的消毒稀释液、生理盐水、不挥发油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，比如苯甲醇或苯甲酸甲脂防腐剂；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢纳；络合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲液，比如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐；以及用于调节渗透压的溶剂，比如氯化钠或左旋糖。可以用酸或碱来调节pH，比如盐酸或氢氧化钠。静脉制剂可以装在玻璃或塑料制的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。为了患者或治疗医师的方便，可以以包括治疗过程(例如，治疗7天)所需的所有用具(例如，药瓶、稀释液瓶、注射器和针头)的试剂盒的形式提供剂量制剂。

适于注射用途的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或者用于临时制备无菌注射液或分散液的分散剂或无菌粉末。为了静脉注射，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,帕西波尼,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外给药的组合物必须无菌且应当是达到易于注射的程度的存在的液体。用于肠胃外给药的组合物在制造和存储条件下必须稳定且应当被保存同时防止诸如细菌和真菌的微生物的污染行为。

所述芳香族阳离子肽组合物可以包括载体，该载体可以是包括诸如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇以及液态聚乙二醇等)及其合适的组合物的溶剂或分散介质。可以通过例如以下的方式来保持适当的流体性：利用比如卵磷脂的涂层；在分散质的情况下，通过保持所需的颗粒尺寸；和通过利用表面活性剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现防止微生物的行为，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。可以包括谷胱甘肽和其他的抗氧化剂以防止氧化。在很多情况下，将优选的是，在该组合物中包括等渗剂，比如糖、多元醇(比如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在该组合物中包括延迟吸收的制剂来引起可注射组合物的延长吸收，所述延迟吸收的制剂例如为单硬脂酸铝或药用胶。

可以通过将所需量的活性化合物加入具有以上列出的一种成分或多种成分的组合的适当的溶剂中、根据需要然后进行过滤灭菌来制备注射用无菌溶液。通常，通过将活性化合物加入在包括基本分散介质以及以上列出的所需的其它成分的无菌载体中来制备分散质。在用来制备注射用无菌溶液的无菌粉末的情况中，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这可以产出活性成分以及来自于先前灭菌过滤的溶液中的任何其他所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。为了口服治疗给药，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)的形式使用。还可利用用作洗口剂的液态载体来制备口服组合物。药学上相容的粘合剂和/或辅助材料可以被包括为该组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂或锭剂等可以包括具有相似性质的以下成分或化合物中的任一种：粘合剂，比如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；分裂剂，比如褐藻酸、羧甲淀粉钠、或玉米淀粉；润滑剂，比如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，比如胶态二氧化硅；甜味剂，比如蔗糖或糖精；或者增味剂，比如薄荷、水杨酸甲酯或桔子调味品。

关于通过吸入法给药，所述化合物可以以喷雾剂的形式从包括合适的推进物(例如，比如二氧化碳的气体)的加压容器或分配器或者喷雾器喷洒而递送。

本文中描述的治疗化合物的全身给药还可以通过经粘膜方法或经皮肤方法来进行。对于经粘膜给药或经皮肤给药，适合于待渗透的屏障的渗透剂用在该配方中。这样的渗透剂通常是本技术领域已知的，例如，对于经粘膜给药而言，这样的渗透剂包括洗涤剂、胆汁盐类或梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷入法来完成经粘膜给药。对于经皮肤给药而言，活性化合物配制成本领域普遍知道的药膏、软膏、凝胶、乳液。在一个实施方式中，经皮肤给药可以通过电离子渗透法来进行。

治疗性蛋白质或肽或其药学上可接受的盐如醋酸盐或三氟醋酸盐可以在载体体系中配制而成。该载体可以是胶态体系。该胶态体系可以是脂质体、磷脂双分子层媒介物。在一个实施方式中，在脂质体中该治疗肽被胶囊化，同时保持肽完整性。本领域的本领域技术人员理解，有各种方法来制备脂质体。(参见：Lichtenberg等的Methods Biochem.Anal.,33:337-462(1988)；Anselem等的Liposome Technology,CRC Press(1993))。脂质体制剂可以延迟排出并增强细胞摄取(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。活性剂还可以载入到由医学上可接受的成分制备成的颗粒中，所述医学上可接受的成分包括但不限于可溶解的、不可溶解的、可渗透的、不可渗透的、可生物降解的或胃内滞留的聚合物或脂质体。这样的颗粒包括但不限于纳米颗粒、可生物降解的纳米颗粒、微颗粒、可生物降解的微颗粒、纳米球、可生物降解的纳米球、微球、可生物降解的微球、胶囊剂、乳剂、脂质体、胶粒以及病毒载体体系。

该载体还可以是聚合物，比如可生物降解的、可生物相容的聚合物基质。在一个实施方式中，治疗性肽可以嵌入到聚合物基质中，同时保持蛋白质完整性。所述聚合物可以是天然的，比如多肽、蛋白质或多糖；或者可以是合成的，比如聚α-羟酸。示例包括由例如以下物质制成的载体：胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、乙酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合。在一个实施方式中，所述聚合物是聚乳酸(PLA)或乳酸羟基乙酸共聚物(PGLA)。可以以各种形式和尺寸来制备并分离聚合物基体，包括微球和纳米球。聚合物制剂可以引起治疗作用的期间的延长(参见：Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。用于人类生长激素(hGH)的聚合物制剂已用在临床试验中(参见：Kozarich和Rich,Chemical Biology,2:548-552(1998))。

高分子微球持续释放剂的示例在PCT公布WO 99/15154(Tracy等)、第5674534号美国专利以及第5716644号美国专利(都属于Zale等)、PCT公布WO 96/40073(Zale等)和PCT公布WO 00/38651(Shah等)中予以描述。第5674534号美国专利以及第5716644号美国专利以及PCT公布WO 96/40073描述了包括含红细胞生成素的颗粒的聚合物基体，所述红细胞生成素的颗粒用盐来防止凝聚而稳定。

在一些实施方式中，治疗性化合物与将保护所述治疗化合物以防止其从身体中快速排出的载体一起制备，所述载体比如控释剂，包括植入体和微胶囊化的输送体系。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，比如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原质、聚原酸酯和聚乳酸。可以利用已知的技术来制备这样的制剂。还可以在市场上获得所述材料，例如从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.买到的脂质体悬浮液(包括针对具有细胞特异性抗原的单细胞克隆抗体的特定细胞的脂质体)也可用作医学上可以接受的载体。所述胶质体悬浮液可以利用本领域技术人员知道的方法来制备，比如，第4522811号美国专利中描述的方法。

还可以配制所述治疗性化合物以增强细胞内传递。例如，本领域已知脂质体传递系统例如，参见：Chonn和Cullis的“Recent Advances in Liposome DrugDelivery Systems”，Current Opinion in Biotechnology 6:698-708(1995)；Weiner的“Liposomes for Protein Delivery:Selecting Manufacture and DevelopmentProcesses”，Immunomethods 4(3)201-9(1994)；和Gregoriadis的“EngineeringLiposomes for Drug Delivery:Progress and Problems”Trends Biotechnol.13(12):527-37(1995)。以下文献描述了利用融合脂质体在体内或在体外将蛋白质传递至细胞：Mizguchi等的Cancer Lett.100:63-69(1996)。

可以通过细胞培养或试验动物中的标准药学过程来确定治疗性药物的用量、毒性和治疗效率，例如，用于确定LD50(总数50％的致命剂量)和ED50(总数50％中有效治疗的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，且其可以表示为比率LD50/ED 50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管具有毒性副作用的化合物可以使用，但应当考虑设计传递系统，该传递系统将这样的化合物靶向组织的受影响的位置，以将对未感染的细胞的可能损伤最小化，且由此降低副作用。

从细胞培养试验和动物研究获取的数据可以用在配制人类中使用的剂量范围中。这样的化合物的剂量优选地位于包括毒性很小或无毒的ED50的循环浓度的范围中。根据使用的剂量类型和利用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。对于该方法中使用的任何化合物而言，可以最初根据细胞培养试验来计算出治疗有效的剂量。可以在动物模型中制定一剂量来获得包括细菌培养中确定的IC50(即，测试化合物的获得最大抑制病症的一半的浓度)的循环血药浓度范围。这样的制剂可以用来更准确地确定人类中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法测定血药浓度。

通常，芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐例如醋酸盐或三氟醋酸盐，例如SS-31或其药学可接受的盐如醋酸盐或三氟醋酸盐，足以获得治疗效果或预防效果的有效量的范围为约0.000001毫克/千克体重/天到约10000毫克/千克体重/天。合适地，剂量范围从约0.0001毫克/千克体重/天到约100毫克/千克体重/天。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天1毫克/千克体重或者10毫克/千克体重，或者在每周、每两周或每三周的1毫克/千克体重到10毫克/千克体重的范围中。在一个实施方式中，肽的单剂量的范围从0.001毫克/千克体重到10000毫克/千克体重。在一个实施方式中，芳香族阳离子肽在载体中的浓度的范围从0.2毫克/每毫升到2000毫克/每毫升。示例性的治疗方法每天或每周提供一次给药。在治疗应用中，在相对短的时间间隔中有相对高的剂量有时是需要的，直到疾病的进程减缓或终止为止，且优选地直到对象显示出部分或完全地改善了疾病的病症。其后，可以对患者实行预防性的给药方式。

作为示例，而不是作为限制，在一个用于预防或减轻MV-诱导的膈膜衰弱的实施方式中，将阳离子肽(例如SS-31或其药学上可接受的盐如醋酸盐或三氟醋酸盐)的初始剂量以约1-20毫克/千克、约1-15毫克/千克、约1-10毫克/千克、约1-5毫克/千克、约2-15毫克/千克、约2-10毫克/千克、约2-5毫克/千克、约2-3毫克/千克、或约3毫克/千克进行给药。初始剂量在MV开始之前、或MV开始之后不久进行给药。另外地或可替选地，在初始剂量之后，以约0.01毫克/千克/小时、约0.02毫克/千克/小时、约0.03毫克/千克/小时、约0.04毫克/千克/小时、约0.05毫克/千克/小时、约0.06毫克/千克/小时、约0.07毫克/千克/小时、约0.08毫克/千克/小时、约0.09毫克/千克/小时、约0.1毫克/千克/小时、约0.2毫克/千克/小时、约0.3毫克/千克/小时、约0.5毫克/千克/小时、约0.75毫克/千克/小时或约1.0毫克/千克/小时进行给药。

在一些实施方式中，芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(如醋酸盐或三氟醋酸盐)的治疗有效的量可以限定为目标组织中的肽的浓度为10^-12摩尔到10^-6摩尔，例如约10^-7摩尔。可以以0.01毫克/千克到100毫克/千克的全身剂量或身体表面面积的等效剂量来给予前述浓度。优化剂量的时间表，以保持目标组织的治疗浓度，最优选地通过每天或每周给药，但也包括连续给药(例如，输液或经皮肤施药)来进行。

本领域技术人员将认识到，某些因素可以影响有效地治疗一对象的剂量和时间，包括但不限于疾病或失调的严重程度、先前的治疗、健康情况和/或对象的年龄以及存在的其它疾病。而且，利用本文描述的治疗有效量的治疗组合物来治疗一对象可以包括单次治疗或一系列治疗。

根据本发明的方法治疗的哺乳动物可以是任何动物，例如，包括：农场动物，如羊、猪、牛和马；宠物动物，如狗和猫；实验室里的动物，如大鼠、小鼠和兔。在优选的实施方式中，所述哺乳动物是人。

在一个实施方式中，附加的治疗剂联合芳香族阳离子肽或其药学上可接受的盐(如醋酸盐或三氟醋酸盐)给药至对象，以便产生协同的治疗效应。“协同的治疗效应”指通过结合两种治疗剂产生的大于加和的治疗效应，并且超过了治疗剂中任一种单独给药导致的治疗效应。因此，治疗剂中的一种或两种的较低的剂量可用于治疗肌肉衰弱，这导致增加的治疗效果和降低的副作用。

多种治疗剂可以以任何次序、同时、依次或重叠给药。如果同时给药，多种治疗剂可以以单一统一形式或多个形式(仅作为示例，作为单个药丸或作为两个独立的药丸)被提供。所述治疗剂中的一种治疗剂可以以多剂量提供或所述治疗剂都可以作为多剂量提供。如果不是同时给药，多剂量之间的时间安排可从超过零周至小于四周之间变化。此外，组合方法、组合物和配方不限于仅仅两种试剂的使用。

实施例

本发明通过下面实施例进一步阐明，但不作为以任何方式限制。

I.实施例1

A.试验设计

本实验的目的为证明线粒体ROS排放在MV-诱导的膈膜无力中的作用，以及证明线粒体靶向的抗氧化剂肽(SS-31)对线粒体功能和大鼠膈肌的影响。对两个不同组的大鼠(1和2)进行如下处理。

1.清醒且自主呼吸的大鼠

为了确定线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对清醒且自主呼吸的大鼠的膈膜收缩功能、纤维横断面面积(CSA)和线粒体功能的影响，对动物进行如下处理。将动物(n＝6/组)随机分配到两个试验组中的一个组中：(1)对照组-每间隔3小时注射(腹腔内，i.p.)生理盐水，持续12小时；和(2)线粒体抗氧化剂组-每3小时注射(腹腔内，i.p.)SS-31，持续12小时。在完成12小时的处理时段时，测量膈膜收缩功能、纤维CSA、线粒体ROS排放和线粒体呼吸功能。

将线粒体靶向的抗氧化剂SS-31溶解在生理盐水中且在12小时的试验时间段期间借助四次皮下注射给药。在试验开始时将第一单次(负荷)剂量(3毫克/千克；皮下注射)给药。然后，在12小时的试验期间，每3小时地通过皮下注射来分阶段地给药SS-31(0.05毫克/千克/小时)。对于所有需要SS-31给药的试验，所有的动物在12小时期间接收相同总量的SS-31。

2.麻醉动物

为了分析MV-诱导的膈膜氧化应激和膈膜无力之后的线粒体ROS排放，将大鼠随机分配到三个试验组中的一组(n＝12/组)：(1)急性麻醉的对照组；(2)12-小时MV组(MV)；和(3)用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31(MVSS)处理的12-小时MV组。由于大量的独立测量需要大型组织，因此，每个试验组的6只动物用于线粒体测定，每组中剩余的6只动物用在所有的其它的生化分析中。

通过腹腔(IP)注射戊巴比妥钠(60毫克/千克体重)来急性麻醉对照组的动物。在达到麻醉的外科平面之后，快速去除膈膜。在一组动物(n＝6)中，立即将一条近中的肋膈膜用于体外收缩测量，保存一分离部分用于组织学测定，且将肋膈膜剩余的部分快速在液氮中冷冻且在-80℃保存以用于后续的生化分析。在第二组动物(n＝6)中，全部肋膈膜被快速去除且用来针对测量线粒体呼吸和ROS排放而分离线粒体。将线粒体靶向的抗氧化剂SS-31溶解在生理盐水中，且在MV开始前的15分钟时，以单次(负荷)剂量(3毫克/千克；皮下注射)进行给药。在整个MV期间保持恒定的静脉输注(0.05毫克/千克/小时)SS-31。

B.材料和方法

线粒体靶向的抗氧化剂-化学细节和试验输送。选择命名为“SS-31”的线粒体靶向的抗氧化剂用在当前的试验中。该分子属于小的水溶性肽的家族，该肽含有交替的芳香族阳离子特征序列且选择性靶向线粒体。例如，参见：Zhao等，Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membraneinhibit mitochondrial swelling,oxidative cell death,and reperfusion injury.TheJournal of biological chemistry.Vol.,279(33)：34682-34690(2004)。

机械通气。使用无菌技术进行所有的外科步骤。采用IP注射戊巴比妥钠(60毫克/千克体重)对在MV组中的动物进行麻醉，切开气管，利用压力控制式人工呼吸机(Servo Ventilator 300,Siemens)在下列设定下进行机械通气12小时：上呼吸道压力极限：20厘米H₂O，通常呼气末正压(PEEP)上的压力产生为6-9厘米H₂O；呼吸速率：80bpm；和PEEP：1厘米H₂O。

将导管插入颈动脉中以允许在试验方案期间连续测量血压和收集血液。周期性地去除动脉血样(100微升/样本)且使用电子血-气分析仪(GEM Premier3000；Instrumentation Laboratory，列克星敦(Lexington),MA)分析动脉pO₂、pCO₂和pH。如果动脉pCO₂超过40mmHg时，进行人工呼吸机调节。在整个试验中，通过增加FIO₂(22-26％氧)来维持动脉pO₂>60mmHg。

将静脉导管插入颈静脉中以连续输注戊巴比妥钠(～10毫克/千克/小时)和流体置换。通过使用再循环式加热毯将体温保持在37℃，且通过导联II心电图仪监控心率。在MV方案期间的连续监护包括使眼睛润滑、挤压膀胱、去除呼吸道粘液、翻转动物和被动地移动肢体。在MV期间，动物还每2小时地接收肌肉注射胃长宁(glycopyrrolate，0.18毫克/千克)以减少呼吸道分泌。在完成MV时，在6只动物的一个组中，快速地去除膈膜且一条近中的肋膈膜用于体外收缩测量，保存一段用于组织学测定，且将剩余的部分在液氮中冷冻且在-80℃保存用于后续的生化分析。此外，另外的动物组(n＝6)中，将全部肋膈膜快速去除且用于针对线粒体呼吸和ROS排放的测定分离线粒体。

生化测量。线粒体的分离。采用Makinen和Lee的方法(Makinen和Lee,Biochemical studies of skeletal muscle mitochondria.I.Microanalysis of cytochromecontent,oxidative and phosphorylative activities of mammalian skeletal musclemitochondria.Archives of biochemistry and biophysics.,Vol.,126(l):75-82(1968))，以较小的改动，使用大约500毫克的肋膈膜肌肉来分离出膈膜线粒体。参见：Kavazis等，Mechanical ventilation induces diaphragmatic mitochondrial dysfunctionand increased oxidant production.Free radical biology & medicine.,Vol.,46(6):842-850(2009)。

线粒体呼吸.使用先前描述的技术(例如，见Kavazis等，Mechanicalventilation induces diaphragmatic mitochondrial dysfunction and increased oxidantproduction.Free radical biology & medicine.,Vol.,46(6):842-850(2009))测量线粒体的氧消耗。如以下中描述的，测量最大呼吸(态3)和态4呼吸(基础呼吸)：Eastbrook等，Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurementof ADP/O ratios.Methods Enzymology.Vol.,10:41-47(1967))。通过态3呼吸除以态4呼吸，来计算呼吸控制率(RCR)。

线粒体ROS排放。使用AmplexTM Red(分子探针,Eugene,OR)确定膈膜线粒体ROS排放。该试验的细节已经在先前进行描述。例如，参见：Kavazis等(2009),Mitochondrial ROS production was measured using the creatine kinaseenergy clamp technique to maintain respiration at steady state。该步骤的方法细节先前已经由Messer和合作者进行描述。参见：Messer等，Pyruvate and citric acidcycle carbon requirements in isolated skeletal muscle mitochondria.Americanjournal of physiology.Vol.,286(3):C565-572(2004)。最后，将H₂O₂的排放速率进行标准化为线粒体蛋白含量。

蛋白质印迹分析。使用先前描述的方法通过蛋白质印迹分析确定膈膜样本中的蛋白质丰度。参见：McClung等,Caspase-3regulation of diaphragm myonucleardomain during mechanical ventilation-induced atrophy.Am JRespir Crit Care MedVol.,175(2):150-159(2007)。在电泳后，蛋白质转移到硝化纤维素膜中，与针对感兴趣的蛋白的一级抗体一起培养。用探针检测4-羟基壬烯醛(4-HNE)(Abeam)作为指示氧化应激的测量，同时通过分析murf1(ECM Biosciences)、atroginl(ECM Biosciences)、分裂的(活跃的)钙蛋白酶-1(细胞信号传导)和分裂的(活跃的)半胱天冬酶-3(细胞信号传导)来评估蛋白水解活性。此外，测量α-II血影蛋白(Santa Cruz)钙蛋白酶特异性分裂(145kDa分裂产物)和半胱天冬酶-3特异性分裂(120kDa分裂产物)以得到在MV期间的钙蛋白酶-1和半胱天冬酶-3的活性的附加测量。测量肌动蛋白(Santa Cruz)的蛋白质丰度作为在膈膜中的全部蛋白水解的指标。应注意，所有的膜用丽春红(Ponceau S)进行染色且被分析以证实同等的蛋白负荷和蛋白转移。

借助反应性羰基衍生物的蛋白质氧化评估.评估肌原纤维蛋白质样品中的反应性羰基衍生物的水平作为蛋白质修饰量级的指标。使用先前描述的来自Chemicon International(Temecula,Ca)的Oxyblot氧化蛋白检测试剂盒实现该评估。参见Kavazis等(2009)。

RNA分离和cDNA合成。根据制造商的指导，利用TRIzol试剂(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)从肌肉组织中分离全部RNA。通过分光光度计测量RNA含量(微克/毫克肌肉)。然后，使用oligo(dT)20引物和制造商列出的方案，通过用于RT-PCR(生命技术)的Superscript III第一链合成系统对RNA(5微克)进行反转录。

实时聚合酶链式反应。使用Taqman化学和ABI Prism 7000序列检测系统(ABI,Foster City,CA)，将1微升cDNA加入到25微升的用于实时PCR的PCR反应物中。使用相对的计算机断层摄影术方法(ABI，User Bulletin#2)进行基因表达相对量化。基于先前利用试验操作示出未改变的表达的工作，选择β-葡糖苷酸酶，即溶酶体糖苷水解酶作为参照基因。例如参见：Deruisseau等，Diaphragm Unloading via Controlled Mechanical Ventilation Alters the GeneExpression Profile.Am J Respir Crit Care Med.Vol.,172(10):1267-1275(2005)。通过预设计的大鼠引物和从应用生物系统(Applied Biosystems，Assays-on-Demand)购买到的探针序列分析MAFbx(GenBank NM AY059628)mRNA和MuRF-1(GenBank NM AY059627,NM BC061824)mRNA的转录。

20S蛋白酶体活性。将一段腹部肋膈膜进行均质，使用Stein和合作者描述的技术应用荧光法测量20S蛋白酶体的体外胰凝乳蛋白酶样活性。参见：Stein等,Kinetic characterization of the chymotryptic activity of the 20S proteasome.Biochemistry 35(13):3899-3908(1996)。

功能测量。体外膈膜收缩性性能的测量。在完成试验时间段时，将全部膈膜去除且放置在含有用95％O₂-5％CO₂气体平衡的Krebs-Hensleit溶液的解剖室中。将包括中心腱和胸腔处的腱附着体的肌肉条(～3毫米宽)从肋中区切割下来。将肌肉条竖直悬吊在两个轻质有机玻璃(Plexiglas)夹之间，一端与夹套式组织浴内的等容积测力传感器(模式FT-03，Grass Instruments,Quincy,MA)连接。将肌肉电刺激以收缩，且通过先前所述的计算机数据采集系统记录力输出。参见：Powers等，Mechanical ventilation results in progressive contractiledysfunction in the diaphragm.J Appl Physiol,Vol.92(5):1851-1858(2002)。为了对比的目的，将膈膜的(成束纤维)力产生标准化为纤维横断面面积(即特定力产生)。

组织学测量。肌纤维横断面面积。使用低温切片机(Shandon Inc.，Pittsburgh，PA)将冷冻的膈膜样品部分切割成10微米厚，对营养不良蛋白、肌球蛋白重链(MHC)蛋白和MHC型IIa蛋白进行染色用于如上所述的纤维横断面分析(CSA)。参见：McClung等，Antioxidant administration attenuates mechanicalventilation-induced rat diaphragm muscle atrophy independent of protein kinase B(PKB Akt)signaling.J Physiol,Vol.585:203-215(2007)。应用Scion软件(NIH)确定CSA。

统计分析。对于每一独立的变量，通过单向方差分析(ANOVA)进行两个组之间的比较，并且当适合时，进行事后Tukey HSD(诚实显著性差异，honestlysignificant difference)测验。p<0.05，确立显著性。数据表示为均值±SEM。

线粒体蛋白羰基组的测量。对于线粒体蛋白提取，在线粒体分离缓冲液(ImM EGTA,10mM HEPES,250mM蔗糖,10mM Tris-HCl,pH 7.4)中对心室的组织进行均质，将裂解液在4℃下800g离心7分钟。然后将上清液在4℃下4000g离心30分钟。将粗线粒体颗粒再次悬浮在少量的线粒体分离缓冲液中，在冰上超声处理以破坏细胞膜，用1％的硫酸链霉素处理以沉降线粒体核酸。每次测试，使用OxiSelect^TM蛋白羰基酶联免疫吸附测量(ELISA)试剂盒(CellBiolabs)分析1微克蛋白样品。根据指导手册进行ELISA，可有较小的改动。简单来讲，使蛋白样品与二硝基苯肼(DNPH)反应，利用抗-DNPH抗体进行探针测定，然后利用HRP结合的第二抗体进行探针测定。抗-DNPH抗体和HRP结合的第二抗体的浓度分别为1:2500和1:4000。

定量PCR。利用具有Taqman基因表达需求分析(Taqman Gene ExpressionAssays on Demand)的应用生物系统(Applied Biosystems)7900热循环仪，通过定量实时PCR量化基因表达，其包括PGCl-α(Mm00731216)、TFAM(Mm00447485)、NRF-1(Mm00447996)、NRF-2(Mm00487471)、Collagen la2(Mm00483937)和ANP(Mm01255747)。将表达分析标准化为18S RNA。

NADPH氧化酶活性。如下进行NADPH氧化酶活性分析。简单来讲，将10微克的心室蛋白提取物与二氢乙锭(DHE,10μΜ)、精子DNA(1.25μg/ml)和NADPH(50μΜ)在PBS/DTPA(含有100μΜDTPA)中培养。该试验在37℃下暗处培养30分钟，并且采用490/580nm的激发/发射检测荧光。

C.结果

1.SS-31没有影响膈膜纤维SCA或在自主呼吸的动物中不起作用

为了确定线粒体抗氧化剂SS-31对清醒且自主呼吸的大鼠中的膈膜收缩功能、纤维横断面面积(CSA)和线粒体功能的影响，对动物进行12小时的SS-31处理，该SS-31的浓度与在12小时的MV时间段期间提供给机械通气的动物的浓度相同。下表7A-7C中示出的结果证实，与未处理的对照动物相比，使用SS-31的动物处理没有影响膈膜的线粒体的ROS排放和线粒体呼吸比率。此外，结果证实，与对照相比，使用SS-31的动物处理没有改变膈膜收缩功能和纤维CSA。

表7A示出来自对照(用生理盐水注射处理)动物和用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31处理的清醒且自主呼吸的动物的膈肌纤维的纤维横断面面积(CSA)。在任何类型的纤维中，在对照组和SS-31组之间，膈肌纤维CSA不存在显著差异。值为均值±SEM。

表7B示出，线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对对照(注射生理盐水)动物和SS-31处理的动物中的膈膜力-频率响应(体外)的影响。在任何刺激频率下，对照组和SS-31组之间，膈膜力产生不存在显著性差异。值为均值±SEM。

表7C示出线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)对对照(注射生理盐水)动物和SS-31处理的动物中的膈膜线粒体过氧化氢排放和线粒体呼吸功能的影响。使用丙酮酸盐/苹果酸盐作为底物获得这些数据。VO₂＝线粒体氧消耗；RCR＝呼吸控制率。态-3VO₂的单位和态-4VO₂的单位为纳摩尔氧/毫克蛋白/分钟。值为平均值±SEM﹡＝在p<0.5水平上与对照的差异。

2.对长期MV的生理响应

为了评估MV方案对于维持体内平衡的作用，在试验开始和在MV期间的各个时间间隔点测量所有动物中的动脉血压、动脉PCO₂、动脉PO₂和动脉pH。尽管在动脉血压、血气、和pH随着时间存在小的变化，但是本试验结果证实，在MV期间可较好地维持动脉血压和血气/pH的体内平衡(图8)。

表8示出在完成12小时的机械通气时的动物心率、心脏收缩血压、和动脉血气张力/pH。值为平均值±SEM。在任何这些生理变量中，两个试验组之间不存在显著性差异。

此外，假定脓毒症与膈膜收缩功能障碍相关的话，则在整个试验期间进行严格的无菌技术。重要的是，数据表明动物在MV期间没有形成感染。这通过以下观察支持：血液的显微学检查显示出没有可检测到的细菌，并且肺和腹膜腔的尸体解剖(可视的)检查没有出现可检测到的异常。此外，MV动物在调查期间没有发热现象，体温在36.3℃至37.4℃的范围内。最后，在MV过程之间，MV动物的体重没有发生显著的变化(P<0.05)。总体地，这些结果表明MV动物明显地没有任何感染。

与对照相比，该结果表明利用SS-31对自主呼吸动物的处理没有改变任何这些独立的测量(见下文)中的任一测量。因此，使用SS-31作为线粒体靶向的抗氧化剂进行了另外的试验，以分析在MV诱导的膈膜无力期间的线粒体ROS排放，膈膜无力期间包括12小时的MV。

3.SS-31阻碍MV-诱导的来自膈膜线粒体的ROS排放

针对与膈膜中的MV-诱导的氧化损伤、收缩功能障碍和萎缩相关联，评估线粒体中的线粒体来源的ROS排放。在这个方面，采用线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)处理大鼠，以防止MV-诱导的来自膈膜线粒体的ROS排放。应该注意，SS-31处理防止在态3线粒体呼吸和态4线粒体呼吸期间的MV-诱导的膈膜线粒体H₂O₂释放的增加。见图1。在这点上，在不存在SS-31的情况下，从机械通气(MV)的大鼠的膈膜中分离的线粒体的过氧化氢释放没有显示下降。因此，用SS-31对动物的处理显著地降低了长期MV后来自线粒体的H₂O₂释放速率。值为平均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图1。

长期MV导致线粒体受到损伤，这通过从MV动物的膈膜中分离的线粒体中的受损伤的偶联(即，较低的呼吸控制率)表示。因此，采用SS-31对动物的处理保护膈膜线粒体免受MV-诱导的线粒体解偶联。如表9所示，SS-31处理成功地避免了发生在长期MV后发生的膈膜线粒体解偶联。

表9

参数	对照	MV	MVSS
				态-3VO2	235.9±10	212.4±11	193.1±9
态-4VO2	61.8±3	77.6±5*	42.4±3
				RCR	4.7±0.2	2.7±0.3*	4.6±0.2
ADP/O比率	2.1±0.2	2.3±0.2	2.3±0.2

表9示出从对照(CON)动物、机械通气(MV)的动物、机械通气且线粒体抗氧化剂SS-31处理(MVSS)的动物的膈膜分离出的线粒体的态-3呼吸、态-4呼吸和呼吸控制率(RCR)。这些数据通过丙酮酸盐/苹果酸盐作为底物得到。用于态-3氧消耗(VO₂)和态-4氧消耗(VO₂)的单位为纳摩尔氧/毫克蛋白/分钟。值为平均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS的差异(p<0.05)。

4.MV-诱导的氧化应激由线粒体ROS排放介导。

为了确定膈膜中的MV-诱导的氧化应激是否需要线粒体ROS排放，测量氧化损伤的两个生物标记物，即4-HNE-结合的胞质蛋白的膈膜含量和肌原纤维蛋白中的蛋白羰基的含量。结果揭示了采用SS-31的动物处理保护膈膜免受通常与长期MV相关联的ROS-诱导的蛋白羰基和4-HNE-结合的胞质蛋白的增加。见图2。在这方面上，测量对照(CON)大鼠、机械通气(MV)大鼠和机械通气且采用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31处理的大鼠中的氧化修饰蛋白的含量。

如图2A所示，列出了三个试验组的膈膜中的4-羟基壬烯醛结合蛋白的含量。直方图上方的图像为来自该三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹。图2B进一步说明该三个试验组的膈膜中的蛋白质羰基水平。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图2。

5.MV-诱导的膈膜收缩功能障碍和纤维萎缩要求增加的线粒体ROS排放

为了评估线粒体ROS排放在MV-诱导的膈膜收缩功能障碍中的作用，采用从对照动物、MV动物和MV且SS-31处理的动物中得到的膈肌的条来体外测量膈膜收缩性能。使用SS-31防止线粒体ROS排放成功地防止了与长期MV相关的膈膜收缩功能障碍。见图3。如图3所示，在对照大鼠和使用/不使用线粒体靶向的抗氧化剂的机械通气的大鼠中，长期MV影响膈膜力-频率响应(体外)。然而，在任何刺激频率下，在对照组(CON)和MVSS组之间，膈膜力产生不存在显著性差异。值为均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图3。

对于与长期MV相关的膈膜纤维萎缩，MV-诱导的氧化应激是必须的。参见：Betters等，Trolox attenuates mechanical ventilation-induced diaphragmaticdysfunction and proteolysis.Am J Respir Crit Care Med.,Vol.,170(11):1179-1184(2004)。如图4所示，测量了来自对照(CON)大鼠和机械通气且用线粒体靶向的抗氧化剂处理(MVSS)的大鼠以及机械通气且没有用线粒体靶向的抗氧化剂处理(MV)的大鼠的膈膜肌肉肌原纤维的纤维横断面面积(CSA)。注意到，在任何类型的纤维中，在CON组和MVSS组之间，膈膜纤维CSA不存在显著的差异。值为均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图4。可以确定，对于MV诱导的膈膜萎缩，MV-诱导的线粒体ROS排放是必要条件。对于所有处理组的单个纤维类型，确定肌原纤维横断面面积。数据表示，防止MV-诱导的线粒体ROS排放的增加保护膈膜免受MV-诱导的纤维萎缩。见图4。

6.MV-诱导的线粒体ROS排放促使膈膜蛋白酶激活和蛋白水解

在长期MV期间，膈膜中蛋白水解的泛素-蛋白酶体系统被激活，并且因此可能有助于MV-诱导的膈膜蛋白质分解。为了确定线粒体ROS排放对蛋白水解的泛素-蛋白酶体系统的作用，测量膈膜中的20S蛋白酶体活性以及两个重要肌肉特异性E3连接酶(即atrogin-l/MAFbx和MuRF-1)的mRNA含量和蛋白含量。结果显示出，借助SS-31防止MV-诱导的线粒体ROS释放避免了膈膜中的20S蛋白酶体活性发生MV-诱导的增加。见图5A。此外，结果表示出，长期MV导致两个MV组的膈膜中的atrogin-l/MAFbx mRNA含量的显著增加；然而，采用SS-31对动物的处理显著地减弱了膈膜中的atrogin-l/MAFbx蛋白含量的MV-诱导的增加。见图5B。

图5C示出长期MV对MuRF-1的膈膜mRNA含量和蛋白含量的影响。长期MV导致膈膜中MuRF-1mRNA含量的显著增加，尽管MuRF-1蛋白含量在机械通气动物的膈膜中趋向于增加，但这些差异并未达到显著。在图5B-C中的直方图上方的图像为来自三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹。值为均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图5。

膈膜中的钙蛋白酶和半胱天冬酶-3激活对于MV-诱导的膈膜萎缩和膈膜收缩功能障碍具有重要的作用。参见：McClung等，Caspase-3 regulation ofdiaphragm myonuclear domain during mechanical ventilation-induced atrophy，Am JRespir Crit Care Med.,Vol.175(2):150-159(2007)。使用两种不同但互补的方法测量膈膜钙蛋白酶和半胱天冬酶-3活性。首先，通过蛋白质印迹确定肌肉中活性的钙蛋白酶-1和半胱天冬酶-3的含量，以检测钙蛋白酶-1和半胱天冬酶-3的分裂形式和活性形式。见图6。如图6A所示，在完成12小时MV时，测量膈肌中钙蛋白酶-1的活性形式。在完成12小时MV时，也示出膈肌中的半胱天冬酶-3的分裂带和活性带。见图6B。在图6A和图6B的直方图上方的图像为来自三个试验组的数据的蛋白质印迹。值为均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图6B。

在一个时间段测量钙蛋白酶1和半胱天冬酶-3的活性。因此，还测量αΙΙ-血影蛋白的钙蛋白酶和半胱天冬酶-3特异性分解产物，这是因为这些分解产物提供了可以被检测到的体内特征。见图7。该技术提供了MV期间随着长时间段膈膜中体内钙蛋白酶和半胱天冬酶-3活性的指标。如在图7A中所示，在进行12小时的MV后，测量膈肌中145kDaα-ΙΙ-血影蛋白分解产物(SBPD)。注意到，SBDP 145kDa为对完整的α-ΙΙ-血影蛋白的钙蛋白酶分裂特异的α-ΙΙ-血影蛋白分解产物，因此，采用细胞水平的SBDP145kDa作为体内钙蛋白酶活性的生物标记物。

如图7B所示，在进行12小时的MV后，测量膈肌中120kDaα-ΙΙ-血影蛋白分解产物(SBPD 120kDa)。应该注意，SBDP 120kDa为α-ΙΙ-血影蛋白降解产物，其对于完整的α-ΙΙ-血影蛋白的半胱天冬酶-3分裂是特异的，因此，细胞水平的SBDP120kDa可作为半胱天冬酶-3活性的生物标记物。在图7A和图7B的直方图的上方的图像为来自三个试验组的数据的典型的蛋白质印迹。值为均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图7。

这些结果一起表明，采用线粒体靶向的抗氧化剂(SS-31)进行的动物处理保护膈膜免受钙蛋白酶和半胱天冬酶-3的激活。见图6至图7。这些发现表明，线粒体是膈膜中的MV-诱导的ROS产生的主要源，并且线粒体ROS产生对于膈膜中钙蛋白酶和半胱天冬酶-3的激活是必要的。

7.线粒体靶向的抗氧化剂保护免受MV-诱导的膈膜蛋白水解

在证实防止MV-诱导的线粒体ROS排放增加保护膈膜免受蛋白酶激活之后，测量作为废用-诱导的肌肉蛋白水解的标记物的膈膜中横纹肌蛋白肌动蛋白的相对丰度。由于肌动蛋白优选地在废用肌肉萎缩期间分解，因此肌动蛋白含量的评估提供了蛋白水解的指标。参见：Li等,Interleukin-1stimulates catabolismin C2C12myotubes.American Journal of Physiology.,Vol.,297(3):C706-714(2009)。结果显示出，与来自对照动物和MV-SS动物的膈肌相比，进行长期MV而没有线粒体抗氧化剂处理的动物的膈肌中的肌动蛋白丰度显著下降。见图8。因此，防止MV-诱导的线粒体ROS排放不仅保护免受蛋白酶激活，而且该处理还保护免受MV-诱导的膈膜蛋白水解。

如图8所示，测量来自对照(CON)动物、机械通气且采用线粒体靶向的抗氧化剂处理(MVSS)的动物、和机械通气且没有采用线粒体靶向的抗氧化剂处理(MV)的动物的膈膜中的肌动蛋白含量与总肌小节蛋白含量的比率。由于肌动蛋白优选地在废用肌肉萎缩期间分解，因此肌动蛋白含量与总肌小节蛋白含量的比率的评估提供了长期MV期间膈膜蛋白水解的相对指标。在直方图上方的图像为来自三个实验组的数据的典型的蛋白质印迹。值为均值±SEM。﹡＝与对照(CON)和MVSS(n＝6/组)的差异(p<0.05)。见图8。

II.试验2

A.试验设计和方法：

本试验的目的在于证实MV-诱导的线粒体氧化通用于废用-诱导的骨骼肌无力。两组不同的小鼠(1和2)进行如下处理。

1.正常的活动的小鼠

将正常的活动的小鼠随机分成两个组A和B，每组8只。组A小鼠接收无菌生理盐水注射；组B小鼠接收线粒体靶向的肽SS-31注射。

2.石膏固定后肢的小鼠

将小鼠的后肢用石膏固定14天，从而诱导后肢肌肉萎缩。石膏固定的小鼠无菌生理盐水注射(0.3毫升)或进行含有肽SS-31的注射(0.3毫升)。在本试验中还应用未处理的小鼠的对照组。

B.材料和方法

动物

将72只成年雄性C57B16小鼠(21-28周龄，体重26.44±0.54克)用在这些试验中。将动物维持在12:12小时光照-黑暗周期，并且在整个试验期间提供食物(AIN93食物)和水的自由采食。佛罗里达大学动物养护和使用委员会机构证实这些试验。

试验设计

为了测试线粒体ROS产生在固定诱导的骨骼肌萎缩中起作用这一假设，将小鼠随机分配到三个试验组的一个组中(n＝24/组)：1)未处理(对照)组；2)14天后肢固定组(石膏固定)；和3)14天后肢固定且采用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31处理的组(石膏固定+SS)。注意，14天后肢固定组(石膏固定)接收生理盐水灌输，而该处理组中的动物在固定时段期间采用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31处理。

试验方案

固定.将小鼠通过气化的异氟醚(吸入3％，维持0.5-2.5％)进行麻醉。将麻醉的小鼠在脚放松伸直的位置的踝关节两侧进行石膏固定，以诱导跖肌和比目鱼肌的最大萎缩。后肢和尾部四分之一的身体被熟石膏绷带所包围。一薄层衬垫放置在石膏绑带下面以防止擦伤。此外，为了防止动物啃咬石膏绑带，一条玻璃纤维材料应用在石膏上方。每日监控小鼠的啃咬石膏、擦伤、静脉阻塞以及移动问题。

给药线粒体靶向的抗氧化剂。在固定期间，后肢固定组的小鼠每日接收皮下注射溶解在生理盐水中的线粒体靶向的抗氧化剂SS-31(1.5毫克/千克)。由于其作为线粒体靶向的抗氧化剂的特异性，而选择SS-31(Zhao K,Zhao GM,WuD,Soong Y,Birk AV,Schiller PW,Szeto HH.Cell-permeable peptide antioxidantstargeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling,oxidativecell death,and reperfusion injury.The Journal of biological chemistry,2004；279:34682-34690)。

生化测量

制备可渗透的肌肉纤维。该技术根据先前的方法(Korshunov SS等，Highprotonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species inmito-chondria.FEBS Lett 416:15-18,1997；Tonkonogi M等，Reduced oxidativepower but unchanged antioxidative capacity in skeletal muscle from aged humans.Pfliigers Arch 446:261-269,2003)改变而成。简单地讲，切开小部分(～25毫克)的比目鱼肌和跖肌，将其放置在含有冰冷的缓冲液X(60mM K-MES、35mMKCl、7.23mM K₂EGTA、2.77mM CaK₂EGTA、20mM咪唑、0.5mM DTT、20mM牛磺酸、5.7mM ATP、15mM PCr和6.56mM MgCl₂，pH 7.1)的塑料Petr培养皿上。将肌肉修剪掉连接组织，切断得到纤维束(4-8毫克湿重)。在显微镜下，利用一对超锋利的镊子，轻轻地将肌肉纤维分离在冰冷的缓冲液X中以使纤维束的表面积最大化。为了使肌原纤维可渗透，在4℃下将每一纤维束培养在旋转器上的含有50微克/毫升的皂角苷的冰冷缓冲液X中30分钟。然后将可渗透的纤维束在冰冷的缓冲液Z(110mM K-MES、35mM KCl、1mM EGTA、5mM K₂HPO₄和3mM MgCl₂、0.005mM谷氨酸盐和0.02mM苹果酸盐(和0.5mg/ml BSA，pH 7.1)中进行洗涤。

可渗透纤维中的线粒体呼吸。在维持在37℃的呼吸室中利用极谱分析法测量呼吸(Hansatech仪器，英国)。在对呼吸室进行校正后，将可渗透的纤维束用1毫升含有20mM肌酸的呼吸缓冲液Z进行培养，以使肌酸激酶饱和(Saks VA等，Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrialfunction in vivo.Mo I Cell Biochem 184:81-100,1998；Walsh B等，The role ofphosphorylcreatine and creatine in the regulation of mitochondrial respiration inhuman skeletal muscle.J Physiol 537:971-978,2001)。使用5mM丙酮酸盐和2mM苹果酸盐测量穿过复合物I的流量。限定为ADP存在时的呼吸速率的最大呼吸(态3)通过将0.25mM的ADP添加到呼吸室中而引发。在10微克/毫升寡霉素存在下确定基础呼吸(态4)以抑制ATP合成。将态3呼吸除以态4呼吸计算呼吸控制率(RCR)。

线粒体ROS产生。使用Amplex^TM红试剂(分子探针，Eugene,OR)确定线粒体ROS产生。使用琥珀酸盐作为底物，在37℃下，在96孔板中进行该试验分析。具体地，该试验分析基于这样的概念而形成：辣根过氧化物酶催化过氧化氢依赖的非荧光Amplex^TM红到荧光Amplex^TM红的氧化，并且辣根过氧化物酶用于测量作为过氧化物产生的指示的过氧化氢。以40单位/毫升添加超氧化物歧化酶(SOD)，以将全部过氧化物转化成过氧化氢。使用多孔板读取仪荧光计(SpectraMax，分子设备，Sunnyvale,CA)，在激发波长为545nm处和发射波长为590nm处监控试卤灵(Resorufin)形成(通过H₂O₂的Amplex^TM红氧化)。在15分钟中，每5分钟记录试卤灵形成，然后，采用标准曲线计算过氧化氢的产生。

蛋白质印迹分析。通过蛋白质印迹分析确定骨骼样品中的蛋白质丰度。简单地讲，利用蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)，将比目鱼肌和跖肌样品以1:10(重量/体积)在5mM的Tris(pH 7.5)和5mM的EDTA(pH 8.0)中进行均质，然后4℃下1500g离心10分钟。在收集产生的上清液后，通过Bradford(Sigma,St.Louis)方法评估肌肉蛋白含量。在200V电压下，使用含有0.1％十二烷基硫酸钠的4-20％的聚丙烯酰胺凝胶通过1小时电泳分离蛋白。在电泳之后，将蛋白转移到硝化纤维素膜，且与针对感兴趣的蛋白的一级抗体培养。探针检测4-HNE(Abeam)作为氧化应激的测量指示，而蛋白水解活性通过分裂的(活化的)钙蛋白酶-1(细胞信号传导)和分裂的(活化的)半胱天冬酶-3(细胞信号传导)来评估。在培养之后，利用PBS-Tween溶液洗涤膜，且用二级抗体(AmershamBiosciences)处理膜。使用化学发光系统以检测标记的蛋白(GE Healthcare)，并且使用放射自显影膜和显影剂(Kodak)对膜显影。使用计算机化图像分析分析得到的图像以确定与对照的百分比变化。利用丽春红S对膜进行染色，且分析该膜以证实相同的蛋白负荷和蛋白转移。

组织学测量

肌原纤维横断面面积。使用冷冻切片机(Shandon Inc.,Pittsburgh,PA)，将冷冻的比目鱼肌样品和跖肌样品(包埋在OCT中)切成10微米厚的切片，对营养不良蛋白、肌球蛋白重链(MHC)I和MHC型IIa蛋白进行染色，用于如上所述纤维横断面面积分析(CSA)(McClung JM等，Antioxidant administrationattenuates mechanical ventilation-induced rat diaphragm muscle atrophy independentof protein kinase b(pkb akt)signalling.J Physiol 2007；585:203-215)。使用Scion软件(NIH)确定CSA。

统计分析

对于每一独立的变量，通过单向方差分析(ANOVA)进行两个组之间的比较，并且当适合时，进行事后Tukey HSD(诚实显著性差异，honestly significantdifference)测验。显著性建立在p<0.05。数据显示为均值±SEM。

C.结果：

如图9-18所示，SS-31对正常的骨骼肌尺寸或线粒体功能没有影响。然而，SS-31能够预防氧化伤害和相关的后肢固定导致的肌肉无力(例如萎缩、收缩性功能障碍等)。

1.正常的活动的小鼠

如图9A-9D所示，在活动小鼠中，SS-31分别对比目鱼肌重量、呼吸控制率(RCR)、线粒体态3呼吸、或线粒体态4呼吸不产生影响。RCR为通过氧消耗测量的态3呼吸与态4呼吸的呼吸系数比。同样，图10A-图10C示出SS-31对正常的比目鱼肌中不同尺寸的肌肉纤维不具有任何变化的影响。此外，如图11A-11D所示，SS-31分别对跖肌重、呼吸偶联率(RCR)、线粒体态3呼吸或线粒体态4呼吸没有影响。相似的，图12A-B示出SS-31对正常的跖肌纤维组织中不同尺寸的肌肉纤维没有产生任何变化的影响。

2.后肢石膏固定的小鼠

如图13A-13D，石膏固定7天导致比目鱼肌重量(图13A)、RCR(图13B)和线粒体态3呼吸(图13C)的显著下降，所有下降通过给药SS-31而逆转。石膏固定对态4呼吸不具有显著的影响。同样，石膏固定7天显著地增加从比目鱼肌分离的线粒体的H₂O₂量，相似地，这可通过SS-31而防止。见图14A-B。如图14B所示，SS-31预防在比目鱼肌中三种类型的纤维(类型I、IIa和IIb/x)的横断面面积损失。

石膏固定还显著地增加了比目鱼肌中氧化损伤，如通过4-羟基壬烯醛(4-HNE)测定的脂质过氧化作用所示。见图15A。该影响通过给药SS-31消除。此外，石膏固定显著地增加了比目鱼肌中的蛋白酶活性，该活性很可能负责肌肉降解和肌肉萎缩。如图15B-D分别示出，通过SS-31可全部防止钙蛋白酶-1、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-12的蛋白水解降解。

如图16A-D所示，石膏固定7天导致跖肌重量(图16A)、RCR(图16B)和线粒体态4呼吸(图16C)的显著下降，这与ROS产生密切相关。所有下降通过给药SS-31而逆转。石膏固定对态3呼吸不具有显著的影响。见16C。相似地，石膏固定7天显著地增加了从跖肌分离的线粒体的H₂O₂量，这通过SS-31而防止。见图17A-B。如图17B所示，SS-31预防在跖肌中两种类型的纤维(IIa和IIb/x)的横断面面积损失。

石膏固定还显著地增加了跖肌中氧化损伤，如通过4-羟基壬烯醛(4-HNE)测定的脂质过氧化作用所示。见图18A。该影响通过给药SS-31消除。此外，石膏固定显著地增加了跖肌中的蛋白酶活性，该活性很可能负责肌肉降解和肌肉萎缩。如图18B-D分别示出，通过SS-31可全部防止钙蛋白酶-1、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-12的蛋白水解降解。

总之，从这些试验的结果示出，将SS-31给药至具有MV-诱导的或废用诱导的线粒体ROS排放增加的对象，不仅减少了蛋白酶活性，而且还减弱骨骼肌萎缩和骨骼肌收缩障碍。采用线粒体靶向的抗氧化剂SS-31的动物处理成功地预防如上文所述的骨骼肌中的类型I、IIa和IIb/x纤维的萎缩。此外，防止MV-诱导的和废用-诱导的线粒体ROS排放的增加还保护膈膜免受MV-诱导的在次最大刺激频率和最大刺激频率下的膈膜特异力产生的下降。见图3。总之，这些结果指出，SS-31可预防和处理在膈膜和其他骨骼肌中MV-诱导的和废用-诱导的线粒体ROS排放。

本发明不限于在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和改动。根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范围内的功能上等同的方法和装置对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲落在所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及与这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限制。应当理解，本公开不限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合物和生物系统可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不用来是限制性的。

此外，在以马库什组的方式描述本公开的特征或方面的情况下，本领域的本领域技术人员将意识到，本公开也是以马库什组中的任一单个成员或亚组成员的方式所描述的。

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在以下的权利要求范围内提出其他的实施方式。

Claims (1)

1.一种治疗或预防哺乳动物对象中骨骼肌衰弱的方法，所述方法包括将治疗有效量的肽D-Arg-2’,6’Dmt-Lys-Phe-NH₂或其药学上可接受的盐给药至所述哺乳动物对象。