ES2392341T3 - Ácidos nucleicos y proteínas correspondientes tituladas 191P4D12(B) útiles en el tratamiento y la detección de cáncer - Google Patents

Ácidos nucleicos y proteínas correspondientes tituladas 191P4D12(B) útiles en el tratamiento y la detección de cáncer Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para diagnosticar cáncer que comprende:(a) poner en contacto una muestra de prueba de un sujeto humano del que se sospecha que tiene cáncer conuna sonda que puede unirse específicamente a un ARNm de 191P4D12(b) que tiene la secuencia expuestaen SEC ID Nº: 2, en el que la muestra de prueba es de un tejido seleccionado del grupo que consiste enriñón, cuello uterino y ovario;(b) determinar el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba; y(c) comparar el nivel así determinado con el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en una muestrade tejido normal del mismo tipo de tejido que la muestra de prueba, por lo que la presencia de expresión deARNm de 191P4D12(b) elevada en la muestra de prueba con respecto a la muestra de tejido normal indica lapresencia o estado de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario.

Description

Ácidos nucleicos y proteínas correspondientes tituladas 191P4D12(b) útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
Campo de la invención
La invención descrita en el presente documento se refiere a genes y a sus proteínas codificadas, llamadas 191P4D12(b), expresadas en ciertos cánceres, y a procedimientos de diagnóstico útiles en el tratamiento de cánceres que expresan 191P4D12(b).
Antecedentes de la invención
El cáncer es la segunda causa frecuente de muerte humana junto a la enfermedad coronaria. En el mundo, millones de personas mueren de cáncer cada año. En Estados Unidos solo, como se informa por la Sociedad americana del cáncer, el cáncer produce la muerte de más de medio millón de personas anualmente, con más de 1,2 millones de casos nuevos diagnosticados por año. Aunque las muertes de enfermedad cardíaca han ido disminuyendo significativamente, aquellas resultantes de cáncer generalmente están en aumento. Se predice que a principios del próximo siglo el cáncer sea la causa principal de muerte.
En el mundo, varios cánceres destacan como las causas principales de mortalidad. En particular, los carcinomas de pulmón, próstata, mama, colon, páncreas y ovario representan la causa primaria de muerte por cáncer. Estos y prácticamente todos los otros carcinomas comparten una característica mortal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastásica de un carcinoma es mortal. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer que inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha mostrado que sus vidas están espectacularmente alteradas. Muchos pacientes con cáncer experimentan fuertes ansiedades accionadas por la conciencia de las posibilidades de reaparición o fracaso del tratamiento. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilitaciones físicas tras el tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una reaparición.
En el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en el hombre. En América del norte y Europa del norte, es con mucho el cáncer más común en hombres y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en el hombre. En Estados Unidos solo, más de 30.000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad – en segundo lugar tras el cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no hay tratamiento eficaz para el cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, radioterapia, terapia de ablación de hormonas, castración quirúrgica y quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, estos tratamientos son ineficaces para muchos y frecuentemente están asociados a consecuencias no deseables.
En el frente del diagnóstico, la falta de un marcador de tumor de próstata que pueda detectar con exactitud tumores localizados en el estado temprano sigue siendo una limitación significativa en el diagnóstico y el tratamiento de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antígeno prostático específico (PSA) en suero ha sido una herramienta muy útil, sin embargo se considera ampliamente que su especificidad y utilidad general carecen de varios aspectos importantes.
El progreso en identificar marcadores específicos adicionales para cáncer de próstata ha mejorado por la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes estados de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de LAPC (cáncer de próstata de Los Ángeles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido a pase por ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID) y han presentado la capacidad de imitar la transición de dependencia de andrógenos a independencia de andrógenos (Klein y col., 1997, Nat. Med. 3:402). Marcadores de cáncer de próstata más recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), antígeno prostático específico de membrana (PSM) (Pinto y col., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert y col., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8) y antígeno de citoblasto de próstata (PSCA) (Reiter y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735).
Aunque los marcadores previamente identificados tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado esfuerzos para diagnosticar y tratar cáncer de próstata, existe la necesidad de la identificación de marcadores y dianas terapéuticas adicionales para cánceres de próstata y relacionados con el fin de mejorar adicionalmente el diagnóstico y la terapia.
El carcinoma de células renales (CCR) representa aproximadamente el 3 por ciento de los tumores malignos en adultos. Una vez los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, existe potencial maligno. En el adulto, los dos tumores renales malignos principales son adenocarcinoma de células renales y carcinoma de células transicionales de la pelvis renal o uréter. La incidencia de adenocarcinoma de células renales se estima en más de 29.000 casos en Estados Unidos, y más de 11.600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de células transicionales es menos frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por año en Estados Unidos.
La cirugía ha sido la terapia primaria para adenocarcinoma de células renales durante muchas décadas. Hasta recientemente, la enfermedad metastásica ha sido resistente a cualquier terapia sistémica. Con los recientes desarrollos en terapias sistémicas, particularmente inmunoterapias, el carcinoma de células renales metastásico puede abordarse agresivamente en pacientes apropiados con una posibilidad de respuestas duraderas. Sin embargo, hay una necesidad continua de terapias eficaces para estos pacientes.
De todos los nuevos casos de cáncer en Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente el 5 por ciento en hombres (quinta neoplasia más común) y el 3 por ciento en mujeres (octava neoplasia más común). La incidencia está aumentando lentamente, simultáneamente a una población cada vez más vieja. En 1998 hubo un cálculo aproximado de 54.500 casos, que incluyeron 39.500 en hombres y 15.000 en mujeres. La incidencia ajustada a la edad en Estados Unidos es 32 por cada 100.000 para hombres y ocho por cada 100.000 en mujeres. La relación histórica hombre/mujer de 3:1 puede estar disminuyendo relacionado con los patrones de tabaquismo en las mujeres. Hay un cálculo aproximado de 11.000 muertes de cáncer de vejiga en 1998 (7.800 en hombres y 3.900 en mujeres). La incidencia y mortalidad del cáncer de vejiga aumentan considerablemente con la edad y serán un problema cada vez mayor a medida que la población se vuelve cada vez más vieja.
La mayoría de los cánceres de vejiga se producen en la vejiga. El cáncer de vejiga se trata con una combinación de resección transuretral (RTU) de la vejiga y quimioterapia intravesical o inmunoterapia. La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga señala las limitaciones de la RTU. La mayoría de los cánceres invasivos de músculo no son curados por RTU sola. La cistectomía radical y la diversión urinaria son el medio más eficaz para eliminar el cáncer, pero lleva un impacto innegable sobre la función urinaria y sexual. Continúa habiendo una necesidad significativa para las modalidades de tratamiento que son beneficiosas para pacientes con cáncer de vejiga.
Un cálculo estimado de 130.200 casos de cáncer colorrectal se produjeron en el año 2000 en Estados Unidos, que incluyeron 93.800 casos de cáncer de colon y 36.400 de cáncer rectal. Los cánceres colorrectales son el tercer cáncer más común en hombres y mujeres. Las tasas de incidencia disminuyeron significativamente durante 19921996 (-2,1% por año). La investigación sugiere que estas diminuciones han sido debidas a un aumento en la detección y extirpación de pólipos, prevención de la evolución de pólipos a cánceres invasivos. Hubo un cálculo estimado de 56.300 muertes (47.700 de cáncer de colon, 8.600 de cáncer rectal) en el año 2000, representando aproximadamente el 11% de todas las muertes por cáncer en EE.UU.
Actualmente, la cirugía es la forma más común de terapia para el cáncer colorrectal, y para cánceres que no se han extendido es frecuentemente curativa. La quimioterapia, o quimioterapia más radiación, se da antes o después de la cirugía a la mayoría de los pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared del intestino o se ha extendido a los ganglios linfáticos. Ocasionalmente se necesita una colostomía permanente (creación de una abertura abdominal para la eliminación de desechos del cuerpo) para cáncer de colon y frecuentemente es poco requerida para cáncer rectal. Continúa habiendo una necesidad de modalidades de diagnóstico y tratamiento eficaces para cáncer colorrectal.
Hubo un cálculo estimado de 164.100 nuevos casos de cáncer de pulmón y bronquial en el año 2000, representando el 14% de todos los diagnósticos de cáncer en EE.UU. La tasa de incidencia de cáncer de pulmón y bronquial está disminuyendo significativamente en hombres, desde un máximo de 86,5 por cada 100.000 en 1984 a 70,0 en 1996. En los 90, la tasa de aumento entre mujeres empezó a disminuir. En 1996, la tasa de incidencia en mujeres era de 42,3 por cada 100.000.
El cáncer de pulmón y bronquial produjo un cálculo estimado de 156.900 muertes en el año 2000, representando el 28% de todas las muertes por cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad de cáncer de pulmón disminuyó significativamente entre hombres (-1,7% por año), mientras que las tasas para mujeres todavía fueron aumentando significativamente (0,9% por año). Desde 1987, más mujeres han muerto cada año de cáncer de pulmón que de cáncer de mama que, durante más de 40 años, fue la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres. La disminución de las tasas de incidencia y mortalidad por cáncer de pulmón se produjo lo más probablemente por la disminución de las tasas de tabaquismo durante los 30 años previos; sin embargo, la disminución en los patrones de tabaquismo entre mujeres se quedó atrás de los de hombres. Es de interés que, aunque han disminuido los descensos en el uso de tabaco en adultos, el uso del tabaco en la juventud está aumentado de nuevo.
Las opciones de tratamiento para cáncer de pulmón y bronquial se determinan por el tipo y el estado del cáncer e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es normalmente el tratamiento de elección. Debido a que la enfermedad normalmente se ha extendido en el momento en el que se descubre, la radioterapia y quimioterapia son frecuentemente necesarias en combinación con cirugía. La quimioterapia sola o combinada con radiación es el tratamiento de elección para cáncer de pulmón de células pequeñas; con esta pauta, un gran porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es de larga duración. Sin embargo, hay una necesidad continua de enfoques de tratamiento y diagnóstico eficaces para cánceres de pulmón y bronquiales.
Se esperó que se produjera un cálculo estimado de 182.800 nuevos casos invasivos de cáncer de mama entre mujeres en Estados Unidos durante el año 2000. Adicionalmente, se esperó que se diagnosticaran aproximadamente 1.400 nuevos casos de cáncer de mama en hombres en el año 2000. Después de aumentar aproximadamente el 4% por año en los 80, las tasas de incidencia de cáncer de mama en mujeres se han estabilizado en los 90 a aproximadamente 110,6 casos por 100.000.
En EE.UU. solo hubo un cálculo estimado de 41.200 muertes (40.800 mujeres, 400 hombres) en el año 2000 debido a cáncer de mama. El cáncer de mama está clasificado como el segundo entre las muertes por cáncer en mujeres. Según los datos más recientes, las tasas de mortalidad disminuyeron significativamente durante 1992-1996 con la mayor disminución en mujeres jóvenes, tanto blancas como negras. Estas disminuciones fueron probablemente el resultado de detección temprana y tratamiento mejorado.
Teniendo en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias del paciente, el tratamiento de cáncer de mama puede implicar lumpectomía (extirpación local del tumor) y eliminación de los ganglios linfáticos debajo del brazo; mastectomía (extirpación quirúrgica de la mama) y extirpación de los ganglios linfáticos debajo del brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia con hormonas. Frecuentemente se usan dos o más procedimientos en combinación. Numerosos estudios han mostrado que, para enfermedad en estado temprano, las tasas de supervivencia a largo plazo después de lumpectomía más radioterapia son similares a las tasas de supervivencia después de mastectomía radical modificada. Avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan varias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, tal reconstrucción se ha hecho al mismo tiempo que la mastectomía.
La extirpación local de carcinoma ductal in situ (CDIS) con cantidades adecuadas de tejido de mama normal de alrededor puede prevenir la reaparición local de CDIS. La radiación a la mama y/o tamoxifeno pueden reducir la probabilidad de que el CDIS se produzca en el tejido de mama restante. Esto es importante debido a que el CDIS, si se deja sin tratar, puede desarrollarse en cáncer de mama invasivo. Sin embargo, hay graves efectos secundarios o secuelas a estos tratamientos. Por tanto, hay una necesidad de tratamientos eficaces para el cáncer de mama.
Hubo un cálculo estimado de 23.100 nuevos casos de cáncer de ovario en Estados Unidos en el año 2000. Representa el 4% de todos los cánceres entre mujeres y se clasifica como el segundo entre cánceres ginecológicos. Durante 1992-1996, las tasas de incidencia de cáncer de ovario fueron disminuyendo significativamente. Como consecuencia del cáncer de ovario hubo un cálculo estimado de 14.000 muertes en el año 2000. El cáncer de ovario produce más muertes que ningún otro cáncer del aparato reproductor femenino.
La cirugía, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para cáncer de ovario. La cirugía normalmente incluye la extirpación de uno o ambos ovarios, las trompas de Falopio (salpingo-ooforectomía) y el útero (histerectomía). En algunos tumores muy tempranos sólo se extirpará el ovario implicado, especialmente en mujeres jóvenes que desean tener niños. En enfermedad avanzada se hace un intento por extirpar toda la enfermedad intraabdominal para potenciar el efecto de la quimioterapia. Continúa habiendo una necesidad importante de opciones de tratamiento eficaces para cáncer de ovario.
Hubo un cálculo estimado de 28.300 nuevos casos de cáncer pancreático en Estados Unidos en el año 2000. Durante los últimos 20 años, las tasas de cáncer pancreático han disminuido en hombres. Las tasas entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes, pero pueden estar empezando a disminuir. El cáncer pancreático produjo un cálculo estimado de 28.200 muertes en el año 2000 en Estados Unidos. Durante los últimos 20 años ha habido una disminución ligera, pero significativa, en las tasas de mortalidad entre hombres (aproximadamente -0,9% por año), mientras que las tasas han aumentado ligeramente entre mujeres.
La cirugía, radioterapia y quimioterapia son opciones de tratamiento para cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que produzcan una cura para la mayoría. Hay una necesidad significativa de opciones terapéuticas y de diagnóstico adicionales para cáncer pancreático.
El documento WO02/59377 informa de la identificación de ácidos nucleicos y proteínas que tienen perfiles de expresión asociados a cáncer de mama. El documento WO01/55315 informa de un gran número de secuencias de polinucleótidos y polipéptidos. SEC ID Nº: 136 del documento WO01/55315 es la secuencia de aminoácidos codificada por un gen llamado HBCBF11 que se informa que tiene homología con la molécula de adhesión a células nectina-3 alfa. El documento WO01/18016 informa de una proteína llamada tango 364. Se dice que tango 364 presenta la capacidad para afectar uno o más de crecimiento, proliferación, supervivencia, diferenciación, actividad, morfología y movimiento/migración de células fetales humanas y de piel adulta y tejido. También se establece que tango 364 participa en la modulación de la adhesión célula a célula, invasividad de tejido y matriz extracelular de células, infectividad de células por patógenos, procesos de señalización endocrina, desarrollo de tejido y procesos de organización.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un gen, designado 191P4D12(b), que ahora se ha encontrado que se expresa en exceso en el (los) cáncer(es) enumerado(s) en la Tabla 1. El análisis de expresión de transferencia Northern de la expresión génica de 191P4D12(b) en tejidos normales muestra un patrón de expresión limitado en tejidos adultos. Se proporcionan las secuencias de nucleótidos (Figura 2) y aminoácidos (Figura 2 y Figura 3) de 191P4D12(b). El perfil relacionado con el tejido de 191P4D12(b) en tejidos adultos normales, combinado con la expresión en exceso observada en los tejidos enumerados en la Tabla 1, muestra que 191P4D12(b) se expresa anormalmente en exceso en al menos algunos cánceres y, por tanto, sirve de diana diagnóstica, profiláctica, de pronóstico y/o terapéutica útil para cáncer del (de los) tejido(s) tal(es) como aquellos enumerados en la Tabla 1.
Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar cáncer que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra de prueba de un sujeto humano del que se sospecha que tiene cáncer con una sonda que puede unirse específicamente a un ARNm de 191P4D12(b) que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, en el que la muestra de prueba es de un tejido seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario;
(b)
determinar el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba; y
(c)
comparar el nivel así determinado con el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en una muestra de tejido normal del mismo tipo de tejido que la muestra de prueba,
por lo que la presencia de expresión de ARNm de 191P4D12(b) elevada en la muestra de prueba con respecto a la muestra de tejido normal indica la presencia o estado de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario.
La invención también proporciona un procedimiento para determinar la susceptibilidad a desarrollar cáncer que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra de prueba de un sujeto humano con una sonda que puede unirse específicamente a un ARNm de 191P4D12(b) que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, en el que la muestra de prueba es de un tejido seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario; y
(b)
determinar el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba, en el que la presencia de ARNm de 191P4D12(b) indica la susceptibilidad a cáncer y en el que el nivel de expresión de ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba guarda relación con el grado de susceptibilidad a cáncer de riñón, cuello uterino u ovario.
En el presente documento se describen polinucleótidos correspondientes o complementarios a todos o parte de los genes 191P4D12(b), ARNm y/o secuencias codificantes, preferentemente en forma aislada, que incluyen polinucleótidos que codifican proteínas relacionadas con 191P4D12(b) y fragmentos de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos contiguos: al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o más de 100 aminoácidos contiguos de una proteína relacionada con 191P4D12(b), además de los propios péptidos/proteínas; ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos o oligonucleótidos complementarios o que tienen al menos una homología del 90% con los genes 191P4D12(b) o secuencias de ARNm o partes de las mismas, y polinucleótidos o oligonucleótidos que se hibridan con los genes 191P4D12(b), ARNm, o con polinucleótidos que codifican 191P4D12(b). También se describen medios para aislar ADNc y los genes que codifican 191P4D12(b). También se describen moléculas de ADN recombinantes que contienen polinucleótidos 191P4D12(b), células transformadas o transducidas con tales moléculas, y sistemas huésped-vector para la expresión de productos del gen 191P4D12(b). En ciertas realizaciones, hay una condición de que la secuencia de ácidos nucleicos entera de la Figura 2 no sea codificada y/o la secuencia de aminoácidos entera de la Figura 2 no sea preparada. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos entera de la Figura 2 está codificada y/o la secuencia de aminoácidos entera de la Figura 2 se prepara, cualquiera de las cuales están en formas de dosis unitaria humana respectiva.
La invención proporciona procedimientos para detectar la presencia y estado de polinucleótidos y proteínas 191P4D12(b) en diversas muestras biológicas, además de procedimientos para identificar células que expresan 191P4D12(b). Una realización típica de la presente invención proporciona procedimientos para monitorizar productos del gen 191P4D12(b) en un tejido o muestra de hematología que tiene o de la que se sospecha que tiene alguna forma de desregulación del crecimiento tal como cáncer.
Obsérvese que para determinar la posición de inicio de cualquier péptido expuesto en las Tablas VIII-XXI y XXII a XLIX (en conjunto Tablas de péptidos de HLA) con respecto a su proteína parental, por ejemplo, variante 1, variante 2, etc., se hace referencia a tres factores: la variante particular, la longitud del péptido en una tabla de péptidos de HLA y los péptidos de búsqueda en la Tabla VII. Generalmente se usa un único péptido de búsqueda para obtener péptidos de HLA de un particular para una variante particular. La posición de cada péptido de búsqueda con respecto a su molécula parental respectiva se enumera en la Tabla VII. Por consiguiente, si un péptido de búsqueda empieza en la posición “X”, debe añadírsele el valor “X-1” a cada posición en las Tablas VIII-XXI y XXII a XLIX para obtener la posición real de los péptidos de HLA en su molécula parental. Por ejemplo, si un péptido de búsqueda particular empieza en la posición 150 de su molécula parental, debe añadírsele 150-1, es decir, 149, a cada posición de aminoácido del péptido de HLA para calcular la posición de ese aminoácido en la molécula parental.
En el presente documento se describen epítopes de anticuerpo que comprenden una región de péptido, o un oligonucleótido que codifica la región de péptido, que tienen una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes características:
i) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de hidrofilia de la Figura 5; ii) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o inferior a 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, o que tiene un valor igual a 0,0, en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6; iii) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7; iv) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8; o
v) una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de giro beta de la Figura 9.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La secuencia de SSH de 191P4D12(b) de 223 nucleótidos.
Figura 2.
A) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 1 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.1” o “variante 1 de 191P4D12(b)”) se muestra en la Figura 2A. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. B) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 2 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.2”) se muestra en la Figura 2B. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. C) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 3 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.3”) se muestra en la Figura 2C. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. D) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 4 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.4”) se muestra en la Figura 2D. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. E) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 5 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.5”) se muestra en la Figura 2E. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. F) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 6 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.6”) se muestra en la Figura 2F. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 789-1676, incluyendo el codón de parada. G) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 7 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.7”) se muestra en la Figura 2G. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1721, incluyendo el codón de parada. H) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 8 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.8”) se muestra en la Figura 2H. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. I) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 9 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.9”) se muestra en la Figura 21. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 708-1121, incluyendo el codón de parada. J) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 10 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.10”) se muestra en la Figura 2J. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. K) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 11 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.11”) se muestra en la Figura 2K. El codón para la metionina de inicio está subrayado.
El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. L) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 12 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.12”) se muestra en la Figura 2L. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1796, incluyendo el codón de parada. M) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 13 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.13”) se muestra en la Figura 2M. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 264-1799, incluyendo el codón de parada. N) La secuencia de ADNc y de aminoácidos de la variante 14 de 191P4D12(b) (también llamada “191P4D12(b) v.14”) se muestra en la Figura 2N. El codón para la metionina de inicio está subrayado. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 708-1121, incluyendo el codón de parada.
Figura 3.
A) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.1 se muestra en la Figura 3A; tiene 510 aminoácidos. B) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.2 se muestra en la Figura 3B; tiene 510 aminoácidos. C) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.6 se muestra en la Figura 3C; tiene 295 aminoácidos. D) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.7 se muestra en la Figura 3D; tiene 485 aminoácidos. E) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.10 se muestra en la Figura 3E; tiene 510 aminoácidos. F) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.11 se muestra en la Figura 3F; tiene 510 aminoácidos. G) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.12 se muestra en la Figura 3G; tiene 510 aminoácidos. H) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.13 se muestra en la Figura 3H; tiene 511 aminoácidos. I) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.9 se muestra en la Figura 3I; tiene 137 aminoácidos. J) La secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.14 se muestra en la Figura 3J; tiene 137 aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, una referencia a 191P4D12(b) incluye todas las variantes de la misma, que incluye aquellas mostradas en las Figuras 2, 3, 10 y 11, a menos que el contexto indique claramente de otro modo.
Figura 4. Alineamiento de 191P4D12(b) con homólogos conocidos. Figura 4(A) Alineamiento de 191P4D12(b) con el receptor de la superfamilia de Ig humana LNIR (gi 14714574). Figura 4(B) Alineamiento de 191P4D12(b) con nectina 4 de ratón (gi 18874521).
Figura 5. Perfil de aminoácidos de hidrofilia de 191P4D12(b)v.1, v.7 y v.9 determinado por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Hopp y Woods (Hopp T.P., Woods K.R.,1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828) al que se accede por el sitio web de Protscale localizado en la malla mundial en (expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 6. Perfil de aminoácidos de hidropaticidad de 191P4D12(b)v.1, v.7 y v.9 determinado por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Kyte y Doolittle (Kyte J., Doolitle R.F., 1982.
J. Mol. Biol. 157:105-132) al que se accede por el sitio web de Protscale localizado en la malla mundial en (.expasy.chlcgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 7. Perfil de aminoácidos de porcentaje de residuos accesibles de 191P4D12(b)v.1, v.7 y v.9 determinado por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) al que se accede por el sitio web de Protscale localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 8. Perfil de aminoácidos de flexibilidad promedio de 191P4D12(b)v.1, v.7 y v.9 determinado por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) al que se accede por el sitio web de Protscale localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 9. Perfil de aminoácidos del giro beta de 191P4D12(b)v.1, v.7 y v.9 determinado por análisis de secuencias por algoritmo informático usando el procedimiento de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B,1987 Protein Engineering 1:289-294) al que se accede por el sitio web de Protscale localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) por el servidor de biología molecular ExPasy.
Figura 10. Alineamiento esquemático de variantes de SNP de 191P4D12(b). Las variantes 191P4D12(b) v.2 a v.5 y v.10 a v.12 son variantes con diferencias en un único nucleótido. En comparación con v.1, v.13 tuvo una inserción de tres bases (GCA) entre 1262 y 1263 y añadió un aminoácido “A” a la proteína. La variante
v.14 fue una variante de SNP de la variante del transcrito v.9, correspondiente al SNP en 2688 de v.1. Aunque estas variantes de SNP se mostraron por separado, también podrían producirse en cualquier combinación y en cualquier variante de transcrito, como se muestra en la Fig. 12, que contuvo los pares de bases: los números se corresponden con aquellos de 191P4D12(b) v.1. El recuadro negro muestra la misma secuencia que 191P4D12(b) v.1. Los SNP se indican encima del recuadro.
Figura 11. Alineamiento esquemático de variantes de proteína 191P4D12(b). Las variantes de proteína se corresponden con variantes de nucleótidos. Las variantes de nucleótidos 191P4D12(b) v.3, v.4, v.5 y v.8 codificaron la misma proteína que v.1. Las variantes de nucleótidos 191P4D12(b) v.6, v.7, v.8 y v.9 fueron variantes de corte y empalme de v.1, como se muestra en la Figura 12. La variante v.9 se tradujo en una proteína totalmente diferente distinta de las otras variantes, con dos isoformas que son diferentes entre sí por un aminoácido en 64: A o D. La variante v.13 tuvo una inserción de un aminoácido “A” en 334. Las diferencias en un único aminoácido se indicaron encima de los recuadros. Los recuadros negros representan la misma secuencia que 191P4D12(b) v.1. Los números debajo del recuadro se corresponden con 191P4D12(b) v.1.
Figura 12. Composiciones de exones de las variantes de transcrito de 191P4D12(b). La variante 191P4D12(b) v.6, v.7, v.8 y v.9 son variantes de transcrito de v.1. Las variantes v.6, v.7 y v.8 cortaron y empalmaron 202-321,1497-1571 y 2951-3013 de v.1, respectivamente. La variante v.9 fue parte del último exón de v.1. El orden de los posibles exones sobre el genoma humano se muestra en la parte inferior. No se mostraron colas de poli A en la figura. Los extremos de los de exones se muestran encima de los recuadros. Los números en “()” debajo de los recuadros se corresponden con aquellos de 191P4D12(b) v.1. Las longitudes de intrones y exones no son proporcionales.
Figura 13. Predicción de la estructura secundaria y dominios transmembrana para variantes de la proteína 191P4D12(b). La estructura secundaria de las variantes de proteína 191P4D12(b) 1 (SEC ID Nº: 127), v6 (SEC ID Nº: 128), v7 (SEC ID Nº: 129) y v9 (SEC ID Nº: 130) (Figuras 13A-D, respectivamente) se predijeron usando el procedimiento de HNN – Red neural jerárquica (Guermeur,1997, http://pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html) al que se accede por el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/). Este procedimiento predice la presencia y localización de hélices alfa, cadena extendida y bobina al azar de la secuencia de proteína primaria. También se enumera el porcentaje de la proteína en una estructura secundaria dada. Figuras 13E, 13G, 13I, 13K: Representaciones esquemáticas de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana y orientación de las variantes 1, 6, 7 y 9 de 191P4D12(b), respectivamente, basándose en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE-A database of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seiler 374:166, 1993). Figuras 13F, 13H, 13J, 13L. Representaciones esquemáticas de la probabilidad de existencia de regiones transmembrana y la orientación extracelular y intracelular de las variantes 1, 6, 7 y 9 de 191P4D12(b), respectivamente, basándose en el algoritmo TMHMM de Sonnhammer, von Heijne y Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne y Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences en Proc. de Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, pág. 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff y C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). A los algoritmos TMpred y TMHMM se accede por el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/).
Figura 14. Expresión de 191P4D12(b) por RT-PCR. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de (A) conjunto vital 1 (hígado, pulmón y riñón), conjunto vital 2 (páncreas, colon y estómago); riñón normal, conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de mama y conjunto de metástasis de cáncer; (B) metástasis de cáncer de próstata a ganglio linfático, conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de mama, conjunto de metástasis de cáncer, conjunto de cáncer de páncreas y conjunto de xenoinjerto de próstata LAPC. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. En (A) los resultados muestran fuerte expresión de 191P4D12(b) en el conjunto de cáncer de vejiga. La expresión de 191P4D12(b) también se detectó en conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de mama y conjunto de metástasis de cáncer, pero muy débilmente en el conjunto vital 1 y el conjunto vital 2. En (B) los resultados muestran fuerte expresión de 191P4D12(b) en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, mama, metástasis de cáncer y muestras de cáncer de páncreas.
Figura 15. Expresión de 191P4D12(b) en tejidos normales. Se sondaron dos transferencias Northern de múltiples tejidos (Clontech) tanto con 2 ug de ARNm/carril con la secuencia de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases (kb) se indican al lado. Los resultados muestran la expresión de un transcrito de aproximadamente 4 kb en placenta y muy débilmente en próstata, pero no en ningún otro tejido normal probado. Se detectó un transcrito de 191P4D12(b) más pequeño de aproximadamente 2,5 kb en corazón y músculo esquelético.
Figura 16. Expresión de 191P4D12(b) en especímenes de cáncer de pacientes y tejidos normales. Se extrajo ARN de un conjunto de 3 especímenes de pacientes con cáncer de vejiga, además de de próstata normal (PrN), vejiga normal (VN), riñón normal (RN), colon normal (CN), pulmón normal (PN), mama normal (MN), ovario normal (ON) y páncreas normal (PaN). Se sondó transferencia Northern con 10 ug de ARN total/carril con la secuencia de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases (kb) se indican al lado. El transcrito de 191P4D12(b) se detectó en los especímenes de cáncer de vejiga, pero no en los tejidos normales probados.
Figura 17. Expresión de 191P4D12(b) en especímenes de pacientes con cáncer de vejiga: se extrajo ARN de líneas celulares (LC) de cáncer de vejiga, vejiga normal (N) y tumores (T) de pacientes con cáncer de vejiga. Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con el fragmento de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en los tejidos tumorales de vejiga, pero no en vejiga normal. Se detectó un transcrito más pequeño en la línea celular HT1197, pero no en las otras líneas de células cancerosas probadas.
Figura 18. Expresión de 191P4D12(b) en xenoinjertos de cáncer de próstata. Se extrajo ARN de próstata normal y de xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD y LAPC-9AI. Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con el fragmento de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en todos los tejidos de xenoinjerto LAPC, pero no en próstata normal.
Figura 19. Expresión de 191P4D12(b) en especímenes de pacientes con cáncer de cuello uterino. Se extrajo ARN de cuello uterino normal, línea de células cancerosas Hela y 3 tumores (T) de pacientes con cáncer de cuello uterino. Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con el fragmento de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en 2 de los 3 tumores de cuello uterino, pero no en cuello uterino normal ni en la línea celular Hela.
Figura 20. Expresión de 191P4D12(b) en especímenes de pacientes con cáncer de pulmón. Se extrajo ARN de líneas de células (LC) cancerosas de pulmón, pulmón normal (N), tumores (T) de pacientes con cáncer de vejiga y tejido adyacente normal (Nat). Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en los tejidos tumorales de pulmón, pero no en pulmón normal ni en las líneas celulares probadas.
Figura 21. Figura 21A. Expresión de 191P4D12(b) en cáncer de pulmón. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de cáncer de pulmón. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 97% de los 31 especímenes de pacientes con cáncer de pulmón probados. Figura 21B. Expresión de 191P4D12(b) en cáncer de vejiga. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de cáncer de vejiga. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para el fragmento SSH de 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 94% de los 18 especímenes de pacientes con cáncer de vejiga probados. Figura 21C. Expresión de 191P4D12(b) en cáncer de próstata. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de cáncer de próstata, y cuatro xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC . La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 100% de los 20 especímenes de pacientes con cáncer de próstata probados, y en los 4 xenoinjertos de cáncer de próstata. Figura 21D. Expresión de 191P4D12(b) en cáncer de colon. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de cáncer de colon. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 100% de los 22 especímenes de pacientes con cáncer de colon probados. Figura 21 E. Expresión de 191P4D12(b) en cáncer de útero. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de cáncer de útero. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para el fragmento SSH de 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 100% de los 12 especímenes de pacientes con cáncer de útero probados. Figura 21F. Expresión de 191P4D12(b) en cáncer de cuello uterino. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes con cáncer de cuello uterino. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 100% de los 14 especímenes de pacientes con cáncer de cuello uterino probados.
Figura 22. Expresión transitoria de 191P4D12(b) en células 293T transfectadas. Células 293T se transfectaron con tanto 191P4D12(b).pTag5, 191P4D12(b).pcDNA3.1/MycHis como el vector control pcDNA3.1/MycHis. Cuarenta horas después se recogieron los lisados celulares y el sobrenadante. Se ejecutaron muestras sobre un gel de acrilamida de SDS-PAGE, se transfirieron y se tiñeron con anticuerpo anti-His. La transferencia se reveló usando el kit de quimioluminiscencia ECL y se visualizó por autorradiografía. Los resultados muestran la expresión del plásmido 191P4D12(b).pTag5 del dominio extracelular de 191P4D12(b) en el lisado (Carril 2) y la secreción en el sobrenadante de cultivo (Carril 1). Por tanto, la expresión de 191P4D12(b) se detectó en los lisados de células transfectadas con 191P4D12(b).pcDNA3.1/MycHis (Carril 3), pero no con pcDNA3.1/MycHis de control (Carril 4).
Figura 23. Expresión de 191P4D12(b) en células transducidas tras la transferencia de genes retrovíricos. Células 3T3 se transdujeron con el vector retrovírico pSR que codifica el gen 191P4D12(b). Tras la selección con neomicina, las células se expandieron y se extrajo ARN. Se sondó transferencia Northern con 10 ug de ARN total/carril con la secuencia de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases (kb) se indican al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) accionada a partir de LTR retrovírico, que migra más lentamente que el transcrito de 191P4D12(b) de 4 kb endógeno detectado en el control positivo LAPC-4AD.
Descripción detallada de la invención
Esquema de secciones
I.) Definiciones II.) Polinucleótidos 191P4D12(b)
II.A.) Usos de polinucleótidos 191P4D12(b)
II.A.1.) Monitorización de anomalías genéticas II.A.2.) Cebadores y pares de cebadores II.A.3.) Aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que codifican 191P4D12(b) II.A.4) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas de huésped-vector
III.) Proteínas relacionadas con 191P4D12(b)
III.A.) Realizaciones de proteína que llevan motivo III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con 191P4D12(b)
IV) Procedimientos para la detección de 191P4D12(b) V) Procedimientos para monitorizar el estado de genes relacionados con 191P4D12(b) y sus productos VI) Realizaciones de diagnóstico y pronóstico de 191P4D12(b). VII) KITS/artículos de fabricación
I.) Definiciones:
A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la materia, notaciones y otros términos científicos o terminología usada en el presente documento pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquellos expertos en la materia a la que se refiere la presente invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para claridad y/o para fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no debe interpretarse necesariamente que represente una diferencia sustancial con respecto a lo que generalmente se entiende en la materia. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o citados en el presente documento son muy entendidos y comúnmente empleados usando metodología convencional por aquellos expertos en la materia tal como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente según protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.
Los términos “cáncer de próstata avanzado”, “cáncer de próstata localmente avanzado”, “enfermedad avanzada” y “enfermedad localmente avanzada” significa cánceres de próstata que se han extendido por la cápsula de la próstata y pretenden incluir enfermedad en estado C bajo el sistema de la Asociación urológica americana (AUA), enfermedad de estado C1 - C2 bajo el sistema de Whitmore-Jewett y enfermedad de estado T3 - T4 y N+ bajo el sistema de TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, la cirugía no se recomienda para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen desenlaces sustancialmente menos favorables en comparación con pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado al órgano). La enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente por pruebas palpables de induración más allá del límite lateral de la próstata, o asimetría o induración por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica presentemente patológicamente tras prostatectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.
“Alterar el patrón de glucosilación nativo” está previsto para los fines en el presente documento que signifique delecionar uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en la secuencia nativa de 191P4D12(b) (tanto eliminando el sitio de glucosilación subyacente como delecionando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de 191P4D12(b). Además, el término incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de hidrato de carbono presentes.
El término “análogo” se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con 191P4D12(b)). Por ejemplo, un análogo de una proteína 191P4D12(b) puede unirse específicamente por un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a 191P4D12(b).
El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio. Por tanto, un “anticuerpo” puede producirse naturalmente o producirse por el hombre tal como anticuerpos monoclonales producidos por tecnología de hibridomas convencional. Los anticuerpos anti-191P4D12(b) comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales, además de fragmentos que contienen el dominio de unión a antígeno y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos.
Un “fragmento de anticuerpo” se define como al menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une a su diana, es decir, la región de unión a antígeno. En una realización cubre específicamente anticuerpos anti-191P4D12(b) individuales y clones de los mismos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpo anti-191P4D12(b) con especificidad poliepitópica.
El término “secuencias de codón optimizado” se refiere a secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para una especie de huésped particular reemplazando cualquier codón que tenga una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20%. Las secuencias de nucleótidos que han sido optimizadas para la expresión en una especie de huésped dada por eliminación de secuencias de poliadenilación falsas, eliminación de señales de corte y empalme de exones/intrones, eliminación de repeticiones similares a transposón y/u optimización del contenido de GC, además de optimización de codones, se denominan en el presente documento “secuencias de expresión potenciada”.
Una “biblioteca combinatoria” es una colección de diversos compuestos químicos generada por tanto síntesis química como síntesis biológica combinando varios “bloques de unión” químicos tal como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal, tal como una biblioteca de polipéptidos (por ejemplo, muteína), se forma combinando un conjunto de bloques de construcción químicos llamados aminoácidos de cualquier forma posible para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto de polipéptido). Numerosos compuestos químicos se sintetizan por tal mezcla combinatoria de bloques de construcción químicos (Gallop y col., J. Med. Chem. 37(9):1233-1251 (1994)).
La preparación y cribado de bibliotecas combinatorias es muy conocido para aquellos expertos en la materia. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero no se limitan a, bibliotecas de péptidos (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.010.175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton y col., Nature, 354:84-88 (1991)), peptoides (publicación PCT nº WO 91/19735), péptidos codificados (publicación PCT WO 93/20242), biooligómeros al azar (publicación PCT WO 92/00091), benzodiazepinas (patente de EE.UU. nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara y col., J. Amer. Chem. Soc,114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje de beta-D-glucosa (Hirschmann y col., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen y col., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho y col., Science 261:1303 (1993)) y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell y col., J. Org. Chem. 59:658 (1994)). Véanse, generalmente, Gordon y col., J. Med. Chem. 37:1385 (1994), bibliotecas de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Stratagene, Corp.), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Vaughn y col., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996) y el documento PCT/US96/10287), bibliotecas de hidratos de carbono (véanse, por ejemplo, Liang y col., Science 274:1520-1522 (1996) y la patente de EE.UU. nº 5.593.853) y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véanse, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum, C&EN, Jan 18, página 33 (1993); isoprenoides, patente de EE.UU. nº 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente de EE.UU. nº 5.549.974; pirrolidinas, patentes de EE.UU. nº 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, patente de EE.UU. nº 5.506.337; benzodiazepinas, patente de EE.UU. nº 5.288.514; y similares).
Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están comercialmente disponibles (véanse, por ejemplo, 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA). También se han desarrollado varios sistemas robóticos muy conocidos para químicas en fase de disolución. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas tales como el aparato de síntesis automatizado desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos robóticos (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.), que imitan las operaciones sintéticas manuales realizadas por un químico. Cualquiera de los dispositivos anteriores es adecuado para su uso con la presente invención. La naturaleza e implementación de las modificaciones a estos dispositivos (si las hay) de manera que puedan operar como se ha tratado en el presente documento serán evidentes para expertos en la materia relevante. Además, numerosas bibliotecas combinatorias están comercialmente disponibles por sí mismas (véanse, por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD; etc.).
El término “agente citotóxico” se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de células, función de células y/o produce la destrucción de células. El término está previsto que incluya isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas. Ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, auristatinas, auromicinas, maitansinoides, itrio, bismuto, ricina, cadena de ricina A, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorubicina, daunorubicina, taxol, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracenodiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de Saponaria officinalis y glucocorticoide, y otros agentes quimioterapéuticos, además de radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213, P32 e isótopos radiactivos de Lu que incluyen Lu177. Los anticuerpos también pueden conjugarse con una enzima activante de pro-fármaco anticancerígeno que puede convertir el pro-fármaco en su forma activa.
El “producto génico” se denomina algunas veces en el presente documento una proteína o ARNm. Por ejemplo, un “producto génico de la invención” se denomina algunas veces en el presente documento una “secuencia de aminoácidos de cáncer”, “proteína de cáncer”, “proteína de un cáncer enumerado en la Tabla I”, un “ARNm de cáncer”, “ARNm de un cáncer enumerado en la Tabla I”, etc. En una realización, la proteína de cáncer está codificada por un ácido nucleico de la Figura 2. La proteína de cáncer puede ser un fragmento, o alternativamente, ser la proteína de longitud completa para el fragmento codificado por los ácidos nucleicos de la Figura 2. En una realización, una secuencia de aminoácidos de cáncer se usa para determinar la identidad de secuencias o similitud. En otra realización, las secuencias son variantes alélicas que se producen naturalmente de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura 2. En otra realización, las secuencias son variantes de secuencia como se han descrito adicionalmente en el presente documento.
Los ensayos de “cribado de alto rendimiento” para la presencia, ausencia, cuantificación u otras propiedades de ácidos nucleicos particulares o productos de proteína son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Similarmente, los ensayos de unión y los ensayos de genes indicadores son similarmente muy conocidos. Por tanto, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.559.410 desvela procedimientos de cribado de alto rendimiento para proteínas; la patente de EE.UU. nº 5.585.639 desvela procedimientos de cribado de alto rendimiento para la unión a ácido nucleico (es decir, en matrices); mientras que las patentes de EE.UU. nº 5.576.220 y 5.541.061 desvelan procedimientos de alto rendimiento de cribado para la unión de ligando/anticuerpo.
Además, los sistemas de cribado de alto rendimiento están comercialmente disponibles (véanse, por ejemplo, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA; etc.). Estos sistemas normalmente automatizan procedimientos enteros, que incluyen todo el pipeteado de muestras y reactivos, dispensación de líquidos, incubaciones controladas y lecturas finales de la microplaca en detector(es) apropiado(s) para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan alto rendimiento y rápido arranque, además de un alto grado de flexibilidad y personalización. Los fabricantes de tales sistemas proporcionan protocolos detallados para diversos sistemas de alto rendimiento. Por tanto, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen sistemas de cribado para detectar la modulación de la transcripción de genes, unión a ligando y similares.
El término “homólogo” se refiere a una molécula que presenta homología con otra molécula, por ejemplo, teniendo secuencias de residuos químicos que son iguales o similares en las posiciones correspondientes.
El “antígeno leucocitario humano” o “HLA” es una proteína del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) humano de clase I o clase II (véase, por ejemplo, Stites y col., IMMUNOLOGY, 8ª ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).
Los términos “hibridar”, “hibridando”, “se hibrida” y similares, usados en el contexto de polinucleótidos, pretenden referirse a condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como hibridación en 50% de formamida/6X SSC/0,1% de SDS/100 µg/ml de ADNmc, en las que las temperaturas para la hibridación están por encima de 37 grados C y las temperaturas para lavar en 0,1X SSC/0,1% de SDS están por encima de 55 grados C.
Los términos “aislado” o “biológicamente puro” se refieren a material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. Por tanto, los péptidos aislados según la invención no contienen preferentemente materiales normalmente asociados a los péptidos en su entorno in situ. Por ejemplo, un polinucleótido se dice que está “aislado” cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que se corresponden o son complementarios a genes distintos de los genes 191P4D12(b) o que codifican polipéptidos distintos del producto del gen 191P4D12(b) o fragmentos del mismo. Un experto puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido 191P4D12(b) aislado. Una proteína se dice que está “aislada”, por ejemplo, cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos o químicos para eliminar las proteínas 191P4D12(b) de constituyentes celulares que normalmente están asociados a la proteína. Un experto puede emplear fácilmente procedimientos de purificación convencionales para obtener una proteína 191P4D12(b) aislada. Alternativamente, una proteína aislada puede prepararse por medios químicos.
El término “mamífero” se refiere a cualquier organismo clasificado como mamífero, que incluye ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un ser humano.
Los términos “cáncer de próstata metastásico” y “enfermedad metastásica” significan cánceres de próstata que se han diseminado a ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes y pretenden incluir enfermedad en estado D bajo el sistema AUA y estado TxNxM+ bajo el sistema TNM. Como es el caso con cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía no es generalmente indicada para pacientes con enfermedad metastásica, y la terapia hormonal (ablación de andrógenos) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico eventualmente desarrollan un estado resistente a andrógenos en el plazo de 12 a 18 meses desde el inicio del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes resistentes a andrógenos mueren en el plazo de 6 meses después de desarrollar ese estado. El sitio más común para la metástasis de cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis de hueso por cáncer de próstata son frecuentemente osteoblásticas en vez de osteolíticas (es decir, que producen la formación de hueso neta). Las metástasis ósea se encuentran lo más frecuentemente en la espina dorsal, seguido del fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros sitios comunes para metástasis incluyen ganglios linfáticos, pulmón, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastásico se diagnostica normalmente por linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, barridos con radionúclidos del cuerpo entero, radiografía esquelética y/o biopsia de lesión ósea.
El término “modulador” o “compuesto de prueba” o “candidato a fármaco” o equivalentes gramaticales como se usan en el presente documento describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., que vaya a probarse para la capacidad para alterar directamente o indirectamente el fenotipo del cáncer o la expresión de una secuencia de cáncer, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos o de proteínas, o efectos de secuencias de cáncer (por ejemplo, señalización, expresión génica, interacción de proteínas, etc.). En un aspecto, un modulador neutralizará el efecto de una proteína de cáncer de la invención. Por “neutralizar” se indica que una actividad de una proteína se inhibe o bloquea, junto con el efecto consecuente sobre la célula. En otro aspecto, un modulador neutralizará el efecto de un gen, y su proteína correspondiente, de la invención normalizando niveles de dicha proteína. En realizaciones preferidas, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o perfiles de expresión de ácidos nucleicos o proteínas proporcionados en el presente documento, o vías efectoras en la dirección 3'. En una realización, el modulador suprime un fenotipo de cáncer, por ejemplo, para una huella de tejido normal. En otra realización, un modulador indujo un fenotipo de cáncer. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo se ejecuta en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve de control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección.
Moduladores, candidatos a fármaco o compuestos de prueba engloban numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños, que tienen un peso molecular superior a 100 e inferior a aproximadamente 2.500 Dalton. Moléculas pequeñas preferidas son inferiores a 2000, o inferiores a 1500 o inferiores a 1000 o inferiores a 500 D. Agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente unión a hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente se prefieren péptidos. Una clase de moduladores son péptidos, por ejemplo, de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, prefiriéndose de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos, y prefiriéndose particularmente de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Preferentemente, la proteína moduladora del cáncer es soluble, incluye una región no transmembrana y/o tiene una Cys del extremo N para ayudar en la solubilidad. En una realización, el extremo C del fragmento se mantiene como un ácido libre y el extremo N es una amina libre para ayudar en el acoplamiento, es decir, a cisteína. En una realización, una proteína de cáncer de la invención está conjugada con un agente inmunogénico como se trata en el presente documento. En una realización, la proteína de cáncer está conjugada con BSA. Los péptidos de la invención, por ejemplo, de longitudes preferidas, pueden ligarse entre sí o a otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más largo. Los péptidos moduladores pueden ser digestos de proteínas que se producen naturalmente como se ha explicado brevemente anteriormente, péptidos al azar o péptidos al azar “sesgados”. En una realización preferida, los moduladores basados en péptidos/proteínas son anticuerpos, y fragmentos de los mismos, como se define en el presente documento.
Los moduladores de cáncer también pueden ser ácidos nucleicos. Los agentes moduladores de ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos que se producen naturalmente, ácidos nucleicos al azar o ácidos nucleicos al azar “sesgados”. Por ejemplo, pueden usarse digestos de genomas procariotas o eucariotas en un enfoque análogo al explicado brevemente anteriormente para proteínas.
El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que están presentes en cantidades menores.
Un “motivo”, como en motivo biológico de una proteína relacionada con 191P4D12(b), se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada a una función particular (por ejemplo, interacción proteína-proteína, interacción proteína-ADN, etc.) o modificación (por ejemplo, que está fosforilada, glucosilada o amidada), o localización (por ejemplo, secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que guarda relación con ser inmunogénica, tanto humoralmente como celularmente. Un motivo puede ser tanto contiguo como puede estar alineado con ciertas posiciones que generalmente guardan relación con una cierta función o propiedad. En el contexto de motivos de HLA, “motivo” se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, normalmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para un motivo de HLA de clase I HLA y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para un motivo de HLA de clase II HLA, que es reconocido por una molécula de HLA particular. Los motivos de péptido para unión a HLA son normalmente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y se diferencian en el patrón de los residuos de anclaje primarios y secundarios.
Un “excipiente farmacéutico” comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservantes y similares.
“Farmacéuticamente aceptables” se refiere a una composición no tóxica, inerte y/o que es fisiológicamente compatible con seres humanos u otros mamíferos.
El término “polinucleótido” significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretende incluir formas mono y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la materia, este término se usa frecuentemente indistintamente con “oligonucleótido”. Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento en la que la timidina (T), como se muestra, por ejemplo, en la Figura 2, también puede ser uracilo (U); esta definición se refiere a las diferencias entre las estructuras químicas de ADN y ARN, en particular la observación de que una de las cuatro bases principales en el ARN es uracilo (U) en lugar de timidina (T).
El término “polipéptido” significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. En toda la memoria descriptiva se usan las designaciones de tres letras o de una letra convencionales para aminoácidos. En la materia, este término se usa frecuentemente indistintamente con “péptido” o “proteína”.
Un “residuo de anclaje primario” de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia de péptidos que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. Uno a tres, normalmente dos, residuos de anclaje primarios dentro de un péptido de longitud definida definen generalmente un “motivo” para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos residuos se ajustan en estrecho contacto con el surco de unión a péptido de una molécula de HLA, con sus cadenas laterales enterradas en bolsillos específicos del surco de unión. En una realización, por ejemplo, los residuos de anclaje primarios para una molécula de clase I de HLA están localizados en la posición 2 (desde la posición del extremo amino) y en la posición del extremo carboxilo de un epítope de péptido de 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos según la invención. Alternativamente, en otra realización, los residuos de anclaje primarios de un péptido que se unen a una molécula de clase II de HLA están separados los unos con respecto a los otros en vez de con respecto a los extremos de un péptido, en los que el péptido tiene generalmente al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones de anclaje primarias para cada motivo y supermotivo se exponen en la Tabla IV. Por ejemplo, pueden crearse péptidos análogos alterando la presencia o ausencia de residuos particulares en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias mostradas en la Tabla IV. Tales análogos se usan para modular la afinidad de unión y/o cobertura de la población de un péptido que comprende un motivo o supermotivo de HLA particular.
“Radioisótopos” incluyen, pero no se limitan a, los siguientes (también se exponen usos a modo de ejemplo no limitantes): Ejemplos de isótopos médicos:
Isótopo Descripción de uso
Actinio-225 (Ac-225) Véase Torio-229 (Th-229)
Actinio-227 (Ac-227) Padre del Radio-223 (Ra-223) que es un emisor alfa usado para tratar metástasis en el esqueleto resultantes de cáncer (es decir, cánceres de mama y próstata), e radioinmunoterapia para el cáncer
Bismuto-212 (Bi-212) Véase Torio-228 (Th-228)
Bismuto-213 (Bi-213) Véase Torio-229 (Th-229)
Cadmio-109 (Cd-109) Detección de cáncer
Cobalto-60 (Co-60) Fuente de radiación para radioterapia de cáncer, para irradiadores de alimentos y para la esterilización de aparatos médicos
Cobre-64 (Cu-64) Un emisor de positrones usado para terapia contra el cáncer y obtención de imágenes por SPECT
Cobre-67 (Cu-67) Emisor beta/gamma usado en radioinmunoterapia para el cáncer y estudios de diagnóstico (es decir, cánceres de mama y de colon, y linfoma)
Disprosio-166 (Dy-166) Radioinmunoterapia para el cáncer
Erbio-169 (Er-169) Tratamiento de artritis reumatoide, particularmente para las articulaciones pequeñas asociadas a los dedos de las manos y los dedos de los pies
Europio-152 (Eu-152) Fuente de radiación para irradiación de alimentos y para la esterilización de aparatos médicos
Europio-154 (Eu-154) Fuente de radiación para irradiación de alimentos y para la esterilización de aparatos médicos
Gadolinio-153 (Gd-153) Detección de osteoporosis y dispositivos de seguridad de calidad médica nuclear
Oro-198 (Au-198) Implante y terapia para intracavidad de cánceres de ovario, próstata y cerebral
Holmio-166 (Ho-166) Tratamiento de múltiples mielomas en terapia esquelética dirigida, inmunoterapia para el cáncer, ablación de médula ósea y tratamiento de artritis reumatoide
Yodo-125 (I-125) Detección de osteoporosis, obtención de imágenes de diagnóstico, fármacos trazadores, tratamiento de cáncer cerebral, radiomarcado, obtención de imágenes de tumores, mapeo de receptores en el cerebro, radioterapia intersticial, braquiterapia para tratamiento de cáncer de próstata, determinación de la tasa de filtración glomerular (GFR), determinación del volumen de plasma, detección de trombosis venosa profunda en las piernas
Yodo-131 (I-131) Evaluación de la función tiroidea, detección de enfermedad de tiroides, tratamiento de cáncer de tiroides, además de otras enfermedades de tiroides no malignas (es decir, enfermedad de Graves, bocios e hipertiroidismo), tratamiento de leucemia, linfoma y otras formas de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama) usando radioinmunoterapia
Iridio-192 (Ir-192) Braquiterapia, tratamiento de tumor cerebral y de médula espinal, tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) e implantes para tumores de mama y de próstata
Lutecio-177 (Lu-177) Inmunoterapia para el cáncer y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis)
Molibdeno-99 (Mo-99) Padre del Tecnecio-99m (Tc-99m) que se usa para la obtención de imágenes del cerebro, hígado, pulmones, corazón y otros órganos. Actualmente, el Tc-99m es el radioisótopo más ampliamente usado para la obtención de imágenes de diagnóstico de diversos cánceres y enfermedades en las que participa el cerebro, corazón, hígado, pulmones; también se usa en la detección de trombosis venosa profunda en las piernas
Osmio-194 (Os-194) Inmunoterapia para el cáncer
Paladio-103 (Pd-103) Tratamiento de cáncer de próstata
Platino-195m (Pt-195m) Estudios de biodistribución y metabolismo de cisplatino, un fármaco quimioterapéutico
Fósforo-32 (P-32) Policitemia roja vera (enfermedad de los glóbulos de la sangre) y tratamiento de leucemia, diagnóstico/tratamiento de cáncer de huesos; tratamiento de cáncer de colon, pancreático y de hígado; radiomarcado de ácidos nucleicos para investigación in vitro, diagnóstico de tumores superficiales, tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis) y terapia para intracavidad
Fósforo-33 (P-33) Tratamiento de leucemia, diagnóstico/tratamiento de enfermedad de los huesos, radiomarcado y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis)
Radio-223 (Ra-223) Véase Actinio-227 (Ac-227)
Renio-186 (Re-186) Alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de artritis reumatoide y diagnóstico y tratamiento de linfoma y cánceres de huesos, mama, colon y de hígado usando radioinmunoterapia
Renio-188 (Re-188) Diagnóstico y tratamiento de cáncer usando radioinmunoterapia, alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de artritis reumatoide y tratamiento de cáncer de próstata
Rodio-105 (Rh-105) Inmunoterapia para el cáncer Samario-145 (Sm-145) Tratamiento de cáncer ocular Samario-153 (Sm-153) Inmunoterapia para el cáncer y alivio de dolor por cáncer de huesos Escandio-47 (Sc-47) Inmunoterapia para el cáncer y alivio de dolor por cáncer de huesos Selenio-75 (Se-75) Radiotrazador usado en estudios del cerebro, obtención de imágenes de la corteza
suprarrenal por gamma-escintigrafía, localizaciones laterales de tumores secretantes esteroides, barrido pancreático, detección de glándulas paratiroideas hiperactivas, medida de la tasa de pérdida de ácido biliar del conjunto endógeno
Estroncio-85 (Sr-85) Detección de cáncer de huesos y barridos del cerebro Estroncio-89 (Sr-89) Alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de mieloma múltiple y terapia
osteoblástica Tecnecio-99m (Tc-99m) Véase Molibdeno-99 (Mo-99) Torio-228 (Th-228) Padre del Bismuto-212 (Bi-212) que es un emisor alfa usado en inmunoterapia para
el cáncer Torio-229 (Th-229) Padre del Actinio-225 (Ac-225) y abuelo del Bismuto-213 (Bi-213) que son emisores alfa usados en inmunoterapia para el cáncer Tulio-170 (Tm-170) Fuente gamma para irradiadores de sangre, fuente de energía para dispositivos
médicos implantados Estaño-117m (Sn-117m) Inmunoterapia para el cáncer y alivio de dolor por cáncer de huesos Tungsteno-188 (W-188) Padre del Renio-188 (Re-188) que se usa para diagnósticos/tratamiento de cáncer,
alivio de dolor por cáncer de huesos, tratamiento de artritis reumatoide y tratamiento de arterias bloqueadas (es decir, arteriosclerosis y reestenosis)
Xenón-127 (Xe-127) Obtención de imágenes neuronales de trastornos del cerebro, estudios de SPECT de alta resolución, pruebas de la función pulmonar y estudios de circulación sanguínea cerebral
Iterbio-175 (Yb-175) Inmunoterapia para el cáncer Itrio-90 (Y-90) Microsemillas obtenidas de irradiar Itrio-89 (Y-89) para el tratamiento de cáncer de hígado
Itrio-91 (Y-91) Una marca gamma-emisora para Itrio-90 (Y-90) que se usa para inmunoterapia para el cáncer (es decir, linfoma, cánceres de mama, colon, riñón, pulmón, ovario, próstata, pancreático y de hígado inoperable)
Por “aleatorizado” o equivalentes gramaticales como se aplican en el presente documento a ácidos nucleicos y proteínas se indica que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos esencialmente al azar, respectivamente. Estos péptidos al azar (o ácidos nucleicos, tratados en el presente documento) pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El procedimiento sintético puede diseñarse para generar
5 proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o casi todas las posibles combinaciones sobre la longitud de la secuencia, formándose así una biblioteca de agentes proteináceos bioactivos candidatos aleatorizados.
Una biblioteca puede ser “completamente aleatorizada”, sin ninguna preferencia o constante de secuencia en cualquier posición. En otra realización, la biblioteca es una biblioteca “al azar sesgada”. Es decir, algunas posiciones 10 dentro de la secuencia tanto se mantienen constantes como están seleccionadas de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, los nucleótidos o residuos de aminoácidos se aleatorizan dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrófobos, residuos hidrófilos, residuos estéricamente sesgados (tanto pequeños como grandes), hacia la creación de dominios de unión a ácido nucleico, la creación de cisteínas, para reticulación, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o para purinas,
15 etc.
Una molécula de ADN o ARN “recombinante” es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro.
Ejemplos no limitantes de moléculas pequeñas incluyen compuestos que se unen o interactúan con 191P4D12(b), ligandos que incluyen hormonas, neuropéptidos, quimiocinas, fragancias, fosfolípidos y equivalentes funcionales de 20 los mismos que se unen y preferentemente inhiben la función de proteínas 191P4D12(b). Tales moléculas pequeñas no limitantes tienen preferentemente un peso molecular inferior a aproximadamente 10 kDa, más preferentemente inferior a aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. En ciertas realizaciones, las moléculas pequeñas se asocian físicamente con, o se unen a, proteína 191P4D12(b); no se encuentran en rutas metabólicas que se producen naturalmente; y/o son más solubles
en disoluciones acuosas que en no acuosas
La “rigurosidad” de reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para la apropiada hibridación, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende generalmente de la capacidad de las secuencias de ácidos nucleicos desnaturalizadas para rehibridarse cuando están presentes las cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que pueda usarse. Como resultado, de esto resulta que las mayores temperaturas relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas menores a menos rigurosas. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
“Condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, como se define en el presente documento, se identifican por, pero no se limitan a, aquellas que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado a alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC. “Condiciones moderadamente rigurosas” se describen por, pero no se limitan a, aquellas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de disolución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de sonda y similares.
Un “supermotivo” de HLA es una especificidad de unión a péptido compartida por moléculas de HLA codificadas por dos o más alelos de HLA. Las frecuencias fenotípicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas se exponen en la Tabla IV (F). Los constituyentes no limitantes de diversos supertipos son del siguiente modo:
A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A* 0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207 A3: A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101 B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602 B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006) A1: A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001 A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003 B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08 B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58 B62: B*460.1, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77)
La cobertura de la población calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA se expone en la Tabla IV (G).
Como se usa en el presente documento, “para tratar” o “terapéutico” y términos gramaticalmente relacionados se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de enfermedad, tal como supervivencia prolongada, menos morbilidad y/o una reducción de efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; no se requiere erradicación completa de la enfermedad.
Un “animal transgénico” (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal o un antepasado del animal en un estado prenatal, por ejemplo, embrionario. Un “transgén” es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico.
Como se usa en el presente documento, una “vacuna” de respuesta inmunitaria a HLA o celular es una composición que contiene o codifica uno o más péptidos de la invención. Hay numerosas realizaciones de tales vacunas, tales como una mezcla de uno o más péptidos individuales; comprendiendo uno o más péptidos de la invención un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican tales péptidos o polipéptidos individuales, por ejemplo, un minigen que codifica un péptido poliepitópico. El “uno o más péptidos” puede incluir cualquier número entero unitario de 1-150 o más, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 ó 150 o más péptidos de la invención. Los péptidos o polipéptidos pueden modificarse opcionalmente tal como por lipidación, adición de secuencias que eligen diana u otras secuencias. Los péptidos de clase I de HLA de la invención pueden mezclarse con, o ligarse a, péptidos de clase II de HLA para facilitar la activación de tanto linfocitos T citotóxicos como linfocitos T colaboradores. Las vacunas de HLA también pueden comprender células presentadoras de antígeno pulsadas por péptido, por ejemplo, células dendríticas.
El término “variante” se refiere a una molécula que presenta una variación de un tipo o norma descrita, tal como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácidos diferentes en la(s) posición (posiciones) correspondiente(s) de una proteína específicamente descrita, por ejemplo, la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura
3. Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de corte y empalme y polimorfismos de un único nucleótido (SNP) son otros ejemplos de variantes.
Las “proteínas relacionadas con 191P4D12(b)” de la invención incluyen aquellas específicamente identificadas en el presente documento, además de variantes alélicas, variantes de sustitución conservativa, análogos y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentación adicional siguiendo los procedimientos explicados brevemente en el presente documento o fácilmente disponibles en la materia. También están incluidas las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas 191P4D12(b) o fragmentos de las mismas, además de proteínas de fusión de una proteína 191P4D12(b) y un polipéptido heterólogo. Tales proteínas 191P4D12(b) se denominan en conjunto las proteínas relacionadas con 191P4D12(b), las proteínas de la invención,
o 191P4D12(b). El término “proteína relacionada con 191P4D12(b)” se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de proteínas 191P4D12(b) de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 ó 576 o más aminoácidos.
II.) Polinucleótidos 191P4D12(b)
La invención se refiere a polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen 191P4D12(b), ARNm y/o secuencia codificante, preferentemente en forma aislada, que incluyen polinucleótidos que codifican una proteína relacionada con 191P4D12(b) y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN y moléculas relacionadas, polinucleótidos o oligonucleótidos complementarios a un gen 191P4D12(b) o secuencia de ARNm o una parte de la misma, y polinucleótidos o oligonucleótidos que se hibridan con un gen 191P4D12(b), ARNm o con un polinucleótido que codifica 191P4D12(b) (en conjunto “polinucleótidos 191P4D12(b)”). En todos los casos en los que se refiere a esta sección, T también puede ser U en la Figura 2.
Realizaciones de un polinucleótido 191P4D12(b) incluyen: un polinucleótido 191P4D12(b) que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleótidos de 191P4D12(b) como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, realizaciones de nucleótidos de 191P4D12(b) comprenden, sin limitación:
(I)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia como se muestra en la Figura 2, en el que T también puede ser U;
(II)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2A, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(III) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2B, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(IV)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2C, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(V)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2D, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(VI)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2E, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(VII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2F, desde el residuo de nucleótido número 789 hasta el residuo de nucleótido número 1676, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(VIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2G, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1721, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(IX)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2H, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(X)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2I, desde el residuo de nucleótido número 708 hasta el residuo de nucleótido número 1121, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XI)
un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2J, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2K, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2L, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1796, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XIV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2M, desde el residuo de nucleótido número 264 hasta el residuo de nucleótido número 1799, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia como se muestra en la Figura 2N, desde el residuo de nucleótido número 708 hasta el residuo de nucleótido número 1121, incluyendo el codón de parada, en el que T también puede ser U;
(XVI) un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con 191P4D12(b) que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% homóloga a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-N;
(XVII) un polinucleótido que codifica una proteína relacionada con 191P4D12(b) que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-N;
(XVIII) un polinucleótido que codifica al menos un péptido expuesto en las Tablas VIII-XXI y XXII-XLIX;
(XIX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de las Figuras 3A-B y 3E-G en cualquier incremento de número entero hasta 510 que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13,14,15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A-B y 3E-G en cualquier incremento de número entero hasta 510 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A-B y 3E-G en cualquier incremento de número entero hasta 510 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A-B y 3E-G en cualquier incremento de número entero hasta 510 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A-B y 3E-G en cualquier incremento de número entero hasta 510 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXIV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 295 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 295 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXVI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 295 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXVII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 295 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXVIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 295 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXIX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3D en cualquier incremento de número entero hasta 485 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3D en cualquier incremento de número entero hasta 485 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXXI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3D en cualquier incremento de número entero hasta 485 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXXII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12, 3, 14, 5, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3D en cualquier incremento de número entero hasta 485 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXXIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7; 8, 9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3D en cualquier incremento de número entero hasta 485 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXXIV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3H en cualquier incremento de número entero hasta 511 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXXV) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3H en cualquier incremento de número entero hasta 511 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXXVI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3H en cualquier incremento de número entero hasta 511 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXXVII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3H en cualquier incremento de número entero hasta 511 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXXVIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3H en cualquier incremento de número entero hasta 511 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9
(XXXIX) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3I-J en cualquier incremento de número entero hasta 137 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XL) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27; 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3I-J en cualquier incremento de número entero hasta 137 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XLI) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3I-J en cualquier incremento de número entero hasta 137 que incluye 1, 2, 3, 4, 5. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XLII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3I-J en cualquier incremento de número entero hasta 137 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XLIII) un polinucleótido que codifica una región de péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3I-J en cualquier incremento de número entero hasta 137 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9
(XLIV) un polinucleótido que es completamente complementario a un polinucleótido de una cualquiera de (I)(XLIII).
(XLV) un péptido que está codificado por cualquiera de (I) a (XLIV); y
(XLVI) una composición que comprende un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIII) o péptido de (XLV) junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana,
(XLVII) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIV) o péptido de (XLV) o una composición de (XLVI) en un procedimiento para modular una célula que expresa 191P4D12(b),
(XLVIII) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIV) o péptido de (XLV) o una composición de (XLVI) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa 191P4D12(b)
(XLIX) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIV) o péptido de (XLV) o una composición de (XLVI) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa 191P4D12(b), dicha célula de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I;
(L)
un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIV) o péptido de (XLV) o una composición de (XLVI) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer;
(LI)
un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIV) o péptido de (XLV) o una composición de (XLVI) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I; y,
(LII) un procedimiento de uso de un polinucleótido de cualquiera de (I)-(XLIV) o péptido de (XLV) o una composición de (XLVI) en un procedimiento para identificar o caracterizar un modulador de una célula que expresa 191P4D12(b).
Como se usa en el presente documento, se entiende que un intervalo desvela específicamente todas las posiciones unitarias completas del mismo.
Polinucleótidos 191P4D12(b) típicos codifican porciones específicas de secuencias de ARNm de 191P4D12(b) (y aquellas que son complementarias a tales secuencias) tales como aquellas que codifican las proteínas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo:
(a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 505 ó 510 o más aminoácidos contiguos de la variante 1 de 191P4D12(b); las longitudes máximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 510 aminoácidos; variante 6, 295 aminoácidos, variante 7, 485 aminoácidos, variante 10, 510 aminoácidos, variante 11, 510 aminoácidos, variante 12, 510 aminoácidos, variante 13, 511 aminoácidos, variante 9, 137 aminoácidos, y variante 14,137 aminoácidos.
Por ejemplo, polinucleótidos representativos incluyen: polinucleótidos y sus péptidos codificados por sí mismos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína 191P4012(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, en incrementos de aproximadamente 10 aminoácidos, terminando en el aminoácido del extremo carboxilo expuesto en la Figura 2 o la Figura 3. Por consiguiente, los polinucleótidos que codifican partes de la secuencia de aminoácidos (de aproximadamente 10 aminoácidos) de los aminoácidos 100 al aminoácido del extremo carboxilo de la proteína 191P4D12(b) son realizaciones de la invención. En los que se entiende que cada posición de aminoácido particular desvela esa posición más o menos cinco residuos de aminoácidos.
Los polinucleótidos que codifican porciones relativamente largas de una proteína 191P4D12(b) también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 ó 30 ó 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 30 ó 40 ó 50 etc.) de la proteína 191P4D12(b) “o variante” mostrada en la Figura 2 o la Figura 3 pueden generarse mediante una variedad de técnicas muy conocidas en la técnica. Estos fragmentos de polinucleótidos pueden incluir cualquier porción de la secuencia de 191P4D12(b) como se muestra en la Figura 2.
Polinucleótidos adicionales incluyen fragmentos de polinucleótidos 191P4D12(b) que codifican uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia de proteína “o variante” de 191P4D12(b)” que incluye una o más de las subsecuencias que llevan motivos de una proteína 191P4D12(b) “o variante” expuesta en las Tablas VIIIXXI y XXII-XLIX. Fragmentos de polinucleótidos típicos codifican una o más de las regiones de la proteína 191P4D12(b) o variante que presentan homología con una molécula conocida. Fragmentos de polinucleótidos típicos pueden codificar uno o más de los sitios de N-glucosilación de la proteína 191P4D12(b) o variante, sitios de fosforilación de proteínas cinasas dependientes de cAMP y cGMP, sitios de fosforilación de caseínas cinasas II o sitio de N-miristoilación y sitios de amidación.
Obsérvese que para determinar la posición de inicio de cualquier péptido expuesto en las Tablas VIII-XXI y Tablas XXII a XLIX (en conjunto tablas de péptidos de HLA) con respecto a su proteína parental, por ejemplo, variante 1, variante 2, etc., se hace referencia a tres factores: la variante particular, la longitud del péptido en una tabla de péptidos de HLA y los péptidos de búsqueda enumerados en la Tabla VII. Generalmente se usa un único péptido de búsqueda para obtener péptidos de HLA para una variante particular. La posición de cada péptido de búsqueda con respecto a su molécula parental respectiva está enumerada en la Tabla VII. Por consiguiente, si un péptido de búsqueda empieza en la posición
“X”, debe añadírsele el valor “X menos 1” a cada posición en las Tablas VIII-XXI y las Tablas XXII-IL para obtener la posición real de los péptidos de HLA en su molécula parental. Por ejemplo si un péptido particular de búsqueda empieza en la posición 150 de su molécula parental, debe añadírsele 150 - 1, es decir, 149, a cada posición de aminoácido del péptido de HLA para calcular la posición de ese aminoácido en la molécula parental.
II.A.) Usos de polinucleótidos 191P4D12(b)
II.A.1.) Monitorización de anomalías genéticas
Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen varios usos específicos diferentes. El gen 191P4D12(b) humano se mapea para la localización cromosómica expuesta en el ejemplo titulado “Mapeo cromosómico de 191P4D12(b)”. Por ejemplo, debido a que el gen 191P4D12(b) se mapea para este cromosoma, los polinucleótidos que codifican diferentes regiones de las proteínas 191P4D12(b) se usan para caracterizar anomalías citogenéticas de este escenario cromosómico, tal como anomalías que se identifican como que están asociadas a diversos cánceres. En ciertos genes, una variedad de anomalías cromosómicas que incluyen transposiciones se han identificado como anomalías citogenéticas frecuentes en varios cánceres diferentes (véanse, por ejemplo, Krajinovic y col., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson y col., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger y col.,
P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Por tanto, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas 191P4D12(b) proporcionan nuevas herramientas que pueden usarse para delinear, con mayor precisión que la previamente posible, anomalías citogenéticas en la región cromosómica que codifica 191P4D12(b) que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la materia para ampliar la sensibilidad del cribado cromosómico con el fin de identificar anomalías cromosómicas más leves y menos comunes (véase, por ejemplo, Evans y col., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4):1055-1057 (1994)).
Además, como se mostró que 191P4D12(b) se expresaba altamente en cánceres de próstata y otros cánceres, los polinucleótidos 191P4D12(b) se usan en procedimientos que evalúan el estado de productos del gen 191P4D12(b) en tejidos normales frente a cancerosos. Normalmente, los polinucleótidos que codifican regiones específicas de las proteínas 191P4D12(b) se usan para evaluar la presencia de perturbaciones (tales como deleciones, inserciones, mutaciones puntuales o alteraciones que producen una pérdida de un antígeno, etc.) en regiones específicas del gen 191P4D12(b), tal como regiones que contienen uno o más motivos. Ensayos a modo de ejemplo incluyen tanto ensayos de RT-PCR, además de análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria (SSCP) (véase, por ejemplo, Marrogi y col., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), ambos de los cuales utilizan polinucleótidos que codifican regiones específicas de una proteína para examinar estas regiones dentro de la proteína.
II.A.2.) Cebadores y pares de cebadores
Otras realizaciones específicas de estos nucleótidos incluyen cebadores y pares de cebadores que permiten la amplificación específica de polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que se hibridan selectivamente o específicamente con moléculas de ácidos nucleicos de la invención o con cualquier parte de los mismos. Las sondas pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Tales sondas y cebadores se usan para detectar la presencia de un polinucleótido 191P4D12(b) en una muestra y como medio para detectar una célula que expresa una proteína 191P4D12(b).
Ejemplos de tales sondas incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de 191P4D12(b) humana mostrada en la Figura 2. En los ejemplos también se describen ejemplos de pares de cebadores que pueden amplificar específicamente ARNm de 191P4D12(b). Como entenderá el experto, pueden prepararse muchísimos cebadores y sondas diferentes basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento y usarse eficazmente para amplificar y/o detectar un ARNm de 191P4D12(b).
Los polinucleótidos 191P4D12(b) de la invención son útiles para una variedad de fines que incluyen, pero no se limitan a, su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del gen(es) 191P4D12(b), ARNm o fragmentos de los mismos; como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias codificantes que pueden dirigir la expresión de polipéptidos 191P4D12(b); como herramientas para modular o inhibir la expresión del gen(es) 191P4D12(b) y/o la traducción del (de los) transcrito(s) de 191P4D12(b); y como agentes terapéuticos.
La presente invención incluye el uso de cualquier sonda como se describe en el presente documento para identificar y aislar una secuencia de ácidos nucleicos de 191P4D12(b) o relacionada con 191P4D12(b) a partir de una fuente que se produce naturalmente, tal como seres humanos u otros mamíferos, además de la secuencia de ácidos nucleicos aislada por sí misma, que comprendería todas o parte de las secuencias encontradas en la sonda usada.
II.A.3.) Aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que codifican 191P4D12(b)
Las secuencias de ADNc de 191P4D12(b) descritas en el presente documento permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el (los) producto(s) génico(s) de 191P4D12(b), además del aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto del gen 191P4D12(b), alternativamente isoformas cortadas y empalmadas, variantes alélicas y formas mutantes de un producto del gen 191P4D12(b), además de polinucleótidos que codifican análogos de proteínas relacionadas con 191P4D12(b). Diversos procedimientos de clonación molecular que pueden emplearse para aislar ADNc de longitud completa que codifican un gen 191P4D12(b) son muy conocidos (véanse, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y col., Eds., Wiley y Sons, 1995). Por ejemplo, pueden emplearse convenientemente metodologías de clonación de fago lambda usando sistemas de clonación comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Los clones de fago que contienen ADNc del gen 191P4D12(b) pueden identificarse sondando con un ADNc de 191P4D12(b) marcado o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, un ADNc de 191P4D12(b) (por ejemplo, Figura 2) o una parte del mismo puede sintetizarse y usarse como una sonda para recuperar ADNc superpuestos y de longitud completa correspondientes a un gen 191P4D12(b). Un propio gen 191P4D12(b) puede aislarse cribando bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de 191P4D12(b).
II.A.4.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes y sistemas huésped-vector
El ADN recombinante o las moléculas de ARN pueden contener un polinucleótido 191P4D12(b), un fragmento, análogo o homólogo del mismo que incluyen, pero no se limitan a, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YAC, BAC, además de diversos vectores víricos y no víricos muy conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tal ADN recombinante o moléculas de ARN. Los procedimientos para generar tales moléculas son muy conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, arriba).
Un sistema huésped-vector puede comprender una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido 191P4D12(b), fragmento, análogo u homólogo del mismo dentro de una célula huésped procariota o eucariota adecuada. Ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula de planta
o una célula de animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por baculovirus tal como una célula Sf9 o HighFive). Ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas líneas de células de cáncer de próstata tales como DU145 y TsuPr1, otras líneas de células de cáncer de próstata transfectables o transducibles, células primarias (PrEC), además de varias células de mamífero rutinariamente usadas para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de 191P4D12(b) o un fragmento, análogo u homólogo de la misma, puede usarse para generar proteínas 191P4D12(b) o fragmentos de las mismas usando cualquier número de sistemas huésped-vector rutinariamente usados y ampliamente conocidos en la técnica.
Está disponible una amplia gama de sistemas huésped-vector adecuados para la expresión de proteínas 191P4D12(b) o fragmentos de las mismas, véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, arriba; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, arriba. Vectores preferidos para la expresión de mamífero incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3.1/marca de myc-His (Invitrogen) y el vector retrovírico pSRtkneo (Muller y col., 1991, MCB 11:1785). Usando estos vectores de expresión, 191P4D12(b) puede expresarse en varias líneas celulares de cáncer de próstata y no próstata que incluyen, por ejemplo, 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPr1. Los sistemas huésped-vector son útiles para la producción de una proteína 191P4D12(b) o fragmento de la misma. Tales sistemas huésped-vector pueden emplearse para estudiar las propiedades funcionales de mutaciones o análogos de 191P4D12(b) y 191P4D12(b).
La proteína 191P4D12(b) humana recombinante o un análogo u homólogo o fragmento de la misma puede producirse por células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica un nucleótido relacionado con 191P4D12(b). Por ejemplo, células 293T pueden transfectarse con un plásmido de expresión que codifica 191P4D12(b) o fragmento, análogo u homólogo de la misma, una proteína relacionada con 191P4D12(b) se expresa en las células 293T, y la proteína 191P4D12(b) recombinante se aísla usando procedimientos de purificación convencionales (por ejemplo, purificación por afinidad usando anticuerpos anti-191P4D12(b)). Una secuencia codificante de 191P4D12(b) puede subclonarse en el vector retrovírico pSRMSVtkneo y usarse para infectar diversas líneas celulares de mamífero, tales como NIH-3T3, TsuPr1, 293 y rat-1 con el fin de establecer líneas celulares que expresan 191P4D12(b). También pueden emplearse diversos otros sistemas de expresión muy conocidos en la técnica. Las construcciones de expresión que codifican un péptido líder unido en marco con una secuencia codificante de 191P4D12(b) pueden usarse para la generación de una forma secretada de proteína 191P4D12(b) recombinante.
Como se trata en el presente documento, la redundancia en el código genético permite la variación en secuencias de genes 191P4D12(b). En particular, se sabe en la técnica que las especies huésped específicas frecuentemente tienen preferencias de codón específicas y, por tanto, la secuencia desvelada puede adaptarse según se prefiera para un huésped deseado. Por ejemplo, secuencias de codones análogos preferidas normalmente tienen codones raros (es decir, codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente el 20% en secuencias conocidas del huésped deseado) sustituidos por codones de mayor frecuencia. Las preferencias de codones para una especie específica se calculan, por ejemplo, utilizando las tablas de uso de codones disponibles en INTERNET tales como en URL dna.affrc.go.jp/-nakamura/codon.html.
Se conocen modificaciones de secuencias adicionales para potenciar la expresión de proteínas en un huéspedcelular. Éstas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitios de corte y empalme de exones/intrones, repeticiones similares a transposones y/u otras secuencias tales bien caracterizadas que son perjudiciales para la expresión génica. El contenido de GC de la secuencia se ajusta a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias de horquilla predichas. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia consenso de iniciación de la traducción en el inicio del marco de lectura abierto, como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989). Los expertos habituales entienden que la regla general de que los ribosomas eucariotas inician la traducción exclusivamente en el codón AUG próximo a 5' sólo se deroga bajo condiciones raras (véanse, por ejemplo, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).
III.) Proteínas relacionadas con 191P4D12(b)
Las proteínas 191P4D12(b) específicas comprenden un polipéptido que tiene toda o parte de la secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) humana como se muestra en la Figura 2 o la Figura 3. Alternativamente, las proteínas 191P4D12(b) comprenden polipéptidos variantes, homólogos o análogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3.
Los polipéptidos 191P4D12(b) incluyen: polipéptidos 191P4D12(b) que tienen una secuencia mostrada en la Figura 2, una secuencia de péptidos de una 191P4D12(b) como se muestra en la Figura 2 en la que T es U; teniendo al menos 10 nucleótidos contiguos de un polipéptido la secuencia como se muestra en la Figura 2; o teniendo al menos 10 péptidos contiguos de un polipéptido la secuencia como se muestra en la Figura 2 en la que T es U. Por ejemplo, las realizaciones de péptidos de 191P4D12(b) comprenden, sin limitación:
(I)
una proteína que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 2A-N o la Figura 3A-J;
(II)
una proteína relacionada con 191P4D12(b) que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% homóloga a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-N o 3A-J;
(III) una proteína relacionada con 191P4D12(b) que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos entera mostrada en la Figura 2A-N o 3A-J;
(IV)
una proteína que comprende al menos un péptido expuesto en las Tablas VIII a XLIX, opcionalmente con una condición de que no sea una proteína entera de la Figura 2;
(V)
una proteína que comprende al menos un péptido expuesto en las Tablas VIII-XXI, en conjunto, péptido que también se expone en las Tablas XXII a XLIX, en conjunto, opcionalmente con una condición de que no sea una proteína entera de la Figura 2;
(VI)
una proteína que comprende al menos dos péptidos seleccionados de los péptidos expuestos en las Tablas VIII-XLIX, opcionalmente con una condición de que no sea una proteína entera de la Figura 2;
(VII) una proteína que comprende al menos dos péptidos seleccionados de los péptidos expuestos en las Tablas VIII a XLIX, en conjunto, con una condición de que la proteína no sea un secuencia contigua de una secuencia de aminoácidos de la Figura 2;
(VIII) una proteína que comprende al menos un péptido seleccionado de los péptidos expuestos en las Tablas VIII-XXI; y al menos un péptido seleccionado de los péptidos expuestos en las Tablas XXII a XLIX, con una condición de que la proteína no sea un secuencia contigua de una secuencia de aminoácidos de la Figura 2;
(IX)
un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A-B o 3E-G, en cualquier incremento de número entero hasta 510 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(X)
un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A-B o 3E-G, en cualquier incremento de número entero hasta 510 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XI)
un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A-B o 3E-G, en cualquier incremento de número entero hasta 510 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A-B o 3E-G, en cualquier incremento de número entero hasta 510 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3A-B o 3E-G en cualquier incremento de número entero hasta 510 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XIV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 295 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 295 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XVI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 295 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XVII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de número entero hasta 295 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XVIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3C en cualquier incremento de número entero hasta 295 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XIX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 485 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 20, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 485 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 485 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3D, en cualquier incremento de número entero hasta 485 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3D en cualquier incremento de número entero hasta 485 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXIV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3H, en cualquier incremento de número entero hasta 511 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3H, en cualquier incremento de número entero hasta 511 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXVI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3H, en cualquier incremento de número entero hasta 511 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12,13,14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXVII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3H, en cualquier incremento de número entero hasta 511 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXVIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3H en cualquier incremento de número entero hasta 511 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXIX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3I-J, en cualquier incremento de número entero hasta 137 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de hidrofilia de la Figura 5;
(XXX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3I-J, en cualquier incremento de número entero hasta 137 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6;
(XXXI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14,15,16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3I-J, en cualquier incremento de número entero hasta 137 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7;
(XXXII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3I-J, en cualquier incremento de número entero hasta 137 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8;
(XXXIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3I-J en cualquier incremento de número entero hasta 137 respectivamente que incluye al menos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posición (posiciones) de aminoácido(s) que tiene(n) un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XXXIV) un péptido que se produce al menos dos veces en las Tablas VIII-XXI y XXII a XLIX, en conjunto;
(XXXV) un péptido que se produce al menos tres veces en las Tablas VIII-XXI y XXII a XLIX, en conjunto;
(XXXVI) un péptido que se produce al menos cuatro veces en las Tablas VIII-XXI y XXII a XLIX, en conjunto;
(XXXVII) un péptido que se produce al menos cinco veces en las Tablas VIII-XXI y XXII a XLIX, en conjunto;
(XXXVIII) un péptido que se produce al menos una vez en las Tablas VIII-XXI, y al menos una vez en las Tablas XXII a XLIX;
(XXXIX) un péptido que se produce al menos una vez en las Tablas VIII-XXI, y al menos dos veces en las Tablas XXII a XLIX;
(XL) un péptido que se produce al menos dos veces en las Tablas VIII-XXI, y al menos una vez en las Tablas XXII a XLIX;
(XLI) un péptido que se produce al menos dos veces en las Tablas VIII-XXI, y al menos dos veces en las Tablas XXII a XLIX;
(XLII) un péptido que comprende una, dos, tres, cuatro, o cinco de las siguientes características, o un oligonucleótido que codifica tal péptido:
i) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de hidrofilia de la Figura 5; ii) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o inferior a 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, o que tiene un valor igual a 0,0, en el perfil de hidropaticidad de la Figura 6; iii) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7; iv) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de flexibilidad promedio de la Figura 8; o v) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de número entero hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o que tiene un valor igual a 1,0, en el perfil de giro beta de la Figura 9;
(XLIII) una composición que comprende un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana.
(XLIV) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XLIII) en un procedimiento para modular una célula que expresa 191P4D12(b),
(XLV) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XLIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa 191P4D12(b)
(XLVI) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición (XIIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un individuo que lleva una célula que expresa 191P4D12(b), dicha célula de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I;
(XLVII) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XLIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer;
(XLVIII) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición de (XLIII) en un procedimiento para el diagnóstico, profilaxis, pronóstico o tratamiento de un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I; y,
(XLIX) un procedimiento de uso de un péptido de (I)-(XLII) o un anticuerpo o región de unión del mismo o una composición (XLIII) en un procedimiento para identificar o caracterizar un modulador de una célula que expresa 191P4D12(b).
Como se usa en el presente documento, se entiende que un intervalo desvela específicamente todas las posiciones unitarias completas del mismo.
Los polinucleótidos 191P4D12(b) típicos codifican porciones específicas de secuencias de ARNm de 191P4D12(b) (y aquellas que son complementarias a tales secuencias) tales como aquellas que codifican las proteínas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo:
(a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 189, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 505 ó 510 o más aminoácidos contiguos de la variante 1 de 191P4D12(b); las longitudes máximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 510 aminoácidos; variante 6, 295 aminoácidos, variante 7, 485 aminoácidos, variante 10, 510 aminoácidos, variante 11, 510 aminoácidos, variante 12, 510 aminoácidos, variante 13, 511 aminoácidos, variante 9,137 aminoácidos, y variante 14,137 aminoácidos.
En general, las variantes alélicas que se producen naturalmente de 191P4D12(b) humana comparten un alto grado de identidad y homología estructural (por ejemplo, el 90% o más de homología). Normalmente, las variantes alélicas de una proteína 191P4D12(b) contienen sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de las secuencias de 191P4D12(b) descritas en el presente documento o contienen una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de 191P4D12(b). Una clase de variantes alélicas de 191P4D12(b) son proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una región pequeña de una secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) particular, peo adicionalmente contienen una salida de radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservativa, truncación, inserción o desplazamiento del marco. En comparaciones de secuencias de proteínas, los términos, similitud, identidad y homología tienen cada uno un significado distinto como se aprecia en el campo de la genética. Además, la ortología y paralogía pueden ser conceptos importantes que describen la relación de miembros de una familia de proteínas dada en un organismo con los miembros de la misma familia en otros organismos.
Las abreviaturas de aminoácidos se proporcionan en la Tabla II. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden hacerse frecuentemente en una proteína sin alterar tanto la conformación como la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservativas. Tales cambios incluyen sustituir cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservativas dependiendo del entorno del aminoácido particular y su función en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, como puede ser alanina (A) y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en localizaciones en las que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y los pK diferentes de estos dos residuos de aminoácidos no son significativos. Otros cambios más pueden considerarse “conservativos” en entornos particulares (véanse, por ejemplo, la Tabla III en el presente documento; páginas 13-15 “Biochemistry” 2ª ED. Lubert Stryer ed (Stanford Universidad); Henikoff y col., PNAS 1992 Vol 8910915-10919; Lei y col., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6).
En el presente documento se desvela una amplia variedad de variantes o análogos aceptados en la materia de proteínas 191P4D12(b) tales como polipéptidos que tienen inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de 191P4D12(b) pueden prepararse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida a sitio, barrido con alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida a sitio (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis en casete (Wells y col., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis de selección por restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir el ADN de la variante de 191P4D12(b).
El análisis de aminoácidos por barrido también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua que participa en una actividad biológica específica tal como una interacción proteína-proteína. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es normalmente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. La alanina también se prefiere normalmente debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en tanto posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no da cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isostérico.
Como se define en el presente documento, las variantes, análogos u homólogos de 191P4D12(b) tienen el atributo diferenciador de tener al menos un epítope que es “reactivo de forma cruzada” con una proteína 191P4D12(b) que tiene una secuencia de aminoácidos de la Figura 3. Como se usa en esta frase, “reactivo de forma cruzada” significa que un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a una variante de 191P4D12(b) también se une específicamente a una proteína 191P4D12(b) que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 3. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína mostrada en la Figura 3 cuando ya no contiene ningún epítope que pueda ser reconocido por un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a la proteína 191P4012(b) de partida. Aquellos expertos en la materia entienden que los anticuerpos que reconocen proteínas se unen a epítopes de tamaño variable, y una agrupación del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, se considera un número típico de aminoácidos en un epítope mínimo. Véanse, por ejemplo, Nair y col., J. Immunol 2000165(12): 6949-6955; Hebbes y col., Mol Immunol (1989) 26(9):865-73; Schwartz y col., J Immunol (1985) 135(4):2598-608.
Otras clases de variantes de proteína relacionadas con 191P4D12(b) comparten el 70%, 75%, 80%, 85º% o el 90%
o más similitud con una secuencia de aminoácidos de la Figura 3, o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de proteínas 191P4D12(b) comprende uno o más de los motivos biológicos de 191P4D12(b) descritos en el presente documento o presentemente conocidos en la técnica. Por tanto, los análogos de fragmentos de 191P4D12(b) (nucleico o aminoácido) pueden tener propiedades funcionales alteradas (por ejemplo, inmunogénicas) con respecto al fragmento de partida. Deberá apreciarse que los motivos de ahora o que se vuelven parte de la materia van a aplicarse a las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de la Figura 2 o la Figura 3.
Como se trata en el presente documento, los polipéptidos pueden contener menos de la secuencia de aminoácidos entera de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Por ejemplo, polipéptidos representativos comprenden péptidos/proteínas que tienen cualquiera de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3.
Además, polipéptidos representativos consisten en de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3, etc., a lo largo de toda la totalidad de una secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b). Además, los polipéptidos que consisten en de aproximadamente el aminoácido 1 (o 20 ó 30 ó 40 etc.) a aproximadamente el aminoácido 20 (o 130 ó 140 ó 150 etc.) de una proteína 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3 son realizaciones de la invención. Deberá apreciarse que las posiciones de inicio y parada en este párrafo se refieren a la posición especificada, además de esa posición más o menos 5 residuos.
Las proteínas relacionadas con 191P4D12(b) se generan usando tecnología de síntesis de péptidos convencional o usando procedimientos de escisión química muy conocidos en la técnica. Alternativamente, los procedimientos recombinantes pueden usarse para generar moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína relacionada con 191P4D12(b). Las moléculas de ácidos nucleicos proporcionan un medio para generar fragmentos definidos de una proteína 191P4D12(b) (o variantes, homólogos o análogos de la misma).
II.A.) Realizaciones de proteínas que llevan motivos
Los polipéptidos 191P4D12(b) pueden comprender los residuos de aminoácidos de uno o más de los motivos biológicos contenidos dentro de una secuencia de polipéptidos 191P4D12(b) expuesta en la Figura 2 o la Figura 3. Diversos motivos se conocen en la técnica, y una proteína puede evaluarse para la presencia de tales motivos por varios sitios de internet públicamente disponibles (véanse, por ejemplo, las direcciones URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html; Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, bimas.datnih.govl.).
Las subsecuencias que llevan motivos de todas las proteínas variantes 191P4D12(b) se exponen e identifican en las Tablas VIII-XXI y XXII-XLIX.
La Tabla V expone varios motivos que se producen frecuentemente basándose en búsquedas de pfam (véase la dirección URL pfam.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla V enumeran (1) abreviatura del nombre del motivo, (2) identidad en porcentaje encontrada entre los diferentes miembros de la familia de motivos, (3) nombre del motivo o descripción y (4) función más común; se incluye información de localización si el motivo es relevante para la localización.
Los polipéptidos que comprenden uno o más de los motivos de 191P4012(b) tratados anteriormente son útiles en elucidar las características específicas de un fenotipo maligno en vista de la observación de que los motivos de 191P4D12(b) tratados anteriormente están asociados a desregulación del crecimiento y debido a que 191P4D12(b) se expresa en exceso en ciertos cánceres (véase, por ejemplo, la Tabla I). La caseína cinasa II, cAMP y la proteína cinasa dependiente de camp, y la proteína cinasa C, por ejemplo, son enzimas conocidas por asociarse al desarrollo de fenotipo maligno (véanse, por ejemplo, Chen y col., Lab Invest, 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon y col., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall y col., Nucleic Acids Research 24(6):1119-1126 (1996); Peterziel y col., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, tanto la glucosilación como la miristoilación también son modificaciones de proteínas asociadas a cáncer y progresión de cáncer (véanse, por ejemplo, Dennis y col., Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju y col., Exp. Cell Res. 235(1):145-154 (1997)). La amidación también es otra modificación de proteínas asociadas a cáncer y progresión de cáncer (véase, por ejemplo, Treston y col., J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13):169-175 (1992)).
Las proteínas pueden comprender uno o más de los epítopes inmunorreactivos identificados según procedimientos aceptados en la materia, tales como los péptidos expuestos en las Tablas VIII-XXI y XXII-XLIX. Los epítopes de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 191P4D12(b) que pueden unirse óptimamente a alelos de HLA especificados (por ejemplo, Tabla IV; Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/Epimatrix/Epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.) Además, los procedimientos para identificar péptidos que tienen suficiente afinidad de unión para moléculas de HLA y que guardan relación con epítopes que son inmunogénicos son muy conocidos en la técnica y se llevan a cabo sin experimentación adicional. Además, los procedimientos para identificar péptidos que son epítopes inmunogénicos son muy conocidos en la técnica, y se llevan a cabo sin experimentación adicional tanto in vitro como in vivo.
En la técnica también se conocen principios para crear análogos de tales epítopes con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se empieza con un epítope que lleva un motivo de CTL o HTL (véanse, por ejemplo, motivos/supermotivos de clase I de HLA y clase II de HLA de la Tabla IV). El epítope se analogiza sustituyendo un aminoácido en una de las posiciones especificadas y sustituyéndolo con otro aminoácido especificado para esa posición. Por ejemplo, basándose en residuos definidos en la Tabla IV, un residuo perjudicial puede sustituirse en favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferido; sustituir un residuo menos preferido con un residuo preferido; o sustituir un residuo preferido que se produce originalmente con otro residuo preferido. Las sustituciones pueden producirse en posiciones de anclaje primarias o en otras posiciones en un péptido; véase, por ejemplo, la Tabla IV.
Una variedad de referencias reflejan la materia referente a la identificación y generación de epítopes en una proteína de interés, además de análogos de la misma. Véanse, por ejemplo, el documento WO 97/33602 a Chesnut y col.; Sette, Inmunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette y col., J. Immunol. 2001 166(2):1389-1397; Sidney y col., Hum. Immunol. 1997 58(1):12-20; Kondo y col., Inmunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney y col., J. Immunol, 1996157(8): 3480-90; y Falk y col., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col.,
J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast y col., 1994152(8); 3904-12; Borras-Cuesta y col., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander y col., J. Immunol. 2000164(3); 164(3):16251633; Alexander y col., PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan y col., J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander y col., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander y col., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92.
Los polipéptidos relacionados comprenden combinaciones de los diferentes motivos expuestos en la Tabla VI y/o uno o más de los epítopes de CTL predichos de las Tablas VIII-XXI y XXII-XLIX y/o uno o más de los epítopes de HTL predichos de las Tablas XLVI-XLIX y/o uno o más de los motivos de unión a linfocitos T conocidos en la técnica. Las realizaciones preferidas no contienen inserciones, deleciones o sustituciones tanto dentro de los motivos como dentro de las secuencias intervinientes de los polipéptidos. Además, las realizaciones que incluyen varios residuos de aminoácidos tanto del extremo N como del extremo C en cualquier lado de estos motivos pueden ser deseables (para, por ejemplo, incluir una mayor porción de arquitectura de polipéptidos en la que el motivo está localizado). Normalmente, el número de residuos de aminoácidos del extremo N y/o extremo C en cualquier lado de un motivo es entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferentemente 5 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos.
Las proteínas relacionadas con 191P4D12(b) se expresan de muchas formas, preferentemente en forma aislada. Una molécula de proteína 191P4D12(b) purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que alteran la unión de 191P4D12(b) a anticuerpo, linfocito T u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso previsto. Las realizaciones de proteínas relacionadas con 191P4D12(b) incluyen proteínas relacionadas con 191P4D12(b) purificadas y proteínas relacionadas con 191P4D12(b) solubles funcionales. En una realización, una proteína 191P4D12(b) soluble funcional o fragmento de la misma retiene la capacidad para ser unida por anticuerpo, linfocito T u otro ligando.
Las proteínas 191P4D12(b) pueden comprender fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) mostrada en la Figura 2 o la Figura 3. Tales proteínas presentan propiedades de la proteína 191P4D12(b) de partida, tales como la capacidad para provocar la generación de anticuerpos que se unen específicamente a epítope asociados a la proteína 191P4D12(b) de partida; para unirse por tales anticuerpos; para provocar la activación de HTL o CTL; y/o para ser reconocidas por HTL o CTL que también se unen específicamente a la proteína de partida.
Los polipéptidos relacionados con 191P4D12(b) que contienen estructuras particularmente interesantes pueden predecirse y/o identificarse usando diversas técnicas analíticas muy conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, los procedimientos de análisis de Chou-Fasman, Gamier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o basándose en inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en generar anticuerpos anti-191P4D12(b) específicos para subunidad o linfocitos T o en identificar factores celulares que se unen a 191P4D12(b). Por ejemplo, pueden generarse perfiles de hidrofilia e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Hopp, T.P. y Woods, KR., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA 78:3824-3828. Pueden generarse perfiles de hidropaticidad e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Puede generarse el perfil de porcentaje (%) de residuos accesibles e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Pueden generarse los perfiles de flexibilidad promedio e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K, 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Pueden generarse perfiles de giro beta e identificarse fragmentos de péptidos inmunogénicos usando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294.
Los epítopes de CTL pueden determinarse usando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de una proteína 191P4D12(b) que pueden unirse óptimamente a alelos de HLA especificados (por ejemplo, usando el sitio de SYFPEITHI en la URL de la malla mundial syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; las enumeraciones en la Tabla IV(A)(E); Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/Epimatrix/Epimatrix.html); y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). Ilustrando esto, se predijeron epítopes de péptidos 191P4D12(b) que se presentan en el contexto de moléculas de clase I del MHC humano, por ejemplo, HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B35 (véanse, por ejemplo, las Tablas VIII-XXI, XXII-XLIX). Específicamente, la secuencia de aminoácidos completa de la proteína 191P4D12(b) y porciones relevantes de otras variantes, es decir, para predicciones de la clase I de HLA 9 residuos flanqueantes en cualquier lado de una mutación puntual o unión de exones, y para las predicciones de la clase II de HLA 14 residuos flanqueantes en cualquier lado de una mutación puntual o unión de exones correspondientes a esa variante, se entraron en el algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos de HLA encontrado la malla mundial de Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) enumerado anteriormente; además del sitio de SYFPEITHI, en URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/.
El algoritmo de búsqueda de motivos de péptidos de HLA se desarrolló por Dr. Ken Parker basándose en la unión de secuencias de péptidos específicas en el surco de las moléculas de clase I de HLA, en particular HLA-A2 (véanse, por ejemplo, Falk y col., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992); Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker y col., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la localización y clasificación de péptidos 8-meros, 9-meros y 10-meros de una secuencia de proteínas completa para la unión predicha a HLA-A2, además de numerosas otras moléculas de clase I de HLA. Muchos péptidos de unión a la clase I de HLA son 8-, 9-,10- ó 11-meros. Por ejemplo, para HLA-A2 de la clase I, los epítopes contienen preferentemente una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2 y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C (véase, por ejemplo, Parker y col., J. Immunol. 149:3580-7 (1992)). Los resultados seleccionados de los péptidos de unión predichos de 191P4D12(b) se muestran en las Tablas VIII-XXI y XXII-XLIX en el presente documento. En las Tablas VIII-XXI y XXII-XLVII, los candidatos seleccionados, 9-meros y 10-meros, para cada miembro de familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. En las Tablas XLVI-XLIX, los candidatos seleccionados, 15-meros, para cada miembro de familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico y una puntuación de unión estimada. La puntuación de unión se corresponde con la semivida estimada de la disociación de complejos que contienen el péptido a 37ºC a pH 6,5. Se predice que los péptidos con la mayor puntuación de unión son los más estrechamente unidos a la clase I de HLA sobre la superficie celular durante el mayor periodo de tiempo y, por tanto, representan las mejores dianas inmunogénicas para el reconocimiento de linfocitos T.
La unión real de péptidos a un alelo de HLA puede evaluarse por estabilización de la expresión de HLA sobre la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento de antígeno (véanse, por ejemplo, Xue y col., Prostate 30:73-8 (1997) y Peshwa y col., Prostate 36:129-38 (1998)). La inmunogenicidad de péptidos específicos puede evaluarse in vitro por simulación de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ en presencia de células presentadoras de antígeno tal como células dendríticas.
Deberá apreciarse que cada epítope predicho por el sitio BIMAS, los sitios Epimer™ y Epimatrix™, o especificados por los motivos de clase I o clase II de HLA disponibles en la materia o que se convertirán en parte de la materia tal como se expone en la Tabla IV (o se determinan usando el sitio de la malla mundial URL syfpeithi.bmiheidelberg.com/, o BIMAS, bimas.dcrtnih.gov/), van a “aplicarse” a una proteína 191P4D12(b) según la invención. Como se usa en este contexto, “aplicarse” significa que una proteína 191P4D12(b) se evalúa, por ejemplo, visualmente o por procedimientos de búsqueda de patrones basados en ordenador, como se aprecia por aquellos expertos en la materia relevante. Cada subsecuencia de una proteína 191P4D12(b) de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos que lleva un motivo de clase I de HLA, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que lleva un motivo de clase II de HLA, están dentro del alcance de la invención.
III.B.) Expresión de proteínas relacionadas con 191P4D12(b)
191P4D12(b) puede expresarse convenientemente en células (tal como células 293T) transfectadas con un vector de expresión comercialmente disponible tal como un vector de expresión accionado por el CMV que codifica 191P4D12(b) con una marca 6XHis y MYC del extremo C (pcDNA3.1/myc-HIS, Invitrogen, o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). El vector Tag5 proporciona un señal de secreción de IgGK que puede usarse para facilitar la producción de una proteína 191P4D12(b) secretada en células transfectadas. La 191P4012(b) marcada con His secretada en los medios de cultivo puede purificarse, por ejemplo, usando una columna de níquel usando técnicas convencionales.
(IV) Procedimientos para la detección de 191P4D12(b)
La presente invención se refiere a procedimientos para detectar polinucleótidos 191P4D12(b) y proteínas relacionadas con 191P4D12(b), además de a procedimientos para identificar una célula que expresa 191P4D12(b). El perfil de expresión de 191P4D12(b) hace que sea un marcador de diagnóstico para enfermedad metastatizada. Por consiguiente, el estado de productos del gen 191P4D12(b) proporciona información útil para predecir una variedad de factores que incluyen la susceptibilidad a enfermedad en estado avanzado, tasa de progresión y/o agresividad del tumor. Como se trata en detalle en el presente documento, el estado de productos del gen 191P4D12(b) en muestras de paciente puede analizarse por una variedad de protocolos que son muy conocidos en la técnica que incluyen análisis inmunohistoquímicos, la variedad de técnicas de transferencia Northern que incluyen hibridación in situ, análisis por RT-PCR (por ejemplo, en muestras micro-diseccionadas de captura láser), análisis de transferencia Western y análisis de matrices de tejido.
Más particularmente, la invención proporciona ensayos para la detección de polinucleótidos 191P4D12(b) en una muestra biológica, en los que la muestra es de un tejido seleccionado de riñón, cuello uterino y ovario. Polinucleótidos 191P4D12(b) detectables incluyen, por ejemplo, un gen 191P4D12(b) o fragmento del mismo, ARNm de 191P4D12(b), ARNm de 191P4D12(b) de variantes de corte y empalme alternativas y moléculas de ADN recombinante o ARN que contienen un polinucleótido 191P4D12(b). Varios procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia de polinucleótidos 191P4D12(b) son muy conocidos en la técnica y pueden emplearse en la práctica de este aspecto de la invención.
En una realización, un procedimiento para detectar un ARNm de 191P4D12(b) en una muestra biológica comprende producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador, amplificar el ADNc así producido usando un polinucleótido 191P4D12(b) como cebadores de sentido directo y de sentido contrario para amplificar ADNc de 191P4D12(b) en su interior; y detectar la presencia del ADNc de 191P4D12(b) amplificado. Opcionalmente, la secuencia del ADNc de 191P4D12(b) amplificado puede determinarse.
En otra realización, un procedimiento de detectar un gen 191P4D12(b) en una muestra biológica comprende primero aislar ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos 191P4D12(b) como cebadores de sentido directo y de sentido contrario; y detectar la presencia del gen 191P4D12(b) amplificado. Cualquier número de combinaciones de sonda sentido y antisentido apropiadas puede diseñarse a partir de una secuencia de nucleótidos de 191P4D12(b) (véase, por ejemplo, la Figura 2) y usarse para este fin.
También, en el presente documento se describen ensayos para detectar la presencia de una proteína 191P4D12(b) en un tejido u otra muestra biológica tal como suero, semen, hueso, próstata, orina, preparaciones de células y similares. Los procedimientos para detectar una proteína relacionada con 191P4D12(b) también son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímicos, análisis de transferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, un procedimiento de detectar la presencia de una proteína relacionada con 191P4D12(b) en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo para 191P4D12(b), un fragmento reactivo con 191P4D12(b) del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de unión a antígeno de un anticuerpo para 191P4D12(b); y luego detectar la unión de la proteína relacionada con 191P4D12(b) en la muestra.
Los procedimientos para identificar una célula que expresa 191P4D12(b) también se describen en el presente documento. Un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 191P4D12(b) comprende detectar la presencia de ARNm de 191P4012(b) en la célula. Los procedimientos para la detección de ARNm particulares en células son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementarias (tal como hibridación in situ usando ribosondas de 191P4D12(b) marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para 191P4D12(b), y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen 191P4D12(b) comprende detectar la presencia de proteína relacionada con 191P4D12(b) en la célula o secretada por la célula. Diversos procedimientos para la detección de proteínas son muy conocidos en la técnica y se emplean para la detección de proteínas relacionadas con 191P4D12(b) y células que expresan proteínas relacionadas con 191P4D12(b).
El análisis de expresión de 191P4D12(b) también es útil como herramienta para identificar y evaluar agentes que modulan la expresión génica de 191P4D12(b). Por ejemplo, la expresión de 191P4D12(b) está significativamente regulada por incremento en cáncer de próstata, y se expresa en cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. La identificación de una molécula o agente biológico que inhibe la expresión o expresión en exceso de 191P4D12(b) en células cancerosas es de valor terapéutico. Por ejemplo, un agente tal puede identificarse usando un cribado que cuantifica la expresión de 191P4D12(b) por RT-PCR, hibridación de ácidos nucleicos o unión a anticuerpos.
(V) Procedimientos para monitorizar el estado de genes relacionados con 191P4D12(b) y sus productos
Se sabe que la oncogénesis es un proceso de múltiples etapas en el que el crecimiento celular se desregula progresivamente y las células progresan de un estado fisiológico normal a precanceroso y luego a estados cancerosos (véanse, por ejemplo, Alers y col., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs y col., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995)). En este contexto, el examen de una muestra biológica para pruebas de crecimiento celular desregulado (tal como la expresión anómala de 191P4012(b) en cánceres) permite la detección temprana de tal fisiología anómala antes de que un estado patológico tal como cáncer haya progresado a un estado en el que las opciones terapéuticas están más limitadas y/o el pronóstico es peor. En tales exámenes, el estado de 191P4D12(b) en una muestra biológica de interés puede compararse, por ejemplo, con el estado de 191P4D12(b) en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra de ese individuo o alternativamente otro individual que no está afectado por una patología). Una alteración en el estado de 191P4D12(b) en la muestra biológica (con respecto a la muestra normal) proporciona pruebas de crecimiento celular desregulado. Además de usar una muestra biológica que no está afectada por una patología como muestra normal también puede usarse un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresión de ARNm (véanse, por ejemplo, Grever y col., J. Comp. Neurol, 1996 Dec 9; 376(2): 306-14 y la patente de EE.UU. nº 5.837.501) para comparar el estado de 191P4D12(b) en una muestra.
El término “estado” en este contexto se usa según su significado aceptado en la materia y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Normalmente, los expertos habituales usan varios parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y sus productos. Estos incluyen, pero no se limitan a, la localización de productos génicos expresados (incluyendo la localización de células que expresan 191P4D12(b)), además del nivel, y actividad biológica de productos génicos expresados (tales como ARNm, polinucleótidos y polipéptidos 191P4D12(b)). Normalmente, una alteración en el estado de 191P4D12(b) comprende un cambio en la localización de 191P4D12(b) y/o células que expresan 191P4D12(b) y/o un aumento en ARNm de 191P4D12(b) y/o expresión de proteínas.
El estado de 191P4D12(b) en una muestra puede analizarse por varios medios muy conocidos en la técnica que incluyen, sin limitación, análisis inmunohistoquímico, hibridación in situ, análisis por RT-PCR en muestras micro-diseccionadas de captura láser, análisis de transferencia Western y análisis de matrices de tejido. Protocolos típicos para evaluar el estado de un gen 191P4D12(b) y productos génicos se encuentran, por ejemplo en Ausubel y col. eds.,1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (transferencia Northern), 4 (transferencia Southern), 15 (inmunotransferencia) y 18 (análisis por PCR). Por tanto, el estado de 191P4D12(b) en una muestra biológica se evalúa por diversos procedimientos utilizados por expertos en la materia que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern genómico (para examinar, por ejemplo, perturbaciones en un gen 191P4D12(b)), análisis Northern y/o análisis por PCR de ARNm de 191P4D12(b) (para examinar, por ejemplo, alteraciones en las secuencias de polinucleótidos o niveles de expresión de ARNm de 191P4D12(b)) y análisis Western y/o inmunohistoquímicos (para examinar, por ejemplo, alteraciones en secuencias de polipéptidos, alteraciones en la localización de polipéptidos dentro de una muestra, alteraciones en los niveles de expresión de proteínas 191P4D12(b) y/o asociaciones de proteínas 191P4D12(b) con componentes de unión a polipéptido). Polinucleótidos 191P4D12(b) detectables incluyen, por ejemplo, un gen 191P4D12(b) o fragmento del mismo, ARNm de 191P4D12(b), variantes de corte y empalme alternativas, ARNm de 191P4D12(b) y ADN recombinante o moléculas de ARN que contienen un polinucleótido 191P4D12(b).
El perfil de expresión de 191P4D12(b) hace que sea un marcador de diagnóstico para enfermedad local y/o metastatizada, y proporciona información sobre el crecimiento o potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de 191P4D12(b) proporciona información útil para predecir la susceptibilidad a estados de enfermedad particulares, progresión y/o agresividad del tumor. La invención proporciona procedimientos y ensayos para determinar el estado de 191P4D12(b) y diagnosticar cánceres que expresan 191P4D12(b), tal como cánceres de los tejidos enumerados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el ARNm de 191P4D12(b) se expresa tan altamente en cánceres próstata y otros cánceres con respecto a tejido de próstata normal, ensayos que evalúan los niveles de transcritos de ARNm de 191P4D12(b) o proteínas en una muestra biológica pueden usarse para diagnosticar una enfermedad asociada a desregulación de 191P4D12(b), y puede proporcionar información de pronóstico útil en definir opciones terapéuticas apropiadas.
El estado de expresión de 191P4D12(b) proporciona información que incluye la presencia, estado y localización de células displásicas, precancerosas y cancerosas, prediciendo la susceptibilidad a diversos estados de enfermedad, y/o para calcular la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión hace que sea útil como reactivo de obtención de imágenes para enfermedad metastatizada. Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a los diversos procedimientos de pronóstico y de diagnóstico molecular para examinar el estado de 191P4D12(b) en muestras biológicas tales como aquellas de individuos que padecen, o de los que se sospecha que padecen, una patología caracterizada por crecimiento celular desregulado, tal como cáncer.
Como se ha descrito anteriormente, el estado de 191P4D12(b) en una muestra biológica puede examinarse por varios procedimientos muy conocidos en la materia. Por ejemplo, el estado de 191P4D12(b) en una muestra biológica tomada de una localización específica en el cuerpo puede examinarse evaluando la muestra para la presencia o ausencia de células que expresan 191P4D12(b) (por ejemplo, aquellas que expresan ARNm o proteínas 191P4D12(b)). Este examen puede proporcionar pruebas de crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando las células que expresan 191P4D12(b) se encuentran en una muestra biológica que normalmente no contiene tales células (tal como un ganglio linfático), debido a que tales alteraciones en el estado de 191P4D12(b) en una muestra biológica están frecuentemente asociadas a crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador de celular desregulado es las metástasis de células cancerosas de un órgano de origen (tal como la próstata) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático). En este contexto, las pruebas de crecimiento celular desregulado son importantes, por ejemplo, debido a que metástasis de ganglio linfático ocultas pueden detectarse en una proporción sustancial de pacientes con cáncer de próstata, y tales metástasis están asociadas a factores pronósticos conocidos de progresión de enfermedad (véanse, por ejemplo, Murphy y col., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su y col., Semin. Surg. Oncol. 18(l): 17-28 (2000) y Freeman y col., J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1):474-8).
En un aspecto, los procedimientos pueden monitorizar productos del gen 191P4D12(b) determinando el estado de productos del gen 191P4D12(b) expresados por células de un individuo del que se sospecha que tiene una enfermedad asociada a crecimiento celular desregulado (tal como hiperplasia o cáncer) y luego comparando el estado así determinado con el estado de productos del gen 191P4D12(b) en una muestra normal correspondiente. La presencia de productos del gen 191P4D12(b) anómalos en la muestra de prueba con respecto a la muestra normal proporciona una indicación de la presencia de crecimiento celular desregulado dentro de las células del individuo.
En otro aspecto, los ensayos pueden ser útiles en determinar la presencia de cáncer en un individuo que comprende detectar un aumento significativo en la expresión de ARNm o de proteínas 191P4D12(b) en una célula de prueba o muestra de tejido con respecto a los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La presencia de ARNm de 191P4D12(b) puede evaluarse, por ejemplo, en tejidos que incluyen, pero no se limitan a, aquellos enumerados en la Tabla I. Según la presente invención, el tejido está seleccionado de riñón, cuello uterino y ovario. La presencia de expresión de 191P4D12(b) significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la aparición, presencia y/o gravedad de un cáncer, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan ARNm de 191P4D12(b) o lo expresan a niveles menores.
El estado de 191P4D12(b) puede determinarse al nivel de proteínas en vez de al nivel de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un procedimiento tal comprende determinar el nivel de proteína 191P4D12(b) expresada por células en una muestra de tejido de prueba y comparar el nivel así determinado con el nivel de 191P4D12(b) expresado en una muestra normal correspondiente. En una realización, la presencia de proteína 191P4D12(b) se evalúa, por ejemplo, usando procedimientos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos para 191P4D12(b) o componentes de unión que pueden detectar la expresión de proteínas 191P4D12(b) se usan en una variedad de formatos de ensayo muy conocidos en la técnica para este fin.
Puede evaluarse el estado de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 191P4D12(b) en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y similares. Tales evaluaciones son útiles debido a que perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se observan en un gran número de proteínas asociadas a un fenotipo desregulado de crecimiento (véase, por ejemplo, Marrogi y col., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). Por ejemplo, una mutación en la secuencia de 191P4D12(b) puede ser indicativa de la presencia o promoción de un tumor. Por tanto, tales ensayos tienen valor de diagnóstico y predictivo cuando una mutación en 191P4D12(b) indica una posible pérdida de función o aumento en el crecimiento tumoral.
Una amplia variedad de ensayos para observar perturbaciones en secuencias de nucleótidos y de aminoácidos son muy conocidos en la técnica Por ejemplo, el tamaño y estructura de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de productos del gen 191P4D12(b) se observan por protocolos de Northern, Southern, Western, PCR y secuenciación de ADN tratados en el presente documento. Además, otros procedimientos para observar perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos tales como análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria son muy conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº
5.382.510 concedida el 7 de septiembre de 1999 y 5.952.170 concedida el 17 de enero de 1995).
Adicionalmente puede examinarse el estado de metilación de un gen 191P4D12(b) en una muestra biológica. La desmetilación y/o hipermetilación anómala de islotes de CpG en las regiones reguladoras de 5' del gen se produce frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas, y puede producir expresión alterada de diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión S-transferasa de clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en >90% de carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en carcinomas de próstata (De Marzo y col., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos el 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). En otro ejemplo, la expresión del gen específico para el tumor LAGE-I (que no se expresa en próstata normal pero que se expresa en el 25-50% de los cánceres de próstata) se induce por desoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debida a desmetilación (Lethe y col., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). Una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse en enfoques de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islotes de CpG. Además, la MSP (PCR específica para metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en un islote de CpG de un gen dado. Este procedimiento implica modificación inicial de ADN por bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas sin metilar en uracilo), seguido de amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. Los protocolos que implican interferencia de la metilación también pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, Unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995.
La amplificación génica es un procedimiento adicional para evaluar el estado de 191P4D12(b). La amplificación génica se mide en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia Southern o transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente se emplean anticuerpos que reconocen dúplex específicos que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos se marcan a su vez y el ensayo se lleva a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex sobre la superficie puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a dúplex.
Puede ensayarse convenientemente tejido de biopsia o sangre periférica para la presencia de células cancerosas usando por ejemplo, transferencia Northern, puntual o análisis por RT-PCR para detectar la expresión de 191P4D12(b). La presencia de ARNm de 191P4D12(b) amplificable por RT-PCR proporciona una indicación de la presencia de cáncer. Los ensayos de RT-PCR son muy conocidos en la técnica. Los ensayos de detección por RTPCR para células tumorales en sangre periférica están siendo actualmente evaluados para su uso en el diagnóstico y la atención de varios tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, éstos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de células que expresan PSA y PSM (Verkaik y col., 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein y col., 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston y col., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).
Otro aspecto de la invención es una evaluación de la susceptibilidad que tiene un individuo para desarrollar cáncer. Un procedimiento para predecir la susceptibilidad a cáncer puede comprender detectar ARNm de 191P4D12(b) o proteína 191P4D12(b) en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad a cáncer, en el que el grado de expresión de ARNm de 191P4D12(b) establece una correlación con el grado de susceptibilidad. Puede examinarse la presencia de 191P4D12(b) en próstata u otro tejido, proporcionando la presencia de 191P4D12(b) en la muestra una indicación de susceptibilidad a cáncer de próstata (o la aparición o existencia de un tumor de próstata). Similarmente, puede evaluarse la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de 191P4D12(b) en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en productos del gen 191P4D12(b) en la muestra es una indicación de susceptibilidad a cáncer (o la aparición o existencia de un tumor).
La invención también comprende procedimientos para calcular la agresividad del tumor. Un procedimiento para calcular la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de ARNm de 191P4D12(b) o proteína 191P4D12(b) expresada por células tumorales, comparando así el nivel determinado con el nivel de ARNm de 191P4D12(b) o proteína 191P4D12(b) expresada en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que el grado de ARNm de 191P4D12(b) o expresión de proteínas 191P4D12(b) en la muestra tumoral con respecto a la muestra normal indica el grado de agresividad. La agresividad de un tumor puede evaluarse determinando el grado al que 191P4D12(b) se expresa en las células tumorales, indicando mayores niveles de expresión tumores más agresivos. La evaluación de la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de 191P4D12(b) es en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos.
Los procedimientos pueden usarse para observar la progresión de un tumor maligno en un individuo con el tiempo. Los procedimientos para observar la progresión de un tumor maligno en un individuo con el tiempo pueden comprender determinar el nivel de ARNm de 191P4D12(b) o proteína 191P4D12(b) expresada por células en una muestra del tumor, comparar el nivel así determinado con el nivel de ARNm de 191P4D12(b) o proteína 191P4D12(b) expresada en un muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, en el que el grado de ARNm de 191P4D12(b) o la expresión de 191P4D12(b) de proteínas en la muestra tumoral con el tiempo proporciona información sobre la progresión del cáncer. La progresión de un cáncer puede evaluarse determinando la expresión de 191P4D12(b) en las células tumorales con el tiempo, en la que un aumento de la expresión con el tiempo indica una progresión del cáncer. Por tanto, puede evaluarse la integridad de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos 191P4D12(b) en una muestra biológica con el fin de identificar perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, deleciones, sustituciones y similares, en la que la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer.
Los anteriores enfoques de diagnóstico pueden combinarse con una cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y de diagnóstico conocidos en la técnica, por ejemplo, procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 191P4D12(b) y productos del gen 191P4D12(b) (o perturbaciones en el gen 191P4D12(b) y productos del gen 191P4D12(b)) y un factor que está asociado a tumor maligno, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Puede utilizarse una amplia variedad de factores asociados a tumor maligno, tal como la expresión de genes asociados a tumor maligno (por ejemplo, la expresión de PSA, PSCA y PSM para cáncer de próstata, etc.), además de observaciones citológicas macroscópicas (véanse, por ejemplo, Bocking y col., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson y col., 1998, Mod. Pathol. 11 (6):543-51; Baisden y col., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Los procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 191P4D12(b) y productos del gen 191P4D12(b) (o perturbaciones en el gen 191P4D12(b) y productos del gen 191P4D12(b)) y otro factor que está asociado a tumor maligno son útiles, por ejemplo, debido a que la presencia de un conjunto de factores específicos que coinciden con enfermedad proporciona información crucial para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido.
Pueden usarse procedimientos para observar una coincidencia entre la expresión del gen 191P4D12(b) y productos del gen 191P4D12(b) (o perturbaciones en el gen 191P4D12(b) y productos del gen 191P4D12(b)) y otro factor asociado a tumor maligno que implican detectar la expresión en exceso de ARNm de 191P4D12(b) o proteína en una muestra de tejido, detectar la expresión en exceso de ARNm o proteína de PSA en una muestra de tejido (o expresión de PSCA o PSM), y observar una coincidencia del ARNm de 191P4D12(b) o proteína y ARNm de PSA o expresión en exceso de proteína (o expresión de PSCA o PSM). En una realización específica se examina la expresión de 191P4D12(b) y ARNm de PSA en tejido de próstata, en la que la coincidencia de la expresión en exceso de 191P4D12(b) y de ARNm de PSA en la muestra indica la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad a cáncer de próstata o la aparición o estado de un tumor de próstata.
Los procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 191P4D12(b) o proteína se describen en el presente documento, y tecnologías de detección y cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas convencionales son muy conocidas en la técnica. Los procedimientos convencionales para la detección y cuantificación de ARNm de 191P4D12(b) incluyen hibridación in situ usando ribosondas de 191P4D12(b) marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas usando sondas de polinucleótidos 191P4D12(b), análisis por RT-PCR usando cebadores específicos para 191P4D12(b), y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica se usa RT-PCR semi-cuantitativa para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de 191P4D12(b). Para este fin puede usarse cualquier número de cebadores que pueda amplificar 191P4D12(b), que incluye, pero no se limita a, los diversos conjuntos de cebadores específicamente descritos en el presente documento. Anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína 191P4D12(b) natural pueden usarse en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia.
(VI) Realizaciones de diagnóstico y pronóstico de 191P4D12(b).
Como se desvela en el presente documento, los polinucleótidos 191P4D12(b), polipéptidos, linfocitos T citotóxicos reactivos (CTL), linfocitos T colaboradores reactivos (HTL) y anticuerpos anti-polipéptido se usan en ensayos de diagnóstico, pronóstico y terapéuticos muy conocidos que examinan condiciones asociadas a crecimiento celular desregulado tal como cáncer, en particular los cánceres enumerados en la Tabla I (véase, por ejemplo, tanto su patrón específico de expresión de tejido, además de su expresión en exceso en ciertos cánceres, como se describe, por ejemplo, en el ejemplo titulado “Análisis de expresión de 191P4D12(b) en tejidos normales y especímenes de paciente”).
191P4D12(b) puede analogizarse a un antígeno asociado a la próstata PSA, el marcador arquetípico que ha sido usado por los médicos durante años para identificar y monitorizar la presencia de cáncer de próstata (véanse, por ejemplo, Merrill y col., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik y col., J. Urol. Aug; 162(2):293-306 (1999) y Fortier y col., J. Nat. Cancer Inst. 91 (19): 1635-1640(1999)). Una variedad de otros arcadores de diagnóstico también se usan en contextos similares que incluyen p53 y K-ras (véanse, por ejemplo, Tulchinsky y col., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 y Minimoto y col., Cancer Detect Prev 2000; 24(1):1-12). Por tanto, esta divulgación de polinucleótidos y polipéptidos 191P4D12(b) (además de sondas de polinucleótidos 191P4D12(b) y anticuerpos anti-191P4D12(b) usados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades permiten que expertos en la materia utilicen estas moléculas en procedimientos que son análogos a aquellos usados, por ejemplo, en una variedad de ensayos de diagnóstico dirigidos a examinar afecciones asociadas a cáncer.
Los procedimientos de diagnóstico típicos que utilizan los polinucleótidos 191P4D12(b), polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos son análogos a aquellos procedimientos de ensayos de diagnóstico bien establecidos que emplean, por ejemplo, polinucleótidos de PSA, polipéptidos, linfocitos T reactivos y anticuerpos. Por ejemplo, precisamente como los polinucleótidos de PSA se usan como sondas (por ejemplo, en análisis de Northern, véase, por ejemplo, Sharief y col., Biochem. Mol. Biol. Int,33(3):567-74(1994)) y cebadores (por ejemplo, en análisis por PCR, véase, por ejemplo, Okegawa y col., J. Urol,163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de ARNm de PSA en procedimientos de monitorizar la expresión en exceso de PSA o las metástasis de cánceres de próstata, los polinucleótidos 191P4D12(b) descritos en el presente documento pueden utilizarse de la misma forma para detectar la expresión en exceso de 191P4012(b) o la metástasis de próstata y otros cánceres que expresan este gen. Alternativamente, precisamente como los polipéptidos de PSA se usan para generar anticuerpos específicos para PSA que luego pueden usarse para observar la presencia y/o el nivel de proteínas de PSA en procedimientos para monitorizar la expresión en exceso de proteínas de PSA (véase, por ejemplo, Stephan y col., Urology 55(4):560-3 (2000)) o la metástasis de células de próstata (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. PracL 192(3):233-7 (1996)), los polipéptidos 191P4D12(b) descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar anticuerpos para su uso en detectar la expresión en exceso de 191P4D12(b) o la metástasis de células de próstata y células de otros cánceres que expresan este gen.
Específicamente, debido a que las metástasis implican el movimiento de células cancerosas de un órgano de origen (tal como el pulmón o próstata, etc.) a un área diferente del cuerpo (tal como un ganglio linfático), los ensayos que examinan una muestra biológica para la presencia de células que expresan polinucleótidos y/o polipéptidos 191P4D12(b) pueden usarse para proporcionar pruebas de metástasis. Por ejemplo, si se encuentra que una muestra biológica de tejido que normalmente no contiene células que expresan 191P4D12(b) (ganglio linfático) contiene células que expresan 191P4D12(b) tales como la expresión de 191P4D12(b) observada en LAPC4 y LAPC9, xenoinjertos aislados de ganglio linfático y metástasis de hueso, respectivamente, este hallazgo es indicativo de metástasis.
Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos 191P4D12(b) pueden usarse para proporcionar pruebas de cáncer, por ejemplo, cuando se encuentra que las células en una muestra biológica que normalmente no expresa 191P4D12(b) o expresa 191P4D12(b) a un nivel diferente expresan 191P4D12(b) o tienen un aumento de expresión de 191P4D12(b) (véase, por ejemplo, la expresión de 191P4D12(b) en los cánceres enumerados en la Tabla I y en muestras de paciente, etc., mostradas en las figuras adjuntas). En tales ensayos, los expertos pueden desear adicionalmente generar pruebas complementarias de metástasis para probar la muestra biológica para la presencia de un segundo marcador limitado a tejido (además de 191P4D12(b)) tal como PSA, PSCA, etc. (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).
El uso de inmunohistoquímica para identificar la presencia de un polipéptido 191P4D12(b) dentro de una sección de tejido puede indicar un estado alterado de ciertas células dentro de ese tejido. Es bien entendido en la materia que la capacidad de un anticuerpo para localizar un polipéptido que se expresa en células cancerosas es una forma de diagnosticar la presencia de enfermedad, estado de enfermedad, progresión y/o agresividad del tumor. Un anticuerpo tal también puede detectar una distribución alterada del polipéptido dentro de las células cancerosas, con respecto a tejido no maligno correspondiente.
El polipéptido 191P4D12(b) y composiciones inmunogénicas también son útiles en vista de los fenómenos de localización de proteínas subcelulares alteradas en estados de enfermedad. La alteración de células de estado normal a enfermo produce cambios en la morfología celular y está frecuentemente asociada a cambios en la localización/distribución de proteína subcelular. Por ejemplo, las proteínas de la membrana celular que se expresan de un modo polarizado en células normales pueden alterarse en enfermedad, produciendo distribución de la proteína de un modo no polar sobre toda la superficie celular.
El fenómeno de localización de proteínas subcelulares alteradas en un estado de enfermedad se ha demostrado con la expresión de proteínas MUC1 y Her2 usando medios inmunohistoquímicos. Las células epiteliales normales tienen una distribución apical típica de MUC1, además de alguna localización supranuclear de la glucoproteína, mientras que las lesiones malignas frecuentemente demuestran un patrón de tinción apolar (Diaz y col., The Breast Journal, 7; 40-45 (2001); Zhang y col., Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao y col., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45:1547-1557 (1997)). Además, el epitelio de mama normal es tanto negativo para proteína Her2 como presenta sólo una distribución basolateral, mientras que células malignas pueden expresar la proteína sobre la superficie celular completa (De Potter y col., International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick y col., 117; 935-943 (2002)). Alternativamente, la distribución de la proteína puede alterarse en una única localización de superficie para incluir expresión citoplásmica difusa en el estado de enfermo. Un ejemplo tal puede observarse con MUC1 (Diaz y col., The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).
La alteración en la localización/distribución de una proteína en la célula, como se detecta por procedimientos inmunohistoquímicos, también puede proporcionar información valiosa referente a la favorabilidad de ciertas modalidades de tratamiento. Este último punto se ilustra por una situación en la que una proteína puede ser intracelular en tejido normal, pero estar en la superficie celular en células malignas; la localización de la superficie celular hace que las células sean favorablemente aceptadas para pautas de diagnóstico y de tratamiento basadas en anticuerpo. Cuando una alteración tal de la localización de proteínas se produce para 191P4D12(b), la proteína 191P4D12(b) y las respuestas inmunitarias relacionadas con la misma son muy útiles. Por consiguiente, la capacidad para determinar si la alteración de la localización de proteínas subcelulares se produjo para 24P4C12 o no hace que la proteína 191P4D12(b) y las respuestas inmunitarias relacionadas con la misma sean muy útiles. El uso de las composiciones de 191P4D12(b) permite que aquellos expertos en la materia tomen importantes decisiones de diagnóstico y terapéuticas.
Los reactivos inmunohistoquímicos específicos para 191P4D12(b) también son útiles para detectar metástasis de tumores que expresan 191P4D12(b) cuando el polipéptido aparece en tejidos en los que normalmente no se produce 191P4D12(b).
Por tanto, los polipéptidos 191P4D12(b) y anticuerpos resultantes de respuestas inmunitarias a los mismos son útiles en una variedad de contextos importantes tales como fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos conocidos para aquellos expertos en la materia.
Precisamente, como los fragmentos de polinucleótidos de PSA y variantes de polinucleótidos son empleados por expertos en la materia para su uso en procedimientos de monitorizar PSA, los fragmentos de polinucleótidos 191P4D12(b) y variantes de polinucleótidos se usan de un modo análogo. En particular, polinucleótidos de PSA típicos usados en procedimientos de monitorizar PSA son sondas o cebadores que consisten en fragmentos de la secuencia de ADNc de PSA. Ilustrando esto, los cebadores usados para PCR amplifican un polinucleótido de PSA que debe incluir menos de una secuencia de PSA completa para funcionar en la reacción en cadena de la polimerasa. En el contexto de tales reacciones de PCR, los expertos en la materia generalmente crean una variedad de fragmentos de polinucleótidos diferentes que pueden usarse como cebadores con el fin de amplificar diferentes porciones de un polinucleótido de interés, o para optimizar reacciones de amplificación (véanse, por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson y col., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Una ilustración adicional del uso de tales fragmentos se proporciona en el ejemplo titulado “Análisis de expresión de 191P4D12(b) en tejidos normales y especímenes de paciente” en el que un fragmento de polinucleótidos 191P4D12(b) se usa como sonda para mostrar la expresión de ARN de 191P4D12(b) en células cancerosas. Además, las secuencias de polinucleótidos variantes se usan normalmente como cebadores y sondas para los ARNm correspondientes en análisis de PCR y Northern (véanse, por ejemplo, Sawai y col., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11(6):407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995)). Los fragmentos y variantes de polinucleótidos son útiles en este contexto en el que pueden unirse a una secuencia de polinucleótidos diana (por ejemplo, un polinucleótido 191P4D12(b) mostrado en la Figura 2 o variante del mismo) en condiciones de alta rigurosidad.
Además, los polipéptidos de PSA que contienen un epítope que puede reconocerse por un anticuerpo o linfocito T que se une específicamente a ese epítope se usan en procedimientos de monitorizar PSA. Los fragmentos de polipéptidos 191P4D12(b) y análogos o variantes de polipéptidos también pueden usarse de un modo análogo. Esta práctica de uso de fragmentos de polipéptidos o variantes de polipéptidos para generar anticuerpos (tal como anticuerpos anti-PSA o linfocitos T) es típica en la materia con una amplia variedad de sistemas tales como proteínas de fusión que se usan por médicos (véase, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995). En este contexto, cada epítope funciona proporcionando la arquitectura con la que un anticuerpo o linfocito T es reactivo. Normalmente, los expertos en la materia crean una variedad de fragmentos de polipéptidos diferentes que pueden usarse con el fin de generar respuestas inmunitarias específicas para diferentes porciones de un polipéptido de interés (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº
5.840.501 y la patente de EE.UU. nº 5.939.533). Por ejemplo, puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprende uno de los motivos biológicos de 191P4D12(b) tratados en el presente documento o una subsecuencia que lleva motivos que es fácilmente identificada por un experto en la materia basándose en los motivos disponibles en la materia. Los fragmentos de polipéptidos, variantes o análogos son normalmente útiles en este contexto en tanto que comprendan un epítope que pueda generar un anticuerpo o linfocito T específico para una secuencia de polipéptidos diana (por ejemplo, un polipéptido 191P4D12(b) mostrado en la Figura 3).
Como se muestra en el presente documento, los polinucleótidos y polipéptidos 191P4D12(b) (además de las sondas de polinucleótidos 191P4D12(b) y anticuerpos anti-191P4D12(b) o linfocitos T usados para identificar la presencia de estas moléculas) presentan propiedades específicas que hace que sean útiles en diagnosticar cánceres tales como aquellos enumerados en la Tabla 1. Los ensayos de diagnóstico que miden la presencia de productos del gen 191P4D12(b), con el fin de evaluar la presencia o aparición de una condición de enfermedad descrita en el presente documento, tal como cáncer de próstata, se usan para identificar pacientes para medidas preventivas o monitorizar adicionalmente, como se ha hecho así satisfactoriamente con PSA. Además, estos materiales satisfacen una necesidad en la materia para moléculas que tienen características similares o complementarias a PSA en situaciones en las que, por ejemplo, no puede hacerse un diagnóstico definitivo de metástasis de origen prostático basándose en una prueba para PSA solo (véase, por ejemplo, Alanen y col., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)) y, por consiguiente, necesitan emplearse materiales tales como polinucleótidos y polipéptidos 191P4D12(b) (además de las sondas de polinucleótidos 191P4D12(b) y anticuerpos anti-191P4D12(b) usados para identificar la presencia de estas moléculas) para confirmar una metástasis de origen prostático.
Finalmente, además de su uso en ensayos de diagnóstico, los polinucleótidos 191P4D12(b) desvelados en el presente documento tienen varias otras utilidades tales como su uso en la identificación de anomalías oncogenéticas asociadas a cromosómicas en la región cromosómica con la que el gen 191P4D12(b) se mapea (véase el ejemplo titulado “Mapeo cromosómico de 191P4D12(b)” más adelante). Además, además de su uso en ensayos de diagnóstico, las proteínas y polinucleótidos relacionados con 191P4D12(b) desvelados en el presente documento tienen otras utilidades tales como su uso en el análisis forense de tejidos de origen desconocido (véase, por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;80(1-2): 63-9).
Adicionalmente, las proteínas o polinucleótidos relacionados con 191P4D12(b) de la invención pueden usarse para tratar una afección patológica caracterizada por la expresión en exceso de 191P4D12(b). Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de la Figura 2 o la Figura 3, o fragmentos de cualquiera de ellas, puede usarse para generar una respuesta inmunitaria a un antígeno de 191P4D12(b). Anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con 191P4D12(b) pueden usarse para modular la función de esta molécula, y así proporcionar un beneficio terapéutico.
VII) Kits/artículos de fabricación
Para su uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas en el presente documento se describen kits. Tales kits pueden comprender un soporte, envase o recipiente que está compartimentalizado para recibir uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada (uno de los) recipiente(s) uno de los elementos separados que van a usarse en el procedimiento. Por ejemplo, el (los) recipiente(s) puede(n) comprender una sonda que es o puede ser detectablemente marcada. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína relacionada con la Figura 2 o un gen o mensajero de la Figura 2, respectivamente. Si el procedimiento utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener recipientes que contiene(n) nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como una marca enzimática, fluorescente o de radioisótopo. El kit puede incluir todas o parte de las secuencias de aminoácidos en la Figura 2 o la Figura 3 o análogos de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica tales secuencias de aminoácidos.
El kit comprenderá normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas; etiquetas de soportes, envases, recipientes, viales y/o tubos que enumeren contenidos y/o instrucciones para su uso, y prospectos con instrucciones para su uso.
Una etiqueta puede estar presente sobre el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, tal como una aplicación de diagnóstico o de laboratorio, y también puede indicar instrucciones para tanto uso in vivo como in vitro, tal como aquellas descritas en el presente documento. Las instrucciones y/u otra información también puede incluirse en un inserto(s) o etiqueta(s) que se incluyen con o en el kit.
Los términos “kit” y “artículo de fabricación” pueden usarse como sinónimos.
Se proporciona un artículo(s) de fabricación que contiene(n) composiciones, tales como secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácidos nucleicos y/o anticuerpo(s), por ejemplo, materiales útiles para el diagnóstico, pronóstico, profilaxis y/o tratamiento de neoplasias de tejidos tales como aquellos expuestos en la Tabla I. El artículo de fabricación normalmente comprende al menos un recipiente y al menos una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente puede contener secuencia(s) de aminoácidos, molécula(s) pequeña(s), secuencia(s) de ácidos nucleicos y/o anticuerpo(s), en una realización el recipiente contiene un polinucleótido para su uso en examinar el perfil de expresión de ARNm de una célula, junto con reactivos usados para este fin.
El recipiente puede contener alternativamente una composición que es eficaz para el tratamiento, diagnóstico, pronóstico o profilaxis de una afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo que puede unirse específicamente a 191P4D12(b) y modular la función de 191P4D12(b).
La etiqueta puede estar sobre o asociada al recipiente. Una etiqueta puede estar sobre un recipiente cuando las letras, números u otros caracteres que forman la etiqueta están moldeados o grabados en el propio recipiente; una etiqueta puede asociarse a un recipiente cuando está presente dentro de un receptáculo o soporte que también contiene el recipiente, por ejemplo, como un prospecto. La etiqueta puede indicar que la composición se usa para diagnosticar, tratar, la profilaxis o pronosticar una afección, tal como una neoplasia de un tejido expuesto en la Tabla
I. El artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y/o disolución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringuillas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones para su uso.
Ejemplos:
Diversos aspectos de la invención se describen adicionalmente y se ilustran a modo de los varios ejemplos que siguen, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Aislamiento generado por SSH de fragmento de ADNc del gen 191P4D12(b)
Para aislar genes que están expresados en exceso en cáncer de próstata los inventores usaron el procedimiento de hibridación sustractiva por supresión (SSH) usando ADNc derivado de tejidos de cáncer de próstata. La secuencia de ADNc de SSH de 191P4D12(b) se derivó de tumor de vejiga menos ADNc derivados de un conjunto de 9 tejidos normales. El ADNc de 191P4D12(b) se identificó como altamente expresado en el cáncer de vejiga.
Materiales y procedimientos
Tejidos humanos:
Se compraron tejidos de cáncer de pacientes y normales de diferentes fuentes tales como NDRI (Philadelphia, PA). El ARNm para algunos tejidos normales se compró de Clontech, Palo Alto, CA.
Aislamiento de ARN:
Los tejidos se homogeneizaron en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de ARN total aislado de tejido. Se purificó ARN de poli A de ARN total usando los kits Qiagen's Oligotex mRNA Mini y Midi. Se cuantificaron ARN total y ARNm por análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron por electroforesis en gel.
Oligonucleótidos:
Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.
DPNCDN (cebador de síntesis de ADNc):
5'TTTTGATCAAGCTT303' (SEC ID Nº: 48)
Adaptador 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEC ID Nº: 49)
3'GGCCCGTCCTAG5' (SEC ID Nº: 50)
Adaptador 2:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' (SEC ID Nº: 51)
3'CGGCTCCTAG5' (SEC ID Nº: 52)
Cebador de PCR 1:
5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3' (SEC ID Nº: 53)
Cebador anidado (CA) 1:
5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEC ID Nº: 54) Cebador anidado (CA) 2:
5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3' (SEC ID Nº: 55)
Hibridación sustractiva por supresión:
Se usó hibridación sustractiva por supresión (SSH) para identificar ADNc correspondientes a genes que podían expresarse diferencialmente en cáncer de vejiga. La reacción de SSH utilizó ADNc de tejidos de cáncer de vejiga y normales.
La secuencia del gen 191P4D12(b) se derivó de la resta de ADNc de tejido de cáncer de vejiga menos de normal. Se identificó la secuencia de ADN de SSH (Figura 1).
El ADNc derivado del conjunto de tejidos normales se usó como fuente del ADNc “conductor”, mientras que el ADNc de cáncer de vejiga se usó como fuente del ADNc “probador”. Los ADNc bicatenarios correspondientes a ADNc probadores y conductores se sintetizaron a partir de 2 µg de ARN de poli(A)+ aislado de tejido de xenoinjerto relevante, como se ha descrito anteriormente, usando CLONTECH's PCR-Select cDNA Subtraction Kit y 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como cebador. La síntesis de la primera y segunda cadena se llevaron a cabo como se describe en el protocolo del manual de usuario del kit (protocolo de CLONTECH nº PT1117-1, nº de catálogo K18041). El ADNc resultante se digirió con Dpn II durante 3 h a 37ºC. El ADNc digerido se extrajo con fenol/cloroformo
(1:1) y se precipitó con etanol.
El ADNc conductor se generó combinando en una relación 1:1 ADNc digerido con Dpn II de la fuente de tejido relevante (véase anteriormente) con una mezcla de ADNc digeridos derivada de los nueve tejidos normales: estómago, músculo esquelético, pulmón, cerebro, hígado, riñón, páncreas, intestino delgado y corazón.
Se generó ADNc probador diluyendo 1 µl de ADNc digerido con Dpn II de la fuente de tejido relevante (véase anteriormente) (400 ng) en 5 µl de agua. Entonces, el ADNc diluido (2 µl, 160 ng) se ligó a 2 µl de Adaptador 1 y Adaptador 2 (10 µM), en reacciones de ligación separadas, en un volumen total de 10 µl a 16ºC durante la noche, usando 400 u de T4 ADN ligasa (CLONTECH). La ligación se terminó con 1 µl de EDTA 0,2 M y calentando a 72ºC durante 5 min.
La primera hibridación se realizó añadiendo 1,5 µl (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de dos tubos que contenían 1,5 µl (20 ng) de ADNc probador ligado a Adaptador 1 y Adaptador 2. En un volumen final de 4 µl, las muestras se recubrieron con aceite mineral, se desnaturalizaron en un ciclador térmico de MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y luego se dejó que se hibridaran durante 8 h a 68ºC. Entonces, las dos hibridaciones se mezclaron junto con 1 µl adicional de ADNc conductor recientemente desnaturalizado y se dejó que se hibridaran durante la noche a 68ºC. Entonces, la segunda hibridación se diluyó en 200 µl de Hepes 20 mM, pH 8,3, NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 min y se guardó -20ºC.
Clonación y secuenciación por amplificación por PCR de fragmentos de genes generados a partir de SSH:
Para amplificar fragmentos de genes resultantes de reacciones de SSH se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la reacción de PCR primaria, 1 µl de la mezcla de hibridación final diluida se añadió a 1 µl de cebador de PCR 1 (10 µM), 0,5 µl de mezcla de dNTP (10 µM), 2,5 µl de 10 x tampón de reacción (CLONTECH) y 0,5 µl de 50 x mezcla de polimerasa de ADNc Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 µl. La PCR 1 se realizó usando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min, 94ºC durante 25 s, luego 27 ciclos de 94ºC durante 10 s, 66ºC durante 30 s, 72ºC durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias separadas para cada experimento. Los productos se reunieron y se diluyeron 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, 1 µl de la reacción de PCR primaria reunida y diluida se añadió a la misma mezcla de reacción que se usa para PCR 1, excepto que se usaron los cebadores CA1 y CA2 (10 µM) en lugar del cebador 1 de PCR. La PCR 2 se realizó usando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 s, 68ºC durante 30 s y 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en 2% de gel de agarosa.
Los productos de PCR se insertaron en pCR2.1 usando el kit de clonación de vectores T/A (Invitrogen). Las E. coli transformadas se sometieron a selección azul/blanco y con ampicilina. Las colonias blancas se recogieron y se dispusieron en matrices en placas de 96 pocillos y se cultivaron en cultivo líquido durante la noche. Para identificar insertos se realizó amplificación por PCR en 1 µl de cultivo bacteriano usando las condiciones de PCR1 y CA1 y CA2 como cebadores. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en 2% de gel de agarosa.
Los clones bacterianos se almacenaron en 20% de glicerol en un formato de 96 pocillos. El ADN de plásmido se preparó, se secuenció y se sometió a búsquedas de homología de ácidos nucleicos de las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.
Análisis de expresión por RT-PCR:
Los ADNc de la primera cadena pueden generarse a partir de 1 µg de ARNm con cebado con oligo (dT)12-18 usando el sistema de preamplificación Gibco-BRL Superscript. Se usó el protocolo del fabricante, que incluyó una incubación durante 50 min a 42ºC con transcriptasa inversa, seguido de tratamiento con ARNsa H a 37ºC durante 20 min. Después de completarse la reacción, el volumen puede aumentarse a 200 µl con agua antes de la normalización. Los ADNc de la primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes pueden obtenerse de Clontech.
La normalización de los ADNc de la primera cadena de múltiples tejidos se realizó usando los cebadores
5 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (SEC ID Nº: 56) y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' (SEC ID Nº: 57) para amplificar βactina. Los ADNc de la primera cadena (5 µl) se amplificaron en un volumen total de 50 µl que contenía cebadores 0,4 µM, 0,2 µM de cada dNTP, 1X tampón de PCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3) y 1X ADN polimerasa Klentaq (Clontech). Cinco µl de la reacción de PCR pueden extraerse en 18, 20 y 22 ciclos y usarse para electroforesis en gel de agarosa. La PCR se realizó usando un ciclador térmico MJ Research bajo las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial puede ser a 94ºC durante 15 s, seguido de 18, 20 y 22 ciclos de 94ºC durante 15, 65ºC durante 2 min, 72ºC durante 5 s. Se llevó a cabo una extensión final a 72ºC durante 2 min. Después de la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de bandas de las bandas de β-actina de 283 pb de múltiples tejidos se compararon por inspección visual. Los factores de dilución para los ADNc de la primera cadena se calcularon para producir intensidades de bandas de β-actina iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de
15 PCR. Pueden requerirse tres rondas de normalización para lograr intensidades de bandas iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR.
Para determinar los niveles de expresión del gen 191P4D12(b), 5 µl de ADNc de la primera cadena normalizado se analizaron por PCR usando 26 y 30 ciclos de amplificación. El análisis de expresión semi-cuantitativa puede lograrse comparando los productos de PCR a números de ciclos que dan intensidades de bandas claras. Los cebadores usados para RT-PCR se diseñaron usando la secuencia de SSH de 191P4D12(b) y se enumeran a continuación:
191P4D12(b).1
5'- GGCTGGAGTTCAATGAGGTTTATTT -3' (SEC ID Nº: 58)
191P4D12(b).2
5'- TCCAGCAGATTTCAGACTAAGAAGA - 3' (SEC ID Nº: 59)
25 Un análisis de expresión por RT-PCR típica se muestra en la Figura 14. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir del conjunto vital 1 (hígado, pulmón y riñón), conjunto vital 2 (páncreas, colon y estómago), riñón normal, conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de mama y conjunto de metástasis de cáncer. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para 191P4D12(b), se realizó en 26 y 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran fuerte expresión de 191P4D12(b) en el conjunto de cáncer de vejiga. La expresión de 191P4D12(b) también se detectó en el conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de mama y conjunto de metástasis de cáncer, pero muy débilmente en el conjunto vital 1 y el conjunto vital 2.
Ejemplo 2: Aislamiento ADNc que codifica 191P4D12(b) de longitud completa
35 La secuencia de ADNc de SSH de 191P4D12(b) se derivó de una resta que consiste en cáncer de vejiga menos una mezcla de 9 tejidos normales: estómago, músculo esquelético, pulmón, cerebro, hígado, riñón, páncreas, intestino delgado y corazón. La secuencia de ADNc de SSH de 223 pb (Figura 1) se designó 191P4D12(b).
191P4D12(b) v.1 (clon 1A1) de 3464 pb se clonó a partir de la biblioteca de ADNc de cáncer de vejiga, revelando un ORF de 510 aminoácidos (Figura 2 y Figura 3). Otras variantes de 191P4D12(b) también se identificaron y éstas se enumeran en las Figuras 2 y 3.
Las proteínas 191P4D12(b) v.1, v.2, v.10, v.11 y v.12 tienen 510 aminoácidos de longitud y se diferencian entre sí por un aminoácido como se muestra en la Figura 11. 191P4D12(b) v.3, v.4, v.5 y v.8 codifican la misma proteína que 191P4D12(b) v.1. 191P4D12(b) v.6 y v.7 son variantes de corte y empalme y codifican proteínas de 295 y 485 aminoácidos, respectivamente. El clon 9C de 191P4D12(b) v.13 se clonó a partir de ADNc de cáncer de vejiga y
45 tiene una inserción de aminoácidos en la posición 334 en comparación con 191P4D12(b) v.1. El clon BCP1 de 191P4D12(b) v.9 es una variante de corte y empalme de 191P4D12(b) v.1 y se clonó a partir de un biblioteca de ADNc de cáncer de vejiga. 191P4D12(b) v.14 es una variante de SNP y se diferencia de 191P4D12(b) v.9 por un aminoácido como se muestra en la Figura 2.
191P4D12(b) v.1 muestra el 99% de identidad con respecto a 2744 para el receptor de la superfamilia de lg LNIR (nectina-4), número de acceso TNM_030916. La proteína 191P4D12(b) v.9 es 100% idéntica al clon AF218028 con función para inhibir el crecimiento de células de cáncer.
Ejemplo 3: Mapeo cromosómico de 191P4D12(b)
La localización cromosómica puede implicar genes en patogénesis de enfermedad. Están disponibles varios enfoques de mapeo de cromosomas que incluyen hibridación fluorescente in situ (FISH), paneles de híbridos de radiación (RH) de ser humano/hámster (Walteran y col., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville Al), paneles de híbridos de células somáticas de ser humano-roedor tales como están disponibles de Cornell Institute (Camden, New Jersey) y visualizadores genómicos que utilizan homologías de BLAST para secuenciar y mapear clones genómicos (NCBI, Bethesda, Mariland).
191P4D12(b) se mapea con el cromosoma 1q22-q23.2 usando la secuencia de 191P4D12(b) y la herramienta NCBI BLAST localizada en la malla mundial en (.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs).
Ejemplo 4: Análisis de expresión de 191P4D12(b) en tejidos normales y especímenes de paciente
El análisis de expresión por RT-PCR demostró que 191P4D12(b) se expresa fuertemente en especímenes de pacientes con cáncer de vejiga (Figura 14). Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de (A) conjunto vital 1 (hígado, pulmón y riñón), conjunto vital 2 (páncreas, colon y estómago), riñón normal, conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de mama y conjunto de metástasis de cáncer; (B) metástasis de cáncer de próstata a ganglio linfático, conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de vejiga, conjunto de cáncer de riñón, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de ovario, conjunto de cáncer de mama, conjunto de metástasis de cáncer, conjunto de cáncer de páncreas y conjunto de xenoinjerto de próstata LAPC. La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, usando cebadores para 191P4D12(b), se realizó en 26 y 30 ciclos de amplificación. En (A), los resultados muestran fuerte expresión de 191P4D12(b) en el conjunto de cáncer de vejiga. La expresión de 191P4D12(b) también se detectó en el conjunto de cáncer de próstata, conjunto de cáncer de colon, conjunto de cáncer de pulmón, conjunto de cáncer de mama y conjunto de metástasis de cáncer, pero muy débilmente en el conjunto vital 1 y el conjunto vital 2. En (B), los resultados muestran fuerte expresión de 191P4D12(b) en próstata, vejiga, riñón, colon, pulmón, ovario, mama, metástasis de cáncer y especímenes de cáncer de páncreas.
El análisis de transferencia Northern de 251 P5G2 es una técnica conocida para aquellos expertos en la materia para detectar la producción de proteína 251 P5G2. La transferencia Northern detecta niveles relativos de ARNm expresado a partir de un gen 251P5G2. Se mide ARNm específico usando una técnica de hibridación de ácidos nucleicos y la señal se detecta en un autorradiograma. Cuanto más fuerte sea la señal, más abundante será el ARNm. Para genes 251 P5G2 que producen ARNm que contiene un marco de lectura abierto flanqueado por un buen sitio de iniciación de la traducción de Kozak y un codón de terminación, en la gran mayoría de los casos el ARNm sintetizado se expresa como una proteína.
El nivel de expresión del gen 251 P5G2 se determina en diversos tejidos normales y en diversos tejidos tumorales y líneas celulares tumorales usando la técnica de transferencia Northern, que detecta la producción de ARN mensajero. Es muy sabido en la técnica que la producción de ARN mensajero, que codifica la proteína, es una etapa necesaria en la producción de la propia proteína. Por tanto, la detección de altos niveles de ARN mensajero por, por ejemplo, transferencia Northern, es una forma de determinar que se produce la propia proteína. La técnica de transferencia Northern se usa como procedimiento rutinario debido a que no requiere los retrasos de tiempo (en comparación con la transferencia Western, inmunotransferencia o inmunohistoquímica) implicados en aislar o sintetizar la proteína, preparar una composición inmunológica de la proteína, provocar una respuesta inmunitaria humoral, recoger los anticuerpos y verificar la especificidad de los mismos.
La secuencia consenso de Kozak para la iniciación de la traducción CCACCATGG, en la que se observa el codón de iniciación ATG, es la secuencia con la mayor probabilidad establecida de iniciar la traducción. Esto se confirmó por Peri y Pandey Trends en Genetics (2001) 17: 685-687. La conclusión está de acuerdo con el conocimiento general en la materia de que, con raras excepciones, la expresión de un ARNm es predictiva de la expresión de su proteína codificada. Esto es particularmente cierto para ARNm con un marco de lectura abierto y una secuencia consenso de Kozak para la iniciación de la traducción.
Se entiende en la materia que los niveles absolutos de ARN mensajero presentes y las cantidades de proteína producidas no siempre proporcionan una correlación 1:1. En aquellos casos en los que la transferencia Northern ha mostrado que el ARNm está presente, casi siempre es posible detectar la presencia de la proteína correspondiente en el tejido que proporcionó un resultado positivo en la transferencia Northern. Los niveles de la proteína en comparación con los niveles del ARNm pueden ser diferenciales, pero generalmente, las células que presentan ARNm detectable también presentan proteína correspondiente detectable y viceversa. Esto es particularmente cierto cuando el ARNm tiene un marco de lectura abierto y una buena secuencia de Kozak (véase, Peri y Pandey, arriba).
Ocasionalmente, aquellos expertos en la materia encuentran una rara manifestación cuando no hay proteína detectable en presencia de ARNm correspondiente (véase, Fu, L. y col., Embo. Journal, 15:4392-4401 (1996)). En muchos casos, una ausencia informada de la expresión de proteínas es debida a limitaciones técnicas del ensayo de detección de proteínas. Estas limitaciones son fácilmente conocidas para aquellos expertos en la materia. Estas limitaciones incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos disponibles que sólo detectan proteína desnaturalizada y no proteína nativa presente en una célula y proteínas inestables con semivida muy corta. Las proteínas de corta vida todavía son funcionales y previamente se ha descrito que inducen formación de tumor (véase, por ejemplo, Reinstein y col., Oncogene, 19: 5944-5950). En tales situaciones, la expresión de proteínas se detecta cuando se realizan técnicas de detección más sensibles y/o se generan otros anticuerpos. Si los estudios fracasan al tener en cuenta estos principios, probablemente informan correlaciones artificialmente reducidas de ARNm con proteína. Fuera de estas raras excepciones, el uso de análisis de transferencia Northern es reconocido para aquellos expertos en la materia por ser predictivo e indicativo de la detección de producción de proteína 251 P5G2.
La amplia expresión de 191P4D12(b) en tejidos normales se muestra en la Figura 15. Se sondaron dos transferencias Northern de múltiples tejidos (Clontech), ambas con 2 ug de ARNm/carril, con la secuencia de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases (kb) se indican al lado. Los resultados muestran la expresión de un transcrito en placenta de aproximadamente 4 kb y muy débilmente en próstata, pero no en ningún otro tejido normal probado. Se detectó un transcrito de 191P4D12(b) más pequeño de aproximadamente 2,5 kb en corazón y músculo esquelético.
La expresión de 191P4D12(b) en especímenes de pacientes con cáncer de vejiga y tejidos normales humanos se muestra en la Figura 16. Se extrajo ARN de un conjunto de 3 especímenes de pacientes con cáncer de vejiga, además de próstata normal (PrN), vejiga normal (VN), riñón normal (RN), colon normal (CN), pulmón normal (PN), mama normal (MN), ovario normal (ON) y páncreas normal (PaN). La transferencia Northern con 10 ug de ARN total/carril se sondó con la secuencia de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases (kb) se indican al lado. El transcrito de 191P4D12(b) se detectó en los especímenes de cáncer de vejiga, pero no en los tejidos normales probados.
El análisis de especímenes de pacientes con cáncer de vejiga individuales se representa en la Figura 17. Se extrajo ARN de líneas celulares (LC) de cáncer de vejiga, vejiga normal (N) y tumores (T) de pacientes con cáncer de vejiga. Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con el fragmento de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en los tejidos tumorales de vejiga, pero no en vejiga normal. Se detectó un transcrito más pequeño en la línea celular HT1197, pero no en las otras líneas de células cancerosas probadas.
La expresión de 191P4D12(b) también se detectó en tejidos de xenoinjerto de cáncer de próstata (Figura 18). Se extrajo ARN de próstata normal, y de los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD y LAPC-9AI. Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con el fragmento de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en todos los tejidos de xenoinjerto LAPC, pero no en próstata normal.
La Figura 19 muestra la expresión de 191P4D12(b) en especímenes de pacientes con cáncer de cuello uterino. Se extrajo ARN de cuello uterino normal, línea de células cancerosas Hela y 3 tumores (T) de pacientes con cáncer de cuello uterino. Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con el fragmento de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en 2 de los 3 tumores de cuello uterino probados, pero no en cuello uterino normal ni en la línea celular Hela.
También se expresó 191P4D12(b) en especímenes de pacientes con cáncer de pulmón (Figura 20). Se extrajo ARN de líneas celulares (LC) de cáncer de pulmón, pulmón normal (N), tumores (T) de pacientes con cáncer de vejiga y tejido adyacente normal (Nat). Se sondaron transferencias Northern con 10 ug de ARN total con 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases están al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) de aproximadamente 4 kb en los tejidos de tumor de pulmón, pero no en pulmón normal ni en las líneas celulares probadas.
La expresión de 191P4D12(b) se probó en un panel de especímenes de cáncer de pacientes individuales (Figura 21). Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de un panel de especímenes de cáncer de pulmón (A), especímenes de cáncer de vejiga (B), especímenes de cáncer de próstata (C), especímenes de cáncer de colon (D), especímenes de cáncer de útero (E) y especímenes con cáncer de cuello uterino (F). La normalización se realizó por PCR usando cebadores para actina. Se realizó PCR semi-cuantitativa, usando los cebadores para el fragmento SSH de 191P4D12(b), en 26 y 30 ciclos de amplificación. El nivel de expresión se registró como 0 = no se detectó expresión; 1 = expresión débil, 2 = expresión moderada; 3 = expresión fuerte. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en el 97% de los 31 especímenes de pacientes con cáncer de pulmón probados, el 94% de los 18 especímenes de pacientes con cáncer de vejiga, el 100% de los 20 especímenes de pacientes con cáncer de próstata, el 100% de los 22 especímenes de pacientes con cáncer de colon, el 100% de los 12 especímenes de pacientes con cáncer de útero y el 100% de los 14 especímenes de pacientes con cáncer de cuello uterino probados.
La expresión limitada de 191P4D12(b) en tejidos normales y la expresión detectada en especímenes de pacientes con cáncer sugieren que 191P4D12(b) es una posible diana terapéutica y un marcador de diagnóstico para cánceres humanos.
Ejemplo 5: Variantes de transcritos de 191P4D12(b)
Las variantes de transcritos son variantes de ARNm maduro del mismo gen que se producen por transcripción alternativa o corte y empalme alternativo. Los transcritos alternativos son transcritos del mismo gen, pero inician la transcripción en diferentes puntos. Las variantes de corte y empalme son variantes de ARNm cortadas y empalmadas de forma diferente del mismo transcrito. En eucariotas, cuando un gen multi-exónico se transcribe a partir de ADN genómico, el ARN inicial se corta y empalma para producir ARNm funcional, que sólo tiene exones y se usa para la traducción en una secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, un gen dado puede tener cero a muchos transcritos alternativos y cada transcrito puede tener cero a muchas variantes de corte y empalme. Cada variante de transcrito tiene una única representación de exones y puede tener diferentes porciones codificantes y/o no codificantes (extremo 5' ó 3') del transcrito original. Las variantes de transcritos pueden codificar proteínas similares o diferentes con la misma función o una similar o pueden codificar proteínas con diferentes funciones, y pueden expresarse en el mismo tejido al mismo tiempo, o en diferentes tejidos al mismo tiempo, o en el mismo tejido en momentos diferentes, o en tejidos diferentes en momentos diferentes. Las proteínas codificadas por variantes de transcritos pueden tener localizaciones celulares o extracelulares similares o diferentes, por ejemplo, secretadas frente a intracelulares.
Las variantes de transcritos se identifican mediante una variedad de procedimientos aceptados en la materia. Por ejemplo, los transcritos y variantes de corte y empalme alternativos se identifican por experimento de clonación de longitud completa, o por uso de transcrito de longitud completa y secuencias EST. Primero, todas las EST humanas se agruparon en agrupaciones que mostraron la identidad directa o indirecta entre sí. Segundo, las EST en la misma agrupación se agruparon adicionalmente en sub-agrupaciones y se ensamblaron en una secuencia consenso. La secuencia del gen original se compara con la(s) secuencia(s) consenso u otras secuencias de longitud completa. Cada secuencia consenso es una posible variante de corte y empalme para ese gen. Incluso cuando se identifica que una variante no es un clon de longitud completa, esa porción de la variante es muy útil para la generación de antígenos y para clonar adicionalmente la variante de corte y empalme de longitud completa, usando técnicas conocidas en la técnica.
Además, en la materia están disponibles programas informáticos que identifican variantes de transcritos basadas en secuencias genómicas. Los programas de identificación de variantes de transcritos basadas en genómica incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev. “Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA”, Genome Research. Abril de 2000; 10(4):516-22); Grail (URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para una discusión general de protocolos de identificación de variantes de corte y empalme véanse, por ejemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J. y col., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7; 97(23):12690-3.
Para confirmar adicionalmente los parámetros de una variante de transcrito, en la materia están disponibles una variedad de técnicas, tales como clonación de longitud completa, validación proteómica, validación basada en PCR y validación con 5' RACE, etc. (véanse, por ejemplo, Proteomic Validation: Brennan, S.O. y col., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 1999 Aug 17;1433(1-2):321-6; Ferranti P y col., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7. Para validación basada en PCR: Wellmann
S. y col., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Apr;47(4):654-60; Jia, H.P. y col., Discovery of new human betadefensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24; 263(1-2):211-8. Para validación basada en PCR y validación con 5' RACE: Brigle, K.E. y col., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353(2): 191-8).
Se sabe en la técnica que las regiones genómicas se modulan en cánceres. Cuando la región genómica con la que se mapea un gen se modula en un cáncer particular, también se modulan los transcritos o variantes de corte y empalme alternativos del gen. En el presente documento se desvela que 191P4D12(b) tiene un perfil de expresión particular relacionado con el cáncer. Los transcritos y variantes de corte y empalme alternativos de 191P4D12(b) también pueden participar en cánceres en los mismos tejidos o tejidos diferentes, sirviendo así de marcadores/antígenos asociados a tumor.
Usando el gen de longitud completa y secuencias EST se identificaron cuatro variantes de transcritos adicionales, designadas 191P4D12(b) v.6, v.7, v.8 y v.9 como se muestra en la Figura 12. Los límites de los exones en el transcrito original, 191P4D12(b) v.1, se mostraron en la Tabla LI. En comparación con 191P4D12(b) v.1, la variante
v.6 cortó y empalmó 202-321 del primer exón de v.1, mientras que la variante v.8 cortó y empalmó 63 bases del último exón de v.1. La variante v.7 cortó y empalmó el exón 8 de v.1. La variante 9 fue parte del último exón de v.1. Teóricamente, cada combinación diferente de exones en orden espacial, por ejemplo, los exones 2, 3, 5, 7 y 9 de v.1, es una posible variante de corte y empalme.
Las Tablas LII (a) - (d) a LV (a) - (d) se exponen en una base de variante por variante. Las Tablas LII (a) - (d) muestran la secuencia de nucleótidos de las variantes de transcritos. Las Tablas LIII (a) - (d) muestran un alineamiento de la variante de transcrito con la secuencia de ácidos nucleicos de 191P4D12(b) v.1. Las Tablas LIV
(a) - (d) disponen la traducción de aminoácidos de la variante de transcrito para la orientación del marco de lectura identificado. Las Tablas LV (a) - (d) muestran alineamientos de la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de corte y empalme con la de 191P4D12(b) v.1.
Ejemplo 6: Polimorfismos de un único nucleótido de 191P4D12(b)
Un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) es una variación en un único par de bases en una secuencia de nucleótidos en una localización específica. En cualquier punto dado del genoma hay cuatro posibles pares de bases de nucleótidos: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere a la secuencia de pares de bases específica de una o más localizaciones en el genoma de un individuo. El haplotipo se refiere a la secuencia de pares de bases de más de una localización en la misma molécula de ADN (o el mismo cromosoma en organismos superiores), frecuentemente en el contexto de un gen o en el contexto de varios genes fuertemente ligados. El SNP que se produce en un ADNc se llama cSNP. Este cSNP puede cambiar aminoácidos de la proteína codificada por el gen y, por tanto, cambiar las funciones de la proteína. Algunos SNP producen enfermedades heredadas; otros contribuyen a variaciones cuantitativas en el fenotipo y a reacciones a factores medioambientales que incluyen dieta y fármacos entre individuos. Por tanto, el SNP y/o las combinaciones de alelos (llamados haplotipos) tienen muchas aplicaciones, que incluyen diagnóstico de enfermedades heredadas, determinación de reacciones a fármaco y dosificación, identificación de genes responsables de enfermedades y análisis de la relación genética entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon y A. M. Goate, “SNP analysis to dissect human traits”, Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct; 11(5):637-641; M. Pirmohamed y B. K. Park, “Genetic susceptibility to adverse drug reactions”, Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6): 298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai y A. Roses, “The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes”, Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1):39-47; R. Judson, J.
C. Stephens y A. Windemuth, “The predictive power of haplotypes in clinical response”, Pharmacogenomics. 2000 feb; 1(1):15-26).
Los SNP se identifican por una variedad de procedimientos aceptados en la materia (P. Bean, “The promising voyage of SNP target discovery”, Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20(9):18-20; K. M. Weiss, “In search of human variation”, Genome. Res. 1998.Jul; 8(7):691-697; M. M. She, “Enabling large-scale pharmacogenetic studies by highthroughput mutation detection and genotyping technologies”, Clin. Chem. 2001 Feb; 47(2):164-172). Por ejemplo, el SNP puede identificarse secuenciando fragmentos de ADN que muestran polimorfismo por procedimientos basados en gel tales como polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción (RFLP) y electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE). También pueden descubrirse por secuenciación directa de muestras de ADN reunidas de diferentes individuos o comparando secuencias de diferentes muestras de ADN. Con la rápida acumulación de datos de secuencias en bases de datos públicas y privadas pueden descubrirse SNP comparando secuencias usando programas informáticos (Z. Gu, L. Hillier y P. Y. Kwok, “Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace”, Hum. Mutat. 1998; 12(4):221-225). El SNP puede verificarse y el genotipo o haplotipo de un individuo puede determinarse mediante una variedad de procedimientos que incluyen secuenciación directa y micromatrices de alto rendimiento (P. Y. Kwok, “Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms”, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines y A. Duesterhoeft, “High-throughput SNP genotyping with the Masscode system”, Mol. Diagn. 2000 Dec; 5(4):329-340).
Usando los procedimientos descritos anteriormente, siete SNP y una inserción/deleción de tres bases se identificaron en el transcrito original, 191P4D12(b) v.1, en las posiciones 420 (T/C), 2184 (G/T), 2341 (G/A), 2688 (C/A), 367 (A/G), 699 (C/A), 1590 (C/T), e inserción de GCA entre 1262 y 12631. Los transcritos o proteínas con alelo alternativo se designaron variante 191P4D12(b) v.2 a v.5 y v.10 a v.13, como se muestra en la Figura 10. La Figura 11 muestra el alineamiento esquemático de variantes de proteínas, correspondientes a variantes de nucleótidos. Las variantes de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos que v.1 no se muestran en la Figura 11. Estos alelos de SNP, aunque se muestran por separado aquí, pueden producirse en diferentes combinaciones (haplotipos) y en una cualquiera de las variantes de transcritos (tal como 191P4D12(b) v.9) que contienen el sitio del SNP. El SNP en 2688 de v.1 también se produce en la variante de transcrito v.9 y contribuyó a un cambio de codón de v.9 en el aminoácido 64 de Ala a Asp (Figura 11).
Ejemplo 7: Producción de 191P4D12(b) recombinante en sistemas procariotas
Para expresar 191P4D12(b) recombinante y variantes de 191P4D12(b) en células procariotas, secuencias de 191P4D12(b) de longitud completa o parcial y de ADNc de variantes de 191P4D12(b) se clonan en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Se expresan una o más de las siguientes regiones de las variante de 191P4D12(b): la secuencia de longitud completa presentada en las Figuras 2 y 3, o cualquiera de 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 191P4D12(b), variantes, o análogos de la misma.
A. Construcciones de transcripción y traducción in vitro:
pCRII: Para generar sondas de ARN sentido y antisentido de 191P4D12(b) para investigaciones in situ de ARN se generan construcciones de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) que codifican tanto todo como los fragmentos del ADNc de 191P4D12(b). El vector pCRII tiene promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para accionar la transcripción de ARN de 191P4D12(b) para su uso como sondas en experimentos de hibridación in situ de ARN. Estas sondas se usan para analizar la expresión de células y tejidos de 191P4D12(b) al nivel de ARN. El ARN de 191P4D12(b) transcrito que representa la región codificante de aminoácidos de ADNc del gen 191P4D12(b) se usa en sistemas de traducción in vitro tales como TnT™ Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteína 191P4D12(b).
B. Construcciones bacterianas:
Construcciones de pGEX: Para generar proteínas 191P4D12(b) recombinantes en bacterias que están fusionadas con la proteína glutatión S-transferasa (GST), toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 191P4D12(b) se clonan en la familia pGEX de los vectores de fusión de GST (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteínas 191P4D12(b) recombinantes con GST fusionada en el extremo amino y un epítope de seis histidinas (6X His) en el extremo carboxilo. Las marcas GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-GST y anti-His. La marca de 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3', por ejemplo, del marco de lectura abierto (ORF). Un sitio de escisión proteolítica, tal como el sitio de reconocimiento PreScission™ en pGEX-6P-1, puede emplearse de forma que permita la escisión de la marca GST de la proteína relacionada con 191P4D12(b). El gen de resistencia a ampicilina y el origen pBR322 permiten la selección y el mantenimiento de los plásmidos pGEX en E. coli.
Construcciones de pMAL: Para generar, en bacterias, proteínas 191P4D12(b) recombinantes que están fusionadas con proteína de unión a maltosa (MBP), toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 191P4D12(b) se fusionan con el gen MBP clonando en los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA). Estas construcciones permiten la expresión controlada de secuencias de proteínas 191P4D12(b) recombinantes con MBP fusionada en el extremo amino y una marca de epítope de 6X His en el extremo carboxilo. Las marcas MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante de bacterias inducidas con la matriz de afinidad apropiada y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con anticuerpos anti-MBP y anti-His. La marca de epítope 6X His se genera añadiendo 6 codones de histidina al cebador de clonación de 3'. Un sitio de reconocimiento de factor Xa permite la escisión de la marca pMAL de 191P4D12(b). Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X se optimizan para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o periplasma, respectivamente. La expresión en el periplasma potencia el plegamiento de proteínas con enlaces disulfuro.
Construcciones de pET: Para expresar 191P4D12(b) en células bacterianas, toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 191P4D12(b) se clonan en la familia pET de vectores (Novagen, Madison, WI). Estos vectores permiten la expresión fuertemente controlada de la proteína 191P4D12(b) recombinante en bacterias con y sin fusión con proteínas que potencian la solubilidad, tal como NusA y tiorredoxina (Trx), y marcas de epítopes, tales como 6X His y S-Tag™ que ayudan en la purificación y detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, las construcciones se preparan utilizando el sistema de fusión pET NusA 43.1 de forma que las regiones de la proteína 191P4D12(b) se expresan como fusiones del extremo amino con NusA.
C. Construcciones de levadura:
Construcciones de pESC: Para expresar 191P4D12(b) en las especies de levadura Saccharomyces cerevisiae para la generación de proteína recombinante y estudios funcionales, toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 191P4D12(b) se clonan en la familia pESC de vectores, conteniendo cada uno 1 de los 4 marcadores de selección, HIS3, TRP1, LEU2 y URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Estos vectores permiten la expresión controlada del mismo plásmido de hasta 2 genes diferentes o secuencias clonadas que contienen tanto las marcas de epítopes Flag™ como Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar interacciones proteína-proteína de 191P4D12(b). Además, la expresión en levadura da modificaciones postraduccionales similares tales como glucosilaciones y fosforilaciones, que se encuentran cuando se expresa en células eucariotas.
Construcciones de pESP: Para expresar 191P4D12(b) en las especies de levadura Saccharomyces pombe, toda o partes de la secuencia codificante de proteínas de ADNc de 191P4D12(b) se clonan en la familia pESP de vectores. Estos vectores permiten la expresión controlada de alto nivel de una secuencia de proteínas 191P4D12(b) que está fusionada en tanto el extremo amino como en el extremo carboxilo con GST que ayuda en la purificación de la proteína recombinante. Una marca de epítope Flag™ permite la detección de la proteína recombinante con anticuerpo anti-Flag™.
Ejemplo 8: Producción de 191P4D12(b) recombinante en sistemas eucariotas superiores
A. Construcciones de mamífero:
Para expresar 191P4D12(b) recombinante en células eucariotas, las secuencias de ADNc de 191P4D12(b) de longitud completa o parcial pueden clonarse en una cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o más de las siguientes regiones de 191P4D12(b) se expresan en estas construcciones, aminoácidos 1 a 510, o cualquiera de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 191P4D12(b) v.1, v.2, v.10, v.11, v.12; aminoácidos 1 a 511, o cualquiera de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25; 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de 191P4D12(b) v.13, variantes, o análogos de la misma.
Las construcciones pueden transfectarse en una cualquiera de una amplia variedad de células de mamífero tal como células 293T. Los lisados de células 293T transformadas pueden sondarse con el suero policlonal anti-191P4D12(b), descrito en el presente documento.
Construcciones de pcDNA4/HisMax: Para expresar 191P4D12(b) en células de mamífero, un ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, de 191P4D12(b) se clonaron en pcDNA4/HisMax versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV) y el potenciador de la traducción SP16. La proteína recombinante tiene epítopes de Xpress™ y seis histidinas (6X His) fusionados con el extremo amino. El vector pcDNA4/HisMax también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad de ARNm junto con el origen SV40 para la replicación episómica y el simple rescate de vectores en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a zeocina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
Construcciones de pcDNA3.1/MycHis: Para expresar 191P4D12(b) en células de mamífero, un ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, de 191P4D12(b) con un sitio de iniciación de la traducción de Kozak consenso se clonó en pcDNA3.1/MycHis versión A (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen el epítope de myc y el epítope de 6X His fusionado con el extremo carboxilo. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen SV40 para la replicación episómica y el simple rescate de vectores en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Puede usarse el gen de resistencia a neomicina, ya que permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. La Figura 22 muestra la expresión de 191P4D12(b).pcDNA3.1/MycHis tras la transfección del vector en células 293T. Las células 293T se transfectaron con tanto 191P4D12(b).pcDNA3.1/MycHis como con el vector de control pcDNA3.1/MycHis. Cuarenta horas después, los lisados celulares se recogieron. Las muestras se ejecutaron sobre un gel de acrilamida de SDS-PAGE, se transfirieron y se tiñeron con anticuerpo anti-His. La transferencia se reveló usando el kit de quimioluminiscencia ECL y se visualizó por autorradiografía. Los resultados muestran la expresión de 191P4D12(b) en los lisados de células transfectadas con 191P4D12(b).pcDNA3.1/MycHis (Carril 3), pero no a partir del control pcDNA3.1/MycHis (Carril 4).
Construcción de pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar 191P4D12(b) en células de mamífero y para permitir la detección de las proteínas recombinantes usando fluorescencia, un ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, con un sitio de iniciación de la traducción de Kozak consenso se clonan en pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV). Las proteínas recombinantes tienen la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con el extremo carboxilo que facilita la detección in vivo no invasiva, y estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO también contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para potenciar la estabilidad del ARNm, junto con el origen SV40 para la replicación episómica y el simple rescate de vectores en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a neomicina permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Construcciones adicionales con una fusión de GFP del extremo amino se hacen en pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO que se extiende la longitud entera de una proteína 191P4D12(b).
PAPtag: Un ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, se clona en pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo de una proteína 191P4D12(b) a la vez que fusiona la secuencia señal IgGκ con el extremo amino. También se generan construcciones en las que la fosfatasa alcalina con una secuencia señal IgGκ del extremo amino está fusionada con el extremo amino de una proteína 191P4D12(b). Las proteínas 191P4D12(b) recombinantes resultantes se optimizan para la secreción en los medios de células de mamífero transfectadas y pueden usarse para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con proteínas 191P4D12(b). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del CMV y las proteínas recombinantes también contienen epítopes de myc y 6X His fusionados en el extremo carboxilo que facilitan la detección y purificación. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
pTag5: Un dominio extracelular de 191P4D12(b) v.1 se clonó en el plásmido pTag-5. Este vector es similar a pAPtag, pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Esta construcción genera la proteína 191P4D12(b) con una secuencia señal IgGκ del extremo amino y marcas de epítopes de myc y 6X His en el extremo carboxilo que facilitan la detección y purificación por afinidad. La proteína 191P4D12(b) recombinante resultante se optimiza para la secreción en los medios de células de mamífero transfectadas, y se usa como inmunogén o ligando para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas 191P4D12(b). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del CMV. El gen de resistencia a zeocina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli. La Figura 22 muestra la expresión y secreción del dominio extracelular de 191P4D12(b) tras la transfección del vector 191P4D12(b).pTag5 en células 293T. Las células 293T se transfectaron con 191P4D12(b).pTag5. Cuarenta horas después se recogieron el lisado celular y sobrenadante. Las muestras se ejecutaron en un gel de acrilamida de SDS-PAGE, se transfirieron y se tiñeron con anticuerpo anti-His. La transferencia se reveló usando el kit de quimioluminiscencia ECL y se visualizó por autorradiografía. Los resultados muestran la expresión del plásmido 191P4D12(b).pTag5 del dominio extracelular de 191P4D12(b) en el lisado (Carril 2) y la secreción en el sobrenadante de cultivo (Carril 1).
ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, también se clona en el plásmido pTag-5.
PsecFc: Un ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, también se clona en psecFc. El vector psecFc se ensambló clonando la Fc de la inmunoglobulina humana G1 (IgG) (regiones bisagra, CH2, CH3) en pSecTag2 (Invitrogen, California). Esta construcción genera una fusión de Fc de IgG1 en el extremo carboxilo de las proteínas 191P4D12(b), a la vez que fusiona la secuencia señal IgGK con el extremo N. También se usan las fusiones de 191P4D12(b) que utilizan la región Fc de IgG1 murina. Las proteínas 191P4D12(b) recombinantes resultante se optimizan para secreción en los medios de células de mamífero transfectadas, y pueden usarse como inmunógenos
o para identificar proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con la proteína 191P4D12(b). La expresión de proteínas es accionada a partir del promotor del CMV. El gen de resistencia a higromicina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia a ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
Construcciones de pSR: Para generar líneas celulares de mamífero que expresan 191P4D12(b) constitutivamente, ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, de 191P4D12(b) se clonaron en construcciones pSR. Se generaron retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos por transfección de construcciones pSR en la línea de encapsidación 293T-10A1 o co-transfección de pSR y un plásmido colaborador (que contenía secuencias de encapsidación delecionadas) en las células 293, respectivamente. El retrovirus se usa para infectar una variedad de líneas celulares de mamífero, produciendo la integración del gen clonado, 191P4D12(b), en las líneas de células huésped. La expresión de proteínas es accionada a partir de una repetición terminal larga (LTR). El gen de resistencia a neomicina presente en el vector permite la selección de células de mamífero que expresan las proteínas, y el gen de resistencia a ampicilina y el origen ColE1 permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Los vectores retrovíricos pueden usarse después para infección y generación de diversas líneas celulares usando, por ejemplo, células PC3, NIH-3T3, TsuPr1, 293 o rat-1.
La Figura 23 muestra la expresión estable de 191P4D12(b) tras la transducción de 191P4D12(b).pSR en células 3T3. Se transdujeron células 3T3 con el vector retrovírico pSR que codifica el gen 191P4D12(b). Tras la selección con neomicina, las células se expandieron y se extrajo el ARN. La transferencia Northern con 10 ug de ARN total/carril se sondó con la secuencia de SSH de 191P4D12(b). Los patrones de tamaño en kilobases (kb) se indican al lado. Los resultados muestran la expresión del transcrito de 191P4D12(b) accionado a partir de LTR retrovírica, que migra más lento que el transcrito de 191P4D12(b) de 4 kb endógeno detectado en el control positivo LAPC-4AD.
Se preparan construcciones pSR adicionales que fusionan una marca de epítope tal como la marca FLAG™ con el extremo carboxilo de secuencias de 191P4D12(b) para permitir la detección usando anticuerpos anti-Flag. Por ejemplo, la secuencia de FLAG™ 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEC ID Nº: 60) se añade al cebador de clonación en el extremo 3' de ORF. Se preparan construcciones pSR adicionales para producir tanto proteínas de fusión de GFP y myc/6X His del extremo amino como del extremo carboxilo de las proteínas 191P4D12(b) de longitud completa.
Vectores víricos adicionales: Se preparan construcciones adicionales para administración mediada por virus y expresión de 191P4D12(b). Se logra alto título de virus que conduce a expresión de alto nivel de 191P4D12(b) en sistemas de administración vírica tales como vectores adenovíricos y vectores de amplicón de herpes. Secuencias codificantes de 191P4D12(b) o fragmentos de las mismas se amplifican por PCR y se subclonan en el vector lanzadera AdEasy (Stratagene). La recombinación y la encapsidación de virus se realizan según las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovíricos. Alternativamente, las secuencias codificantes de 191P4D12(b) o fragmentos de las mismas se clonan en el vector HSV-1 (Imgenex) para generar vectores víricos de herpes. Los vectores víricos se usan después para la infección de diversas líneas celulares tales como células PC3, NIH-3T3, 293 o rat-1.
Sistemas de expresión regulada: Para controlar la expresión de 191P4D12(b) en células de mamífero, secuencias codificantes de 191P4D12(b), o porciones de las mismas, se clonan en sistemas de expresión de mamífero regulados tales como el sistema T-Rex (Invitrogen), el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema Ecdysone fuertemente regulado (Stratagene). Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración de 191P4D12(b) recombinante. Estos vectores se usan después para controlar la expresión de 191P4D12(b) en diversas líneas celulares tales como células PC3, NIH-3T3, 293 o rat-1.
B. Sistemas de expresión de baculovirus
Para generar proteínas 191P4D12(b) recombinantes en un sistema de expresión de baculovirus, ORF de 191P4D12(b), o porciones del mismo, se clonan en el vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona una marca de His en el extremo N. Específicamente, pBlueBac-191P4D12(b) se cotransfecta con plásmido colaborador pBac-N-Blue (Invitrogen) en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para generar baculovirus recombinante (véase el manual de instrucciones de Invitrogen para detalles). Entonces se recoge baculovirus del sobrenadante de células y se purifica por ensayo en placa.
Entonces se genera proteína 191P4D12(b) recombinante por infección de células de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificado. La proteína 191P4D12(b) recombinante puede detectarse usando anticuerpo anti191P4D12(b) o anti-marca His. La proteína 191P4D12(b) puede purificarse y usarse en diversos ensayos basados en células o como inmunogén para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para 191P4D12(b).
Ejemplo 9: Perfiles de antigenicidad y estructura secundaria
La Figura 5(A-C), Figura 6(A-C), Figura 7(A-E), Figura 8(A-C) y Figura 9(A-C) representan gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de las variantes 1, 7 y 9 de 191P4D12(b), cada evaluación disponible accediendo al sitio web ProtScale localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) en el servidor de biología molecular ExPasy.
Estos perfiles: Figura 5, Hidrofilia, (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828); Figura 6, Hidropaticidad, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Figura 7, Porcentaje de residuos accesibles (Janin J., 1979 Nature 277:491-492); Figura 8, Flexibilidad promedio, (Bhaskaran R., y Ponnuswamy P.K,1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255); Figura 9, Giro beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294); y opcionalmente otros disponibles en la materia, tal como en el sitio web ProtScale, se usaron para identificar regiones antigénicas de cada una de las proteínas de variantes de 191P4D12(b). Cada uno de los perfiles de aminoácidos anteriores de variantes de 191P4D12(b) se generaron usando los siguientes parámetros de ProtScale para análisis: 1) un tamaño de ventana de 9; 2) 100% en peso de los extremos de ventana en comparación con el centro de la ventana; y, 3) valores del perfil de aminoácidos normalizados para encontrarse entre 0 y 1.
Los perfiles de hidrofilia (Figura 5), hidropaticidad (Figura 6) y porcentaje de residuos accesibles (Figura 7) se usaron para determinar estiramientos de aminoácidos hidrófilos (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de hidrofilia y de porcentaje de residuos accesibles, y valores inferiores a 0,5 en el perfil de hidropaticidad). Es probable que tales regiones se expongan al entorno acuoso, estén presentes sobre la superficie de la proteína y, por tanto, disponibles para reconocimiento inmunitario, tal como por anticuerpos.
Los perfiles de flexibilidad promedio (Figura 8) y giro beta (Figura 9) determinan estiramientos de aminoácidos (es decir, valores superiores a 0,5 en el perfil de giro beta y el perfil de flexibilidad promedio) que no están impuestos en estructuras secundarias tales como láminas beta y hélices alfa. También es más probable que tales regiones se expongan sobre la proteína y, por tanto, sean accesibles al reconocimiento inmunitario, tal como por anticuerpos.
Las secuencias antigénicas de las proteínas de variantes de 191P4D12(b) indicadas, por ejemplo, por los perfiles expuestos en la Figura 5(A-C), Figura 6(A-C), Figura 7(A-C), Figura 8(A-C) y/o la Figura 9(A-C) se usan para preparar inmunógenos, tanto péptidos como ácidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti191P4D12(b) terapéuticos y de diagnóstico. El inmunogén puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican, de las variantes de proteína 191P4D12(b) enumeradas en las Figuras 2 y 3, de las cuales los perfiles de aminoácido se muestran en la Figura 9, o son idénticos a las secuencias de variantes que son las mismas que una variante representada en la Figura 9. En particular, los inmunógenos de péptido de la invención pueden comprender una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en los perfiles de hidrofilia de la Figura 5; una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor inferior a 0,5 en el perfil de hidropaticidad de las Figuras 6; una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de porcentaje de residuos accesibles de la Figura 7; una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en los perfiles de flexibilidad promedio en la Figura 8; y, una región de péptido de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de número entero que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor superior a 0,5 en el perfil de giro beta de las Figuras 9. Los inmunógenos de péptidos de la invención también pueden comprender ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anteriores.
Todos los inmunógenos de la invención, péptido o ácido nucleico, pueden expresarse en forma de dosis unitaria humana, o estar comprendidos por una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana.
La estructura secundaria de las variantes 1, 7, y 9 de la proteína 191P4D12(b), concretamente la presencia y localización predicha de las hélices alfa, cadenas extendidas y bobinas al azar, se predice a partir de la secuencia de aminoácidos primaria usando el procedimiento de Red neural jerárquica HNN (Guermeur,1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa-nn.html), al que se accede por el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/). El análisis indica que la variante 1 de 191P4D12(b) está compuesta por 24,90% de hélice alfa,18,63% de cadena extendida y 56,47% de bobina al azar (Figura 13A). La variante 6 está compuesta por 28,47% de hélice alfa, 19,32% de cadena extendida y 52,20% de bobina al azar (Figura 13B). La variante 7 está compuesta por 26,19% de hélice alfa, 18,76% de cadena extendida y 55,05% de bobina al azar (Figura 13C). La variante 7 está compuesta por 56,20% de hélice alfa, 8,76% de cadena extendida y 35,04% de bobina al azar (Figura 13D).
El análisis para la posible presencia de dominios transmembrana en las proteínas de variantes de 191P4D12(b) se llevó a cabo usando una variedad de algoritmos de predicción transmembrana a los que se accede por el servidor de biología molecular ExPasy localizado en la malla mundial en (.expasy.ch/tools/). En la Figura 13E y 13F se muestran gráficamente los resultados del análisis de la variante 1 que representan la presencia y localización de 1 dominio transmembrana usando el programa TMpred (Figura 13E) y 1 dominio transmembrana usando el programa TMHMM (Figura 13F). En la Figura 13G y 13H se muestran gráficamente los resultados del análisis de la variante 6 que representan la presencia y localización de 1 dominio transmembrana usando el programa TMpred (Figura 13G) y 1 dominio transmembrana usando el programa TMHMM (Figura 13H). En la Figura 13I y 13J se muestran gráficamente los resultados del análisis de la variante 7 que representan la presencia y localización de 1 dominio transmembrana usando el programa TMpred (Figura 13I) y 1 dominio transmembrana usando el programa TMHMM (Figura 13J). En la Figura 13K y 13L se muestran gráficamente los resultados del análisis de la variante 9 que representan la presencia y localización de 2 dominios transmembrana usando el programa TMpred (Figura 1K) y 1 dominio transmembrana usando el programa TMHMM (Figura 13L). Los resultados de cada programa, concretamente los aminoácidos que codifican los dominios transmembrana, se resumen en la Tabla VI y la Tabla L.
Ejemplo 10: Generación de anticuerpos policlonales para 191P4D12(b)
Los anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero, por ejemplo, por una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero por inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples. Además de inmunizar con una variante de proteína 191P4D12(b) de longitud completa, se emplean algoritmos informáticos en el diseño de inmunógenos que, basándose en el análisis de secuencias de aminoácidos, contienen características de ser antigénicas y estar disponibles para el reconocimiento por el sistema inmunitario del huésped inmunizado (véase el ejemplo titulado “Perfiles de antigenicidad y estructuras secundarias”). Se predeciría que tales regiones son hidrófilas, flexibles, en conformaciones de giro beta y están expuestas sobre la superficie de la proteína (véanse, por ejemplo, la Figura 5(A-C), Figura 6(A y C), Figura 7(A-C), Figura 8(A-C) o la Figura 9(A-C) para perfiles de aminoácidos que indican tales regiones de variantes de la proteína 191P4D12(b)).
Por ejemplo, las proteínas o péptidos de fusión bacterianos recombinantes que contienen regiones de giro beta flexibles hidrófilas de variantes de la proteína 191P4D12(b) se usan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos blancos de Nueva Zelanda o anticuerpos monoclonales como se describen en el Ejemplo 11. Por ejemplo, en la variante 1 de 191P4D12(b), tales regiones incluyen, pero no se limitan a, los aminoácidos 27-39, los aminoácidos 93-109 y los aminoácidos. 182-204. En la secuencia única para la variante 7, tales regiones incluyen, pero no se limitan a, los aminoácidos 400-420. En la secuencia específica para la variante 9, tales regiones incluyen, pero no se limitan a, los aminoácidos 80-94. Es útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. En una realización, un péptido que codifica los aminoácidos 52-63 de la variante 1 de 191P4D12(b) y los aminoácidos 179-197 se conjugaron cada uno con KLH y se usaron para inmunizar conejos separados Alternativamente, el agente inmunizante puede incluir toda o porciones de las proteínas de variantes de 191P4D12(b), análogos o proteínas de fusión de las mismas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la variante 1 de 191P4D12(b) puede fusionarse usando técnicas de ADN recombinante con una cualquiera de una variedad de componentes de proteínas de fusión que son muy conocidos en la técnica, tal como proteínas de fusión marcadas con glutatión-S-transferasa (GST) y HIS. En otra realización, los aminoácidos 2-349 de la variante 1 de 191P4D12(b) se fusionaron con GST usando técnicas recombinantes y el vector de expresión pGEX se expresó, purificó y usó para inmunizar un conejo. Tales proteínas de fusión se purifican de bacterias inducidas usando la matriz de afinidad apropiada.
Otras proteínas de fusión bacterianas recombinantes que pueden emplearse incluyen proteína de unión a maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA, o una región constante de inmunoglobulina (véanse la sección titulada “Producción de 191P4D12(b) en sistemas procariotas” y Current Protocols In Molecular Biology, volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul y col. eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N. y Ledbetter, L.(1991) J. Exp. Med. 174, 561-566).
Además de proteínas de fusión derivadas de bacteria, también se usan antígenos de proteínas expresadas en mamífero. Estos antígenos se expresan a partir de vectores de expresión de mamífero tales como los vectores de fusión con Tag5 y Fc (véase la sección titulada “Producción de 191P4D12(b) recombinante en sistemas eucariotas”), y retienen modificaciones postraduccionales tales como glucosilaciones encontradas en la proteína nativa. En una realización, los aminoácidos 31-347 de la variante 1, que codifica el dominio extracelular, se clonó en el vector de secreción de mamífero Tag5, y se expresó en células 293T produciendo una proteína secretada soluble (Figura 22). La proteína recombinante se purifica por cromatografía en quelato metálico a partir de sobrenadantes de cultivo de tejido de células 293T que expresan establemente el vector recombinante. Entonces, la proteína Tag5 191P4D12(b) purificada se usa como inmunogén.
Durante el protocolo de inmunización es útil mezclar o emulsionar el antígeno en adyuvantes que potencien la respuesta inmunitaria del animal huésped. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintético).
En un protocolo típico, conejos se inmunizan inicialmente subcutáneamente con hasta 200 µg, normalmente 100-200 µg, de proteína de fusión o péptido conjugado con KLH mezclada en adyuvante completo de Freund (CFA). Entonces, los conejos se inyectan subcutáneamente cada dos semanas con hasta 200 µg, normalmente 100-200 µg, del inmunogén en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Los sangrados de prueba se toman aproximadamente 710 días tras cada inmunización y se usan para monitorizar el título del antisuero por ELISA.
Para probar la reactividad y especificidad de suero inmune, tal como el suero de conejo derivado de inmunización con la proteína de la variante 1 de Tag5 - 191P4D12(b), el ADNc de la variante 1 de 191P4D12(b) de longitud completa se clona en el vector de expresión pCDNA3.1/myc-his (Invitrogen, véase el ejemplo titulado “Producción de 191P4D12(b) recombinante en sistemas eucariotas”). Después de la transfección de las construcciones en células 293T, los lisados celulares se sondan con el suero anti-191P4D12(b) y con anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para determinar reactividad específica para proteína 191P4D12(b) desnaturalizada usando la técnica de transferencia Western. Además, el suero inmune se prueba por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo e inmunoprecipitación contra 293T (Figura 22) y otras células recombinantes que expresan 191P4D12(b) para determinar el reconocimiento específico de proteína nativa. La transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y técnicas de citometría de flujo usando células que expresan endógenamente 191P4D12(b) también se llevan a cabo para probar la reactividad y especificidad.
El antisuero de conejos inmunizados con proteínas de fusión de variantes de 191P4D12(b), tales como proteínas de fusión GST y MBP, se purifican por agotamiento de anticuerpos reactivos con la secuencia del componente de fusión por pase sobre una columna de afinidad que contiene el componente de fusión tanto solo como en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Por ejemplo, el antisuero derivado de una proteína de fusión de GST-variante 1 de 191P4D12(b) se purifica primero por pase sobre una columna de proteína GST covalentemente acoplada a la matriz AffiGel (BioRad, Hercules, Calif.). Entonces, el antisuero se purifica por afinidad por pase sobre una columna compuesta de una proteína de fusión MBP-191P4D12(b) covalentemente acoplada a matriz de Affigel. Entonces, el suero se purifica adicionalmente por cromatografía de afinidad por proteína G para aislar la fracción de IgG. Los sueros de otros antígenos marcados con His y conejos inmunizados con péptido, además de sueros agotados en componente de fusión, se purifican por afinidad por pase sobre una matriz de columna compuesta por el inmunogén de la proteína original o péptido libre.
Ejemplo 11: Generación de anticuerpos monoclonales para 191P4D12(b) (mAb)
En una realización, los mAb terapéuticos para variantes de 191P4D12(b) comprenden aquellos que reaccionan con epítopes específicos para cada proteína de variante o específicos para secuencias en común entre las variantes que alterarían o modularían la función biológica de las variantes de 191P4D12(b), por ejemplo, aquellas que alterarían la interacción con ligandos y componentes de unión. Los inmunógenos para la generación de tales mAb incluyen aquellos diseñados para codificar o contener la secuencia de la variante de la proteína 191P4D12(b) entera, regiones de las variantes de la proteína 191P4D12(b) que se predice que son antigénicas del análisis informático de la secuencia de aminoácidos (véanse, por ejemplo, la Figura 5(A-C), Figura 6(A-C), Figura 7(A-C), Figura 8(A-C) o la Figura 9(A-C), y el ejemplo titulado “Perfiles de antigenicidad”). Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes y proteínas Tag 5 expresadas de mamífero y proteínas de fusión de IgG-Fc humanas y murinas. Además, células manipuladas para expresar altos niveles de una variante de 191P4D12(b) respectiva, tales como células Pre-B murinas de la variante 1 de 293T-191P4D12(b) o la variante 1 de 300.19-191P4D12(b), se usan para inmunizar ratones.
Para generar mAb para una variante de 191P4D12(b), los ratones se inmunizan primero intraperitonealmente (IP) con, normalmente, 10-50 µg de inmunogén de proteína o 107 células que expresan 191P4D12(b) mezcladas en adyuvante completo de Freund. Entonces, los ratones se inmunizan posteriormente IP cada 2-4 semanas con, normalmente, 10-50 µg de inmunogén de proteína o 107 células mezcladas en adyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, en las inmunizaciones se usa adyuvante MPL-TDM. Además de la proteína anterior y las estrategias de inmunización basadas en célula, se emplea un protocolo de inmunización basado en ADN en el que un vector de expresión de mamífero que codifica una secuencia de variante de 191P4D12(b) se usa para inmunizar ratones por inyección directa del ADN de plásmido. Por ejemplo, los aminoácidos 31-347 se clonaron en el vector de secreción de mamífero Tag5 y el vector recombinante se usará entonces como inmunogén. En otro ejemplo, los mismos aminoácidos se clonan en un vector de secreción de fusión de Fc en el que la secuencia de la variante 1 de 191P4D12(b) está fusionada en el extremo amino con una secuencia conductora IgK y en el extremo carboxilo con la secuencia codificante de la región Fc de IgG humana o murina. Entonces, este vector recombinante se usa como inmunogén. Los protocolos de inmunización de plásmidos se usan en combinación con proteínas purificadas expresadas a partir del mismo vector y con células que expresan la variante respectiva de 191P4D12(b).
Durante el protocolo de inmunización, sangrados de prueba se toman 7-10 días tras una inyección para monitorizar título y especificidad de la respuesta inmunitaria. Una vez se obtiene la reactividad y especificidad apropiada como se ha determinado por análisis de ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía de fluorescencia y de citometría de flujo, entonces se lleva a cabo la fusión y generación de hibridomas con procedimientos establecidos muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).
En una realización para generar anticuerpos monoclonales para 191P4D12(b), un antígeno de la variante 1 de Tag5191P4D12(b) que codifica los aminoácidos 31-347 se expresó (Figura 22) y luego se purificó a partir de células 293T establemente transfectadas. Ratones Balb C se inmunizan inicialmente intraperitonealmente con 25 µg de proteína de la variante 1 de Tag5-191P4D12(b) mezclada en adyuvante completo de Freund. Los ratones se inmunizan posteriormente cada dos semanas con 25 µg del antígeno mezclado en adyuvante incompleto de Freund durante un total de tres inmunizaciones. El ELISA usando el antígeno Tag5 determina el título de suero de ratones inmunizados. La reactividad y especificidad de suero por la variante 1 de la proteína 191P4D12(b) de longitud completa se monitoriza por transferencia Western, inmunoprecipitación y citometría de flujo usando células 293T transfectadas con un vector de expresión que codifica el ADNc de la variante 1 de 191P4D12(b) (véanse, por ejemplo, el ejemplo titulado “Producción de 191P4D12(b) recombinante (a) y (b) en sistemas eucariotas” y la Figura 22). También se usan otras células que expresan la variante 1 de 191P4D12(b) recombinante o células que expresan endógenamente la variante 1 de 191P4D12(b). A los ratones que muestran la reactividad más fuerte se les deja descansar y se les administra una inyección final de antígeno Tag5 en PBS y luego se sacrifican cuatro días después. Los bazos de los ratones sacrificados se recogen y se fusionan con células de mieloma SPO/2 usando procedimientos convencionales (Harlow y Lane, 1988). Los sobrenadantes de pocillos de crecimiento seleccionados con HAT se criban por ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo para identificar clones productores de anticuerpos específicos para 191P4D12(b).
Para generar anticuerpos monoclonales que son específicos para cada proteína de variante de 191P4D12(b) se diseñan inmunógenos para codificar secuencias únicas para cada variante. En una realización, un antígeno de fusión de GST que codifica la secuencia de la variante 9 de 191P4D12(b) (aa 1-137) se produce, se purifica y se usa como inmunogén para derivar anticuerpos monoclonales específicos para la variante 2 de 191P4D12(b). En otra realización, un péptido antigénico compuesto por los aminoácidos 400-420 de la variante 7 de 191P4D12(b) se acopla a KLH y se usa como inmunogén. Entonces, los sobrenadantes de hibridoma se criban sobre el antígeno respectivo y luego se criban adicionalmente sobre células que expresan la variante específica y se criban de forma cruzada sobre células que expresan las otras variantes para derivar anticuerpos monoclonales específicos para variante.
La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal para variante de 191P4D12(b) se determina usando tecnologías convencionales. Las mediciones de la afinidad cuantifican la fuerza de la unión del anticuerpo al epítope y se usan para ayudar a definir qué anticuerpos monoclonales para variante de 191P4D12(b) son preferidos para uso de diagnóstico o terapéutico, como se aprecia por un experto en la materia. El sistema BIAcore (Uppsala, Suecia) es un procedimiento preferido para determinar la afinidad de unión. El sistema BIAcore usa resonancia de plasmones superficiales (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para monitorizar interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis BIAcore genera convenientemente constantes de asociación, constante de disociación, constantes de disociación en equilibrio y constantes de afinidad.
Ejemplo 12: Ensayos de unión de clase I y clase II de HLA
Los ensayos de unión de clase I y clase II de HLA usando moléculas de HLA purificadas se realizan según protocolos desvelados (por ejemplo, publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney y col., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney y col., J. Immunol. 154:247 (1995); Sette y col., Mol. Immunol. 31:813 (1994)). Brevemente, moléculas de MHC purificadas (5 a 500 nM) se incuban con diversos inhibidores de péptidos sin marcar y péptidos de sonda radiomarcados con 125I 1-10 nM como se ha descrito. Tras la incubación, los complejos MHC-péptido se separan del péptido libre por filtración en gel y la fracción de péptido unida se determina. Normalmente, en experimentos preliminares, cada preparación de MHC se valora en presencia de cantidades fijas de péptidos radiomarcados para determinar la concentración de moléculas de HLA necesaria para unirse al 10-20% de la radiactividad total. Todos los ensayos de inhibición y de unión directa posteriores se realizan usando estas concentraciones de HLA.
Como bajo estas condiciones [marca]<[HLA] y CI50≥[HLA], los valores de CI50 medidos son aproximaciones razonables de los valores de KD reales. Los inhibidores de péptidos se prueban normalmente a concentraciones que oscilan de 120 µg/ml a 1,2 ng/ml, y se prueban en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en experimentos diferentes, para cada péptido se calcula una cifra de unión relativa dividiendo la CI50 de un control positivo para la inhibición entre la CI50 para cada péptido probado (normalmente versiones sin marcar del péptido de sonda radiomarcado). Para fines de bases de datos, y comparaciones entre experimentos, los valores de unión relativa se compilan. Estos valores pueden convertirse de nuevo posteriormente en valores de nM de CI50 dividiendo nM de CI50 de los controles positivos para la inhibición entre la unión relativa del péptido de interés. Este procedimiento de compilación de datos es preciso y coherente para comparar péptidos que han sido probados en diferentes días, o con diferentes lotes de MHC purificado.
Los ensayos de unión como se explican resumidamente anteriormente pueden usarse para analizar péptidos que llevan supermotivos de HLA y/o motivos de HLA (véase la Tabla IV).
Ejemplo 13: Identificación de epítopes candidatos de CTL que llevan supermotivos y motivos de HLA
Las composiciones de vacuna de HLA de la invención pueden incluir múltiples epítopes. Los múltiples epítopes pueden comprender múltiples supermotivos o motivos de HLA para lograr una amplia cobertura de la población. Este ejemplo ilustra la identificación y confirmación de epítopes que llevan supermotivos y motivos para la inclusión en una composición de vacuna tal. El cálculo de la cobertura de la población se realiza usando la estrategia descrita más adelante.
Búsquedas y algoritmos informáticos para la identificación de epítopes que llevan supermotivos y/o motivos
Las búsquedas realizadas para identificar las secuencias de péptidos que llevan motivos en el ejemplo titulado “Perfiles de antigenicidad” y las Tablas VIII-XXI y XXII-XLIX emplean los datos de secuencias de proteínas del producto del gen 191P4D12(b) expuesto en las Figuras 2 y 3, los péptidos de búsqueda específicos usados para generar las tablas se enumeran en la Tabla VII.
Las búsquedas informáticas para epítopes que llevan supermotivos o motivos de clase I o clase II de HLA se realizan del siguiente modo. Todas las secuencias de proteínas 191P4D12(b) traducidas se analizan usando un programa de software de búsqueda de cadenas de texto para identificar posibles secuencias de péptidos que contengan motivos de unión de HLA apropiados; tales programas se producen fácilmente según información en la materia en vista de divulgaciones de motivos/supermotivos conocidas. Además, tales cálculos pueden hacerse mentalmente. Las secuencias de supermotivos A2, A3 y DR identificadas se puntúan usando algoritmos polinómicos para predecir su capacidad para unirse a moléculas de clase I o de clase II de HLA específicas. Estos algoritmos polinómicos explican el impacto de diferentes aminoácidos en diferentes posiciones, y están esencialmente basados en la premisa de que la afinidad global (o ΔG) de interacciones péptido-molécula de HLA puede aproximarse a una función polinómica lineal del tipo:
“ΔG” = a1i × a2i × a3i ...... × ani
en la que aji es un coeficiente que representa el efecto de la presencia de un aminoácido (j) dado en una posición (i) dada a lo largo de la secuencia de un péptido de n aminoácidos. La suposición crucial de este procedimiento es que los efectos en cada posición son esencialmente independientes entre sí (es decir, unión independiente de cadenas laterales individuales). Cuando el residuo j se produce en la posición i en el péptido, se supone que contribuye a una cantidad constante ji a la energía libre de unión del péptido independientemente de la secuencia del resto del péptido.
El procedimiento de derivación de coeficientes de algoritmos específicos se ha descrito en Gulukota y col., J. Mol. Biol. 267:1258-126, 1997; (véanse también Sidney y col., Human Immunol. 45:79-93, 1996; y Southwood y col., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998). Brevemente, para todas las posiciones i, de anclaje y similares a no anclaje, la media geométrica de la unión relativa promedio (ARB) de todos los péptidos que llevan j se calcula con respecto al resto del grupo, y se usa como el cálculo aproximado de ji. Para los péptidos de clase II, si son posibles múltiples alineamientos, sólo se utiliza el alineamiento de mayor puntuación, siguiente un procedimiento iterativo. Para calcular una puntuación de algoritmo de un péptido dado en un conjunto de prueba, los valores de ARB correspondientes a la secuencia del péptido se multiplican. Si este producto supera un umbral elegido, se predice que el péptido se une. Umbrales apropiados se eligen en función del grado de rigurosidad de la predicción deseada.
Selección de péptidos reactivos de forma cruzada del supertipo HLA-A2
Secuencias de proteínas de 191P4D12(b) se barren utilizando software de identificación de motivos para identificar secuencias de 8-, 9- 10- y 11-meros que contienen la especificidad de anclaje principal del supermotivo HLA-A2. Normalmente, estas secuencias se puntúan luego usando el protocolo descrito anteriormente y se sintetizan los péptidos correspondientes a las secuencias de puntuación positiva y se prueban para su capacidad para unirse a moléculas de HLA-A*0201 purificadas in vitro (HLA-A*0201 se considera una molécula de supertipo de prototipo A2).
Entonces, estos péptidos se prueban para la capacidad para unirse a moléculas de supertipo A2 adicionales (A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802). Los péptidos que se unen a al menos tres de los cinco alelos del supertipo A2 probados son normalmente considerados ligantes reactivos de forma cruzada del supertipo A2. Los péptidos preferidos se unen a una afinidad igual a o inferior a 500 nM a tres o más moléculas de supertipo HLA-A2.
Selección de epítopes que llevan supermotivos HLA-A3
La(s) secuencia(s) de proteína 191P4D12(b) barrida(s) anteriormente también se examina(n) para la presencia de péptidos con los anclajes primarios del supermotivo HLA-A3. Entonces, los péptidos correspondientes a las secuencias que llevan el supermotivo HLA-A3 se sintetizan y se prueban para unirse a moléculas HLA-A*0301 y HLA-A*1101, las moléculas codificadas por los dos alelos del supermotivo A3 más prevalentes. Entonces, los péptidos que se unen a al menos uno de los dos alelos con afinidades de unión de ≤500 nM, frecuentemente ≤ 200 nM, se prueban para la reacción cruzada de unión con los otros alelos de supertipo A3 comunes (por ejemplo, A*3101, A*3301 y A*6801) para identificar aquellos que pueden unirse a al menos tres de las cinco moléculas de supertipo HLA-A3 probadas.
Selección de epítopes que llevan supermotivos HLA-B7
La(s) proteína(s) 191P4D12(b) barrida(s) anteriormente también se analiza(n) para la presencia de péptidos 8-, 9-, 10- u 11-meros con el supermotivo HLA-B7. Se sintetizan péptidos correspondientes y se prueban para unirse a HLA-B*0702, la molécula codificada por el alelo de supertipo B7 más común (es decir, el alelo del supertipo de prototipo B7). Los péptidos que se unen a B*0702 con CI50 de ≤500 nM se identifican usando procedimientos convencionales. Entonces, estos péptidos se prueban para unirse a otras moléculas de supertipo B7 comunes (por ejemplo, B*3501, B*5101, B*5301, y B*5401). Así se identifican los péptidos que pueden unirse a tres o más de los cinco alelos de supertipo B7 probados.
Selección de epítopes que llevan motivos A1 y A24
Para aumentar adicionalmente la cobertura de población, epítopes de HLA-A1 y -A24 también puede incorporarse en composiciones de vacuna. Un análisis de la proteína 191P4D12(b) también puede realizarse para identificar secuencias que contienen motivos HLA-A1-y A24.
Los epítopes de unión con alta afinidad y/o reactivos de forma cruzada que llevan otros motivos y/o supermotivos se identifican usando metodología análoga.
Ejemplo 14: Confirmación de inmunogenicidad
Los péptidos que llevan el supermotivo A2 de CTL candidatos reactivos de forma cruzada que se identifican como se describe en el presente documento se seleccionan para confirmar la inmunogenicidad in vitro. La confirmación se realiza usando la siguiente metodología:
Líneas celulares diana para cribado celular:
La línea celular 221A2.1 producida por transferencia del gen HLA-A2.1 en la línea celular B-linfoblastoide humana mutante nula de HLA-A, -B, -C 721.221 se usa como diana cargada por péptido para medir la actividad de CTL limitados a HLA-A2.1. Esta línea celular se cultiva en medio RPMI-1640 complementado con antibióticos, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y 10% (v/v) de SBF inactivado por calor. Las células que expresan un antígeno de interés, o transfectantes que comprenden el gen que codifica el antígeno de interés, pueden usarse como células diana para confirmar la capacidad de CTL específicos para péptido para reconocer antígeno endógeno.
Cultivos de inducción de CTL primarios:
Generación de células dendríticas (CD): se descongelan PBMC en RPMI con 30 µg/ml de ADNsa, se lavan dos veces y se resuspenden en medio completo (RPMI-1640 más 5% de suero AB humano, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, L-glutamina y penicilina/estreptomicina). Los monocitos se purifican sembrando 10×106 PBMC/pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de 2 horas a 37ºC, las células no adherentes se eliminan agitando cuidadosamente las placas y aspirando los sobrenadantes. Los pocillos se lavan un total de tres veces con 3 ml de RPMI para eliminar la mayoría de las células no adherentes y libremente adherentes. Entonces se añaden tres ml de medio completo que contiene 50 ng/ml de GM-CSF y 1.000 U/ml de IL-4 a cada pocillo. Se añade TNF a las CD en el día 6 a 75 ng/ml y las células se usan para cultivos de inducción de CTL en el día 7.
Inducción de CTL con CD y péptido: linfocitos T CD8+ se aíslan por selección positiva con perlas inmunomagnéticas Dynal (Dynabeads® M-450) y el reactivo Detacha-bead®. Normalmente, aproximadamente 200-250×106 PBMC se procesan para obtener 24×106 linfocitos T CD8+ (suficientes para un cultivo en placa de 48 pocillos). Brevemente, las PBMC se descongelan en RPMI con 30 µg/ml de ADNsa, se lavan una vez con PBS que contiene 1% de suero AB humano y se resuspenden en PBS/1% de suero AB a una concentración de 20×106 células/ml. Las perlas magnéticas se lavan 3 veces con PBS/suero AB, se añaden a las células (140 µl de perlas/20×106 células) y se incuban durante 1 hora a 4ºC con mezcla continua. Las perlas y células se lavan 4x con PBS/suero AB para eliminar las células no adherentes y se resuspenden a 100×106 células/ml (basado en el número de células original) en PBS/suero AB que contiene 100 µl/ml de reactivo Detacha-bead® y 30 µg/ml de ADNsa. La mezcla se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con mezcla continua. Las perlas se lavan de nuevo con PBS/AB/ADNsa para recoger los linfocitos T CD8+. Las CD se recogen y se centrifugan a 1300 rpm durante 5-7 minutos, se lavan una vez con PBS con 1% de BSA, se cuentan y se pulsan con 40 µg/ml de péptido a una concentración de células de 12×106/ml en presencia de 3 µg/ml de 2-microglobulina durante 4 horas a 20ºC. Entonces, las CD se irradian (4.200 rad), se lavan 1 vez con medio y se cuentan de nuevo.
Establecimiento de cultivos de inducción: 0,25 ml de CD generadas por citocinas (a 1×105 células/ml) se co-cultivan con 0,25 ml de linfocitos T CD8+ (a 2×106 célula/ml) en cada pocillo de una placa de 48 pocillos en presencia de 10 ng/ml de IL-7. Se añade IL-10 humana recombinante al día siguiente a una concentración final de 10 ng/ml y se añade IL-2 humana recombinante 48 horas después a 10 UI/ml.
Reestimulación de los cultivos de inducción con células adherentes pulsadas con péptido: Siete y catorce días después de la inducción primaria, las células se reestimularon con células adherentes pulsadas con péptido. Las PBMC se descongelan y se lavan dos veces con RPMI y ADNsa. Las células se resuspenden a 5×106 células/ml y se irradian a ~4200 rad. Las PBMC se siembran en placa a 2×106 en 0,5 ml de medio completo por pocillo y se incuban durante 2 horas a 37ºC. Las placas se lavan dos veces con RPMI golpeando cuidadosamente la placa para eliminar las células no adherentes y las células adherentes se pulsan con 10 µg/ml de péptido en presencia de 3 µg/ml de 2-microglobulina en 0,25 ml de RPMl/5% de AB por pocillo durante 2 horas a 37ºC. La disolución de péptido de cada pocillo se aspira y los pocillos se lavan una vez con RPMI. La mayoría del medio se aspira de los cultivos de inducción (células CD8+) y se llevan a 0,5 ml con medios frescos. Entonces, las células se transfieren a los pocillos que contienen las células adherentes pulsadas con péptido. Veinticuatro horas después se añade lL-10 humana recombinante a una concentración final de 10 ng/ml y al día siguiente se añade IL-2 humana recombinante y de nuevo 2-3 días después a 50 UI/ml (Tsai y col., Critical Reviews in Immunology 18(1-2):65-75, 1998). Siete días después, los cultivos se ensayan para actividad de CTL en un ensayo de liberación de 51Cr. En algunos experimentos, los cultivos se ensayan para reconocimiento específico para péptido en el ELISA de IFN in situ en el momento de la segunda reestimulación, seguido de ensayo de reconocimiento endógeno 7 días después. Después de la expansión, la actividad se mide en ambos ensayos para una comparación en paralelo.
Medición de la actividad lítica de CTL por liberación de 51Cr.
Siete días después de la segunda reestimulación, la citotoxicidad se determina en un ensayo de liberación de 51Cr convencional (5 h) ensayando pocillos individuales a una única E:D. Las dianas pulsadas con péptido se preparan incubando las células con 10 µg/ml de péptido durante la noche a 37ºC.
Las células adherentes diana se extraen de los matraces de cultivo con tripsina-EDTA. Las células diana se marcan con 200 µCi de cromato de sodio 51Cr (Dupont, Wilmington, DE) durante 1 hora a 37ºC. Las células diana marcadas se resuspenden a 106 por ml y se diluyen 1:10 con células K562 a una concentración de 3,3×106/ml (una línea celular de eritroblastoma sensible a NK usada para reducir lisis no específica). Las células diana (100 µl) y las efectoras (100 µl) se siembran en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se incuban durante 5 horas a 37ºC. En ese momento, 100 µl de sobrenadante se recogen de cada pocillo y el porcentaje de lisis se determina según la fórmula:
[(cpm de la muestra de prueba - cpm de la muestra de liberación espontánea de 51Cr ) / (cpm de la muestra de liberación máxima de 51Cr - cpm de la muestra de liberación espontánea de 51Cr)] x 100
La liberación máxima y espontánea se determina incubando las dianas marcadas con 1% de Triton X-100 y medios solos, respectivamente. Un cultivo positivo se define como uno en el que la lisis específica (muestra - referencia) es el 10% o superior en el caso de pocillos individuales y es el 15% o más en las dos mayores relaciones E:D cuando se ensayan cultivos ampliados.
Medición in situ de la producción de IFN humano como indicador de reconocimiento específico y endógeno para péptidos
Placas lmmulon 2 se recubren con anticuerpo monoclonal de ratón anti-IFN humano (4 µg/ml de NaHCO3 0,1 M, pH 8,2) durante la noche a 4ºC. Las placas se lavan con PBS libre de Ca2+, Mg2+/0,05% de Tween 20 y se bloquean con PBS/10% de SBF durante dos horas, después de lo cual se añaden CTL (100 µl/pocillo) y dianas (100 µl/pocillo a cada pocillo, dejando pocillos vacíos para los patrones y blancos (que sólo recibieron medio). Las células diana, tanto pulsadas con péptido como dianas endógenas, se usan a una concentración de 1×106 células/ml. Las placas se incuban durante 48 horas a 37ºC con 5% de CO2.
Se añade IFN-gamma humano recombinante a los pocillos convencionales empezando a 400 pg o 1200 µg/100 microlitro/pocillo y la placa se incuba durante dos horas a 37ºC. Las placas se lavan y se añaden 100 µl de anticuerpo monoclonal de ratón anti-IFN-gamma humano biotinilado (2 microgramos/ml en PBS/3% de SBF/0,05% de Tween 20) y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar de nuevo se añaden 100 microlitros de HRP-estreptavidina (1:4000) y las placas se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Entonces, las placas se lavan 6x con tampón de lavado, se añaden 100 microlitros/pocillo de disolución de revelado (TMB 1:1) y se deja que las placas se revelen durante 5-15 minutos. La reacción se detiene con 50 microlitros/pocillo de H3PO4 1 M y se leen a DO450. Un cultivo se considera positivo si mide al menos 50 pg de IFN-gamma/pocillo por encima de la referencia y es dos veces el nivel de referencia de la expresión.
Expansión de CTL.
Aquellos cultivos que demuestran actividad lítica específica contra dianas pulsadas con péptido y/o dianas de tumor se expanden durante un periodo de dos semanas con anti-CD3. Brevemente, 5×104 células CD8+ se añaden a un matraz T25 que contiene lo siguiente: 1×106 PBMC irradiadas (4.200 rad) (autólogas o alógenas) por ml, 2×105 células transformadas con EBV irradiadas (8.000 rad) por ml y OKT3 (anti-CD3) a 30 ng por ml en RPMI-1640 que contiene 10% (v/v) de suero AB humano, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol 25 µM, Lglutamina y penicilina/estreptomicina. Se añade IL-2 humana recombinante 24 horas después a una concentración final de 200 UI/ml y cada tres días después medio fresco a 50 UI/ml. Las células se fraccionan si la concentración de células supera 1×106/ml y los cultivos se ensayan entre los días 13 y 15 a relaciones E:D de 30,10, 3 y 1:1 en el ensayo de liberación de 51Cr o a 1×106/ml en el ensayo de IFN in situ usando las mismas dianas que antes de la expansión.
Los cultivos se expanden en ausencia de anti-CD3+ del siguiente modo. Se seleccionan aquellos cultivos que demuestran actividad lítica específica contra dianas de péptido y endógenas y se añaden 5×104 células CD8+ a un matraz T25 que contiene lo siguiente: 1×106 PBMC autólogas por ml que han sido pulsadas con péptido con 10 µg/ml de péptido durante dos horas a 37ºC y se irradian (4.200 rad); 2×105 células transformadas con EBV irradiadas (8.000 rad) por ml de RPMI-1640 que contiene 10% (v/v) de suero AB humano, aa no esenciales, piruvato de sodio, 2-ME 25 mM, L-glutamina y gentamicina.
Inmunogenicidad de péptidos que llevan supermotivos A2
Los péptidos de unión reactivos de forma cruzada con supermotivos A2 se prueban en el ensayo celular para la capacidad para inducir CTL específicos para péptidos en individuos normales. En este análisis, un péptido se considera normalmente que es un epítope si induce CTL específicos para péptidos en al menos individuos, y preferentemente, también reconoce el péptido endógenamente expresado.
La inmunogenicidad también puede confirmarse usando PBMC aisladas de pacientes que tienen un tumor que expresa 191P4D12(b). Brevemente, PBMC se aíslan de pacientes, se re-estimulan con monocitos pulsados con péptido y se ensayan para la capacidad para reconocer células diana pulsadas con péptido, además de células transfectadas endógenamente que expresan el antígeno.
Evaluación de la inmunogenicidad de A*03/A11
Los péptidos de unión reactivos de forma cruzada que llevan supermotivos HLA-A3 también se evalúan para inmunogenicidad usando metodología análoga a la usada para evaluar la inmunogenicidad de los péptidos con supermotivos HLA-A2.
Evaluación de la inmunogenicidad de B7
El cribado de inmunogenicidad de los péptidos de unión reactivos de forma cruzada de supertipo B7 identificados como se expone en el presente documento se confirma de un modo análogo a la confirmación de péptidos de unión con supermotivos A2 y A3.
Los péptidos que llevan otros supermotivos/motivos, por ejemplo, HLA-A1, HLA-A24, etc., también se confirman usando metodología similar
Ejemplo 15: Implementación del supermotivo extendido para mejorar la capacidad de unión de epítopes nativos creando análogos
Los motivos y supermotivos de HLA (que comprenden residuos primarios y/o secundarios) son útiles en la identificación y preparación de péptidos nativos altamente reactivos de forma cruzada, como se demuestra en el presente documento. Además, la definición de motivos y supermotivos de HLA también permite manipular epítopes altamente reactivos de forma cruzada identificando residuos dentro de una secuencia de péptidos nativa que puede analogizarse para conferir al péptido ciertas características, por ejemplo, mayor reactividad cruzada dentro del grupo de moléculas de HLA que comprenden un supertipo, y/o mayor afinidad de unión por algunas o todas aquellas moléculas de HLA. Ejemplos de péptidos de analogización que presentan afinidad de unión modulada se exponen en este ejemplo.
Analogización en residuos de anclaje primarios
Se implementan estrategias de manipulación de péptidos para aumentar adicionalmente la reactividad cruzada de los epítopes. Por ejemplo, los anclajes principales de péptidos que llevan supermotivos A2 se alteran, por ejemplo, para introducir un L, I, V o M preferido en la posición 2, y I o V en el extremo C.
Para analizar la reactividad cruzada de los péptidos análogos, cada análogo manipulado se prueba inicialmente para unirse al alelo de supertipo de prototipo A2 A*0201, luego, si se mantiene la capacidad de unión por A*0201, para la reactividad cruzada de supertipo A2.
Alternativamente, se confirma que un péptido se une a uno o a todos los miembros de supertipo y luego se analogiza para modular la afinidad de unión por uno cualquiera (o más) de los miembros de supertipo para añadir cobertura de la población.
La selección de análogos para inmunogenicidad en un análisis de cribado celular está normalmente adicionalmente limitada por la capacidad del péptido natural (WT) parental para unirse al menos débilmente, es decir, unirse a una CI50 de 5000 nM o menos, a tres o más alelos de supertipo A2. El fundamento para este requisito es entonces que los péptidos WT deben estar presentes endógenamente en cantidad suficiente para ser biológicamente relevantes. Se ha mostrado que los péptidos analogizados tienen una inmunogenicidad y reactividad cruzada elevada por linfocitos T específicos para el epítope parental (véanse, por ejemplo, Parkhurst y col., J. Immunol. 157:2539, 1996; y Pogue y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8166,1995).
En el cribado celular de estos análogos de péptidos es importante confirmar que los CTL específicos para análogo también pueden reconocer el péptido natural y, si es posible, células diana que expresan endógenamente el epítope.
Analogización de péptidos que llevan supermotivos HLA-A3 y B7
Los análogos de epítopes que llevan supermotivos HLA-A3 se generan usando estrategias similares a aquellas empleadas en analogizar péptidos que llevan supermotivos HLA-A2. Por ejemplo, péptidos que se unen a 3/5 de las moléculas de supertipo A3 se manipulan en los residuos de anclaje primarios para poseer un residuo preferido (V, S, M, o A) en la posición 2.
Entonces, los péptidos análogos se prueban para la capacidad para unirse a A*03 y A*11 (alelos de supertipo de prototipo A3). Entonces, se confirma que aquellos péptidos que demuestran ≤ 500 nM de capacidad de unión tienen reactividad cruzada por supertipo A3.
Similarmente a los péptidos que llevan motivos A2 y A3, los péptidos que se unen a 3 o más alelos de supertipo B7 pueden mejorarse, cuando sea posible, para lograr un aumento de la unión reactiva de forma cruzada o mayor afinidad de unión o semivida de unión. Los péptidos que llevan supermotivos B7 son, por ejemplo, manipulados para poseer un residuo preferido (V, I, L o F) en la posición de anclaje primaria del extremo C, como se demuestra por Sidney y col. (J. Immunol,157:3480-3490,1996).
La analogización de los residuos de anclaje de otros epítopes que llevan motivos y/o supermotivos se realiza de un modo similar.
Entonces, los péptidos análogos se confirman para inmunogenicidad, normalmente en un ensayo de cribado celular. De nuevo, es generalmente importante demostrar que los CTL específicos para análogos también pueden reconocer el péptido natural y, cuando sea posible, dianas que expresan endógenamente el epítope.
Analogización en residuos de anclaje secundarios
Además, los supermotivos de HLA son de valor en la manipulación de péptidos altamente reactivos de forma cruzada y/o péptidos que se unen a moléculas de HLA con elevada afinidad identificando residuos particulares en posiciones de anclaje secundarias que están asociadas a tales propiedades. Por ejemplo, se analiza la capacidad de unión de un péptido que lleva supermotivo B7 con un residuo F en la posición 1. Entonces, el péptido se analogiza para, por ejemplo, sustituir L por F en la posición 1. El péptido analogizado se evalúa para el aumento de afinidad de unión, semivida de unión y/o aumento de reactividad cruzada. Un procedimiento tal identifica péptidos analogizados con propiedades potenciadas.
Los análogos manipulados con capacidad de unión o reactividad cruzada suficientemente mejorada también pueden probarse para inmunogenicidad en ratones transgénicos HLA-B7, siguiendo, por ejemplo, inmunización con IFA o inmunización con lipopéptido. Los péptidos analogizados se prueban adicionalmente para la capacidad para estimular una respuesta de rellamada usando PBMC de pacientes con tumores que expresan 191P4D12(b).
Otras estrategias analogizantes
Otra forma de analogizar péptidos, sin relacionar con posiciones de anclaje, implica la sustitución de una cisteína con ácido -aminobutírico. Debido a su naturaleza química, la cisteína tiene la propensión para formar puentes disulfuro y alterar suficientemente el péptido estructuralmente de manera que se reduzca la capacidad de unión. La sustitución de ácido -aminobutírico con cisteína no sólo alivia este problema, sino que se ha mostrado que mejora las capacidades de unión y reticulación en algunos casos (véase, por ejemplo, la revisión por Sette y col., en: Persistent Viral Infections, Eds. R. Ahmed y I. Chen, John Wiley & Sons, England, 1999).
Por tanto, por el uso de sustituciones de un único aminoácido pueden modularse las propiedades de unión y/o la reactividad cruzada de ligandos de péptido para moléculas de supertipo de HLA.
Ejemplo 16: Identificación y confirmación de secuencias derivadas de 191P4D12(b) con motivos de unión HLA-DR
Los epítopes de péptidos que llevan un supermotivo o motivo de clase II de HLA se identifican y confirman como se explica resumidamente más adelante usando metodología similar a la descrita para péptidos de clase I de HLA.
Selección de epítopes que llevan supermotivos HLA-DR Para identificar epítopes de HTL de clase II derivados de 191P4D12(b), un antígeno de 191P4D12(b) se analiza para la presencia de secuencias que llevan un motivo o supermotivo HLA-DR. Específicamente, se seleccionan secuencias de 15-meros que comprenden un supermotivo DR, que comprende un núcleo de 9-mero, y regiones flanqueantes del extremo N y C de tres residuos (15 aminoácidos totales).
Se han desarrollado protocolos para predecir la unión de péptidos a moléculas DR (Southwood y col., J. lmmunol. 160:3363-3373,1998). Estos protocolos, específicos para moléculas de DR individuales, permiten la puntuación y clasificación de regiones de núcleo de 9-mero. Cada protocolo no sólo puntúa secuencias de péptidos para la presencia de anclajes primarios de supermotivos DR (es decir, en la posición 1 y la posición 6) dentro de un núcleo de 9-mero, sino que evalúa adicionalmente secuencias para la presencia de anclajes secundarios. Usando tablas de selección específicas para alelo (véase, por ejemplo, Southwood y col., véase arriba) se ha encontrado que estos protocolos seleccionan eficientemente secuencias de péptidos con una alta probabilidad de unirse a molécula de DR particular. Adicionalmente, se ha encontrado que realizando estos protocolos en tándem, específicamente aquellos para DR1, DR4w4 y DR7, pueden seleccionarse eficientemente péptidos reactivos de forma cruzada de DR.
Los péptidos derivados de 191P4D12(b) identificados anteriormente se prueban para su capacidad de unión para diversas moléculas de HLA-DR comunes. Todos los péptidos se prueban inicialmente para unirse a las moléculas de DR en el panel primario: DR1, DR4w4 y DR7. Entonces, péptidos que se unen a al menos dos de estas tres moléculas de DR se prueban para unirse a moléculas de DR2w2 β1, DR2w2 β2, DR6w19 y DR9 en ensayos secundarios. Finalmente, los péptidos que se unen a al menos dos de las cuatro moléculas de DR del panel secundario y, por tanto, acumulativamente a al menos cuatro de las siete moléculas de DR diferentes, se criban para unirse a moléculas de DR4w15, DR5w11 y DR8w2 en ensayos terciarios. Los péptidos que se unen a al menos siete de las diez moléculas de DR que comprenden los ensayos de cribado primarios, secundarios y terciarios se consideran ligantes de DR reactivos de forma cruzada. Se encontró que los péptidos derivados de 191P4D12(b) que se unen a alelos de HLA-DR comunes son de particular interés.
Selección de péptidos con motivos DR3
Debido a que HLA-DR3 es un alelo que es prevalente en poblaciones caucásicas, negras e hispanas, la capacidad de unión de DR3 es un criterio relevante en la selección de epítopes de HTL. Por tanto, los péptidos que se muestra que son candidatos también pueden ensayarse para su capacidad de unión a DR3. Sin embargo, en vista de la especificidad de unión del motivo DR3, los péptidos que se unen sólo a DR3 también pueden considerarse candidatos para inclusión en una formulación de vacuna.
Para identificar eficientemente péptidos que se unen a DR3, antígenos de 191P4D12(b) diana se analizan para secuencias que llevan uno de los dos motivos específicos para unión a DR3 informados por Geluk y col. (J. lmmunol. 152:5742-5748, 1994). Entonces, los péptidos correspondientes se sintetizan y se confirma que tienen la capacidad para unirse a DR3 con una afinidad de 1 µM o mejor, es decir, inferior a 1 µM. Se encuentra que los péptidos cumplen este criterio de unión y se califican como ligantes con alta afinidad de clase II de HLA.
Los epítopes de unión a DR3 identificados de este modo están incluidos en composiciones de vacuna con epítopes de péptidos que llevan supermotivos DR.
Similarmente al caso de los péptidos que llevan motivos de clase I de HLA, los péptidos que llevan motivos de clase II se analogizan para mejorar la afinidad o reactividad cruzada. Por ejemplo, el ácido aspártico en la posición 4 de la secuencia del núcleo de 9-mero es un residuo óptimo para la unión a DR3, y la sustitución para ese residuo frecuentemente mejora la unión a DR3.
Ejemplo 17: Inmunogenicidad de epítopes de HTL derivados de 191P4D12(b)
Este ejemplo determina epítopes que llevan supermotivos DR y motivos DR3 inmunogénicos entre aquellos identificados usando la metodología expuesta en el presente documento.
La inmunogenicidad de epítopes de HTL se confirma de un modo análogo a la determinación de la inmunogenicidad de epítopes de CTL, evaluando la capacidad para estimular respuestas de HTL y/o usando modelos de ratón transgénico apropiados. La inmunogenicidad se determina cribando para: 1.) inducción primaria in vitro usando PBMC normal o 2.) respuestas de rellamada de pacientes que tienen tumores que expresan 191P4D12(b).
Ejemplo 18: Cálculo de frecuencias fenotípicas de supertipos de HLA en diversos orígenes étnicos para determinar la amplitud de la cobertura de la población
Este ejemplo ilustra la evaluación de la amplitud de la cobertura de la población de una composición de vacuna que comprende múltiples epítopes que comprenden múltiples supermotivos y/o motivos.
Con el fin de analizar la cobertura de la población se determinan frecuencias de genes de alelos HLA. Las frecuencias de genes para cada alelo HLA se calculan a partir de frecuencias de antígenos o alelos utilizando las fórmulas de distribución binómica gf=1-(SQRT(1-af)) (véase, por ejemplo, Sidney y col., Human lmmunol. 45:79-93, 1996). Para obtener frecuencias fenotípicas globales se calculan frecuencias de genes acumuladas, y las frecuencias de antígenos acumuladas se derivan usando la fórmula inversa [af=1-(1-Cgf)2].
Si los datos de frecuencia no están disponibles al nivel de tipado de ADN, se asume la correspondencia con las frecuencias de antígenos serológicamente definidas. Para obtener la posible cobertura de la población de supertipos total se asume equilibrio de enlace, y sólo están incluidos alelos confirmados que pertenecen a cada uno de los supertipos (cálculos aproximados mínimos). Los cálculos aproximados de la posible cobertura total alcanzada por combinaciones de inter-loci se hacen añadiendo a la cobertura A la proporción de la población no cubierta por A que cabría esperar que estuviera cubierta por los alelos B considerados (por ejemplo, total=A+B*(1-A)). Los miembros confirmados del supertipo similar a A3 son A3, A11, A31, A*3301 y A*6801. Aunque el supertipo similar a A3 también puede incluir A34, A66 y A*7401, estos alelos no se incluyeron en los cálculos de frecuencia global. Asimismo, los miembros confirmados de la familia de supertipos similar a A2 son A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901. Finalmente, los alelos confirmados para supertipo similar a B7 son: B7, B*3501-03, B51, B*5301, B*5401, B*5501-2, B*5601, B*6701 y B*7801 (posiblemente también B*1401, B*3504-06, B*4201 y B*5602).
La cobertura de la población alcanzada combinando los supertipos A2, A3 y B7 es aproximadamente el 86% en los cinco grupos étnicos principales. La cobertura puede extenderse incluyendo péptidos que llevan los motivos A1 y A24. En promedio, A1 está presente en el 12% y A24 en el 29% de la población a través de los cinco grupos étnicos principales diferentes (caucásico, negro norteamericano, chino, japonés e hispano). Juntos, estos alelos se representan con una frecuencia promedio del 39% en estas mismas poblaciones étnicas. La cobertura total a través de las etnicidades principales cuando se combinan A1 y A24 con la cobertura de los alelos de supertipo A2, A3 y B7 es >95%, véase, por ejemplo, la Tabla lV (G). Puede usarse un enfoque análogo para estimar la cobertura de la población alcanzada con combinaciones de epítopes que llevan el motivo de clase II.
Los estudios de inmunogenicidad en seres humanos (por ejemplo, Bertoni y col., J. Clin. Invest,100:503, 1997; Doolan y col., Immunity 7:97, 1997; y Threlkeld y col., J. Immunol,159:1648,1997) han mostrado que péptidos de unión altamente reactivos de forma cruzada son casi siempre reconocidos como epítopes. El uso de péptidos de unión altamente reactivos de forma cruzada es un criterio de selección importante en identificar epítopes candidatos para inclusión en una vacuna que es inmunogénica en una población diversa.
Con un número suficiente de epítopes (como se desvela en el presente documento y de la materia), se predice que una cobertura promedio de la población será superior al 95% en cada una de las cinco poblaciones étnicas principales. El análisis de simulación de Monte Carlo de la teoría del juego, que se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Osborne, M.J. y Rubinstein, A. “A course in game theory” MIT Press, 1994), puede usarse para estimar qué porcentaje de los individuos en una población que comprende los grupos étnicos caucásico, negro norteamericano, japonés, chino e hispano reconocería los epítopes de vacuna descritos en el presente documento. Un porcentaje preferido es el 90%. Un porcentaje más preferido es el 95%.
Ejemplo 19: Reconocimiento de CTL de antígenos endógenamente procesados después del cebado
Este ejemplo confirma que CTL inducidos por los epítopes de péptidos nativos o analogizados identificados y seleccionados como se describe en el presente documento reconocen antígenos endógenamente sintetizados, es decir, nativos.
Células efectoras aisladas de ratones transgénicos que se inmunizan con epítopes de péptidos, por ejemplo, epítopes que llevan supermotivos HLA-A2, se re-estimulan in vitro usando células estimuladoras recubiertas con péptido. Seis días después, las células efectoras se ensayan para citotoxicidad y las líneas celulares que contienen actividad citotóxica específica para péptido se re-estimulan adicionalmente. Seis días adicionales después, estas líneas celulares se prueban para actividad citotóxica sobre células diana Jurkat-A2.l/Kb marcadas con 51Cr en ausencia o presencia de péptido, y también se prueban sobre células diana marcadas con 51Cr que llevan el antígeno endógenamente sintetizado, es decir, células que se transfectan establemente con vectores de expresión de 191P4D12(b).
Los resultados demuestran que las líneas de CTL obtenidas de animales sensibilizados con epítope de péptido reconocen antígeno de 191P4D12(b) endógenamente sintetizado. La elección del modelo de ratón transgénico que va a usarse para un análisis tal depende del (de los) epítope(s) que están siendo evaluados. Además de ratones transgénicos para HLA-A*0201/Kb, se han caracterizado varios otros modelos de ratón transgénico que incluyen ratones con alelos A11, que también pueden usarse para evaluar epítopes A3, y B7 humanos y están siendo desarrollados otros (por ejemplo, ratones transgénicos para HLA-A1 y A24). También se han desarrollado modelos de ratón HLA-DR1 y HLA-DR3, que puede usarse para evaluar epítopes de HTL.
Ejemplo 20: Actividad de epítopes conjugados de CTL-HTL en ratones transgénicos
Este ejemplo ilustra la inducción de CTL y HTL en ratones transgénicos usando composiciones de vacuna de péptidos de CTL y HTL derivados de 191P4D12(b). La composición de vacuna usada en el presente documento comprende péptidos que van a administrarse a un paciente con un tumor que expresa 191P4D12(b). La composición de péptido puede comprender múltiples epítopes de CTL y/o HTL. Los epítopes se identifican usando metodología como se describe en el presente documento. Este ejemplo también ilustra que la potenciada inmunogenicidad puede lograrse por inclusión de uno o más epítopes de HTL en una composición de vacuna de CTL; una composición de péptido tal puede comprender un epítope de HTL conjugado con un epítope de CTL. El epítope de CTL puede ser uno que se une a múltiples miembros de la familia HLA a una afinidad de 500 nM o menos, o análogos de ese epítope. Los péptidos pueden estar lipidados, si se desea.
Procedimientos de inmunización: La inmunización de ratones transgénicos se realiza como se describe (Alexander y col., J. Immunol. 159:4753-4761, 1997). Por ejemplo, ratones A2/Kb, que son transgénicos para el alelo HLA A2.1 humano y se usan para confirmar la inmunogenicidad de epítopes que llevan motivos HLA-A*0201 o supermotivos HLA-A2, y se sensibilizan subcutáneamente (base de la cola) con 0,1 ml de péptido en adyuvante incompleto de Freund, o si la composición de péptido es un conjugado de CTUHTL lipidado, en DMSO/solución salina, o si la composición de péptido es un polipéptido, en PBS o adyuvante incompleto de Freund. Siete días después de la sensibilización, los esplenocitos obtenidos de estos animales se reestimulan con linfoblastos activados por LPS irradiados singénicos recubiertos con péptido.
Líneas celulares: Células diana para ensayos de citotoxicidad específicos para péptido son células de Jurkat transfectadas con el gen quimérico HLA-A2.1/Kb (por ejemplo, Vitiello y col., J. Exp. Med. 173:1007, 1991).
Activación de CTL in vitro: Una semana después de la sensibilización, las células del bazo (30x106 células/matraz) se co-cultivan a 37ºC con linfoblastos recubiertos con péptido (10x106 células/matraz) irradiados (3000 rads) singénicos en 10 ml de medio de cultivo/matraz T25. Después de seis días, las células efectoras se recogen y se ensayan para actividad citotóxica.
Ensayo para actividad citotóxica: Células diana (1,0 a 1,5x106) se incuban a 37ºC en presencia de 200 µl de 51Cr. Después de 60 minutos, las células se lavan tres veces y se resuspenden en medio R10. Se añade péptido cuando se requiera a una concentración de 1 µg/ml. Para el ensayo, 104 células diana marcadas con 51Cr se añaden a diferentes concentraciones de células efectoras (volumen final de 200 µl) en placas de 96 pocillos con fondo en U. Después de un periodo de incubación de seis horas a 37ºC, una alícuota de 0,1 ml de sobrenadante se toma de cada pocillo y la radiactividad se determina en un contador gamma automático Micromedic. El porcentaje de lisis específica se determina por la fórmula: porcentaje de liberación específica = 100 x (liberación experimental liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). Para facilitar la comparación entre ensayos de CTL separados ejecutados bajo las mismas condiciones, los datos de % de liberación de 51Cr se expresan como unidades líticas/106 células. Una unidad lítica se define arbitrariamente como el número de células efectoras requeridas para lograr el 30% de lisis de 10.000 células diana en un ensayo de liberación de 51Cr de seis horas. Para obtener unidades líticas/106 específicas, las unidades líticas/106 obtenidas en ausencia de péptido se restan de las unidades líticas/106 obtenidas en presencia de péptido. Por ejemplo, si el 30% de liberación de 51Cr se obtiene a la relación efectoras (E): diana (D) de 50:1 (es decir, 5x105 células efectoras para 10.000 dianas) en ausencia de péptido y 5:1 (es decir, 5x104 células efectoras para 10.000 dianas) en presencia de péptido, las unidades líticas específicas serían: [(1/50.000)-(1/500.000)] × 106 =18 UL.
Los resultados se analizan para evaluar la magnitud de las respuestas de CTL de animales inyectados con la preparación de vacuna de conjugado CTUHTL inmunogénica y se comparan con la magnitud de la respuesta de CTL alcanzada usando, por ejemplo, epítopes de CTL como se explica resumidamente anteriormente en el ejemplo titulado “Confirmación de inmunogenicidad”. Análisis similares a éste pueden realizarse para confirmar la inmunogenicidad de conjugados de péptidos que contienen múltiples epítopes de CTL y/o múltiples epítopes de HTL. Según estos procedimientos, se encuentra que una respuesta de CTL se induce, y que simultáneamente se induce una respuesta de HTL tras la administración de tales composiciones.
Ejemplo 21: Selección de epítopes de CTL y HTL para inclusión en una vacuna específica para 191P4D12(b).
Este ejemplo ilustra un procedimiento para seleccionar epítopes de péptidos para composiciones de vacuna de la invención. Los péptidos en la composición pueden estar en forma de una secuencia de ácidos nucleicos, tanto una única secuencia como una o más secuencias (es decir, minigen) que codifican péptido(s), o pueden ser péptidos únicos y/o poliepitópicos.
Los siguientes principios se utilizan cuando se selecciona una pluralidad de epítopes para inclusión en una composición de vacuna. Cada uno de los siguientes principios se equilibra con el fin de hacer la selección.
Se seleccionan epítopes que, tras la administración, imitan respuestas inmunitarias que guardan relación con la eliminación de 191P4D12(b). El número de epítopes usados depende de observaciones de pacientes que eliminan espontáneamente 191P4D12(b). Por ejemplo, si se ha observado que pacientes que eliminan espontáneamente células que expresan 191P4D12(b) generan una respuesta inmunitaria a al menos tres (3) epítopes del antígeno de 191P4D12(b), entonces al menos tres epítopes deben incluirse para la clase I de HLA. Un fundamento similar se usa para determinar epítopes de clase II de HLA.
Frecuentemente se seleccionan epítopes que tienen una afinidad de unión de una CI50 de 500 nM o menos para una molécula de clase I de HLA, o para clase II, una CI50 de 1000 nM o menos; o péptidos de clase I de HLA con altas puntuaciones de unión del sitio web BIMAS, en URL bimas.dcrt.nih.gov/.
Con el fin de lograr una amplia cobertura de la vacuna a través de una diversa población, péptidos que llevan suficientes supermotivos, o una matriz suficiente de péptidos que llevan motivos específicos para alelo, se seleccionan para dar una amplia cobertura de la población. En una realización, los epítopes se seleccionan para proporcionar al menos el 80% de cobertura de la población. Puede emplearse un análisis de Monte Carlo, una evaluación estadística conocida en la técnica, para evaluar la anchura, o redundancia, de la cobertura de la población.
Cuando se crean composiciones poliepitópicas o un minigen que codifica las mismas, normalmente es deseable generar el péptido más pequeño posible que englobe los epítopes de interés. Los principios empleados son similares, si no los mismos, que aquellos empleados cuando se selecciona un péptido que comprende epítopes anidados. Por ejemplo, se selecciona una secuencia de proteínas para la composición de vacuna debido a que tiene el máximo número de epítopes contenidos dentro de la secuencia, es decir, tiene una alta concentración de epítopes. Los epítopes pueden estar anidados o superpuestos (es decir, marco desplazado el uno con respecto al otro). Por ejemplo, con epítopes superpuestos, dos epítopes 9-meros y un epítope 10-mero puede estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Cada epítope puede exponerse y unirse por una molécula de HLA tras la administración de un péptido tal. Un epítope multiepitópico puede generarse sintéticamente, recombinantemente o por escisión de la fuente nativa. Alternativamente, un análogo puede prepararse a partir de esta secuencia nativa, por lo que uno o más de los epítopes comprenden sustituciones que alteran las propiedades de reactividad cruzada y/o afinidad de unión del péptido poliepitópico. Una composición de vacuna tal se administra para fines terapéuticos
o profilácticos. Esta realización proporciona la posibilidad de que un aspecto todavía por descubrir del procesamiento del sistema inmunitario se aplique a la secuencia anidada nativa y así facilite la producción de composiciones de vacuna inductoras de respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas. Adicionalmente, una realización tal proporciona la posibilidad de epítopes que llevan motivos para una preparación de HLA que es presentemente desconocida. Además, esta realización (ausente la creación de cualquier análogo) dirige la respuesta inmunitaria a múltiples secuencias de péptidos que en realidad están presentes en 191P4D12(b), evitando así la necesidad de evaluar cualquier epítope de unión. Finalmente, la realización proporciona una economía de escala cuando se producen composiciones de vacuna de ácidos nucleicos. Relacionado con esta realización, programas informáticos pueden derivarse según principios en la materia, que identifican en una secuencia diana el mayor número de epítopes por longitud de secuencia.
Una composición de vacuna que comprende péptidos seleccionados, cuando se administra, es segura, eficaz y provoca una respuesta inmunitaria similar en magnitud a una respuesta inmunitaria que controla o elimina células que llevan o expresan en exceso 191P4D12(b).
Ejemplo 22: Construcción de plásmidos de ADN de multi-epítopes de “minigen”
Este ejemplo trata la construcción de un plásmido de expresión de minigen. Los plásmidos de minigen pueden, por supuesto, contener diversas configuraciones de epítopes de linfocitos B, CTL y/o HTL o análogos de epítopes como se describe en el presente documento.
Un plásmido de expresión de minigen normalmente incluye múltiples epítopes de péptidos de CTL y de HTL. En el presente ejemplo, los epítopes de péptidos que llevan los supermotivos HLA-A2, -A3, -B7 y los epítopes de péptidos que llevan los motivos HLA-A1 y -A24 se usan conjuntamente con epítopes que llevan supermotivos DR y/o epítopes de DR3. Los epítopes de péptidos que llevan supermotivos o motivos de clase I de HLA derivados de 191P4D12(b) están seleccionados de forma que se representen múltiples supermotivos/motivos para garantizar la amplia cobertura de la población. Similarmente, los epítopes de clase II de HLA están seleccionados de 191P4D12(b) para proporcionar una amplia cobertura de la población, es decir, tanto los epítopes que llevan supermotivos DR-1-4-7 de HLA como los epítopes que llevan motivos DR-3 de HLA están seleccionados para inclusión en la construcción de minigen. Entonces, los epítopes de CTL y de HTL seleccionados se incorporan en un minigen para la expresión en un vector de expresión.
Una construcción tal puede incluir adicionalmente secuencias que dirigen los epítopes de HTL al retículo endoplásmico. Por ejemplo, la proteína Ii puede fusionarse con uno o más epítopes de HTL como se describe en la materia, en el que la secuencia CLIP de la proteína li se elimina y se sustituye con una secuencia de epítope de clase II de HLA de manera que el epítope de clase II de HLA se dirige al retículo endoplásmico, en el que el epítope se une a una molécula de clase II de HLA.
Este ejemplo ilustra los procedimientos que van a usarse para construcción de un plásmido de expresión que lleva un minigen. Otros vectores de expresión que pueden usarse para composiciones de minigen están disponibles y son conocidos para aquellos expertos en la materia.
El plásmido de ADN del minigen de este ejemplo contiene una secuencia consenso de Kozak y una secuencia señal de la cadena ligera de Ig kappa murina consenso seguida de epítopes de CTL y/o de HTL seleccionados según principios desvelados en el presente documento. La secuencia codifica un marco de lectura abierto fusionado con la marca de epítope del anticuerpo Myc y His codificada por el vector de pcDNA3.1/ Myc-His.
La superposición de oligonucleótidos que pueden, por ejemplo, promediar aproximadamente 70 nucleótidos de longitud con 15 superposiciones de nucleótidos se sintetizan y se purifican por HPLC. Los oligonucleótidos codifican los epítopes de péptidos seleccionados, además de nucleótidos ligadores apropiados, secuencia de Kozak y secuencia señal. El minigen de multiepítopes final se ensambla extendiendo los oligonucleótidos superpuestos en tres conjuntos de reacciones usando PCR. Se usa una máquina de PCR Perkin/Elmer 9600 y se realizan un total de 30 ciclos usando las siguientes condiciones: 95ºC durante 15 s, temperatura de hibridación (5º por debajo de la menor Tf calculada de cada par de cebadores) durante 30 s, y 72ºC durante 1 min.
Por ejemplo, un minigen se prepara del siguiente modo. Para una primera reacción de PCR, 5 µg de cada uno de los dos oligonucleótidos se hibridan y se extienden: en un ejemplo usando ocho oligonucleótidos, es decir, cuatro pares de cebadores, los oligonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6 y 7+8 se combinan en 100 µl de reacciones que contienen tampón de Pfu polimerasa (1x= KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-cloruro 20 mM, pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 µg/ml de BSA), 0,25 mM de cada dNTP y 2,5 U de Pfu polimerasa. Los productos dímeros de longitud completa se purifican en gel y dos reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4, y el producto de 5+6 y 7+8, se mezclan, se hibridan y se extienden durante 10 ciclos. Entonces se mezcla la mitad de las dos reacciones y se llevan a cabo 5 ciclos de hibridación y extensión antes de añadir cebadores flanqueantes para amplificar el producto de longitud completa. El producto de longitud completa se purifica en gel y se clona en pCR-blunt (Invitrogen) y los clones individuales se criban por secuenciación.
Ejemplo 23: Construcción de plásmido y el grado al que induce inmunogenicidad
El grado al que una construcción de plásmido, por ejemplo, un plásmido construido según el ejemplo previo, puede inducir inmunogenicidad se confirma in vitro determinando la presentación de epítope por APC tras la transducción o transfección de APC con una construcción de ácido nucleico que expresa epítope. Un estudio tal determina “antigenicidad” y permite el uso de APC humana. El ensayo determina la capacidad del epítope para ser presentado por la APC en un contexto que es reconocido por un linfocito T cuantificando la densidad de complejos de epítopeclase I de HLA sobre la superficie celular. La cuantificación puede realizarse midiendo directamente la cantidad de péptido eluido de la APC (véanse, por ejemplo, Sijts y col., J. Immunol 156:683-692, 1996; Demotz y col., Nature 342682-684,1989); o el número de complejos de péptido-clase I de HLA puede estimarse midiendo la cantidad de lisis o liberación de linfocinas inducida por células diana enfermas o transfectadas, y luego determinando la concentración de péptido necesaria para obtener niveles equivalentes de lisis o liberación de linfocinas (véase, por ejemplo, Kageyama y col., J. Immunol. 154:567-576, 1995).
Alternativamente, la inmunogenicidad se confirma por inyecciones in vivo en ratones y posterior evaluación in vitro de la actividad de CTL y HTL, que se analizan usando ensayos de citotoxicidad y de proliferación, respectivamente, como se detalla, por ejemplo, en Alexander y col., Immunity 1:751-761,1994.
Por ejemplo, para confirmar la capacidad de una construcción de minigen de ADN que contiene al menos un péptido con supermotivo HLA-A2 para inducir CTL in vivo, ratones transgénicos para HLA-A2.1/Kb, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de ADNc desnudo. Como medio de comparación del nivel de CTL inducidos por la inmunización de ADNc, un grupo de control de animales también se inmuniza con una composición de péptido real que comprende múltiples epítopes sintetizados como un único polipéptido ya que serían codificados por el minigen.
Esplenocitos de animales inmunizados se estimulan dos veces con cada una de las composiciones respectivas (epítopes de péptidos codificados en el minigen o el péptido poliepitópico), luego se ensayan para actividad citotóxica específica para péptido en un ensayo de liberación de 51Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta de CTL dirigida contra el epítope limitado a A2, indicando así la inmunogenicidad in vivo de la vacuna del minigen y la vacuna poliepitópica.
Por tanto, se encuentra que el minigen provoca respuestas inmunitarias dirigidas hacia los epítopes de péptidos con supermotivo HLA-A2 como lo hace la vacuna de péptido poliepitópico. También se realiza un análisis similar usando otros modelos de ratón transgénico HLA-A3 y HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por epítopes con motivo o supermotivo HLA-A3 y HLA-B7, por el cual también se encuentra entonces que el minigen provoca respuestas inmunitarias apropiadas dirigidas hacia los epítopes proporcionados.
Para confirmar la capacidad de un minigen que codifica el epítope de clase II para inducir HTL in vivo, ratones transgénicos DR, o para aquellos epítopes que reaccionan de forma cruzada con la molécula de MHC de ratón apropiada, ratones limitados a I-Ab, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con 100 µg de ADN de plásmido. Como medio de comparación del nivel de HTL inducidos por inmunización con ADN, un grupo de animales de control también se inmuniza con una composición de péptido real emulsionada en adyuvante completo de Freund. Los linfocitos T CD4+, es decir, HTL, se purifican a partir de esplenocitos de animales inmunizados y se estimulan con cada una de las composiciones respectivas (péptidos codificados en el minigen). La respuesta de HTL se mide usando un ensayo de proliferación por incorporación de 3H-timidina (véase, por ejemplo, Alexander y col. Immunity 1:751-761,1994). Los resultados indican la magnitud de la respuesta de HTL, demostrándose así la inmunogenicidad in vivo del minigen.
Los minigenes de ADN, construidos como se describe en el ejemplo previo, también pueden confirmarse como una vacuna en combinación con un agente de refuerzo usando un protocolo de sensibilización-refuerzo. El agente de refuerzo puede consistir en proteína recombinante (por ejemplo, Barnett y col., Aids Res. and Human Retroviruses 14, Suplemento 3:S299-S309, 1998) o variolovacuna recombinante, por ejemplo, que expresa un minigen o ADN que codifica la proteína completa de interés (véanse, por ejemplo, Hanke y col., Vaccine 16:439-445,1998; Sedegah y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:7648-53,1998; Hanke y McMichael, Immunol. Letters 66:177-181,1999; y Robinson y col., Nature Med. 5:526-34,1999).
Por ejemplo, la eficacia del minigen de ADN usado en un protocolo de sensibilización-refuerzo se evalúa inicialmente en ratones transgénicos. En este ejemplo, ratones transgénicos para A2.11Kb se inmunizan 1 M con 100 µg de un minigen de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos que incluyen al menos un péptido que lleva supermotivo HLA-A2. Después de un periodo de incubación (que oscila de 3-9 semanas), los ratones se refuerzan IP con 107 ufp/ratón de un virus de la variolovacuna recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigen de ADN. Los ratones de control se inmunizan con 100 µg de ADN o variolovacuna recombinante sin la secuencia del minigen, o con ADN que codifica el minigen, pero sin el refuerzo de variolovacuna. Después de un periodo de incubación adicional de dos semanas, los esplenocitos de los ratones se ensayan inmediatamente para actividad específica para péptido en un ensayo de ELISPOT. Adicionalmente, los esplenocitos se estimulan in vitro con los epítopes de péptidos limitados a A2 codificados en el minigen y variolovacuna recombinante, luego se ensayan para actividad específica para péptido en un ELISA de IFN alfa, beta y/o gamma.
Se encuentra entonces que el minigen utilizado en un protocolo de sensibilización-refuerzo provoca mayores respuestas inmunitarias hacia los péptidos con supermotivo HLA-A2 que con ADN solo. También puede realizarse un análisis tal usando modelos de ratón transgénico HLA-A11 o HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por epítopes con motivos o supermotivos HLA-A3 o HLA-B7. El uso de protocolos de sensibilización-refuerzo en seres humanos se describe más adelante en el ejemplo titulado “Inducción de respuestas de CTL usando un protocolo de sensibilización-refuerzo”.
Ejemplo 24: Composiciones de péptidos para usos profilácticos
Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden usarse para prevenir la expresión de 191P4D12(b) en personas que están en riesgo de tumores que llevan este antígeno. Por ejemplo, una composición de péptido de epítope poliepitópico (o un ácido nucleico que comprende la misma) que contiene múltiples epítopes de CTL y de HTL tales como aquellos seleccionados en los ejemplos anteriores, que también se seleccionan para elegir como diana más del 80% de la población, se administra a individuos en riesgo de un tumor asociado a 191P4D12(b).
Por ejemplo, una composición basada en péptido se proporciona como un único polipéptido que engloba múltiples epítopes. La vacuna se administra normalmente en una disolución fisiológica que comprende un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund. La dosis de péptido para la inmunización inicial es de aproximadamente 1 a aproximadamente 50.000 µg, generalmente 100-5.000 µg, para un paciente de 70 kg. La administración de vacuna inicial va seguida de dosificaciones de refuerzo a las 4 semanas, seguido de la evaluación de la magnitud de la respuesta inmunitaria en el paciente por técnicas que determinan la presencia de poblaciones de CTL específicas para epítope en una muestra de PBMC. Dosis de refuerzo adicionales se administran según se requiera. Se encuentra que la composición es tanto segura como eficaz como una profilaxis contra enfermedad asociada a 191P4D12(b).
Alternativamente, una composición que normalmente comprende agentes de transfección se usa para la administración de una vacuna basada en ácidos nucleicos según metodologías conocidas en la técnica y desveladas en el presente documento.
Ejemplo 25: Composiciones de vacuna poliepitópica derivadas de secuencias de 191P4D92(b) nativas
Se analiza una secuencia de poliproteína 191P4D12(b) nativa, usando preferentemente algoritmos informáticos definidos para cada supermotivo o motivo de clase y/o de clase II para identificar regiones “relativamente cortas” de la poliproteína que comprenden múltiples epítopes. Las regiones “relativamente cortas” son preferentemente de menos longitud que un antígeno nativo entero. Esta secuencia relativamente corta que contiene múltiples epítopes “anidados” distintos o superpuestos puede usarse para generar una construcción de minigen. La construcción se manipula para expresar el péptido, que se corresponde con la secuencia de proteína nativa. El péptido “relativamente corto” tiene generalmente menos de 250 aminoácidos de longitud, frecuentemente menos de 100 aminoácidos de longitud, preferentemente menos de 75 aminoácidos de longitud, y más preferentemente menos de 50 aminoácidos de longitud. La secuencia de proteínas de la composición de vacuna se selecciona debido a que tiene el máximo número de epítopes contenidos dentro de la secuencia, es decir, tiene una alta concentración de epítopes. Como se observa en el presente documento, los motivos de epítopes pueden estar anidados o superpuestos (es decir, marco desplazado el uno con respecto al otro). Por ejemplo, con epítopes superpuestos, dos epítopes 9-meros y un epítope 10-mero puede estar presentes en un péptido de 10 aminoácidos. Una composición de vacuna tal se administra para fines terapéuticos o profilácticos.
La composición de vacuna incluirá, por ejemplo, múltiples epítopes de CTL del antígeno de 191P4D12(b) y al menos un epítope de HTL. Esta secuencia nativa poliepitópica se administra tanto como un péptido como una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido. Alternativamente puede prepararse un análogo de esta secuencia nativa, por lo que uno o más de los epítopes comprenden sustituciones que alteran las propiedades de reactividad cruzada y/o afinidad de unión del péptido poliepitópico.
La realización de este ejemplo proporciona la posibilidad de que un aspecto todavía por descubrir del procesamiento del sistema inmunitario se aplique a la secuencia anidada nativa y así facilite la producción de composiciones de vacuna inductoras de respuestas inmunitarias terapéuticas o profilácticas. Adicionalmente, una realización tal proporciona la posibilidad de epítopes que llevan motivos para una preparación (preparaciones) de HLA que es (son) presentemente desconocida(s). Además, esta realización (excluyendo una realización analogizada) dirige la respuesta inmunitaria a múltiples secuencias de péptidos que en realidad están presentes en 191P4D12(b) nativa, evitando así la necesidad de evaluar cualquier epítope de unión. Finalmente, la realización proporciona una economía de escala cuando se producen composiciones de vacuna de péptidos o ácidos nucleicos.
Relacionado con esta realización, en la materia están disponibles programas informáticos que pueden usarse para identificar en una secuencia diana el mayor número de epítopes por longitud de secuencia.
Ejemplo 26: Composiciones de vacuna poliepitópicas de múltiples antígenos
Los epítopes de péptidos de 191P4D12(b) de la presente invención se usan conjuntamente con epítopes de otros antígenos asociados a tumor diana para crear una composición de vacuna que es útil para la prevención o el tratamiento de cáncer que expresa 191P4D12(b) y tales otros antígenos. Por ejemplo, una composición de vacuna puede proporcionarse como un único polipéptido que incorpora múltiples epítopes de 191P4D12(b), además de antígenos asociados a tumor que se expresan frecuentemente con un cáncer diana asociado a expresión de 191P4D12(b), o pueden administrarse como una composición que comprende una mezcla de uno o más epítopes discretos. Alternativamente, la vacuna puede administrarse como una construcción de minigen o como células dendríticas que se han cargado con los epítopes de péptidos in vitro.
Ejemplo 27: Uso de péptidos para evaluar una respuesta inmunitaria
Los péptidos de la invención pueden usarse para analizar una respuesta inmunitaria para la presencia de anticuerpos específicos, CTL o HTL dirigidos a 191P4D12(b). Un análisis tal puede realizarse de un modo descrito por Ogg y col., Science 279:2103-2106,1998. En este ejemplo, los péptidos según la invención se usan como reactivo para fines de diagnóstico o pronóstico, no como un inmunogén.
En este ejemplo, complejos tetraméricos (“tetrámeros”) de antígenos leucocitarios humanos altamente sensibles se usan para un análisis en sección transversal de, por ejemplo, frecuencias de CTL específicas para 191P4D12(b) HLA-A*0201 de individuos positivos para HLA A*0201 en diferentes estados de enfermedad o tras la inmunización que comprende un péptido de 191P4D12(b) que contiene un motivo A*0201. Los complejos tetraméricos se sintetizan como se ha descrito (Musey y col., N. Engl. J. Med. 337:1267, 1997). Brevemente, se sintetizan cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y β2-microglobulina por medio de un sistema de expresión procariota. La cadena pesada se modifica por deleción de la transmembrana-cola citosólica y adición al extremo COOH de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimática BirA. La cadena pesada, β2-microglobulina y el péptido se repliegan por dilución. El producto replegado de 45 kD se aísla por cromatografía de líquidos rápida de proteínas y luego se biotinila por BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri), adenosin 5' trifosfato y magnesio. El conjugado de estreptavidina-ficoeritrina se añade en una relación molar 1:4, y el producto se concentra a 1 mg/ml. El producto resultante se denomina tetrámero-ficoeritrina.
Para el análisis de muestras de sangre de paciente, aproximadamente un millón de PBMC se centrifugan a 300 g durante 5 minutos y se resuspenden en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato fría. El análisis Tri-color se realiza con el tetrámero-ficoeritrina, junto con anti-CD8-Tricolor y anti-CD38. Las PBMC se incuban con tetrámero y los anticuerpos sobre hielo durante 30 a 60 min y luego se lavan dos veces antes de la fijación con formaldehído. Se aplican puertas para contener >99,98% de las muestras de control. Los controles para los tetrámeros incluyen tanto individuos negativos para A*0201 como donantes no enfermos positivos para A*0201. Entonces, el porcentaje de células teñidas con el tetrámero se determina por citometría de flujo. Los resultados indican el número de células en la muestra de PBMC que contiene CTL limitados a epítope, indicando así fácilmente el grado de respuesta inmunitaria al epítope de 191P4D12(b) y, por tanto, el estado de exposición a 191P4D12(b), o exposición a una vacuna que provoca una respuesta protectora o terapéutica.
Ejemplo 28: Uso de epítopes de péptidos para evaluar respuestas de rellamada
Los epítopes de péptidos de la invención se usan como reactivos para evaluar respuestas de linfocitos T, tales como respuestas agudas o de rellamada, en pacientes. Un análisis tal puede realizarse en pacientes que se han recuperado de enfermedad asociada a 191P4D12(b) o que han sido vacunados con una vacuna de 191P4D12(b).
Por ejemplo, puede analizarse la respuesta de CTL limitados a clase I de personas que han sido vacunadas. La vacuna puede ser cualquier vacuna de 191P4D12(b). Se recogen PBMC de individuos vacunados y se tipan para HLA. Entonces, epítopes de péptidos apropiados de la invención que, óptimamente, llevan supermotivos para proporcionar reactividad cruzada con múltiples miembros de la familia del supertipo HLA, se usan para el análisis de muestras derivadas de individuos que llevan ese tipo de HLA.
Las PBMC de individuos vacunados se separan en gradiente de densidad de Ficoll-Histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), se lavan tres veces en HBSS (GIBCO Laboratories), se resuspenden en RPMI-1640 (GIBCO Laboratories) complementado con L-glutamina (2 mM), penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 µg/ml) y Hepes (10 mM) que contiene 10% de suero AB humano inactivado por calor (RPMI completo) y se siembran usando formatos de microcultivo. Un péptido sintético que comprende un epítope de la invención se añade a 10 µg/ml a cada pocillo y el epítope 128-140 del núcleo del HBV se añade a 1 µg/ml a cada pocillo como fuente de ayuda de linfocitos T durante la primera semana de estimulación.
En el formato de microcultivo, 4 x 105 PBMC se estimulan con péptido en 8 cultivos duplicados en placa de fondo redondo de 96 pocillos en 100 µl/pocillo de RPMI completo. En los días 3 y 10,100 µl de RPMI completo y 20 U/ml de concentración final de rlL-2 se añaden a cada pocillo. En el día 7, los cultivos se transfieren en una placa de fondo plano de 96 pocillos y se reestimulan con péptido, rlL-2 y 105 células nodrizas autólogas irradiadas (3.000 rad). Los cultivos se prueban para actividad citotóxica en el día 14. Una respuesta de CTL positiva requiere dos o más de los ocho cultivos duplicados para mostrar más del 10% de liberación de 51Cr específica basándose en la comparación con sujetos de control no enfermos como se ha descrito previamente (Rehermann y col., Nature Med. 2:1104,1108,1996; Rehermann y col., J. Clin. Invest. 97:1655-1665, 1996; y Rehermann y col. J. Clin. Invest. 98:1432-1440,1996).
Líneas celulares diana son B-LCL transformadas con EBV autólogas y alógenas que son tanto compradas de American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI, Boston, MA) como establecidas a partir del conjunto de pacientes como se ha descrito (Guilhot y col. J. Virol. 66:2670-2678, 1992).
Los ensayos de citotoxicidad se realizan del siguiente modo. Células diana consisten en tanto la línea celular linfoblastoide B del mismo HLA alógena como transformada con EBV autóloga que se incuban durante la noche con el epítope de péptido sintético de la invención a 10 µM, y se marca con 100 µCi de 51Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, lL) durante 1 hora después de lavarse cuatro veces con HBSS.
La actividad citolítica se determina en un ensayo de liberación de 51Cr en pocillos divididos de 4 h convencional usando placas de 96 pocillos con fondo en U que contienen 3.000 dianas/pocillo. Se prueban PBMC simuladas a relaciones de efectoras/diana (E/D) de 20-50:1 en el día 14. El porcentaje de citotoxicidad se determina a partir de la fórmula: 100-x [(liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)]. La liberación máxima se determina por lisis de dianas por detergente (2% de Triton X-100; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La liberación espontánea es <25% de la liberación máxima para todos los experimentos.
Los resultados de un análisis tal indican el grado con el que las poblaciones de CTL limitados a HLA se han estimulado por exposición previa a 191P4D12(b) o una vacuna de 191P4D12(b).
Similarmente, también pueden analizarse respuestas de HTL limitados a clase II. PBMC purificadas se cultivan en una placa de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 1,5x105 células/pocillo y se estimulan con 10 µg/ml de péptido sintético de la invención, antígeno de 191P4D12(b) completo o PHA. Las células se siembran rutinariamente por duplicado de 4-6 pocillos para cada condición. Después de siete días de cultivo, el medio se elimina y se sustituye con medio fresco que contiene 10 U/ml de IL-2. Dos días después se añade 1 µCi de 3H-timidina a cada pocillo y la incubación continúa durante 18 horas adicionales. Entonces, el ADN celular se recoge sobre esteras de fibra de vidrio y se analiza para la incorporación de 3H-timidina. La proliferación de linfocitos T específicos para antígeno se calcula como la relación de incorporación de 3H-timidina en presencia de antígeno dividido entre la incorporación de 3H-timidina en ausencia de antígeno.
Ejemplo 29: Inducción de respuesta de CTL específica en seres humanos
Un ensayo clínico humano para una composición inmunogénica o que comprende epítopes de CTL y de HTL de la invención se establece como un estudio de aumento de dosis de fase I de PEI y se lleva a cabo como un ensayo controlado por placebo de doble ciego aleatorizado. Un ensayo tal se diseña, por ejemplo, del siguiente modo:
Se enrolan un total de aproximadamente 27 individuos y se dividen en 3 grupos:
Grupo I: 3 sujetos se inyectan con placebo y 6 sujetos se inyectan con 5 µg de composición de péptido; Grupo II: 3 sujetos se inyectan con placebo y 6 sujetos se inyectan con 50 µg de composición de péptido; Grupo III: 3 sujetos se inyectan con placebo y 6 sujetos se inyectan con 500 µg de composición de péptido.
Después de 4 semanas tras la primera inyección, todos los sujetos reciben una inoculación de refuerzo en la misma dosificación.
Los criterios de valoración medidos en este estudio se refieren a la seguridad y tolerabilidad de la composición de péptido, además de a su inmunogenicidad. Las respuestas inmunitarias celulares a la composición de péptido son un índice de la actividad intrínseca de esta composición de péptido y, por tanto, pueden visualizarse como una medida de eficacia biológica. Lo siguiente resume los datos clínicos y de laboratorio que se refieren a criterios de valoración de seguridad y eficacia.
Seguridad: La incidencia de acontecimientos adversos se monitoriza en el grupo de placebo y de tratamiento con fármaco y se evalúa en términos de grado y reversibilidad.
Evaluación de la eficacia de la vacuna: Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, los sujetos se sangran antes y después de la inyección. Células mononucleares de sangre periférica se aíslan de sangre recientemente heparinizada por centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque, se separan en alícuotas en medios de congelación y se almacenan congeladas. Las muestras se ensayan para actividad de CTL y de HTL.
Se encuentra que la vacuna es segura y eficaz.
Ejemplo 30: Ensayos de fase II en pacientes que expresan 191P4D12(b)
Los ensayos de fase II se realizan para estudiar el efecto de administrar las composiciones de péptido de CTL-HTL a pacientes que tienen cáncer que expresa 191P4D12(b). Los objetivos principales del ensayo son determinar una dosis eficaz y pauta para inducir CTL en pacientes con cáncer que expresa 191P4D12(b) para establecer la seguridad de inducir una respuesta de CTL y de HTL en estos pacientes, y para ver hasta qué grado la activación de CTL mejora el cuadro clínico de estos pacientes como se manifiesta, por ejemplo, por la reducción y/o encogimiento de las lesiones. Un estudio tal se diseña, por ejemplo, del siguiente modo:
Los estudios se realizan en múltiples centros. El diseño del ensayo es un protocolo de aumento de dosis sin control de etiqueta abierta en el que la composición de péptido se administra como una dosis única seguida seis semanas después por una dosis de refuerzo única de la misma dosis. Las dosificaciones son 50, 500 y 5.000 microgramos por inyección. Se registran los efectos adversos asociados a los fármacos (gravedad y reversibilidad).
Hay tres agrupaciones de pacientes. El primer grupo se inyecta con 50 microgramos de la composición de péptido y el segundo y tercer grupos con 500 y 5.000 microgramos de la composición de péptido, respectivamente. Los pacientes dentro de cada grupo oscilan en edad de 21-65 y representan diversos orígenes étnicos. Todos ellos tienen un tumor que expresa 191P4D12(b).
Las manifestaciones clínicas o respuestas de linfocitos T específicos para antígeno se monitorizan para evaluar los efectos de administrar las composiciones de péptido. Se encuentra que la composición de vacuna es tanto segura como eficaz en el tratamiento de enfermedad asociada a 191P4D12(b).
Ejemplo 31: Inducción de respuestas de CTL usando un protocolo de sensibilización-refuerzo
Un protocolo de sensibilización-refuerzo similar en su principio esencial al usado para confirmar la eficacia de una vacuna de ADN en ratones transgénicos, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo titulado “Construcción de plásmido y el grado al que induce inmunogenicidad,” también puede usarse para la administración de la vacuna a seres humanos. Una pauta de vacuna tal puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, ADN desnudo seguido de un refuerzo usando virus recombinante que codifica la vacuna, o proteína/polipéptido recombinante o una mezcla de péptidos administrada en un adyuvante.
Por ejemplo, la inmunización inicial puede realizarse usando un vector de expresión, tal como el construido en el ejemplo titulado “Construcción de plásmidos de ADN de multi-epítopes de “minigen”” en forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0,5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0,1 a 1000 µg) también puede administrarse usando una pistola de genes. Tras un periodo de incubación de 3-4 semanas, entonces se administra una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus recombinante de la viruela aviar administrado a una dosis de 5-107 a 5x109 ufp. Un virus recombinante alternativo, tal como un MVA, canaripox, adenovirus o virus adenoasociado, también puede usarse para el refuerzo, o puede administrarse la proteína poliepitópica o una mezcla de los péptidos. Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, muestras de sangre del paciente se obtienen antes de la inmunización, además de a intervalos tras la administración de la vacuna inicial y la dosis de refuerzo de la vacuna. Células mononucleares de sangre periférica se aíslan de sangre recientemente heparinizada por centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque, se separan en alícuotas en medios de congelación y se almacenan congeladas. Las muestras se ensayan para actividad de CTL y de HTL.
El análisis de los resultados indica que se genera una magnitud de respuesta suficiente para lograr una inmunidad terapéutica o protectora contra 191P4D12(b).
Ejemplo 32: Administración de composiciones de vacuna usando células dendríticas (CD)
Vacunas que comprenden epítopes de péptidos de la invención puede administrarse usando APC, o APC “profesionales” tales como CD. En este ejemplo, CD pulsadas con péptido se administran a un paciente para estimular una respuesta de CTL in vivo. En este procedimiento, células dendríticas se aíslan, se expanden y se pulsan con una vacuna que comprende epítopes de CTL y HTL de péptidos de la invención. Las células dendríticas se infunden de nuevo en el paciente para provocar respuestas de CTL y de HTL in vivo. Entonces, las CTL y HTL inducidas destruyen o facilitan la destrucción, respectivamente, de las células diana que poseen la proteína 191P4D12(b) de la que se derivan los epítopes en la vacuna.
Por ejemplo, una mezcla de péptidos que comprenden epítope se administra ex vivo a PBMC, o CD aisladas de las mismas. Puede usarse un agente farmacéutico para facilitar la recogida de CD, tal como ProgenipoietinTM (Monsanto, St. Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las CD con péptidos, y antes de la reinfusión en pacientes, las CD se lavan para eliminar péptidos sin unir.
Como se aprecia clínicamente, y se determina fácilmente por un experto basándose en desenlaces clínicos, el número de CD reinfundidas en el paciente puede variar (véanse, por ejemplo, Nature Med. 4:328, 1998; Nature Med. 2:52,1996 y Prostate 32:272, 1997). Aunque normalmente se administran 2-50 x 106 CD por paciente, también puede proporcionarse un mayor número de CD, tal como 107 ó 108. Tales poblaciones de células normalmente contienen entre el 50-90% de CD.
En algunas realizaciones, las PBMC cargadas con péptido se inyectan en pacientes sin purificación de las CD. Por ejemplo, PBMC generadas después del tratamiento con un agente tal como ProgenipoietinTM se inyectan en pacientes sin purificación de las CD. El número total de PBMC que se administran frecuentemente oscila de 108 a 1010. Generalmente, la dosis de células inyectada en pacientes se basa en el porcentaje de CD en la sangre de cada paciente, como se determina, por ejemplo, por análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-CD específicos. Por tanto, por ejemplo, si ProgenipoietinTM moviliza el 2% de CD en la sangre periférica de un paciente dado, y ese paciente va a recibir 5 x 106 CD, entonces el paciente se inyectará con un total de 2,5 x 108 de PBMC cargadas con péptido. Normalmente se estima que el porcentaje de CD movilizadas por un agente tal como ProgenipoietinTM está entre el 2-10%, pero puede variar como se aprecia por un experto en la materia.
Activación ex vivo de respuestas de CTL/HTL
Alternativamente, las respuestas de CTL o de HTL ex vivo a antígenos de 191P4D12(b) pueden inducirse incubando, en cultivo de tejido, las células precursoras de CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de APC, tal como CD, y péptidos inmunogénicos. Después de un tiempo de incubación apropiado (normalmente aproximadamente 7-28 días) en el que las células precursoras se activan y expanden en células efectoras, las células se infunden en el paciente, en el que destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de sus células diana específicas, es decir, células tumorales.
Ejemplo 33: Un procedimiento alternativo de identificación y confirmación de péptidos que llevan motivos
Otro procedimiento de identificación y confirmación de péptidos que llevan motivos es eluirlos de células que llevan moléculas de MHC definidas. Por ejemplo, las líneas de linfocitos B transformados con EBV usadas para el tipado de tejido se han caracterizado ampliamente para determinar qué moléculas de HLA expresan. En ciertos casos, estas células sólo expresan un único tipo de molécula de HLA. Estas células pueden transfectarse con ácidos nucleicos que expresan el antígeno de interés, por ejemplo, 191P4D12(b). Entonces, los péptidos producidos por el procesamiento de antígenos endógenos de péptidos producidos como resultado de la transfección se unirán a moléculas de HLA dentro de la célula y se transportarán y se expresarán sobre la superficie de la célula. Los péptidos se eluyen luego de las moléculas de HLA por exposición a condiciones ácidas suaves y su secuencia de aminoácidos se determina, por ejemplo, en análisis espectral de masas (por ejemplo, Kubo y col., J. Immunol. 152:3913,1994). Debido a que la mayoría de los péptidos que se unen a la molécula de HLA particular llevan motivos, esto es una modalidad alternativa para obtener una correlación de los péptidos que llevan motivos con la molécula de HLA particular expresada sobre la célula.
Alternativamente, las líneas celulares que no expresan moléculas de HLA endógenas pueden transfectarse con una construcción de expresión que codifica un único alelo de HLA. Entonces, estas células pueden usarse como se ha descrito, es decir, luego pueden transfectarse con ácidos nucleicos que codifican 191P4D12(b) para aislar péptidos correspondientes a 191P4D12(b) que se han presentado sobre la superficie celular. Los péptidos obtenidos de un análisis tal llevarán motivo(s) que se corresponde(n) con la unión al único alelo de HLA que se expresa en la célula.
Como se aprecia por un experto en la materia, un análisis similar puede realizarse sobre una célula que lleva más de un alelo de HLA y posteriormente determinar péptidos específicos para cada alelo de HLA expresado. Además, un experto también reconocería que pueden usarse medios distintos de la transfección, tal como carga con un antígeno de proteína, para proporcionar una fuente de antígeno a la célula.
Ejemplo 34: Polinucleótidos complementarios
Las secuencias complementarias a las secuencias codificantes de 191P4D12(b), o cualquier parte de las mismas, se usan para detectar, disminuir o inhibir la expresión de 191P4D12(b) que se produce naturalmente. Aunque se describe el uso de oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de bases, el mismo procedimiento se usa esencialmente con fragmentos de secuencias más pequeños o más grandes. Se diseñan oligonucleótidos apropiados usando, por ejemplo, el software OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia codificante de 191P4D12(b). Para inhibir la transcripción se diseña un oligonucleótido complementario a partir de la secuencia de 5' más única y se usa para prevenir la unión del promotor a la secuencia codificante. Para inhibir la traducción se diseña un oligonucleótido complementario para prevenir la unión ribosómica a un transcrito que codifica 191P4D12(b).
Ejemplo 35: Purificación de 191P4D12(b) que se produce naturalmente o recombinante usando anticuerpos específicos para 191P4D12(b)
191P4D12(b) que se produce naturalmente o recombinante se purifica sustancialmente por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para 191P4D12(b). Se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-191P4D12(b) a una resina cromatográfica activada tal como SEPHAROSE activada con CNBr (Amersham Pharmacia Biotech). Después del acoplamiento, la resina se bloquea y se lava según las instrucciones del fabricante.
El medio que contenía 191P4D12(b) se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial de 191P4D12(b) (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en presencia de detergente). La columna se eluye en condiciones que alteran la unión anticuerpo/191P4D12(b) (por ejemplo, un tampón de pH 2 a pH 3, o una alta concentración de un caótropo, tal como urea o ión tiocianato), y se recoge GCR.P.
Ejemplo 36: Identificación de moléculas que interactúan con 191P4D12(b)
191P4D12(b), o fragmentos biológicamente activos de la misma, se marcan con 121 l de reactivo Bolton-Hunter (véase, por ejemplo, Bolton y col. (1973) Biochem. J. 133:529). Moléculas candidatas previamente matrizadas en los pocillos de una placa de múltiples pocillos se incuban con 191P4D12(b) marcada, se lavan y se ensaya cualquier pocillo con complejo de 191P4D12(b) marcado. Los datos obtenidos usando diferentes concentraciones de 191P4D12(b) se usan para calcular valores para el número, afinidad y asociación de 191P4D12(b) con las moléculas candidatas.
Ejemplo 37: Ensayo in vivo para la promoción del crecimiento tumoral de 191P4D12(b)
El efecto de la proteína 191P4D12(b) sobre el crecimiento de células tumorales se evalúa in vivo evaluando el desarrollo y crecimiento de células tumorales que expresan o que carecen de 191P4D12(b). Por ejemplo, ratones SCID se inyectan subcutáneamente en cada flanco con 1 x 106 de tanto 3T3, líneas de células de cáncer de próstata (por ejemplo, células PC3), vejiga (por ejemplo, células UM-UC3), riñón (por ejemplo, células CaKi) como de pulmón (por ejemplo, células A427) que contienen el vector vacío tkNeo o 191P4D12(b). Pueden usarse al menos dos estrategias: (1) expresión constitutiva de 191P4D12(b) bajo la regulación de un promotor tal como un promotor constitutivo obtenido de los genomas de virus tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK
2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped, y (2) expresión regulada bajo el control de un sistema de vector inducible tal como ecdisona, tetraciclina, etc., siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped. Entonces, el volumen de tumor se monitoriza por medición con compás calibrador en la aparición de tumores palpables y se sigue con el tiempo para determinar si las células que expresan 191P4D12(b) crecen a un tasa más rápida y si los tumores producidos por células que expresan 191P4D12(b) demuestran o no características de agresividad alterada (por ejemplo, metástasis potenciada, vascularización, sensibilidad reducida a fármacos quimioterapéuticos).
Adicionalmente, los ratones puede implantarse con 1 x 105 de las mismas células ortotópicamente para determinar si 191P4D12(b) tiene un efecto sobre el crecimiento local en la próstata, y si 191P4D12(b) afecta o no la capacidad de las células para metastatizar, específicamente a ganglios linfáticos, y hueso (Miki T y col., Oncol Res. 2001; 12:209; Fu X y col., Int J Cancer. 1991, 49:938). El efecto de 191P4D12(b) sobre la formación y el crecimiento de tumor óseo puede evaluarse inyectando células tumorales intratibialmente.
El ensayo también es útil para determinar el efecto inhibidor de 191P4D12(b) de composiciones terapéuticas candidatas tales como, por ejemplo, intracuerpos de 191P4D12(b), moléculas antisentido de 191P4D12(b) y ribozimas.
Ejemplo 38: Inhibición mediada por anticuerpos monoclonales para 191P4D12(b) de tumores in vivo
La significativa expresión de 191P4D12(b) en tejidos de cáncer y la localización superficial, junto con su restrictiva expresión en tejidos normales, hace que 191P4D12(b) sea una buena diana para terapia con anticuerpos. Similarmente, 191P4D12(b) es una diana para inmunoterapia basada en linfocitos T. Por tanto, la eficacia terapéutica de mAb anti-191P4D12(b) en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer humano, que incluye cáncer de próstata, pulmón, vejiga, riñón y otros cánceres de 191P4D12(b) enumerados en la Tabla 1, se evalúa usando líneas celulares recombinantes tales como PC3-191P4D12(b), UM-UC3-191P4D12(b), CaKi-191P4D12(b), A427191P4D12(b) y 3T3-191P4D12(b) (véase, por ejemplo, Kaighn, M.E. y col., Invest Urol, 1979. 17(1):16-23), además de modelos de xenoinjerto de próstata, riñón y vejiga humano tales como LAPC-9AD, AGS-K3 y AGS-B1 (Saffran y col. PNAS 1999,10:1073-1078).
La eficacia de los anticuerpos sobre el crecimiento tumoral y la formación de metástasis se estudia, por ejemplo, en modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata, riñón, vejiga y pulmón ortotópicos de ratón. Los anticuerpos pueden estar sin conjugar, como se trata en este ejemplo, o pueden conjugarse con una modalidad terapéutica, como se aprecia en la materia. Los mAb anti-191P4D12(b) inhiben la formación de tumores en xenoinjertos de próstata, riñón, vejiga y pulmón. Los mAb anti-191P4D12(b) también retardan el crecimiento de tumores ortotópicos establecidos y prolongaron la supervivencia de ratones que tenían tumor. Estos resultados indican la utilidad de mAb anti191P4D12(b) en el tratamiento de estados locales y avanzados de varios tumores sólidos (véanse, por ejemplo, Saffran, D. y col., PNAS 10:1073-1078 o la URL de la malla mundial pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).
La administración de los mAb anti-191P4D12(b) condujo al retardo del crecimiento tumoral ortotópico establecido y a la inhibición de metástasis a sitios distantes, produciendo una prolongación significativa en la supervivencia de ratones que tenían tumor. Estos estudios indican que 191P4D12(b) es una diana atractiva para inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de mAb anti-191P4D12(b) para el tratamiento de cáncer de próstata local y metastásico. Este ejemplo indica que los anticuerpos monoclonales para 191P4D12(b) sin conjugar son eficaces para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor de próstata, riñón, vejiga y pulmón humanos cultivados en ratones SCID; por consiguiente, también es efectiva una combinación de tales anticuerpos monoclonales eficaces.
Inhibición de tumores usando múltiples mAb 191P4D12(b) sin conjugar
Materiales y procedimientos
Anticuerpos monoclonales para 191P4D12(b):
Se producen anticuerpos monoclonales contra 191P4D12(b) como se describe en el ejemplo titulado “Generación de anticuerpos monoclonales para 191P4D12(b) (mAb)”. Los anticuerpos se caracterizan por ELISA, transferencia Western, FACS e inmunoprecipitación para su capacidad para unirse a 191P4D12(b). Los datos de mapeo de epítopes para mAb anti-191P4D12(b), como se ha determinado por ELISA y análisis Western, reconocen epítopes sobre la proteína 191P4D12(b). Se realiza el análisis inmunohistoquímico de tejidos y células de cáncer de próstata, riñón, vejiga y pulmón con estos anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales se purifican a partir de ascitis o sobrenadantes de cultivo de tejido de hibridoma por cromatografía en proteína G-Sepharose, se dializan contra PBS, se esterilizan por filtración y se guardan a -20ºC. Las determinaciones de proteína se realizan por un ensayo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Un anticuerpo monoclonal terapéutico o una mezcla que comprende una mezcla de anticuerpos monoclonales individuales se prepara y se usa para el tratamiento de ratones que reciben inyecciones subcutáneas u ortotópicas de xenoinjertos de tumor de PC3, UM-UC3, CaKi y A427.
Líneas celulares y xenoinjertos
Las líneas de células cancerosas, PC3, UM-UC3, CaKi, y la línea celular A427, además de la línea de fibroblastos NIH-3T3 (Colección americana de cultivos tipo) se mantienen en RPMI (PC3) y DMEM (UM-UC3, CaKi, y A427, 3T3) respectivamente, complementado con L-glutamina y 10% de SBF.
Se generan poblaciones de células PC3-191P4D12(b), UM-UC3-191P4D12(b), CaKi-191P4D12(b), A427191P4D12(b) y 3T3-191P4D12(b) por transferencia de genes retrovíricos como se describe en Hubert, R.S. y col., Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25): 14523. El xenoinjerto de LAPC-9, que expresa un receptor de andrógenos natural y produce antígeno prostático específico (PSA), se pasa por ratones ICR-con inmunodeficiencia grave combinada (SCID) macho de 6 a 8 semanas de edad (Taconic Farms) por implante por trocar s.c. (Craft, N. y col., Nat Med. 1999, 5:280). Se preparan suspensiones de una única célula de células tumorales LAPC-9 como se describe en Craft y col. Similarmente, xenoinjertos derivados de pacientes de riñón (AGS-K3) y vejiga (AGS-B1) se pasan por ratones macho ICR-SCID de 6 a 8 semanas de edad.
Modelos de ratón de xenoinjerto.
Se generan tumores subcutáneos (s.c.) mediante inyección de 2 x 106 células cancerosas mezcladas a una dilución
1:1 con Matrigel (Collaborative Reseach) en el flanco derecho de ratones SCID macho. Para probar la eficacia de los anticuerpos en la formación de tumores, es decir, las inyecciones de anticuerpo se inician en el mismo día que las inyecciones de células de tumor. Como control, los ratones se inyectan tanto con IgG de ratón purificada (ICN) como con PBS; o un anticuerpo monoclonal purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares no se encuentra diferencia entre IgG de ratón o PBS en el crecimiento tumoral. Los tamaños de los tumores se determinan por mediciones de compás calibrador, y el volumen de tumor se calcula como longitud x anchura x altura. Los ratones con tumores subcutáneos superiores a 1,5 cm de diámetro se sacrifican.
Se realizan inyecciones ortotópicas con anestesia usando ketamina/xilazina. Para estudios ortotópicos de próstata se hace una incisión por el abdomen para exponer la próstata y células tumorales LAPC o PC3 (5 x 105 mezcladas con Matrigel) se inyectan en la cápsula de la próstata en un volumen de 10 µl. Para monitorizar el crecimiento tumoral, los ratones se palpan y se recoge sangre semanalmente para medir niveles de PSA. Para modelos ortotópicos de riñón se hace una incisión por los músculos abdominales para exponer el riñón. Células AGS-K3 mezcladas con Matrigel se inyectan bajo la cápsula del riñón. Los ratones se segregan en grupos para los tratamientos apropiados, inyectándose i.p. mAb anti-191P4D12(b) o de control.
Los mAb anti-191P4D12(b) inhiben el crecimiento de tumores por cáncer de xenoinjerto que expresan 191P4D12(b)
El efecto de mAb anti-191P4D12(b) sobre la formación de tumores se prueba usando modelos ortotópicos de tumor derivado de línea celular (por ejemplo, PC3, UM-UC3, CaKi, A427 y 3T3) y de paciente (por ejemplo, LAPC9, AGSK3, AGS-B1). Como comparación con el modelo de tumor s.c., el modelo ortotópico, que requiere la inyección de células tumorales directamente en el órgano del ratón, tal como próstata, vejiga, riñón o pulmón, produce un crecimiento tumoral local, desarrollo de metástasis en sitios distales, deterioro de la salud del ratón y posterior muerte (Saffran, D. y col., PNA, arriba). Las características hacen que el modelo ortotópico sea más representativo de la progresión de la enfermedad humana y permitió que los inventores siguieran el efecto terapéutico de mAb en criterios de valoración clínicamente relevantes.
Por ejemplo, se inyectan células tumorales en la próstata de ratón y 2 días después los ratones se segregan en dos grupos y se tratan con tanto a) 200-500 µg de Ab anti-191P4D12(b) como b) PBS tres veces por semana durante dos a cinco semanas.
Una ventaja importante de los modelos de cáncer ortotópicos es la capacidad para estudiar el desarrollo de metástasis. La formación de metástasis en ratones que tienen tumores ortotópicos establecidos se estudia por análisis de IHC en secciones de pulmón usando un anticuerpo contra una proteína de la superficie celular específica para tumor tal como anti-CK20 para cáncer de próstata (Lin S y col., Cancer Detect Prev. 2001;25:202).
Otra ventaja de los modelos de cáncer de xenoinjerto es la capacidad para estudiar la neovascularización y angiogénesis. El crecimiento tumoral es parcialmente dependiente del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Aunque el sistema capilar y la red sanguínea en desarrollo es de origen huésped, la iniciación y la arquitectura de la neovascular está regulada por el tumor de xenoinjerto (Davidoff AM y col., Clin Cancer Res. 2001;7:2870; Solesvik O y col., Eur J Cancer Clin Oncol. 1984, 20:1295). El efecto del anticuerpo y la molécula pequeña sobre la neovascularización se estudia según procedimientos conocidos en la técnica, tales como por análisis de IHC de tejidos tumorales y su microentorno de alrededor.
Ratones que tienen tumores ortotópicos establecidos se administran con inyecciones de 1000 µg de tanto mAb anti191P4D12(b) como PBS durante un periodo de 4 semanas. Se deja que los ratones en ambos grupos establezcan una alta carga tumoral para garantizar una alta frecuencia de formación de metástasis en pulmones de ratón. Entonces, los ratones se sacrifican y sus vejigas, hígados, hueso y pulmones se analizan para la presencia de células tumorales por análisis de IHC. Estos estudios demuestran una amplia eficacia antitumoral de anticuerpos anti-191P4D12(b) en la iniciación y la progresión de cáncer de próstata en modelos de ratón de xenoinjerto. Los anticuerpos anti-191P4D12(b) inhiben la formación de tumores de tumores, además de retardar el crecimiento de tumores ya establecidos y prolongar la supervivencia de ratones tratados. Además, los mAb anti-191P4D12(b) demuestran un efecto inhibidor espectacular sobre la diseminación de tumor de próstata local a sitios distales, incluso en presencia de una gran carga tumoral. Por tanto, los mAb anti-191P4D12(b) son eficaces en importantes criterios de valoración clínicamente relevantes (crecimiento tumoral), prolongación de la supervivencia y salud.
Ejemplo 39: Uso terapéutico y de diagnóstico de anticuerpos anti-191P4D12(b) en seres humanos
Anticuerpos monoclonales anti-191P4D12(b) se usan con seguridad y eficazmente para fines de diagnóstico, profilácticos, pronósticos y/o terapéuticos en seres humanos. La transferencia Western y el análisis inmunohistoquímico de tejidos de cáncer y xenoinjertos de cáncer con mAb anti-191P4D12(b) muestran una fuerte y amplia tinción en carcinoma, pero niveles significativamente menores o indetectables en tejidos normales. La detección de 191P4D12(b) en carcinoma y en enfermedad metastásica demuestra la utilidad del mAb como indicador de diagnóstico y/o pronóstico. Por tanto, los anticuerpos anti-191P4D12(b) se usan en aplicaciones de diagnóstico tales como inmunohistoquímica de especímenes de biopsia de riñón para detectar cáncer de pacientes sospechosos.
Como se determina por citometría de flujo, el mAb anti-191P4D12(b) se une específicamente a células de carcinoma. Por tanto, los anticuerpos anti-191P4D12(b) se usan en aplicaciones de obtención de imágenes del cuerpo entero de diagnóstico tales como radioinmunoescintigrafía y radioinmunoterapia (véase, por ejemplo, Potamianos S. y col. Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000)) para la detección de cánceres localizados y metastásicos que presentan expresión de 191P4D12(b). La eliminación o liberación de un dominio extracelular de 191P4D12(b) en el medio extracelular, tal como el observado para fosfodiesterasa alcalina B10 (Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998)) permite la detección de diagnóstico de 191P4D12(b) por anticuerpos anti191P4D12(b) en suero y/o muestras de orina de pacientes sospechosos.
Los anticuerpos anti-191P4D12(b) que se unen específicamente a 191P4D12(b) se usan en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de cánceres que expresan 191P4D12(b). Los anticuerpos anti-191P4D12(b) se usan como modalidad sin conjugar y como forma conjugada en la que los anticuerpos están unidos a una de diversas modalidades terapéuticas o de obtención de imágenes muy conocidas en la técnica, tales como a profármacos, enzimas o radioisótopos. En estudios preclínicos, los anticuerpos anti-191P4D12(b) sin conjugar y conjugados se prueban para la eficacia de la prevención de tumor e inhibición del crecimiento en los modelos de xenoinjerto de cáncer de ratón SCID, por ejemplo, modelos de cáncer de riñón AGS-K3 y AGS-K6 (véase, por ejemplo, el ejemplo titulado “Inhibición mediada por anticuerpo monoclonales para 191P4D12(b) de tumores de vejiga y pulmón in vivo”). Se usan anticuerpos anti-191P4D12(b) tanto conjugados como sin conjugar como modalidad terapéutica en ensayos clínicos humanos tanto solos como en combinación con otros tratamientos como se describe en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 40: Ensayos clínicos humanos para el tratamiento y el diagnóstico de carcinomas humanos mediante el uso de anticuerpos anti-191P4D12(b) humanos in vivo
Según la presente invención se usan anticuerpos que reconocen un epítope sobre 191P4D12(b), y se usan en el tratamiento de ciertos tumores tales como aquellos enumerados en la Tabla I. Basándose en varios factores, que incluyen niveles de expresión de 191P4D12(b), tumores tales como aquellos enumerados en la Tabla I son presentemente indicaciones preferidas. A propósito de cada una de estas indicaciones, se buscan satisfactoriamente tres enfoques clínicos.
I.) Terapia auxiliar: En terapia auxiliar, los pacientes se tratan con anticuerpos anti-191P4D12(b) en combinación con un agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o radioterapia. Las dianas de cáncer primario tales como aquellas enumeradas en la Tabla I se tratan bajo protocolos convencionales mediante la adición de anticuerpos anti-191P4D12(b) a terapia de primera y segunda línea convencional. Los diseños del protocolo tratan la eficacia como se evalúa por reducción en la masa de tumor, además de la capacidad para reducir las dosis usuales de quimioterapia convencional. Estas reducciones de dosificación permiten terapia adicional y/o prolongada reduciendo la toxicidad relacionada con la dosis del agente quimioterapéutico. Los anticuerpos anti-191P4D12(b) se utilizan en varios ensayos clínicos auxiliares en combinación con los agentes quimioterapéuticos o antineoplásicos adriamicina (carcinoma de próstata avanzado), cisplatino (carcinomas de cabeza y cuello y de pulmón avanzados), taxol (cáncer de mama) y doxorubicina (preclínico).
II.) Monoterapia: A propósito del uso de los anticuerpos anti-191P4D12(b) en monoterapia de tumores, los anticuerpos se administran a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico En una realización, la monoterapia se realiza clínicamente en pacientes con cáncer terminal con enfermedad metastásica extensa. Los pacientes muestran alguna estabilización de la enfermedad. Los ensayos demuestran un efecto en pacientes resistentes al tratamiento con tumores cancerosos.
III.) Agente de obtención de imágenes mediante unión de un radionúclido (por ejemplo, yodo o itrio (I131, Y90)) a anticuerpos anti-191P4D12(b), los anticuerpos radiomarcados se utilizan como agente de diagnóstico y/o de obtención de imágenes. En una función tal, los anticuerpos marcados se localizan en tanto tumores sólidos, además de lesiones metastásicas de células que expresan 191P4D12(b). A propósito del uso de los anticuerpos anti-191P4D12(b) como agentes de obtención de imágenes, los anticuerpos se usan como auxiliar para el tratamiento quirúrgico de tumores sólidos, como tanto un cribado pre-quirúrgico, además de un seguimiento posoperatorio para determinar qué tumor sigue y/o reaparece. En una realización, un anticuerpo (111In)-191P4D12(b) se usa como agente de obtención de imágenes en un ensayo clínico humano de fase I en pacientes que tienen un carcinoma que expresa 191P4D12(b) (por analogía véase, por ejemplo, Divgi y col. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)). Los pacientes son seguidos con gammacámara anterior y posterior convencional. Los resultados indican que se identifican lesiones primarias y lesiones metastásicas.
Dosis y vía de administración
Como se aprecia para aquellos expertos en la materia, las consideraciones de dosificación pueden determinarse por comparación con los productos análogos que están en la clínica. Por tanto, los anticuerpos anti-191P4D12(b) pueden administrarse con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m2, con la menor dosis usada, por ejemplo, a propósito de estudios de seguridad. La afinidad de anticuerpos anti-191P4D12(b) con respecto a la afinidad de un anticuerpo conocido para su diana es un parámetro usado por aquellos expertos en la materia para determinar pautas de dosis análogas. Además, los anticuerpos anti-191P4D12(b) que son anticuerpos completamente humanos, con respecto al anticuerpo quimérico, tienen eliminación más lenta; por consiguiente, la dosificación en pacientes con tales anticuerpos anti-191P4D12(b) completamente humanos puede ser menor, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m2, y todavía siguen siendo eficaces. La dosificación en mg/m2, a diferencia de la medición de la dosis convencional en mg/kg, es una medida basada en el área superficial y es una medición de dosificación conveniente que se diseña para incluir pacientes de todos tamaños desde lactantes hasta adultos.
Tres enfoques de administración distintos son útiles para la administración de anticuerpos anti-191P4D12(b). La administración intravenosa convencional es una técnica de administración convencional para muchos tumores. Sin embargo, a propósito de los tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, vía biliar, otras vías y similares, la administración intraperitoneal puede demostrar ser favorable para obtener alta dosis de anticuerpo en el tumor y también para minimizar la eliminación de anticuerpo. De un modo similar, ciertos tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para perfusión regional. La perfusión regional permite una alta dosis de anticuerpo en el sitio de un tumor y minimiza la eliminación a corto plazo del anticuerpo.
Plan de desarrollo clínico (PCD)
Visión general: El PCD sigue y desarrolla tratamientos de anticuerpos anti-191P4D12(b) a propósito de terapia auxiliar, monoterapia y como un agente de obtención de imágenes. Los ensayos demuestran inicialmente la seguridad y después confirman la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son de etiqueta abierta en comparación
5 con la quimioterapia convencional con terapia convencional más anticuerpos anti-191P4D12(b). Como se apreciará, un criterio que puede utilizarse a propósito del enrolamiento de pacientes es los niveles de expresión de 191P4D12(b) en sus tumores como se ha determinado por biopsia.
Al igual que con cualquier agente terapéutico basado en la infusión de proteínas o anticuerpos, los asuntos de seguridad están relacionados principalmente con (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente para la respuesta terapéutica del anticuerpo o HAHA); y, (iii) toxicidad para células normales que expresan 191P4D12(b). Las pruebas convencionales y el seguimiento se utilizan para monitorizar cada uno de estos asuntos de seguridad. Se encuentra que los anticuerpos anti-191P4D12(b) son seguros tras la administración humana.
15 Ejemplo 41: Ensayo clínico humano de terapia auxiliar con anticuerpo anti-191P4D12(b) humano y agente quimioterapéutico
Se inicia un ensayo clínico humano de fase I para evaluar la seguridad de seis dosis intravenosas de un anticuerpo anti-191P4D12(b) humano a propósito del tratamiento de un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer de un tejido enumerado en la Tabla I. En el estudio se evalúa la seguridad de dosis únicas de anticuerpos anti-191P4D12(b) cuando se utilizan como terapia auxiliar para un agente antineoplásico o quimioterapéutico como se define en el presente documento tal como, sin limitación: cisplatino, topotecan, doxorubicina, adriamicina, taxol o similares. El diseño del estudio incluye la administración de seis dosis únicas de un anticuerpo anti-191P4D12(b) con dosificación de anticuerpo aumentando de aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 275 mg/m2 durante el transcurso del tratamiento según el siguiente programa:
Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35
Dosis de mAb 25 mg/m2 75 mg/m2 125 mg/m2 175 mg/m2 225 mg/m2 275 mg/m2
Quimioterapia (dosis convencional) + + + + + +
25 Los pacientes son estrechamente seguidos durante una semana tras cada administración de anticuerpo y quimioterapia. En particular, los pacientes se evalúan para los asuntos de seguridad mencionados anteriormente: (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente a la respuesta terapéutica del anticuerpo humano o HAHA); y, (iii) toxicidad para células normales que expresan 191P4D12(b). Las pruebas convencionales y el seguimiento se utilizan para monitorizar cada uno de estos asuntos de seguridad. También se evalúan pacientes para desenlace clínico, y particularmente la reducción en la masa de tumor como se prueba por RMN u otra obtención de imágenes.
Se demuestra que los anticuerpos anti-191P4D12(b) son seguros y eficaces, los ensayos de fase II confirman la eficacia y refinan la dosificación óptima.
35 Ejemplo 42: Ensayo clínico humano: monoterapia con anticuerpo anti-191P4D12(b) humano
Los anticuerpos anti-191P4D12(b) son seguros a propósito del ensayo auxiliar anteriormente tratado, un ensayo clínico humano de fase II confirma la eficacia y dosificación óptima para monoterapia. Tal ensayo se lleva a cabo e implica los mismos análisis de seguridad y de resultados que el ensayo auxiliar anteriormente descrito con la excepción de que los pacientes no reciben quimioterapia simultáneamente con la recepción de la dosis de anticuerpos anti-191P4D12(b).
Ejemplo 43: Ensayo clínico humano: Obtención de imágenes de diagnóstico con anticuerpo anti191P4D12(b)
De nuevo, como la terapia auxiliar tratada anteriormente es segura dentro de los criterios de seguridad tratados anteriormente, se realiza un ensayo clínico humano referente al uso de anticuerpos anti-191P4D12(b) como agente
45 de obtención de imágenes de diagnóstico. El protocolo se diseña de un modo sustancialmente similar al descrito en la materia, tal como en Divgi y col. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991). Se encuentra que los anticuerpos son tanto seguros como eficaces cuando se usan en una modalidad de diagnóstico.
Ejemplo 44: Comparación de homología de 191P4D92(b) con secuencias conocidas
La proteína 191P4D12(b) humana presenta un alto grado de homología con una proteína humana conocida, concretamente el receptor de la superfamilia de Ig LNIR (gi 14714574), también conocido como nectina 4 humana (gi 16506807). El LNIR humano muestra el 100% de identidad con 191P4D12(b) al nivel de proteínas. El homólogo de ratón de 191P4D12(b) se ha identificado como nectina 4 murina (gi 18874521). Muestra una fuerte homología con 191P4D12(b), presentado el 92% de identidad y el 95% de homología con 191P4D12(b) (véase la Figura 4).
El miembro prototipo de la familia 191P4D12(b), 191P4D12(b)v.1, es una proteína de 510 aminoácidos, con el extremo N localizado extracelularmente y el extremo C intracelular. El análisis bioinformático inicial usando programas de predicción de topología sugirió que 191P2D14 puede contener 2 transmembranas basándose en el perfil de hidrofobia. Sin embargo, el primer dominio hidrófobo se identificó como una secuencia señal, que convierte 191P2D12 en una proteína de membrana de tipo I, con un extremo N extracelular.
El gen 191P4D12(b) tiene varias variantes, que incluyen un SNP representado en 191P4D12(b) v.2, una variante de deleción del extremo N representada en 191P4D12(b) v.6 y 191P4D12(b) v.7 que carece de 25 aminoácidos entre los aminoácidos 411 y 412 de 191P4D12(b) v.1.
El análisis de motivos reveló la presencia de varios motivos funcionales de proteína en la proteína 191P4D12(b) (Tabla L). Se han identificado dos dominios de inmunoglobulina en las posiciones 45-129 y 263-317. Además, 191P4D12(b) contiene una firma de cadherina que incluye y la secuencia RGD. Los dominios de inmunoglobulina se encuentran en numerosas proteínas y participan en interacciones proteína-proteína tales que incluyen interacciones proteína-ligando (Weismann y col., J Mol Med 2000, 78:247). Además, los dominios de Ig funcionan en la adhesión de células, permitiendo la interacción de leucocitos y células transmitidas por la sangre con el endotelio (Wang y Springer, Immunol Rev 1998, 163:197). Las cadherinas son proteínas transmembrana individuales que contienen dominios similares a inmunoglobulina y participan en la adhesión y clasificación de células (Shan y col., Biophys Chem 1999, 82:157). Median en la adhesión de células específica para tejido, tal como adhesión de linfocitos a la superficie de células epiteliales. Finalmente, el homólogo más relacionado con 191P4D12(b) es la nectina 4, una molécula de adhesión conocida que regula las uniones epiteliales y endoteliales, sugiriendo fuertemente que 191P4D12(b) participa en la adhesión de células (Reymond N y col., J Biol Chem 2001, 276:43205).
Los motivos encontrados en 191P4D12(b) pueden participar en el crecimiento y la progresión tumoral potenciando las etapas iniciales de tumorigénesis, tales como crecimiento del tumor o establecimiento de un tumor, permitiendo la adhesión a membranas basales y rodeando células, mediando en la comunicación y supervivencia de células.
Por consiguiente, cuando 191P4D12(b) funciona como regulador del establecimiento de tumor, formación de tumor, crecimiento tumoral, señalización de células o como un modulador de la transcripción que participa en genes activantes asociados a supervivencia, invasión, tumorigénesis o proliferación, 191P4D12(b) se usa para fines terapéuticos, de diagnóstico, pronóstico y/o preventivos. Además, cuando una molécula, tal como una variante o SNP de 191P4D12(b), se expresa en tejidos cancerosos, tales como aquellos enumerados en la Tabla I, se usan para fines terapéuticos, de diagnóstico, pronóstico y/o preventivos.
Ejemplo 45: Regulación de la transcripción
La localización de la superficie celular de 191P4D12(b) acoplada a la presencia de dominios de Ig dentro de su secuencia indica que 191P4D12(b) modula la transducción de señales y la regulación de la transcripción de genes eucariotas. La regulación de la expresión génica se confirma, por ejemplo, estudiando la expresión génica en células que expresan o que carecen de 191P4D12(b). Para este fin se realizan dos tipos de experimentos.
En el primer conjunto de experimentos, el ARN de células parentales y que expresan 191P4D12(b) se extrae y se hibrida con matrices de genes comercialmente disponibles (Clontech) (Smid-Koopman E y col. Br J Cancer. 2000. 83:246). Se comparan células en reposo, además de células tratadas con SBF, andrógeno o factores de crecimiento. Los genes diferencialmente expresados se identifican según procedimientos conocidos en la técnica. Entonces, los genes diferencialmente expresados se mapean para rutas biológicas (Chen K y col. Thyroid. 2001,11:41.).
En el segundo conjunto de experimentos, la activación de la ruta de transcripción específica se evalúa usando construcciones indicadoras de luciferasa comercialmente disponibles (Stratagene) que incluyen: NFkB-luc, SRE-luc, ELK1-luc, ARE-luc, p53-luc y CRE-luc. Estos indicadores de la transcripción contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que se encuentran en la dirección 3' de rutas de transducción de señales bien caracterizadas, y representan una buena herramienta para determinar la activación de la ruta y cribar moduladores positivos y negativos de la activación de la ruta.
Por tanto, 191P4D12(b) desempeña una función en la regulación de genes y se usa como diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 46: Identificación y confirmación de posibles rutas de transducción de señales
Se ha informado que muchas proteínas de mamífero interactúan con moléculas de señalización y participan en la regulación de rutas de señalización (J Neurochem. 2001; 76:217-223). Las moléculas similares a inmunoglobulina se han asociado en particular a varias tirosina cinasas que incluyen Lyc, Blk, syk (), la cascada de señalización de MAPK que controla la mitogénesis de células y el flujo de calcio (Vilen J y col., J Immunol 1997, 159:231; Jiang F, Jia Y, Cohen I. Blood. 2002, 99:3579). Además, la proteína 191P4D12(b) contiene varios sitios de fosforilación (véase la Tabla VI) que indican una asociación a cascadas de señalización específicas. Usando técnicas de inmunoprecipitación y transferencia Western se identifican proteínas que se asocian a 191P4D12(b) y median en los acontecimientos de señalización. Se sabe que varias rutas que desempeñan una función en la biología del cáncer pueden regularse por 191P4D12(b), que incluyen rutas de fosfolípidos tales como P13K, AKT, etc., rutas de adhesión y migración, que incluyen FAK, Rho, Rac-1, -catenina, etc., además de cascadas mitogénicas/de supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11:279; J Biol Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000,19:3003, J. Cell Biol. 1997,138:913.). Con el fin de determinar si la expresión de 191P4D12(b) es suficiente para regular las rutas de señalización específicas no de otro modo activas en células PC3 en reposo, el efecto de estos genes sobre la activación de la cascada de p38 MAPK se investigó en la línea celular de cáncer de próstata PC3 (Figura 21A-B). La activación de la cinasa p38 depende de su fosforilación en residuos de tirosina y serina. p38 fosforilada puede distinguirse del estado no fosforilado por un mAb fosfo-p38. Este Ab específico para fosfo se usó para estudiar el estado de fosforilación de p38 en líneas celulares PC3 manipuladas.
Las células PC3 que expresan establemente neo de 191P4D12(b) se cultivaron durante la noche en tanto 1% como 10% de SBF. Los lisados celulares completos se analizaron por transferencia Western. Las células PC3 tratadas con los activadores de p38 conocidos, NaSal o TNF, se usaron como control positivo. Los resultados muestran que mientras que la expresión del gen neo de control no tiene no efecto sobre la fosforilación de p38, la expresión de 191P4D12(b) en células PC3 es suficiente para inducir la activación de la ruta de p38 (Figura 21A). Los resultados se verificaron usando transferencia Western con un Ab anti-p38, que muestra carga de proteína igual sobre los geles (Figura 21 B).
En otro conjunto de experimentos se examinó la cantidad suficiente de expresión de 191P4D12(b) en la línea celular de cáncer de próstata PC3 para activar la ruta de MAPK mitogénica, concretamente la cascada de ERK (Figura 22AB). La activación de ERK depende de su fosforilación sobre residuos de tirosina y serina. ERK fosforilada puede distinguirse del estado no fosforilado por un mAb fosfo-ERK. Este Ab específico para fosfo se usó para estudiar el estado de fosforilación de ERK en líneas celulares PC3 manipuladas. Las células PC3, que expresan una forma activada de Ras, se usaron como control positivo.
Los resultados muestran que mientras que la expresión del gen neo de control no tiene efecto sobre la fosforilación de ERK, la expresión de 191P4D12(b) en células PC3 es suficiente para inducir un aumento en la fosforilación de ERK (Figura 22A). Estos resultados se verificaron usando transferencia Western anti-ERK (Figura 22B) y confirman la activación de la ruta de ERK por 191P4D12(b) y STEAP-2.
Como el SBF contiene varios componentes que pueden contribuir a la activación de ERK mediada por receptor, los inventores examinaron el efecto de 191P4D12(b) en niveles bajos y óptimos de SBF. Las células PC3 que expresan neo o 191P4D12(b) se cultivaron en tanto 0,1% como 10% de SBF durante la noche. Las células se analizaron por transferencia Western anti-fosfo-ERK. Este experimento muestra que 191P4D12(b) induce la fosforilación de ERK en 0,1% de SBF, y confirma que la expresión de 191P4D12(b) es suficiente para inducir la activación de la cascada de señalización de ERK en ausencia de estímulos adicionales.
Para confirmar que 191P4D12(b) activa directamente o indirectamente rutas de transducción de señales conocidas en células, ensayos indicadores de la transcripción basados en luciferasa (luc) se llevan a cabo en células que expresan genes individuales. Estos indicadores de la transcripción contienen sitios de unión consenso para factores de transcripción conocidos que se encuentran en la dirección 3' de rutas de transducción de señales bien caracterizadas. Los indicadores y ejemplos de estos factores de transcripción asociados, rutas de transducción de señales y estímulos de activación se enumeran a continuación.
1.
NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-cinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés
2.
SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación
3.
AP-1-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés
4.
ARE-luc, receptor de andrógenos; esteroides/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
5.
p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis
6.
CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés
7.
TCF-luc, TCF/Lef; -catenina, adhesión/invasión
Los efectos mediados por genes pueden ensayarse en células que muestran expresión de ARNm. Los plásmidos indicadores de luciferasa pueden introducirse por transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega). La actividad de luciferasa, un indicador de actividad de transcripción relativa, se mide por incubación de extractos de células con sustrato de luciferina y la luminiscencia de la reacción se monitoriza en un luminómetro.
Las rutas de señalización activadas por 191P4D12(b) se mapean y se usan para la identificación y validación de dianas terapéuticas. Cuando 191P4D12(b) participa en la señalización de células, se usa como diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 47: Participación en la progresión tumoral
Basándose en la función de dominios de Ig y motivos de cadherina en el crecimiento celular y la transducción de señales, el gen 191P4D12(b) puede contribuir al crecimiento, invasión y transformación de células cancerosas. La función de 191P4D12(b) en el crecimiento tumoral se confirma en una variedad de líneas celulares primarias y transfectadas que incluyen líneas celulares de próstata, además de células NIH-3T3 manipuladas para expresar establemente 191P4D12(b). Las células parentales que carecen 191P4D12(b) y células que expresan 191P4D12(b) se evalúan para crecimiento celular usando un ensayo de proliferación bien documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000;44:61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer Drugs. 1996, 7:288).
Para confirmar la función de 191P4D12(b) en el proceso de transformación, su efecto se investiga en ensayos formadores de colonias. Las células NIH-3T3 parentales que carecen de 191P4D12(b) se comparan con células NIH-3T3 que expresan 191P4D12(b) usando un ensayo de agar blando bajo condiciones rigurosas y más permisivas (Song Z. y col. Cancer Res. 2000;60:6730).
Para confirmar la función de 191P4D12(b) en invasión y metástasis de células cancerosas se usa un ensayo bien establecido, por ejemplo, un ensayo Transwell Insert System (Becton Dickinson) (Cancer Res. 1999; 59:6010). Células de control, que incluyen líneas celulares de próstata, mama y riñón que carecen de 191P4D12(b), se comparan con células que expresan 191P4D12(b). Las células se cargan con el colorante fluorescente calceína y se siembran en el pocillo superior del inserto Transwell recubierto con un análogo de membrana basal. La invasión se determina por fluorescencia de células en la cámara inferior con respecto a la fluorescencia de la población de células entera.
191P4D12(b) también puede desempeñar una función en el ciclo celular y apoptosis. Células parentales y células que expresan 191P4D12(b) se comparan para diferencias en la regulación del ciclo celular usando un ensayo BrdU bien establecido (Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988,136:247). En resumen, las células se cultivan bajo tanto condiciones óptimas (suero completo) como limitantes (suero bajo), se marcan con BrdU y se tiñen con Ab anti-BrdU y yoduro de propidio. Las células se analizan para la entrada en las fases G1, S y G2M del ciclo celular. Alternativamente, el efecto del estrés sobre la apoptosis se evalúa en células parentales de control y células que expresan 191P4D12(b), que incluyen células de próstata normales y de tumor. Las células manipuladas y parentales se tratan con diversos agentes quimioterapéuticos, tales como etopósido, taxol, etc., e inhibidores de la síntesis de proteínas, tales como cicloheximida. Las células se tiñen con anexina V-FITC y la muerte celular se mide por análisis FACS. La modulación de la muerte celular por 191P4D12(b) puede desempeñar una función crítica en la regulación de la progresión tumoral y la carga tumoral.
Cuando 191P4D12(b) desempeña una función en el crecimiento, transformación, invasión o apoptosis celular, se usa como diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 48: Participación en angiogénesis
La angiogénesis o la formación de nuevos vasos sanguíneos capilares es necesaria para el crecimiento tumoral (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998139:441). Basándose en el efecto de cadherinas sobre la adhesión de células tumorales y su interacción con células endoteliales, 191P4D12(b) desempeña una función en la angiogénesis (Mareel y Leroy: Physiol Rev. 83:337; DeFouw L y col., Microvasc Res 2001, 62:263). Se han desarrollado varios ensayos para medir la angiogénesis in vitro e in vivo, tal como los ensayos de cultivo de tejido de formación de tubos de células endoteliales y proliferación de células endoteliales. Usando estos ensayos, además de la neo-vascularización in vitro se confirma la función de 191P4D12(b) en angiogénesis, potenciamiento o inhibición.
Por ejemplo, las células endoteliales manipuladas para expresar 191P4D12(b) se evalúan usando la ensayos de formación de tubos y proliferación. El efecto de 191P4D12(b) también se confirma en modelos animales in vivo. Por ejemplo, las células que tanto expresan como que carecen de 191P4D12(b) se implantan subcutáneamente en ratones inmunodeprimidos. La migración y angiogénesis de células endoteliales se evalúan 5-15 días después usando técnicas inmunohistoquímicas. 191P4D12(b) afecta la angiogénesis, y se usa como diana para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 49: Participación en interacciones proteína-proteína
Se ha mostrado que los dominios de Ig y los motivos de cadherina median en la interacción con otras proteínas, que incluyen proteína de la superficie celular. Usando técnicas de inmunoprecipitación, además de dos sistemas híbridos de levadura, se identifica que las proteínas se asocian a 191P4D12(b). Los inmunoprecipitados de células que expresan 191P4D12(b) y células que carecen de 191P4D12(b) se comparan para asociaciones proteína-proteína específicas.
Se realizan estudios para confirmar el grado de asociación de 191P4D12(b) con moléculas efectoras, tales como proteínas nucleares, factores de transcripción, cinasas, fosfatos etc. Los estudios que comparan células positivas para 191P4D12(b) y negativas para 191P4D12(b), además de estudios que comparan células sin estimular/en reposo y células tratadas con activadores de células epiteliales, tales como citocinas, factores de crecimiento, andrógeno y Ab anti-integrina, revelan interacciones únicas.
Además, las interacciones proteína-proteína se confirman usando metodología de dos híbridos de levadura (Curr. Opin. Chem Biol. 1999, 3:64). Un vector que lleva una biblioteca de proteínas fusionada con el dominio de activación de un factor de transcripción se introduce en levadura que expresa una proteína de fusión ADN de 191P4D12(b)dominio de unión y una construcción indicadora. La interacción proteína-proteína se detecta por actividad indicadora colorimétrica. La asociación específica con moléculas efectoras y factores de transcripción dirige a un experto al modo de acción de 191P4D12(b) y, por tanto, identifica dianas terapéuticas, de pronóstico, preventivas y/o de diagnóstico para cáncer. Este ensayo y ensayos similares también se usan para identificar y cribar moléculas pequeñas que interaccionan con 191P4D12(b). Por tanto, se encuentra que 191P4D12(b) se asocia a proteínas y moléculas pequeñas. Por consiguiente, 191P4D12(b) y estas proteínas y moléculas pequeñas se usan para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 50: Participación de 191P4D12(b) en la comunicación célula-célula
La comunicación célula-célula es esencial en el mantenimiento de la integridad de órganos y homeostasis, ambos de los cuales se desregulan durante la formación y progresión tumoral. Basándose en la presencia de un motivo de cadherina en 191P4D12(b), un motivo que se sabe que participa en la interacción de células y la adhesión célula-célula, 191P4D12(b), puede regular la comunicación de células. Las comunicaciones intercelulares pueden medirse usando dos tipos de ensayos (J. Biol. Chem. 2000, 275:25207). En el primer ensayo, células cargadas con un colorante fluorescente se incuban en presencia de células receptoras sin marcar y las poblaciones de células se examinan bajo microscopía fluorescente. Este ensayo cualitativo mide el intercambio de colorante entre células adyacentes. En el segundo sistema de ensayo, poblaciones de células donantes y receptoras se tratan como antes y las mediciones cuantitativas de la población de células receptoras se realizan por análisis de FACS. Usando estos dos sistemas de ensayo, células que expresan 191P4D12(b) se comparan con controles que no expresan 191P4D12(b), y se encuentra que 191P4D12(b) potencia las comunicaciones de células. La Figura 19 y la Figura 20 demuestran que 191P4D12(b) media en la transferencia de la calceína de moléculas pequeñas entre células adyacentes, y así regula la comunicación célula-célula en células de cáncer de próstata. En este experimento, células PC3 receptoras se marcaron con dextrano-Texas Red y células PC3 donantes se marcaron con calceína AM (verde). Las células donantes (verdes) y receptoras (rojas) se co-cultivaron a 37ºC y se analizaron por microscopía para la co-localización de Texas red y calceína. Los resultados demostraron que mientras que las células de control PC3 (expresión de proteínas 191P4D12(b) no detectable) presentan poca transferencia de calceína, la expresión de 191P4D12(b) permite la transferencia de moléculas pequeñas entre células (Figura 19), por lo que las células receptoras inicialmente rojas toman un color parduzco, y co-localizan moléculas rojas y verdes. Las moléculas pequeñas y/o anticuerpos que modulan la comunicación célula-célula mediada por 191P4D12(b) se usan como agentes terapéuticos para cánceres que expresan 191P4D12(b). Cuando 191P4D12(b) funciona en la comunicación célula-célula y el transporte de moléculas pequeñas, se usa como diana o marcador para fines de diagnóstico, pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 51: Modulación de la función de 191P4D12(b)
Silenciamiento de la expresión de 191P4D12(b)
Pueden usarse varias técnicas para silenciar o inactivar la expresión de 191P4D12(b) in vitro e in vivo, que incluyen ARN interferente (ARNi) y otras tecnologías antisentido. El ARNi hace uso de ARN bicatenario específico para secuencia para prevenir la expresión génica. Se transfectan ARN interferente pequeño (ARNip) en células de mamífero y así median en la degradación de ARNm específico para secuencia (Elbashir y col., Nature, 2001; vol.
411: 494-498). Usando este enfoque, ARNi específico para 191P4D12(b) se introduce en células que expresan 191P4D12(b) por transfección. El efecto del silenciamiento de la expresión de la proteína 191P4D12(b) se evalúa usando los ensayos biológicos mencionados en los Ejemplos 44 a 50, anteriormente.
La reducción de la expresión de proteínas 191P4D12(b) se detecta 24-48 horas después de la transfección por inmunotinción y citometría de flujo. La introducción de ARNi específico para 191P4D12(b) redujo la expresión de células positivas para 191P4D12(b) y reduce el efecto biológico de 191P4D12(b) sobre el crecimiento y la progresión tumoral.
Por consiguiente, las secuencias de oligonucleótidos de ARN se usan en aplicaciones terapéuticas y profilácticas. Además, las secuencias de oligonucleótidos de ARN se usan para evaluar cómo la modulación de la expresión de un gen 191P4D12(b) afecta la función de células y/o tejidos cancerosos.
Inhibición usando molécula pequeña y anticuerpos
Usando líneas celulares de control y líneas celulares que expresan 191P4D12(b) se identifican inhibidores de la función de 191P4D12(b). Por ejemplo, células PC3 y PC3-191P4D12(b) pueden incubarse en presencia y ausencia de mAb o inhibidores de moléculas pequeñas. El efecto de estos mAb o inhibidores de moléculas pequeñas se investiga usando los ensayos de comunicación, proliferación y señalización de células descritos anteriormente.
La transducción de señales y la salida biológica mediada por cadherinas puede modularse por diversos mecanismos, que incluyen inhibición de la unión a receptor, prevención de interacciones de proteínas, o afectando la expresión de co-receptores y componentes de unión (Kamei y col., Oncogene 1999,18:6776). Usando líneas celulares de control y líneas celulares que expresan 191P4D12(b) se identifican moduladores (inhibidores o potenciadores) de la función de 191P4D12(b). Por ejemplo, células PC3 y PC3-191P4D12(b) se incuban en presencia y ausencia de mAb o moduladores de moléculas pequeñas. Cuando el mAb y las moléculas pequeñas modulan, por ejemplo, inhiben, el transporte y la función tumorigénica de 191P4D12(b), se usan para fines preventivos, de pronóstico, diagnóstico y/o terapéutico.
TABLAS:
TABLA I: Tejidos que expresan 191P4D12(b):
a. Tejidos malignos Próstata Vejiga Riñón Colon Pulmón Páncreas Ovario Mama Útero Cuello uterino
TABLA II: Abreviaturas de aminoácido
UNA SOLA LETRA
TRES LETRAS NOMBRE COMPLETO
F
Phe fenilalanina
L
Leu leucina
S
Ser serina
Y
Tyr tirosina
C
Cys cisteína
W
Trp triptófano
P
Pro prolina
H
His histidina
Q
Gln glutamina
R
Arg arginina
I
Ile isoleucina
M
Met metionina
T
Thr treonina
N
Asn asparagina
K
Lys lisina
V
Val valina
A
Ala alanina
D
Asp ácido aspártico
E
Glu ácido glutámico
G
Gly glicina
TABLA III: Matriz de sustitución de aminoácidos
Adaptada de la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 del software de GCG 9.0 (matriz de sustitución de bloques). Cuanto mayor sea el valor, más probable es que una sustitución se encuentre en 10 proteínas naturales relacionadas (véase la URL de la malla mundial ikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)
TABLA IV: Motivos/Supermotivos de clase I/II de HLA TABLA IV (A): Supermotivos/Motivos de clase I de HLA
SUPERMOTIVO
POSICIÓN POSICIÓN POSICIÓN
2 (Anclaje primario)
3 (Anclaje primario) Extremo C (Anclaje primario)
A1
TILVMS FWY
A2
LIVMATQ IVMATL
A3
VSMATLI RK
A24
YFINIVLMT FIYWLM
B7
P VILFMWYA
B27
RHK FYLWMIVA
B44
ED FWYLIMVA
B58
ATS FWYLIVMA
B62
QLIVMP FWYMIVLA
MOTIVOS
A1
TSM Y
A1
DEAS Y
A2.1
LMVQIAT VLIMAT
A3
LMVISATFCGD KYRHFA
(continuación)
A11
VTMLISAGNCDF KRYH
A24
YFWM FLIW
A*3101
MVTALIS RK
A*3301
MVALFIST RK
A*6801
AVTMSLI RK
B*0702
P LMFWYAIV
B*3501
P LMFWYIVA
B51
P LIVFWYAM
B*5301
P IMFWYALV
B*5401
P ATIVLMFWY
Se prefieren los residuos en negrita, los residuos en cursiva son menos preferidos: Un péptido se considera que lleva motivos si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primario para un motivo o supermotivo como se especifica en la tabla anterior.
TABLA IV (B): Supermotivo de clase II de HLA
1
6 9
W, F, Y, V, I, L
A, V, I, L, P, C, S, T A, V, I, L, C, S, T, M, Y
5
TABLA IV (C): Motivos de clase II de HLA
MOTIVOS
1º anclaje 1 2 3 4 5 1º anclaje 6 7 8 9
DR4
preferida FMILIVW M T I VSTCPALIM MH MH
perjudicial
W R WDE
DR1
preferida MFLIVWY PAMQ VMATSPLIC M AVM
perjudicial
C CH FD CWD GDE D
DR7
preferida MFLIVWY M W A IVMSACTPL M IV
perjudicial
C G GRD N G
DR3
MOTIVOS 1º anclaje 1 2 3 1º anclaje 4 5 1º anclaje 6
Motivo a preferido
LIVMFY D
Motivo b preferido
LIVMFAY DNQEST KRH
Supermotivo DR
MFLIVWY VMSTACPLI
Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o “tolerados”
SUPER-MOTIVOS A1 A2 A3 A24 B7 B27 B44
POSICIÓN: preferida perjudicial preferida. perjudicial 1 DE (3/5); P (5/5) FWY (5/5) LIVM (3/5) DE (3/5); P(5/5): G(4/5); A(3/5); QN(3/5) TABLA IV (D): Supermotivos de clase I de HLA 2 3 4 5 6 1º Anclaje TILVMS 1º Anclaje LIVMATQ 1º Anclaje VSMATLI YFW (4/5) YFW (3/5) DE (4/5) 1º Anclaje YFWIVLMT 1º Anclaje P FWY (4/5) DE (3/5) G (4/5) 1º Anclaje RHK 1 º Anclaje ED 7 YFW (4/5) QN (4/5) 8 P (4/5) FWY (3/5) DE (4/5) Extremo C 1º Anclaje FWY 1º Anclaje LIVMAT 1º Anclaje RK 1º Anclaje YFWIVLMT 1ºAnclaje VILFMWYA 1º Anclaje FYLWMIVA 1º Anclaje FWYLIMVA
82 83 84
B58
1º Anclaje ATS (continuación) 1 º Anclaje FWYLIVMA
B62
1º Anclaje QL/VMP 1º Anclaje FWYMIVLA
Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o “tolerados”
POSICIÓN A1 9-mero preferida perjudicial A1 9-mero preferida perjudicial A A1 10-mero preferida perjudicial GP A1 10-mero preferida perjudicial RHK A2.1 9-mero preferida perjudicial DEP A2.1 10-mero preferida perjudicial DEP A3 preferida
1 GFYW DE GRHK YFW YFW YFW AYFW RHK 2 1º Anclaje STM ASTCLIVM RHKDEPYFW 1º Anclaje STM STCLIVM RHKDEPYFW 1º Anclaje LMIVQAT 1º Anclaje LMIVQAT 1º Anclaje LMVISATFCGD TABLA IV (E): Motivos de clase I de HLA 3 4 5 6 DEA YFW P RHKLIVMP A G A 1º Anclaje DEAS GSTC ASTC DE PQN RHK DEAQN A YFWQN RHKGLIVM DE RHK QNA 1º Anclaje DEAS A YFW P G YFW STC YFW DERKH RKH LVIM G G DE RKHA P YFW PRHKYF W A YFW 7 DEQN LIVM PG PASTC RHKYFW PG A DERKH RKH 8 YFW DE GP GDE RHK G PRHK P FYWL VIM DERKH P 9 o extremo C 1º Anclaje Y 1º Anclaje Y P A YFW QN 1º Anclaje VLIMAT RKH 1º Anclaje KYRHFA Extremo C 1º Anclaje Y 1º Anclaje Y 1º Anclaje VLIMAT
(continuación)
POSICIÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C
o extremo C
perjudicial
DEP DE
A11
preferida A 1º Anclaje YFW YFW A YFW YFW P 1º Anclaje
VTLMISAGNCD F
KRYH
perjudicial
DEP A G
A24
preferida YFWRHK - 1º Anclaje STC YFW YFW 1º Anclaje
9-mero
YFWM FLIW
perjudicial DEG
DE G QNP DERHK G AQN
A24
preferida 1º Anclaje P YFWP P 1º Anclaje
10-mero
YFWM FLIW
perjudicial
GDE QN RHK DE A QN DEA
A3101
preferida RHK 1º Anclaje YFW P YFW YFW AP 1º Anclaje
MVTALIS
RK
perjudicial DEP
DE ADE DE DE DE
A3301
preferida 1º Anclaje YFW AYFW 1º Anclaje
MVALFIST
RK
perjudicial GP
DE
A6801
preferida YFWSTC 1º Anclaje YFWLIV M YFW P 1º Anclaje
AVTMSLI
RK
perjudicial GP
DEG RHK A
B0702
preferida RHKFWY 1º Anclaje RHK RHK RHK RHK PA 1º Anclaje
85
(continuación)
POSICIÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C
o extremo C
P
LMFWYAI
perjudicial DEQNP
DEP DE DE GDE QN DE V
B3501
preferida FWYLIVM 1º Anclaje FWY FWY 1º Anclaje
P
LMFWYIV A
A1
preferida GFYW 1º Anclaje DEA YFW P DEQN YFW 1º Anclaje
9-mero
STM Y
perjudicial
DE RHKLIVMP A G A
A1
preferida GRHK ASTCLIVM 1º Anclaje GSTC ASTC LIVM DE 1º Anclaje
9-mero
DEAS Y
perjudicial A
RHKDEPYFW DE PQN RHK PG GP
perjudicial
AGP G G
B51
preferida LIVMFWY 1º Anclaje P FWY STC FWY G FWY 1º Anclaje
LIVFWYA M
perjudicial AGPDER
HKSTC DE G DEQN GDE
B5301
preferida LIVMFWY 1º Anclaje P FWY STC FWY LIVMFWY FWY 1º Anclaje
IMFWYAL V
perjudicial
AGPQN G RHKQN DE
B5401
preferida FWY 1º Anclaje P FWYLIVM LIVM ALIVM FWYA P 1º Anclaje
ATIVLMF
WY
perjudicial
GPQNDE GDESTC RHKDE DE QNDGE DE
86 87
TABLA IV (F):
Resumen de supertipos de HLA
Frecuencias fenotípicas globales de supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas
Especificidad Frecuencia fenotípica
Posición de supertipo
2 Extremo C Caucásico Negro norteamericano Japonés Chino Hispano Promedio
B7
P AILMVFWY 43,2 55,1 57,1 43,0 49,3. 49,5
A3
AILMVST RK 37,5 42,1 45,8 52,7 43,1 44,2
A2
AILMVT AILMVT 45,8 39,0 42,4 45,9 43,0 42,2
A24
YF (WIVLMT) FI (YWLM) 23,9 38,9 58,6 40,1 38,3 40,0
B44
E (D) FWYLIMVA 43,0 21,2 42,9 39,1 39,0 37,0
A1
TI(LVMS) FWY 47,1 16,1 21,8 14,7 26,3 25,2
B27
RHK FIL(WMI) 28,4 26,1 13,3 13,9 35,3 23,4
B62
QL(IVMP) FWY (MIV) 12,6 4,8 36,5 25,4 11,1 18,1
B58
ATS FWY(LIV) 10,0 25,1 1,6 9,0 5,9 10,3
TABLA IV (G):
Cobertura de la población calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA
Supertipos de HLA Frecuencia fenotípica
A2, A3 y B7 A2, A3, B7, A24, B44 y A1 A2, A3, B7, A24, B44, A1, B27, B62 y B58
Caucásico Negro norteamericano Japonés Chino Hispano Promedio
83,0
86,1 87,5 88,4 86,3 86,2
99,5
98,1 100,0 99,5 99,4 99,3
99,9
99,6 100,0 99,8 99,9 99,8
Los motivos indican los residuos que definen las especificidades de supertipo. Los motivos incorporan residuos determinados basándose en datos publicados para ser reconocidos por múltiples alelos dentro del supertipo. Los residuos dentro de los paréntesis son residuos adicionales también predichos para ser tolerados por múltiples alelos dentro del supertipo.
Tabla V: Motivos que se producen frecuentemente
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
zf-C2H2
34% Dedo de cinc, tipo C2H2 la proteína de unión a ácido nucleico funciona de factor de transcripción, localización nuclear probable
citocromo_b_N
68% Citocromo b (extremo N)/b6/petB oxidasa unida a membrana, generan superóxido
Ig
19% Dominio de inmunoglobulina los dominios tienen cien aminoácidos de longitud e incluyen un enlace disulfuro intra-dominio conservado
WD40
18% Dominio WD, repetición de G-beta repeticiones en tándem de aproximadamente 40 residuos, conteniendo cada una un motivo de Trp-Asp. Función en transducción de señales e interacción de proteínas
PDZ
23% Dominio PDZ puede funcionar en la elección como diana de moléculas de señalización para sitios submembranosos
LRR
28% Repetición rica en leucina motivos de secuencia cortos que participan en las interacciones proteína-proteína
(continuación) (continuación)
Tabla V: Motivos que se producen frecuentemente
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
Pcinasa
23% Dominio de proteína cinasa núcleo catalítico conservado común a tanto serina/treonina como a proteínas tirosinas cinasas que contienen un sitio de unión a ATP y un sitio catalítico
PH
16% Dominio PH homología de pleckstrin que participa en la señalización intracelular o como constituyentes del citoesqueleto
EGF
34% Dominio similar a EGF 30-40 aminoácidos de longitud encontrados en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas secretadas
Rvt
49% Transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN)
Ank
25% Repetición Ank proteína citoplásmica, asocia proteínas de la membrana integral al citoesqueleto
Oxidored_q1
32% NADH-Ubiquinona/plastoquinona (complejo I), diversas cadenas asociada a membrana. Participa en la translocalización de protones a través de la membrana
Efhand
24% Mano EF dominio de unión a calcio, consiste en un bucle de 12 residuos flanqueado en ambos lados por un dominio de hélice alfa de 12 residuos
Rvp
79% Aspartilproteasa retrovírica Aspartilproteasas o proteasas ácidas, centradas en un residuo de aspartilo catalítico
Colágeno
42% Repetición de triple hélice de colágeno (20 copias) proteínas estructurales extracelulares que participan en la formación de tejido conjuntivo. La secuencia consiste en G-X-Y y las cadenas de polipéptidos forman una triple hélice.
Fn3
20% Dominio de tipo III de fibronectina Localizado en la región de unión a ligando extracelular de receptores y tiene aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de longitud con dos pares de cisteínas que participan en enlaces disulfuro
Tabla V: Motivos que se producen frecuentemente
Nombre
% de identidad promedio Descripción Posible función
7tm_1
19% receptor de 7 transmembrana (familia rhodopsin) siete regiones transmembrana hidrófobas, con el extremo N localizado extracelularmente mientras que el extremo C es citoplásmico. Señal a través de proteínas G
Tabla VI: Motivos y modificaciones postraduccionales de 191P4D12(b)
Tabla VI: Modificaciones postraduccionales de 191P4D12(b)
Sitio de N-glucosilación 281 - 284 NWTR (SEC ID Nº: 61) 430 - 433 NSSC (SEC ID Nº: 62) 489 - 492 NGTL (SEC ID Nº: 63)
Sitio de sulfatación de tirosina 118 - 132 VQADEGEYECRVSTF (SEC ID Nº: 64)
Sitio de fosforilación de proteína cinasa C 26 - 28 TGR 192 - 194 SSR 195 - 197 SFK 249 - 251 SVR 322 - 324 SSR 339 - 341 SGK 383 - 385 TQK 397 - 399 SIR 426 - 428 SLK 450 - 452 TVR 465 - 467 SGR 491 - 493 TLR
Sitio de fosforilación de caseína cinasa II 283-286 TRLD (SEC ID Nº: 65) 322-325 SSRD (SEC ID Nº: 66) 410-413 SQPE (SEC ID Nº: 67) 426-429 SLKD (SEC ID Nº: 68) 450-453 TVRE (SEC ID Nº: 69) 456-459 TQTE (SEC ID Nº: 70)
Sitio de N-miristoilación 135-140 GSFQAR (SEC ID Nº: 71) 162-167 GQGLTL (SEC ID Nº: 72) 164-169 GLTLAA (SEC ID Nº: 73) 189-194 GTTSSR (SEC ID Nº: 74) 218-223 GQPLTC (SEC ID Nº: 75) 311-316 GIYVCH (SEC ID Nº: 76) 354-359 GVIAAL (SEC ID Nº: 77) 464-469 GSGRAE (SEC ID Nº: 78) 477-482 GIKQAM (SEC ID Nº: 79) 490-495 GTLRAK (SEC ID Nº: 80) 500-505 GIYING (SEC ID Nº: 81)
Secuencia de unión a células RGD 55 - 57 RGD
Tabla VII:
Péptidos de búsqueda 191P4D12(b)v.1 aa 1-510
9-meros, 10-meros y 15-meros (SEC ID Nº: 82)
v.2 aa 1-510
9-meros 45-61 GQDAKLPCLYRGDSGEQ (SEC ID Nº: 83) 10-meros 44-62 LGQDAKLPCLYRGDSGEQV (SEC ID Nº: 84) 15-meros 39-67 VVTWLGQDAKLPCLYRGDSGEQVGQVAW (SEC ID Nº: 85)
v.7 ORF: 264..1721 marco +3
9-meros 403-418 SHHTDPRSQSEEPEGR (SEC ID Nº: 86) 10-meros 402-419 HSHHTDPRSQSEEPEGRS (SEC ID Nº: 87) 15-meros 397-424 SIRRLHSHHTDPRSQSEEPEGRSYSTLT (SEC ID Nº: 88)
V.9: aa 1-137; 9-meros, 10-meros, 15-meros (SEC ID Nº: 89) v.10 Variante de SNP
9-meros 27-43 GRCPAGELGTSDVVTVV (SEC ID Nº: 90) 10-meros 26-44 TGRCPAGELGTSDVVTVVL (SEC ID Nº: 91) 15-meros 21-49 LLASFTGRCPAGELGTSDVVTVVLGQDAK (SEC ID Nº: 92)
v.11 Variante de SNP
9-meros 138-154 QARLRLRVMVPPLPSLN (SEC ID Nº: 93) 10-meros 137-155 FQARLRLRVMVPPLPSLNP (SEC ID Nº: 94) 15-meros 132-160 FPAGSFQARLRLRVMVPPLPSLNPGPALE (SEC ID Nº: 95)
Variante de SNP
9-meros 435-451 VMSEEPEGCSYSTLTTV (SEC ID Nº: 96) 10-meros 434-452 SVMSEEPEGCSYSTLTTVRE (SEC ID Nº: 97) 15-meros 429-457 DNSSCSVMSEEPEGCSYSTLTTVREIETQ (SEC ID Nº: 98)
v.13 Inserción de un aa en 333-4
9-meros 426-442 SQVTVDVLADPQEDSGK (SEC ID Nº: 99) 10-meros 425-443 DSQVTVDVLADPQEDSGKQ (SEC ID Nº: 100) 15-meros 420-448 EFSSRDSQVTVDVLADPQEDSGKQVDLVS (SEC ID Nº: 101)
191P4D12(b)v.14: aa 56-72; 9-meros
GSSNPPASASLVAGTLS (SEC ID Nº: 102)
191P4D12(b)v.14: aa 55-73; 10-meros
LGSSNPPASASLVAGTLSV (SEC ID Nº: 103)
191P4D12(b) v.14: aa 50-78; 15-meros
AGLELLGSSNPPASASLVAGTLSVHHCAC (SEC ID Nº: 104)
Tablas VIII-XXI:
Tabla VIII-V1-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla VIII-V2-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Tabla VIII-V9-HLA-A1-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla VIII-V9-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla VIII-V12-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla VIII-V13-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla VIII-V14-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuenci a Punt.
Tabla VIII-V10-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla VIII-V10-HLA-A1-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla VIII-V12-HLA-A1-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla VIII-V14-HLA-A1-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V1-HLA-A1-10-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V1-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V1-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla IX-V1-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V9-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla IX-V2-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V2-HLA-A1-10-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V9-HLA-A1-10-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V9-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V10-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla IX-V11-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla IX-V12-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla IX-V9-HLA-A1-10-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V10-HLA-A1-10-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inici
Subsecuencia
Punt o
Tabla IX-V12-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V13-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla IX-V114-HLA-A1-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V1-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla IX-V14-HLA-A1-10-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V1-HLA-A201-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V1-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V7-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla X-V9-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla X-V1-HLA-A201-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V7-HLA-A201-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V9-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V9-HLA-A201-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V9-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla X-V10-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla X-V11-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla X-V11-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla X-V12-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V1-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla X-V13-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V1-HLA-A20110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V1-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V1-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V2-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V7-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V7-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V9-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V9-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V9-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V12-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V13-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V10-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V14-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XI-V10-HLA-A20110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V11-HLA-A20110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V12-HLA-A20110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XI-V14-HLA-A20110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XII-V1-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XII-V7-HLA-A3-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho Inicio Subsecuencia Punt
Tabla XII-V9-HLA-A3-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho Inicio Subsecuencia Punt
Tabla XII-V9-HLA-A310-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XII-V9-HLA-A201-9-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XIII-V2-HLA-A3-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XIII-V7-HLA-A3-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XIII-V9-HLA-A3-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XIII-V9-HLA-A3-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XIII-V9-HLA-A3-10-meros191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XIV-V1-A11019-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XIV-V7-A11019-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XIV-V9-A11019-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt.
Tabla XV-V1-A110110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XV-V7-A110110-meros-191P4D12B
Tabla XV-V9-A110110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XV-V11-A110110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Tabla XV-V13-A110110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XV-V14-A110110-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio nueve
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XVI-V1-A24-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XVI-V2-A24-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº:5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XVIII-V1-B79-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Tabla XVIII-V2- HLA-B7-9-meros191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XIX-V13-HLA-B710-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Tabla XX-V11-HLA-B35019-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho
Inicio
Subsecuencia Punt
Tabla XXI-V9-HLA-B350110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve
Inicio
Subsecuencia Punt Tabla XXI-V14-HLA-B350110-meros-191P4D12B
Tablas XXII-XLIX:
Tabla XXII-V1-HLA-A19-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXII-V7-HLA-A19-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXII-V2-HLA-A19-meros-191P4D12B
Tabla XXII-V11-HLA-A19-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXII-V12-HLA-A19-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXII-V13-HLA-A19-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXIII-V9-HLA-A02019-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXIII-V12-HLA-A02019-meros-191P4D12B
Tabla XXIII-V7-HLA-A02019-meros-191P4D12B
Tabla XXV-V7-HLA-A03 -9-meros-191P4D12B
Tabla XXVI-V2-HLA-A269-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXVII-V1-HLA-B0702-9meros-191P4D12B
Tabla XXVII-V2-HLA-B07029-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXVII-V7-HLA-B07029-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt Tabla XXVII-V13-HLA-B07029-meros-191P4D12B
Tabla XXVIII-V7-HLA-B089-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXVIII-V2-HLA-B089-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de
Tabla XXVIII-V11-HLA-B089-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXVIII-V14-HLA-B089-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Tabla XXIX-V2-HLA-B15109-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXIX-V9-HLA-B15109-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Tabla XXIX-V14-HLA-B1510
9-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada
Tabla XXIX-V11-HLA-B15109-meros-191P4D12B
Tabla XXX-V7-HLA-B27059-meros-191P4D12B
Tabla XXX-V13-HLA-B27059-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXXI-V9-HLA-B27099-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXXI-V1-HLA-B27099-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXXI-V7-HLA-B27099-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXXI-V13-HLA-B2709 -9-meros-191P4D12B Tabla XXXII-V2-HLA-B4402-9meros-191P4D12B
Tabla XXXII-V10-HLA-B4402-9meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXXII-V12-HLA-B4402-9meros-191P4D12B Tabla XXXIII-V1-HLA-B51019-meros-191P4D12B
Tabla XXXIII-V7-HLA-B51019-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 9 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más ocho.
Pos.
123456789 Punt
Tabla XXXIV-V2-HLA-A110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIV-V7-HLA-A110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIV-V9-HLA-A110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIV-V15-HLA-A1- 10-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIV-V11-HLA-A1- 10-meros-191P4D12B
Tabla XXXV-V1-HLA-A020110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXV-V7-HLA-A020110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXV-V12-HLA-A020110-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del
Tabla XXXVI-V1-HLA-A020310-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Tabla XXXVI-V7-HLA-A020310-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XXXVI-V12-HLA-A020310-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XXXVI-V13-HLA-A0203
Tabla XXXVI-V9-HLA-A0203
10-meros-191P4D12B
10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la
Tabla XXXVII-V10-HLA-A0310-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve. Pos. 1234567890 Punt Tabla XXXVII-V11-HLA-A0310-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve. Pos. 1234567890 Punt
Tabla XXXVII-V12-HLA-A0310-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve. Pos. 1234567890 Punt
Tabla XXXVII-V13-HLA-A0310-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de
Tabla XXXVIII-V1-HLA-A2610-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXVIII-V1-HLA-A26- 10-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXVIII-V10-HLA-A2610-meros-191P4D12B
Tabla XXXVIII-V1-HLA-A2610-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXVIII-V11-HLA-A2610-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXVIII-V12-HLA-A2610-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25; se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXVIII-V13-HLA-A2610-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIX-V1-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIX-V2-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIX-V2-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXXIX-V10-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XXIV-V11-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XXIV-V12-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados Tabla XXIV-V13-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XXIV-V14-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados Tabla XLI-V1-HLA-B1510- 10-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XLI-V2-HLA-B1510- 10-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XXXIX-V11-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XL-V1-HLA-B0810-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados Tabla XXIV-V7-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XLI-V7-HLA-B1510- 10-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XXXIX-V12-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos. 1234567890 Punt
Tabla XXIV-V9-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados Tabla XXIV-V10-HLA-A02039-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XLI-V9-HLA-B1510- 10-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados Tabla XLI-V10-HLA-B151010-meros-191P4D12B Pos. 1234567890 Punt No se encontraron resultados
Tabla XXXIX-V13-HLA-B0702 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27 se especifica cada posición de inicio, la longitud del.
Tabla XLI-V10-HLA-B151010-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V9-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V7-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLI-V11-HLA-B151010-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V10-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V9-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLI-V12-HLA-B151010-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V11-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V10-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLI-V13-HLA-B151010-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V12-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V11-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLI-V14-HLA-B151010-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V13-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V12-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V1-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V14-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V130-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V2-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V1-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V14-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLII-V7-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V2-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIV-V1-HLA-B4402 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XLII-V9-HLA-B270510-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIII-V7-HLA-270910-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLIV-V1-HLA-B4402 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XLIV-V7-HLA-B4402 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve. Pos. 1234567890 Punt Tabla XLIV-V9-HLA-B4402 10-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve. Pos. 1234567890 Punt
Tabla XLIV-V14-HLA-B4402 10-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 10 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más nueve.
Pos.
1234567890 Punt
Tabla XLV-V1-HLA-B510110-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLV-V2-HLA-B510110-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLV-V7-HLA-B510110-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLV-V9-HLA-B510110-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLV-V10-HLA-B510110-meros-191P4D12B
Pos.
1234567890 Punt
No se encontraron resultados
Tabla XLV-V11-HLA-B510110-meros-191P4D12B
Tabla XLVI-V2-HLA-DRB1-0101 15-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Tabla XLVI-V9-HLA-DRB1-0101 15-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVI-V12-HLA-DRB1-0101 15-meros-191P4D12B
Tabla XLVI-V14-HLA-DRB1-0101 15-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 29 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVII-V9-HLA-DRB1-0301 15-meros-191P4D12B Tabla XLVIII-V1-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Tabla XLVIII-V1-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V2-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V2-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V7-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V9-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V9HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V9-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V11-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V12-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V10-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V11-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V14-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V1-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLVIII-V13-HLA-DRB1-0401 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 27 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V1-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V1-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V1-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 3 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V2-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V7-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 15 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V9-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V9-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 19 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V12-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 25 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V13-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V10-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 21 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce. Pos. 123456789012345 Punt Tabla XLIX-V11-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 23 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce. Pos. 123456789012345 Punt
Tabla XLIX-V14-HLA-DRB1-1101 15-meros-191P4D12B
Cada péptido es una porción de SEC ID Nº: 5 se especifica cada posición de inicio, la longitud del péptido es 15 aminoácidos y la posición de fin para cada péptido es la posición de inicio más catorce.
Pos.
123456789012345 Punt

Tabla L: Propiedades de 191P4D12(b)
191P4D12(b)B v.1
Programa URL Resultado
bioinformático
ORF
ORF finder 264-1796
Longitud
de 510 aa
proteína
Región
TM Pred http://www.ch.embnet.org/ 2 TM, aa 14-30, 351-370
transmembrana
HMMTop
http://www.enzim.hu/hmmtop/ 1 TM, aa 347-371
Sosui
http://www.genome.ad.jp/SOSui/ 2 TM, aa 14-31, 347-369
TMHMM
http://www.cbs.ctu.dk/services/TMHMM 1 TM, aa 350-372
Péptido señal
Signal P http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/ sí, escindió aa 31-32
pl
pl/MW tool http://www.expasy.ch/tools/ pl 5,27
Peso molecular
pl/MW tool http://www.expasy.ch/tools/ 55,4 kDa
Localización
PSORT http://psort.nibb.ac.jp/ 46% de membrana plasmática
PSORT II
http://psort.nibb.ac.jp/ 39,1% citoplásmico, 21% nuclear
Motivos
Pfam http://www.sanger.ac.uk/Pfam/ Dominio de inmunoglobulina
Prints
http://www.biochem.ucl.ac.uk/ Firma de cadherina
Blocks
hftp://www.blocks.fhcrc.org/ Dominio de Ig, glucoproteína D del
virus del herpes
v.6
Programa URL Resultado
bioinformático
ORF
ORF finder
Longitud
de 295 aa
proteína
Región
TM Pred http:/lwww.ch.embnet.org/ 1 TM, aa 135-156
transmembrana
HMMTop
http://www.enzim.hu/hmmtop/ 1 TM, aa 132-156
Sosui
http://www.genome.ad.jp/SOSui/ 1 TM, aa 132-154
TMHMM
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 1 TM, aa 135-157
Péptido señal
Signal P http://www.cbs.dtu.dk/services/SeñalP/ ninguno
pl
pl/MW tool http://www.expasy.ch/tools/ pl 5,28
Peso molecular
pl/MW tool http://www.expasy.ch/tools/ 32,6 kDa
Localización
PSORT hftp://psort.nibb.ac.jp/ 70% de membrana plasmática
20% de retículo endoplásmico
PSORT II
http://psort.nibb.ac.jp/ 39% citoplásmico, 21% nuclear
Motivos
Pfam http://www.sanger.ac.uk/Pfam/ Dominio de inmunoglobulina
Prints
http://www.biochem.ucl.ac.uk/ ninguno
Blocks
http://www.blocks.fhcrc.org/ glucoproteína D del virus del
herpes
Tabla LI: Límites de exones del transcrito 191P4D12(b) v.1
Número de exón
Inicio Fin Longitud
1
2 342 341
2
343 702 360
3
703 993 291
4
994 1114 121
5
1115 1263 149
6
1264 1420 157
7
1421 1496 76
8
1497 1571 75
9
1572 3459 1888
Tabla LII(a). Secuencia de nucleótidos de la variante de transcrito 191P4D12(b) v.6 (SEC ID Nº: 105)
Tabla LIII(a). Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 106) y 191P4D12(b)
v.6 (SEC ID Nº: 107).
Tabla LIV(a). Secuencias de péptidos de la proteína codificada por 191P4D12(b) v.6 (SEC ID Nº: 108)
Tabla LV(a). Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 109) y 191P4D12(b) v.6 (SEC ID Nº: 110)
Tabla LII(b). Secuencia de nucleótidos de la variante de transcrito 191P4D12(b) v.7 (SEC ID Nº: 111)
Tabla LIII(b). Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 112) y 191P4D12(b)
v.7 (SEC ID Nº: 113)
Tabla LIV(b). Secuencias de péptidos de la proteína codificada por 191P4D12(b) v.7 (SEC ID Nº: 114)
Tabla LV (b). Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 115) y 191P4D12(b) v.7 (SEC ID Nº: 116)
Tabla LII(c). Secuencia de nucleótidos de la variante de transcrito 191P4D12(b) v.8 (SEC ID Nº: 117)
Tabla LIII(c). Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 118) y 191P4D12(b)
v.8 (SEC ID Nº: 119)
Tabla LIV(c). Secuencias de péptidos de la proteína codificada por 191P4D12(b) v.8 (SEC ID Nº: 120)
Tabla LV(c). Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 121) y 191P4D12(b) v.8 (SEC ID Nº: 122)
Tabla LII(d). Secuencia de nucleótidos de la variante de transcrito 191P4D12(b) v.9 (SEC ID Nº: 123)
Tabla LIII(d). Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de 191P4D12(b) v.1 (SEC ID Nº: 124) y 191P4D12(b)
v.9 (SEC ID Nº: 125)
Tabla LIV(d). Secuencias de péptidos de la proteína codificada por 191P4D12(b) v.9 (SEC ID Nº: 126)
Tabla LV(d). Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 191P4D12(b) v.1 y 191P4D12(b) v.9 (APAREAMIENTO NO SIGNIFICATIVO)
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Agensys, Inc. Raitano, Arthur B. Challita-Eid, Pia M. Jakobovits, Aya Faris, Mary Ge, Wangmao
<120> Ácidos nucleicos y proteínas correspondientes tituladas 191P412(B) útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
<130> 51158-20082.40
<140> Sin asignar
<141>
<150> US60/404.306
<151>
<150> US60/423.290
<151>
<160> 130
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1 <211>223
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210>2
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 2
<210>3
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3 <210>4
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264) ... (1796)
<400> 4
<210>5
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5 <210>6
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 6
<210>7
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210>8
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 8
<210>9
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 10
<210> 11
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11 <210> 12
<211> 3344
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (789)...(1676)
<400> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1721)
<400> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 3401
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 16
<210> 17
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (708)...(1121)
<400> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 20
<210> 21
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21 <210> 22
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 22
<210> 23
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)...(1796)
<400> 24
<210> 25
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25 <210> 26
<211> 3467
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (264)... (1799)
<400> 26
<210> 27
<211> 511
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (708)...(1121)
<400> 28
<210> 29
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210>31
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33 <211>485
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 511
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41 <210> 42
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> Tetanus toxoid
<400> 44
<210> 45
<211> 21
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<400> 45 <210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> Streptococcus
<400> 46
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3
<223> Xaa = ciclohexilalanina, fenilalanina o tirosina.
<221> VARIANTE
<222> 1, 13
<223>
Xaa = D-alanina o L-alanina
<223>
Epítopo de unión a Pan DR
<400> 47
<210> 48
<211> 14
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 48
<210> 49
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 49
<210> 50
<211> 12
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 50
<210>51
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 51
<210> 52
<211> 10
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 52
<210> 53
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 53
<210> 54
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 54
<210> 55
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 55 <210> 56
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 56
<210> 57
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 57
<210> 58
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 58
<210> 59
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 59
<210> 60
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Marcador epitópico
<400> 60
<210>61 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61 <210> 62 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
<210> 63 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
<210> 65 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
<210> 66 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 67 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
<210> 68 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68 <210> 69 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
<210> 70 <211>4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
<210>71 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
<210> 72 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
<210> 73 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
<210> 74 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74 <210> 75 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
<210> 76 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
<210> 77 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
<210> 78 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
<210> 79 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
<210> 80 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
<210>81 <211>6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
<210> 82
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82 <210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
<210> 84
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84 <210> 85
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
<210> 88
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
<210> 89
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89 <210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
<210>91
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
<210> 92
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93 <210> 94
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
<210> 95
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
<210> 98
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98 <210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
<210> 100
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
<210> 101
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103 <210> 104
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
<210> 105
<211> 3344
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 105 <210> 106 <211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 106 <210> 107
<211> 3344
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 107 <210> 108 <211>295
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
<210> 109 <211>295
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 111
<210> 112
<211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 112
<210> 113
<211> 3389
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114 <210> 115
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
<210> 117
<211> 3401
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 117 <210> 118 <211> 3464
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 118 <210> 119
<211> 3401
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 119 <210> 120 <211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120 <210> 121
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
<210> 122
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 123
<210> 124 <211>1669
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 124 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 125
<210> 126
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
<210> 127
<211> 510
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
<210> 130
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para diagnosticar cáncer que comprende:
    (a)
    poner en contacto una muestra de prueba de un sujeto humano del que se sospecha que tiene cáncer con una sonda que puede unirse específicamente a un ARNm de 191P4D12(b) que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, en el que la muestra de prueba es de un tejido seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario;
    (b)
    determinar el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba; y
    (c)
    comparar el nivel así determinado con el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en una muestra de tejido normal del mismo tipo de tejido que la muestra de prueba, por lo que la presencia de expresión de ARNm de 191P4D12(b) elevada en la muestra de prueba con respecto a la muestra de tejido normal indica la presencia o estado de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda está marcada con un marcador detectable.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el marcador detectable es un isótopo radiactivo que está seleccionado del grupo que consiste en 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212 Bi, 32P y 177Lu.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que determinar el nivel de expresión del ARNm en la muestra de prueba comprende
    producir ADNc a partir del ARNm por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc obtenido usando polinucleótidos 191P4D12(b) como cebadores de sentido directo y de sentido contrario, en el que los polinucleótidos 191P4D12(b) usados como cebadores de sentido directo y de sentido contrario son eficaces para amplificar un ADNc de 191P4D12(b); y detectar la presencia del ADNc de 191P4D12(b) amplificado.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, en el que la sonda es un cebador que puede unirse específicamente al ARNm o ADNc.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, en el que un aumento en la expresión de ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba con respecto a la muestra normal es una indicación de que la muestra muestra crecimiento celular desregulado.
  7. 7.
    Un procedimiento para determinar la susceptibilidad a desarrollar cáncer que comprende:
    (a)
    poner en contacto una muestra de prueba de un sujeto humano con una sonda que puede unirse específicamente a un ARNm de 191P4D12(b) que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, en el que la muestra de prueba es de un tejido seleccionado del grupo que consiste en riñón, cuello uterino y ovario; y
    (b)
    determinar el nivel de expresión del ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba, en el que la presencia de ARNm de 191P4D12(b) indica la susceptibilidad a cáncer y en el que el nivel de expresión de ARNm de 191P4D12(b) en la muestra de prueba guarda relación con el grado de susceptibilidad a cáncer del riñón, cuello uterino u ovario.
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