CN1412309A - 人支气管上皮细胞恶性转化差异表达基因的cDNA文库及与肺癌病变相关的克隆 - Google Patents

Abstract

本发明的名称为人支气管上皮细胞恶性转化差异表达基因的cDNA文库及与肺癌病变相关的克隆，涉及基因的cDNA文库及与病变相关的克隆。本发明的目的是利用辐射诱发的人支气管上皮细胞体外恶性转化实验模型，构建细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库，以及在此文库基础上筛选出可用于阐述人肺癌发生机理和临床肺癌诊断的cDNA克隆。人支气管上皮细胞恶性转化前的差减cDNA文库，由序列1至序列42组成；恶性转化早期的差减cDNA文库，由序列43至序列77组成；恶性转化时期的差减cDNA文库，由序列78至序列105组成。与病变相关的克隆是序列1、10、11、19、45和66。

Description

人支气管上皮细胞恶性转化差异表达基因的cDNA文库 及与肺癌病变相关的克隆

技术领域

本发明涉及基因的cDNA文库及与病变相关的克隆，特别是涉及人支气管上皮细胞恶性转化差异表达基因的cDNA文库及与人肺癌病变相关的克隆。

背景技术

肺癌是人类主要恶性肿瘤之一。大量的流行病学调查分析表明，肺癌发病除与吸烟有关外，居室内氡(电离辐射)的暴露也是人支气管肺癌的一个重要的环境诱因。早期、准确地进行诊断，是治愈和缓解肺癌的关键。虽然目前癌症诊断的技术手段越来越先进，但仍然建立在器官已发生器质性病变的基础上。细胞恶性转化实验模型的建立使人们能够从不同方面深入探讨细胞癌变的分子机理，开辟了一个从分子的角度进行癌变诊断的新领域。

BEP2D细胞系是经HPV18病毒永生化的人支气管上皮细胞，正常条件下可在体外长期传代，但在外界致癌因素的诱导下，可发生恶性转化，与体内的癌症发生极其相似，是进行人支气管上皮细胞癌变研究的好材料。BEP2D细胞癌变系已于2001年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号是CGMCC №0641。

发明内容

本发明的目的是利用辐射诱发的人支气管上皮细胞体外恶性转化实验模型，构建细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库，以及在此文库基础上筛选出可用于阐述人肺癌发生机理和临床肺癌诊断的cDNA克隆。

人支气管上皮细胞恶性转化前的差减cDNA文库，由序列1至序列42组成。

人支气管上皮细胞恶性转化早期的差减cDNA文库，由序列43至序列77组成。

人支气管上皮细胞恶性转化时期的差减cDNA文库，由序列78至序列105组成。

人支气管上皮细胞恶性转化前与肺癌病变相关的基因克隆为序列1、10、11和19。

人支气管上皮细胞恶性转化早期与肺癌病变相关的基因克隆为序列45和66。

本发明的研究均利用BEP2D细胞系的细胞进行。细胞用HLC-8无血清培养液于37℃，5％的CO₂培养箱中培养。该细胞经1.5Gyα粒子照射并连续培养至20代(R15Hp20)时开始出现细胞形态学的改变：细胞间失去接触抑制，呈密集复层生长，细胞骨架排列紊乱，细胞增大且出现异形性，核质比例增大，核仁异形突出，细胞器发达，体外生存能力增强，可在软琼脂中形成克隆等，但接种裸鼠不成瘤，说明细胞发生了形态学转化，是恶性转化早期。第35代(R15Hp35)的细胞接种裸鼠后成瘤，组织切片证实该瘤为人上皮来源的鳞癌，说明细胞已发生恶性转化。由此可见，BEP2D细胞体外恶性转化与体内癌症的发生一样，是一个渐进的多阶段的连续发展过程。以该细胞系为对象进行研究，对于深入了解肺癌发生、发展和恶性转化的分子机理具有重要价值。本发明文库对于保存永生化人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因以及寻找参与肺癌恶性转化、肺癌诊断及其它肿瘤相关基因具有重要意义。筛选出的克隆，使从分子的角度进行癌变的各期诊断成为可能，还可以用于肺癌发病机理研究及药物靶标的寻找。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1、文库的建立

本发明分别采用永生化BEP2D细胞、α粒子照射后20代(R15Hp20)和35代(R15Hp35)转化细胞进行差减文库的构建。

抑制消减杂交(SSH)的具体过程如下：

1、细胞总RNA提取

细胞常规培养达指数生长期2×10⁶时，采用Trizol(Gibicol)试剂分别提取永生化BEP2D细胞、照射后R15Hp20和R15Hp35细胞的总RNA。

2、抑制消减杂交(SSH)

具体操作按SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit和Clontech PCR-Select^TM cDNASubtractive Kit说明书进行。

3个文库的差减方案为：人支气管上皮细胞恶性转化前的cDNA差减文库是以BEP2D细胞的cDNA为被差减cDNA，R15Hp35细胞的cDNA为差减cDNA，进行差减杂交；人支气管上皮细胞恶性转化早期的cDNA差减文库是以R15Hp20细胞的cDNA为被差减cDNA，BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合在一起作为差减cDNA进行差减杂交；人支气管上皮细胞恶性转化时期的cDNA差减文库是以R15Hp35细胞的cDNA为被差减cDNA，BEP2D细胞的cDNA为差减cDNA进行差减杂交。

3、差减cDNA文库的构建(T/A载体克隆法)

从PCR扩增后的差减基因产物中分别取出3 l，与1μlpGEM-T载体连接，4℃过夜。从连接体系中取4μl转化受体大肠杆菌DH5α，接种于X-gal/IPTG Amp琼脂平板上培养，挑取白色克隆在5ml LB培养基中37℃振摇培养过夜，加15％甘油，液氮速冻，-70℃保种。

4、文库的鉴定和筛选(测序和PCR法)

测序鉴定：随机挑取文库的克隆，对插入的cDNA片段进行单向测序。测序结果与GenBank中序列比较，17.76％的克隆未查到同源序列，消减库中约86.37％的克隆代表着不同的基因，表明cDNA消减群体内部很少重复拷贝，不同基因间丰度的差异得到了很好的均衡。

PCR鉴定：用与接头有互补序列的内引物(巢式引物)1R和2R对质粒进行扩增，取5μl菌液于5ml MS液体培养基过夜培养后，再取1μl培养液直接作模板，然后依次加入10×PCR buffer 2.5μl，巢式引物1R和2R各1.0μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5 U)，50×dNTP 0.5μl，H₂O 18.5μl，于94℃ 30s、68℃ 30s、72℃ 1.5min，30个循环扩增，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。因为只有插入片段才连有接头，所以在电泳图谱上可见扩增产物者为阳性克隆，而无扩增产物者为空载质粒。

PCR筛选：以pGEM-T载体两端的一对通用引物T7/SP6扩增了1316个克隆的外源插入片段。经1.0％琼脂糖电泳鉴定，除其中13个克隆没有扩增出插入片段外，其余克隆都得到了特异扩增片段，外源插入片段的大小大部分介于500-1000bp之间，平均大小在750bp左右，与SSH设计预期的插入片段大小吻合。本发明3个cDNA文库共获得1303个cDNA克隆，其中永生化细胞恶性转化前416个、恶性转化早期(形态学变化但不成瘤)301个、恶性转化(癌变)时期586个，其中序列表中的105个克隆是已测序鉴定的部分。

实施例2、筛选出与肺癌发病相关和可用于肺癌诊断的克隆

以上述文库克隆中的基因为筛选的靶基因。

从临床上选择如下病理材料：15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经角质瘤和结肠癌各3例。

采用cDNA微矩阵(芯片)方法，具体过程如下：

1、芯片制作

将1303个克隆按如下方法制作成芯片，取2.5μl原菌液于5mlMS培养基过夜培养后，再取1μl培养液作模板于94℃30秒、55℃30秒、65℃30秒30个循环扩增，然后用QIAquick PCR Purification Kit纯化、真空抽干，最后以0.5ug/μl的浓度溶于12μl 50％的DMSO。在100℃变性5分钟后，移入96孔板并用点样仪点布于醛基化的玻璃片上。

2、探针制备

用Trizol(Gibicol公司)试剂，按其说明提取各病理组织标本的总RNA，用DNaseI消化去除gDNA后再抽取总RNA。取1μlg用SMART PCR cDNA Kit逆转录，然后将逆转录产物用LD PCR标记成探针(80μl水、10μl 10×Advantage 2 PCR buffer、2μl 50×dNTP(final conc：500uM dATP、dGTP、dTTP、dCTP 500uM)，1μl 25nM Cy5或Cy3标记的dCTP、4μl PCR Primer、2μltemple；循环参数：95℃5秒、65℃5秒、68℃6分钟，18个循环扩增)。接着用QIAquick PCR Purification Kit柱子纯化、真空抽干，然后以50ng/μl的浓度溶于水。取6μl在100℃变性5分钟后，迅速置冰上，然后加入10μl UniHyb^TM杂交液并混匀。

3、杂交及洗片

用移液器将探针迅速移于基因芯片上并用盖玻片轻轻盖住，置杂交盒内于62℃杂交8-10小时。杂交完毕，分别用1×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC和水各清洗两分钟。

4、图象扫描及分析

芯片置ScanArray 3000扫描仪内扫描，ImaGene软件分析和处理数据，以持家基因β-action的密度值作为参照进行校正。按如下公式计算基因的表达丰度：

以表达量高于对照组10倍以上为标准进行差异表达基因的筛选，结果是：以肺癌旁组织为对照组时，肺癌组织中高表达的26个，其它8种癌组织中高表达的12个；以肺癌组织为对照组时，肺癌旁组织中高表达的31个，其它8种癌组织中高表达的13个；以其它8种癌组织为对照组时，肺癌旁组织中高表达的63个，肺癌组织中高表达的87个。

筛选出的与肺癌发病相关和可用于肺癌诊断的克隆，细胞恶性转化前是序列1、10、11和19；细胞恶性转化早期是序列45和66。

序列表<160>105<210>1<211>540<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>1tccattaaat gctcccgccg ccatggagga cgcgggaatt ccatttcgag cggacgaccg    60ggcaggtacc atcttgactt ccccagttac attcacctgg tctggtctct gtaagcttag   120aagagtagaa tcactttatt ttttaaagac ttccggccag gcacggtggt tcacgcccgt   180aatgccagca ctttgggagg ccgaggcggg tggaccacct gaggtcagga gttcaagacc   240agcctggccg acatggcgaa accctgtctc tactaaaaaa aaatacaaaa agattagctg   300ggtgtggtgg tgtgtgccta taatcccagc tactcaggag gctgaggcag gagaattctt   360ttaacccaag aggcggaggt tgcagtgagt caagatcaca ccactgcact ccagcctggg   420cgacagaatg agactctgtc tcaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaagtacct cggccgcgac   480cacgctaatc actagtgaat tcgcggccgc ctgcaggtcc gaccatatgg gagagctccc   540<210>2<211>600<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>2atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attcgatttc gagcggccgc ccgggcaggt    60acatatgaga acacagatac tacattgccc aatgtcatca actagaacag caggaatctg   120tgtgctggga agcctgaccc cagaaccagt gctctcaaat ccccaccaat gtcatctagt   180ggttactgga gtccttattt tggagtcctg atatccatgc taccaattcc tatctgagtg   240gcaatgaaca tgtcacttcc ctttctgagt tggcttccac actcacagga tggagactga   300gataccattt tgctagggtg ttatcaagat tcagagatcc aaagttacac ttaaaagtca   360tttgagacat ttgtcttttt ttctacccca ccccctgcct aaaaggttct cctcttaccc   420aggatgaact caagatgtaa cattttaaaa tgagccttag gaaaaaacct gcaagggttg   480gtacctcggc cgcgaccacg ctaatcacta gtgaattccg cggacgcctg caggtcgacc   540atatggggag agctaccaac gcgttggaag cataacttga gtattctata gtgtcaccta   600<210>3<211>600<212>DNA<213>人属 人种(Homo sapiens)<400>3atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attcgattag cgtggtcgcg gccgaggtac    60tcatttttta ccttgtaggg agggtgggca gtggggttac ctgaccttat ttgagggtat   120gggctttctt tttttatttc atcacttgtt atctcaaaga gactcggagc cagtgatcct   180tttatcctgc tacagtcttt agggagctaa aaaaaaaaaa aaaaaagcag gggctgccaa   240aactcttgat ttcatatttc cttctctaaa tatatatgta tcctgttttt ttggataaaa   300ttttaccaag aatccaaaaa aaaaaaaacc ctagaattta atcaacaaga tcagtctaca   360ggtcacagtg gatttctttt caaactgaca atgtttaggt tttaagcaaa taaagttcca   420gttaatgtga aactcagtca caaagagttg agatttttcc tttatgaaat agaattgaca   480ttcttttatg ctataaatgt gcattcaggt cccattaacc atgctctgct tttatttggg   540gatagaacat tttctttttc atatcccaac cttcccactt cttcatagaa atgtgataag   600<210>4<211>660<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>4atgctcccgg ccgcctggcg gcccgcggga attcgatttc gagcggccgc ccgggcaggt    60actaattgat cctttgttgc tttttatttt aaatagtcaa ctttttactc ctgctatgaa   120ttcacacgta taaatttcag gttgactaga gaggtaacta gagaaaagga agccatgaaa   180taacttaaag atggccgagg tgggtggatc atgaggtcag gagttcgaga ccatcctggc   240taacacggtg aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaaa attagccagg cgtggtggca   300cacacctgta gtcccaaagt gctaggaata caggcgtaag ccacctcacc cagccaggtg   360aattttcaaa gccaacttaa tcccaataaa atattttgca agttagagtt tttaattttg   420gaagctactg ttttaaatat aaaatgagat gagatgttgg cacaaatatt ttcttttggg   480attttctttt aaatgccata gaatgcctct taagataaca aagaattgtt ggcatacctt   540acgtacctcg gccgcgacca cgctaatcac tagtgaattc gcggtcgcct gcaggcgcca   600tatgggagag ctcccaacgc gttggatgca tagcttgagt attctatagt gtcacctaaa   660<210>5<211>660<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>5atgctcccgg ccgcctgcgg ccgcgggaat tcgattctag cggtcgcccg ggcaggtaca    60aggctctcct gaatgatcct ttttttattt tttagtatac atcacaaatt cttgcatgag   120tgcagctgga agtaaattcc aattcaaatt ccctctgtta gtaaattcca attcaacaga   180taaatatttt tgtcttaaga tgcttaaagg gaatgactgt ccttgtaaga gtcaactgaa   240gcacagaaca ggttaatcac ttatcacatg tcttccttca gctacaagaa atggcattac   300acgccaagaa ttcctattca ctaactagtg acttgctgga tgtacctcgg ccgcgaccac   360gctaatcact agtgaattcg cggccgcctg caggtcgacc atatgggaga gctcccaacg   420cgttggatgc atagcttgag tattctatag tgtcacctaa atagcttggc gtaatcatgg   480tcatagctgt ttctgtgtga aattggtatt cgttcacaat tccacacaac atacgagccc   540ggaagcataa agtgttaagc ctggggtgcc ttatgagtga gctaactcac attaattgcg   600ttgcgctcac tgccgctttt cagtctggaa acctggccgt gccactgcat taatgaatcc   660<210>6<211>600<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>6tgcgtcgacg ctcccggccg ccatggcggc cgcgggaatt cgattagcgt ggtcgcggcc    60gaggtaccat gtatgtcaca tggataatat ctttataagt ttttaacagg taataagaaa   120taaactaact ctccattaga aaactgggca agagtgctca gaagaaaagc aaatgaaata   180agcatataaa aaatgtttga tttccctagt agtgataagc aaaatgtttt acctgtcact   240ttggcagact tttgtttaaa aagaaaaccc atgacggaga gagtgctgct aaatgcctgc   300ttttaatgta ttacaagtaa atgtatggga gtgtaaattg gcacagcctt cctgaaaaag   360cacatctttt gacccactaa atcctcttca aagaatttat cctaaggatg taattagaga   420tggagacaaa gccttatata tcaagaatgc ttattataat attattgagt aataacagca   480aaaataaaaa aaaccgtggt aaaatgtctt acagttggga agtgcctaat gaagtatgat   540ttatccatac tatgtaatat tacataccat caaaaatcat atttaaagat aatgaccttg   600<210>7<211>600<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>7cgcgtcgcat gctcccggcc gcctggcggc cgcgggaatt cgatttcgag cggccgcccg    60ggcaggtact ttctcctttt cctttttttc tatttagacc aaaaaaaaca aaaacaaaaa   120caaaaaaaaa caaaataata caaaacgaaa aaaaaagaaa gaacacccgt taacacacac   180gcgcacacac acacaaaatc tgtccatttg ccggaggcaa ttgtatgtat gttagttgga   240gggtattaac aaatc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Claims (5)

1、人支气管上皮细胞恶性转化前的差减cDNA文库，由序列1至序列42组成。

2、人支气管上皮细胞恶性转化早期的差减cDNA文库，由序列43至序列77组成。

3、人支气管上皮细胞恶性转化时期的差减cDNA文库，由序列78至序列105组成。

4、人支气管上皮细胞恶性转化前与肺癌病变相关的基因克隆序列1、10、11和19。

5、人支气管上皮细胞恶性转化早期与肺癌病变相关的基因克隆序列45和66。