CN102725634B - 用于测定cd8+t细胞的健康的测试法 - Google Patents

用于测定cd8+t细胞的健康的测试法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测定受试者的CD8+T细胞是否功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，该方法包括a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触，b)量化所接触的HLA-E+的增殖，c)使受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触，d)在接触受试者的CD8+T细胞后量化荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞的增殖，e)比较在步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖。

Description

用于测定CD8+T细胞的健康的测试法
本申请要求2010年3月18日提交的美国临时申请号61/340,492，2009年9月15日提交的美国临时申请号61/276,733以及2009年8月24日提交的美国序号12/583,723的优先权，这些申请均通过引入并入本文。
本发明在美国国立卫生研究院授予的资助号为RO1AI065609和U19AI46132的政府资助下完成的。因此，美国政府也对该发明享有一定的权利。
该申请中所引用的各种出版物用数字在括号内注明。这些参考文献的出处可在说明书末尾、权利要求书之前找到。这些出版物公开的内容通过引用整体并入本文，以便能够更全面地说明本发明所涉及的现有技术水平。
背景技术
如何特异且有效地防止并治疗人自身免疫性疾病一直是医药领域的核心难题。原因部分是由于我们还不完全了解免疫系统在胸腺阴性选择后如何区分自我和非我以维持外周自身耐受。通常认为表达对MHC/自身肽复合物具有高亲和力的TCR的胸腺细胞被去除的胸腺阴性选择(1-3)消除了外周中病理性自身免疫的“紧急危险”并且是自身耐受的主要机制。然而，通过胸腺阴性选择向外周中释放大部分中等亲和力的自反应性T细胞代表了各个体内遗传的病理性自身免疫性的潜在危险(4-6)，原因是潜在病理性自身反应性T细胞包含在中等亲和力T细胞库中并常常能够被功能性活化以引发自身免疫性疾病(6-9)。因此，在胸腺阴性选择后自我/非我的区分必须在外周中继续，且外周调节机制的主要功能之一是选择性地下调对自身抗原的免疫应答而不损害正在进行的对外来病原的应答(10-12)。
因此，在鼠研究中已经证明了通过胸腺阴性选择和随后的外周T细胞调节实现自我和非我区分，其中在外周T细胞调节中Qa-1限制性CD8+T细胞选择性地下调由其自身和外来抗原活化的中等亲和力T细胞(11-15)。与Foxp3+CD25+Treg和当前已知的控制免疫应答的量级和类型的任何其它调节细胞(16，17)不同，Qa-1限制性CD8+T细胞代表仅当前证实的在外周中发挥区分自我和非我功能的调节机制(11，12)。由于外周自反应性T细胞库因胸腺阴性选择而不具有高亲和力部分，中等亲和力T细胞的选择性下调同时能够抑制自身免疫并保持由高亲和力T细胞支配的功能性抗感染免疫(11-15)。与MHCIb类分子Qa-1偶联的热休克肽(Hsp60sp)也被证明是常见的替代靶结构，其优先以较高水平在中等亲和力T细胞上表达并特异性地被Qa-1限制性CD8+T细胞识别(14)。该发现揭示了Qa-1限制性CD8+T细胞和其靶T细胞之间的分子相互作用并解释了Qa-1限制性CD8+T细胞为何能够选择性地下调中等亲和力的T细胞。该发现提供了解释T细胞活化的亲和力能够被翻译成外周T细胞调节以区分外周中的自我和非我的分子和细胞机制(15)。本文描述了基于这些发现用于测定受试者HLA-E+限制性CD8+T细胞的健康的新测试法。
发明内容
测定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，
其中步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有B7sp肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，
其中步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
测定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括测定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的增殖，其中如果所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的增殖，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。
测定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括测定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中如果所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的方法，所述方法包括：
A)
i)使纯化的CD4+细胞群与(a)一定量的自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；
iv)量化所述活化的CD4+细胞的增殖；和
v)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大增殖所需的自身抗原的量并由此测定所述纯化的CD4+细胞群的自身抗原的ED50；
B)
i)使从所述受试者获得的外周血单核细胞样品与(a)自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；
iv)量化所述活化的CD4+细胞的增殖；
v)利用不同量的自身抗原重复步骤B)i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大增殖所需的自身抗原的量并由此测定所述外周血单核细胞样品的自身抗原的ED50；
其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行；
和
C)比较所述自身抗原的ED50和所述外来抗原的ED50，
其中，所述外来抗原的ED50高于所述自身抗原的ED50表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED50等于或小于所述自身抗原的ED50表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，其中
其中，步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
测定受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括：
a)使从所述受试者获得的包含HLA-E限制性CD8+T细胞的样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和
b)检测步骤(a)是否引起所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶，
其中，所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步骤b)中没有可检测的细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞没有被HLA-E/Hsp60sp活化。
鉴定样品中的功能性HLA-E限制性CD8+T细胞的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和
b)检测步骤(a)是否引起所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶，
其中，所述样品的细胞中细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述样品包含功能性HLA-E限制性CD8+T细胞。
预防性地治疗受试者而免于发展为自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此预防性地治疗受试者而免于发展为所述自身免疫性疾病。
用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此治疗所述自身免疫性疾病。
治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括：
a)测定从所述受试者获得的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我；和
b)如果在步骤a)中测定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能够区分自我和非我，则向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的外来体或树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞，并由此治疗所述自身免疫性疾病。
附图说明
图1A：荷载肽后HLA-E在HLA-E转染子B721/E表面上的表达。按照方法中所述，用肽荷载HLA-E转染子，然后用抗-HLA-EmAb对表面进行染色。
图1B：HLA-E限制性CD8+T细胞[CD8(H)]特异性地抑制表达HLA-E且荷载有Hsp60sp的细胞。按照方法中的描述，产生CD8(H)和对照细胞系并在CD8+T细胞抑制测试中测验。数据来自三个健康的正常个体。
图1C：HLA-E限制性CD8+T细胞抑制了对自身抗原MBP和GAD的整体免疫应答，但增强了对外来抗原TT和PPD的免疫应答。按照方法中的描述，产生CD8(H)和对照细胞系并在自我/非我区分测试中测验。数据来自三个健康的正常个体。
图2A：与正常个体相比，从1型糖尿病(T1D)患者新鲜分离的PBMC中的CD8+T细胞丧失了区分自我和非我的能力。按照方法中的描述，从T1D患者的PBMC中纯化CD8+T细胞，并在CD8+T细胞抑制测试中测验。所显示的数据表示与健康的正常对照配对测验的10位T1D患者中的9位患者的数据。
图2B：与正常个体相比，从T1D患者新鲜分离的PBMC中的CD8+T细胞丧失了特异性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的能力。按照方法中的描述，在标准的自我/非我区分测试中从来自T1D患者的PBMC纯化CD4+T细胞、测验并与PBMC比较。所显示的数据表示与健康的正常对照配对测验的10位T1D患者中的9位患者的数据。
图3A：与正常个体相比，在体外用荷载有Hsp60sp肽的自体树突细胞(DC)加强后，CD8+T细胞恢复了区分自我和非我的能力。按照描述从各T1D患者和相应的正常对照产生CD8(H)和对照CD8+细胞系，并在自我/非我区分测试中测验和比较。所显示的数据表示与健康的正常对照配对的最初测试具有HLA-E限制性CD8+T细胞缺陷的9位T1D患者中的8位患者的数据。
图3B：与正常个体相比，在体外用荷载有Hsp60sp肽的自体DC加强后，CD8+T细胞恢复了特异性地识别靶结构HLA-E/Hsp60sp的能力。按照描述从各T1D患者和相应的正常对照产生CD8(H)和对照CD8+细胞系，并在CD8+T细胞抑制测试中测验和比较。所显示的数据表示与健康的正常对照配对的最初测试具有HLA-E限制性CD8+T细胞缺陷的9位T1D患者中的8位患者的数据。
图3C：与正常对照个体相比，从所测验的大多数1型糖尿病(T1D)患者新鲜分离的PBMC中的CD8+T细胞都丧失了区分外周中的自我和非我的能力。与正常对照配对，比较了所纯化的CD4+T细胞和各T1D患者中的PBMC对自身抗原GAD比外来抗原TT的免疫应答。在存在和不存在CD8+T细胞下在各个个体中使用SND指标作为评价对自身比外来抗原的应答之间的区别的参数。数据表示用于各患者的两个测验。
图3D：来自所测试的多数糖尿病患者的CD8±T细胞在体外加强后再次获得了区分自我和非我的能力。与正常对照配对，比较了所建立的CD8(H)细胞系和各T1D患者的CD8(B)和CD8(N)细胞系对自身抗原GAD比外来抗原TT的免疫应答。SDN指标用作评价各个体对自身抗原比外来抗原的应答的差异的参数。数据表示用于各患者的两个测验。
图4：所测试的从多数T1D患者新鲜分离的CD8+T细胞都丧失了区分外周中的自我和非我的能力。与正常对照配对，比较了所纯化的CD4+T细胞以及各T1D患者的CD4+T细胞加CD8+T细胞对自身抗原MBP比外来抗原TT的免疫应答。数据概括了10位T1D患者和相应的对照。
图5：由特异性靶结构HLA-E/Hsp60sp触发的HLA-E限制性CD8+T细胞的提高的细胞溶解酶(CE)表达。将来自健康个体的CD8(H)和CD(B)细胞系与荷载有Hsp60sp肽或B7sp对照肽的B721/E细胞共培养。按照方法中的描述，通过利用穿孔素(Perf)、颗粒酶A(GA)和颗粒酶B(GB)的细胞内三色染色和随后的FACS分析测定CD8+T的CE表达。数据表示来自三个健康的正常个体之一的数据。上图表示CE表达的三个不同组合的CE表达指标，下图表示CD8(H)细胞系上CE的细胞内染色图谱。
发明详述
本发明使用的“HLA-E”具有本领域的通常含义，即人白细胞抗原系统E。
HLA-E蛋白序列描述于NCBI登录号CAA05527、CAA40172、BAB63328和BAF31260，其通过引用并入本文。在实施方式中，所述试剂是HLA-E/IgG融合蛋白，所述试剂是HLA-E四聚体或HLA-E/Hsp60sp四聚体。四聚体描述在，例如Salcedoetal.，Eur.J.Immunol.2000Apr；30(4)：1094-101中，其通过引用并入本文。所述亲和力模型和中等亲和力T细胞描述在2008年8月28日公开的WO/2008/103471中，其通过引用并入本文。
本文使用的“HLA-E限制性CD8+T细胞”是识别免疫系统抗原提呈细胞(APC)上或HLA-E+树突细胞上由HLA-E分子提呈的肽的调节性CD8+T细胞。如本文所涵盖的，用于HLA-E限制性CD8+T细胞的抗原提呈细胞包括中等亲和力T细胞，其也是这些CD8+T细胞的特异性靶标。
本文使用的“荷载”有肽的细胞或膜结合组合物应表示在允许进入所述细胞或所述肽的膜结合组合物和/或结合于所述细胞或所述肽的膜结合组合物的条件下所述细胞或膜结合组合物与所述肽一起温育。例如，可以通过在37℃下分别用浓度为50uM的Hsp60sp或B7sp温育细胞2小时使树突细胞荷载Hsp60sp或B7sp。
在实施方式中，所述HLA-E+细胞是CD4+/HLA-E+T细胞、CD8+/HLA-E+T细胞。
在优选的实施方式中，所述Hsp60sp是人的。人Hsp60sp是QMRPVSRVL(SEQIDNO：1)。鼠Hsp60sp具有序列QMRPVSRAL(SEQIDNO：2)。B7sp具有序列VMAPRTVLL(SEQIDNO：3)。
“自身抗原”根据其存在的生物体定义，其是生物体自身组织的生理组分和能够刺激自身免疫的机体成分。
“外来抗原”或非我抗原根据其存在的生物体定义，其是这样的分子：该分子不是生物体自身组织的生理组分和机体成分但能够在生物体内刺激免疫应答。
本文使用的细胞增殖可以以本领域已知的方式量化。
本文使用的“ED50”应表示引发相关细胞(例如抗原活化的CD4+T细胞)的半数最大增殖的抗原或自身抗原的剂量。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，
其中步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有B7sp肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，
其中步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
在本发明方法的实施方式中，步骤a)和/或步骤c)中的所述受试者的CD8+T细胞样品是从所述受试者获得的外周血单核细胞样品。在本发明方法的实施方式中，所述受试者具有自身免疫性疾病。在本发明方法的实施方式中，所述自身免疫性疾病是1型糖尿病。
测定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括测定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的增殖，其中如果所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的增殖，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。
在本发明所述方法的实施方式中，通过以下步骤测定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的增殖：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，
其中，步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
测定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括测定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中如果所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。
在本发明方法的实施方式中，受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的测定包括：
A)
i)使CD4+细胞群与(a)一定量的自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；
iv)量化所述活化的CD4+细胞的增殖；和
v)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大增殖所需的自身抗原的量并由此测定自身抗原的ED50；
B)
i)使CD4+细胞群与(a)外来抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述外来抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；
iv)量化所述活化的CD4+细胞的增殖；和
v)利用不同量的外来抗原重复步骤B)i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大增殖所需的外来抗原的量并由此测定外来抗原的ED50；
其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行；
和
C)比较所述自身抗原的ED50和所述外来抗原的ED50，
其中，外来抗原的ED50高于所述自身抗原的ED50表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED50等于或小于所述自身抗原的ED50表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。
本发明方法的实施方式中，所述CD8+T细胞包含在从所述受试者获得的外周血单核细胞的样品中。在本发明方法的实施方式中，所述CD8+T细胞是HLA-E限制性的。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的方法，所述方法包括：
A)
i)使纯化的CD4+细胞群与(a)一定量的自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；
iv)量化所述活化的CD4+细胞的增殖；和
v)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大增殖所需的自身抗原的量并由此测定所述纯化的CD4+细胞群的自身抗原的ED50；
B)
i)使从所述受试者获得的外周血单核细胞样品与(a)自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；
iv)量化所述活化的CD4+细胞的增殖；和
v)利用不同量的自身抗原重复步骤B)i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大增殖所需的自身抗原的量并由此测定所述外周血单核细胞样品的自身抗原的ED50；
其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行；
和
C)比较所述自身抗原的ED50和所述外来抗原的ED50，
其中，所述外来抗原的ED50高于所述自身抗原的ED50表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED50等于或小于所述自身抗原的ED50表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。
测定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和
e)比较步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖，
其中，步骤d)中量化的增殖的量大于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于步骤b)中量化的增殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
在本发明方法的实施方式中，步骤a)和/或步骤c)中的所述受试者的CD8+T细胞样品是从所述受试者获得的外周血单核细胞样品。在本发明方法的实施方式中，所述受试者具有自身免疫性疾病。在本发明方法的实施方式中，所述自身免疫性疾病是1型糖尿病。
测定受试者是否可能发展为自身免疫性病症的方法，所述方法包括测定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中CD8+T细胞不能区分自我和非我的受试者被确定为可能发展为自身免疫性疾病。在一个实施方式中，测定所述受试者的CD8+T细胞能够通过上文描述的方法区分自我和非我。
测定患有自身免疫性疾病的受试者是否能够通过施用荷载有HSP60sp的细胞治疗所述自身免疫性疾病的方法，所述方法包括测定所述受试者的CD8+T细胞是否功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，其中CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的患有自身免疫性疾病的受试者被确定为能够通过施用荷载Hsp60sp的细胞来治疗。在一个实施方式中，通过上文描述的方法测定所述受试者的CD8+T细胞自身能够功能性地识别HLA-E/Hsp60靶结构。
测定受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括：
a)使从所述受试者获得的包含HLA-E限制性CD8+T细胞的样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和
b)检测步骤(a)是否引起所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞对细胞内细胞溶解酶的分泌，
其中，所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步骤b)中没有可检测的细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞没有被HLA-E/Hsp60sp活化。
在实施方式中，所述包含HLA-E/Hsp60sp的组合物是经转染表达HLA-E且荷载有Hsp60sp的细胞。在一个实施方式中，经转染表达HLA-E的细胞是B721细胞。在一个实施方式中，所述细胞内细胞溶解酶是穿孔素、颗粒酶A或颗粒酶B。在一个实施方式中，所述样品是血液样品或源自血液。在一个实施方式中，通过使所述样品与结合有可检测标记物的抗细胞溶解酶抗体接触来检测所述细胞溶解酶。
鉴定样品中的功能性HLA-E限制性CD8+T细胞的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和
b)检测步骤(a)是否引起所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶，
其中，所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述样品包含功能性HLA-E限制性CD8+T细胞。
预防性地治疗受试者而免于发展为自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而在所述受试者中活化HLA-E限制性CD8+T细胞并由此预防性地治疗所述受试者而免于发展为所述自身免疫性疾病。
用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而在所述受试者中活化HLA-E限制性CD8+T细胞并由此治疗所述自身免疫性疾病。
治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括：
a)测定从所述受试者获得的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我；和
b)如果在步骤a)中测定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能够区分自我和非我，则向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的外来体或树突细胞从而在所述受试者中活化HLA-E限制性CD8+T细胞，并由此治疗所述自身免疫性疾病。
在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病是1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮。在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病是斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征(crestsyndrome)、克隆氏病、德戈斯病(Dego’sdisease)、皮肌炎、幼年型皮肌炎(dermatomyositis-juvenile)、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、全身肌强直综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。
在所述方法的实施方式中，Hsp60sp肽具有SEQIDNO：1所示的序列。在所述方法的实施方式中，所述树突细胞是不成熟的树突细胞。
在本发明方法的实施方式中，所述受试者是人。
本文所述方法、组合物和过程的各个要素的所有组合都在本发明的范围内。
通过参考以下实验细节可更好地理解本发明，但本领域技术人员可容易理解具体的实验细节仅例示本发明，在下文的权利要求书中将对本发明进行更全面完整的描述。
实验细节
在本文中提供了实验性证据证明能够从健康个体分离出参与人自身免疫性疾病1型糖尿病(T1D)的发生和控制的、能够差异性地调节针对自身抗原和外来抗原的免疫应答的HLA-E限制性CD8+T细胞。此外，还提供了测定HLA-E限制性CD8+T细胞的健康的试验并进行了测试。
特异性识别靶细胞上表达的HLA-E/Hsp60sp的人HLA-E限制性CD8+T 细胞系的建立
之前在小鼠中的研究中证明了与MHCIb类分子Qa-1偶联的热休克肽(Hsp60sp)是常见的替代靶结构，其优先在被任何抗原活化的中等亲和力T细胞上表达并特异性地被Qa-1限制性CD8+T细胞识别。因此，通过中等亲和力T细胞上该常见靶结构的特异性识别，Qa-1限制性CD8+T细胞能够选择性地下调中等亲和力而非高亲和力T细胞从而在外周中实现自我/非我的区分(14，15)。
为了研究HLA-E限制性人CD8+T细胞，证实了可能从健康人的PBMC产生特异性识别与HLA-E结合的Hsp60sp的HLA-E限制性CD8+T细胞系。因此，之前的研究表明荷载有Qa-1结合肽Hsp60sp而非Qdm的鼠树突细胞可以用作疫苗以诱导来自EAE的CD8+T细胞依赖性保护(14)。该结果强烈提示在体内可能通过荷载有Hsp60sp的树突细胞诱导功能性Qa-1/HLA-E限制性CD8+T细胞。采用这种方法，已经通过用荷载有Hsp60sp的自体树突细胞(称为“CD8(H)”)或荷载有作为对照的B7sp的自体树突细胞(称为“CD8(B)”)刺激纯化的外周CD8+T细胞成功地从数种DR4+健康个体产生了两种类型的人CD8+T细胞系。
首先对从健康供体产生的CD8+T细胞系进行测试以验证其识别靶T细胞上表达的HLA-E/Hsp60sp。因此，为了鉴定能够被调节性CD8+T细胞识别的HLA-E结合肽，建立了在其表面上表达HLA-E的人细胞系。为此，建立了HLA-E表达构建体并转染到人HLA-A、B、C缺陷型B细胞系中(18，19)。通过有限稀释产生HLA-E表达克隆并用作HLA-E提呈细胞，以鉴定靶HLA-E结合肽并测验所述HLA-E限制性CD8+T细胞的功能。按照描述(14，20)首先通过用HLA-E特异性mAb3D-12(21)对荷载有所述肽的B721/E细胞染色而测定HLA-E在所克隆的B721/HLA-E转染子(B721/E)表面上的表达。图1A显示了亚克隆B721/E的代表性结果，在B721/E中B7sp和Hsp60sp都能够与HLA-E结合以稳定所述细胞表面HLA-E的表达。
Hsp60sp特异性CD8+T细胞抑制荷载有Hsp60sp的HLA-E表达细胞， 但不抑制荷载有对照肽B7sp的HLA-E表达细胞
通过测验CD8(H)细胞系对表达HLA-E且荷载有Hsp60sp、B7sp或对照HLA-E非结合肽的转染子B721/HLA-E的抑制作用，对从健康个体产生的CD8(H)细胞系的特异性进行了研究(CD8+T细胞抑制测试)。图1B显示的结果证明：与由荷载有B7sp的DC触发的CD8+T细胞(CD8(B))相比，在所测验的所有个体中由荷载Hsp60sp的DC触发的CD8+T细胞(CD8(H))均显示对荷载有Hsp60sp而非B7sp或对照肽的HLA-E转染子的抑制。对照CD8(B)不抑制任何转染子。通过检测由HLA-E限制性CD8+T细胞分泌的细胞溶解酶(CE)进一步证实了HLA-E限制性CD8+T细胞对在靶细胞上表达的HLA-E/Hsp60sp的特异性认知识别(specificcognitiverecognition)。因此，如图5中的代表性结果所示，当将CD8(H)细胞系与荷载有Hsp60sp的B721/E细胞而非荷载有对照肽B7sp的B721/E细胞共培养时，或者当将CD8(B)细胞系与荷载有Hsp60sp或B7sp的B721/E共培养时，观察到CD8+T细胞分泌的CE(例如穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)增加。这些观察结果与在上述CD8+T细胞抑制测试中检测的荷载有Hsp60sp而非B7sp的CD8(H)细胞系对靶标的特异性杀伤准确关联。
这些结果表明，能够从健康人的血液产生HLA-E限制性、Hsp60sp特异性CD8+T细胞(在小鼠中鉴定的Qa-1限制性调节性CD8+T细胞的人对应物)。
HLA-E限制性CD8+T细胞在外周中发挥区分自我和非我的功能
在成功建立且之前在小鼠研究中使用的标准T细胞增殖测试中测定CD8+T细胞系对CD4+T细胞对自身抗原MBP(或GAD)比外来抗原TT(或PPD)的免疫应答的整体亲和力的影响。因此，通过系列剂量的MBP(和GAD)或TT(和PPD)活化所纯化的自体CD4+T细胞，并将CD8(H)细胞加入到CD4+T细胞培养物中。使用CD8(B)和“CD8(N)”细胞(即用没有荷载肽的DC致敏(prime))作为对照。在使用GAD作为自身抗原的研究中，所选择的供体是DR4+的。如图1C所示，在图1B所示的相同个体中，与CD8(B)或CD8(N)*细胞相比，CD8(H)抑制了CD4+T细胞对自身抗原MBP和GAD的免疫应答，但增强了CD4+T细胞对外来抗原TT和PPD的免疫应答。与在对照CD8(B)和CD8(N)细胞存在下对相同抗原的应答相比，通过在CD8(H)存在下对自身抗原MBP和GAD的免疫应答中整体亲和力的降低(反映为ED50的增加)显示了受抑制的免疫应答的典型图谱。然而，与在对照CD8(B)和CD8(N)细胞存在下对相同抗原的应答相比，通过在CD8(H)存在下对外来抗原TT和PPD的免疫应答中整体亲和力的提高(反映为ED50的降低)显示了增强的免疫应答的典型图谱。该组实验直接且明确证明了HLA-E限制性、Hsp60sp特异性的CD8+T细胞能够差异性地在健康人的外周中调节对自身抗原和外来抗原的免疫应答的功能。
已经在所测试的多数T1D患者中检测到了由HLA-E限制性CD8+T细 胞介导的通路的缺陷
在之前的研究中，已经证明Qa-1限制性CD8+T细胞在NOD小鼠中通过自我/非我区分控制自发形成的T1D(15)。为了验证HLA-E限制性CD8+T细胞在人T1D的控制中也发挥主要作用，测定了从10位T1D患者新鲜分离的MPBC中CD8+T细胞的功能。所选择的标准抗原是外来抗原TT和自身抗原GAD和MBP，因此在该研究的所有实验中所测验的每位患者都选择为DR4+的并且与DR4+健康正常对照配对。
a)与正常对照个体相比，从所测试的大多数T1D患者新鲜分离的CD8+ T细胞都丧失了区分外周中的自我和非我的能力
首先，按照以上所述，使用T细胞增殖测试评价CD8+T细胞对CD4+T细胞对自身抗原GAD或MBP比外来抗原TT的应答的影响，以评价其区分自我/非我的功能。因此，为了测定正常人CD8+T细胞能否在体外发挥区分自我和非我的功能，比较了人PBMC在CD8+T细胞存在或不存在下对自身和外来抗原的整体免疫应答。在第一组实验中，培养包含(a)CD8+T细胞和CD4+T细胞两者的完整的PBMC群，并利用不同剂量的GAD(和MBP)或TT培养纯化的CD4+T细胞群。因此，认为将PBMC群单独与纯化的CD4+T细胞群相比不能明确显示PBMC中包含的CD8+T细胞的功能。然而，在利用纯化的CD8+T细胞作为调节子进行大规模实验(表示为图1C)以显示HLA-E限制性CD8+T细胞能够区分自我和非我，然后比较PBMC和纯化的CD4+T细胞的免疫应答并组合其它测试法可以用作对CD8+T细胞功能的快速解读。在按照所述测验T1D患者中CD8+T细胞的功能并将其与CD8+T细胞抑制测试组合中即是如此。
图2显示与纯化的CD4+T细胞相比，正常对照的PBMC中CD8+T细胞的存在显著抑制了对自身抗原GAD和MBP的整体应答(反映为ED50的增加)(图2Ab)，而增强了对外来抗原TT的整体应答(反映为ED50的降低)(图2Aa)。然而，当对T1D患者的PBMC进行相同的测验时，PBMC和所纯化的CD4+T细胞之间应答自身抗原GAD和MBP或外来抗原TT的ED50均没有显著差异(图2Ac和2Ad)，这表明来自T1D患者的CD8+T细胞丧失了区分自我和非我的能力。
为了更好更清楚的了解由10位患者和相应对照的自我/非我区分测试获得的大量功能数据，需要各个个体的除ED50以外的另外的较简单但却有意义且可靠的参数以评价T细胞的功能。因此，本发明公开了在所测验的所有正常个体中，在不存在HLA-E限制性CD8+T细胞的情况下，外来抗原(TT或PPD)引发T细胞的最大增殖所需的抗原剂量总是高于自身抗原(GAD或MBP)。当在正常对照的CD4+T细胞培养中存在HLA-E限制性CD8+T细胞时，这种状况被逆转。
对来自6位对照和10位T1D患者的数据进行统计学分析。当在所有正常对照中存在调节性CD8+T细胞时，观察到引发应答自身抗原GAD和MBP的增殖所需的抗原剂量和引发应答外来抗原TT和PPD的最大增殖所需的抗原剂量之间具有非常显著的差异。在新鲜分离的淋巴细胞和体外致敏的CD8T细胞中均观察到了这种结果。然而，不论存在CD8+T细胞与否，观察到从多数T1D患者新鲜分离的淋巴细胞引发最大增殖所需的自身抗原和外来抗原剂量之间没有任何差异(表2)。
为了获得该观察结果，设想了一个新参数——自我和非我区分指标(SND指标)。SND是各个个体中对自身抗原的应答比对外来抗原的免疫应答而引发最大量T细胞增殖的抗原剂量的相关性。
利用SND指标作为参数将来自10位T1D患者和6位正常对照的结果(10次测试)总结于图3C。因此，在缺乏CD8+T细胞的CD4+T细胞培养物中，T1D患者和正常对照对外来抗原TT应答和自身抗原应答的SND指标之间均没有差异(P＞0.05)(参见表1)。然而，与图2Aa和2Ab所示的代表性结果相一致，在含有CD8+T细胞的PBMC培养中，所有正常对照都显示不同的图谱——对自身抗原GAD的应答的SND指标增加并显著高于对外来抗原TT的应答。在所测验的所有个体中，引发最大增殖所需的外来抗原剂量相比之下显著降低(P＜0.05)。这显示在正常的健康个体中受到良好控制的自身反应性。
相比之下，在存在CD8+T细胞和不存在CD8+T细胞的情况下，在10位T1D患者中有9位均显示相同的SND指标分布图谱除了患者#4)。这显示了这9位患者对自身抗原GAD的不受控制的自身反应性(表2)。该观察结果进一步被9位T1D患者对另一自身抗原(MBP)的增加的反应性所证实(参见图4和表)。这些观察结果与所测试的多数T1D患者的CD8+T细胞均在区分自我和非我的功能上具有缺陷的观点相一致。
表1：新鲜分离的CD4+T细胞和CD8+细胞即PBMC(T1D患者和正常对照)对外来抗原TT和自身抗原GAD的应答的T-检验。使用SND指标作为参数进行T-检验以分析从自我/非我区分测试中获得的数据。
*：P为在相反方向的显著性，例如外来抗原TT的SND指标高于自身抗原GAD。
表2：T1D患者和正常对照之间，在存在和不存在HLA-E限制性CD8+T细胞调节的情况下对TT和GAD应答的T-检验。
*：P为在相反方向的显著性，例如外来抗原TT的SND指标高于自身抗原GAD。
表3：T1D患者和正常对照之间，新鲜分离的CD4+T细胞和CD4+T细胞加CD8+T细胞对TT和MBP应答的T-检验。
*：P为在相反方向的显著性，例如外来抗原TT的SND指标高于自身抗原MBP。
b)与正常对照相比，从所测验的多数T1D患者新鲜分离的CD8+T细胞 不能识别在靶细胞上表达的特异性靶结构HLA-E/Hsp60sp
使用荷载有B7sp或非-HLA-E结合肽的B721/E作为对照，在荷载有Hsp60sp的HLA-E转染子B721/E上测验从T1D患者纯化的CD8+T细胞。如图2B所示，虽然来自正常对照的CD8+T细胞特异性抑制了荷载有Hsp60sp的B721/E，而不是对照肽(C)，但来自T1D患者的CD8+T细胞(P)不能抑制荷载有Hsp60sp的B721/E。因此，如图3C所示，与正常对照相比，在所测试的10位T1D患者中有9位的新鲜分离的PBMC的CD8+T细胞不能特异性抑制荷载有Hsp60sp的B721/E(P＜0.001)，这与各患者不能进行自我/非我区分明确相关，结果总结于表4中。
表4：与正常对照相比，从所测验的多数T1D患者新鲜分离的PBMC中的CD8+T细胞不能识别在靶细胞上表达的特异性靶结构HLA-E/Hsp60sp。在所述“CD8+T细胞抑制测试”中，测验从T1D患者的PBMC新鲜分离的纯化的CD8+T细胞识别HLA-E表达细胞系B721/E提呈的HLA-E/Hsp60sp的特异性。该表总结了来自10位T1D患者和正常对照的数据，代表每位患者的两次测验。
总之，在所测验的多数T1D患者中都检测到了HLA-E限制性CD8+T细胞介导的调节通路的缺陷，并且通过以上两个功能测试得到验证。这些结果强烈表明HLA-E限制性CD8+T细胞参与人T1D的免疫病理。
来自所测验的多数T1D患者的CD8+T细胞都可以在体外得到加强以恢 复其功能
对来自T1D患者的CD8+T细胞能否在体外得到加强以恢复其功能进行了验证。简而言之，如上所述，利用荷载有Hsp60sp的DC[CD8(H)]或荷载有B7sp的DC[CD8(B)]或者没有荷载肽的DC[CD8(N)]在体外致敏来自T1D患者的CD8+T细胞。利用上述两个测试，测验在体外得到加强的CD8+T细胞系功能的特异性以及区分自我/非我的功能。
如图3Ac和3Ad中代表性地显示的，与从正常对照产生的CD8+T细胞系相比，从最初测验的CD8+T细胞具有缺陷的9位T1D患者中的8位患者产生的CD8+T细胞系在用荷载有Hsp60sp的DC在体外特异性加强后恢复了区分自我/非我的功能(图3Aa和3Ab)。
为了证明CD8+T细胞所恢复的功能，在针对荷载有Hsp60sp的HLA-E转染子B721/E的CD8+T细胞抑制测试中还测试了这些CD8+T细胞系的特异性。将来自各患者的CD8(B)细胞系作为对照。如图3B中代表性地显示的，与正常的健康个体的效力相同，来自T1D患者的CD8(H)特异性地抑制荷载有Hsp60sp而非B7sp或对照肽的B721/E。来自同一患者的CD8(B)丝毫没有抑制。在所测验的在CD8+T细胞上具有缺陷的9位T1D患者中有8位患者也观察到了该现象。然而，在9位T1D患者中有1位患者(#7)的CD8+T细胞的功能不能被简单的体外“加强”所恢复。通过CD8+T细胞抑制测试检测的多数T1D患者的HLA-E限制性CD8+T细胞功能的恢复通过统计学分析所证实，其中在T1D组和正常对照组之间没有差异[P＝0.98(w/o#7患者)]。
使用SND指标作为参数，还评价了从T1D患者产生的HLA-E限制性Hsp60sp特异性CD8+T细胞系的功能。如图3D和表5所总结的，在缺乏HLA-E限制性调节CD8+T细胞的情况下，在两组对照组CD8(N)和CD8(B)中，在GAD应答中T1D患者和正常对照的SND指标均显著小于TT应答(P＜0.05)。
表5：在存在和不存在体外加强的HLA-E限制性CD8+T细胞的情况下，10位T1D患者和10位正常对照之间对TT和GAD应答的T-检验。
*：P为在相反方向的显著性，例如外来抗原TT的SND指标高于自身抗原GAD。
然而，当将CD8(H)细胞加入到T细胞培养物中时，在所有正常对照以及10位患者中的9位患者(除#7患者)中，GAD应答的SND指标显著高于TT应答(P＜0.05)，这表明在HLA-E限制性CD8+T细胞的控制下与对外来抗原的提高的免疫应答相关的对自身抗原的受抑制的免疫应答。这种观点进一步得到统计学分析的验证：在存在CD8(H)的情况下，在T1D患者(P＜0.05)和对照(P＜0.05)中对TT和GAD应答之间的均具有显著差异。然而，当在T1D组和对照组之间比较相同值时，没有观察到显著性差异(P＝0.25(TT)和P＝1.0(GAD))，这表明与正常对照组相比，在T1D组中HLA-E限制性CD8+T细胞的功能得到恢复(表6)。在所测验的多数T1D患者中，这些观察结果与通过在体外利用荷载有Hsp60sp的DC的增强能够矫正CD8+T细胞的缺陷的观点相一致。此外，所述数据还显示SND指标可以被用作直观、简单且可靠的诊断参数，以在临床背景下评价T1D患者中HLA-E限制性CD8+T细胞的功能。
表6：来自所测验的多数糖尿病患者的CD8+T细胞在体外加强后重新获得了识别该常规的替代靶结构的能力。在所述“CD8+T细胞抑制测试”中，检测来自各位患者的体外经过加强的CD8(H)细胞系识别HLA-E表达细胞系B721/E提呈的HLA-E/Hsp60sp的特异性。该表总结了来自10位T1D患者和正常对照的数据，代表每位患者的两次测验。
讨论
自我/非我区分以及控制免疫应答的量级和类型是两个同等重要但却不同的外周调节机制，其在环境中发挥作用以保证免疫系统的最佳功能(12，16，17)。目前，几乎所有经确定的外周调节机制都通过控制免疫应答的量级和类型而发挥作用(16，17)，这不是开发准确且安全的治疗方法以预防和治疗由不能自我/非我区分所引起的人自身免疫性疾病的生物基础(11，12)。越来越有必要寻找用于处理与免疫相关的临床问题的创新方法的新概念性框架，这成为医药界的挑战。为此，Qa-1/HLA-E限制性CD8+T细胞代表当前经确定发挥在外周中区分自我和非我的功能的唯一机制(10，11，12，17，22，23)，其可能形成治疗人自身免疫性疾病的特异且有效的方法的新方向。
在目前的研究中，本发明人提供了Qa-1限制性CD8+T细胞的人对应物(即HLA-E限制性CD8+T细胞)发挥区分自我和非我的功能且在人中确实存在并起作用的实验性证据。
通过用荷载有Hsp60sp肽的自体树突细胞在体外致敏来自健康个体PBMC的经纯化的CD8+T细胞可以产生HLA-E限制性调节CD8+T细胞系。此细胞特异性地抑制荷载有Hsp60sp但不荷载对照肽的HLA-E表达细胞。他们通过抑制对自身抗原而非外来抗原的整体免疫应答而发挥区分自我和非我的功能。
本研究还证实了HLA-E限制性CD8+T细胞介导的通路参与人自身免疫性疾病T1D的发展和控制。与健康的正常个体相比，来自10位T1D患者的数据表明所测试的多数T1D患者的HLA-E限制性CD8+T细胞介导的通路都存在缺陷，并且多数缺陷可以通过利用荷载Hsp60sp肽的自体DC在体外加强而得到矫正。
HLA-E限制性CD8+T细胞介导的通路的核心方面之一是调节的独特特异性。所述调节的特异性不是在激活靶T细胞的抗原的水平上而是在可能由任何抗原启动的、优先在靶标T细胞上表达发挥中等活化功能的特定的常规替代性抗原结构HLA-E/Hsp60sp的水平上。为了控制由外周自我/非我区分缺陷引起的任何自身免疫性疾病，HLA-E限制性CD8+T细胞的这种特征使免疫系统能够在生物学水平上采用简单的一元化机制区分自我和非我。该调节通路具有缺陷的人易于患任何器官特异性自身免疫性疾病。然而，个体患者通常受到与对其它多种自身抗原的反应性提高相关的一种特定的器官特异性自身免疫性疾病所控制。这与本发明人目前在T1D患者中的观察结果，即在T1D患者中其CD8+T细胞不仅不能抑制对T1D相关的自身抗原GAD的免疫应答，还不能抑制对T1D不相关的自身抗原MBP的免疫应答，同时这些细胞还不能识别由靶细胞提呈的HLA-E/Hsp60sp相一致。
在中心或外周水平上的自我/非我区分缺陷均可能在外周引起具有独特特征性特点的病理性自身免疫。因此，与由中心胸腺阴性选择的缺陷引起的全面且常常致命的病理性自身免疫不同，通常看到的器官特异性自身免疫性疾病一般发生在胸腺阴性选择被完成之后，且由自我/非我区分的外周调节缺陷引起并由环境损害触发(12)。预期对于器官特异性自身免疫性疾病的发生，有两点是必须的：(1)外周T细胞调节的功能障碍和(2)特定自身抗原向中等亲和力的自身反应性T细胞的快速高水平的呈递，其通常为从由感染或损伤引起的炎症部位的受损细胞释放的大量自身抗原的结果。因此，前者提供了器官特异性自身免疫性疾病发生的条件，后者(其可能受各个个体的某些遗传组成和特定的环境因素，例如某些地理位置和气候)决定可能发生哪种器官特异性自身免疫性疾病。由于感染或损伤通常限定在所影响的器官内，因此由来自生物学正常的外周T细胞库的此类损害引起的主动性自身免疫可能是器官特异性的，这不同于由胸腺阴性选择的缺陷引起的较群集且致命的病理性自身免疫。然而，在某些情况下，如果感染或损伤发生在多个器官中，则可能在此类患者的多于一个器官中观察到自身免疫。这与在一些T1D患者中诊断到其它自身免疫性疾病如自身免疫胸腺疾病、乳糜泻(celiacdisease)和阿狄森氏病的观察结果相一致。
由于缺乏调节仅提供了自身免疫性疾病发生的条件，“亲和力”模型回答了在免疫调节领域难以理解自我/非我区分的外周调节的基础问题，即为何调节通路的完全敲除不使动物的器官特异性自身免疫性疾病自发发生。这解释了在第一种情况下Qa-1KO小鼠为何没有自发发生无正当理由的自身免疫性疾病(24)。因此，与WT小鼠相比，虽然Qa-1KO小鼠不要求实验性诱导(如在WT小鼠中)以发展EAE的第一事件，但其由于Qa-1限制性CD8+T细胞的缺陷而丧失了对抗EAE再诱导的能力(24)。Qa-1KO小鼠的表型正好揭露了与主要由胸腺阴性选择的遗传缺陷引起的罕见、急剧且致命的全面性致病性自身免疫的对照相比，如何将外周自身耐受维持在实际生命中最常见情况的生物背景中(11，12)。本发明人当前的研究还证明了HLA-E限制性CD8+T细胞在维持外周自身耐受中的生物学意义。在正常对照中在利用不同情况进行的所有测验中，在不存在HLA-E限制性CD8+T细胞时，CD4+T细胞对自身抗原的免疫应答常常明显高于对外来抗原的免疫应答(P＜0.05)或与对外来抗原的免疫应答相同。相比之下，在含有HLA-E限制性CD8+T细胞的所有测试中CD4+T细胞对自身抗原的免疫应答总是显著低于对外来抗原的免疫应答(P＜0.05)，而没有任何例外。这种观点还得到所测试的多数T1D患者的HLA-E限制性CD8+T细胞已经丧失了功能这一事实的支持。
在本研究中，在所测验的10位T1D患者中，除#4患者外有9位患者显示HLA-E限制性CD8+T细胞的缺陷。HLA-E限制性CD8+T细胞缺陷在所测验的T1D患者中的高发生率的这种意外但却一致的观察结果提出以下假定：HLA-E限制性CD8+T细胞介导的通路在人T1D的发生和控制中发挥重要作用。然而，在比例小得多的患者中T1D可能是由除HLA-E限制性CD8+T细胞以外的不同调节机制的缺陷引起的。因此，在人中可能具有两类主要的T1D，即依赖于或不依赖于HLA-E限制性CD8+T细胞缺陷，这两类T1D需要不同的治疗方法。此外，在具有HLA-E限制性CD8+T细胞缺陷的9位T1D患者中，8位患者的CD8+T细胞在体外用荷载有Hsp60sp的自体DC加强后能够再次获得功能。然而，此类体外增强可能不能矫正来自所述患者的CD8+T细胞的功能。这种观察结果表明，该患者中CD8+T细胞介导的通路的缺陷可能不在CD8+T细胞本身的水平上，而是在可能不能诱导CD8+T细胞的树突细胞或者可能不易受CD8+T细胞调节的CD4+T细胞的水平上。应该进行进一步的系统研究以研究这些可能性。
在当前研究中建立且使用的两种主要的测试专门设计以检测HLA-E限制性CD8+T细胞。第一个“CD8+T细胞抑制测试”是基于HLA-E/Hsp60sp复合物的优先表达仅在中等亲和力T细胞中发生的事实来检测HLA-E限制性CD8+T细胞对靶向中等亲和力而非高亲和力T细胞的特异性(14)。第二个是T细胞增殖测试，以在存在和不存在HLA-E限制性CD8+T细胞的情况下通过测定并比较对自身抗原和外来抗原的T细胞免疫应答的整体亲和力来系统地检测人CD8+T细胞的自我/非我区分(15)。
这两种测试法的组合产生了能够在基础和临床研究中鉴定人HLA-E限制性CD8+T细胞的特异性和功能的独特且可靠的测试系统。与用于检测Foxp3+Tregs的目前受欢迎的测试相比，该测试系统具有重要的优势。例如，在用于检测Foxp3+Tregs功能的测试中，靶标T细胞通常被诸如抗-CD3mAb或有丝分裂原的试剂非特异性地活化。这是因为Foxp3+Treg识别的特异靶结构和特定T细胞靶群从未被准确鉴定，这代表了Foxp3+Tregs生物学中未解决的重要问题。相比之下，CD8+T细胞抑制测试能够明确测定CD8+T细胞是否为HLA-E限制性的和这些细胞是否特异性地识别在靶细胞上表达的特定靶结构HLA-E/Hsp60sp，而自我/非我区分测试能够准确测定这些细胞的生物学功能。重要的是，由这两种测试检测的调节程度和量级的生物学有效性不仅得到了统计学分析的验证(表3)，还得到了此程度和量级的调节足以有效保护动物免受T1D和EAE的观察结果的支持(15)。
总之，本发明人目前的发现不仅可能开启了理解外周自我耐受的生物学基础和基于“亲和力模型”的概念性框架的人自身免疫性疾病控制的新主题，还提供了在诊断和治疗水平上特异且有效地预防和治疗人T1D的潜在临床方法。发挥区分自我和非我功能的外周调节机制的鉴定开启了预防和治疗自身免疫性疾病而不损害抗感染和抗肿瘤免疫性(当前使用的免疫治疗药的主要副作用)的新型临床介入的新可能。基于本发明人当前的发现，所述潜在治疗可能是用荷载有Hsp60sp的自体DC接种患者或者将体外加强的CD8+T细胞转移回患者。然而，在目前阶段，本发明人不知道体外加强HLA-E限制性CD8+T细胞的作用是否可能被直接翻译成体内疗法以治疗人T1D。关于这一点，虽然有时NOD小鼠中的鼠T1D研究不能提供与人T1D的直接关联，但是使用在NOD小鼠中的T1D模型可能将作为治疗方法的潜在应用直接进一步开发为体内应用。此外，本发明人的测试体系不仅能够评价HLA-E限制性CD8+T细胞在所建立的T1D患者中的功能状态还可能进行没有症状的“前-T1D患者”(具有随后发展为全面的T1D的潜能的T1D患者群)的早诊断。
多发性硬化症
在来自三个多发性硬化症(MS)患者的样品上进行特异性测试和自我/非我区分测试，并使用两个正常个体作为对照。所有三个MS患者都显示其HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我的缺陷。
盲研究
在盲测的6位受试者中，5位受试者被鉴定为HLA-E限制性CD8+T细胞具有自我/非我识别缺陷，并且被确定具有自身免疫性疾病的症状。一位受试者虽然没有临床症状，但该受试者的样品显示了HLA-E限制性CD8+T细胞的缺陷。跟踪该个体以确定是否发生自身免疫性疾病。
在所述盲样品中，对于来自血液测验对所测验的所有自身抗体均为阴性的1型糖尿病(T1D)患者的HLA-E限制性CD8+T细胞的缺陷，特异性测试和自我-非我区分测试可能明确诊断不能使用其它测试的自身免疫性疾病。这可以作为鉴定可以通过矫正调节通路的缺陷而治疗的高风险人群的早期诊断，从而防止随后发生自身免疫性疾病。
材料和方法
试剂
抗-HLA-EmAb3D-12和对照mAb4D-12由DanielGeraghty博士(FredHutchinsonCancerResearchCenter，西雅图，USA)惠赠。染色剂荧光素(Fl)-抗人CD8)、藻红蛋白(PE)-抗人CD4)和荧光素(FI)-山羊抗小鼠购自BDPharmingen，NJ，USA。肽：人HSP60sp(QMRPVSRVL)(SEQIDNO：1)；hB7sp(VMAPRTVLL)(SEQIDNO：3)；TT-830(QYIKANSKFIGITE)(SEQIDNO：4)；GAD555-567(NFFRMVISNPAAT)(SEQIDNO：5)；MBP84-102(NPVVHFFKNIVTPRTPPP)(SEQIDNO：6)由GeneScriptCorporation，NJ，USA合成。PPD购自SanofiPasteurLimited，多伦多，加拿大。
人PBMC的制备和所纯化的CD8+和CD4+T细胞
由肝素化的血液制备PBMC，其用Hank’s平衡盐溶液稀释为1∶1，在Ficoll-Hypaque上分层并在SorvallRC-3(IvanSorvall，Inc.，NY，USA)中以1,000g离心30分钟。除去血清Ficoll界面的淋巴细胞并洗涤三次，并用于亚群的进一步纯化。按照描述(13)，使本研究提供的所有实验中的CD8+和CD4+T细胞均通过MACS磁珠(MiltenyiBiotec，Inc.AuburnCA，USA)正向选择。简而言之，用结合有抗人CD4或CD8的磁珠以10×106细胞/10ul珠温育PBMC，并根据厂商的方法使用接触磁场的分离柱分离CD+和CD-群。CD4+或CD8+T细胞的纯度为＞95％。
HLA-E表达转染子的产生
为了得到DSRed-HLA-E融合构建体，利用源自人B细胞系B721的总RNA通过反转录分离编码人HLA-E的cDNA。使用以下引物对进行扩增：正向引物-GGGGATCCAACAAGCTGTGAGACTCAGACCC(SEQIDNO：7)。将所产生的PCR产物亚克隆至载体pCR2.1(InvitrogenCorp.，nowLifeTechnologies，CA，USA)中并将所扩增的克隆在两条链上全部测序以证明身份。6个独立的全长克隆具有与所公开的HLA-E101单倍体型相同的序列，不同的是所有克隆都没有设计3’终止密码子。利用设计在引物内部的限制性位点(XhoI，5’末端；BamHI，3’末端)从pCR2.1切除序列得到验证的克隆，并利用相同的限制性位点亚克隆至哺乳动物表达载体pDSRed-Express-N1(Clonetech，Inc.，CA，USA)。将HLA-EcDNA插入到pDSRed载体中产生了编码由连接至海葵种的红色荧光蛋白变体(Clonetech，Inc.，CA，USA)的HLA-E组成的融合蛋白的单个开放阅读框。在293T胚肾成纤维细胞系中通过瞬时表达测试对荧光HLA-E的表达进行验证。随后通过电穿孔将pDS-Red-HLA-E构建体引入到人HLA-A、B、C缺陷B细胞系B721(18)中，并利用Geneticin(G418)(GibcoBRLLifeTechnologies，Inc，.CA，USA)针对载体编码的新霉素抗性进行3周筛选后获得稳定表达，通过进一步的亚克隆方法获得稳定的转染子。
测验HLA-E转染子在HLA-E表面的表达
通过在26℃下用hHsp60sp和B7sp或对照非-HLA-E结合肽外源荷载细胞18个小时评价HLA-E在用HLA-E转化的B721表面上的表达。然后洗涤细胞，用抗-HLA-EmAb3D-12(21)和随后的F-山羊抗-小鼠Ig染色，并按照前述(13)在FACScan流式细胞仪和CellQuestTM软件(BectonDickinson，MountainView，CA，USA)上分析。Mab4D-12作为对照(21)。
HLA-E限制性Hsp60sp特异性CD8+T细胞系的产生
树突细胞源自去除CD4+和CD8+T细胞的PBMC，并在6孔板中在没有血清的Click培养基中于37℃、5％CO2下培养1-1.5小时。然后洗涤细胞并在含有终浓度分别为80ng/ml和20ng/ml的GM-CSF和IL-4的培养基中培养6天。在第6天收集DC并用50uM的Hsp60sp或B7sp在37℃荷载2小时。然后将所纯化的1.5-2x106个CD8+T细胞与荷载肽的0.5x106DC以1ml共培养在48孔板中，以建立CD8(H)、CD8(B)和CD8(N)细胞系(由没有荷载肽的DC致敏)。在第二天加入IL-2。在整个本研究中，针对每位T1D患者和对照均建立这三种类型的细胞系。
CD8+T细胞抑制测试
这种类型的测试是基于Qa-1或HLA-E/Hsp60sp复合物的优先表达仅在中等亲和力T细胞中发生的事实来检测Qa-1或HLA-E限制性CD8+T细胞对靶向中等亲和力而非高亲和力T细胞的特异性(14，15)。简而言之，按照描述产生CD8(H)和CD8(B)细胞系。使所建立的转染HLA-E的细胞(B721/E)在26℃过夜被动荷载测试肽。将等量的荷载有肽的未标记B721/E细胞和没有荷载肽的CFSE标记的B721细胞混合，并将级量CD8(H)细胞加入到靶标中，E/T比为3∶1至0.01∶1。将荷载有不同肽的CD8[B]细胞作为额外的对照。因此，本发明人已经确定所测验的CD8(H)细胞对单独的B721细胞或用hsp60sp或B7spB721脉冲的细胞没有作用。5-6天之后，通过FACS分析评价细胞混合物，其中所述CD8+T细胞在分析过程中被门出(gateout)。计算两种类型的靶标的比例以评价测验CD8+T细胞对靶标的作用。在CD8+T细胞存在下测定荷载肽(非-CFSE-标记)的B721/E细胞和没有荷载(CFSE-标记)的B721细胞的比例(％特异性抑制)：{[对照培养物(没有CD8+T细胞)中荷载B721/E和没有荷载B721细胞的比例-具有CD8+T细胞的实验培养物中的比例]/对照培养物的比例}×100％(14，15)。
由CD8+T细胞分泌的细胞内细胞溶解酶(CE)的检测
按照描述从健康个体产生CD8(H)和CD8(B)细胞系。使用所建立的HLA-E转染细胞(B721/E)作为触发CD8+T细胞的靶标，并在26℃过夜使其被动荷载Hsp60sp肽和作为对照的B7sp肽。将级量测验CD8(H)和CD8(B)细胞系加入到荷载有E/T比为3∶1至0.005∶1的不同肽的靶标B721/E细胞中。按照厂商的说明在不同时间点利用抗-穿孔素-PE、抗-颗粒酶A-FITC和抗-颗粒酶B-Bio/Cy(BDPharmingen，圣地亚哥，CA，USA)在细胞混合物上进行三种颜色的细胞内染色。通过FACS分析评价细胞，其中在分析中CD8+T细胞被圈在门内。计算CE表达指标作为不同E/T比的功能：[(％来自不同E/T比培养物的双阳性CE染色的CD8+T细胞)-(％来自没有被靶细胞触发的CD8+T细胞的双阳性CE染色的CD8+T细胞)]/％来自没有被靶细胞触发的CD8+T细胞的双阳性CE染色的CD8+T细胞。
自我/非我区分测试
已经通过在标准T细胞增殖测试中测定T细胞对不同抗原的免疫应答的整体亲和力，建立了系统地测定人CD8+T细胞系对CD4+T细胞对自身抗原比外来抗原的整体免疫应答的作用的功能测试。因此，在本发明的标准方法中，本发明人分别选择TT和PPD作为外来抗原，选择GAD和MBP作为自身抗原。简而言之，在作为APC的受辐射的脾细胞存在下通过0.08uM至50uM系列剂量(使用1∶12500至1∶20的PPD)的GAD(或MBP)或TT(或PPD)激活所纯化的CD4+T细胞24小时。洗去抗原并将所纯化的0.1x105个CD4+T细胞和1x105个受辐射的脾细胞的混合物铺在含有补充有1mML-谷氨酰胺且不含血清的AIM-V淋巴细胞培养基(GIBCO)的96孔圆底平板中。还以0.1-0.2∶1的E/T比向CD4+T细胞中加入CD8(H)，并进一步培养5-6天。为此，本发明人对加入至由不同抗原剂量活化的CD4+T细胞培养物中的CD8(H)细胞的量进行滴定，并选择加入至CD4+T细胞培养物的10-20％的CD8+T细胞，以揭示CD8(H)细胞的最佳抑制作用。使用CD8(B)和CD8(N)作为对照。在5-6天培养的最后18个小时，加入3H胸苷(1uCi/孔)并通过液闪计数仪测定掺入的标记。对细胞增殖(细胞数/分钟)和抗原浓度作曲线，并通过计算导致半数最大增殖的抗原浓度截距导出ED50值。关于这一点，普遍接受“ED50”是目前评价抗原特异性T细胞克隆的亲和力的最可靠方法，其反映了TCR与MHC/肽复合物直接连接的整合功能以及通过共刺激分子的信号转导。因此，本发明人选择该方法测定T细胞应答的整体亲和力，该方法已经成功地运用至本发明人之前的研究中(13-15)。除了“ED50”外，本发明人还设计了评价T细胞的自我/非我区分功能的新参数自我/非我区分指标：在各个个体中引发对自身抗原的免疫应答比对外来抗原的免疫应答之间的最高T细胞增殖的抗原剂量(如本文详述)。
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Claims (17)

1.(i)荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞和(ii)荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞在制备用于测定受试者的CD8+T细胞的功能状态的试剂中的应用，其中，所述测定包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与所述荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞的生长抑制；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与所述荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中的荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞的生长抑制；和
e)比较步骤d)中量化的生长抑制和步骤b)中量化的生长抑制，
其中步骤b)中量化的生长抑制的量大于步骤d)中量化的生长抑制的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤b)中量化的生长抑制的量小于或等于步骤d)中量化的生长抑制的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
2.(i)荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞和(ii)荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞在制备用于测定受试者的CD8+T细胞的功能状态的试剂中的应用，其中，所述测定包括：
a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与所述荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；
b)量化步骤a)中与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触的CD8+T细胞的细胞内细胞溶解酶的分泌；
c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与所述荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触；
d)量化步骤c)中与荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触的CD8+T细胞的细胞内细胞溶解酶的分泌；和
e)比较步骤b)中量化的CD8+T细胞的细胞内细胞溶解酶分泌和步骤d)中量化的CD8+T细胞的细胞内细胞溶解酶分泌，
其中步骤b)中量化的细胞内细胞溶解酶分泌的量大于步骤d)中量化的细胞内细胞溶解酶分泌的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤b)中量化的细胞内细胞溶解酶分泌的量小于或等于步骤d)中量化的内细胞溶解酶分泌的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述细胞内细胞溶解酶是穿孔素、颗粒酶A或颗粒酶B。
4.如权利要求1或2所述的应用，用于测定受试者是否具有发展为自身免疫性疾病的倾向，其中当所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构时，所述受试者具有发展为自身免疫性疾病的倾向。
5.如权利要求1或2所述的应用，用于测定患有自身免疫性疾病的受试者是否能够通过施用荷载有Hsp60sp的细胞或荷载有Hsp60sp的膜结合组合物来治疗。
6.如权利要求1或2所述的应用，用于测定患有自身免疫性疾病的受试者的治疗效力，其中如果受试者的CD8+T细胞在治疗后恢复识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的功能，则该治疗是有效的。
7.如权利要求1-2中任一项所述的应用，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
8.如权利要求1-2中任一项所述的应用，其中所述CD8+T细胞是HLA-E限制性的CD8+T细胞。
9.如权利要求1-2中任一项所述的应用，其中所述受试者是人。
10.如权利要求4所述的应用，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克隆氏病、德戈斯病、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、结节病、干燥综合征、全身肌强直综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。
11.如权利要求5所述的应用，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克隆氏病、德戈斯病、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、结节病、干燥综合征、全身肌强直综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。
12.如权利要求6所述的应用，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克隆氏病、德戈斯病、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、结节病、干燥综合征、全身肌强直综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。
13.如权利要求7所述的应用，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克隆氏病、德戈斯病、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、结节病、干燥综合征、全身肌强直综合征、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。
14.如权利要求10所述的应用，其中所述皮肌炎是幼年型皮肌炎；所述狼疮是系统性红斑狼疮或盘状狼疮；所述血管炎是结节性多动脉炎、大动脉炎或颞动脉炎/巨细胞动脉炎。
15.如权利要求11所述的应用，其中所述皮肌炎是幼年型皮肌炎；所述狼疮是系统性红斑狼疮或盘状狼疮；所述血管炎是结节性多动脉炎、大动脉炎或颞动脉炎/巨细胞动脉炎。
16.如权利要求12所述的应用，其中所述皮肌炎是幼年型皮肌炎；所述狼疮是系统性红斑狼疮或盘状狼疮；所述血管炎是结节性多动脉炎、大动脉炎或颞动脉炎/巨细胞动脉炎。
17.如权利要求13所述的应用，其中所述皮肌炎是幼年型皮肌炎；所述狼疮是系统性红斑狼疮或盘状狼疮；所述血管炎是结节性多动脉炎、大动脉炎或颞动脉炎/巨细胞动脉炎。
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