ES2387305T3 - Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales - Google Patents

Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales Download PDF

Info

Publication number
ES2387305T3
ES2387305T3 ES04803117T ES04803117T ES2387305T3 ES 2387305 T3 ES2387305 T3 ES 2387305T3 ES 04803117 T ES04803117 T ES 04803117T ES 04803117 T ES04803117 T ES 04803117T ES 2387305 T3 ES2387305 T3 ES 2387305T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
medium
microorganisms
caco3
value
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES04803117T
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Luy
Matthias RÜSING
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza AG
Celanese Sales Germany GmbH
Original Assignee
Lonza AG
Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza AG, Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH filed Critical Lonza AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2387305T3 publication Critical patent/ES2387305T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Edible Oils And Fats (AREA)

Abstract

Procedimiento para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales, caracterizado porque losmicroorganismos se cultivan en un medio de fermentación que presenta CaCO3 como medio esencial para laestabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de fermentación, siendoentonces CaCO3 un medio esencial para la estabilización del valor de pH si la suma de diferencias de valores de pH,que se pueden medir con o sin adición de ácidos, - en cada caso con la adición de CaCO3 según la invención - esmenor o igual a 1.

Description

Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales
Diversos ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs para polyunsaturated fatty acids), y especialmente ácidos grasos omega-3 (ácidos grasos n3), son componentes esenciales de la nutrición humana.
Sin embargo es sabido que en la mayor parte de naciones industriales, el abastecimiento con ácidos grasos n3 es deficiente. Por el contrario, la fracción grasa total en la nutrición, así como la alimentación de ácidos grasos saturados y ácidos grasos n6 es demasiado elevada. Esto se basa en una modificación de nuestra composición alimenticia, que ha tenido lugar sobre todo aproximadamente en los últimos 150 años, y se ha correlacionado con la aparición de diversas enfermedades crónicas de la civilización, como por ejemplo enfermedades circulatorias - la causa principal de mortandad en zonas industriales - (Simopoulos, A. P., 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70, 560-569). Entre tanto, una pluralidad de estudios ha mostrado que mediante el aumento selectivo de la alimentación de ácidos grasos n3, en especial de ácido eicosapentanoico (EPA) y de ácido docosahexanoico (DHA), se puede reducir significativamente el riesgo circulatorio (GISSI-Prevenzione Investigators (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell,Infarto miocardico), 1999, Dietary suplementation with n-3polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-pevenzione trial., Lancet 3544, 447-455; Burr et al., 1989, Effects of changes in fat, fish, and fibre intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction trial (DART). Lancet 2, 757-761): correspondientemente se recomienda por diversas organizaciones (WHO, FAO, AHA, ISSFAL, British Nutrition Foundation u.v.a.) aumentar significativamente la alimentación de ácidos grasos n3 (Kris-Eherton et al., Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease. Circulation 2002, 2747-2757).
Fuentes para la obtención de PUFAs, y en especial ácidos grasos n3, son sobre todo peces marinos de agua fría y aceites obtenidos a partir de los mismos, pero también microorganismos marinos que tienen la ventaja, frente a peces, de poder ser empleados en fermentadores para la producción de PUFAs bajo condiciones económicas y controladas. En el caso de una obtención por fermentación no existe peligro de impurezas, como se describen para peces o aceites de pescado obtenidos a partir de los mismos (Olsen SF. Int J Epidemiol. 2001: 1279-80). Además se puede influir positivamente sobre la composición de los aceites obtenidos mediante selección del organismo y las condiciones de cultivo, y no se está sometido a fluctuaciones de temporada, como se describe igualmente para peces y productos de pescado (Gamez-Meza et al. Lipids 1999: 639-42).
Microoganismos que son apropiados para la obtención de PUFA n3 se encuentran, a modo de ejemplo, en las bacterias bajo la especie Vibrio (por ejemplo: Vibrio marinus), o bajo los Dinoflagellaten (Dinophyta), en especial la especie Crypthecodinium, como C. cohnii, o bajo los Stramenopiles, como Pinguiophyceae, como por ejemplo Glossomastix, Phaeomonas, Pinguiochrysis, Pinguiococcus y Polydochrysis. Microorganismos preferentes para la obtención por fermentación de PUFA pertenecen a Stramenopiles (o Labyrinthulomycota), en especial a la especie Thraustochytriales (Thraustchytriidea), y a su vez en particular a las especies Japonychytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium y Ulkenia.
Es sabido que algunos de los citados microorganismos se pueden emplear para la producción industrial de ácidos grasos, se describieron algunos procedimientos. De este modo, la solicitud de patente internacional WO 91/07498 A1 da a conocer la obtención de PUFAs con organismos de las especies Schizochytrium y Thraustochytrium. La WO 91/11918 A1 da a conocer la obtención de PUFAs con Crypthecodinium cohnii, la WO 96/33263 A1 y la correspondiente solicitud de patente europea EP 0 823 475 A1 describen la obtención de PUFAs con microorganismos de la especie Schizochytrium, mientras que la solicitud de patente WO 98/03671 da a conocer la obtención de PUFAs con microorganismos de la especie Ulkenia.
El espacio vital natural de los microorganismos descritos, y en especial de Labyrinthulomycota, son hábitats marinos. Convencionalmente, éstos microorganismos se cultivan en medios correspondientemente salinos, definiéndose el contenido en sal del agua marina en 32-35 g/l, y una fracción de un 90-95 % en sodio y cloruro, para los fines de la presente invención. Medios típicos para el cultivo de microorganismos marinos, como Thraustochytrium o Schizochytrium se basan en agua marina (por ejemplo ATCC (American Type Culture Collection) 790 By + Medio [extracto de levadura 1,0 g, peptona 1,0 g, D+-glucosa 5,0 g, agua marina 1L]). No obstante, también se sabe que los microorganismos de la especie Thraustochytriales pueden sobrevivir en el medio de cultivo con salinidad muy reducida. No obstante, su crecimiento se considera muy reducido y sin máximos intermedios en el intervalo de salinidad reducido por debajo de un límite de 7,5 - 15 g de sal/L, correspondientemente a una salinidad de un 7,5 15 %. Se consiguen velocidades de crecimiento óptimas sólo por encima de los límites de salinidad indicados anteriormente (Fan et al. Botanica Marina 45, 2002, páginas 50-57).
Un problema de procesos fermentativos que se presenta frecuentemente son las fuertes oscilaciones de pH en el desarrollo del cultivo como consecuencia de la aparición de productos metabólicos y/o del consumo de componentes de medio aislados. Esto es válido en especial para medios ricos en sales para la fermentación de microorganismos marinos. Por lo tanto, tales fermentaciones requieren frecuentemente una regulación de pH. Sin embargo, en el caso de fermentaciones a gran escala, el control del valor de pH conduce a un gasto añadido considerable. En este caso
se requieren depósitos adicionales para la adición de ácidos y bases, que se pueden emplear de otro modo para la alimentación de componentes aditivos. Además, la titración para la regulación del valor de pH se debe controlar técnicamente. En relación con la fermentación de Labyrinthulomycota para la obtención de PUFA a escala de producción, en el estado de la técnica se emplean métodos de cultivo controlados mediante el valor de pH.
No obstante, el control del valor de pH a través de sistemas tampón, habituales en el cultivo celular por lo demás, presenta inconvenientes. De este modo, la capacidad de tamponaje, por ejemplo, de TRIS, HEPES y MOPS debido a sus valores de pKa por encima de 7 no es suficiente en el intervalo de pH necesario para la fermentación de PUFA. TRIS es además un mal tampón en los intervalos de pH por debajo de 7,5, una amina primaria potencialmente reactiva, y puede participar activamente en las más diversas reacciones biológicas. El tampón fosfato, un tampón igualmente empleado con frecuencia, tiene la propiedad de precipitar a partir de la disolución en presencia de cationes divalentes, y además es una mala elección en procesos fermentativos, que requieren, o bien consumen fosfato. Debido a su estrecho intervalo de tamponaje, y debido al hecho de ser metabolizado en el transcurso de la fermentación, el tampón acetato es inapropiado. Además, debido a los costes elevados, muchos sistemas tampón alternativos son poco rentables.
Por lo tanto, considerando el estado de la técnica, era tarea de la presente invención poner a disposición un procedimiento de cultivo nuevo, sencillo y económico para microorganismos marinos. En este caso se conseguirá una simplificación considerable del control de proceso. Aparte de la eficiencia de costes, el procedimiento posibilitará la obtención de PUFAs altamente puros en rendimiento elevado.
Estos problemas, así como otros no citados explícitamente, pero que se pueden derivar o deducir de los contextos aquí discutidos preliminarmente, se solucionan mediante el objeto que está definido en las reivindicaciones de la presente invención. La presente invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales, en el que los microorganismos se cultivan en un medio de fermentación que presenta CaCO3 como medio esencial para la estabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de fermentación, siendo CaCO3 un medio esencial para la estabilización del valor de pH si la suma de diferencias de valores de pH, que se pueden medir con o sin adición de ácidos, - en cada caso con la adición de CaCO3 según la invención - es menor o igual a 1.
PUFAs preferentes son DHA, DPA y EPA según la invención.
En especial, los microorganismos cultivados en el procedimiento citado anteriormente muestran una producción de más de un 10 %, preferentemente más de un 14 %, y de modo muy especialmente preferente más de un 18 % de DHA por biomasa seca.
Los microoganismos cultivados en el procedimiento citado anteriormente muestran en especial una producción de más de un 1 %, preferentemente más de un 2 %, y de modo muy especialmente preferente más de un 3 % de DPA por biomasa seca.
Mediante aislamiento de PUFAs, que sigue al cultivo, a partir de la biomasa de microorganismos y/o del medio de cultivo, los PUFAs se pueden obtener en rendimiento y pureza elevados.
Además se recurre al empleo de un medio de cultivo que comprende CaCO3 como medio esencial para la estabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de cultivo, para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochyriales.
En este caso, bajo condiciones según la invención, los microorganismos muestran una producción de más de un 25 % en peso de aceite, preferentemente de más de un 35 % en peso de aceite, y de modo muy especialmente preferente de más de un 45 % en peso de aceite por unidad ponderal de biomasa seca.
Según la invención se entiende por aceite una fracción de al menos un 70 % de lípidos neutros y al menos un 2 % de fosfolípidos, lo que corresponde al espectro de ácidos grasos normal, conocido por el especialista, de Thraustochytriales. En este caso, los lípidos neutros están constituidos por al menos un 80 % de triglicéridos y otros compuestos, como por ejemplo glicéridos de diacilo, esteroles, etc. Además, la fracción ponderal de triglicéridos está constituida por aproximadamente un 95 % de ácidos grasos y un 5 % de glicerina.
La posibilidad de fermentar un microorganismo marino para la producción de PUFA sin regulación externa de valor de pH, en especial bajo condiciones que posibilitan un crecimiento rápido y un consumo de glucosa elevado, era completamente sorprendente. Precisamente bajo tales condiciones se llega muy rápidamente a una acidificación del medio, que conduce al ajuste del crecimiento, en la fermentación de microorganismos marinos sin correspondiente control de pH (véase ejemplo 1 y Wen, Z.Y. and Chen, F., 2003, Biotechnology Advances 21, 273-294).
Sorprendentemente, el procedimiento según la invención no requiere la adición de otros agentes estabilizadores del valor de pH. Según la invención se entiende por agentes estabilizadores de valor de pH tanto la adición de ácido o base de tanques de adición, regulada en dependencia del valor de pH que se ajusta durante el cultivo, como también el empleo de sistemas tampón en el propio medio, aunque los inventores no conozcan procedimientos de cultivo aplicables desde el punto de vista económico bajo empleo de sistemas tampón, como por ejemplo TRIS o tampón fosfato.
Según la invención, CaCO3 es el medio esencial para la estabilización del valor de pH. A pesar de ello, puede ser que la adición de ácido o base al cultivo bajo determinadas condiciones sea necesaria para el ajuste de un valor de pH. Tal adición está incluida por la invención, en tanto CaCO3 siga siendo el agente esencial para la estabilización de pH. A modo de ejemplo, si el valor de pH desciende por debajo de un determinado valor objetivo durante el cultivo debido a crecimiento de microorganismos especialmente rápido, este valor objetivo se puede ajustar a corto plazo mediante adición de ácido o base, sin que ésta adición sea el medio esencial para la regulación del valor de pH.
Los conceptos regulación de valor de pH y control de valor de pH, o bien estabilización de valor de pH, se emplean como sinónimos según la invención.
El agente esencial sigue siendo CaCO3 si la suma de diferencias de valores de pH, que se pueden medir con o sin adición de ácidos - en cada caso con la adición de CaCO3 según la invención -, es menor o igual a 1, preferentemente menor o igual a 0,75, de modo especialmente preferente menor o igual a 0,5, de modo muy especialmente preferente menor o igual a 0,2, y en la mayor parte de los casos preferentemente menor o igual a 0,1. Tal adición de ácidos o bases se considera una adición insignificante de ácidos y/o bases según la invención, que está incluida en la invención.
Son preferentes sistemas de cultivo que no requieren empleo de aditivos ácidos y/o básicos.
Además, muchos sistemas tampón alternativos son poco rentables frente al empleo de carbonato de calcio, debido a costes más elevados.
La alta eficacia de carbonato de calcio como tampón para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales es sorprendente, ya que el dióxido de carbono producido posee sólo una solubilidad limitada en agua, y de este modo la capacidad tampón desciende durante la fermentación.
Sorprendentemente, no sólo era posible la fermentación hasta consumo completo de glucosa, además aumentó también la fracción de PUFA en la biomasa significativamente en el caso de empleo del medio estabilizado carbonato de calcio según la invención. Es aún más sorprendente que la utilización de glucosa, y vinculada a la misma la producción de PUFA, se acelera y conduce de este modo a un rendimiento espacio-tiempo elevado.
Hasta la presente invención no había ningún proceso de fermentación conocido para la producción de ácidos grasos n3 en microorganismos de la especie Thraustochytriales bajo empleo de un medio de pH estabilizado con carbonato de calcio, pudiéndose prescindir de otros agentes estabilizadores del valor de pH.
Según la invención, PUFAs son ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados, con una longitud de cadena > C12, con al menos dos dobles enlaces. PUFAs obtenibles conforme al procedimiento según la invención son especialmente ácidos grasos n3 y ácidos grasos n6.
Se entiende por ácidos grasos n3 (ácidos grasos omega-3, ácidos grasos w3) ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, con una longitud de cadena > C12, con al menos dos o más dobles enlaces, estando constituido el primero de los dobles enlaces entre los átomos de carbono C3 y C4 partiendo del extremo alquilo. Por consiguiente, en el caso de ácidos grasos n6, el primer doble enlace se sitúa entre los átomos de carbono C6 y C7 partiendo del extremo alquilo.
Para la producción de PUFAs conforme al procedimiento según la invención entran en consideración microorganismos de la especie Thraustochytriales (Thraustochytriidea) (Lewis, T. E., Nichols, P. D., McMeekin, T. A., The Biotechnological Potential of Thraustochytrids, Marine Biotecnology, 1999, páginas 580-587 y Porter, D. Phylum Labyrinthulomycota en Handbook of protoctista: the structure, cultivation, habitats and life histories of the eukariotic microorganisms and their descendants exclusive of animals, plants and fungi: a guide to the algae, ciliates, foraminifera, sprorozoa, water molds, and other protoctists. Editores: Margulis, L, Corliss, J. O., Melkonian, M. and Chapman, D. J. editorial coordinator, McK-hann, H. I., Jones and Bartlett Publishers, ISBN 0-86720-052-9 1990, páginas 388-398). Son especialmente preferentes microorganismos de las especies Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium Althornia, Labyrinthuloides, Aplanochytrium y Ulkenia. En este caso son muy especialmente preferentes Schizochytrium, Thraustochytrium y Ulkenia. Son especialmente preferentes: Japonochytrium sp. ATCC 28207, Thraustochytrium aureum (en especial ATCC 28211, o bien ATTC 34304),
Thraustochytrium roseum ATCC 28210, Thraustochytrium sp. ATCC 20890, ATTC 20891, ATTC 20892 y ATTC 26185, Schizochytrium aggregatum ATTC 28209, Schizochytrium sp. ATCC 20888 y ATTC 20889, Schizochytrium SR21, así como Ulkenia spec. SAM 2179 y SAM 2180.
Microorganismos apropiados para el procedimiento según la invención son tanto formas de tipo salvaje, como también mutantes, y cepas derivadas de los mismos, así como cepas recombinantes de los correspondientes organismos. En medida especial la invención comprende mutantes o cepas recombinantes para el aumento de producción de PUFA.
Los microorganismos se cultivan mediante inoculado de un medio líquido o sólido con un cultivo previo de estos organismos.
Técnicas de cultivo apropiadas para microorganismos de la especie Thraustochytriales son convenientemente conocidas por el especialista. Típica, pero no exclusivamente, el cultivo se lleva a cabo por medio de fermentación acuosa en un correspondiente depósito. Los ejemplos de depósitos típicos para tal fermentación comprenden matraces vibratorios o bio-reactores, como por ejemplo STRs (stirred tank reactors) o columnas de burbujas. El cultivo se lleva a cabo típicamente a temperaturas entre 10ºC y 40ºC, preferentemente entre 20ºC y 35ºC, de modo especialmente preferente entre 25ºC y 30ºC, de modo muy especialmente preferente entre 27ºC y 29ºC, y en especial a 28 ± 0,5ºC.
En el ámbito de la presente invención, el contenido en carbonato de calcio del medio estabilizante de valor de pH corresponde a un valor en el intervalo de 3g/L a 15 g/L, preferentemente de 4 g/L a 12 g/L, y de modo especialmente preferente de 5 g/L a 10 g/L. Es muy especialmente preferente un contenido en carbonato de calcio de 7,5 ± 0,5 g/L.
El medio con valor de pH estabilizado comprende además, preferentemente, una o varias fuentes de carbono, así como una o varias fuentes de nitrógeno. Para el especialista son convenientemente conocidas substancias empleables como fuentes de carbono y nitrógeno para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales.
Fuentes de carbono empleables son, a modo de ejemplo, hidratos de carbono, como glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, fucosa, glucosamina, dextrano, ácido glutámico, melaza, glicerina o manitol, o también grasas y aceites, o hidrolizados vegetales.
Fuentes de nitrógeno naturales empleables son, a modo de ejemplo, peptona, extracto de levadura, extracto de malta, extracto de carne, aminoácidos casaminoácidos, agua viva de maíz o habas de soja, fuentes de nitrógeno orgánicas empleables son, a modo de ejemplo, glutamato y urea, pero también se pueden emplear fuentes de nitrógeno inorgánicas, como por ejemplo acetato amónico, hidrogenocarbonato amónico, sulfato amónico o nitrato amónico.
El medio con valor de pH estabilizado puede contener, además de carbonato de calcio, todos los demás componentes útiles para el especialista para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales, en especial sales inorgánicas, a modo de ejemplo de Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo o Zn. A modo de ejemplo cítense fosfatos, como dihidrogenofosfato potásico, o cloruros, como cloruro de magnesio, sulfatos, como sulfato amónico, sulfato de magnesio, sulfato de hierro o sulfato sódico. Otras sales inorgánicas empleables son, a modo de ejemplo, halogenuros, como bromuro potásico o yoduro potásico, e igualmente otros carbonatos, como por ejemplo hidrogenocarbonato sódico.
En caso dado, el medio puede comprender macro- y micronutrientes adicionales, como aminoácidos, purinas, pirimidinas, Corn Steep Liquor (agua viva de maíz), hidrolizados proteicos, vitaminas (hidrosolubles y/o insolubles en agua), y otros componentes del medio convenientemente conocidos por el especialista. Se pueden añadir agentes antiespumantes en caso necesario. El medio puede contener componentes complejos o estar definido químicamente.
La cantidad de componentes aislados puede variar en tanto no se presente un efecto negativo sobre el crecimiento o la productividad de microorganismos. El especialista puede determinar fácilmente la composición en el caso aislado correspondientemente a las necesidades del microorganismo. En general se añade la fuente de carbono en una concentración hasta 300 g/l y la fuente de nitrógeno en una concentración de 1 a 30 g/l. El contenido en nitrógeno se ajusta preferentemente en dependencia del contenido de carbono del medio.
Un medio con valor de pH estabilizado puede contener glucosa, extracto de levadura, agua viva de maíz (Corn Steep Liquor [CSL]), cloruro de magnesio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, sulfato sódico y fosfato potásico.
El valor de pH del medio se ajusta al comienzo de la fermentación a un intervalo de 3 a 10, preferentemente 4 a 8, de modo especialmente preferente 5 a 7, y de modo muy especialmente preferente aproximadamente 6, mediante adición de un correspondiente ácido o hidróxido.
A continuación se esteriliza el medio. Técnicas para la esterilización de medios son convenientemente conocidas por el especialista, a modo de ejemplo cítense tratamiento en autoclave y esterilización por filtración.
El cultivo se puede efectuar en régimen discontinuo, de alimentación discontinua o continuo, como es conocido generalmente por el especialista.
Un cultivo discontinuo o de alimentación discontinua se efectúa habitualmente durante 1 a 12 días, preferentemente 1 a 10 días, de modo especialmente preferente 3 a 9 días.
Los componentes de medio se pueden añadir al medio por separado o mezclados, también es concebible una mezcla elaborada previamente. Los componentes, en especial la(s) fuente(s) de carbono y nitrógeno, o determinados aditivos al medio, se pueden añadir antes o durante el cultivo. La adición se puede efectuar una vez, o reiteradamente, o también de manera continua.
Los PUFA producidos se presentan en general en forma de grasas neutras, por ejemplo como glicéridos de triacilo o lípidos polares, como por ejemplo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina o fosfatidilinositol.
Para los fines de la presente invención, bajo los conceptos PUFA, ácidos grasos n3 o productos activos n3, se entiende todas las posibles formas en las que se pueden presentar los correspondientes ácidos grasos, es decir, tanto como ácidos grasos libres, ésteres, triglicéridos, fosfolípidos, u otros derivados. Todas estas substancias se reúnen a continuación, y los conceptos se emplean como sinónimos. Por lo demás, los PUFAs se pueden hacer reaccionar mediante transesterificado químico o biocatalítico, a modo de ejemplo con ayuda de enzimas apropiados (lipasas), y concentrar, antes o después del aislamiento a partir del cultivo.
El aislamiento de PUFAs a partir de los microorganismos fermentados, o bien del medio, y el análisis del espectro de ácido graso se efectúa según procedimientos conocidos y habituales para el especialista (Wanasundara, U. N., Wanasundara, J., Shahidi, F., Omega-3 fatty acid concentrates: a review of production technologies, Seafoods-Quality, Technology and Nutraceutical Applications, 2002, páginas 157-174).
A continuación se describe el medio de fermentación con pH estabilizado, que motiva el procedimiento según la invención, por medio de algunos ejemplos y ejemplos comparativos. No obstante, el medio de fermentación, así como la invención, no están limitados a estos ejemplos.
Ejemplo 1: fermentación de Ulkenia spec. cepa SAM 2179 para la producción de PUFA en diferentes medios de cultivos con valor de pH estabilizado, exclusivamente mediante diferentes cantidades de CaCO3
Se cultivó Ulkenia spec. cepa SAM 2179 en matraces Erlenmeyer de 300 ml con un deflector en 50 mL de medio.
Composición de medio:
Medio de fermentación
glucosa 150 g/L
agua viva de maíz 3,75 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2SO4 1 g/L
MgCl2x6H2O 1 g/L
CaCl2x2H2O 0,3 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
Adición de CaCO3 por matraz de 50 mL: medio 1.1 0 g/L (comparación) medio 1.2 1 g/L (comparación) medio 1.3 2 g/L (comparación) medio 1.4 5 g/L
5 medio 1.5 10 g/L Se ajusta el valor de pH a 6,0 con NaOH y se trata en autoclave. Condiciones de cultivo:
Temperatura (ºC) 28 Velocidad de agitación (rpm): 150 10 Se efectuó la cosecha celular tras 96 horas de cultivo mediante centrifugado. A continuación se liofilizaron las células y se determinó la biomasa seca. Se efectuó disgregación de células y determinación de ácidos grasos mediante tratamiento térmico durante 2 horas en ácido clorhídrico metanólico al 10 % a 60ºC (bajo agitación). Los ésteres se analizaron entonces en cromatógrafo de gases para la determinación de la composición de ácidos grasos. 15 Tabla 1: parámetros de fermentación en dependencia de la concentración de carbonato de calcio
CaCO3 (g/L)
Consumo de glucosa (g/L) Valor de pH BTM (g/L) Area DHA (%) DHA/BTM (%) DHA (g/L) DHA-RZA (g/Lxd)
Medio 1.1
0 43,0 1,85 22,72 48,3 3,35 0,76 0,19
Medio 1.2
1 59,0 2,31 30,32 44,0 4,91 1,49 0,37
Medio 1.3
2 81,7 2,84 38,58 43,9 9,90 3,82 0,96
Medio 1.4
5 108,4 5,02 52,99 44,8 15,72 8,33 2,08
Medio 1.5
10 111,9 4,78 52,32 45,5 13,23 6,92 1,73
BTM: biomasa seca; DHA/BTM: % en peso de DHA (ácido docosahexaenoico) por unidad de peso BTM; g/lxd rendimiento espacio-tiempo en gramo por litro por día; RZA: rendimiento espacio-tiempo; área DHA (%) fracción de DHA en el espectro de ácido graso
La fermentación de Ulkenia spec. SAM 2179 en el medio de fermentación sin suficiente estabilización de pH conduce a una ralentización del consumo de glucosa y al ajuste del crecimiento en el transcurso de la fermentación, debido a un fuerte descenso del valor de pH (véase medio 1.1 - 1.3). Sólo cantidades mayores de tampón CaCO3
20 conducen a una estabilización del valor de pH durante el cultivo (medio 1.4 y 1.5). En este caso, con concentración de CaCO3 creciente se llega también a un consumo de glucosa elevado durante el cultivo. Debido a la estabilización del valor de pH, y al consumo de glucosa elevado relacionado con la misma, se alcanzan valores de biomasa más elevados, y como resultado de los mismos también rendimientos DHA-espacio-tiempo más elevados, que se sitúan en aproximadamente 2g/Lxd bajo las condiciones experimentales indicadas anteriormente.
25 Ejemplo 2: fermentación de Ulkenia spec. cepa SAM 2179 para la producción de PUFA en diferentes medios de cultivos con valor de pH estabilizado, exclusivamente mediante diferentes cantidades de CaCO3, hasta limitación de glucosa
Se cultivó Ulkenia spec. cepa SAM 2179 en matraces Erlenmeyer de 300 ml con un deflector en 50 mL de medio hasta consumo completo de glucosa.
Composición de medio:
Medio de fermentación glucosa 150 g/L agua viva de maíz 3,75 g/L
5 KH2PO4 3 g/L
Na2SO4 1 g/L
MgCl2x6H2O 1 g/L
CaCl2x2H2O 0,3 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
10 Adición de CaCO3 por matraz de 50 mL: medio 1.4 5 g/L medio 1.5 10 g/L
Se ajusta el valor de pH a 6,0 con NaOH y se trata en autoclave. Condiciones de cultivo: 15 Temperatura (ºC) 28 Velocidad de agitación (rpm): 150 Se efectuó la cosecha celular tras 144,5 horas de cultivo mediante centrifugado. A continuación se liofilizaron las células y se determinó la biomasa seca. Se efectuó disgregación de células y determinación de ácidos grasos mediante tratamiento térmico durante 2 horas en ácido clorhídrico metanólico al 10 % a 60ºC (bajo agitación). Los
20 ésteres se analizaron entonces en cromatógrafo de gases para la determinación de la composición de ácidos grasos. Tabla 2: parámetros de fermentación tras limitación de glucosa
CaCO3 (g/L)
Consumo de glucosa (g/L) Valor de pH BTM (g/L) Area DHA (%) DHA/BTM (%) DHA (g/L) DHA-RZA (g/Lxd)
Medio 1.4
5 150,0 6,49 58,52 47,7 22,20 12,99 2,14
Medio 1.5
10 150,0 6,58 64,65 46,7 20,54 13,28 2,19
La fermentación de Ulkenia spec. SAM 2179 en medio tamponado con 5 g/L, o bien 10 g/L de CaCO3, posibilita un
25 cultivo hasta limitación de glucosa, sin fuerte reducción del valor de pH. La biomasa alcanzable en este caso y la fracción de DHA por biomasa son, con aproximadamente 58-64 g/L de biomasa y un 20-22 % de DHA/BTM, muy elevadas correspondientemente al consumo completo de glucosa. En este caso se muestra que la concentración de CaCO3 más elevada (10 g/L) conduce a una mayor biomasa, pero la fracción de PUFA DHA esencial por biomasa desciende en cierta medida frente a la concentración más reducida de CaCO3 (5 g/L). Sin embargo, el rendimiento
30 espacio-tiempo en DHA conseguido en este caso sigue siendo aproximadamente igual a ambas concentraciones.
Ejemplo 3: cultivo de Ulkenia spec. cepa SAM 2179 para la producción de PUFA bajo condiciones de fermentación optimizadas
Se cultivó Ulkenia spec. cepa SAM 2179 en matraces Erlenmeyer de 300 ml con un deflector en 50 mL de medio hasta consumo completo de glucosa. La optimización de la fermentación resultó de una concentración de CaCO3 de 7,5 g/L y un cultivo previo modificado. Para el cultivo previo, en lugar de un cultivo estático en medio DH1 se empleó un cultivo agitado con el mismo medio (48 h, 150 rpm y 28ºC).
5 Composición de medio:
Medio de cultivo previo: medio DH1 monohidrato de glucosa (g/l): 56,25 extracto de levadura (g/l): 12,5 [Difco] Tropic Marin (g/l): 16,65 [Dr. Biener GmbH, Wartenberg, Alemania]
10 valor de pH ajustado a 6,0 con HCl
Medio de fermentación: glucosa 150 g/L agua de manantial de maíz 3,75 g/L
KH2PO4 3 g/L
15 Na2SO4 1 g/L
MgCl2x6H2O 1 g/L
CaCl2x2H2O 0,3 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L
Adición de CaCO3 por matraz de 50 mL: medio 1.6 7,5 g/L
20 Se ajusta valor de pH a 6,0 con NaOH y se trata en autoclave.
Condiciones de cultivo: Temperatura (ºC): 28 Velocidad de agitación (rpm): 150
Se efectuó la cosecha celular tras 99,75 horas de cultivo mediante centrifugado. A continuación se liofilizaron las
25 células y se determinó la biomasa seca. Se efectuó disgregación de células y determinación de ácidos grasos mediante tratamiento térmico durante 2 horas en ácido clorhídrico metanólico al 10 % a 60ºC (bajo agitación). Los ésteres se analizaron entonces en cromatógrafo de gases para la determinación de la composición de ácidos grasos.
Tabla 3: parámetros de fermentación bajo condiciones tampón optimizadas
CaCO3 (g/L)
Consumo de glucosa (g/L) Valor de pH BTM (g/L) Area DHA (%) DHA/BTM (%) DHA (g/L) DHA-RZA (g/Lxd)
Medio 1.6
7,5 150,0 6,76 63,84 44,1 23,06 14,72 3,54
Mediante el empleo de condiciones de fermentación optimizadas, en las que se cultivó Ulkenia spec. SAM 2179 en primer lugar 48 h a 28ºC y 150 rpm en medio DH1, el rendimiento espacio-tiempo en DHA se pudo mejorar considerablemente a más de 3,5 g/Lxd. Esto resulta en primer término de un crecimiento más rápido, consiguiéndose la limitación de glucosa en menos de 100 h. El empleo de 7,5 g/L de CaCO3 en el medio de 5 fermentación posibilita una estabilización de pH necesaria para el cultivo óptimo. El empleo de 7,5 g de CaCO3 se infirió de los resultados del ejemplo 2, en los que 10 g/L de CaCO3 dieron por resultado valores de biomasa más elevados, aunque 5 g/L de CaCO3 condujeron a mejores valores de DHA. Por consiguiente, se supuso una concentración de CaCO3 óptima para la producción de DHA (es decir, biomasa lo más elevada posible con contenido en DHA lo más elevado posible) entre 5 y 10 g/L de CaCO3. Además de la estabilización del valor de pH,
10 el empleo del medio de fermentación descrito conduce a un rendimiento espacio tiempo en DHA sorprendentemente elevado, de más de 3 g/Lxd en el momento de la limitación de glucosa. En este caso se alcanzaron valores de biomasa similares a los del ejemplo 2, pero además la fracción de DHA por biomasa seca y las cantidades de DHA conseguidas (más de un 10 %) eran mayores.
Ejemplo 4: fermentación de Ulkenia spec. cepa SAM 2179 para la producción de PUFA en medio de cultivo con y 15 sin estabilización de pH a través de CaCO3
Se cultivó Ulkenia spec. cepa SAM 2179 en un fermentador de 5 L hasta consumo completo de glucosa.
Composición de medio:
Medio de fermentación
glucosa 150 g/L
20 agua viva de maíz 3,75 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2SO4 1 g/L
MgCl2x6H2O 1 g/L
CaCl2x2H2O 0,3 g/L
25 (NH4)2SO4 5 g/L
Para la fermentación con control de pH: ajuste de valor de pH a 4,0 con H3PO4 y tratamiento en autoclave.
Para la fermentación sin control de pH: ajuste de valor de pH a 6,0 con NaOH y tratamiento en autoclave, así como adición de 7,5 g/L de CaCO3
Condiciones de cultivo:
30 Temperatura (ºC) 28
Ventilación: 0,8 vvm
Fermentación con y sin control de pH
Tabla 4: parámetros de fermentación con y sin control de pH El empleo del medio de fermentación estabilizado mediante CaCO3 posibilita un cultivo de Ulkenia spec. SAM 2179 hasta limitación de glucosa, sin control de pH, también en a escala de fermentación de 5 L. El empleo de CaCO3 en cantidad suficiente conduce a un crecimiento más rápido como consecuencia de un consumo de glucosa acelerado. Además se consigue una biomasa superior. Además, en este contexto se alcanza una fracción de DHA por biomasa acrecentada y mayores cantidades de DHA durante la fermentación. Esto conduce a un aumento considerable del rendimiento espacio-tiempo en DHA de más de un 15 % en el caso de fermentación tamponada con CaCO3 frente a fermentación controlada por pH.
Control de pH
CaCO3 (g/L) Consumo de glucosa (g/L) Momento del consumo de glucosa (h) BTM (g/L) Area DHA (%) DHA/BTM (%) DHA (g/L) DHA-RZA (g/Lxd)
+
0 150,0 162 66,9 47,2 25,9 17,35 2,5
-
7,5 150,0 150 67,8 46,7 26,9 18,30 2,9
Ejemplo 5: fermentación de Schizochytrium spec. SR21 para la producción de PUFA en medio de fermentación 1.6
estabilizado por medio de 7,5 g/L de CaCO3 Se cultivó Schizochytrium spec. Stamm SR21 en matraces Erlenmeyer de 300 ml con un deflector en 50 mL de medio hasta consumo de glucosa completo.
Composición de medio:
medio de cultivo previo: medio GY
glucosa (g/l): 30,0
extracto de levadura (g/l): 10,0 [Difco]
Tropic Marin (g/l): 16,65 [Dr. Biener GmbH, Wartenberg, Alemania]
valor de pH ajustado a 6,0 con HCl Medio de fermentación:
glucosa 150 g/L
agua viva de maíz 3,75 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2SO4 1 g/L
MgCl2x6H2O 1 g/L
CaCl2x2H2O 0,3 g/L
(NH4)2SO4 5 g/L Adición de CaCO3 por matraz de 50 mL: medio 1.6 7,5 g/L Se ajusta valor de pH a 6,0 con NaOH y se trata en autoclave. Condiciones de cultivo:
Temperatura (ºC): 28
Velocidad de agitación (rpm): 150 Se efectuó la cosecha celular tras 96 horas de cultivo mediante centrifugado. A continuación se liofilizaron las células y se determinó la biomasa seca. Se efectuó disgregación de células y determinación de ácidos grasos mediante tratamiento térmico durante 2 horas en ácido clorhídrico metanólico al 10 % a 60ºC (bajo agitación). Los ésteres se analizaron entonces en cromatógrafo de gases para la determinación de la composición de ácidos grasos.
Tabla 5: parámetros de fermentación bajo condiciones tampón optimizadas
CaCO3 (g/L)
Consumo de glucosa (g/L) Valor de pH BTM (g/L) Area DHA (%) DHA/BTM (%) DHA (g/L) DHA-RZA (g/Lxd)
SR 21
7,5 150,0 7,35 66,12 34,4 15,28 10,10 2,52
El empleo del medio con pH estabilizado por medio de CaCO3 descrito en la invención conduce a una optimización de la producción de PUFA también en el caso de otros organismos de Labyrinthulomycota. A modo de ejemplo se
5 puede fermentar el microorganismo Schizochytrium spec. cepa SR21 en el medio descrito. El rendimiento espaciotiempo de PUFA, DHA esenciales en SR 21 es algo menor que en Ulkenia sp. SAM 2179 (véase ejemplo 3), pero se sitúa por encima de un 15 % (w/w) de la biomasa seca total, referido a PUFA DHA n-3 esenciales. Este ejemplo muestra que el empleo de medio optimizado con pH estabilizado, que motiva la invención, posibilita una fermentación sin control de pH para la producción de PUFAs también en otros miembros de Labyrinthulomycota.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Procedimiento para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytriales, caracterizado porque los microorganismos se cultivan en un medio de fermentación que presenta CaCO3 como medio esencial para la estabilización del valor de pH, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de fermentación, siendo entonces CaCO3 un medio esencial para la estabilización del valor de pH si la suma de diferencias de valores de pH, que se pueden medir con o sin adición de ácidos, - en cada caso con la adición de CaCO3 según la invención - es menor o igual a 1.
  2. 2.-Procedimiento según la reivindicación 1, dando los microorganismos una producción de más de un 25, preferentemente de más de un 35, y de modo muy especialmente preferente de más de un 45 % en peso de aceite por unidad ponderal de biomasa seca.
  3. 3.-Procedimiento según la reivindicación 1, dando los microorganismos una producción de más de un 10, preferentemente de más de un 14, de modo especialmente preferente de más de un 18, y de modo muy especialmente preferente de más de un 22 % en peso de ácido docosahexenoico (DHA) por unidad ponderal de biomasa seca.
  4. 4.-Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, dando los microorganismos una producción de más de un 1 %, preferentemente más de un 2 %, de modo especialmente preferente más de un 3 %, y de modo muy especialmente preferente de más de un 4 % de ácido docosapentanoico (DHA) por biomasa seca.
  5. 5.-Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, añadiéndose al medio 3 g/L a 15 g/L, preferentemente 4 g/L a 12 g/L, de modo especialmente preferente 5 g/L a 10 g/L, y de modo muy especialmente preferente 7,5 ± 0,5 g/L de CaCO3.
  6. 6.-Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio comprende glucosa, agua viva de maíz, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, carbonato de calcio, sulfato sódico, sulfato amónico e hidrogenofosfato potásico.
  7. 7.-Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el medio presenta un valor de pH entre 3 y 10, preferentemente entre 5 y 7.
  8. 8.-Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se efectúa entre 10ºC y 40ºC, preferentemente entre 25ºC y 35ºC.
  9. 9.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se efectúa durante 1 a 10 días, preferentemente durante 3 a 9 días.
  10. 10.-Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el microorganismo pertenece a la especia Schizochytrium, Thraustochytrium o Ulkenia.
  11. 11.-Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el microorganismo es Ulkenia spec. SAM 2179.
  12. 12.-Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el microorganismo es Schizochytrium spec. SR 21.
  13. 13.- Empleo de un medio de cultivo que comprende como agente esencial para la estabilización del valor de pH CaCO3, que se presenta con un contenido de 3-15 g/l en el medio de cultivo, para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochyriales.
ES04803117T 2003-11-10 2004-11-10 Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales Active ES2387305T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10352837A DE10352837A1 (de) 2003-11-10 2003-11-10 Prozess zur Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Thraustochytriales
DE10352837 2003-11-10
PCT/EP2004/012715 WO2005045050A1 (de) 2003-11-10 2004-11-10 Prozess zur kultivierung von mikroorganismen der gattung thraustochytrieales

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2387305T3 true ES2387305T3 (es) 2012-09-20

Family

ID=34559599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04803117T Active ES2387305T3 (es) 2003-11-10 2004-11-10 Proceso para el cultivo de microorganismos de la especie Thraustochytrieales

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8889382B2 (es)
EP (1) EP1685255B1 (es)
JP (1) JP4791366B2 (es)
KR (1) KR101159869B1 (es)
CN (2) CN1914327A (es)
AT (1) ATE556143T1 (es)
AU (1) AU2004287953B2 (es)
BR (1) BRPI0416362A (es)
CA (1) CA2545416C (es)
DE (1) DE10352837A1 (es)
EA (1) EA011877B1 (es)
ES (1) ES2387305T3 (es)
IL (1) IL175521A (es)
PL (1) PL1685255T3 (es)
SG (1) SG148156A1 (es)
WO (1) WO2005045050A1 (es)
ZA (1) ZA200603855B (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008036654A2 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Algal medium chain length fatty acids and hydrocarbons
ITMI20061843A1 (it) * 2006-09-27 2008-03-28 Immobiliare G M S R L Formulazioni di medium colturali idonei alla applicazione industriale
EP2084290B1 (en) * 2006-10-27 2012-05-02 Lonza AG Production of omega-3 fatty acids in microflora of thraustochytriales using modified media
JP5219390B2 (ja) * 2007-03-19 2013-06-26 学校法人立命館 微生物培養用培地及び微生物製剤
EP2071019A1 (en) * 2007-12-15 2009-06-17 Lonza AG Method for the cultivation of microoranisms of the order thraustochytriales
JP5709196B2 (ja) * 2009-01-09 2015-04-30 国立大学法人山梨大学 油脂生産菌の培養方法
EP2401386A4 (en) * 2009-02-25 2013-03-13 Vb Medicare Pvt Ltd IMPROVED METHODS FOR THE FERMENTATIVE MANUFACTURE OF DOCOSAHEXAENIC ACID
CN103649313B (zh) * 2011-03-07 2017-10-24 Dsm营养产品股份公司 工程化破囊壶菌属微生物
EP3978597A1 (en) * 2011-07-13 2022-04-06 Alltech, Inc. Algal lipid compositions and methods of preparing and utilizing the same
CN102911868B (zh) * 2012-09-28 2015-12-09 新奥科技发展有限公司 一种微生物培养基及培养方法
BR112017002791B1 (pt) * 2014-05-22 2024-03-05 MARA Renewables Corporation Método para a produção de óleo em micro-organismos
CZ307271B6 (cs) 2014-08-26 2018-05-09 Vysoká škola chemicko - technologická v Praze Způsob kultivace mořských protistů, zejména mikroorganismů rodu Thraustochytriales, na médiu obsahujícím odpadní solný roztok z demineralizace sladké mléčné syrovátky

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0113183A1 (en) * 1982-12-01 1984-07-11 Thomas Anthony Carson Fermentation method and composition for use therein
JPH01247079A (ja) * 1988-03-28 1989-10-02 Nec Corp 培地のｐＨ調整方法
US5407957A (en) 1990-02-13 1995-04-18 Martek Corporation Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates
JPH08196288A (ja) * 1995-01-30 1996-08-06 Kaiyo Bio Technol Kenkyusho:Kk 長鎖脂肪酸の製造法
EP0823475B1 (en) * 1995-04-17 2009-06-17 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Novel microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms
JP2764572B2 (ja) * 1995-04-17 1998-06-11 工業技術院長 ドコサヘキサエン酸生産能を有する新規微生物及びそれを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法
CA2261231C (en) 1996-07-23 2012-11-27 Nagase Biochemicals, Ltd. Process using ulkenia sp. to prepare docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007512809A (ja) 2007-05-24
CN104195186A (zh) 2014-12-10
KR101159869B1 (ko) 2012-06-25
US8889382B2 (en) 2014-11-18
KR20070042114A (ko) 2007-04-20
WO2005045050A1 (de) 2005-05-19
EP1685255A1 (de) 2006-08-02
CA2545416C (en) 2014-02-25
PL1685255T3 (pl) 2012-12-31
ATE556143T1 (de) 2012-05-15
IL175521A0 (en) 2006-09-05
AU2004287953B2 (en) 2010-04-29
BRPI0416362A (pt) 2007-03-13
CA2545416A1 (en) 2005-05-19
DE10352837A1 (de) 2005-07-07
AU2004287953A1 (en) 2005-05-19
ZA200603855B (en) 2007-10-31
EP1685255B1 (de) 2012-05-02
EA200600952A1 (ru) 2007-02-27
IL175521A (en) 2011-12-29
SG148156A1 (en) 2008-12-31
JP4791366B2 (ja) 2011-10-12
EA011877B1 (ru) 2009-06-30
US20070141686A1 (en) 2007-06-21
CN1914327A (zh) 2007-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2004287954B2 (en) Method for the cultivation of microorganisms of the genus Thraustochytriales by using an optimized low salt medium
ZA200603855B (en) Process for the cultivation of microorganisms of the genus traustochytriales
Chen et al. Growing phototrophic cells without light
Ratledge Microbial oils: an introductory overview of current status and future prospects
US7989195B2 (en) Heterotrophic algal high cell density production method and system
CN102037130A (zh) 使用网粘菌目微生物来生产含有pufa的油的方法
Min et al. The effects of culture condition on the growth property and docosahexaenoic acid production from Thraustochytrium aureum ATCC 34304
ES2387680T3 (es) Método de cultivo de hongos
JP5278891B2 (ja) 高度不飽和脂肪酸の生産蓄積性を有する形質転換微生物
MXPA06005301A (es) Procedimiento para el cultivo de microorganismos del genero thraustochytriales
MXPA06005296A (es) Metodo para el cultivo de microorganismos del genero traustoquitriales a traves del uso de un medio bajo en sal optimizado
JP2023047453A (ja) ラビリンチュラ類の培養方法
Khosravi‐Darani et al. Production of Single‐Cell Oil Containing Omega‐3 and Omega‐6 Fatty Acids
Tredici G. Chini Zittelli, F. Lavista, A. Bastianini, L. Rodolfi, M. Vincenzini