KR101159869B1 - 트라우스토키트리알레스(Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ)속의 미생물을 배양하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 탄산칼슘을 사용하여 pH-안정화되고 3 내지 15g/L의 CaCO3를 포함하는 발효 배지 내에서, 스트라메노필레스 군(群)에 속하는 미생물을 배양하고, 여기에서 미생물 및/또는 배지로부터 PUFA를 분리하여서 되는 PUFA의 생산을 위한 최적화된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 서로 다른 CaCO3 함량을 갖는 신규한 최적화된 배지에 관한 것이다. 바이오매스 내의 증가된 오일 함량으로 더 많은 양의 DHA가 수득될 수 있는 반면, 적당량의 CaCO3를 사용함으로써 발효하는 동안 공정이 상당히 단순화될 수 있다. 그들은 스트라메토필레스에 속하는 미생물들이 pH 조절 없이 발효될 수 있게 하며, 이에 따라 PUFA 생산을 실질적으로 향상시키고 상당히 단순화시킨다.
Description
서로 다른 PUFAs (polyunsaturated fatty acids) 및 특히 오메가-3 지방산(n-3 지방산)은 인간의 영양 공급에 필수적인 성분들이다.
그러나, 대다수의 산업화 국가들에서 n-3 지방산의 공급이 불충분한 것으로 알려져 있다. 이와는 대조적으로, 포화 지방산과 n-6 지방산의 섭취뿐만 아니라 음식물에 있는 지방질의 전체 비율도 너무 높다. 이것은 우리의 음식물 구성의 변화 때문인데, 특히 이러한 변화는 최근 약 150년 동안 일어났으며, 예를 들면, 심혈관 질환-산업화 국가에서의 주요 사망원인-과 같은 문명화에 따른 다양한 만성질환의 출현과 관련되어 있다 (Smapopulos, A.P., 1999, Am.J.Clin.Nutr.70,560-569). 한편, 많은 연구들이 n-3 지방산, 특히 에이코사펜타에노산 (EPA) 및 도코사헥사엔산 (DHA) 섭취를 목표되게 증가시킴으로써, 심혈관계 위험을 상당히 감소시킬 수 있음을 보여준다 (GISSI-Prevenzione Investigatrrors (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico), 1999, Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: 43aults or the GISSI-prevenzione trial,, Lancet 354, 447-455; Burr et al., 1989, Effects of changes in fat, fish, and fiver intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction tral(DART). Lancet 2, 757-761). 따라서, 서로 다른 많은 기구들 (WHO, FAO, AHA, ISSFAL, British Nutrition Foundation, etc.)은 n-3 지방산 섭취를 매우 늘릴 것을 추천한다 (Kris-Eherton et al., Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease. Circulation 2002, 2747-2757).
PUFAs 및, 특히 n-3 지방산의 생산 원료는 무엇보다도 해양 냉수종 어류 및 이들로부터 추출된 오일 (oil)이며, 뿐만 아니라 어류에 비해 효율적인 비용 및 조절된 조건 하에 PUFA의 생산에 대해 발효체로 사용될 수 있는 이점을 가진 해양 미생물들이다. 발효 생산은, 어류 또는 이들로부터 추출된 오일에 대해 종종 설명되는 바와 같이 어떠한 오염 위험도 일으키지 않는다 (Olsen SF. Int F Epidemiol. 2001:1279-80). 게다가, 상기 추출된 오일의 성분은 유기체의 선택 및 배양 조건의 선택에 따라 긍정적인 영향을 받을 수 있으나, 어류 및 어류 산물에 대해서도 설명되는 바와 같이 계절의 영향을 받지는 않는다 (Gamez-Meza et al. Lipids 1999:639-42).
n-3 PUFA의 생산에 적당한 미생물에는, 예를 들면, 비브리오 속 (예: Vibrio marinus)의 박테리아 또는 디노플라겔라테스 (Dinophyta) 중 어느 하나, 특히 C. 코니 (C. cohnii)와 같은 크립테코디니움 (Crypthecodinium) 속, 또는 핑귀오피세아에 (Pinguiophyyceae)와 같은 스트라메노필레스 (Stramenopoles) 중 어느 하나, 예를 들면 글로소마스틱스 (Glossomastix), 파이오마나스 (Phaeomonas), 핑귀오크리시스 (Pinguiochrysis), 핑귀오코커스 (Pinguiococcus) 및 폴리도크리시스 (Polydochrysis)와 같은 것들이 있다. PUFA의 발효 생산을 위해 바람직한 미생물에는 스트라메노필레스 (또는 라비린툴라문 (Labyrinthulomycota)), 특히 트라우스토키트리알레스 (트라우스키트리이데아) 목 (目), 거기에 또한, 특히 쟈포노키트리움 (Japonochytrium), 치조키트리움 (Schizochytrium), 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium), 알토르니아 (Althornia), 라비린툴로이데스 (Labyrinthuloides), 아플라노키트리움 (Aplanochytrium) 및 울케니아 (Ulkenia) 속들이 속한다.
전술한 미생물들 중 몇몇은 지방산의 공업적 생산에 사용될 수 있음이 알려져 있으며, 상응하는 공정들이 설명되어 있다. 따라서, 국제특허출원 WO 91/07498 A1은 치조키트리움 및 트라우스토키트리움 속의 유기체를 사용한 PUFA의 생산을 개시하고 있다. WO 91/11918 A1은 크립테코테니움 코니를 사용한 PUFAs의 생산을 개시하고 있으며, WO 98/03671은 울케니아 속의 미생물을 사용한 PUFAs의 생산을 개시하는 한편, WO 96/33263 A1 및 대응 유럽특허출원 EP 0 823 475 A1은 치조키트리움 속의 미생물을 사용한 PUFAs의 생산을 개시하고 있다.
전술한 미생물 및 특히 라비린툴라문의 천연 서식지는 해양이다. 따라서, 이러한 미생물은 보통 염(salt)을 포함하는 배지에서 배양되는데, 이때, 본 발명의 목적을 위해, 해수의 염 함량은 32-35 g/L이고 나트륨과 염소의 함량이 90-95 %인 것으로 정의된다. 트라우스토키트리움 또는 치조키트리움과 같은 해양 미생물의 배양을 위한 전형적인 배지는 해수를 기초로 한다 (예를 들면, ATTC (American Type Culture Collection) 790 By + medium [효모 추출물 1.0g, 펩톤 1.0g, D+글루코오스 5.0g, 해수 1L]). 그러나, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 매우 낮은 염분을 갖는 배양 배지에서도 생존할 수 있다고 알려져 있다. 하지만, 7.5-15 ‰의 염분에 상응하는 7.5-15 g salt/L의 한계 이하에서는 이들의 성장이 매우 저조할 뿐이며 낮은 염분 범위에서 중간 최대 수치가 없는 것으로 설명되어 있다. 최적의 성장률은 상기 언급한 염분 한계 이상에서만 이루어진다 (Fan et al. Botanica Marina 45, 2002, pp. 50-57).
그러나, 대다수의 산업화 국가들에서 n-3 지방산의 공급이 불충분한 것으로 알려져 있다. 이와는 대조적으로, 포화 지방산과 n-6 지방산의 섭취뿐만 아니라 음식물에 있는 지방질의 전체 비율도 너무 높다. 이것은 우리의 음식물 구성의 변화 때문인데, 특히 이러한 변화는 최근 약 150년 동안 일어났으며, 예를 들면, 심혈관 질환-산업화 국가에서의 주요 사망원인-과 같은 문명화에 따른 다양한 만성질환의 출현과 관련되어 있다 (Smapopulos, A.P., 1999, Am.J.Clin.Nutr.70,560-569). 한편, 많은 연구들이 n-3 지방산, 특히 에이코사펜타에노산 (EPA) 및 도코사헥사엔산 (DHA) 섭취를 목표되게 증가시킴으로써, 심혈관계 위험을 상당히 감소시킬 수 있음을 보여준다 (GISSI-Prevenzione Investigatrrors (Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto miocardico), 1999, Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: 43aults or the GISSI-prevenzione trial,, Lancet 354, 447-455; Burr et al., 1989, Effects of changes in fat, fish, and fiver intake on death and myocardial reinfarction: diet and reinfarction tral(DART). Lancet 2, 757-761). 따라서, 서로 다른 많은 기구들 (WHO, FAO, AHA, ISSFAL, British Nutrition Foundation, etc.)은 n-3 지방산 섭취를 매우 늘릴 것을 추천한다 (Kris-Eherton et al., Fish Consumption, Fish Oil, Omega-3 Fatty Acids, and Cardiovascular Disease. Circulation 2002, 2747-2757).
PUFAs 및, 특히 n-3 지방산의 생산 원료는 무엇보다도 해양 냉수종 어류 및 이들로부터 추출된 오일 (oil)이며, 뿐만 아니라 어류에 비해 효율적인 비용 및 조절된 조건 하에 PUFA의 생산에 대해 발효체로 사용될 수 있는 이점을 가진 해양 미생물들이다. 발효 생산은, 어류 또는 이들로부터 추출된 오일에 대해 종종 설명되는 바와 같이 어떠한 오염 위험도 일으키지 않는다 (Olsen SF. Int F Epidemiol. 2001:1279-80). 게다가, 상기 추출된 오일의 성분은 유기체의 선택 및 배양 조건의 선택에 따라 긍정적인 영향을 받을 수 있으나, 어류 및 어류 산물에 대해서도 설명되는 바와 같이 계절의 영향을 받지는 않는다 (Gamez-Meza et al. Lipids 1999:639-42).
n-3 PUFA의 생산에 적당한 미생물에는, 예를 들면, 비브리오 속 (예: Vibrio marinus)의 박테리아 또는 디노플라겔라테스 (Dinophyta) 중 어느 하나, 특히 C. 코니 (C. cohnii)와 같은 크립테코디니움 (Crypthecodinium) 속, 또는 핑귀오피세아에 (Pinguiophyyceae)와 같은 스트라메노필레스 (Stramenopoles) 중 어느 하나, 예를 들면 글로소마스틱스 (Glossomastix), 파이오마나스 (Phaeomonas), 핑귀오크리시스 (Pinguiochrysis), 핑귀오코커스 (Pinguiococcus) 및 폴리도크리시스 (Polydochrysis)와 같은 것들이 있다. PUFA의 발효 생산을 위해 바람직한 미생물에는 스트라메노필레스 (또는 라비린툴라문 (Labyrinthulomycota)), 특히 트라우스토키트리알레스 (트라우스키트리이데아) 목 (目), 거기에 또한, 특히 쟈포노키트리움 (Japonochytrium), 치조키트리움 (Schizochytrium), 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium), 알토르니아 (Althornia), 라비린툴로이데스 (Labyrinthuloides), 아플라노키트리움 (Aplanochytrium) 및 울케니아 (Ulkenia) 속들이 속한다.
전술한 미생물들 중 몇몇은 지방산의 공업적 생산에 사용될 수 있음이 알려져 있으며, 상응하는 공정들이 설명되어 있다. 따라서, 국제특허출원 WO 91/07498 A1은 치조키트리움 및 트라우스토키트리움 속의 유기체를 사용한 PUFA의 생산을 개시하고 있다. WO 91/11918 A1은 크립테코테니움 코니를 사용한 PUFAs의 생산을 개시하고 있으며, WO 98/03671은 울케니아 속의 미생물을 사용한 PUFAs의 생산을 개시하는 한편, WO 96/33263 A1 및 대응 유럽특허출원 EP 0 823 475 A1은 치조키트리움 속의 미생물을 사용한 PUFAs의 생산을 개시하고 있다.
전술한 미생물 및 특히 라비린툴라문의 천연 서식지는 해양이다. 따라서, 이러한 미생물은 보통 염(salt)을 포함하는 배지에서 배양되는데, 이때, 본 발명의 목적을 위해, 해수의 염 함량은 32-35 g/L이고 나트륨과 염소의 함량이 90-95 %인 것으로 정의된다. 트라우스토키트리움 또는 치조키트리움과 같은 해양 미생물의 배양을 위한 전형적인 배지는 해수를 기초로 한다 (예를 들면, ATTC (American Type Culture Collection) 790 By + medium [효모 추출물 1.0g, 펩톤 1.0g, D+글루코오스 5.0g, 해수 1L]). 그러나, 트라우스토키트리알레스 목의 미생물은 매우 낮은 염분을 갖는 배양 배지에서도 생존할 수 있다고 알려져 있다. 하지만, 7.5-15 ‰의 염분에 상응하는 7.5-15 g salt/L의 한계 이하에서는 이들의 성장이 매우 저조할 뿐이며 낮은 염분 범위에서 중간 최대 수치가 없는 것으로 설명되어 있다. 최적의 성장률은 상기 언급한 염분 한계 이상에서만 이루어진다 (Fan et al. Botanica Marina 45, 2002, pp. 50-57).
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발효공정에서 종종 일어나는 문제점은, 대사 산물의 출현 및/또는 각각의 배지 성분의 소비에 따라 배양 과정에서의 강한 pH의 변화로 인해 나타난다. 이는 특히 해양 미생물의 발효를 위해 염분이 풍부한 배지에서 적용된다. 이러한 이유 때문에, 발효는 종종 pH-조절 수단을 필요로 한다. 그러나, 큰 규모의 발효의 경우, pH 조절은 많은 추가 비용을 초래한다. 여기에서, 산과 염기를 추가하기 위해 추가의 저장 용기가 필요하며, 이 용기는 추가적인 성분의 공급을 위한 그 밖의 경우에도 사용될 수 있다. 게다가, pH 값을 조절하기 위한 적정 (titration)은 기술적으로 조절되어야만 한다. 생산적인 규모에서 PUFA를 얻기 위한 라비린툴로미코타의 발효와 관련하여, 최신기술에서는 pH 값이 조절된 배양 방법들이 이용되고 있다.
그러나, 세포 배양에서 완충 시스템 또는 다른 통상의 방법을 통해 pH 값을 조절하는 것은 단점을 가진다. 따라서, 예를 들면 TRIS, HEPES 및 MOPS의 완충능은 이들의 pKa 값이 7 이상이기 때문에 PUFA 발효에 필요한 pH 범위에 불충분하다. 또한, TRIS는 7.5 이하의 pH 범위에서는 불량한 완충제로서, 잠재적 활성이 있는 1차 아민이며 다양한 생물학적 반응에 활발하게 참여할 수 있다. 또한 종종 사용되는 완충제인 인산 완충액은 이가(二價) 양이온의 존재하에 용액이 침전되는 특징을 가지고 있어, 인산을 필요로 하거나 소비하는 발효공정에 대해서는 더욱 해로운 선택이다. 아세테이트 완충제는 완충 범위가 좁고, 발효공정 동안에 대사되기 때문에 적합하지 않다. 게다가, 많은 대체 완충 시스템들은 높은 비용 때문에 경제적이지 않다.
그러므로, 최신 기술의 측면에서, 본 발명의 목적은 해양 미생물들에 대한 새롭고, 단순하며 경제적인 배양 수단을 제공하는 것이다. 이에 따라 공정 제어의 상당한 단순화가 이루어진다. 비용의 효율 이외에도, 상기 방법은 고순도 PUFA의 고수율 생산을 가능하게 한다.
그러나, 이러한 과제와 명료하게 기재되지 않은 과제들도, 본 발명의 도입부에서 논의한 관련성으로부터 곤란성 없이 유도하거나 추론할 수 있으며, 이는 본 발명의 청구항에 정의된 목적에 의해 달성된다.
트라우스토키트리알레스 목의 미생물들을 배양하기 위한 유리한 방법들은 청구항 제1항에 정의된 방법에 의해 제공된다. 이러한 방법은 CaCO3의 양이 3 내지 15 g/L 포함된 CaCO3만을 사용하여 안정화된 pH 값을 갖는 배지에 배양하며, 또한 필요에 따라 미생물 및/또는 배양 배지로부터 PUFA을 분리하는 것을 포함한다.
본 발명은 고순도의 PUFAs를 생산하는 방법을 더 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 PUFA는 DHA, DPA 및 EPA이다.
특히, 전술한 방법으로 배양된 미생물들은 건조 바이오매스당 10% 이상, 바람직하게는 14% 이상, 특히 바람직하게는 18% 이상의 DHA의 생산을 나타낸다.
특히, 전술한 방법으로 배양된 미생물들은 건조 바이오매스당 1% 이상, 바람직하게는 2% 이상, 특히 바람직하게는 3% 이상의 DPA의 생산을 나타낸다.
PUFAs는 배양 이후에 미생물 (바이오매스) 및/또는 배양 배지로부터 PUFAs를 분리함으로써 고순도 및 고수율로 수득된다.
더 나아가, 본 발명은 바이오매스를 생산하는 방법을 포함하는데, 여기에서 바이오매스는 본 발명에 따른 배양 방법에 의해 제공된다.
이러한 바이오매스는 생각할 수 있는 모든 방법으로 사용될 수 있다. 특히, 이러한 바이오매스는 예를 들어 건조 형태 (건조 바이오매스)로, 직접적으로 식료품 또는 동물의 사료로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 배양 방법을 수행하고, 미생물 및/또는 배양 배지로부터 오일을 분리하여 수득되는 오일 형태도 포함한다.
특히, 오일 형태는 다른 많은 바람직한 적용 이외에도, 인간의 영양 공급을 위해 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조건 하에, 이에 따른 미생물들은 건조 바이오매스의 중량 단위당 30 중량% 이상, 바람직하게는 35 중량% 이상의 오일 생산을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 오일은 적어도 70%의 중성 지질과 적어도 2%의 인지질 비율이며, 이는 당업자에게 트라우스토키트리알레스의 일반적인 지방산 스펙트럼에 상응하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 중성 지질은 적어도 80%의 트리글리세라이드 및 디아실글리세라이드, 스테롤 등과 같은 다른 화합물들로 구성되어 있다. 더 나아가, 트리글리세라이드 중량 분획은 약 95%의 지방산 및 5%의 글리세린을 포함한다.
극도의 pH 값 조절 없이, 특히 높은 글루코오스 소비로 빠른 성장을 가능하게 하는 조건 하에 PUFA의 생산을 위한 해양 미생물의 발효 가능성은 매우 놀라운 것이었다. 해양 미생물의 발효의 경우 이러한 조건 하에서는 적절한 pH 조절 부족이 매우 빠르게 배지를 산성화시키는 것이 명백하며, 이는 성장을 중단시킨다 (실시예 1 및 Wen, Z.-Y. and Chen,F., 2003, Biotechnology Advances 21, 273-294 참조).
놀랍게도, 본 발명에 따른 방법은 다른 pH 값 안정화 수단의 첨가 없이도 가능하다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, TRIS 또는 인산 완충액과 같은 완충 시스템을 사용하는 어떠한 경제적으로 개발가능한 배양 수단도 발명자들에게 알려져 있지 않았음에도 불구하고, pH 값 안정화 수단은 배양하는 동안 확립된 pH 값에 따라 조절되는 첨가 탱크로부터 산 또는 염기를 첨가하는 것, 그리고 배지 자체의 완충 시스템 사용 둘 다인 것으로 이해된다.
본 발명에 따르면, CaCO3는 pH 값 안정화를 위해 필수적인 수단이다. 그렇다 하더라도, pH 값을 조절하기 위해 산 또는 염기를 배양물에 첨가하는 것은 특정 조건 하에서는 필수적일 수도 있다. 이러한 첨가는 CaCO3가 pH 안정화에 필수적인 수단인 한, 본 발명에 포함된다. 만일, 예를 들어, pH 값이 미생물의 예외적으로 빠른 성장 때문에 특정 목표 수치 이하로 떨어진다면, 이러한 목표 수치는 산이나 염기의 첨가가 pH 값 조절에 필수적인 수단이 되지 않고도, 이들의 첨가에 의해 일시적으로 조절될 수 있다.
pH 값 조절 및 pH 값 제어 또는 pH 값 안정화는 본 발명에서 동일한 의미로 사용된다.
산을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 - 각 경우에 본 발명에 따른 CaCO3의 첨가와 함께 - 측정될 수 있는 pH 값의 차이가 1보다 작거나 같고, 바람직하게는 0.75보다 작거나 같으며, 특히 바람직하게는 0.5보다 작거나 같고, 매우 특히 바람직하게는 0.2보다 작거나 같으며, 가장 특히 바람직하게는 0.1보다 작거나 같은 경우, 필수적인 수단은 여전히 CaCO3이다. 이러한 산 및/또는 염기의 첨가는 본 발명에 따른 산 및/또는 염기의 미량의 첨가로 이해되며, 이는 본 발명에 포함된다.
바람직한 것은, 어떠한 산 및/또는 염기 첨가의 이용을 필요로 하지 않는 배양 시스템이다.
또한, 많은 대체 완충 시스템들은 탄산칼슘의 사용에 비해 더 높은 비용 때문에 비상업적이다.
트라우스토키트리알레스 목의 미생물들을 배양하기 위한 완충제로서 탄산칼슘의 효율이 높다는 점은 놀라운데, 이는 생성되는 이산화탄소가 오직 물에서만 제한된 용해도를 가져 발효하는 동안에 완충 능력을 감소시키기 때문에다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 탄산칼슘 안정화된 배지를 사용하는 경우, 완전한 글루코오스 소비에 이르기까지 발효가 가능할 뿐만 아니라, 이에 더하여 바이오매스 내의 PUFA 비율도 상당히 증가한다. 더욱 놀라운 것은 글루코오스 이용과, 이와 관련하여, PUFA 생산이 가속화되고, 이에 따라 공간-시간 수율을 증가시킨다.
본 발명의 이전까지는, 탄산칼슘으로 pH-안정화된 배지를 사용하는 트라우스토키트리알레스 목의 미생물에서 n-3 지방산을 생산하기 위해 가능한 발효 공정이 알려져 있지 않았으며, 추가의 pH 값 안정화 수단이 필요하지 않게 되었다.
PUFAs는 적어도 두 개의 이중 결합을 포함하는 탄소 수 12보다 큰 사슬 길이를 가지는 다중 불포화 장쇄 지방산이다. 본 발명에 따른 방법으로 생산될 수 있는 PUFAs는 특히 n-3 지방산과 n-6 지방산이다.
본 발명의 의미에서, n-3 지방산 (오메가-3 지방산, ω-3 지방산)은 적어도 두 개 또는 그 이상의 이중 결합을 포함하는 탄소 수 12보다 큰 사슬 길이를 가지는 다중 불포화 장쇄 지방산이고, 여기에서 첫 번째 이중 결합은 알킬 말단에서부터 시작하여 3번째 및 4번째 위치의 탄소 원자 사이에 있는 것으로 이해된다. 따라서, n-6 지방산에 대해 첫 번째 이중 결합은 알킬 말단에서부터 시작하여 6번째 및 7번째 탄소 원자 사이에 위치한다.
라비린툴라문 군(郡)에 속하는 미생물이 본 발명의 방법에 따른 PUFAs의 생산을 위해 고려된다. 트라우스토키트리알레스 (트라우스키트리이데아) 목의 미생물이 바람직하다 (Lewis, T.E., Nichols, P.D., McMeekin, T.A., The Biotechnological Potential of Thraustochytrids, Marine Biotechnology, 1999, pp. 580-587 and Porter, D. Phylum Labyrinthulomycota in Handbook of protoctista: the structure, cultibation, habitats, and life histories of the eukaryotic microorganisms and their descendants exclusive of animals, plants, and fungi: a guide to the algae, cilates, foraminifera, sprorozoa, water molds, and other protoctists. Editors: Margulis, L, Corliss, J.P., Melkonian, M. and Chapman, D.J., editorial coordinator, McKhann, H.I., Jones and Bartlett Publishers, ISBN 0-86720-052-9 1990, pp. 388-398). 특히 쟈포노키트리움, 라비린툴로이데스, 아플라노키트리움, 알토르니아, 치조키트리움, 트라우스토키트리움 및 울케니아 속(屬)의 미생물이 바람직하다. 이들 중에, 울케니아 속 SAM 2179 및 SAM 2180뿐만 아니라, 치조키트리움 속 ATCC 28207, 트라우스토키트리움 아우레움 (특히 ATCC 28211 및 ATCC 34304), 트라우스토키트리움 로세움 ATCC 28210 트라우스토키트리움 속 ATCC 20890, ATCC 20891, ATCC 20892 및 ATCC 26185, 치조키트리움 마그레가툼 ATCC 28209, 치조키트리움 속 ATCC 2088 및 ATCC 20889, 치조키트리움 SR21이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 미생물은 야생형과 변이체, 그리고 이들로부터 유래된 균주뿐만 아니라 해당 유기체의 재조합 균주이다. 본 발명은 특히 PUFA 생산의 증대를 위한 변이체 및 재조합 균주를 포함한다.
본 발명에 따른 미생물은 액체나 고체 배지에 이들 유기체의 예비 배양 (preculture)을 주입함으로써 배양된다.
트라우스토키트리알레스 목의 미생물에 적합한 배양 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이에 제한되는 것은 아니지만, 배양은 상응하는 용기 (container)에서 수용성 발효에 의해 수행된다. 이러한 유형의 발효를 위한 전형적인 용기의 예로서, 쉐이킹 플라스크(shaking flasks), 또는 예를 들면 교반탱크반응기(STRs(stirred tank reactors)) 또는 기포컬럼(bubble columns)과 같은 생물반응장치(bioreactor)가 있다. 배양은 전형적으로 10 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 35℃, 특히 바람직하게는 25 내지 30℃, 더욱 특히 바람직하게는 27 내지 29℃, 특히 28±0.5℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, pH-안정화된 배지의 탄산칼슘의 함량은 3g/L 내지 15g/L, 바람직하게는 4g/L 내지 12g/L, 특히 바람직하게는 5g/L 내지 10g/L의 범위 내의 수치에 해당한다. 매우 특히 바람직하게는 탄산칼슘의 함량이 7.5±0.5g/L인 것이다.
더욱 바람직하게 pH-안정화된 배지는 하나 또는 그 이상의 질소원뿐만 아니라, 하나 또는 그 이상의 탄소원을 포함한다. 트라우스토키트리알레스 목의 미생물을 배양하기 위한 탄소원 및 질소원으로 사용가능한 물질들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
사용가능한 탄소원은 예를 들어, 글루코오스, 프럭토오스, 자일로오스, 수크로오스, 말토오스, 가용성 전분, 퓨코오스, 글루코사민, 덱스트란, 글루탐산, 몰라세스 (molasses), 글리세린 또는 만니톨과 같은 탄화수소, 또는 지방과 오일 또는 식물성 가수분해물이다.
사용가능한 천연 질소원의 예로서, 펩톤, 효소 추출물, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수 침지액 또는 두유이며, 사용가능한 유기 질소원은 예를 들면 글루타메이트와 우레아이고, 뿐만 아니라 암모늄 아세테이트, 암모튬 하이드로젠 카보네이트, 황산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 질소원으로 사용될 수 있다.
탄산칼슘 이외에도, pH-안정화된 배지는 트라우스토키트리알레스 목의 미생물의 배양을 보조하기 위해, 당업자에게 알려진 모든 다른 성분들, 특히 예를 들면, Ca, Mg, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo 또는 Zn과 같은 무기 염들을 포함할 수 있다. 인산수소칼륨과 같은 인산염, 또는 염화 마그네슘과 같은 염화염, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산철 또는 황산나트륨과 같은 황산염을 그 예로 들 수 있다. 추가로 사용가능한 무기염의 예로서, 브롬화칼륨 또는 요오드화칼륨과 같은 할로겐화물, 또한 탄산수소나트륨과 같은 다른 탄산염도 있다.
적용 가능한 경우, 배지는 아미노산, 퓨린, 피리미딘, 옥수수 침지액, 단백질 가수분해물, 비타민 (수용성 및/또는 불용성)과 같은 다량 영양소 또는 미량 영양소 및 그 밖의 당업자에게 잘 알려진 배지 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 만일 필요하다면 소포제 (anti-forming agent)가 추가될 수 있다. 배지는 복잡한 성분들을 함유할 수 있고, 또는 화학적으로 규명될 수 있다.
개별적인 성분들의 양은, 미생물의 성장이나 생산성에 부정적 영향이 없는 한 다양할 수 있다. 당업자는 미생물의 필요에 따라, 각 개별적인 경우에 대해 조성을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 탄소원은 300 g/L 이하의 농도로 첨가되고 질소원은 1 내지 30 g/L의 농도로 첨가된다. 바람직하게는, 질소 함량은 배지의 탄소 함량에 따라 조절된다.
특히 바람직한 pH 값 안정화된 배지는 글루코오스, 효모 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 염화 마그네슘, 탄산칼슘, 염화칼슘, 황산 나트륨, 및 인산 칼륨을 포함한다.
배지의 pH 값은 상응하는 산 또는 염기를 첨가함으로써, 3 내지 10, 바람직하게는 4 내지 8, 특히 바람직하게는 5 내지 7 및 매우 특히 바람직하게는 약 6의 범위에서, 발효의 시작 전에 맞춰진다.
배지는 그 후 멸균된다. 배지를 멸균하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 오토클레이브 (autoclave) 및 멸균 여과법을 예로 들 수 있다.
배양은 당업자에게 일반적으로 알려진 바와 같이 페드-배치식 (fed-batch mode) 또는 연속적으로, 배치방식 (batchwise)으로 수행할 수 있다.
배치 또는 페드-배치 배양은 일반적으로 1 내지 12일, 바람직하게는 2 내지 10일, 특히 바람직하게는 3 내지 9일에 걸쳐 수행한다.
배지에 배지 성분이 개별적으로 또는 혼합물로 첨가될 수 있는데, 미리 제조된 혼합물 또한 가능하다. 상기 성분, 특히 탄소원과 질소원 또는 특정 배지 첨가물이 배양 이전에 또는 배양하는 동안에 첨가될 수 있다. 첨가는 한번 또는 여러 번 반복하거나 또는 연속적으로도 수행할 수 있다.
생산된 PUFA는 일반적으로, 예를 들면 트리아실글리세리드와 같은 중성 지방, 또는 예를 들면 포스파티딜콜린, 포스파티딜에타놀아민 또는 포스파티딜이노시톨과 같은 극성 지질의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 PUFA, n-3 지방산 또는 n-3 활성 물질들은 지방산에 상응하는 모든 가능한 형태, 즉 에스테르, 트리글리세리드, 인지질 또는 그 밖의 유도체뿐만 아니라 유리(free) 지방산으로 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 모든 물질들은 다음의 문헌에서 간략히 설명되어 있으며, 그 용어가 동일한 의미로 사용된다. 더 나아가, PUFAs는 배지로부터 분리되기 전 또는 후에, 예를 들면 적절한 효소 (리파아제)의 도움으로, 화학적 또는 생촉매성 에스터교환 (biocatalytic transesterification)에 의해 전환 및 농축될 수 있다.
발효된 미생물 또는 배지로부터 PUFAs의 분리, 및 지방산 스펙트럼의 분석은 당업자에게 알려진 일반적인 공정을 사용하여 수행된다 [Wanasundara, U.N., Wanasundara, J.,Shahidi, F., Omega-3 fatty acid concentrates: a review of production technologies, Seafoods - Quality, Technology and Nutraceutical Applications, 2002, pp. 157-174].
본 발명에 따른 방법을 위한 기초를 형성하는 pH-안정화된 발효 배지는 이하 몇몇 실시예로서 설명된다. 그러나, 본 발명뿐만 아니라 발효 배지는 이러한 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1 : 서로 다른 양의 CaCO3에 의해서만 pH-안정화된 서로 다른 배양 배지에서 PUFA 생산을 위한 울케니아 속 SAM 2179 균주의 발효.
울케니아 속 SAM 2179 균주를 조절판(baffle)이 있는 300ml 삼각 플라스크 내의 50 ml 배지에서 배양하였다.
배지 조성:
발효 배지:
글루코오스 150g/L
옥수수 침지액 3.75g/L
KH2PO4 3g/L
Na2SO4 1g/L
MgCl2×6H20 1g/L
CaCl2×2H20 0.3g/L
(NH4)2SO4 5g/L
50mL 플라스크 당 CaCO3 첨가: 배지 1.1 0g/L
배지 1.2 1g/L
배지 1.3 2g/L
배지 1.4 5g/L
배지 1.5 10g/L
NaOH 및 오토클레이브를 사용하여 pH 값을 6.0에 맞춤
배양 조건:
온도(℃): 28
진탕속도(rpm): 150
세포 수확은 배양 96시간 후에 원심분리에 의해 수행하였다. 그 후에 상기 세포들을 동결 건조하고 건조 바이오매스를 결정하였다. 세포 분해 (digestion)와 지방산은 10%의 메탄올 하이드로클로릭 산 (methanolic hydrochloric acid)에서 60℃로 2시간 동안 열처리를 하여 (교반 하에) 결정하였다. 에스테르는 지방산 조성물을 결정하기 위해 기체 크로마토그래프에서 분석하였다
| CaCO3 (g/L) |
글루코오스 소비 (g/L) |
pH 값 | DBM (g/L) |
DHA 영역 (%) |
DHA/DBM (%) |
DHA (g/L) |
DHA-STY (g/Lxd) |
|
| 배지 1.1 | 0 | 43.0 | 1.85 | 22.72 | 48.3 | 3.35 | 0.76 | 0.19 |
| 배지 1.2 | 1 | 59.0 | 2.31 | 30.32 | 44.0 | 4.91 | 1.49 | 0.37 |
| 배지 1.3 | 2 | 81.7 | 2.84 | 38.58 | 43.9 | 9.90 | 3.82 | 0.96 |
| 배지 1.4 | 5 | 108.4 | 5.02 | 52.99 | 44.8 | 15.72 | 8.33 | 2.08 |
| 배지 1.5 | 10 | 111.9 | 4.78 | 52.32 | 45.5 | 13.23 | 6.92 | 1.73 |
DBM : 건조 바이오매스; DHA/DBM : DBM 중량 단위당 wt% DHA (도코사헥사에노산); g/Lxd : 일(day)당 리터당 공간-시간 수율 (g); STY : 공간-시간 수율; DHA 영역 (%) : 지방산 스펙트럼 내의 DHA 비율
충분한 pH 안정화가 부족한 발효 배지에서 울케니아 속 SAM 2179의 발효는 발효가 진행되는 동안 글루코오스의 소비를 감속시켰으며, pH 값의 급격한 감소로 인하여 성장을 중단시켰다 (배지 1.1 내지 1.3 참조). 오직 더 많은 양의 CaCO3 완충제만이 배양하는 동안 pH 값을 안정화시켰다 (배지 1.4 및 1.5). 여기에서, 또한 CaCO3 농도의 증가는 배양하는 동안 글루코오스의 소비를 증가시켰다. pH 값 안정화 및 이와 관련하여 증가된 글루코오스 소비로 인하여 더 높은 바이오매스 수치를 얻었으며, 그 결과, 또한 전술한 조건 하에서 약 2g/Lxd의 더 높은 DHA 공간-시간 수율을 얻을 수 있었다.
실시예 2 : 서로 다른 양의 CaCO3에 의해서만 pH-수치 안정화된 서로 다른 배양 배지에서 PUFA의 생산을 위한, 글루코오스 한계에 이르기까지의 울케니아 속 SAM 2179 균주의 발효.
울케니아 속 SAM 2179 균주를 완전한 글르코스 소비에 이르기까지 조절판이 있는 300ml 삼각 플라스크 내의 50 ml 배지에서 배양하였다.
배지 조성 :
발효 배지 :
글루코오스 150g/L
콘 스팁 리커 3.75g/L
KH2PO4 3g/L
Na2SO4 1g/L
MgCl2×6H20 1g/L
CaCl2×2H20 0.3g/L
(NH4)2SO4 5g/L
50mL 플라스크 당 CaCO3 첨가: 배지 1.4 5g/L
배지 1.5 10g/L
NaOH 및 오토클레이브를 사용하여 pH 값을 6.0에 맞춤
배양 조건:
배양 조건:
삭제
온도(℃): 28
진탕속도(rpm): 150
세포 수확은 배양 144.5시간 후에 원심분리에 의해 수행하였다. 그 후, 상기 세포들을 동결 건조하여 건조 바이오매스를 결정하였다. 세포 분해 및 지방산은 10%의 메탄올 하이드로클로릭 산에서 60℃로 2시간 동안 열처리를 하여 (교반 하에) 결정하였다. 에스테르는 지방산 조성물을 결정하기 위해 기체 크로마토그래프에서 분석하였다
| CaCO3 (g/L) |
글루코오 스 소비 (g/L) |
pH 값 | DBM (g/L) |
DHA 영역 (%) |
DHA/DBM (%) |
DHA (g/L) |
DHA-STY (g/Lxd) |
|
| 배지 1.4 | 5 | 150.0 | 6.49 | 58.52 | 47.7 | 22.20 | 12.99 |
2.14 |
| 배지 1.5 | 10 | 150.0 | 6.58 | 64.65 | 46.7 | 20.54 | 13.28 |
2.19 |
각각 5g/L 및 10g/L의 CaCO3로 완충된 배지에서 울케니아 속 SAM 2179의 발효는, 글루코오스 한계에 이르기까지 각각의 pH 값의 현저한 감소 없이 배양을 가능하게 했다. 이에 따라 달성가능한 바이오매스 및 바이오매스 당 DHA의 비율은, 완전한 글루코오스 소비에 상응하는 약 58 내지 64 g/L의 바이오매스 및 20 내지 22%의 DHA/DBM로 매우 높다. 비록 바이오매스당 필수적인 PUFA DHA의 비율이, CaCO3농도가 낮은 경우 (5g/L)에 관해서는 약간 감소하지만, CaCO3 농도가 더 높은 경우 (10g/L)는 바이오매스의 양이 더 많아지도록 했다. 그러나, 이와 함께 수득한 DHA 공간-시간 수율은 양쪽 농도 모두에서 대략 동일하였다.
실시예 3 : 최적화된 발효 조건 하에서 PUFA 생산을 위한 울케니아 속 SAM 2179 균주의 배양.
울케니아 속 SAM 2179 균주를 완전한 글르코스 소비에 이르기까지 조절판이 있는 300ml 삼각 플라스크 내의 50 ml 배지에서 배양하였다. 7.5g/L의 CaCO3 농도 및 변경된 예비 배양으로 인해 발효가 최적화되었다. 예비 배양을 위해, DH1 배지에서 정치 배양 (stand culture)을 사용하는 대신, 동일한 배지로 진탕 배양 (shake culture)을 사용하였다 (48시간, 150rpm 및 28℃).
배지 조성 :
예비배양 배지 : DH1 배지
글루코오스 모노하이드레이트(g/L) : 56.25
효모 추출물(g/L) : 12.5 [Difco]
트로픽 마린(Tropic Marin)(g/L) : 16.65 [Dr. Biener GmbH, Wartenberg, Germany]
염산으로 pH 값을 6.0에 맞춤
발효 배지 :
글루코오스 150g/L
옥수수 침지액 3.75g/L
KH2PO4 3g/L
Na2SO4 1g/L
MgCl2×6H20 1g/L
CaCl2×2H20 0.3g/L
(NH4)2SO4 5g/L
50mL 플라스크 당 CaCO3 첨가: 배지 1.6 7.5g/L
NaOH 및 오토클레이브로 pH 값을 6.0에 맞춤
배양 조건 :
온도 (℃): 28
진탕속도 (rpm): 150
세포 수확은 배양 99.75시간 후에 원심분리에 의해 수행하였다. 그 후 상기 세포들을 동결 건조하여 건조 바이오매스를 결정하였다. 세포 분해 및 지방산은 10%의 메탄올 하이드로클로릭 산에서 60℃로 2시간 동안 열처리를 하여 (교반 하에) 결정하였다. 에스테르는 지방산 조성물을 결정하기 위해 기체 크로마토그래프에서 분석하였다
| CaCO3 (g/L) |
글루코오 스 소비 (g/L) |
pH 값 | DBM (g/L) |
DHA 영역 (%) |
DHA/DBM (%) |
DHA (g/L) |
DHA-STY (g/Lxd) |
|
| 배지1.6 |
7.5 | 150.0 | 6.76 | 63.84 | 44.1 | 23.06 | 14.72 | 3.54 |
최적화된 발효 조건 -울케니아 속 SAM 2179를 우선 DH1 배지에서 48시간 동안 28℃ 및 150rpm으로 배양함- 을 사용하여, DHA 공간-시간 수율이 3.5g/Lxd 이상으로 실질적으로 향상될 수 있었다. 이러한 결과는 주로 보다 빠른 성장에 기인한 것으로, 글루코오스 한계가 100시간 전에 도달하였다. 발효 배지에서 7.5g/L의 CaCO3의 사용은 최적화된 배양에 필요한 pH 안정화를 가능하게 하였다. 7.5g/L의 CaCO3의 사용은 실시예 2의 결과에 따른 것으로, 여기에서 10g/L의 CaCO3는 더 높은 바이오매스 수치를 나타낸 반면, 5g/L의 CaCO3는 더 나은 DHA 수치를 발생시켰다. DHA 생산을 위한 최적의 CaCO3 농도(즉, 최대 가능한 DHA 함량을 갖는 최대 가능한 바이오매스의 함량)는 따라서 5 내지 10g/L의 CaCO3 범위로 추측하였다. pH 값의 안정화 이외에도, 본 발명에 따른 발효 배지의 사용이 글루코오스 한계 시점에서 3g/Lxd 이상의 대단히 높은 DHA 공간-시간 수율 결과를 가져왔다. 이 경우, 실시예 2과 유사한 바이오매스 수치를 얻었으나, 건조 바이오매스당 DHA 비율 및 수득한 DHA 양은 더 많았다 (10% 이상).
실시예 4 : CaCO3에 의해 pH 안정화되거나 안정화되지 않은 배양 배지에서 PUFA 생산을 위한 울케니아 속 SAM 2179 균주의 발효.
울케니아 속 SAM 2179 균주를 완전한 글루코오스 소비에 이르기까지 5L의 발효조에서 배양하였다.
배지 조성 :
발효 배지 :
글루코오스 150g/L
옥수수 침지액 3.75g/L
KH2PO4 3g/L
Na2SO4 1g/L
MgCl2×6H20 1g/L
CaCl2×2H20 0.3g/L
(NH4)2SO4 5g/L
pH 조절이 있는 발효: H3PO4 및 오토클레이브로 pH 값을 4.0으로 맞춤
pH 조절이 없는 발효: 7.5g/L의 CaCO3 첨가와 아울러 NaOH 및 오토클레이브로 pH 값을 6.0으로 맞춤
배양 조건 :
온도(℃) : 28
공기주입속도(ventilation) : 0.8vvm
pH 조절 및 조절 없이 발효
| pH 조절 | CaCO3 (g/L) |
글루코오 스 소비 (g/L) |
글루코오스 소비를 위한 시간 (h) |
DBM (g/L) |
DHA 영역 (%) |
DHA/DBM (%) |
DHA (g/L) |
DHA-STY (g/Lxd) |
| + | 0 | 150.0 | 162 | 66.9 | 47.2 | 25.9 | 17.35 | 2.5 |
| - | 7.5 | 150.0 | 150 | 67.8 | 46.7 | 26.9 | 18.30 | 2.9 |
본 발명에 따른 CaCO3-안정화된 발효 배지의 사용으로 5L 발효조 규모에서도 pH 조절 없이 글루코오스 한계에 이르기까지 울케니아 속 SAM 2179의 배양이 가능했다. 충분한 양의 CaCO3의 사용으로 가속화된 글루코오스 소비로 인해 성장이 더 빨라졌다. 또한, 더 많은 바이오매스을 수득하였다. 더 나아가, 이와 관련하여, 발효하는 동안에 더 큰 비율의 바이오매스당 DHA 및 더 많은 양의 DHA를 얻었다. 이는 pH-조절된 발효에 비해 CaCO3-완충된 발효에 대한 DHA 공간-시간 수율을 15% 이상으로 적지 않게 증가시켰다.
실시예 5 : 7.5g/L의 CaCO3로 안정화된 발효 배지 1.6에서 PUFA의 생산을 위한 치조키트리움 속 SR21의 발효.
치조키트리움 속 SR21 균주를 조절판이 있는 300mL 삼각플라스크 내의 50mL 배지에서 완전한 글루코오스 소비에 이르기까지 배양하였다.
배지 조성:
예비 배지 : GY 배지
글루코오스(g/L) : 30.0
효모 추출물(g/L) : 10.0 [Difco]
트로픽 마린(g/L) : 16.65 [Dr.Biener GmbH, Wartenberg, Germany]
HCl로 pH 값을 6.0으로 맞춤
발효 배지 :
글루코오스 150g/L
옥수수 침지액 3.75g/L
KH2PO4 3g/L
Na2SO4 1g/L
MgCl2×6H20 1g/L
CaCl2×2H20 0.3g/L
(NH4)2SO4 5g/L
50mL 플라스크 당 CaCO3 첨가: 배지 1.6 7.5g/L
NaOH 및 오토클레이브로 pH 값을 6.0으로 맞춤
배양 조건 :
온도(℃): 28
진탕속도(rpm): 150
세포 수확은 배양 96시간 후에 원심분리에 의해 수행하였다. 그 후 상기 세포들을 동결 건조하고 건조 바이오매스를 결정하였다. 세포 분해 및 지방산은 10%의 메탄올 하이드로클로릭 산에서 60℃로 2시간 동안 열처리를 하여 (교반 하에) 결정하였다. 에스테르는 지방산 조성물을 결정하기 위해 기체 크로마토그래프에서 분석하였다
| CaCO3 (g/L) |
글루코오 스 소비 (g/L) |
pH 값 | DBM (g/L) |
DHA 영역 (%) |
DHA/DBM (%) |
DHA (g/L) |
DHA-STY (g/Lxd) |
|
| SR21 |
7.5 | 150.0 | 7.35 | 66.12 | 34.4 | 15.28 | 10.10 | 2.52 |
본 발명에 기재된 CaCO3를 사용하여 pH-안정화된 배지는 또한, 라비린툴로미코타에 속하는 다른 유기체의 경우에도 PUFA 생산을 최적화시켰다. 따라서 본 발명의 목적을 형성하는 배지에서 미생물 치조키트리움 속 SR21 균주를 발효하는 것이 가능했다. SR21에서의 필수적인 PUFA, DHA의 공간-시간 수율은 울케니아 속 SAM 2179에서 보다 약간 낮았지만 (실시예 3을 참조), 이는 n-3 PUFA DHA와 관련하여 총 건조 바이오매스의 15%(w/w) 이상이었다. 이러한 실시예는 본 발명의 목적을 형성하는 최적화된 pH-안정화된 배지가 다른 종류의 라비린툴로미코타에서도 PUFA의 생산을 위한 pH 조절 없이 발효를 가능하게 함을 보여준다.
Claims (20)
- 트라우스토키트리알레스 (Thraustochytriales) 목(目) 미생물을 배양하는 방법으로서, pH 안정화를 위한 필수적인 수단으로 3 내지 15 g/L의 CaCO3을 포함하는 발효 배지에서 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 건조 바이오매스의 중량 단위당 25 중량% 이상의 오일(oil)을 생산하도록 하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 건조 바이오매스 중량 단위당 10 중량% 이상의 DHA를 생산하도록 하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 건조 바이오매스당 1 중량% 이상의 DPA를 생산하도록 하는 것인 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 배지가 글루코스, 옥수수 침지액, 염화마그네슘, 염화칼슘, 탄산칼슘, 황산나트륨, 황산암모늄 및 인산수소칼륨 (potassium hydrogen phosphate)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지가 3 내지 10의 pH 값을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배양은 10 내지 40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배양은 1 내지 10일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 치조키트리움 (Schizochytrium), 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium) 또는 울케니아 (Ulkenia) 속에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 울케니아 속 SAM 2179인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물이 치조키트리움 속 SR 21인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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