EA011877B1

EA011877B1 - Способ культивирования микроорганизмов рода thraustochytriales

Info

Publication number: EA011877B1
Application number: EA200600952A
Authority: EA
Inventors: Маркус Луи; Маттиас Рюзинг
Original assignee: Нутринова Ньютришн Спешиэлтис Энд Фуд Ингридиентс Гмбх
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2009-06-30
Also published as: CA2545416A1; EA200600952A1; US8889382B2; PL1685255T3; CA2545416C; AU2004287953A1; SG148156A1; EP1685255A1; AU2004287953B2; KR101159869B1; US20070141686A1; IL175521A; EP1685255B1; JP4791366B2; BRPI0416362A; KR20070042114A; CN104195186A; DE10352837A1; JP2007512809A; ZA200603855B

Abstract

Данное изобретение относится к оптимизированному способу получения PUFA культивированием микроорганизмов отряда Thraustochytriales в ферментационной среде со стабилизированным при помощи СаСОзначением рН, включающей в себя 3-15 г/л СаСО, и последующим выделением PUFA из этих микроорганизмов и/или этой среды. В частности, описаны новые оптимизированные среды с различным содержанием СаСО. Применение соответствующих количеств СаСОделает возможным значительное упрощение проведения процесса во время ферментации. Кроме того, могут быть получены повышенные количества DHA при повышенном содержании масла в биомассе. Эти повышенные количества делают возможной ферментацию микроорганизмов Thraustochytriales без регулирования рН и тем самым позволяют значительно улучшить и значительно упростить получение PUFA.

Description

Различные жирные кислоты с множественной ненасыщенностью (РИГА, полиненасыщенные жирные кислоты) и, в частности, жирные омега-3-кислоты (жирные п3-кислоты), являются существенными компонентами питания человека.

Однако, известно, что в большинстве индустриальных наций обеспечение жирными п3-кислотами является недостаточным. Напротив, общая доля жиров в питании, а также снабжение насыщенными жирными кислотами и жирными п6-кислотами являются слишком высокими. В основе этого лежит изменение состава питания, которое имеет место прежде всего в последние приблизительно 150 лет и которое коррелирует с возникновением различных хронических болезней цивилизации, таких как, например, сердечно-сосудистые заболевания - основная причина смерти для индустриальных наций (81торои1ок, А.Р., 1999, Ат. 1. С1т. ΝιιΙγ. 70, 560-569). Между тем многочисленные исследования показали, что целевое повышение снабжения жирными пЗ-кислотами, в частности, эйкозапентаеновой кислотой (ЕРА) и докозагексаеновой кислотой (ΌΗΑ), может значимо уменьшать риск сердечно-сосудистых заболеваний (С1881-Ргеуеп/1опе 1пуекйда!огк (Отирро НаНапо рег 1о 8!ибю бе11а 8оргауу|уепха пе1Г1п£атЮ шюсатбко), 1999, П1е!ату кир1етеп!а!юп \νί11ι п-3 ро1уипка!ита!еб Га11у ас1бк апб уйатш Е айет туосагб1а1 шГагсбоп; текийк оГ 1Не С1881-ргеуеп/1опе 1г1а1., Ьапсе! 354, 447-455; Вигг е! а1., 1989, ЕГГес1к оГ сйапдек шГа!, йкй, апб йЬте 1п!аке оп беа!1 апб туосагб1а1 геш£атс!юп: б1е! апб те1пГагс!юп !па1 (ΌΑΒΤ). Ьапсе! 2, 757-761). Соответственно этому, многими различными организациями (\УНО (Всемирной Организацией Здравоохранения, ВОЗ), ГАО (Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций, ФАО), ΑΗΑ (Американской кардиологической Ассоциацией); 188ГАЬ, Βτί!ίκ1 МЦпбоп Еоипбайоп и многими другими) рекомендуется существенное повышение потребления жирных п3-кислот (Кпк-ЕНеПоп е! а1., ЕМ1 Сопкитрйоп, Икй Ой, Отеда-3 Га!!у Ас1бк, апб Сагбюуакси1аг Э^еаке, С1гси1а!юп 2002, 27472757).

Источниками получения РИГА и, в частности, жирных п3-кислот, являются прежде всего морские холодноводные рыбы и полученные из них масла, но также морские микроорганизмы, которые имеют преимущество перед рыбами, заключающееся в том, что они могут выращиваться в ферментерах в требующих меньших затрат и контролируемых условиях для получения РИГА. При ферментативном получении отсутствует опасность загрязнений, которые часто описываются для рыб или полученного из них (жидкого) рыбьего жира (О1кеп 8Г. 1п! 1 Ер1бешю1. 2001: 1279-80). Кроме того, на состав полученных масел можно положительно воздействовать посредством выбора организма и условий культивирования, и он не подвергается сезонным колебаниям, как это также описано для рыбы и рыбных продуктов (Сатех-Меха е! а1. Ыр1бк 1999:639-42).

Микроорганизмы, которые пригодны для получения п3-РИГА, находятся, например, среди бактерий рода УФпо (например, УФпо таппик) или среди динофлагеллят (Пшорйу!а), в них, в частности, род Стур!йесоб1шит, например, С. сойпн, или среди 8!гатепорбек, таких как РтдшорЬусеае, таких как, например, С1оккотакйх, Рйаеотопак, Ртдшосйгукщ, Ршдшососсик и РойбосНгубк. Предпочтительные микроорганизмы для ферментативного получения РИГА принадлежат к 8!гатепорйек (или ЬаЬупп!йи1отусо!а) , в частности, к отряду Тйтаик!осйу!па1ек (Тгаик!сйу!шбеа) и в нем, в частности, к родам 1аропосйу!пит, 8с1н/ос11у1пит. Тйгаик!осйуйшт, А1!йогша, ЕаЬупп!йи1о1бек, Ар1ап)сНу1г1ит и и1кеша.

Известно, что некоторые из названных микроорганизмов могут применяться для промышленного производства жирных кислот, были описаны соответствующие способы. Так, международная патентная заявка \¥О 91/07498 А1 раскрывает получение РИГА с использованием организмов родов 8с1нхос11у1пит и Тйтаик!осйу!пит. \УО 91/11918 А1 описывает получение РИГА с использованием Сгур!йесоб1п1ит со1пл, \УО 96/33263 А1 и соответствующая Европейская патентная заявка ЕР 0823475 А1 описывают получение РИГА с использованием микроорганизмов рода 8сЫхосйу!пит, тогда как патентная заявка \¥О 98/03671 раскрывает получение РИГА с использованием микроорганизмов рода и1кеша.

Природным местом обитания описанных микроорганизмов и, в частности, ЕаЬупп!йи1отусо!а, являются морские места обитания. Таким образом, обычно эти микроорганизмы культивируют в соответственных солесодержащих средах, причем для целей данного изобретения содержание соли морской воды определяется как 32-35 г/л и доля натрия и хлорида определяется как 90-95%. Типичные среды для культивирования морских микроорганизмов, таких как Тйгаик!осйу!пит и 8сЫхосйу!пит, основываются на морской воде (например, АТСС (Американская Коллекция Типовых Культур) 790 Ву+ Мебшт [дрожжевой экстракт 1,0 г, пептон 1,0 г, Э+-глюкоза 5,0 г, морская вода 1 л]). Но также известно, что микроорганизмы отряда Тйтаик!осйу!па1ек могут выживать при очень низкой солености в культуральной среде. Однако их рост ниже предела 7,5-15 г соли/л, соответственно солености 7,5-15%, описывается как лишь очень небольшой и без промежуточных максимумов в более низкой области солености. Оптимальные скорости роста достигаются только выше указанного предела солености (Гап е! а1. Во!ашса Маппа 45, 2002, 8. 50-57).

Часто возникающей проблемой ферментативных процессов являются сильные колебания рН в ходе культивирования, как следствие появления продуктов метаболизма и/или потребления отдельных компонентов среды. Это относится, в частности, к богатым солями средам для ферментации морских микроорганизмов. Поэтому такие ферментации часто требуют регулирования рН. Однако регулирование показателя рН приводит при ферментации в крупном масштабе к значительным дополнительным расходам.

- 1 011877

При этом необходимы дополнительные сосуды для подачи кислот и щелочей, которые в противном случае могли бы применяться по-другому для подкормки дополнительными компонентами. Кроме того, титрование для регулирования показателя рН должно контролироваться технически. В связи с ферментацией ЕаЬугш1йи1отусо1а для получения РИГА в производственном масштабе в существующем уровне техники используются способы культивирования с контролируемым показателем рН.

Однако контроль показателя рН посредством в остальном обычных буферных систем для культуры клеток обнаруживает недостатки. Так, буферная емкость, например, ТК18, ΗΕΡΕ8 и МОР8, на основе их показателей рК_а более 7, является недостаточной в необходимой для ферментации РИЕА рН-области. ТК18, кроме того, является плохим буфером в рН-областях ниже 7,5, он является потенциально реакционноспособным первичным амином и может активно участвовать в различных биологических реакциях. Фосфатный буфер, также часто применяемый буфер, имеет свойство осаждаться из раствора в присутствии двухвалентных катионов и, кроме того, является плохим выбором при ферментативных процессах, которые нуждаются в фосфате или потребляют фосфат. Ацетатные буферы являются непригодными на основании их узкой буферной области и вследствие того факта, что они метаболизируются в процессе ферментации. Кроме того, многие альтернативные буферные системы являются нерентабельными вследствие их высоких стоимостей.

Поэтому с учетом существующего уровня техники, задачей данного изобретения было обеспечение нового, простого и рентабельного способа культивирования морских микроорганизмов. При этом должно достигаться значительное упрощение проведения процесса. Помимо рентабельности этот способ должен сделать возможным получение высокоочищенных РИГА с высоким выходом.

Эти, а также дополнительные, не указанные явно задачи, которые, однако, являются легко выводимыми и раскрываемыми из вступительного обсуждаемого контекста, решаются посредством объектов, которые определены в пунктах формулы данного изобретения.

Предпочтительный способ для культивирования микроорганизмов отряда Т1шш51ос11у1па1с5 обеспечен способом по п.1. Этот способ предусматривает культивирование в среде, рН которой стабилизируется исключительно за счет СаСО₃, включающей в себя содержание СаСО₃ 3-15 г/л, и в случае необходимости выделение этих РИГА из микроорганизмов и/или культуральной среды.

Данное изобретение включает в себя, кроме того, способ получения высокоочищенных РИГА. Предпочтительными РИГА являются по данному изобретению ЭНА. ЭРА и ЕРА.

В частности, культивируемые в вышеуказанном способе микроорганизмы обнаруживают продуцирование более чем 10%, предпочтительно более чем 14%, и особенно предпочтительно более чем 18% ЭНА на сухую биомассу.

В частности, культивируемые в вышеуказанном способе микроорганизмы обнаруживают продуцирование более чем 1%, предпочтительно более чем 2%, и особенно предпочтительно более чем 3% ЭРА на сухую биомассу.

Посредством выделения РИГА из биомассы микроорганизмов и/или из культуральной среды после культивирования могут быть получены РИГА с высоким выходом и высокой степенью чистоты.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает также способ получения биомассы, причем эта биомасса обеспечивается способом культивирования по данному изобретению.

Эта биомасса может найти применение для известных видов применения. В частности, эта биомасса, например, в высушенном состоянии (сухая биомасса), может применяться в качестве пищевых продуктов или в качестве кормовых продуктов.

Кроме того, данное изобретение включает в себя также масло, которое получают посредством проведения способа культивирования по данному изобретению, и это масло выделяют из микроорганизмов и/или культуральной среды.

В частности, речь идет при этом о масле, которое наряду с дополнительными предпочтительными целями применения может выгодным образом применяться для питания человека.

При этом микроорганизмы при условиях данного изобретения обнаруживают продукцию более чем 30 мас.% масла, предпочтительно более чем 35 мас.% масла на единицу массы сухой биомассы.

Под маслом в соответствии с данным изобретением понимают долю по меньшей мере 70% нейтральных липидов и по меньшей мере 2% фосфолипидов, что соответствует известному специалистам в данной области спектру жирных кислот ТЬгаи81осйу1па1е8. Нейтральные липиды состоят при этом по меньшей мере из 80% триглицеридов и других соединений, таких как, например, диацилглицериды, стерины и т.д. Кроме того, массовая доля триглицеридов состоит из приблизительно 95% жирных кислот и 5% глицерина.

Возможность способности морского микроорганизма ферментироваться для продуцирования РИГА без наружного регулирования показателя рН, в частности, при условиях, которые делают возможным быстрый рост при высоком потреблении глюкозы, была совершенно неожиданной. Именно при таких условиях при ферментации морских микроорганизмов без соответствующего контроля рН очень быстро возникает подкисление среды, которое приводит к прекращению роста (см. пример 1 и ^еп, Ζ.-Υ. и С1еп, Г., 2003, Вю1есйио1о§у Абуаисек 21, 273-294).

Способ данного изобретения обходится неожиданным образом без добавления прежнего стабили

- 2 011877 зирующего показатель рН средства. Под средствами, стабилизирующими показатель рН, понимают в соответствии с данным изобретением как регламентированное в зависимости от установленного во время культивирования показателя рН добавление кислоты или основания из дополнительных резервуаров, так и применение буферных систем в самой среде, хотя авторам данного изобретения неизвестны рентабельно пригодные способы культивирования с применением буферных систем, таких как, например, Трисбуфер или фосфатный буфер.

Согласно данному изобретению СаСО₃ является важным средством для стабилизации показателя рН. Несмотря на это, не исключено, что при определенных условиях может быть необходимым добавление кислоты или основания к культуре для установления показателя рН. Такое добавление включено в данное изобретение, пока СаСО₃ остается существенным средством для стабилизации показателя рН. Если, например, показатель рН во время культивирования на основе особенно быстрого роста микроорганизмов падает ниже определенного желаемого показателя, то этот желаемый показатель может краткосрочно устанавливаться кислотой или основанием, без добавления значительного количества средства для регулирования показателя рН.

Термины регулирования показателя рН и управления показателем рН или стабилизации показателя рН используются в данном изобретении взаимозаменяемо.

СаСО3 остается важным средством, если величина различия показателей рН, которые могут быть измерены с добавлением кислот или без добавления кислот (в каждом случае с добавлением СаСО₃ в соответствии с данным изобретением), меньше 1, предпочтительно меньше 0,75, особенно предпочтительно меньше 0,5, еще более предпочтительно меньше чем 0,2, и наиболее предпочтительно меньше чем 0,1. Такое добавление кислот и/или оснований считают незначительным добавлением кислот и/или оснований, которое включено в данное изобретение.

Предпочтительными являются системы культивирования, которые полностью обходятся без применения добавления кислот и/или оснований.

Кроме того, многие альтернативные буферные системы являются нерентабельными в сравнении с применением карбоната кальция вследствие более высоких затрат.

Высокая эффективность карбоната кальция в качестве буфера для культивирования микроорганизмов рода Т11гаиз1ос11у1па1ез является неожиданной, так как возникающий диоксид углерода имеет лишь ограниченную растворимость в воде и вследствие этого буферная емкость понижается во время ферментации.

Неожиданным образом не только была возможной ферментация до полного потребления глюкозы, но, кроме того, значимо повышалась доля РИЕЛ в биомассе при применении стабилизируемой карбонатом кальция среды. Еще более удивительным является то, что утилизация глюкозы и связанное с ней продуцирование РИГА ускоряется и таким образом приводит к повышенному объемно-временному выходу продукции.

До данного изобретения не был известен ферментационный процесс для получения жирных п3кислот в микроорганизмах из отряда Тйгаиз1осйу1па1ез с использованием рН-стабилизируемой карбонатом кальция среды, посредством которой можно было избежать применения дополнительного средства, стабилизирующего показатель рН.

РИЕА являются в соответствии с данным изобретением многократно ненасыщенными длинноцепочечными жирными кислотами с длиной цепи > С12 с по меньшей мере двумя двойными связями. Получаемые в соответствии с данным изобретением РИГА являются, в частности, жирными п3-кислотами и жирными п6-кислотами.

Под жирными п3-кислотами (жирными омега-3-кислотами, жирными ш3-кислотами) в контексте данного изобретения подразумевают многократно ненасыщенные длинноцепочечные жирные кислоты с длиной цепи > С12 с по меньшей мере двумя или более двойными связями, причем первая из двойных связей находится между атомами углерода С3 и С4 от алкильного конца.

Для получения РИГА по данному изобретению применяют микроорганизмы из группы рассматриваемых ЬаЬуг1п1йи1отусо1а. Микроорганизмы отряда Т11гаиз1ос11у1па1ез (Тйтаиз1осЬу1гйбеа) являются предпочтительными (Ьетаз, Т.Е., №сйо1з, Р.Э.. МсМеекш, Т.А., Т1е Вю1ес11по1офса1 Ро1епба1 о! ТНгаизЮс1иу1пб5. Маппе В^есйпоШ^у, 1999, 8. 580-587 и Ройет, Ό. Р1у1ит ЕаЬуппШи1отусо1а ш НапбЬоок о! рго!осйз1а: 1ке зйисШте, сиШуабоп, 1аЬйа1з, апб НГе 1из1опез о! Не еикатуойс тктоотдашзтз апб 1Не1г безсепбапз ех1из1уе о! ашта1з, р1ап!з, апб Гипф: а дшбе Ю Не а1дае, сШа!ез, ГотауЬшГега, зрого/оа, \\Шег то1бз, апб о1Нег ргоЮсбзй. Ебйотз: МатдиНз, Ь., СотНзз, Ι.Θ., Ме1кошап, М. апб Сйартап, Ό.Ι, ебйопа1 соотбша1от, МсКкапп, Η.Ι., 1опез апб Ват1ей РиЬйзйегз, Ι8ΒΝ 0-86720-052-9 1990, 8. 388-398). Особенно предпочтительными являются микроорганизмы родов 1аропосйуйшт, 8сЫ7осйуйшт, Тйгаиз1осйуйшт, АИйогша, ЬаЬуппШиШбез, АркицсНуйиип и И1кеша. Особенно предпочтительными из них являются 8сЫ7осйуйшт, ТНгаийосНуйшт и и1кеша. В частности, предпочтительными являются: 1аропосйуйшт §р. АТСС 28207, Тйгаиз1осйуйшт аигеит (в частности, АТСС 28211 или АТСС 34304), ТНгаийосНуйшт гозеит АТСС 28210, ТйтаизЮсйуйшт зр. АТСС 20890, АТСС 20891, АТСС 20892 и АТСС 26185, 8с1и/ос11у1пит аддгедаШт АТСС 28209, 8с1и/ос11у1пит зр. АТСС 20888 и АТСС 20889, 8с1и/ос11у1пит

- 3 011877

8К.21, а также И1кеша крес. 8ЛМ 2179 и 8ЛМ 2180.

Подходящими микроорганизмами для способа в соответствии с данным изобретением являются как формы дикого типа, так и мутанты и полученные из них штаммы, а также рекомбинантные штаммы соответствующих организмов. В особой степени, данное изобретение включает в себя мутанты или рекомбинантные штаммы для повышения продуцирования РИРЛ.

Микроорганизмы по данному изобретению культивируют инокуляцией жидкой или твердой среды предварительной культурой данного организма.

Подходящие для микроорганизмов отряда Т11гаи51ос11у1па1е5 способы культивирования хорошо известны специалисту. Обычно, но не исключительно, это культивирование проводят с использованием водной ферментации в соответствующем резервуаре. Примеры типичных резервуаров для подобной ферментации включают в себя встряхиваемые колбы или биореакторы, такие как, например, 8ТК. (перемешиваемый танк-реактор) или барботажные колонны. Культивирование проводят обычно при температурах 10-40°С, предпочтительно при 20-35°С, особенно предпочтительно при 25-30°С, еще более предпочтительно при 27-29°С и, в частности, при 28±0,5°С.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения содержание карбоната кальция среды со стабилизированным рН соответствует величине в диапазоне 3-15 г/л, предпочтительно 4-12 г/л и особенно предпочтительно 5-10 г/л. Еще более предпочтительно содержание карбоната кальция равно 7,5±0,5 г/л.

Среда со стабилизированным показателем рН включает в себя дополнительно предпочтительно один или несколько источников углерода, в также один или несколько источников азота. Специалисту в данной области хорошо известны применимые в качестве источников углерода и азота вещества для культивирования микроорганизмов отряда Т11гаи51ос11у1па1е5.

Применимыми источниками углерода являются, например, углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, ксилоза, сахароза, мальтоза, растворимые крахмалы, фукоза, глюкозамин, декстран, глутаминовая кислота, меласса, глицерин или маннит или также жиры и масла или гидролизаты растений.

Применимыми источниками азота являются, например, пептон, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, мясной экстракт, казаминокислоты, кукурузный экстракт или соевые бобы, применимыми органическими источниками азота являются, например, глутамат и мочевина, но также и неорганические источники азота, такие как, например, ацетат аммония, гидрокарбонат аммония, сульфат аммония или нитрат аммония, могут применяться в качестве источников азота.

Среда со стабилизированным показателем рН может, наряду с карбонатом кальция, содержать все дополнительные, известные специалисту, требуемые для культивирования микроорганизмов отряда Т11гаи51ос11у1па1е5 компоненты, в частности, неорганические соли, например соли Са, Мд, Ыа, К, Ре, N1, Со, Си, Мп, Мо или Ζη. В качестве примеров могли бы быть названы фосфаты, такие как гидрофосфат калия, или хлориды, такие как хлорид магния, сульфаты, такие как сульфат аммония, сульфат магния, сульфат железа или сульфат натрия. Дополнительными применимыми неорганическими солями являются, например, галогениды, такие как бромид калия или иодид калия, а также другие карбонаты, такие как, например, гидрокарбонат натрия.

В случае необходимости эта среда может включать в себя дополнительные макро- или микроэлементы пищи, такие как аминокислоты, пурины, пиримидины, жидкий кукурузный экстракт (кукурузный экстракт), гидролизаты белков, витамины (водорастворимые и/или водонерастворимые) и другие хорошо известные специалисту компоненты сред. Если необходимо, могут быть добавлены антивспенивающие средства. Эта среда может содержать комплексные компоненты или иметь химически определенный состав.

Количество отдельных компонентов может варьироваться, пока отсутствует негативное действие на рост или продуктивность микроорганизмов. Специалист может легко определить состав в соответствии с потребностями микроорганизма в каждом отдельном случае. Обычно источник углерода добавляют в концентрации до 300 г/л, а источник азота в концентрации 1-30 г/л. Предпочтительно содержание азота устанавливают в зависимости от содержания углерода среды.

Особенно предпочтительная среда со стабилизированным показателем рН включает в себя глюкозу, дрожжевой экстракт, жидкий кукурузный экстракт (Сот 81еер Ыцоиг [С8Ь]), хлорид магния, карбонат кальция, хлорид кальция, сульфат натрия и фосфат калия.

Показатель рН этой среды устанавливают перед началом ферментации в диапазоне 3-10, предпочтительно 4-8, особенно предпочтительно 5-7 и еще более предпочтительно приблизительно 6 добавлением соответствующей кислоты или щелочи.

Затем среду стерилизуют. Способы стерилизации сред хорошо известны специалисту, например, могли бы быть названы автоклавирование и стерильное фильтрование.

Культивирование может происходить периодическим, периодическим с подпиткой или непрерывным образом, как это обычно известно специалисту в данной области.

Периодическое культивирование или периодическое культивирование с подпиткой происходит обычно на протяжении 1-12 дней, предпочтительно 2-10 дней, особенно предпочтительно 3-9 дней.

- 4 011877

Компоненты сред могут добавляться по отдельности или в смешанном виде, допустимо также предварительное смешивание. Эти компоненты, в частности, источник (источники) углерода и азота или определенные добавки к среде, могут добавляться до или во время культивирования. Добавление может повторяться один или несколько раз или происходить непрерывно.

Продуцируемые РИЕЛ существуют обычно в форме нейтральных жиров, например в виде триглицеридов или полярных липидов, таких как, например, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин или фосфатидилинозит.

Для целей данного изобретения под терминами РЦЕЛ жирные п3-кислоты или активные п3вещества подразумеваются все возможные формы, в которых могут находиться соответствующие жирные кислоты, т.е. как свободные жирные кислоты, так и сложные эфиры, триглицериды, фосфолипиды или другие производные. Все эти вещества в дальнейшем описании объединяются, и эти термины используются как синонимы. В дальнейшем эти РИГА могут быть преобразованы химической или биокаталитической переэтерификацией, например с использованием подходящих ферментов (липаз) и обогащены до или после выделения из культуры.

Выделение РИГА из ферментируемых микроорганизмов или из среды и анализ спектра жирных кислот происходит в соответствии с известными для специалиста и общепринятыми способами (^аиакипйга, υ.Ν., ^аиакипйга, 1., 8ЬаЫй1, Е., Отсда-3 ГаПу ас1й сопссп1га1с5: а гс\зс\\· οί ргойисйоп 1се1то1ощс5. 8саГооЙ5 - ОнаШу, ТссНпо1оду апй №1гассийса1 Аррйсайопк, 2002, 8. 157-174).

Далее, лежащая в основе способа данного изобретения ферментационная среда со стабилизированным рН описывается при помощи нескольких примеров. Однако эта ферментационная среда, а также данное изобретение не ограничиваются этими примерами.

Пример 1. Ферментация штамма Шксша крсс. 8ат 2179 для получения РиЕА в различных культуральных средах, показатель рН которых стабилизируется исключительно различными количествами СаСОз.

Штамм и1ксша крсс. 8ат 2179 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50 мл среды.

Состав среды:

Ферментационная среда:

Глюкоза

150 г/д

Кукурузный экстракт

3,75 г/л

КН₂РО₄ г/л

Νδ₂5Ο₄

МдС1₂х6Н₂О г/л г/л

СаС1₂х2Н₂О

0,3 г/л (ΝΗ₄)₂3Ο₄

Добавление СаСО₃ на каждую колбу на 50 мл:

Среда 1.1 г/л

О г/л

Среда 1.2

0,1 г/л

Среда 1.3 г/л

Среда 1.4 г/л

Среда 1.5 10 г

Показатель рН доводили до 6,0 при помощи ΝηΟΗ и автоклавировали. Условия культивирования:

Температура (°С): 28

Скорость встряхивания (об/мин): 150

Сбор клеток происходил после 96 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом хроматографе для определения состава жирных кислот.

- 5 011877

Таблица 1. Параметры ферментации в зависимости от концентрации карбоната кальция

	С’аСО₃ (г/л)	Потребление глюкозы (г/л)	Показатель рН	ВТМ (г/л)	Площадь ОНА (%)	ОНА/ВТМ (%)	ОНА (г/л)	ΟΗΑ-ΚΖΑ (г/лхд)
Среда 1.1	0	43,0	1,85	22,72	48,3	3,35	0,76	0,19
Среда 1.2	1	59,0	2,31	30,32	44,0	4,91	1,49	0,37
Среда 1.3	2	81,7	2,84	38,58	43,9	9,90	3,82	0,96
Среда 1.4	5	108,4	5,02	52,99	44,8	15,72	8,33	2,08
Среда 1.5	10	111,9	4,78	52,32	45,5	13,23	6,92	1,73

ВТМ: сухая биомасса; ΌΗΑ/ВТМ: мас.% ΌΗΆ (докозагексаеновой кислоты) на единицу массы ВТМ; г/лхд; объемно-временной выход в граммах на литр в день; площадь ΌΗΑ (%): доля ΌΗΑ в спектре жирных кислот.

Ферментация И1кеша крес. 8ат 2179 в ферментационной среде без достаточной стабилизации рН приводит в ходе ферментации к замедлению потребления глюкозы и к прекращению роста вследствие сильного понижения показателя рН (см. среда 1.1-1.3). Лишь более высокие количества СаСО₃-буфера приводят к стабилизации показателя рН во время культивирования (среда 1.4 и 1.5). При этом с увеличением концентрации СаСО3 происходит также повышенное потребление глюкозы во время культивирования. Вследствие стабилизации показателя рН и зависящего от этого повышенного потребления глюкозы достигаются более высокие показатели биомассы и происходящие вследствие этого более высокие объ емно-временные выходы, которые при вышеуказанных экспериментальных условиях находятся при приблизительно 2 г/л в день.

Пример 2. Ферментация штамма И1кеша крес. 8ат 2179 для получения РИТА в различных культуральных средах, показатель рН которых стабилизируется исключительно различными количествами СаСО₃, до лимитирования глюкозы

Штамм И1кеша крес. 8ат 2179 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50 мл среды до полного потребления глюкозы.

Состав среды:

Ферментационная среда:

Глюкоза 150 г/д

Кукурузный экстракт	3,75 г/л
КН₂РО₄	3 г/л
На₂ЗО₄	1 г/л
МдС1₂х6Н₂О	1 г/л
СаС1₂х2Н₂О	0,3 г/л

г/л (ΝΗ₄)₂5Ο₄

Добавление СаСО₃ на каждую колбу на 50 мл:

Показатель рН доводили до 6,0 с помощью ΝηΘΗ и автоклавировали.

Условия культивирования:

Температура (°С): 28

Скорость встряхивания (об/мин); 150

Сбор клеток происходил после 144,5 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом хроматографе для определения состава жирных кислот.

Таблица 2. Параметры ферментации после лимитирования глюкозы

	СаСО₅ (г/л)	Потребление глюкозы (г/л)	Показатель рН	ВТМ (г/л)	Площадь ОНА (%)	ОНА/ВТМ (%)	ΌΗΑ (г/л)	ϋΗΑ-ΚΖΑ (г/лхд)
Среда 1.4	5	150,0	6,49	58,52	47,7	22,20	12,99	2,14
Среда 1.5	10	150,0	6,58	64,65	46,7	20,54	13,28	2,19

Ферментация И1кеша крес. 8ат 2179 в забуференной 5 г/л или 10 г/л СаСО₃ среде делает возможным культивирование до лимитирования глюкозы без сильного понижения показателя рН. Достигаемая при этом биомасса и доля ΌΗΑ на биомассу, с приблизительно 58-64 г/л биомассой и 20-22% ΌΗΑ/ВТМ,

- 6 011877 являются в соответствии с полным потреблением глюкозы очень высокими. При этом оказывается, что более высокая концентрация СаСО₃ (10 г/л) приводит к более высокой биомассе, однако доля важной ΌΗΆ РИЕЛ в расчете на биомассу несколько снижается. Однако полученный при этом объемновременной выход ΌΗΆ остается приблизительно одинаковым при обеих концентрациях.

Выход 3. Культивирование штамма Шкеша крес. 8аш 2179 для получения РИЕЛ при оптимизированных условиях ферментации

Штамм И1кеша крес. 8аш 2179 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50 мл среды до полного потребления глюкозы. Оптимизирование ферментации происходило из концентрации СаСО₃ 7,5 г/л и измененной предварительной культуры. Для предварительной культуры применяли вместо стационарной культуры в ΌΗ1-среде встряхиваемую культуру с той же самой средой (48 ч, 150 об./мин и 28°С).

Состав среды:

Среда предварительной культуры: Среда ΌΗ1

Моногидрат глюкозы (г/л): 56,25

Дрожжевой экстракт (г/л):

Тгордс Магхп (г/л)

12,5 [(Όΐίοο)]

16,65 [Ог.Вдепег СтЬН, рН доводили до 6,0 при помощи Ηί,Ί. Ферментационная среда:

Глюкоза

Кукурузный экстракт

КН₂РО₄

МдС1₂хбН₂О

СаС1₂х2Н₂О (ΝΗ₄)₂3Ο₄

Добавление СаСО3 на каждую колбу на 50 мл: Среда 1.6

ИагХепЬегд, Сегшапу]

150 г/д

3,75 г/л г/л г/л г/л

0,3 г/л г/л

7,5 г/л

Условия культивирования:

Температура (°С) : 28

Скорость встряхивания (об/мин): 150

Сбор клеток происходил после 99,75 ч культивирования посредством центрифугирования. Затем клетки лиофилизировали и определяли сухую биомассу. Расщепление клеток и определение жирных кислот происходило обработкой нагреванием в течение 2 ч в 10%-ном метанольном растворе хлористоводородной кислоты при 60°С (при перемешивании). Затем сложные эфиры анализировали в газовом хроматографе для определения состава жирных кислот.

Таблица 3. Параметры ферментации при оптимизированных буферных условиях

	СаСО₃ (г/л)	Потребление глюкозы (г/л)	Показатель рН	ВТМ (г/л)	Площадь ОНА (%)	ϋΗΑ/ΒΤΜ (%)	ОНА (г/л)	ΟΗΑ-ΚΖΑ (г/лхд)
Среда 1.6	7,5	150,0	6,76	63,84	44,1	23,06	14,72	3,54

Посредством применения оптимизированных условий ферментации, при которых Шкеша крес. 8аш 2179 сначала культивировали 48 ч при 28°С и 150 об./мин в среде ΌΗ1, удалось значительно улучшить объемно-временной выход на более, чем 3,5 г/лхд. Это достигается прежде всего за счет более быстрого роста, посредством чего лимитирование глюкозы достигалось за менее чем 100 ч. Применение 7,5 г/л СаСО3 в ферментационной среде позволяет достигать стабилизации рН, необходимой для оптимизированного культивирования. Применение 7,5 г/л СаСО₃ вытекало из результатов примера 2, в которых 10 г/л СаСО3 давало более высокие показатели биомассы, а 5 г/л, напротив, приводили к лучшим показателям ΌΗΆ. Таким образом, предполагалось, что оптимальная для получения ΌΗΆ концентрация СаСО₃(т.е. для получения наивысшей возможной биомассы при наивысшем возможном содержании ΌΗΆ) находится между 5 и 10 г/л СаСО3. Наряду со стабилизацией показателя рН применение ферментационной среды в соответствии с данным изобретением приводит к удивительно высокому объемно-временному выходу ΌΗΆ более 3 г/лхд к моменту ограничения по глюкозе. При этом достигались показатели биомассы, какие были получены в примере 2, но, кроме того, доля ΌΗΆ на сухую биомассу и достигаемые количества ΌΗΆ (более 10%) были более высокими.

- 7 011877

Пример 4. Ферментация штамма Шкеша крес. Зат 2179 для получения РИГА в культуральной среде с стабилизацией рН или без стабилизации рН с использованием СаСО₃

Штамм Шкеша крес. Зат 2179 культивировали в каждом случае в 5-литровом ферментере до полного потребления глюкозы.

Состав среды:

Ферментационная среда:

Глюкоза	150 г/д
Кукурузный экстракт	3,75 г/л
КН₂РО₄	3 г/л
Ыа₂5О₄	1 г/л
МдС1₂х6Н₂О	1 г/л
СаС1₂х2Н₂О	0,3 г/л
(ΝΗ₄)₂5Ο₄	5 г/л

Для ферментации с регулированием рН: показатель рН доводили до 4,0 при помощи Н₃РО₄ и авто клавировали.

Для ферментации без регулирования рН: показатель рН доводили до 6,0 при помощи ЫаОН и автоклавировали, как и добавку 7,5 г/л СаСО₃.

Условия культивирования:

Температура (°С): 28

Аэрация: 0,8 ννιη

Таблица 4. Параметры ферментации с регулированием и без регулирования рН

Регулирование рн	СаСОз (г/л)	Потребление глюкозы (г/л)	Время потребления глюкозы (ч)	ВТМ (г/л)	Площадь ϋΗΑ (%)	ϋΗΑ/ΒΤΜ (%)	ϋΗΑ (г/л)	ΏΗΑ- ΚΖΑ (г/лхд)
+	0	150,0	162	66,9	47,2	25,9	17,35	2,5
-	7,5	150,0	150	67,8	46,7	26,9	18,30	2,9

Применение стабилизированной при помощи СаСО3 ферментационной среды данного изобретения делает возможным также культивирование Шкеша крес. Зат 2179 в 5-литровом ферментере до лимитирования глюкозы, без регулирования рН. Применение СаСО3 в достаточном количестве приводит к более быстрому росту вследствие ускоренного потребления глюкозы. Кроме того, достигаются более высокие биомассы. Далее, в этой связи во время ферментации достигаются более высокая доля ΌΗΑ на биомассу и более высокие количества ОНА. Это приводит к существенному повышению объемно-временного выхода ΌΗΑ при СаСО₃-забуференной в отношении ферментации рН более чем на 15%.

Пример 5. Ферментация Зс1и/ос11у1пшп крес. ЗИ21 для получения РИГА в ферментационной среде 1.6, стабилизированной 7,5 г/л СаСО₃

Штамм Зс1ихос11у1пшп крес. ЗИ21 культивировали в колбах Эрленмейера на 300 мл с дефлектором в 50 мл среды до полного потребления глюкозы.

Состав среды:

Среда предварительной культуры:

Глюкоза (г/л)

Дрожжевой экстракт (г/л):

Тгорбс Магбп (г/л)

НагТепЬегд, Сегтапу] среда СУ

10,0 [(ϋϊίοο)]

16,65 [Ог. Вбепег СтЬН, рН доводили до 6,0 при помощи НС1.

Ферментационная среда:

Глюкоза	150 г/д
Кукурузный экстракт	3,75 г/л
КН₂РО₄	3 г/л
Да₂ЗО₄	1 г/л
МдС1₂хбН₂О	1 г/л
СаС1_гх2Н₂О	0,3 г/л
(ΝΗ₄)₂5Ο₄	5 г/л

- 8 011877

Добавление СаСО₃ на каждую колбу на 50 мл:

Среда 1.6 7,5 г/л

Показатель рН доводили до 6,0 при помощи ΝαΟΗ и автоклавировали.

Условия культивирования:

Температура (°С): 28

Скорость встряхивания (об/мин): 150

Таблица 5. Параметры ферментации при оптимизированных буферных условиях

	СаСОз (г/л)	Потребление глюкозы (г/л)	Показатель рН	ВТМ (г/л)	Площадь ОНА (%)	БНА/ВТМ (%)	ОНА (г/л)	ϋΗΆ-ΚΖΆ (г/лхд)
8К	7,5	150,0	7,35	66,12	34,4	15,28	10,10	2,52

Описанная в данном изобретении среда со стабилизированным при помощи СаСО3 рН приводит к оптимизации получения РИЕЛ также и у других организмов ЬаЬуг1п1йи1отусо1а. Так, например, микроорганизм, являющийся штаммом 8с1ихос11у1пит крес. 8К.21, мог ферментироваться в среде, лежащей в основе данного изобретения. Объемно-временной выход важной РИГА, БНА, в штамме 8К21 является несколько более низким, чем в И1кеша крес. 8ат 2179 (см. пример 3), однако в расчете на важную п-3 РИГА, БНА он равен более 15% (мас./мас.) всей сухой биомассы. Этот пример показывает, что лежащая в основе данного изобретения оптимизированная среда со стабилизированным рН делает возможной ферментацию без регулирования рН для получения РИГА также и в других членах ЬаЬуг1п1йи1отусо1а.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ культивирования микроорганизмов отряда Т11гаик1ос11у1па1ек в ферментационной среде с добавлением 3-15 г/л СаСО₃ для стабилизации показателя рН между 3 и 10, при температуре между 10 и 40°С в течение 1-10 дней, где микроорганизмы способны продуцировать масло, содержащее более чем 10 мас.% докозагексаеновой кислоты (БНА) и более чем 1% докозапентаеновой кислоты (БРА).
2. Способ по п.1, в котором микроорганизмы продуцируют более чем 25, предпочтительно более чем 35 и особенно предпочтительно более чем 45 мас.% масла на единицу массы сухой биомассы.
3. Способ по п.1, в котором микроорганизмы продуцируют предпочтительно более чем 14 и особенно предпочтительно более чем 18 мас.% и еще более предпочтительно более чем 22 мас.% докозагексаеновой кислоты (БНА) на единицу массы сухой биомассы.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором микроорганизмы продуцируют предпочтительно более чем 2%, особенно предпочтительно более чем 3% и еще более предпочтительно более чем 4% докозапентаеновой кислоты (БРА) на сухую биомассу.
5. Способ по п.1 или 2, в котором к среде добавлено предпочтительно 4-12 г/л, особенно предпочтительно 5-10 г/л и еще более предпочтительно 7,5±0,5 г/л СаСО₃.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что среда включает глюкозу, кукурузный экстракт, хлорид магния, хлорид кальция, карбонат кальция, сульфат натрия, сульфат аммония и гидрофосфат калия.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что среда имеет показатель рН предпочтительно между 5 и 7.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что культивирование происходит предпочтительно между 25 и 35°С.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что культивирование происходит предпочтительно в течение 3-9 дней.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что микроорганизм принадлежит к роду 8с1ихос11у1пит. Т11гаик1ос11у1пит или И1кеп1а.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этим микроорганизмом является Шкеша крес. 8ат 2179.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что микроорганизмом является 8с1ихос11у1пит крес. 8И 21.
13. Масло с содержанием по меньшей мере 20% БНА, предпочтительно по меньшей мере 30% БНА и особенно предпочтительно по меньшей мере 40% БНА от общего содержания полиненасыщенных жирных кислот, полученное с применением способа культивирования микроорганизмов отряда Тйтаик1ос11у1па1ек по любому из пп.1-12 и последующего выделения этого масла из культурального бульона и/или находящейся в нем биомассы.
14. Масло с содержанием по меньшей мере 3% БРА, предпочтительно по меньшей мере 6% БРА и особенно предпочтительно по меньшей мере 9% БРА от общего содержания полиненасыщенных жир

- 9 011877 ных кислот, полученное с применением способа культивирования микроорганизмов отряда ТНгаийосНу1па1е5 по любому из пп.1-12 и последующего выделения этого масла из культурального бульона и/или находящейся в нем биомассы.
15. Биомасса, полученная с использованием способа культивирования микроорганизмов отряда Т11гаи51ос11у1па1е5 по любому из пп.1-12 и последующего отделения этой биомассы из культурального бульона.
16. Кормовой продукт, включающий биомассу по п.15.
17. Пищевой продукт для питания человека, включающий биомассу по п.15.