ES2385484T3 - Proteínas de unión a IL-18 - Google Patents

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ES2385484T3 ES04817825T ES04817825T ES2385484T3 ES 2385484 T3 ES2385484 T3 ES 2385484T3 ES 04817825 T ES04817825 T ES 04817825T ES 04817825 T ES04817825 T ES 04817825T ES 2385484 T3 ES2385484 T3 ES 2385484T3
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ES04817825T
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Tariq Ghayur
Boris Labkovsky
Jeffrey W. Voss
Larry Green
John Babcook
Xiao-Chi Jia
James Wieler
Jaspal Singh Kang
Brad Hedberg
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Abbott Laboratories
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Abstract

Un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, capaz de unirse IL-18 humana, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, comprende una CDR-H1 que tiene los Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 6; una CDR-H2 que tiene los Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 6; una CDR-H3 que tiene los Residuos 99-110 del SEQ ID NO: 6; una CDR-L1 que tiene los Residuos 24-34 del SEQ ID NO: 7; una CDR-L2 que tiene los Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 7; y una CDR-L3 que tiene los Residuos 89-98 del SEQ ID NO: 7.

Description

Proteínas de Unión a IL-18.
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a proteínas de unión a interleuquina 18 (IL-18), y específicamente a sus usos en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas.
Antecedentes de la Invención
La interleuquina-18 (IL-18) fue descrita originalmente en 1989 como factor inductor del interferón gamma (IGIF) y como citoquina pro-inflamatoria con diferentes funciones además de una capacidad para inducir interferón gamma. Estas propiedades biológicas incluyen la activación de NF-Kb, la expresión del ligando Fas, la inducción de quimioquinas tanto CC como CXC, y el aumento de la producción del virus de la inmunodeficiencia humana competente. Debido a la capacidad de IL-18 para inducir la producción de interferón gamma en células T y macrófagos, juega un importante papel en las respuestas inmunitarias de tipo Th1 y participa en la inmunidad tanto innata como adquirida. La IL-18 está relacionada con la familia IL-1 en términos tanto de la estructura como de la función. Para las revisiones de la estructura, la función y la actividad de la IL-18, véanse por ejemplo Dinarello, C. et al. (1998) J. Leukoc. Biol. 63:658-654; Dinarello, C.A. (1999) Methods 19:121-132; y Dinarello, C.A. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 103:11-24; (McInnes, I.B. et. al. (2000) Immunology Today 21:312-315; Nakanishi, K. et al (2001) Ann. Rev. Immunol 19:423-474.
La pro-IL-18 intracelular es procesada proteolíticamente a una forma activa de 18 kDa en células estimuladas con endotoxinas por la caspasa 1 (Ghayur, T. et al., (1997) Nature 386:619-623; Gu, Y. et al., (1997) Science 275:206209) y en células estimuladas por ADN bacteriano o Fas-L por las caspasas 4, 5 y 6 (Tsutsui, H. et al., (1999) Immunity 11:359-67; Ghayur, T., Observaciones No Publicadas). La pro-IL-18 también es procesada proteolíticamente por otras proteasas tales como la proteinasa 3 de neutrófilos (Sugawara, S. et al., (2001) J. Immunol., 167, 6568-6575), la caspasa 3 (Akita, K. et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 26595-26603), y las serina proteasas elastasa y catepsina (Gracie J. A., et al., (2003) Journal of Leukocyte Biology 73, 213-224). Tanto la IL-18 humana como la murina carecen de una secuencia líder clásica y el mecanismo de liberación de la IL-18 madura por las células no es bien conocido.
Las actividades biológicas de la IL-18 están mediadas por la unión de IL-18 a un receptor de IL-18 heterodimérico (IL-18R) que consta de dos subunidades: la subunidad a (un miembro de la familia de IL-1R, también denominado proteína relacionada con IL-1R 1 o IL-1Rrp1) y la subunidad � (también denominada proteína accesoria de IL-18R, IL-18AP o AcPL). La subunidad IL-48Ra se une a IL-18 directamente, pero no es competente para la transducción de la señal. La subunidad � no se une a IL-19 por sí misma, si no que en conexión con la subunidad a forma el receptor de alta afinidad (KD = -0,3 nM) que es necesario para la transducción de la señal (Sims, J.E., (2002) Current Opin Immunol. 14:117-122). La transducción de la señal de IL-18 a través del complejo IL-18Ra� es similar a los sistemas de receptores IL-1R y de tipo Toll (TLR). La señalización de IL-18R utiliza moléculas de transducción de la señal, tales como MyD88, IRAK, TRAF6 y produce respuestas similares (p. ej. activación de las quinasas NIK, IkB, NF-kB, JNK y la quinasa p38 MAP) como lo hace IL-1. El requerimiento de IL-18Ra y las moléculas de transducción de la señal en la mediación en la bioactividad IL-18 ha sido confirmado utilizando genes desactivados de la subunidad IL-18Ra (Hoshino K., et al (1999) J. Immunol. 162:5041-5044;), MyD88 (Adachi O., et al. (1998) Immunity 9:143-150) o IRAK (Kanakaraj P., (1999) J. Exp. Med. 189:1129-1138) respectivamente.
Los anticuerpos que se unen a IL-18 son conocidos en la técnica. Los anticuerpos de ratón competentes para neutralizar IL-18 se describen en el documento EP 0 974 600. En el documento WO 00/56771 se describen anticuerpos de rata para IL-18 humano que, debido a su origen tienen desventajas conocidas para su uso en seres humanos, en particular inmunogenicidad en seres humanos. Los anticuerpos humanos para IL-18 han sido descritos en la publicación PCT WO 0158956. La presente invención proporciona una familia novedosa de proteínas de unión, anticuerpo humanos, y fragmentos de los mismos, capaces de unirse a IL-18, unirse con elevada afinidad, y de unirse y neutralizar IL-18.
Compendio de la Invención
Esta invención tiene que ver con proteínas de unión a IL-18, concretamente anticuerpos para IL-18 humana, así como con métodos de elaboración y uso de tales proteínas de unión. Un aspecto de la invención tiene que ver con un método de regulación de la expresión génica utilizando un modulador de IL-18.
Un aspecto de esta descripción tiene que ver con una proteína de unión que comprende un dominio de unión a un antígeno capaz de unirse a la IL-18 humana.
El dominio de unión a antígeno de la invención comprende las siguientes CDR: Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 6; Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 6; Residuos 99-110 del SEQ ID NO: 6; Residuos 24-34 del SEQ ID NO: 7; Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 7; y Residuos 89-98 del SEQ ID NO: 7.
En otra realización preferida la proteína de unión comprende un dominio VH. Preferiblemente el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6. En otra realización la proteína de unión comprende un dominio VL. Preferiblemente el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7.
En una realización preferida la proteína de unión comprende un dominio VH y uno VL. Más preferiblemente la proteína de unión comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6 y el dominio VL del SEQ ID NO: 7 NO: 6.
En otra realización la proteína de unión comprende adicionalmente un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana; un dominio constante de IgG1 humana; un dominio constante de IgG2 humana; un dominio constante de IgG3 humana; un dominio constante de IgG4 humana; un dominio constante de IgE humana y un dominio constante de IgA humana. Preferiblemente el dominio de la región constante de la inmunoglobulina es un dominio constante de IgG1 humana. Preferiblemente al menos un residuo de aminoácido se remplaza en el dominio de la región constante de la cadena pesada de manera que se alteren las funciones efectoras del anticuerpo. Más preferiblemente el dominio constante de la IgG1 humana comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 2, y el SEQ ID NO: 3.
En otra realización la proteína de unión comprende adicionalmente un dominio constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante kappa de Ig humana; y un dominio constante lambda de Ig humana. Preferiblemente el dominio constante kappa de Ig humana comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 y el dominio constante lambda de la Ig humana comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.
En otra realización la proteína de unión comprende una región pesada constante de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: el SEQ ID NO: 2, y el SEQ ID NO: 3; una región ligera constante de IG que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: el SEQ ID NO: 4, y el SEQ ID NO: 5; una región pesada variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6; y una región ligera variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7
En otra realización la proteína de unión comprende una región pesada constante de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3; una región ligera constante de IG que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4; y una región pesada variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6; y una región ligera variable de Ig que tiene una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7.
En otra realización la unión se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunogloblina o variantes funcionales de la misma conocidas en la técnica, cuyas variantes conservan la propiedad de unión característica de la proteína de unión. Los ejemplos de las realizaciones de inmunoglobulinas específicas incluyen, pero no están limitadas a scFv; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo humanizado; un anticuerpo de un solo dominio; un fragmento Fab; un fragmento Fab'; un F(ab')2; un Fv; un FV conectado a disulfuro, y un anticuerpo biespecífico o de especificidad dual. Muy preferiblemente la proteína de unión es un anticuerpo humano.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión neutralizadora que comprende una cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente donde la proteína de unión neutralizadora es capaz de neutralizar IL-18. Preferiblemente la proteína de unión neutralizadora es capaz de neutralizar una cualquiera de pro-IL-18 humana; IL18 madura humana o IL-18 truncada humana. En otra realización la proteína de unión neutralizadora disminuye la capacidad de IL-18 para unirse a su receptor. Preferiblemente la proteína de unión neutralizadora disminuye la capacidad de pro-IL-18 humana; IL-18 madura humana o IL-18 truncada humana para unirse a su receptor.
En otra realización la proteína de unión neutralizadora es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de IL-18 seleccionadas del grupo que consiste en, modulación de Th1; modulación de Th2 (Nakanishi K., et al (2001) Cytokine and Growth Factor Rev. 12:53-72); modulación de Nk; modulación de neutrófilos; modulación del linaje de monocitos-macrófagos; modulación de neutrófilos; modulación de eosinófilos; modulación de células B; modulación de citoquinas; modulación de quimioquinas; modulación de moléculas de adherencia; y modulación del reclutamiento celular.
En una realización preferida la proteína de unión neutralizadora tiene una constante de disociación (KD) seleccionada del grupo que consiste en: a lo sumo alrededor de 10-7 M; a lo sumo alrededor de 10-8 M; a lo sumo alrededor de 10-9 M; a lo sumo alrededor de 10-10 M; a lo sumo alrededor de 10-11M; a lo sumo alrededor de 10-12 M; y a lo sumo 10-13M.
En otra realización la proteína de unión neutralizadora tiene una constante de unión seleccionada del grupo que consiste en: al menos alrededor de 102M-1s-1; al menos alrededor de 103M-1s-1; al menos alrededor de 104M-1s-1 ; al menos alrededor de 105M-1s-1; y al menos alrededor de 106M-1s-1.
En otra realización más la proteína de unión neutralizadora tiene una constante de desunión seleccionada del grupo que consiste en: a lo sumo alrededor de 10-3s-1; a lo sumo alrededor de 10-4s-1; a lo sumo alrededor de 10-5s-1; y a lo sumo alrededor de 10-6s-1.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión marcada que comprende una cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente donde la proteína de unión se conjuga con una marca detectable. Preferiblemente la marca detectable se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y biotina. Más preferiblemente la radiomarca es H3, C14, S35, Y90, Tc99, In111, I125, I131, Lu177, Ho166, o Sm153.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína conjugada que comprende una cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente donde dicha proteína de unión se conjuga con un agente terapéutico o citotóxico. Preferiblemente el agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un antimetabolito; un agente alquilante; un antibiótico; un factor de crecimiento; una citoquina; un agente anti-angiogénico; un agente antimitótico; una antraciclina; una toxina; y un agente apoptótico.
Una realización tiene que ver con un ácido nucleico aislado que codifica una cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente. Una realización adicional proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado descrito anteriormente donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT con un sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima, S. y Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; y pBJ.
En otra realización una célula anfitriona es transformada con el vector. Preferiblemente la célula anfitriona es una célula procariótica. Más preferiblemente la célula anfitriona es E.Coli. En una realización relacionada la célula anfitriona es una célula eucariótica. Preferiblemente la célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste en células protistas, células animales, células vegetales y células fúngicas. Más preferiblemente la célula anfitriona es una célula de mamífero incluyendo, pero no limitada a, CHO y COS; o una célula fúngica tal como Saccharomyces cerevisiae; o una célula de insecto tal como Sf9.
Otro aspecto de la invención proporciona un método para la producción de una proteína de unión que se une a IL-18 humana, que comprende cultivar una cualquiera de las células anfitrionas descritas anteriormente en un medio de cultivo en condiciones suficientes para producir una proteína de unión que se une a IL-18 humana. Otra realización proporciona una proteína de unión producida de acuerdo con el método descrito anteriormente.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión cristalizada que comprende una cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente, donde la proteína de unión existe en forma de cristal. Preferiblemente el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico son portador. En una realización la proteína de unión que existe en forma de cristal tiene una vida media in vivo superior a la de la contraparte soluble de la proteína de unión. En otra realización la proteína de unión conserva su actividad biológica después de la cristalización.
Una realización proporciona una composición para la liberación de una proteína de unión donde la composición comprende una formulación que a su vez comprende una proteína de unión cristalizada como se ha descrito anteriormente y un ingrediente; y al menos un portador polimérico. Preferiblemente el portador polimérico es un polímero seleccionado entre uno o más del grupo que consiste en: poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido), poli(ésteres), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico)
o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona); poli(etilenglicol), poli((hidroxipropil)metacrilamida, poli[(organo)fosfazeno], poli(ortoésteres), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-alquilviniléter, polioles pluronic, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, combi9naciones y copolímeros de los mismos. Preferiblemente el ingrediente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-�-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol. Otra realización proporciona un método para el tratamiento de un mamífero que comprende la etapa de administración al mamífero de una cantidad eficaz de la composición descrita anteriormente.
Otro aspecto de la descripción proporciona un método para la regulación de la expresión génica de un gen de interés que comprende las etapas de proporcionar un polipéptido IL-18 o un modulador de IL-18; y poner en contacto el polipéptido o modulador con una célula donde el gen de interés se selecciona del grupo que consiste en los genes identificados mediante los números de Identificación Genbank:
NM_000389,
NM_002198, NM_002163, NM_006144, NM_006515, NM_007185, NM_002288,
NM_003661,
NM_021958, NM_001335, Hs.382006, NM_020125, NM_007210, NM_021798,
NM_013324,
M11313, D88152, NM-001103, U37519, NM_000697, J03600,
NK_014578,
566793, U47054, L19871, M81181, NM_001188, U15460,
NM_014417,
Z23115, NM_001713, U45878, U37546, U72649, U49187,
J03507,
U50360 XM_071866, NM_005623, Z32765, Z11697, XM_071866,
U51096,
M83667, D87469, L07765, U66468, X14830, L29217,
X15880,
NM_001851, M27691, M37435, X13589, X16866, X59131,
NM_004393,
U73328, L19267, U53445, X68277, U48807, NM_001950,
U87269,
M57730, X52541, J04076, X63741, L07077, M62831,
M60830,
U53786, NM_001988, NM_000141, M23668, U60062, NM_000141,
U49973,
U89995, U27326, A28102, M25667, L34357, U19523,
L01406,
U03486, X68285, Z18859, D49958, D43772, AC000099,
M57731,
X53800, M91036, D16583, X64877, X58431, M16937,
NM_014468,
X92814, L19314, M26665, D10995, L41147, M24283,
S81914,
J03171, J00219, NM_000619, NM_000585, U31628, X04500,
M27492,
X01057, M26062, Y00081, Y00787, Z31695, X06256,
X57206,
U20734, NM_014879, D31762, D42038, NM_005551, NM_014846,
X06182,
NM_005551, X07730, M13955, M57710, S83362, NM_002314,
NM_005569,
U49957, U89922, X14008, U59914, D14497, X59727,
NM_000429,
U43944, X72755, NM_021230,NM_005951, X78710, X70991,
M32011,
S77763, M58603, S76638, M69043, U91616, D86425,
L13740,
U44848, U79251, M27288, AF000234, D50640, L20971,
L10343,
U77735, NM_003579, U17034, AB000584, X63131, D11428,
NM_032940,
NM_005035, NM_003579, M18255, L01087, D38128, Y10375,
D15049,
M31166, U59877, NM_003579, U64675, S57153, NM_002903,
NG_000013,
X75042, M83221, NM_000537, U22314, S59049, U70426,
U22377,
U38480, L10338, M23178, M69203, NM_005409, D79206,
NM_005065,
NM_004186, J03764, NM_006802, D89077, NM_003037, M91463,
D82326,
L05568, U96094, X83301, D21267, L31529, M62800,
NM_021014,
Z35093, NM_005816, L25444, M95787, NM_005421, L47345,
M57732,
NM-003205, M96956, U19878, M92357, M59465, X83490,
U37518,
NM_003294, U19261, U78798, S69790, U53476, L15309,
U78722,
X57809, U79249, AB000464, X77744, U79248, AI420129,
HG2981-HT3127,
HG3548-HT3749, HG870-HT870, HG4333-HT4603,
HG3111-HT3287,
HG4593-HT4998, HG961-HT961, HG1877-HT1917,
HG3115-HT3291,
HG4115-HT4385, y HG3925-HT4195.
Preferiblemente el modulador es un antagonista. Más preferiblemente el modulador es una proteína de unión o una proteína de unión neutralizadora.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión o una proteína de unión neutralizadora como las descritas anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional la composición farmacéutica comprende al menos un agente terapéutico adicional para el tratamiento de un trastorno en el que actividad de IL-18 es perjudicial. Preferiblemente el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: inhibidores de la angiogénesis (incluyendo pero no limitados un anticuerpos anti-VEGF o trampa de VEGF); inhibidores de quinasas (incluyendo pero no limitados a inhibidores de KDR y TIE-2); bloqueadores de la coestimulación molecular (incluyendo pero no limitados a anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-Ig, anti-CD20); bloqueadores de moléculas de adherencia (incluyendo pero no limitados a Acs anti-LFA-1, Acs anti-selectina E/L, inhibidores de molécula pequeña); anticuerpos anti-citoquina o fragmentos funcionales de los mismos (incluyendo pero no limitados a anti-IL-12, anti-TNF, anticuerpos anti-IL-6/receptor de citoquina); metotrexato; corticoesteroides; ciclosporina; rapamicina; FK506; y agentes antiinflamatorios no esteroideos.
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión para su uso en un método para la inhibición de la actividad humana de IL-18 que comprende poner en contacto IL-18 humana con una proteína de unión descrita anteriormente de manera que se inhiba la actividad humana de IL-18. En un aspecto relacionado la invención proporciona una proteína de unión para su uso en un método para la inhibición de la actividad humana de IL-18 en un sujeto humano que sufra un trastorno en el que actividad de IL-18 es perjudicial, que comprende la administración al sujeto humano de una proteína de unión descrita anteriormente de manera que se inhiba la actividad humana de IL-18 en el sujeto humano y se logre el. Preferiblemente el trastorno se selecciona del grupo que comprende artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, y artritis séptica, espondiloartropatía, lupus eritematoso generalizado, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes mellitus insulinodependiente, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, enfermedad de injerto contra anfitrión, rechazo en el trasplante de órganos (incluyendo pero no limitado a médula ósea y rechazo de órganos sólidos), enfermedad inmunitaria aguda o crónica asociada con el trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Graves, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, neoplasias, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II, esporádicas, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía colítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, artropatía asociada a yersinia y salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad bulosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con la Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedad del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad del tejido conectivo mixta, esclerosis sistémica asociada a enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial, lupus eritematoso generalizado asociado a enfermedad pulmonar, dermatomiositis/polimiositis asociadas a enfermedad pulmonar, enfermedad de Sjögren asociada a enfermedad pulmonar, espondilitis anquilosante asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, hemosiderosis asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterans, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis anti-anticuerpo LKM), hipoglicemia mediada por procesos autoinmunes, resistencia a insulina de tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada con el trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria crónica asociada con el trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis de tipo 1, psoriasis de tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad espermática, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis generalizada, síndrome de Sjögren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune goitrosa (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleostasis, enfermedad hepática idiosincrática. hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS), trastornos mentales (p. ej., depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por Tipo Th2 y Tipo Th1, y cánceres tales como pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y cáncer de recto y neoplasias hematopoyéticas (leucemia y linfoma).
En otro aspecto la invención proporciona una proteína de unión para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece un trastorno en el que IL-18 es perjudicial que comprende la etapa de administración de una cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente antes, durante, o después de la administración de un segundo agente, como se ha comentado anteriormente.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión neutralizadora seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo humanizado y un anticuerpo injertado a CDR, donde la proteína de unión neutralizadora es capaz de unirse a IL-18 madura humana y pro-IL-18 humana.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión neutralizadora seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo humanizado y un anticuerpo injertado a CDR, donde la proteína de unión neutralizadora no es capaz de competir con el anticuerpo 125-2H para unirse a IL-18 humana.
Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión neutralizadora seleccionada del grupo que consiste en un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo humanizado y un anticuerpo injertado a CDR, donde la proteína de unión neutralizadora no es capaz de competir con IL-18BP para unirse a IL-18 humana.
En una realización preferida la proteína de unión es capaz de unirse a IL-18 madura humana. En otra realización la proteína de unión no es capaz de competir con el anticuerpo 125-2H para unirse a IL-18 humana. En otra realización más la proteína de unión no es capaz de competir, con IL-18BP para unirse a IL-18 humana.
Descripción Detallada de la invención
Esta invención tiene que ver con proteínas de unión a IL-18, particularmente anticuerpos anti-IL-18, o sus porciones de unión al antígeno, que se unen a la misma. Algunos aspectos de la invención se refieren a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y sus composiciones farmacéuticas, así como a ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células anfitrionas para elaborar tales anticuerpos y fragmentos. Los métodos para la utilización de los anticuerpos de la invención para detectar IL-18 humana, para inhibir la actividad humana de IL-18, in vitro o in vivo, y para regular la expresión génica también son proporcionados por la descripción. Esta invención también tiene que ver con una IL-18 truncada. En aspectos relacionados la invención también tiene que ver con ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células anfitrionas para elaborar IL-18 truncada.
A no ser que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que son comprendidos comúnmente por los expertos normales en la técnica. Adicionalmente, a no ser que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas diferentes, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Asimismo, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan los elementos y los componentes que comprenden una unidad y los elementos y los componentes que comprenden más de una subunidad a no ser que se indique específicamente lo contrario.
Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los mecanismos de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácido nucleico descritas en la presente memoria son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Los métodos y mecanismos de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que son citadas y comentadas a lo largo de la presente memoria a no ser que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, según se levan a cabo en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas convencionales para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación, y la liberación, y el tratamiento de pacientes.
Para que la presente invención sea entendida más fácilmente, los términos seleccionados se definen más abajo.
El término "Polipéptido" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente con el término polipéptido y también hacen referencia a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. El polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de obtención son están asociados con componentes asociados naturalmente que los acompañan en su estado nativo; están sustancialmente libres de otras proteínas de las mismas especies; son expresados por una célula de una especie diferente; o no se producen en la naturaleza. De este modo, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula a partir de la que se origina naturalmente será "aislada" de sus componentes asociados naturalmente. Una proteína se puede entregar también sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, utilizando mecanismos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica.
El término "recuperación" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia al procedimiento de entrega de una especie química tal como un polipéptido sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, p. ej., utilizando mecanismos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica.
El término "IL-18" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a la citoquina también conocida como factor inductor de interferón-gamma (IGIF), esto es, una citoquina proinflamatoria, que exhibe diversas funciones además de la capacidad de inducir interferón gamma. El término "IL-18 humana" utilizado indistintamente con el término "hIL-18" abarca el polipéptido de SEQ ID NO: 1 y fragmentos del mismo, incluyendo pero no limitado a, proIL-18 humana, IL-18 humana madura, y cualquier IL-18 truncada humana que conserve la actividad biológica de IL18 como se describe en la presente memoria. El término "pro-IL-18 humana" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un polipéptido del SEQ ID NO: 1. El término "IL-18 humana madura" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a los residuos 37-193 del SEQ ID NO: 1, y el término "IL-18 truncada humana según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a los residuos 59-193 del SEQ ID NO: 1. Preferiblemente la IL-18, y los fragmentos de la misma, son biológicamente activos. El término "IL-18 humana recombinante" o "rhIL-18" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a IL-18 humana generada in vitro utilizando técnicas de ADN recombinante.
La "actividad biológica de IL-18" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a todas las propiedades biológicas inherentes de la citoquina IL-18. Las propiedades biológicas de IL-18 incluyen pero no están limitadas a la unión al receptor de IL-18; la promoción de la maduración y la activación de las células Th1 y Tc1; la promoción de la producción de citoquinas tales como TNF, IFNy y IL-1� mediante diversos tipos celulares; la promoción de macrófagos para liberar citoquinas tales como TNF y IFNy, produciendo NO; la promoción de la expresión de FasL, citotoxicidad y liberación de citoquinas (IFNy) desde las células NK; la promoción de la liberación de citoquinas/quimioquinas, estallido respiratorio, liberación de gránulos, expresión de moléculas de adherencia en Neutrófilos; la promoción de la migración de la células endoteliales y promoviendo de este modo la angiogénesis; la promoción de la libración de GAG, producción de MMP y NO en Condrocitos; la promoción de la expresión COX2 en algunas células; y la reducción de la proliferación celular en algunas células.
Los términos "unión específica" o "unido específicamente", según se utiliza en la presente memoria, en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína, o un péptido con una segunda especie química, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura concreta (p. ej., un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a proteínas generalmente. Si un anticuerpo es específico para un epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, no marcado), en una reacción que contiene "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
El término "anticuerpo", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia en general a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante, o derivación del mismo, que conserve las características de unión al epítopo esenciales de una molécula de Ig. Tales formatos de anticuerpos mutantes, variantes, o derivados son conocidos en la técnica. Las realizaciones no limitantes de los mismos se comentan más abajo.
En un anticuerpo completo, cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden dividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., hIL-18). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo completo. Tales realizaciones de anticuerpos pueden ser también biespecíficas, específicas duales, o multiespecíficas; unidas específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados por el término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmento Fab conectados mediante un puente disulfuro a al región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, por medio de un conector sintético que posibilita su elaboración como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv (scFv) de cadena sencilla; véanse p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla estén incluidos dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. También están incluidas otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como fragmentos bivalentes "diabodies". Los fragmentos bivalentes son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que los dominios VH y VL son expresados sobre una cadena polipeptídica sencilla, pero utilizando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, haciendo de ese modo que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (véanse p. ej., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:11211123). Tales porciones de unión al anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 págs. (ISBN 3-540-41354-5).
Aún más, un anticuerpo o porción unión al antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadherencia mayor, formada por medio de la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos diferentes. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadherencia incluyen el uso de la región central de la estreptavidina para elaborar una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hibridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para elaborar moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Se pueden preparar porciones de anticuerpos, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, a partir de anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Por otra parte, los anticuerpos, las porciones de anticuerpos y las moléculas de inmunoadherencia se pueden obtener utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante, como se describe en la presente memoria.
Se pretende que un "anticuerpo aislado", según se utiliza en la presente memoria haga referencia a un anticuerpo que esté sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a hIL-18 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de hIL-18). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hIL-18 puede tener, no obstante, reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de IL-18 de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.
Se pretende que el término "anticuerpo humano", según se utiliza en la presente memoria incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis al azar o de sitio específico in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular en CDR3. Sin embargo, no se pretende que el término "anticuerpo humano", según se utiliza en la presente memoria incluya anticuerpos en las que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ratón, se hayan injertado en las secuencias marco humanas.
Se pretende que el término "anticuerpo humano recombinante", según se utiliza en la presente memoria incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medio de métodos recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula anfitriona (descrito adicionalmente en la Sección II C, más abajo), anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpos humanos combinatoria, recombinante (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para los genes de la inmunoglobulina humana (véanse p. ej.,Tailor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, no obstante, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y de este modo las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque están derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
El término "anticuerpo quimérico" hace referencia un anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada de una especie y secuencias de la región constante de otras especies, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena ligera y pesada murinas conectadas a regiones constantes humanas.
El término "anticuerpo injertado con CDR" hace referencia un anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una especie pero en la que las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL son remplazadas por secuencias de CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena ligera y pesada murinas en las que una o más de las CDR murinas (p. ej., CDR3) han sido remplazadas por secuencias de CDR humanas.
El término "anticuerpo humanizado" hace referencia un anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una especie no humana (p. ej., un ratón) pero en lAs que se ha alterado al menos una porción de la secuencia VH y/o VL para SER más "parecidas a las humanas", es decir, más similares a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el que se introducen secuencias de CDR humanas en secuencias VH y VL no humanas para remplazar las correspondientes secuencias de CDR no humanas.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "proteína de unión neutralizadora de hIL-18 " hace referencia a una proteína que se une específicamente a hIL-18 y neutraliza una actividad biológica de hIL-18. Preferiblemente una proteína de unión neutralizadora es un anticuerpo neutralizador cuya unión a hIL-18 da como resultado la inhibición de una actividad biológica de hIL-18. Preferiblemente la proteína de unión neutralizadora se une a hIL-18 y reduce una actividad biológica de IL-18 en al menos alrededor de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o más. Esta inhibición de una actividad biológica de h1L-18 por una proteína de unión neutralizadora se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hIL-18. Estos indicadores de la actividad biológica de hIL-18 se pueden evaluar mediante uno o más de los diversos análisis in vitro o in vivo convencionales conocidos en la técnica.
El término "epítopos" incluye cualquier determinante polipeptídico susceptible de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activos tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo, o sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
El término "resonancia de plasmón superficial", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por medio de la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas en una matriz biosensora, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véanse Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
Se pretende que el término "Kon", según se utiliza en la presente memoria haga referencia a la constante de unión para la asociación de un anticuerpo al antígeno para formar el complejo anticuerpo/antígeno como es conocido en la técnica.
Se pretende que el término "Koff", según se utiliza en la presente memoria haga referencia a la constante de desunión para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno como es conocido en la técnica.
Se pretende que el término "Kd", según se utiliza en la presente memoria haga referencia a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta como es conocido en la técnica.
El término "proteína de unión marcada" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una proteína con una marca incorporada que proporciona la identificación de la proteína de unión. Preferiblemente, la marca es un marcador detectable, p. ej., incorporación de aminoácido radiomarcado o el anclaje a un polipéptido de radicales biotinilo que puede ser detectado mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por medio de métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de las marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., H3, C14, S35, Y90, Tc99, In111, I125, I131, Lu177, Ho166, o Sm153); marca fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, compuestos de fósforo con lantánidos), marcas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epítópicas); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio.
El término "proteína de unión conjugada" hace referencia a una proteína de unión conectada químicamente a un segundo radical químico, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza en la presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos. Preferiblemente los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, pero no están limitados a, toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
El término "proteína de unión cristalizada" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un polipéptido que existe en forma de un cristal. Los cristales son una forma del estados sólido de la materia, que es distinta de otras formas tales como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos de matrices de átomos, iones, moléculas (p. ej., proteínas tales como anticuerpos) tridimensionales, repetitivas, regulares, o ensamblajes moleculares (p. ej., complejos antígeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales están dispuestas de acuerdo con relaciones matemáticas específicas que son bien conocidas en este ámbito. La unidad fundamental, o unidad estructural, que se repite en un cristal se denomina unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en un ordenamiento que conforma una simetría cristalográfica bien definida, dada proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repetición de la celda unitaria por medio de translaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., págs. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)."
El término "polinucleótido" según se contempla en la presente memoria significa una forma polimérica de dos o más nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye las formas de hebra sencilla y doble de ADN pero preferiblemente es ADN de doble hebra.
El término "polinucleótido aislado" según se utiliza en la presente memoria significará un polinucleótido (p. ej., de origen genómico, ADNc, o sintético, o alguna combinación de los mismos) que, en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado": no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido con el que se encuentra en la naturaleza el "polinucleótido aislado"; está conectado operablemente a un polinucleótido que no está conectado en la naturaleza; o no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
Se pretende que el término "vector", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha conectado. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN en el genoma viral. Ciertos vectores son susceptibles de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se han introducido (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (p. ej., vectores de mamífero no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula anfitriona después de la introducción en la célula anfitriona, y de esa manera se replican junto con el genoma del anfitrión. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están conectados operablemente. Tales vectores son referidos en la presente memoria como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar indistintamente puesto que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, se pretende que la invención incluya tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados carentes de replicación), que cumplen funciones equivalentes.
El término "conectado operablemente" hace referencia a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Se liga una secuencia de control "conectada operablemente" a una secuencia codificante de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "conectadas operablemente" incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que están contiguas al gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, terminación, promotoras e intensificadoras apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como las señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmido; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrión; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen secuencias promotoras, del sitio de unión al ribosoma, y de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen secuencias promotoras y de terminación de la transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias del compañero de fusión.
"Transformación", según se define en la presente memoria, hace referencia a cualquier procedimiento mediante el cual el ADN exógeno se introduce en una célula anfitriona. La transformación puede ocurrir en condiciones naturales
o artificiales utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en cualquier métodos conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico foráneas en una célula anfitriona procariótica o eucariótica. El método se selecciona basándose en la célula anfitriona que esté siendo transformada y puede incluir, pero no está limitado a, infección viral, electroporación, lipofección, y bombardeo de partículas. Tales células "transformadas" incluyen células transformadas establemente en las que el ADN insertado es susceptible de replicación ya sea en un plásmido de replicación autónoma o como parte del cromosoma anfitrión. También incluyen células que expresan transitoriamente el ADN o ARN insertado durante períodos de tiempo limitado.
Se pretende que el término "célula anfitriona recombinante" (o simplemente "célula anfitriona"), según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a una célula en la que se ha introducido ADN exógeno. Se debe entender que se pretende que tales términos hagan referencia no solo a la célula sujeto concreta, sino, a la progenie de tal célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía está incluída dentro del alcance del término "célula anfitriona" según se utiliza en la presente memoria. Preferiblemente las células anfitrionas incluyen células procarióticas y eucarióticas seleccionadas entre cualquiera de los Reinos de la vida. Las células eucarióticas preferidas incluyen células protistas, fúngicas, vegetales y animales. Muy preferiblemente las células anfitrionas incluyen pero no están limitadas a la línea de células procarióticas de E.Coli; las líneas de células de mamífero CHO y COS; la línea de células de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.
Se pueden utilizar técnicas convencionales para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y la transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Se pueden realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo con las especificaciones del fabricante o según se lleva a cabo normalmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden realizar generalmente de acuerdo con mecanismos convencionales bien conocidos en la técnica y según se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria. Véase
p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
"Organismo transgénico", según se conoce en la técnica y según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un organismo que tienen células que contienen un transgén, donde el transgen introducido en el organismo (o un ancestro del organismo) expresa un polipéptido no expresado naturalmente en el organismo. Un "transgén" es un constructo de ADN, que es integrado establemente y operablemente en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla el organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regular" y "modular" se utilizan indistintamente, y, según se utilizan en la presente memoria, hacen referencia a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (p. ej., la actividad biológica de hIL-18). La modulación puede ser un aumento o disminución de la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula de interés. Las actividades y funciones representativas de una molécula incluyen, pero no están limitadas a, características de unión, actividad enzimática, activación de receptores celulares, y transducción de la señal.
Correspondientemente, el término "modulador," según se utiliza en la presente memoria, es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (p. ej., la actividad biológica de hIL-18). Por ejemplo, un modulador puede ocasionar un aumento o disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En ciertas realizaciones, el modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Los inhibidores ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, proteínas, péptidos, anticuerpos, cuerpos peptídicos (de Inglés: "peptibodies"), carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los cuerpos peptídicos se describen, p. ej., en el documento WO 01/83525.
El término "agonista", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, causa un aumento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del agonista. Los agonistas de interés concretos pueden incluir, pero no están limitados a, polipéptidos IL-18 o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, u otras moléculas cualesquiera que se unen a hIL-18.
El término "antagonista" o "inhibidor", según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés causa una disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas de interés concretos incluyen aquellos que bloquean o modulan la actividad biologica o inmunológica de hIL-18. Los antagonistas e inhibidores de hIL-18 pueden incluir, pero no están limitados a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, u otros moléculas cualesquiera que se unen a hIL-18.
El término "muestra", según se utiliza en la presente memoria, se utiliza en su sentido más amplio. Una "muestra biologica", según se utiliza en la presente memoria, incluye, pero no está limitada a, cualquier cantidad de una sustancia de un ente vivo o ente anteriormente vivo. Tales entes vivos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no están limitadas a, sangre, suero, orina, líquido sinovial, células, órganos, tejidos, médula ósea, nódulos linfáticos y bazo.
El término "compite" según se utiliza en la presente memoria, y según es conocido y utilizado por los profesionales expertos en la técnica, hace referencia a la capacidad de una proteína de unión para interferir con, o impedir de otro modo la unión de una segunda proteína de unión a un ligando común a ambas proteínas de unión (p. ej., IL-18). Los análisis útiles para determinar las características de competición de las proteínas de unión son bien conocidos en la técnica. Los análisis de competición preferidos se describen en la presente memoria.
I. Anticuerpos Humanos que se Unen a IL-18 Humana.
Un aspecto de la presente invención proporciona anticuerpo aislados humanos, o sus porciones de unión al antígeno, que se unen a IL-18 con una alta afinidad, una baja constante de desunión y una alta capacidad de neutralización. Preferiblemente, los anticuerpos, o porciones de los mismos, son anticuerpos aislados. Preferiblemente, los anticuerpos humanos de la invención son anticuerpos anti-IL-18 humanos neutralizadores.
A. Método para la elaboración de anticuerpos anti-IL-18
Los anticuerpos de la presente invención se pueden elaborar por medio de cualquiera de varios mecanismos conocidos en la técnica. Un método particularmente preferido para generar anticuerpos anti-IL-18 de la invención incluyen la utilización de ratones transgénicos XENOMOUSE, y la utilización de técnicas de hibridoma y manipulación celular SLAM (Abgenix, Inc., Fremont, CA) conocidas en la técnica para la preparación de anticuerpos, y la utilización de antígenos que comprenden el péptido IL-18 descrito en el Ejemplo 3.2, es decir, IL-18 humana que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO. 1 y fragmentos del mismo.
En una realización de la presente invención, los anticuerpos humanos son producidos inmunizando un animal no humano que comprende algo, o la totalidad, del locus de la inmunoglobulina humana con un antígeno IL-18. En una realización preferida, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón diseñada que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y tiene una producción anticuerpos de ratón deficiente. Véase, p. ej., Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Véanse tambien el documento WO 91/10741, publicado el 25 de Julio de 1991, el documento WO 94/02602, publicado el 3 de Febrero de 1994, el documento WO 96/34096 y el documento WO 96/33735, ambos publicados el 31 de Octubre de 1996, el documento WO 98/16654, publicado el 23 de Abril de 1998, el documento WO 98/24893, publicado el 11 de Junio de 1998, el documento WO 98/50433, publicado el 12 de Noviembre de 1998, el documento WO 99/45031, publicado el 10 de Septiembre de 1999, el documento WO 99/53049, publicado el 21 de Octubre de 1999, el documento WO 00 09560, publicado el 24 de Febrero de 2000 y el documento WO 00/037504, publicado el 29 de Junio de 2000. El ratón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completos humanos, y genera Mabs humanos específicos del antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de la línea germinal del tamaño de megabases de los loci de la cadena pesada y los loci de la cadena ligera x humanos. See Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483495 (1998).
La invención también proporciona un método para elaborar anticuerpos anti-IL-18 a partir de animales distintos de seres humanos y ratones mediante la inmunización de animales no humanos transgénicos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Se pueden producir tales animales utilizando los métodos descritos inmediatamente antes. Los métodos descritos en estas patentes se pueden modificar como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.994.619. En una realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos.
En otra realización, el animal no humano que comprende loci de genes de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque del minilocus, se imita un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de genes individuales a partir del locus de Ig. De este modo, se forman uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) en un constructo para su inserción en un animal. Este enfoque es descrito, inter alia, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, y 5,643,763.
Una ventaja del enfoque del minilocus es la rapidez con la que se pueden generar e introducir constructos que incluyen porciones del locus de Ig en los animales. Sin embargo, una desventaja potencial del enfoque del minilocus es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulina para soportar el desarrollo de células B completas, de manera que puede haber menor producción de anticuerpo.
Con el fin de producir un anticuerpo humano anti-IL-18, un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de la inmunoglobulina humana se inmuniza con un antígeno IL-18 y el anticuerpo o la célula que produce el anticuerpo son aislados del animal. El antígeno IL-18 puede ser IL-18 aislada y/o purificada y es preferiblemente una IL-18 humana. En otra realización, el antígeno IL-18 es un fragmento de IL-18, preferiblemente IL-18 madura. En otra realización, el antígeno IL-18 es un fragmento que comprende al menos un epítopo de IL-18.
La inmunización de animales se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Véase, p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Los métodos para la inmunización de animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas y caballos son bien conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Harlow y Lane y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.994.619. En una realización preferida, el antígeno IL-18 se administra con un coadyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Tales coadyuvantes incluyen coadyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (muramildipéptidos) o ISCOM (complejos inmunoestimuladores). Tales coadyuvantes pueden proteger el polipéptido de la dispersión rápida secuestrándolo en depósitos locales, o pueden contener sustancias que estimulen al anfitrión para que secrete factores que sean quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferiblemente, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, repartidas a lo largo de varias semanas.
El Ejemplo 2.2.A proporciona un protocolo para la inmunización de un ratón transgénico XENOMOUSE con IL-18 humana en solución salina tamponada con fosfato.
B. Producción de Anticuerpos y Líneas Celulares Productoras de Anticuerpos
Después de la inmunización de un animal con un antígeno IL-18, se pueden obtener del animal anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos. Se obtiene un suero que contiene el anticuerpo anti-IL-18 a partir del animal desangrando o sacrificando el animal. El suero se puede utilizar a medida que se obtiene del animal, se puede obtener una fracción de inmunoglobulina del suero, o los anticuerpos anti-IL-18 se pueden purificar a partir del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidos de esta manera son policlonales, teniendo de esta modo un conjunto heterogéneo de propiedades.
En otra realización, se pueden preparar hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B esplénicas se fusionan con células de mieloma inmortalizadas como es bien conocido en la técnica. Véase, p. ej., Harlow y Lane, supra. En una realización preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de la fusión y la selección con antibiótico, los hibridomas se escrutan utilizando IL-18, o una porción de la misma, o una célula que expresa IL-18. En una realización preferida, el escrutinio inicial se realiza utilizando un inmunoanálisis con enzima ligada (ELISA) o un radioinmunoanálisis (RIA), preferiblemente un ELISA. Un ejemplo de escrutinio mediante ELISA se proporciona en el documento WO 00/37504.
Los hibridomas que producen el anticuerpo anti-IL-18 se seleccionan, se clonan y se escruta adicionalmente para determinar las características deseables, incluyendo crecimiento robusto del hibridoma, alta producción de anticuerpo y características deseables del anticuerpo, como se comenta adicionalmente más abajo. Los hibridomas se pueden cultivar y expandir in vivo en animales singenéicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, p.
ej., ratones atímicos, o en cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por los expertos normales en la técnica.
Preferiblemente, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa los genes de la inmunoglobulina humana y las células B esplénicas se fusionan a un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano. Más preferiblemente, el animal inmunizado es un ratón transgénico XENOMOUSE y la línea celular de mieloma es un mieloma de ratón no secretor, tal como línea celular de mieloma P3X63Ag8.653 (véase, p. ej., el Ejemplo 2.2.B).
En un aspecto, la invención proporciona hibridomas que producen anticuerpos anti-IL-18 humanos. En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas ratón, como se ha descrito anteriormente. En otra realización preferida, los hibridomas son producidos en una especie distinta del ser humano y del ratón tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. En otra realización, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que se fusiona un mieloma no secretor humano con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-IL-18.
En otro aspecto de la invención, se generan anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos aislados, individuales utilizando a procedimiento referido en la técnica como método del anticuerpo linfocítico seleccionado ("SLAM" por sus siglas Inglesas), como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.627.052, La Publicación PCT WO 92/02551 y Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. En éste método, las células individuales que secretan los anticuerpos de interés, p. ej., linfocitos derivados uno cualquiera de los animales inmunizados descritos en la Sección I (A), se escrutan utilizando un análisis en placa hemolítica específico del antígeno, donde el antígeno IL-18, o un fragmento del mismo, se acopla a glóbulos rojos de oveja utilizando un conector, tal como la biotina, y se utiliza para identificar células individuales que secretan anticuerpos con especificidad para IL-18. Después de la identificación de las células que secretan el anticuerpo de interés, los ADNc de la región variable de la cadena pesada y ligera se rescatan de las células por medio de PCR con transcriptasa inversa y estas regiones variables se pueden expresar a continuación, en el contexto de las regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (p. ej., regiones constantes humanas), en células anfitrionas de mamífero, tales como células COS o CHO. Las células anfitrionas transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden experimentar a continuación análisis y selección in vitro adicionales, por ejemplo por medio de inmunopurificación de las células transfectadas para aislar las células que expresan los anticuerpos para IL-18. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas se pueden manipular adicionalmente in vitro, por ejemplo mediante métodos de maduración de afinidad in vitro tales como los descritos en la Publicación PCT WO 97/29131 y la Publicación PCT WO 00/56772.
Los métodos in vitro también se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la invención, donde una genoteca de anticuerpos se escruta para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de unión deseada. Los métodos para tal escrutinio de genotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen los métodos descrito, por ejemplo, por Ladner et al. la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409; Kang et al. Publicación PCT Núm. WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT Núm. WO 91/17271; Winter et al. Publicación PCT Núm. WO 92/20791; Markland et al. Publicación PCT Núm. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT Núm. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT Núm. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación PCT Núm. WO 92/09690;Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hibridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos Núm. 20030186374, y la Publicación PCT Núm. WO 97/29131.
La genoteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto inmunizado con IL-18, o una porción de IL-18. Alternativamente, la genoteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto no sometido a tratamiento previo, es decir, uno que no ha sido inmunizado con IL-18, tal como una genoteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con IL-18 humana. Los anticuerpos de la invención se seleccionan escrutando la genoteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende IL-18 humana (p. ej., un péptido que corresponde a una porción de hIL-18) para seleccionar de ese modo los anticuerpos que reconocen IL
18. Los métodos para llevar a cabo tal escrutinio y selección son bien conocidos en la técnica, tales como los descritos en las referencias del párrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tienen afinidades de unión concretas por hIL-18, tales como aquellos que se disocian de IL-18 humana con una constante de desunión koff concreta, se puede utilizar el método de resonancia de plasmón superficial para seleccionar anticuerpos que tienen la constante de desunión koff deseada. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tienen una actividad neutralizadora concreta para hIL-18, tales como aquellos con una CI50 concreta, se pueden utilizar métodos convencionales conocidos en la técnica para la evaluación de la inhibición de la actividad de hIL-18.
En un aspecto, la invención tiene que ver con un anticuerpo aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo, que se une a IL-18 humana. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizador. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En diversas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo neutralizador de la invención más preferido es referido en la presente memoria como 2.5(E) y tiene VL con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7 y VH con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6. Muy preferiblemente, el anticuerpo 2.5(E) se une a IL-18 humana con una Kd de menos de 5x1010 M (véase el Ejemplo 2.2.F).
Preferiblemente, los anticuerpos anti-IL-18 de la presente invención, tales como el anticuerpo 2.5(E) y anticuerpos relacionados, muestran la capacidad de reducir o neutralizar la actividad de IL-18, p. ej., como se evalúa mediante uno cualquiera de los diversos análisis in vitro e in vivo conocidos en la técnica (p. ej., véase el Ejemplo 3.2.F). Por ejemplo, estos anticuerpos neutralizan producción inducida por IL-18 de interferón gamma humano en KG-1 células con valores de CI50 en el intervalo de al menos alrededor de 10-8 M, alrededor de 10-9 M, o alrededor de 10-10 M. Adicionalmente estos anticuerpos también neutralizan la producción inducida por IL-18 de interferón gamma humano en células de sangre completa con valores de CI50 en el intervalo de al menos alrededor de 10-8 M, alrededor de 10-9 M, o alrededor de 10-10 M.
En una realización particularmente preferida el anticuerpo anti-IL-18 2.5(E) se une a IL-18 humana en diversas formas, incluyendo pro-IL-18, IL-18 madura y IL-18 truncada. El anticuerpo 2.5(E) no se une específicamente a otras citoquinas, tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-21, TNF, LT (linfotoxina), LTa1�2, y LTa2�1. Sin embargo, el anticuerpo 2.5(E) no exhibe reactividad cruzada con IL-18 de otras especies. Por ejemplo, el anticuerpo neutralizas la actividad de IL-18 de mono cinomolgus (CI50 para IL-18 cino = 9,1E X 10-11; Véase el Ejemplo 2.2.J1).
En un aspecto, la invención tiene que ver con los anticuerpos 2.5(E) y las porciones funcionales de los anticuerpos, anticuerpos relacionados con 2.5(E) y las porciones funcionales de los anticuerpos, y otros anticuerpos humanos y las porciones funcionales de los anticuerpos con propiedades equivalentes a 2.5(E), tales como alta afinidad de unión por IL-18 con bajas cinéticas de disociación y alta capacidad neutralizadora. En realizaciones preferidas, el anticuerpo aislado, o porción de unión al antígeno del mismo, se une a IL-18 humana, donde el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se disocia de IL-18 humana con una constante de desunión koff de alrededor de 0,1s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o que inhibe la actividad humana de IL-18 con una CI50 de alrededor de 1 x 10-6M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, pueden disociarse de IL-18 humana con una constante de desunión Koff de alrededor de 1 x
10-2-1
s o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad humana de IL-18 con una CI50 de alrededor de 1 x 10-7M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, pueden disociarse de IL-18 humana con una constante de desunión Koff de alrededor de 1 x 10-3s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad humana de IL-18 con una CI50 de alrededor de 1 x 10-7M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, pueden disociarse de IL-18 humana con una constante de desunión Koff de alrededor de 1 x 10-4s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad humana de IL-18 con una CI50 de alrededor de 1 x 10-9M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, pueden disociarse de IL-18 humana con una constante de desunión Koff de alrededor de 1 x 10-5s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad humana de IL-18 con una CI50 de alrededor de 1 x 10-10M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, pueden disociarse de IL-18 humana con una constante de desunión Koff de alrededor de 1 x 10-5s-1 o menos, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad humana de IL-18 con una CI50 de alrededor de 1 x 10-11M o menos.
En otra realización más, la invención proporciona un anticuerpo aislado humano, o una porción de unión al antígeno del mismo , con una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7, y una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada, tal como una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. Preferiblemente, la región constante de la cadena pesada es una región constante de la cadena pesada de IgG1 o una región constante de la cadena pesada de IgG4. Además, el anticuerpo puede comprender una región constante de la cadena ligera, o una región constante de la cadena ligera kappa o una región constante de la cadena ligera lambda. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena ligera kappa. Alternativamente, la porción de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de cadena sencilla.
La reposición de residuos de aminoácidos en la porción Fc para alterar la función efectora del anticuerpo es conocida en la técnica (Winter, et al. Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.648.260; 5.624.821). La porción Fc de un anticuerpo media algunas funciones efectoras importantes p. ej. inducción de citoquinas, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y vida media/velocidad de aclaramiento del anticuerpo y de los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos esas funciones efectoras son deseables para el anticuerpo terapéutico pero en otros casos podría ser innecesario o incluso perjudicial, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos de IgG humanas, particularmente IgG1 e IgG3, median la ADCC y la CDC a través de la unión a FcyRs y al complemento C1q, respectivamente. Los receptores neonatales de Fc (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media de los anticuerpos circulantes. En otra realización más se remplaza al menos un residuo de aminoácido en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fc del anticuerpo, de manera que se alteran las funciones efectoras del anticuerpo.
Una realización proporciona una proteína de unión marcada donde un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es derivatizado o concectado a otra molécula funcional (p. ej., otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la invención se puede obtener conectando funcionalmente un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o un fragmento bivalente), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puedan mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Los agentes detectables útiles con los que se puede derivatizar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ilustrativos incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también se puede derivatizar con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo es derivatizado con una enzima detectable, ésta se detecta añadiendo reactivos adicionales que utiliza la enzima para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobenzidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. También se puede derivatizar un anticuerpo con biotina, y detectar a través de la medición indirecta de unión de avidina o estreptavidina.
Otra realización de la invención proporciona una proteína de unión cristalizada. Preferiblemente la invención se refiere a cristales de anticuerpos anti-IL-18 completos y fragmentos del mismo como se describe en la presente memoria, y formulaciones y composiciones que comprenden tales cristales. En una realización la proteína de unión cristalizada tiene una vida media in vivo superior a la de la contraparte soluble de la proteína de unión. En otra realización la proteína de unión conserva la actividad biológica después de la cristalización.
La proteína de unión cristalizada de la invención se puede producir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y como se describe en el documento WO 02072636. (Véase también el Ejemplo 2.2.M)
Otra realización de la invención proporciona una proteína de unión glicosilada donde el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción de proteína incipiente in vivo puede experimentar una transformación adicional, conocida como modificación post-traduccional. En particular, se pueden añadir enzimáticamente residuos de azúcar (glicosilo), un procedimiento conocido como glicosilación. Las proteínas resultantes que portan cadenas laterales de oligosacáricos conectadas covalentemente son conocidas como proteínas glicosiladas o glicoproteínas. Las glicosilación de proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como a la célula anfitriona en la que se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilación (p. ej., glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen diferentes sustratos (azúcares nucleotídicos) disponibles. Debido a tales factores, el patrón de glicosilación de proteínas, y la composición de residuos de glicosilo, puede diferir dependiendo del sistema anfitrión en el que se expresa la proteína concreta. Los residuos de glicosilo útiles en la invención pueden incluir, pero no están limitados a, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. Preferiblemente la proteína de unión glicosilada comprende residuos de glicosilo de manera que el patrón de glicosilación es humano.
Es conocido por los expertos en la técnica que diferente glicosilación de proteínas puede dar como resultado diferentes características de la proteína. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un microorganismo anfitrión, tal como levadura, y glicosilada utilizando la ruta endógena de la levadura se puede reducir en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea de células CHO. Tales glicoproteínas pueden ser también inmunogénicas en seres humanos y muestran una vida media reducida tras la administración in vivo. Los receptores específicos en seres humanos y otros animales pueden reconocer residuos de glicosilo específicos y promover el rápido aclaramiento de la proteína del torrente sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de la proteína, solubilidad, susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad, o alergenicidad. Por lo tanto, un especialista en medicina puede preferir una proteína terapéutica con una composición y patrón de glicosilación específicos, por ejemplo composición y patrón de glicosilación idénticos, o al menos similares, al producido en células humanas o en las células específicas de la especie del animal sujeto deseado.
Se puede lograr la expresión de proteínas glicosiladas diferentes de las de la célula anfitriona modificando genéticamente la célula anfitriona para que exprese enzimas de glicosilación heterólogas. Utilizando mecanismos conocidos en la técnica un especialista en medicina puede generar anticuerpos o sus porciones de unión al antígeno que exhiben glicosilación de proteínas humanas. Por ejemplo, se han modificado genéticamente cepas de levadura para que expresen enzimas de glicosilación de origen no natural de manera que las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levadura muestren una glicosilación de proteínas idéntica a la de las células animales, especialmente células humanas (solicitudes de patente de los Estados Unidos Núms. 20040018590 y 20020137134).
Adicionalmente, un experto en la técnica apreciará que se puede expresar una proteína de interés utilizando una genoteca de células anfitrionas diseñadas genéticamente para expresar diversas enzimas de glicosilación, de manera que las células anfitrionas miembro de la genoteca producen la proteína de interés con patrones de glicosilación variantes. Un especialista en medicina puede seleccionar y aislar a continuación la proteína de interés con patrones de glicosilación novedosos concretos. Preferiblemente, la proteína que tiene un patrón de glicoslación novedoso seleccionado particularmente exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.
C. Producción de anticuerpos IL-18 recombinantes
Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir por medio de una variedad de mecanismos conocidos en la técnica. Por ejemplo, expresión a partir de células anfitrionas, donde el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas ligera y pesada es o son transfectados a una célula anfitriona mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfeccion" abarquen una amplia variedad de técnicas utilizadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, p. ej., electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección por DEAE-dextrano y similares. Si bien es posible expresar los anticuerpos de la invención en células anfitrionas tanto procarióticas como eucarióticas, es preferible la expresión de anticuerpos en célula eucarióticas, y muy preferible células anfitrionas de mamífero, puesto que es más probable que tales células eucarióticas (y en particular la células de mamífero) más que las procarióticas ensamblen y secreten un anticuerpo plegado apropiadamente e inmunológicamente activo.
Las células anfitrionas de mamífero preferidas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas por Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable para DHFR, p. ej., como describen R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifica anticuerpo genes se introducen en células anfitrionas de mamífero, los anticuerpos son producidos cultivando las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células anfitrionas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína convencionales.
También se pueden usar células anfitrionas para producir fragmentos funcionales de anticuerpos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que las variaciones del procedimiento anterior se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula anfitriona con ADN que codifica fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. También se puede utilizar tecnología de ADN recombinante para eliminar algo, o todo, el ADN que codifica cualquiera o ambas cadenas ligera y pesada que no es necesario para unirse a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas están también abarcadas por los anticuerpos de la invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera son especificas para un antígeno distinto de los antígenos de interés mediante entrecruzamiento de un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpo mediante métodos de entrecruzamiento químico convencionales.
En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en - células CHO dhfr por medio de transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo se conectan operativamente a elementos reguladores potenciadores de CMV/promotores de AdMLP para dirigir los altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR, que permite la selección de las células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células anfitrionas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células anfitrionas, seleccionar los transformantes, cultivar las células anfitrionas y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. La invención proporciona también adicionalmente un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula anfitriona de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetice un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender adicionalmente el aislamiento de anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
La Tabla 1 es una lista de secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de anticuerpos anti-hIL-18 de la
5 descripción. En la región VH, el aminoácido de origen natural de la posición 1 del extremo amino (extremo N) es o bien Glutamato (E) o bien Glutamina (Q). Sin embargo, para generar una proteína recombinante con extremos N homogéneos durante la producción de proteína a gran escala que comprende la región VH, se prefiere Glutamato
(E) en la posición 1 del extremo N.
10 Tabla 1 Lista de las Secuencias de Aminoácidos de las regiones VH y VL
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VH 2.5(E)
SEQ ID NO: 6
VH 2.5 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 6 SYWIG
VH 2.5 CDR-H2
Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 6 FIYPGDSETRYSPTFQG
VH 2.5 CDR-H3
Residuos 99-110 del SEQ ID NO: 6 VGSGWYPYTFDI
VL 2.5(E)
SEQ ID NO: 7
VL 2.5 CDR-L1
Residuos 24-34 del SEQ ID NO: 7 RASESISSNLA
VL 2.5 CDR-L2
Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 7 TASTRAT
VL 2.5 CDR-L3
Residuos 89-98 del SEQ ID NO: 7 QQYNNWPSIT
VH 2.13
SEQ ID NO: 8
VH 2.13 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 8 SGGHYWT
VH 2.13 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 8 YIYYSGSTYYNPSLKS
VCH 2.13 CDR-H3
Residuos 100-110 del SEQ ID NO: 8 DRGGSGSYWDY
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VL 2.13
SEQ ID NO: 9
VL 2.13 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 9 RGSRSVSSGYLA
VL 2.13 CDR-L2
Residuos 21-27 del SEQ ID NO: 9 GVSIRAT
VL 2.13 CDR-L3
Residuos 90- 98 del SEQ ID NO: 9 QQYHGSPLT
VH 23
SEQ ID NO: 10
VH 2.3 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 10 NYYWS
VH 2.3 CDR-H2
Residuos 50-65 del SEQ ID NO: 10 YIYSSGSTNYNPSLKS
VH 2.3 CDR-H3
Residuos 98-107 del SEQ ID NO: 10 DRGGASFFDY
VL 2.3
SEQ ID NO: 11
VL 2.3 CDR-L1
Residuos 24-34 del SEQ ID NO: 11 RASQIIGGYLN
VL 2.3 CDR-L2
Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 11 STSILQS
VL 2.3 CDR-L3
Residuos 89-97 del SEQ ID NO: 11 QQTYITPPT
VH 215
SEQ ID NO: 12
VH 215 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 12 SGDYYWS
VH 215 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 12 HISYRGTTYYNPSLKS
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VH 215 CDR-H3
Residuos 100-108 del SEQ ID NO: 12 DRGGGFFDL
VL 215
SEQ ID NO: 13
VL 215 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 13 RASRSLSSGYLA
VL 215 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 13 GASIRAT
VL 215 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 13 QQYNYSPLT
VH 231
SEQ ID NO: 14
VH 231 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 14 SYSMN
VH 231 CDR-H2
Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 14 YFSSSGGIIYYADSVKG
VH 231 CDR-H3
Residuos 99-111 del SEQ ID NO: 14 DDSSGYYPYFFDY
VL 231
SEQ ID NO: 15
VL 231 CDR-L1
Residuos 24-40 del SEQ ID NO: 15 KSSQTVLYRSNNKNYLA
VL 231 CDR-L2
Residuos 56-62 del SEQ ID NO: 15 WASTRES
VL 231 CDR-L3
Residuos 95-103 del SEQ ID NO: 15 QQYYSTPLT
VH 251
SEQ ID NO: 16
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VH 251 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 16 SRVYYWG
VH 251 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 16 SIYYSGSTYYNPSLKS
VH 251 CDR-H3
Residuos 100-109 del SEQ ID NO: 16 EDSSAWVFEH
VL 251
SEQ ID NO: 17
VL 251 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 17 RASHILSRMYLA
VL 251 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 17 GISIRAT
VL 251 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 17 QHYDNSLCS
VH 268
SEQ ID NO: 18
VH 268 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 18 NYGLH
VH 268 CDR-H2
Residuos 20-36 del SEQ ID NO: 18 8 VIWYDGSNKYYADSVKG
VH 268 CDR-H3
Residuos 99-108 del SEQ ID NO: 18 ESYYYYGMDV
VL 268
SEQ ID NO: 19
VL 268 CDR-L1
Residuos 24-34 del SEQ ID Neo.: 19 RASQSFNSNLV
VL 268 CDR-L2
Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 19 GASTRAT
VL 268 CDR-L3
Residuos 89-97 del SEQ ID NO: 19 QQYNNWTWT
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VH 336
SEQ ID NO: 20
VH 336 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 20 SGDYYWS
VH 336 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 20 HISYRGTTYYNPSLKS
VH 336 CDR-H3
Residuos 100-108 del SEQ ID NO: 20 DRGGGFFDL
VL 336
SEQ ID NO: 21
VL 336 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 21 RASQSVSSGYLA
VL 336 CDR-L2
Residuos 51-57 de SEQ.ID NO.:21 GASIRAT
VL 336 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 21 QQYGYSPLT
VH 351
SEQ ID NO: 22
VH 351 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 22 HYGMH
VH 351 CDR-H2
Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 22 VISYDGRNKYYVDSVKG
VH 351 CDR-H3
Residuos 99-116 del SEQ ID NO: 22 EKGGSGWPPFYYYYGMDV
VL 351
SEQ ID NO: 23
VL 351 CDR-L1
Residuos 24-39 del SEQ ID NO: 23 KSSQNLLYSDGETYLC
VL 351 CDR-L2
Residuos 55-61 del SEQ ID NO: 23 EVSNRFS
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VL 351 CDR-L3
Residuos 94-102 del SEQ ID NO: 23 MQNVQLPLT
VH 413
SEQ ID NO: 24
VH 413 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 24 SRVYYWG
VH 413 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 24 SIYYSGSTYYSPSLKS
VH 413 CDR-H3
Residuos 100-109 del SEQ ED NO.:24 EDSSAWVFEH
VL 413
SEQ ID NO: 25
VL 413 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 25 RASQILSRNYLA
VL 413 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 25 GISIRAT
VL 413 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 25 QHYDNSLCS
VH 435
SEQ ID NO: 26
VH 435 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 26 SRIYYWG
VH 435 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 26 SIYYRGSTYYNPSLKS
VH 435 CDR-H3
Residuos 100-109 del SEQ ID NO: 26 EDSSAWVFDY
VL 435
SEQ ID NO: 27
VL 435 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 27 RASQSVRNNYLN
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VL435 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 27 GLFSRAT
VL 435 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 27 QYGNSIDS
VH 444
SEQ ID NO: 28
VH 444 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 28 SGDYYWS
VH 444 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 28 HISYRGTTYYNPSLKS
VH 444 CDR-H3
Residuos 100-108 del SEQ ID NO: 28 DRGGGFFDL
VL 444
SEQ ID NO: 29
VL 444 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 29 RASQSVSSGYLA
VL 444 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 29 GTSIRAT
VL 444 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 29 QQYGYSPLT
VH 478
SEQ ID NO: 30
VH 478 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 30 SGGHYWS
VH 478 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 30 YIYYSGSTHYNPSLKS
VH 478 CDR-H3
Residuos 99-109 del SEQ ID NO: 30 SLYNGNGYFDL
VL 478
SEQ ID NO: 31
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VL 478 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 31 RASQSISSGYLA
VL 478 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 31 GVSRRAT
VL 478 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 31 QQYGFSPLT
VH521
SEQ ID NO: 32
VH 521 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 32 RSYDYWG
VH 521 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 32 SIYYRGSTYYNPSLKS
VH 521 CDR-H3
Residuos 100-109 del SEQ ID NO: 32 EYSTTWSIDY
VL 521
SEQ ID NO: 33
VL 521 CUR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 33 RASQSIRNNYLA
VL 521 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 33 GASSRAT
VL 521 CDR L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 33 QQYGNSIIT
VH 550
SEQ ID NO: 34
VH 550 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 34 SGGYYWS
VH 550 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 34 HISYRGTTYSNPSLKS
VH 550 CDR-H3
Residuos 100-108 del SEQ ID NO: 34 DRGGGFFDL
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VL 550
SEQ ID NO: 35
VL 550 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 35 RASQSVNSGYLA
VL 550 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 35 GVSIRAT
VL 550 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: 35 QQYGFSPLT
VH 581
SEQ ID NO: 36
VH 581 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 36 HCGMH
VH 581 CDR-H2
Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 36 VISYDGSNKYYADSVKG
VH 581 CDR-H3
Residuos 99-116 del SEQ ID NO: 36 DHGGSGSPPFYYYYGMDV
VL 581
SEQ ID NO: 37
VL 581 CDR-L1
Residuos 24-39 del SEQ ID NO: 37 KSSQSLLHGDGKTYLY
VL 581 CDR-L2
Residuos 55-61 del SEQ ID NO: 37 ELSNRFS
VL 581 CDR-L3
Residuos 94-102 del SEQ ID NO: 37 MQSLQLPLT
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia
Región de la proteína
12345678901234567890
VH 7.5
SEQ ID NO: 38
Proteína
Identificador de Secuencia Secuencia 12345678901234567890
Región de la proteína
VH 7.5 CDR-H1
Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 38 YYGMH
VH 7.5 CDR-H2
Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 38 VIWYDGRNKYYADSVKG
VH 7.5 CDR-H3
Residuos 99-108 del SEQ ID NO: 38 EGGYYYGMDV
VL 7.5
SEQ ID NO: 39
VL 7.5 CDR-L1
Residuos 24-35 del SEQ ID NO: 39 RASQNVSSSYLA
VL 7.5 CDR-L2
Residuos 51-57 del SEQ ID NO: 39 GASSRAT
VL 7.5 CDR-L3
Residuos 90-98 del SEQ ID NO: . :39 QQSGSSLFT
VH 2.11
SEQ ID NO: 40
VH 2.11 CDR-H1
Residuos 31-37 del SEQ ID NO: 40 SGDHYWT
VH 2.11 CDR-H2
Residuos 52-67 del SEQ ID NO: 40 HIYYSGSTYYNPSLKS
VH 2.11 CDR-H3
Residuos 97-109 del SEQ ID NO: 40 CARDYGGNGYFDY
VL 2.11
SEQ ID NO: 41
VL 2.11 CDR-L1
Residuos 24-40 del SEQ ID NO: 41 RSSQSLLDSDDGNTYLD
VL 2.11 CDR-L2
Residuos 56-62 del SEQ ID NO: 41 TLSYRAS
VL 2.11 CDR-L3
Residuos 95-103 del SEQ ID NO: 41 MQRIEFPIT
Las anteriores secuencias de CDR del anticuerpo anti-IL-18 aislado establecen una familia novedosa de proteínas de unión a IL-18, aisladas de acuerdo con esta descripción, y que comprende polipéptidos que incluyen las secuencias de CDR enumeradas en la Tabla 2 de más abajo. Para generar y para seleccionar las CDR de la 28
invención que tienen la actividad de unión y/o neutralización de IL-18 preferida, se pueden utilizar métodos convencionales conocidos en la técnica para la generación de proteínas de unión de la presente invención y la evaluación de las características de unión y/o neutralización de IL-18 de esas proteínas de unión, incluyendo pero no limitadas a las descritas específicamente en la presente memoria.
Tabla 2: Ligandos de afinidad a CDR de IL-18 consenso (los residuos alternativos se enumeran abajo de cada posición de aminoácido: - indica un residuo que puede estar ausente).
región CDR
Identificador de Secuencia Secuencia Consenso
CDR-H1
SEQ ID NO: 42
CDR-H2
SEQ ID NO: 43
CDR-H3
SEQ ID NO: 44
CDR-L1
SEQ ID NO: 45
CDR-L2
SEQ ID NO: 46
región CDR
Identificador de Secuencia Secuencia Consenso
CDR-L3
SEQ ID NO: 47
D. Usos de los Anticuerpos Anti-IL-18
Dada su capacidad para unirse a IL-18 humana, los anticuerpos anti-IL-18 humana, o porciones de los mismos, de la
5 invención se pueden utilizar para detectar IL-18 humana (p. ej., en una muestra biologica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoanálisis convencional, tal como un análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), un radioinmunoanálisis (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. La invención proporciona un método para la detección de IL-18 humana en una muestra biologica que comprende poner en contacto una muestra biologica con un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención y detectar o el anticuerpo (o porción de anticuerpo) unido a IL-18 humana o
10 anticuerpo (o porción de anticuerpo) no unido, para detectar de ese modo IL-18 humana en la muestra biologica. El anticuerpo se marca directamente o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, �-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los
15 ejemplos de los complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye luminol; y los ejemplos de la material radiactivo adecuado incluyen H3, C14, S35, Y90, Tc99, In111 , I125, I131, Lu177, HO166, o Sm153 .
20 De manera alternativa al marcaje del anticuerpo, la IL-18 humana se puede analizar en fluidos biologicos por medio de inmunoanálisis competitivo utilizando patrones de rhIL-18 marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-18 humana no marcado. En este análisis, la muestra biologica, los patrones de rhIL-18 marcados y el anticuerpo anti-IL-18 humana se combinan y se determina la cantidad de patrón de rhIL-18 marcado unido al
25 anticuerpo no marcado. La cantidad de IL-18 humana en la muestra biologica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de rhIL-18 marcada unido al anticuerpo anti-IL-18.
Los anticuerpos y las porciones de anticuerpos de la invención preferiblemente son capaces de neutralizar la actividad humana de IL-18 in vitro e in vivo. Por lo tanto, tales anticuerpos y las porciones de anticuerpos de la 30 invención se pueden utilizar para inhibir actividad de hIL-18, p. ej., en un cultivo celular que contiene hIL-18, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen IL-18 con la que reacciona de manera cruzada un anticuerpo de la invención. En una realización, la invención proporciona un método para la inhibición de actividad de IL-18 que comprende poner en contacto IL-18 con un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención de manera que se inhiba la actividad de IL-18. Preferiblemente, la IL-18 es IL-18 humana. Por ejemplo, en un cultivo celular que
35 contiene, o se sospecha que contiene hIL-18, se puede añadir un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención al medio de cultivo para inhibir la actividad de hIL-18 en el cultivo.
En otra realización, la invención proporciona un método para reducir la actividad de IL-18 en un sujeto, ventajosamente en un sujeto que padecen una enfermedad o trastorno en los que es perjudicial la actividad de Gel40 18. La invención proporciona métodos para reducir la actividad de IL-18 en un sujeto que padecen tal enfermedad o trastorno, cuyo método comprende la administración al sujeto de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención de manera que se reduzca la actividad de IL-18 en el sujeto. Preferiblemente, la IL-18 es IL-18 humana y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que exprese una IL-18 a la que es capaz de unirse un anticuerpo de la invención. Adicionalmente el sujeto puede ser un mamífero en el que se ha 45 introducido hIL-18 (p. ej., por medio de la administración de hIL-18 o por medio de la expresión de un transgen de hIL-18). Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano con fines terapéuticos. Por otra parte, un anticuerpo de la invención se puede administrar a un mamífero no humano que exprese IL-18 con el que el anticuerpo es capaz de unirse con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Considerando lo último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los
50 anticuerpos de la invención (p. ej., evaluación de las dosificaciones y evolución temporal de la administración).
Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "un trastorno en el que la actividad de IL-18 es perjudicial" incluya una enfermedad y otros trastornos en los que se ha demostrado que la presencia de IL-18 en un sujeto que padece el trastorno es o se sospecha que es o responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. Por lo tanto, un trastorno en el que actividad de IL-18 es perjudicial es un trastorno en el que se espera que la reducción de actividad de IL-18 alivie los síntomas y/o el progreso del trastorno. Tales trastornos se pueden poner de manifiesto, por ejemplo, mediante un aumento en la concentración de IL-18 en un fluido biológico de un sujeto que padezca el trastorno (p. ej., un aumento en la concentración de IL-18 en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto), que se puede detectar, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-IL-18 como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos no limitantes de los trastornos que se pueden tratar con los anticuerpos de la invención incluyen los trastornos comentados en la sección de más abajo concernientes a las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.
D. Composición Farmacéutica
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprende adicionalmente al menos un agente terapéutico adicional para el tratamiento de un trastorno en el que actividad de IL-18 es perjudicial.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Por lo general, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo
o porción de anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la presente memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retadadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades mínimas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes y emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida útil o la eficacia del anticuerpo o de la porción de anticuerpo.
Los anticuerpos y porciones anticuerpo de la invención se pueden incorporar a una composición farmacéutica adecuada para su administración parenteral. Preferiblemente, el anticuerpo o las porciones de anticuerpo se prepararán en forma de una solución inyectable que contiene 0,1-250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta o de una forma de dosificación líquida o liofilizada en un vial, ampolla o jeringa precargada de vidrio blanco o ámbar. El tampón puede ser de L-histidina (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH de 5,0 a 7,0 (óptimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen pero no están limitados a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente sacarosa al 0-10% (óptimamente al 0,5-1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes volumétricos para una forma de dosificación liofilizada, principalmente manitol al 1-10% (óptimamente 2-4%). Se pueden utilizar estabilizadores en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-Metionina 1-50 mM (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes volumétricos adecuados incluyen glicina, arginina, pueden estar incluidos en forma de polisorbato-80 al 0-0,05% (óptimamente al 0,005-0,01%). Los tensioactivos adicionales incluyen pero no están limitados a polisorbato 20 y tensioactivos BRU.
Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas; tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica deseados. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (p. ej., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por medio de infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante una inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas por lo general deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular en forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requerido de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos liofilizados, estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secados a vacío y secado de rocío que rinde un polvo del ingrediente activo más un ingrediente deseado adicional a partir de su solución esterilizada previamente mediante filtración. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un agente de revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede facilitar incluyendo, en la composición, un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención se pueden administrar por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica, si bien para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo de administración preferidos son la inyección subcutánea, la inyección o infusión intravenosa. Como apreciarán los expertos en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá el compuesto de la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son conocidos generalmente por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) se puede englobar también en una cápsula de gelatina con cubierta exterior de gelatina dura o blanda, comprimir en comprimidos, o incorporar directamente a la dieta del sujeto. Para su administración terapéutica oral, a los compuestos se les pueden incorporar excipientes y utilizar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas; elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención por medio de otra administración diferente de la parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o administrar simultáneamente el compuesto con, un material que evite su inactivación.
También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos suplementarios. En ciertas realizaciones, se formula simultáneamente y/o administra simultáneamente un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para el tratamiento de trastornos en los que es perjudicial la actividad de IL-18. Por ejemplo, anticuerpo o porción de anticuerpo anti-hlL-18 de la invención se puede formular simultáneamente y/o administrar simultáneamente con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (p. ej., anticuerpos que se unen a otras citoquinas o que se unen a moléculas de la superficie celular). Además, se pueden utilizar uno o más anticuerpos de la invención combinados con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias combinadas pueden utilizar ventajosamente dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando de este modo toxicidades o complicaciones posibles asociadas con las diversas monoterapias.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo contra IL-18 o fragmento del mismo se asocia a un vehículo de vida media prolongada conocido en la técnica. Tales vehículos incluyen, pero no están limitados a, el dominio Fc, polietilenglicol, y dextrano. Tales vehículos se describen, p. ej., en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con el Núm. de Serie 09/428.082 y la Solicitud PCT Publicada Núm. WO 99/25044.
La interleuquina 18 juega un papel crítico en la patología asociada con una variedad de enfermedades que implican elementos inflamatorios e inmunitarios. Estas enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso generalizado, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetes mellitus insulinodependiente, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, enfermedad de injerto contra anfitrión, rechazo en el trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria aguda o crónica asociada con el trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Graves, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, neoplasias, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II, esporádicas, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía colítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, artropatía asociada a yersinia y salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad bulosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con la Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedad del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad del tejido conectivo mixta, esclerosis sistémica asociada a enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial, lupus eritematoso generalizado asociado a enfermedad pulmonar, dermatomiositis/polimiositis asociadas a enfermedad pulmonar, enfermedad de Sjögren asociada a enfermedad pulmonar, espondilitis anquilosante asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, hemosiderosis asociada a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterans, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis anti-anticuerpo LKM), hipoglicemia mediada por procesos autoinmunes, resistencia a insulina de tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada con el trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria crónica asociada con el trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis de tipo 1, psoriasis de tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad espermática, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia simpática, hipertensión pulmonar asociada a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis generalizada, síndrome de Sjörgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune goitrosa (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleostasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS), trastornos mentales (p. ej., depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por Tipo Th2 y Tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y cáncer de recto y neoplasias hematopoyéticas (leucemia y linfoma). Los anticuerpos humanos, y las porciones de anticuerpos de la invención se pueden utilizar para tratar seres humanos que padecen enfermedades autoinmunitarias, en particular aquellas asociadas con inflamación, incluyendo, espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, uveitis autoinmune.
Preferiblemente, los anticuerpos de la invención o sus porciones de unión al antígeno, se utilizan para tratar la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus insulinodependiente y la psoriasis.
Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención también se puede administrar con uno o más agente terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos se pueden utilizar solos o combinados para tratar tales enfermedades. Se debe entender que los anticuerpos de la invención o la porción de unión al antígeno de los mismos se pueden utilizar solos o combinados con un agente adicional, p. ej., un agente terapéutico, selecionándose dicho agente adicional por el experto en la técnica para su propósito deseado. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica por ser útil para tratar la enfermedad o afección que esté siendo tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que confiera un atributo beneficioso a la composición terapéutica p. ej., un agente que tenga efecto sobre la viscosidad de la composición.
Se debe entender además que las combinaciones que se van a incluir en esta invención son aquellas combinaciones útiles para el propósito deseado. Los agentes ilustrados más abajo son ilustrativos de los fines y no se pretende que estén limitados. Las combinaciones, que son parte de esta invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y al menos un agente adicional seleccionado de las listas de más abajo. Las combinación puede incluir también más de un agente adicional, p. ej., dos o tres agentes adicionales si la combinación es de manera que la composición formada puede realizar su función deseada.
Las combinaciones preferidas con uno o varios fármacos antiinflamatorios no esteroideos también referidos como AINES que incluyen fármacos de tipo ibuprofeno. Otras combinaciones preferidas son corticoesteroides que incluyen prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esteroides se pueden reducir o incluso eliminar disminuyendo la dosis requerida de esteroide cuando se tratan pacientes en combinación con los anticuerpos antiIL-18 de esta invención. Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la artritis reumatoide con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: uno o varios fármacos antiinflamatorios supresores de citoquinas (FASC); anticuerpos o antagonistas de otra citoquinas humanas
o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,1L-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-21, IL-23, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).
Las combinaciones preferidas de los agentes terapéuticos puede interferir en diferentes puntos en la cascada autoinmune e inflamatoria subsiguiente; los ejemplos preferidos incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos contra TNF quimérico, humanizado o humano, D2E7, (Publicación PCT Núm. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados de los mismos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) o p55TNFR1gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima conversora de TNFa (TACE); de un modo similar los inhibidores de IL-1 (inhibidores de la enzima conversora de Interleuquina-1, IL-1RA etc.) pueden ser eficaces por la misma razón. Otras combinaciones preferidas incluyen interleuquina 11. Otra combinación preferida adicional son otros actores clave de la respuesta autoinmune que pueden actuar en paralelo a, dependiente de o en concierto con la función de IL-18; son especialmente preferidos los antagonistas de IL-12 incluyendo anticuerpos IL-12 o receptores solubles de IL-12, o proteínas de unión IL-12. Se ha demostrado que IL-12 y IL-18 tienen funciones solapantes pero distintas y puede ser muy eficaz una combinación de antagonistas para ambas. Otras combinaciones preferidas adicionales son los inhibidores anti-CD4 no dañinos. Otras combinaciones preferidas adicionales incluyen antagonistas de la ruta co-estimuladora de CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagónicos.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar también con agentes, tales como metotrexato, 6-MP, azatioprina, sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotionialato (intramuscular y oral), azatioprina, colchicina, corticoesteroides (oral, inhalado y inyección local), agonistas del adrenoreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, cetotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenonato de mofetilo, leflunomida, AINES, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con señalización mediante citoquinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (p. ej. AK, NIK, IKK , p38 o inhibidores de quinasa MAP), inhibidores de la enzima conversora de IL-1�, inhibidores de la enzima conversora de TNFa (TACE), inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6mercaptoporinas, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina, receptores de citoquina solubles y derivados de los mismos (p. ej. receptores de TNF p55 o p75 solubles y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel™ y p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), citoquinas antiinflamatorias (p. ej. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF�), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxeno, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato sódico de oro, aspirina, acetónido de triamcinolona, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenaco, piroxicam, etodolac, diclofenaco sódico, oxaprozina, hcl de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenaco sódico/misoprostol, fentanilo, anakinra, recombinante humano, hcl de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofeno, alendronato sódico, prednisolona, sulfato de morfina, hidrocloruro de lidocaína, indometacina, glucosamina, sulfato de condroitina, hcl de amitriptilina, sulfadiazina, hcl de oxicodona/acetaminofeno, hcl de olopatadina, misoprostol, naproxeno sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-12, Anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801, y Mesopram. Las combinaciones preferidas incluyen metotrexato o leflunomida y en caso de artritis reumatoide moderados o severos, ciclosporina.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para enfermedad inflamatoria intestinal con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticoesteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptoporina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1� ; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos contra o antagonistas de otras citoquinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos contras moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenonato de mofetilo, leflunomida, AINES, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citoquinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (p. ej. IRAK NIK, IKK, p38 o inhibidores de quinasa MAP), inhibidores de la enzima conversora de IL-1�, inhibidores de la enzima conversora de TNFa, inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptoporinas, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina, receptores de citoquinas solubles y derivados de los mismos (p. ej. receptores de TNF p55 o p75 solubles, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL6R) y citoquinas antiinflamatorias (p. ej. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF ).
Los ejemplos preferidos de los agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn en los que se puede combinar un anticuerpo o una porción de unión al antígeno incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (Publicación PCT Núm. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (RENUCADE), CDP 571, constructos de TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (ENBREL) e inhibidores de p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con corticoesteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con la síntesis o la acción de citoquinas proinflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de la enzima conversora de IL-1� e IL-1ra. Los anticuerpos de la invención o la porción de unión al antígeno de los mismos se pueden utilizar también con inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo, 6mercaptopurinas inhibidoras de tirosina quinasas. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con IL-11. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptoporina, infliximab, metilprednisolona, succinato de sodio, difenoxilato/sulfato de atropina, hidrocloruro de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrosa-agua, bitartrato de hidrocodona/apap, hidrocloruro de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, hidrocloruro de ciprofloxazina, sulfato de hiosciamina, hidrocloruro de meperidina, hidrocloruro de midazolam, hcl de oxicodona/acetaminofeno, hidrocloruro de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbófilo, propoxifeno napsilato, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de codeína/apap, hcl de colesevelam, cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacina, metilprednisolona, natalizumab e interferón-gamma.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: corticoesteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-�1a (AVONEX; Biogen); interferón-�1b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferón a-n3) (Interferón Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón �1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics), Peginterferón a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos contra o antagonistas de otras citoquinas humanas
o factores de crecimiento y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-23, IL-15, IL-16, EMAP-II GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CDB, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina; FK506, rapamicina, micofenonato de mofetilo, leflunomida, AINES, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con señalización mediante citoquinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (p. ej. IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de quinasa MAP), inhibidores de la enzima conversora de IL-I �, inhibidores de TACE, inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6mercaptoporinas, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina, receptores de citoquinas solubles y derivados de los mismos (p. ej. receptores de TNF p55 o p75 solubles, sIL-1RI, sIL-IRII, sIL-6R) y citoquinas antiinflamatorias (p. ej. IL-4, IL-10, IL-13 y TNF�).
Los ejemplos preferidos de los agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple en los que el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se pueden combinar incluyen interferón-�, por ejemplo, IFN�1a y IFN� 1b; copaxona, corticoesteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos contra el ligando de CD40 y CD80.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tales como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, hidrocloruro de xaliproden, fampridina, acetato de glatiramer, natalizumab, sinnabidol, inmunoquina-a NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptores de quimioquinas, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposomas), THC.CBD (agonista cannabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpo anti-receptor de IL-6, neurovax, pirfenidona allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida, TGFbeta2, tiplimotida, antagonistas de SLA-4 (por ejemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELANBiogen), antagonistas de interferón gamma, agonistas de IL-4.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Angina con los que se puede combinar un anticuerpo,
o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, mononitrato de isosorbida, succinato de metoprolol, atenolol, tartrato de metoprolol, besilato de amlodipino, hidrocloruro de diltiazem, dinitrato de isosorbida, bisulfato de clopidogrel, nifedipina, atorvastatina cálcica, cloruro de potasio, furosemida, simvastatina, hcl de verapamilo, digoxina, hidrocloruro de propranolol, carvedilol, lisinopril, espironolactona, hidroclorotiazida, maleato de enalapril, nadolol, ramipril, enoxaparina sódica, heparina sódica, valsartan, hidrocloruro de sotalol, fenofibrato, ezetimiba, bumetanida, losartan potásico, lisinopril/hidroclorotiazida, felodipina, captopril, fumarato de bisoprolol.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Espondilitis Anquilosante con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: ibuprofeno, diclofenaco y misoprostol, naproxeno, meloxicam, indometacina, diclofenaco, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazina, Metotrexato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercept, infliximab.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para el Asma con los que se puede combinar un anticuerpo,
o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: albuterol, salmeterol/fluticasona, montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesónida, prednisona, xinafoato de salmeterol, hcl de levalbuterol, albuterol sulfato de ipratropio, fosfato de sodio de prednisolona, acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, succinato de sodio de metilprednisolona, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna del virus de la influenza, metilprednisolona, trihidrato de amoxicilina, flunisolida, inyección contra la alergia, cromolina sódica, hidrocloruro fexofenadina, flunisolida/mentol, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo estimulador del inhalador, guaifenesina, fosfato de sodio de dexametasona, hcl de moxifloxacina, hiclato de doxiciclina, guaifenesina/dmetorfano, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, hidrocloruro de cetirizina, furoato de mometasona, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, hcl de cetirizina/pseudoefed, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozil, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona, sulfato de metaproterenol.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la EPOC con los que se puede combinar un anticuerpo,
o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: sulfato de albuterol/ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, succinato de sodio de metilprednisolona, montelucast sódico, budesónida, fumarato de formoterol, acetónido de triamcinolona, levofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, hcl de levalbuterol, flunisólida, ceftriaxona sódica, trihidrato de amoxicilina, gatifloxacina, zafirlucast, amoxicilina/clavulanato, flunisólida/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, sulfato de metaproterenol, metilprednisolona, furoato de mometasona, p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p-efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R,R)-formoterol, TgAAT, Cilomilast, Roflumilast.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para el HCV con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: Interferón-alfa-2a, Interferón-alfa-2b, Interferón-alfa con1, Interferón-alfa-nl, interferón-alfa-2a Pegilado, interferón-alfa-2b Pegilado, ribavirina, Peginterferón alfa-2b +ribavirina, Ácido Ursodesoxicólico, Ácido Glicirrícico, Timalfasina, Maxamina, VX-497 y cualquier compuesto que se utilice para tratar el HCV a través de la intervención con las siguientes dianas: polimerasa de HCV, proteasa de HCV, helicasa de HCV, HCV IRES (sitio interno de entrada al ribosoma).
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Fibrosis Pulmonar idiopática con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: prednisona, azatioprina, albuterol, colchicina, sulfato de albuterol, digoxina, interferón gamma, sucinato sódico de metilprednisolona, lorazepam, furosemida, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicina d, alteplasa, propionato de fluticasona, levofloxacina, sulfato de metaproterenol, sulfato de morfina, hcl de oxicodona, cloruro de potasio, acetónido de triamcinolona, tacrólimo anhidro, calcio, interferón-alfa, metotrexato, micofenonato de mofetilo, Interferón-gamma-1�.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para el Infarto de Miocardio con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida, retavasa, losartan potásico, hcl de quinapril/carb mag, bumetanida, alteplasa, enalaprilato, hidrocloruro deamiodarona, m-hidrato de hcl de tirofiban, hidrocloruro de diltiazem, captopril, irbesartan, valsartan, hidrocloruro de propranolol, fosinopril sódico, hidrocloruro de lidocaína, eptifibatida, cefazolina sódica, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, hidrocloruro de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, hcl de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, atorvastatina cálcica, hidrocloruro de midazolam, hidrocloruro de meperidina, dinitrato de isosorbida, epinefrina, hidrocloruro de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/simvastatina, avasimiba, cariporida.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Psoriasis con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: calcipotrieno, propionato de clobetasol, acetónido de triamcinolona, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, fluocinonida, dipropionato aumentado de betametasona, acetónido de fluocinolona, acitretina, champú de alquitrán, valerato de betametasona, furoato de mometasona, cetoconazol, pramoxina/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenólido, urea, betametasona, propionato de clobetasol/emol, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula humectante, ácido fólico, desonida, pimecrólimo, alquitrán de hulla, diacetato de diflorasona, folato de etanercept, ácido láctico, metoxsaleno, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, filtro solar, halcinonida, ácido salicílico, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de hulla, alquitrán de hulla /ácido salicílico, alquitrán de hulla/ácido salicílico/azufre, desoximetasona, diazepam, emoliente, fluocinonida/emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/lactona, aceite mineral/aceite de cacahuete, petróleo/misristato de isopropilo, psoraleno, ácido salicílico, jabón/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrólimo, pimecrólimo, PUVA, UVB, sulfasalazina.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Artritis Psoriática con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: metotrexato, etanercept, rofecoxib, celecoxib, ácido fólico, sulfasalazina, naproxeno, leflunomida, acetato de metilprednisolona, indometacina, sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, diprop aumentado de betametasona, infliximab, metotrexato, folato, acetónido de triamcinolona, diclofenaco, dimetilsulfóxido, piroxicam, diclofenaco sódico, cetoprofeno, meloxicam, metilprednisolona, nabumetona, tolmetina sódica, calcipotrieno, ciclosporina, diclofenaco sódico/misoprostol, fluocinonida, sulfato de glucosamina, tiomalato sódico de oro, bitartrato de hidrocodona/apap, ibuprofeno, risedronato sódico, sulfadiazina, tioguanina, valdecoxib, alefacept, efalizumab.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Restenosis con los que se puede combinar un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: sirolimo, paclitaxel, everólimo, tacrólimo, ABT-578, acetaminofeno.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la Ciática con los que se puede combinar un anticuerpo,
o porción de anticuerpo, de la invención incluyen los siguientes: bitartrato de hidrocodona/apap, rofecoxib, hcl de ciclobenzaprina, metilprednisolona, naproxeno, ibuprofeno, hcl de oxicodona/acetaminofeno, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína/apap, hcl de tramadol/acetaminofeno, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, hidrocloruro de lidocaína, diclofenaco sódico, gabapentina, dexametasona, carisoprodol, cetorolaco de trometamina, indometacina, acetaminofeno, diazepam, nabumetona, hcl de oxicodona, hcl de tizanidina, diclofenaco sódico/misoprostol, napsilato de propoxifeno/apap, asa/oxicod/ter de oxicodona, ibuprofeno/bit de hidrocodona, hcl de tramadol, etodolac, hcl de propoxifeno, hcl de amitriptilina, carisoprodol/fos de codeína/asa, sulfato de morfina, multivitaminas, naproxeno sódico, citrato de orfenadrina, temazepam.
Los ejemplos preferidos de los agentes terapéuticos para el LEG (Lupus) en el que un anticuerpo o una porción de unión al antígeno se pueden combinar incluyen los siguientes: AINES, por ejemplo, diclofenaco, naproxeno, ibuprofeno, piroxicam, indometacina; inhibidores de COX2, por ejemplo, Celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; antimaláricos, por ejemplo, hidroxicloroquina; Esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budenosida, dexametasona; Citotóxicos, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, micofenonato de mofetilo, metotrexato; inhibidores de PDE4 o inhibidor de la síntesis de porina, por ejemplo Cellcept. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión al antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, Imuran y agentes que interfieren con la síntesis, la producción o la acción de citoquinas proinflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de caspasa como inhibidores de la enzima conversora de IL-1� y IL-1ra. Los anticuerpos de la invención o la porción de unión al antígeno de los mismos se pueden utilizar también con inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo, inhibidores de tirosina quinasas;
o moléculas que dirigen la activación células T, por ejemplo, CTLA-4-IgG o anticuerpos de la familia anti-B7, anticuerpos de la familia anti-PD-1. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de los mismos, se pueden combinar con IL-11 o anticuerpos anti-citoquinas, por ejemplo, fonotolizumab (anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos anti-receptores, por ejemplo, anticuerpo anti-receptor de IL-6 y anticuerpos contra moléculas de la superficie de células B. Los anticuerpos de la invención o la porción de unión al antígeno de los mismos se pueden utilizar también con LJP 394 (abetimus), agentes que agotan o inactivan las células B, por ejemplo, Rituximab (anticuerpo anti-CD20), linfostat-B (anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (Publicación PCT Núm. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, constructos de TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT)).
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o a "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico deseado. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de anticuerpo y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para lograr una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la
5 que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo es contrarrestado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" hace referencia a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Por lo general, puesto que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o en una fase temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
10 Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, se pueden administrar dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar la dosis proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una
15 forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. Forma de dosificación unitaria según se utiliza en la presente memoria hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la invención están
20 dictadas o dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr, y (b) las limitaciones inherente en la técnica de elaboración de preparados farmacéuticos tal como compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Un intervalo no limitante, ilustrativo para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o
25 porción de anticuerpo de la invención es 0,1-20 mg/Kg., más preferiblemente 1-10 mg/Kg. Se debe observar que los valores de dosificación pueden varar con el tipo y gravedad de la afección que tenga que ser mitigada. Se debe entender adicionalmente que para cualquier sujeto concreto, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en la
30 presente memoria son meramente ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reivindicada.
II. Genes sensibles a IL-18
35 La IL-18 es expresada en macrófagos, células dendríticas, células de Kupffer, microglía, células epiteliales, queratinocitos, células del epitelio intestinal, condrocitos, fibroblastos sinoviales y osteoblastos, así como en la corteza suprarrenal y la glándula pituitaria. En algunas células, tales como monocitos humanos y células dendríticas, la expresión es constitutiva, mientras que en otras células debe ser inducida de novo. Aparte de la expresión del interferón gamma, poco se sabe acerca de otros genes inducidos por IL-18 sola o en concierto con otras citoquinas.
40 Una realización de la descripción proporciona un método para la regulación de la expresión génica de un gen de interés que comprende las etapas de proporcionar IL-18 o un modulador de IL-18; y poner en contacto IL-18 o el modulador con una célula donde el gen de interés se selecciona del grupo que consiste en los genes presentados en la siguiente tabla.
Tabla 3 Genes sensibles a IL-18
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
NM_000389
p21 inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1A (p21, Cip1)
NM_002198
IF1 factor 1 regulador de interferón
N_002163
ICSBP1 proteína de unión 1 a la secuencia consenso del interferón
NM_006144
GZMA granzima A
NM_006515
SETMAR dominio SET y gen de fusión de la transposasa mariner
NM_007185
TNRC4 4 que contiene repeticiones de trinucleótidos
NM_002288
LAIR2 receptor 2 de tipo Ig asociado a leucocitos
NM_003661
APOL1 apolipoproteína L, 1
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
NM_021958
HLX1 homeobox 1 de tipo H2.0 (Drosophila)
NM_001335
CTSW catepsina W (linfopaína)
Hs.382006
FCGR1B forma b de FcRI (AA 1-344)
NM_020125
BLAME leucina aminopeptidasa 3
NM_007210
GALNT6 UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina
NM_021798
IL21R receptor de interleuquina 21
NM_013324
CISH proteína que contiene SH2 inducible por citoquina
M11313
A2M alfa-2-macroglobulina
D88152
ACATN transportador de acetil-Coenzima A
NM_001103
ACTN2 actinina alfa 2
U37519
ALDH8 aldehído deshidrogenasa 8
N_000697
ALOX12 araquidonato 12-lipoxigenasa
J03600
ALOX5 araquidonato 5-lipoxigenasa
NM_014578
ARHD familia genes homólogos ras, miembro
S66793
ARR3 arrestina 3, retinal (X-arrestina)
U47054
ART3 ADP-ribosiltransferasa 3
L19871
ATF3 factor de activación de la transcripción 3
M81181
ATP1B2 ATPasa, transportador de Na+/K+
NML001188
BAK1 antagonista de BCL2/killer 1
U15460
BATF factor de Transcripción con cremalleras de leucina de carácter básico, de tipo ATF
NM_014417
BBC3 componente 3 de unión a Bcl-2
Z23115
BCL2L1 BCL2 de tipo 1
NM_001713
BHMT metiltransferasa de betaína-homocisteína
U45878
BIRC3 que contiene 3 de la repetición IAP de baculovirus
U37546
BIRC3 que contiene 3 de la repetición IAP de baculovirus
U72649
BTG2 familia BTG, miembro 2
U49187
C60RF32 marco de lectura abierto 32 del cromosoma 6
J03507
C7 componente 7 del complemento
U50360
CAMK2G quinasa II gamma CaM
XM_071866
CAT56 proteína CAT56
NM_005623
CCL8
Z32765
CD36 antígeno CD36 (colágeno tipo I/receptor de TSP)
HG2981-HT3127
CD44 antígeno CD4
Z11697
CD83 antígeno CD83
XM_071866
ICDR2 proteína relacionada con la degeneración cerebelar (62kD)
U51096
CDX2 factor de transcripción de tipo homeobox 2
M83667
CEBPD CCAAT/proteína delta de unión al potenciador (C/EBP)
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
D87469
CELSR2 cadherina, receptor 2 de tipo G EGF LAG de siete pasos
L07765
CES1 carboxilesterasa 1
U66468
CGR11 regulador del crecimiento celular con dominio en mano EF
X14830
CHRNB1 receptor colinérgico, nicotínico, polipéptido 1 beta
L29217
CLK3 quinasa 3 de tipo CDC
X15880
COL6A1 colágeno, tipo VI, alfa 1
NM_001851
COL9A1 colágeno, tipo IX, alfa 1
M27691
CREB1 proteína de unión 1 al elemento sensible a AMPc
M37435
CSF1 factor 1 estimulador de colonias (macrófago)
HG3548-HT3749
CUTL1 cut (proteína de desplazamiento de CCAAT)
X13589
CYP19 citocromo P450, subfamilia XIX
X16866
CYP2D7AP citocromo P450, subfamilia IID
X59131
D13S106E proteína altamente cargada
NM_004393
DAG1 distroglicano 1
U73328
DLX4 homeobox distal menos4
L19267
DMWD distrofia miotónica, motivo repetitivo WD
U53445
DOC1 regulado a la baja en cáncer de ovario 1
X68277
DUSP1 fosfatasa 1 de especificidad dual
U48807
DUSP4 fosfatasa 4 de especificidad dual
NM_001950
E2F4 factor de transcripción E2F-4, unión a p107/p130
U87269
E4F1 factor de transcripción E4F-1
M57730
EFNA1 efrina-A1
X52541
EGR1 respuesta de crecimiento temprano 1
J04076
EGR2 respuesta de crecimiento temprano 2 (homólogo Krox-20)
X63741
EGR3 respuesta de crecimiento temprano 3
L07077
EHHADH enoil-Coenzima A
M62831
ETR101 proteína temprana inmediata
M60830
EVI2B sitio 2B de integración viral ecotrópica
U53786
EVPL envoplaquina
NM_001988
EVPL envoplaquina
N_000141
FCGBP fragmento Fc de la proteína de unión a IgG
M23668
FDX1 ferredoxina 1
U60062
FEZ1 proteína zeta 1 de fasciculación y elongación (zingina I)
N_000141
FGFR2 receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos
U49973
FLJ10803 proteína hipotética FLJ10803
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
U89995
FOXE1 caja de la cabeza de tenedor E1 (factor 2 de transcripción tiroideo)
U27326
FUT3 fucosiltransferasa3
A28102
GABRA3 receptor de ácido gamma-aminobutírico (GABA)
M25667
GAP43 proteína 43 asociada al crecimiento
L34357
GATA4 proteína de unión GATA-4
U19523
GCH1 ciclohidrolasa 1 de GTP
L01406
GHRHR receptor de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento
U03486
GJA5 proteína de uniones en hendidura, alfa 5, 40kD (conexina 40)
X68285
GK glicerol quinasa
Z18859
GNAT2 proteína de unión al nucleótido de guanidina (proteína G)
HG870-HT870
GOLGA3 autoantígeno golgi, subfamilia a de la golgina, 3
D49958
GPM6A glicoproteína M6A
D43772
GRB7 proteína 7 de unión al receptor del factor de crecimiento
AC000099
GRM8 receptor de glutamato, metabotrópico 8
M57731
GRO2 oncogen GRO2
X53800
GRO3 oncogen GRO3
M91036
HBG2 hemoglobina, gamma G
D16583
HDC histidina descarboxilasa
X64877
HFL3 factor H (complemento) tipo 3
X58431
HOXB6 homeobox B6
M16937
HOXB7 homeobox B7
NM_014468
HPX42B homeobox progenitor hematopoyético
X92814
HREV107 similar a HREV107 de rata
L19314
HRY homólogo de hairy (Drosophila)
M26665
HTN3 histatina 3
D10995
HTR1B receptor 1B de 5-hidroxitriptamina (serotonina)
L41147
HTR6 receptor 6 de 5-hidroxitriptamina (serotonina)
M24283
ICAM1 molécula 1 de adherencia celular (CD54)
S81914
IER3 respuesta temprana inmediata 3
J03171
IFNAR1 receptor 1 de interferón (alfa, beta y omega)
J00219
IFNG interferón, gamma
NM_000619
IFNG interferón, gamma
NM_000585
IL15 interleuquina 15
U31628
IL15RA receptor de interleuquina 15, alfa
X04500
IL1B interleuquina 1, beta
M27492
IL1R1 receptor de interleuquina 1, tipo I
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
X01057
IL2RA receptor de interleuquina 2, alfa
M26062
IL2RB receptor de interleuquina 2, beta
Y00081
IL6 interleuquina 6 (interferón, beta 2)
Y00787
IL8 interleuquina 8
Z31695
INPP5A inositol polifosfato-5-fosfatasa, 40kD
X06256
ITGA5 integrina, alfa 5
X57206
ITPKB inositol 1,4,5-trisfosfato 3-quinasa B
U20734
JUNB proto-oncogen jun B
NM_014879
KIAA0001 receptor acoplado a proteína G putativo para UDP-glucosa
D31762
KIAA0057 proteína
KIAA0087
producto génico KIAA0087 de tipo TRAM
NM_005551
KIAA0133 producto génico KIAA0133
NM_014846
KIAA0196 producto génico KIAA0196
X06182
KIT oncogen homólogo V-kit
NM_005551
KLK2 calicreína 2, prostática
X07730
KLK3 calicreína 3, (antígeno específico de próstata)
M13955
KRT7 queratina 7
M57710
LGALS3 lectina, unión a galactosidasa, soluble, 3 (galectina 3)
S83362
LIFR receptor del factor inhibidor de leucemia
NM_002314
LIMK1 dominio quinasa 1 LIM
NM_005569
LIMK2 dominio quinasa 2 LIM
U49957
LPP contiene dominio LIM
U89922
LTB linfotoxina beta (superfamilia del TNF, miembro 3)
X14008
LYZ lisozima (amiloidosis renal)
U59914
MADH6 homólogo 6 de MAD)
D14497
MAP3K8 proteína quinasa activada por mitógeno quinasa 8
X59727
MAPK4 proteína quinasa activada por mitógeno 4
NM_000429
MAT1A metionina adenosiltransferasaI, alfa
HG1877-HT1917
MBP proteína básica de mielina
HG3115-HT3291
MBP proteína básica de mielina
U43944
ME1 enzima málica 1, dependiente de NADP(+), citosólica
X72755
MIG monoquina inducida por interferón gamma
NM_021230
IMLL3 leucemia 3 de linaje mieloide/linfoide o mixto
NM_005951
MT1H metalotioneína 1H
X78710
MTF1 factor metal-regulador 1 de la transcripción
X70991
NAB2 proteína de unión 2 a NGFI-A (ERG1 pb 2)
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
M32011
NCF2 factor citosólico 2 de neutrófilos
S77763
NFE2 factor nuclear (derivado eritroide 2), 45kD.
M58603
NFKB1 factor nuclear kappa B (p105)
S76638
NFKB2 factor nuclear kappa B
M69043
NFKBIA factor nuclear kappa B
U91616
NFKBIE factor nuclear kappa B
D86425
NID2 nidógeno 2
L13740
NR4A1 subfamilia 4 del receptor nuclear, grupo A, miembro 1
U44848
NRF1 factor 1 nuclear respiratorio
U79251
OPCML proteína de unión a opioides/tipo molécula de adherencia celular
HG4115-HT4385
OR1E3P receptor olfatorio
M27288
OSM oncostatina M
AF000234
P2RX4 receptor porinérgico P2X
D50640
PDE3B fosfodiesterasa 3B, inhibida por GMPc
L20971
PDE4B fosfodiesterasa 4B, específica de APMc
L10343
PI3 inhibidor de proteasa 3, derivada de piel (SKALP)
IU77735
PIM2 oncogen pim-2
NM_003579
PIP5K2A fosfatidilinositol-4-fosfato 5-quinasa 011
U17034
PLA2R1 receptor 1 de fosfolipasa A2, 180kD
AB000584
PLAB factor de diferenciación de próstata
X63131
PML leucemia promielocítica
D11428
PMP22 proteína de mielina periférica 22
NM_032940
POLR2C polipéptido de polimerasa (ARN) II
NM_005035
POLRMT polimerasa (ARN) mitocondrial (dirigida a ADN)
NM_003579
POU2F2 dominio POU, clase 2, factor de transcripción 2
M18255
PRKCB1 proteína quinasa C, beta 1
L01087
PRKCQ proteína quinasa C, theta
D38128
PTGIR receptor (IP) de prostaglandina I2 (prostaciclina)
Y10375
PTPNS1 tirosina fosfatasa, sustrato 1 no receptor
D15049
PTPRH proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, H
M31166
PTX3 gen relacionado con la pentaxina,
U59877
RAB31 RAB31, miembro de la familia de oncogenes RAS
Nk_003579
RAD54L RAD54 de tipo (S.cerevisiae)
U64675
RANBP2L1 RAN proteína de unión 2 tipo 1
S57153
RBBP1 retinoblastoma-proteína de unión 1
NM_002903
RCV1 recoverina
NG_000013
RDBP proteína de unión a ARN RD
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
X75042
REL v-rel
M83221
RELB v-rel
NM_000537
REN renina
U22314
REST factor de transcripción silenciador de RE1
S59049
RGS1 regulador de la señalización de proteína G 1
U70426
RGS16 regulador de la señalización de proteína G 16
U22377
RLF secuencia de fusión L-myc reordenada
U38480
RXRG receptor X retinoide, gamma
IL10338
SCN1B polipéptido del canal de sodio
M23178
SCYA3 citoquina A3 inducible pequeña
M69203
SCYA4 citoquina A4 inducible pequeña
NM_005409
SCYB11 subfamilia B de citoquina inducible pequeña: CXC11
D79206
SDC4 sindecano 4 (amfiglicano, riudocano)
NM_005065
SEL1L sel-1 de tipo (supresor de lin-12, C.elegans)
NM_004186
SEMA3F semaforina 3F
J03764
SERPINE1 nexina, inhibidor de tipo 1 del activador de plasminógeno
NM_006802
SF3A3 factor de empalme 3a, subunidad 3, 60kD
HG3925-HT4195
SFTPA2 proteína A2 asociada a los pulmones, tensioactiva
D89077
SLA adaptador de tipo Src
No_003037
SLAM molécula de activación linfocítica de la señalización
M91463
SLC2A4 transportador de glucosa de la familia 2 del portador de soluto
D82326
SLC3A1 familia 3 del portador de soluto
L05568
SLC6A4 familia 6 del portador de soluto (serotonina),
U96094
SLN sarcolipina
X83301
SMA3 SMA3
D21267
ISNAP25 proteína asociada al sinaptosoma, 25kD
IL31529
SNTB1 proteína A1 asociada a sintropina, distrofina,
HG961-HT961
SOS1 hijo del homólogo 1 de sevenless (Drosophila)
M62800
SSA1 (52kD, autoantígeno de ribonucleoproteína SSA/Ro)
NM_021014
SSX3 sarcoma sinovial, X punto de rotura 3
Z35093
SURF1 surfeit 1
NM_005816
TACTILE activación células T, aumento de la expresión tardía
L25444
TAF2E factor asociado a la proteína de unión de la caja TATA (TBP)
M95787
TAGLN transgelina
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene
NM_005421
TAL2 leucemia lifocítica aguda 2 de células T
L47345
TCEB3 factor B de elongación de la transcripción (110kD, elonguina A)
M57732
TCF1 factor nuclear hepático (HNF1)
NM_003205
TCF12 factor de transcripción 4 con motivo hélice-asahélice
M96956
TDGF1 factor de crecimiento 1 derivado de teratocarcinoma
U19878
TMEFF1 transmembrana con EGF y de tipo folistatina
M92357
TNFAIP2 proteína 2 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa
M59465
TNFAIP3 proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa
X83490
TNFRSF6 miembro 6 del receptor del factor de necrosis tumoral
U37518
TNFSF10 miembro 10 del factor de necrosis tumoral
Nk_003294
TPSB1 triptasa beta 1
U19261
TRAF1 factor 1 asociado al receptor de TNF
U78798
TRAF6 factor 6 asociado al receptor de TNF
S69790
WASF3 familia de proteína WAS, miembro 3
U53476
WNT7A familia del sitio de integración de MMTV de tipo sin alas
L15309
ZNF141 proteína con dedos de cinc 141 (clon pHZ-44)
U78722
ZNF165 proteína con dedos de cinc 165
HG4333-HT4603
ZNF79 proteína con dedos de cinc 79 (pT7)
X57809
región variable de la cadena ligera lambda
HG3111-HT3287
clon HH409 de Homo sapiens desconocido
U79249
secuencia del clon 23839 humano
AB000464
clon: RES4-24A
HG4593-HT4998
canal de sodio regulado por voltaje (SCN1A)
X77744
Homo sapiens para la proteína FLJ00032, parcial
U79248
secuencia del clon 23826 humano
AI420129
ESTs
El método de identificación de genes regulados por la IL-18 se describe en el Ejemplo 3. Estos estudios mostraron que IL-18 es a citoquina proinflamatoria auténtica y puede regular directamente la expresión de varios genes que codifican otros mediadores proinflamatorios: Estudios en los que se utilizan muestras de sangre humana muestran
5 que muchas respuestas a IL-18 se producen abiertamente en la población humana y demuestran su utilidad como marcadores bioquímicos de IL-18, y como consecuencia de la función anti-IL18.
Los moduladores de IL-18 pueden ser agonistas y antagonistas. Preferiblemente el modulador es una proteína de unión o una proteína de unión neutralizadora.
10 Los inhibidores de IL-18 ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos, y fragmentos de los mismos, que se unen a IL-18; anticuerpos que se unen a IL-18R; anticuerpos que se unen a IL-18RAcP; IL-18bp; fragmentos de IL-18R (p. ej., un dominio extracelular solubilizado del receptor de IL-18); péptidos que se unen a IL-18 y reducen
o previenen su interacción con IL-18R; péptidos que se unen a IL-18R y reducen o previenen su interacción con IL18 o con IL-18RAcP; péptidos que se unen a IL-18RAcP y reducen o previenen su interacción con IL-18R; y moléculas pequeñas que reducen o previenen la producción de IL-18 o la interacción entre cualquiera de IL-18, IL18R, e IL-18RAcP.
Algunos inhibidores de IL-18 se describen, p. ej., en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.912.324, expedida el 14 de Julio de 1994; el documento EP 0 962 531, publicado el 8 de Dic. de 1999; el documento EP 712 931, publicado el 15 de Nov. de 1994; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.914.253, expedida el 14 de Julio de 1994; el documento WO 97/24441, publicado el 10 de Julio de 1997; la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.060.283, expedida el 9 de Mayo de 2000; el documento EP 850 952, publicado el 26 de Dic. de 1996; el documento EP 864 585, publicado el 16 de Sep. de 1998; el documento WO 98/41232, publicado el 24 de Sep. de 1998; la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.054.487, expedida el 25 de Abril de 2000; el documento WO 99/09063, publicado el 14 de Agosto de 1997; el documento WO 99/22760, publicado el 3 de Nov. de 1997; el documento WO 99/37772, publicado el 23 de Enero de 1998; el documento WO 99/37773, publicado el 20 de Marzo de 1998; el documento EP 0 974 600, publicado el 26 de Enero de 2000; el documento WO 00112555, publicado el 9 de marzo de 2000; la Solicitud de Patente japonesa JP 111.399194, publicada el 31 de Oct. de 1997; la Solicitud de Patente de Israel IL 121554 A0, publicada el 8 de Feb. de 1998.
Resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica que serán obvias otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos de la invención descritos en la presente memoria y se pueden realizar utilizando los equivalentes adecuados sin apartarse del alcance de la invención o las realizaciones descritas en la presente memoria. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen solo con fines ilustrativos y no se pretende que limiten la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción y Caracterización de IL-18 recombinante
Ejemplo 1.1: Análisis para determinar la actividad biológica de IL-18
A lo largo del Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 los siguientes análisis se utilizaron para determinar la actividad biológica de IL-18 a no ser que se establezca lo contrario.
Ejemplo 1.1.A: Bioanálisis de KG-1
KG-1 (ATCC #CCL-246) es una línea celular mielomonocítica humana que expresa constitutivamente bajos niveles del receptor funcional de IL-18. El tratamiento con TNF regula al alza IL-18Ra y las subunidades � del receptor funcional de IL-18 en estas células. El bioanálisis de KG-1 se realizó incubando células KG-1 tratadas con TNF con IL-18 humana recombinante (rhu-IL-18) y determinando el nivel de producción de IFNy humano inducido por IL-18 por medio de un ELISA. (Konishi, K., et al (1997) J. Immunol. Methods 209:187-191). El bioanálisis de KG-1 se utilizó para determinar la potencia de neutralización de los antagonistas de IL-18. Por ejemplo, se incubaron anticuerpos anti-IL-18 con diferentes concentraciones de rhu-IL-18 y a continuación se incubaron con células KG-1 tratadas con TNF en una placa de 96 pocillos durante 16-18 horas a 37°C. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar los niveles de IFNy humano por medio de un ELISA. Este análisis puede medir valores de CI50 por debajo de 4x10-11 - 6x10-11 M de un antagonista de IL-18.
Ejemplo 1.1.B: Análisis de Sangre Completa Humana
En resumen, el Análisis de Sangre Completa Humana (ASC) determina la potencia de neutralización de los antagonistas de IL-18 frente a IL-18 natural en un contexto fisiológico. En este análisis, la lectura fue la inhibición de la producción de IFNy humano dependiente de IL-18 endógena. La sangre completa se estimuló con LPS (1 μg/mL) más IL-12 (50 μg/mL) en presencia o ausencia de antagonistas de IL-18 a 37°C. Las concentraciones de IFNy humano se determinaron por medio de ELISA 18-24 hrs post-estimulación con LPS más IL-12.
Ejemplo 1.1.C: Análisis de Unión al Receptor
En resumen, en el Análisis de Unión al Receptor (AUR), se utilizó rhu-IL-18 marcada con I125 para determinar la unión de IL-18 al receptor de IL-18. La rhu-IL-18-I125 se une a específicamente a IL-18Ra� en las células KG-1
tratadas con TNF (ѝ7,000 sitios/célula). La rhu-IL-18-I125 tiene la misma actividad específica que IL-18 no marcada y puede ser apartada de la competición por la IL-18 no marcada.
Se definieron dos modos de inhibición, A y B. En el Modo A de neutralización, no resultó afectada la unión de IL-18
5 al receptor de alta afinidad de IL-18 (IL-18Ra�), pero se bloqueó la transducción de la señal mediada por IL-18 (es decir la producción de IFNy). En el Modo B de neutralización se bloqueó la unión de IL-18 a IL-18Ra� y de ese modo no se produjo la consiguiente señalización mediada por el receptor.
Ejemplo 1.2: Producción de IL-18 recombinante Ejemplo 1.2.A: Construcción del Plásmido, Expresión y purificación de proIL-18 humana
La IL-18 recombinante humana se generó expresando la forma precursora de IL-18 en células de insecto SF-9. Utilizando métodos de biologica molecular convencionales bien conocidos en la técnica, se generó ADNc de pro-IL15 18 humana completo utilizando cebadores específicos de PCR basados en la secuencia publicada (Ushio, S., et al. (1996) J. Immunol. 156:4274-4279) y se clonaron con posterioridad en el vector de transferencia (BV) de baculovirus pVL1393. (BD Biosciences, San Jose, CA; Núm. de Cat 51-21201P). El cebador de PCR 5' utilizado para generar el ADNc de pro-IL-18 humana completo contenía secuencias que codificaban una región 6-Histidina de manera que el extremo N de la proIL-18 contenía una etiqueta 6-HIS. Las células de insecto SF9 se infectaron con baculovirus que
20 albergaban el vector pVL1393 que contenía el ADNc de IL-18. Las células SF9 infectadas se lisaron y los productos lisados se hicieron correr sobre una columna de níquel para purificar la pro-IL-18 (rhu pro IL-18) etiquetada con HIS (BD Biosciences, San Jose, CA; Núm. de Cat. 554802). La pro IL-18 etiquetada con HIS recombinante se procesó adicionalmente mediante digestión con caspasa-1 humana para generar IL-18 biológicamente activa (IL-18 madura). (Ghayur T., (1997) Nature 386:619-623).
Ejemplo 1.2.B: Tratamiento con NEM de IL-18
La IL-18 recombinante humana obtenida de Hayashibara Biochemical Laboratories, Japan, presentaba variación de la actividad específica entre lotes y en la afinidad de unión de IL-18. La IL-18 contenía enlaces disulfuro entre
30 algunos pares de las cuatro cisteínas en la IL-18 madura. Estos causaron heterogeneidad estructural y funcional, y variaciones entre lotes. El modelado por homología de IL-18 humana utilizando coordenadas de IL-1b mostró que los residuos de cisteínas de las posiciones 38 y 68 de la IL-18 humana madura están expuestos y por lo tanto son reactivos.
35 La IL-18 recombinante humana del Ejemplo 1.2.A se trató con N-etilmaleimida (NEM) para proteger las cisteínas de la oxidación. NEM-IL-18 era monomérica, no formaba agregados, era estable, y conservaba una alta actividad específica a lo largo del tiempo. NEM-IL-18 conservaba epítopos neutralizadores debido a que los anticuerpos neutralizadores anti-huIL-18 se unían y neutralizaban NEM-IL-18. A pesar del tratamiento con NEM de IL-18, se preservaron los epítopos neutralizadores sobre NEM-IL-18 según se determina mediante la capacidad de los
40 anticuerpos anti-IL-18 para neutralizar la actividad biológica de NEM-IL-18 y de IL-18 humana natural en ASC humana. Se utilizó NEM-IL-18 para la optimización y selección del análisis y la caracterización inicial de mAbs antiIL-18 humana completamente humanos.
Ejemplo 1.2.C: Generación y caracterización del mutante 4C/A de IL-18
45 El mutante 4C/A de IL-18 se generó por medio de la mutación de los cuatro residuos de Cisteína en IL-18 madura a Alanina ("4GA-huL-18"). Las comparación del mutante 4C/A de IL-18 con NEM-huIL-18, como se resume en la Tabla 4 de más abajo, mostró que las propiedades biológicas y bioquímicas de las dos proteínas eran indistinguibles. Tanto el mutante 4C/A de IL-18 como NEM-huIL-18 eran monoméricos mediante análisis de difracción de luz
50 dinámica (DLS) y cromatografía de exclusión por tamaños (SEC), y similares en conformación y estabilidad física mediante análisis de dicroismo circular. La actividad biológica del mutante 4C/A de IL-18 y de NEM-huIL-18 fue la misma en el análisis KG-1, y ambas formas de IL-18 se unían a IL-18BP y a los anticuerpos anti-IL-18 con afinidad similar. 4C/A-huL-18 no fue objeto de inestabilidad oxidativa y se expresó fácilmente a altos niveles en E. coli.
55 Tabla 4 La Comparación de NEM-IL-18 y 4C/A-huIL-18 muestra que tienen medidas equivalentes de pureza conformacional y oligomérica, estabilidad física, y unión a anticuerpos o a receptores unidos a la célula.
Propiedades
Mediciones NEM-huIL-18 (4C/A)-huIL-18
Estado Oligomérico
SEC Monomérico Monomérico
DLS
Monomérico Monomérico
Confirmación
CD (barrido longitud de onda) CD mínimo a 210 nm CD mínimo a 210 nm
Propiedades
Mediciones NEM-huIL-18 (4C/A)-huIL-18
Estabilidad
CD (barrido temperatura) Estable hasta 40° C Estable hasta 40° C
Bioactividad
producción de IFNy por 2 ng/mL IL-18 IFNy 8 ng/mL IFNy 8 ng/mL
Epítopos
Neutralización de la producción de IFNy por un aglutinante de referencia Neutralizado por IL-18BP-Fc, 125-2H y IL-18Ra Neutralizado por IL-18BP-Fc, 125-2H y IL-18Ra
•
Biacore (KD) IL-18BP-Fc: 0,098 nM 125-2H: 0,2 nM 2,5(E)mg1: 0,3 nM IL-18BP-Fc: 0,135 nM 125-2H: 0,2 nM 2,5(E)mg1: 0,2 nM
Ejemplo 1.2.D: Generación y caracterización de rhuIL-18 Biotinilada (biot-IL-18)
La biotinilación de NEM-IL-18 del Ejemplo 1.2.B se realizó en residuos de lisina utilizando mecanismos
5 convencionales bien conocidos en la técnica, (Sulfo-NHS-LC-Biotin, Pierce, Rockford, IL; Núm. de Cat 21335), y la rhu-IL-18 biotinilada (biot-IL-18) obtenida era una mezcla heterogénea que contenía especies con 1, 2, 3, o 4 biotinas por huIL-18. Además, las especies con 2 o 3 biotinas por rhuIL-18 fueron las especies principales en biot-IL
18. La biot-IL-18 era biológicamente activa, se unía a anticuerpos anti-IL-18 según se determina mediante ELISA, y fue neutralizada por todos los anticuerpos anti-huIL-18 neutralizadores sometidos a ensayo. La Biot-IL-18 se unía a
10 células KG-1 que expresan IL-18Ra� sobre su superficie con alta afinidad, y la biot-IL-18 sobre la superficie de las células KG-1 se detectó mediante análisis FACS utilizando anticuerpos anti-biotina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO; Núm. de cat. B 3640). De este modo la biotinilación no interfiere en la unión al receptor y no enmascara los epítopos neutralizadores de rhuIL-18.
15 Ejemplo 1.2.E: Generación y caracterización de rhuIL-18 Marcada con I125
Los residuos de lisina en NEM-IL-18 del Ejemplo1.2.B se marcaron con I115 utilizando las condiciones especificadas por Amersham (Piscataway, NJ; Núm. de Cat. IM5861). La IL-18 marcada con I125 conserva su actividad específica, compite con IL-18 no modificada, y se une específicamente a IL-18R en células KG-1. La unión de IL-18 marcada
20 con I115 al receptor de IL-18 se bloqueó por medio de la neutralización de anticuerpos monoclonales anti-huIL-18. Esta yodación no afectó a la unión al receptor de IL-18 y no enmascaró los epítopos neutralizadores en la IL-18. La IL-18 marcada con I125 se utilizó para determinar el modo de neutralización y la potencia de los anticuerpos anti-IL18 en el Análisis de Unión al Receptor.
25 EJEMPLO 2: Generación y aislamiento de anticuerpos anti-IL-18
Ejemplo 2.1: Análisis para identificar anticuerpos anti-IL-18
A lo largo del Ejemplo 3 se utilizaron los siguientes análisis para identificar y caracterizar anticuerpos anti-IL-18 a no 30 ser que se establezca lo contrario.
Ejemplo 2.1.A: ELISA
Se desarrolló un ELISA para rastrear anticuerpos que se unen a IL-18 humana. En este ELISA, se capturó NEM
35 huIL-18 biotinilado (véase el Ejemplo 1.2.B) o bien con anti-IgG biotinilada de cabra o bien en placas recubiertas de estreptavidina. Se aplicaron sobrenadantes de hibridoma o células B y se detectaron los anticuerpos unidos a IL-18 utilizando anti-IgG humanas conjugadas con HRP, siguiendo protocolos de ELISA convencionales bien conocidos en la técnica.
40 Ejemplo 2.1.B: Determinaciones de afinidad utilizando la tecnología BIACORE
El análisis BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) determina la afinidad de los anticuerpos con mediciones cinéticas de las constantes de unión y desunión. Los anticuerpos se capturan sobre un chip biosensor por medio de un anticuerpo secundario unido covalentemente (p. ej. anti-IgG humana de cabra o anti-IgG de ratón) y a
45 continuación se aplican concentraciones variables de IL-18 recombinante. La unión se registra como una función del tiempo y se calculan las constantes cinéticas de velocidad. En este análisis, se pueden medir constantes de unión tan rápidas como 106M-1s-1 y constantes de desunión tan lentas como 10-6 s-1.
Ejemplo 2.1.C: Cartografiado Epitópico
50 Se utilizó la tecnología BIACORE se utilizó para cartografiar los epítopos reconocidos por antagonistas de IL-18 tales como los anticuerpos anti-IL-18. En resumen, un antagonista de IL-18 se capturó sobre el chip Biacore y rhuIL-18 se unió al reactivo inmovilizado. A continuación se sometió a ensayo la unión de otro antagonista anti-IL-18 a este complejo. La unión simultánea de dos reactivos demuestra que los dos reconocen epítopos diferentes.
Ejemplo 2.2: Generación de MAbs Anti-IL-18 Hu Utilizando XENOMOUSE
La tecnología del ratón transgénico XENOMOUSE (Abgenix, Inc., Fremont, CA) se empleó para obtener anticuerpos monoclonales anti-IL-18 humana completamente humanos (HuMAbs). Esta tecnología consiste en ratones transgénicos que portan el locus de la cadena pesada variable humana que portan VH, DH, y JH, Cmu, Cdelta y un solo locus de la cadena pesada constante de IgG humana y loci de genes de la cadena ligera. Después de la inmunización con un antígeno de interés, estos ratones generan anticuerpos completamente humanos contra el antígeno.
Ejemplo 2.2.A: Inmunización de XENOMOUSE con antígeno IL-18
Se inmunizaron animales XENOMOUSE vía ruta de almohadillas plantares para todas la inyecciones. El volumen total de cada inyección fue de 50 ul por ratón, 25 ul por almohadilla plantar. La inyección de inmunización contenía 40 ug de IL-18 humana (NEM-rhuIL-18) en DPBS sin pirógeno mezclada 1:1 v/v con TiterMax Gold por ratón. Se realizaron refuerzos posteriores con 40 ug de IL-18 Humana en DPBS sin pirógeno mezclada con 25 ug de Adju-Phos (gel de fosfato de aluminio) por ratón seis veces, a continuación un refuerzo final de 40 ug de IL-18 Humana en DPBS sin pirógeno sin coadyuvante por ratón. Los animales se inmunizaron los días 0, 4, 8, 11, 17, 21, 25 y 35 durante este protocolo. Las fusiones se realizaron el día 39. Después del régimen de inmunización descrito anteriormente; se aplicó eutanasia a los ratones, a continuación se recuperaron los nódulos inguinales y Lumbares.
Ejemplo 2.2.B: Generación de Hibridomas
Los linfocitos se liberaron por medio de rotura mecánica de los nódulos inguinales y Lumbares, obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 2.2.A, utilizando una trituradora de tejido, y agotando las células T mediante selección negativa de CD90. La fusión del hibridoma se realizó mezclando células B enriquecidas lavadas y células de mieloma no secretoras P3X63Ag8.653 adquiridas de ATCC, Núm. de Cat. CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) a una razón de 1:1. La mezcla celular se sedimentó suavemente mediante centrifugación a 800 g. Después de la eliminación completa del sobrenadante, las células se trataron con 2-4 mL de solución Pronase (CalBiochem, San Diego, CA; Núm. de Cat. 53702; 0.5 mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. A continuación se añadieron 3-5 ml de FBS para detener la actividad enzimática y la suspensión se ajustó a un volumen total de 40 ml utilizando una solución de electrofusión celular, ECFS (0,3M Sacarosa, Sigma-Aldrich, St Louis, MO; Núm. de Cat. S7903, Acetato de Magnesio 0,1 mM, Sigma, Núm. de Cat. M2545, Acetato de Calcio 0,1 mM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO; Núm. de Cat. C4705). El sobrenadante se eliminó después de la centrifugación y las células se suspendieron en 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavado se repitió y las células se volvieron a suspender en ECFS a una concentración de 2x106 células/ml. La fusión electro-celular se realizó utilizando un generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de la cámara de fusión utilizada fue de 2,0 ml utilizando los siguientes ajustes instrumentales: Condición de alineamiento: voltaje: 50 v, tiempo: 50 s; Rotura de membrana a: voltaje: 3000 v, tiempo: 30 μs; Tiempo de mantenimiento Post-fusión: 3 s.
Después de la fusión, las células se volvieron a suspender en medio de fusión de hibridoma: DMEM (JRH Biosciences), FBS al 15% (Hyclone), que contenía 0,5XHA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO; Núm. de Cat. A9666), y con un suplemento de L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) para su cultivo a 37°C y 10% CO2 en aire. Las células se cultivaron en placa en placas para el cultivo de tejido de 96 pocillos de fondo plano a 4x104 células por pocillo. Los cultivos se mantuvieron en medio de fusión de hibridoma durante 2 semanas antes de transferirlos a medio de Hibridoma: DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS), FBS al 15% (Hyclone, Logan, Utah), y con un suplemento de L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Los hibridomas se seleccionaron mediante la supervivencia en medio de fusión de hibridoma 0.5XHA y los sobrenadantes de los pocillos que contenían hibridomas se escrutaron para determinar la reactividad del antígeno por medio de ELISA. El formato de ELISA implicó la incubación de los sobrenadantes sobre placas recubiertas con antígeno (placas recubiertas de IL-18 humana) y la detección de los anticuerpos humanos que se unen a anti-IL-18 humana utilizando anti-IgG humana de ratón marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP), a continuación todas las muestras positivas se confirmaron mediante dos series de ELISA en paralelo, que implicó la incubación de los sobrenadantes sobre las placas recubiertas con antígeno (placas recubiertas con IL-18 humana) y la detección de los anticuerpos humanos que se unen a anti-IL-18 humana utilizando anti-cadena Gamma y Kappa humana de ratón marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP).
La clonación se realizó sobre pocillos positivos para el antígeno seleccionados utilizando cultivo en placa de dilución limitada. Las placas se inspeccionaron visualmente para detectar la presencia de crecimiento de una sola colonia y a continuación se escrutaron los sobrenadantes de los pocillos con una sola colonia mediante ELISA específicos del antígeno como se ha descrito anteriormente. Los clones altamente reactivos se analizaron para verificar la pureza de la cadena gamma y kappa humana por medio de ELISA múltiplex utilizando un aparato Luminex.
Ejemplo 2.2.C: Tecnología XENOMAX
5 Alternativamente, los linfocitos obtenidos en Ejemplo 2.2.B se sometieron a un Método de generación de Anticuerpos de Linfocitos Seleccionados (SLAM; del Inglés Selective Lymphocyte Antibody-generation Method), que define la tecnología de selección de anticuerpos XENOMAX (Abgenix, Inc., Fremont, CA). Las células B individuales se cultivaron en placa en placas de 96 pocillos. Las células B que producen anticuerpos monoclonales humanos
10 para un antígeno deseado (IL-18 humana) se identificaron por medio de un análisis celular formador de placa (Babcook, J.S., Leslie, K.B., Olsen, O.A., Salmon, R.A., y Schrader, J.W. Isolation of functional antibody genes from single lymphocytes of defined antigen-specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848, 1996) y los genes de IgG se clonaron mediante RT-PCR de una sola células de células B aisladas utilizando cebadores 5' para secuencias líder de VH y Vk y cebadores 3' específicos para Cgamma y Ckappa humanas. Los genes de IgG
15 recombinante obtenidos se expresaron en células de mamífero como se describe en los Ejemplos 2.2.E y 2.2.G.
Ejemplo 2.2.D: Identificación de los anticuerpos anti-IL-18
Los hibridomas y las células B que producen anticuerpos que se unen a IL-18, generados de acuerdo con los
20 Ejemplos 2.2.B y 2.2.C, se identificaron utilizando ELISA para IL-18 biotinilada (véanse Ejemplo 2.1.A). A continuación los sobrenadantes de los hibridomas y células B que contenían los anticuerpos que se unen a IL-18 se sometieron a ensayo para determinar la potencia de neutralización de IL-18 en el bioanálisis KG-1 realizado de acuerdo con Ejemplo 1.1.A. Los anticuerpos neutralizadores anti-IL-18 (de los enfoques con hibridoma y SLAM) se subclonaron en un vector de expresión de mamífero, se expresaron en células COS, se purificaron y se volvieron a
25 someter a ensayo en el bioanálisis KG-1 (véase la Tabla 5).
Tabla 5 Potencia de Neutralización de HuMAbs Anti-IL-18 en el Bioanálisis KG-1
Núm. HuMAb
Análisis KG-1 (CI50,M)
NEM-rhuIL-18
Hibridoma
2.5.1
3E-10; 4E-10
2.13.1
2E-10; 1E-10; 7E-11
2.3.3
1E-9; 2E-10; 7E-10
XENOMAX
215
1E-10; 3E-10; 1E-10;
444
1E-10; 2E-10; 2E-10
478
7E-10; 2E-9; 3E-10
435
8E-10; 7E-10; 4E-10;
413
1E-9; 7E-10; 7E-10
581
7E-10; 3E-10; 3E-9
231
1E-10; 3E-11; 2E-9
521
6E-10; 3E-10; 2E-9
336
7E-10
351
2E-10
490
5E-10
550
TBD
268
7E-9
Las regiones variables de los anticuerpos de la Tabla 5 se describen en la Tabla 1. 50
Ejemplo 2.2.E: Subclonación de HuMAbs anti-IL-18 neutralizadores en un vector de expresión de mamífero
Los genes para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos se clonaron en vectores pCDNA (Invitrogen, Carlsbad, Ca) bajo el control del promotor de CMV siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos plásmidos con secuencias Gamma-2 y kappa genómicas humanas se utilizaron para cotransfectar células COS mediante
5 electroporación con las cadenas pesada y ligera correspondientes a cada clon empleando condiciones normalizadas bien conocidas en la técnica.
Se dejó que las células se recuperaran, crecieran, y secretaran anticuerpos durante 72 horas en DMEM sin suero con un suplemento de glutamina. Los sobrenadantes de cultivo a continuación se recogieron, se aclararon mediante
10 centrifugación y filtración, y se colocaron sobre resina de Proteína-A. Las columnas se lavaron con PBS, los anticuerpos se hicieron eluir con un tampón de bajo pH, y se neutralizaron rápidamente con solución de Tris 1M. Se cambió el tampón de las preps de anticuerpo por PBS en filtros rotatorios Amicon-30. La concentración y la pureza de los anticuerpos se analizaron por medio de espectrometría a una DO 280 y SDS-PAGE antes de someterlos a ensayo para determinar la potencia de neutralización de IL-18.
15 Para lograr niveles de expresión mayores de anticuerpos humanos en células COS, las cadenas pesada y ligera de algunos anticuerpos se subclonaron en el vector pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17) bajo el control del promotor del factor de elongación.
20 En resumen, se diseñaron cebadores de PCR para las regiones variables de las cadenas pesadas de tal modo que se pudieran insertar en un plásmido pEF-BOS con cassette que contenía un péptido señal de IgG y la secuencia de la región constante de IgG1 humana [tipo salvaje (SEQ ID No. 2) o un mutante inactivo (SEQ ID No.3)]. El cebador de PCR VH directo contenía el sitio de restricción NruI, como también lo contenía la secuencia de nucleótidos del péptido señal. El cebador de PCR VH inverso contenía el sitio de restricción SalI que también fue diseñado en el
25 extremo 5' de la secuencia de Fc gamma-1. Los fragmentos de PCR VH se digirieron con NruI/SalI y se clonaron en los constructos de IgG1 humana pEF-BOS de tipo salvaje o de IgG1 humana pEF-BOS mutantes. Los genes de la cadena ligera completos se movieron en el vector pEF-BOS en su formato Kappa existente desde los vectores pCDNA mediante digestión de restricción con HindIII, rellenando los salientes con polimerasa de T4, seguido de digestión con NotI. Estos fragmentos de la cadena ligera blunt/NotI se clonaron a continuación en el vector pEF-BOS
30 digerido con SrfI/NotI.
Las regiones VH y VL de los anticuerpos se clonaron en las líneas de hibridoma originales. El ARN se preparó a partir de células productoras de anticuerpos, se realizó la RT-PCR con cebadores diseñados como se ha descrito anteriormente, i.e. cebadores NruI/SalI para VH, y cebadores NruI/BsiWI para VL. Las cadenas IgG1 y Kappa
35 completas se ensamblaron en vectores con cassettes.
Los anticuerpos seleccionaron se modificaron adicionalmente. Los anticuerpos de origen natural tienen glutamina
(Q) o glutamato (E) como extremo NH2 de la cadena pesada y/o ligera. La producción de anticuerpos con Q como extremo NH2 produce una heterogeneidad del extremo NH2 debida a la ciclación del residuo de glutamina a 40 glutamato. Por lo tanto, el residuo de glutamina en el extremo NH2 de algunos de los anticuerpos se mutó a glutamato. Asimismo dos residuos, Leucina 234 y Leucina 235 en la región bisagra de la porción Fc, se mutaron a para prevenir las funciones efectoras del anticuerpo. En resumen, la Leucina 234 y la Leucina 235 se remplazaron cada una por un residuo de Alanina utilizando técnicas de biología molecular convencionales (Lund, J. et al., J. Immunology (1991) 147: 2657-2662; Winter, et al. Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.648.260; 5.624.821;
45 5.624.821). Estos anticuerpos con Fc mutada se denominaron (mg1). Estos mutantes se caracterizan adicionalmente en los Ejemplos 2.2.J 6, más abajo.
Ejemplo 2.2.F: Caracterización de anticuerpos anti-IL-18 Neutralizadores Seleccionados
50 Se produjeron varios anticuerpos anti-IL-18 humana recombinantes con distintas secuencias de la línea germinal en células de mamífero, se purificaron y se caracterizaron funcionalmente en diversos análisis (véase la Tabla 6). Tabla 6: Unión de antígeno in vitro, análisis celular y características de la secuencia de la cadena principal de algunos anticuerpos anti-IL-18.
Anticuerpo
Tecnologíaa Biacoreb (KD, nM) RBA (CI50, nM) KG-1a (CI50, nM) ASC (CI50, nM) Diversidad de Secuencia Familias de Genesc
2.5(E)mg1
Hibridoma 0,31 2,38 0,20 3 VL-L2 VCH5-51
2.5(E)wtg1
Hibridoma 0,40 2,38 0,30 3 VL-L2 VHS-51
215(E)mg1d
Xenomax 0,23 1,17 0,17 3 VL-27 VH4-31
444(Q)mg1d
Xenomax 1,61 2,49 0,13 1 VL-A27(7) VH4-31(1)
581(E)mg1d
Xenomax 2,00 1,28 1,3 3 VL-A2 VH3-30
Anticuerpo
Tecnologíaa Biacoreb (KD, nM) RBA (CI50, nM) KG-1a (CI50, nM) ASC (CI50, nM) Diversidad de Secuencia Familias de Genesc
2.3.1(E)wtg1
Hibridoma 0,23 0,20 0,63 2 VL-02 VH4-59
2.13.1(E)wtg1
Hibridoma 0,20 0,20 0,12 2 VL-A27(8) VH4-31(18)
Se utilizó rhuIL-18 protegida con NEM-cys. Los números entre paréntesis indican diferencias en los aminoácidos del clon más próximo a la secuencia de la línea germinal
Ejemplo 2.2.G: Generación de Líneas de Células CHO que Producen 2.5(E)mg1
Se generaron líneas de células CHO estables que expresan el anticuerpo 2.5(E)mg1 siguiendo los procedimientos esbozados más abajo. 5
Ejemplo 2.2.G1: Construcción del Vector de Expresión
El plásmido pA510 se construyó para determinar el alto nivel de expresión de los anticuerpos en líneas celulares de mamíferos. Este plásmido derivado de pUC19 contenía el origen de replicación ColE1 de E. coli y el gen de la beta
10 lactamasa para la resistencia a la ampicilina.
En resumen, se clonaron los ADNc correspondientes a las regiones VH y VL del anticuerpo 2.5(E)mg1 utilizando técnicas de biología molecular convencionales, se fusionaron a los genes de la región constante gamma-1 y kappa humanos mutados, respectivamente, de manera que se produjera el ADN que codifica un anticuerpo IgG1/kappa
15 completamente humano, nativo. Estos ADN se introdujeron en el constructo de expresión pA510. El plásmido resultante contenía secuencias (exclusivas de pUC19) para los siguientes genes o elementos reguladores en el siguiente orden: potenciador de 5'-CMV, promotor tardío principal de adenovirus, péptido señal de inmunoglobulina humana, región variable de inmunoglobulina de la cadena pesada de 2.5(E)mg1, región constante inmunoglobulina gamma-1 humana, secuencia de poliadenilación de SV40, secuencia de terminación de la transcripción de gastrina
20 humana, origen de replicación de SV40 (promotor/potenciador de SV40), secuencia de dihidrofolato reductasa murina, secuencia de poliadenilación de la timidina quinasa del virus Herpes Simplex, potenciador de CMV, promotor tardío principal de adenovirus, péptido señal de inmunoglobulina humana, región variable de inmunoglobulina de la cadena ligera de 2.5(E)mg1, región constante kappa de inmunoglobulina humana, y secuencia de poliadenilación de SV40-3'. Las regiones codificantes se insertaron aguas abajo de los promotores virales fuertes que guiaban la
25 transcripción de los genes del anticuerpo. El vector también codificaba la expresión del gen DHFR de ratón, que posibilitaba la selección de las células transformadas en virtud de su capacidad para crecer en cultivo en ausencia de nucleósidos.
Ejemplo 2.2.G 2: Transfección del Vector de Expresión a una Línea Celular Parental
30 La línea celular, CHO DUX B11. (Urlaub, G. y Chasin L.A. Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220 (1980)), carente de la expresión del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), se utilizó para la transfección del vector de expresión descrito en el Ejemplo 2.2.G 1. Se transfectaron células CHO DUX B 11 con el vector utilizando el método de precipitación con fosfato de calcio bien conocido en la técnica (Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F.V.,
35 Brent, R., Moore, D.M., Kingston, R.E., Seidman, J.G., Smith, J.A., y K. Struhl eds; Wiley Interscience, N.Y., N.Y. (1990)) con las siguientes modificaciones. Las placas se aspiraron y se añadieron 9 ml de medio F12 a cada placa. Las placas se incubaron a 37°C durante dos horas. Se disolvieron 150 microgramos de ADN en 2,7 ml de agua en un tubo cónico de 50 ml. Se añadieron 300 microlitros de CaCl2 2,5 M y se añadió a la vez una gota de esta mezcla de ADN a 3 ml de 2 x solución salina tamponada Hepes (HeBS) en un tubo cónico de 50 ml.
40 La mezcla resultante se sometió a vórtice durante 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se distribuyó uniformemente 1 ml sobre cada placa (todavía en F12) y las placas se incubaron a 37°C durante cuatro horas. Después de la incubación, las placas se aspiraron, y se añadieron 2 ml de DMSO 10% en F12. El choque de DMSO continuó durante un minuto después de lo cual el DMSO se diluyó mediante la adición de 5 ml
45 de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada placa. Las placas se aspiraron y se lavaron dos veces más en PBS. Se añadieron 10 ml de alfa MEM Gibco con nucleósidos y las placas se incubaron a 37°C durante la noche. El día siguiente, el medio se cambió a alfa MEM Gibco sin nucleósidos con suero bovino fetal (FBS) dializado al 5%, y seis horas más tarde las células se escrutaron en placas de 96 pocillos como sigue. Las células de las placas de 10 cm se cosecharon utilizando digestión con tripsina y se resuspendieron en un total de 300 ml de alfa MEM Gibco
50 sin nucleósidos con suero al 5%. Se sembraron 20 placas de 96 pocillos a 10 ml/placa, 100 l/pocillo. Cien ml del mismo medio se añadieron a los 100 ml restantes de células y se sembraron 20 placa de 96 pocillos adicionales como antes. (Esta fue una segunda dilución). El medio se cambió en la placa de 96 pocillos una semana más tarde y de nuevo una semana después de eso. El medio alfa MEM sin nucleósidos se utilizó para seleccionar las células que expresan DHFR y por lo tanto el vector de expresión.
55 52
Ejemplo 2.2.G 3: Selección de células que producen 2.5(E)mg1
Se sometieron a ensayo sobrenadantes de cultivo de células CHO transfectadas para determinar la presencia de anticuerpo 2.5(E)mg1 secretado utilizando un ELISA específico para IgG humana. Una vez que se hubo escrutado un grupo de transfectantes CHO para determinar la expresión del anticuerpo humano, se utilizó una selección adicional para aislar esas células que habían amplificado el número de copias del vector de expresión integrado en el genoma CHO. El fármaco metotrexato (MTX) se utilizó para la selección de las líneas amplificadas. Los cultivos desarrollados en presencia de MTX se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para producir inmunoglobulina. Las líneas resistentes a MTX que expresaban más anticuerpo que sus predecesores sensibles a MTX se llevaron a otro ciclo de selección en MTX de concentración más alta, y se sometieron a ensayo para determinar la producción de inmunoglobulina. Las células CHO que expresan 2.5(E)mg1 se cultivaron en un biorreactor de 1 o 15 litros y se determinó que el rendimiento de anticuerpo era de ѝ1,0 g/L en una ronda de dos semanas.
Ejemplo 2.2.H: Caracterización Fisicoquímica de 2.5(E)mg1 Derivado de Células CHO
Se realizó preliminarmente la caracterización física y química de 2.5(E)mg1 derivado de CHO. El peso molecular determinado experimentalmente de 2.5(E)mg1 fue de aproximadamente 149 kDa, en buena concordancia con el peso molecular teórico. Utilizando técnicas de cartografiado de péptidos (K Biemann Annu. Rev. Biochem. 1992 61 977-1010; D A. Lewis Accelerated Articles, Anal. Chem. 1994, 66, 585-595) se confirmó que 2.5(E)mg1 tenía los extremos N correctos para las cadenas pesada y ligera. Hubo una variabilidad muy pequeña para el extremo C de la cadena pesada, puesto que 99% de las moléculas de 2.5(E)mg1 carecían de lisina en el extremo carboxi de la cadena pesada. Cada cadena pesada de 2.5(E)mg1 contenía un solo sitio de glicosilación conectado a N con oligomanosa y estructuras binatenarias fucosiladas complejas con 0, 1 o 2 residuos de galactosa terminales.
Ejemplo 2.2.I: Solubilidad y Estabilidad de 2.5(E)mg1 Derivado de Células CHO
El 2.5(E)mg1 purificado era soluble hasta al menos 62 mg/mL en tampones de pH 5, 6 y 7 durante un mínimo de 4 semanas. Se realizaron estudios acelerados de estabilidad con 2.5(E)mg1 a 37°C en estos tampones para identificar análisis que indicaran estabilidad y el óptimo de almacenamiento a largo plazo. Se tomaron muestras a intervalos semanales para su análisis por medio de HPLC de exclusión por tamaños y SDS-PAGE para someter a ensayo la agregación y la fragmentación, cartografiado de péptidos LC-MS/MS para la detección del enlace S-S, ELISA para el antígeno y/o bioanálisis basado en células para la medición de la actividad, y HPLC de intercambio catiónico y cuantificación iso-Asp para la medición de la heterogeneidad de carga. El análisis preliminar de las muestras mediante SEC (cromatografía de exclusión por tamaños), SDS-PAGE y cromatografía de intercambio catiónico mostró que los tres análisis indicaban estabilidad y por lo tanto 2.5(E)mg1 es más estable a –pH 6.
Ejemplo 2.2.J: Caracterización del HuMAb anti-IL-18 derivado de células CHO, 2.5(E)mg1
Ejemplo 2.2.J 1: Especificidad de Especie de IL-18
Se evaluó la capacidad de 2.5(E)mg1 para unirse y/o neutralizar IL-18 de ser humano, mono cinomolgus, ratón, rata y perro. Utilizando el análisis BIACORE siguiendo las instrucciones del fabricante (véase el Ejemplo 2.1.B), se mostró que 2.5(E)mg1 se unía a IL-18 humana madura, pero no a IL-18 de ratón. Además, los datos de inmunoprecipitación mostraron que 2.5(E)mg1 se unía a IL-18 de mono cinomolgus (CI50 para IL-18 cino = 9,1E X 10-11), pero no a IL-18 de perro o rata. 2.5(E)mg1 neutralizaba funcionalmente la bioactividad de IL-18 humana y de cinomolgus de una manera similar, pero no se observó la inhibición de IL-18 de perro, rata o ratón.
Ejemplo 2.2.J 2: Especificidad por Citoquinas Humanas
La especificidad de 2.5(E)mg1 por IL-18 se evaluó utilizando el análisis BIACORE siguiendo las instrucciones del fabricante (véase el Ejemplo 2.1.B). El anticuerpo 2.5(E)mg1 se capturó sobre el chip biosensor y se determinó su capacidad para unirse a un panel de citoquinas humanas conocidas en solución. Como se muestra en la Tabla 7, 2.5(E)mg1 se unía a IL-18 y pro-IL-18 madura humana recombinante. En contraste, 2.5(E)mg1 no se une a ninguna de las otras 23 citoquinas humanas sometidas a ensayo, incluyendo los miembros de la familia IL-1 IL-1a e IL-1�.
Tabla 7 Análisis Biacore de Unión a Citoquinas de 2.5(E)mg1
Citoquinas humanas rec. solubles, (1μM)
2.5(E)mg1 Capturado (25 mg/mL)
Unión de 2.5(E)mg
IFNy
-
IL-1a
-
IL-1�
-
Otras citoquinasa
-
IL-18b
+
Pro-IL-18
+
a Las citoquinas adicionales sometidas a ensayo para su unión incluyeron IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-21, TNF, LT, LTa1�2, y LTa2�1. 2.5(E)mg1 no se unen a ninguna de estas citoquinas. El mutante BV Cisteína > Alanina derivaba de IL-18 humana rec.
Ejemplo 2.2.J 3: Mediciones de la Afinidad
5 La Tabla 8 muestra las propiedades de unión a IL-18 in vitro de 2.5(E)mg1 medidas utilizando el análisis BIACORE de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo 2.5(E)mg1 tenía una velocidad de unión rápida, una velocidad de desunión lenta con una afinidad global de 0,196 nM. Los parámetros cinéticos de velocidad de dos antagonistas de referencia de IL-18 (proteína de unión a 125-2H e IL-18) se muestran para su comparación.
Tabla 8 IL-18 Propiedades de Unión 2.5(E)mg1 y Reactivos de Referencia
Reactivo
Parámetros Biacore
Velocidad de unión (x 103M-1s -1)
Velocidad de desunión (x 10-6 s -1) KD (nM)
2.5(E)mg1a
268 52,4 0,196
anti-IL-18 humana murino (1252H)b
190 110 0,550
IL-18BP-Fcc
140 26 0,190
(4C/A)-HuIL-18 se sometió a ensayo en BIACORE. b -125-2H, un mAb IgG1 anti-IL-18 humana de ratón neutralizador c -IL-18BP-Fc, una fusión Fc del antagonista natural de IL-18
Ejemplo 2.2.J 4: Potencia de Neutralización de IL-18 In Vitro
15 La potencia de neutralización in vitro de 2.5(E)mg1 se determinó en el bioanálisis KG-1, el análisis de unión al receptor (RBA) y el ASC humano (véanse los Ejemplos 1.1.A-1.1.C). Como se muestra en la Tabla 8 el anticuerpo 2.5(E)mg1 neutralizó tanto (KG-1 y RBA) recombinante como IL-18 natural (ASC), (CI50 <0.5 nM en KG-1, <2 nM en RBA y <5 nM en ASC), y es congruente con su afinidad de unión a IL-18.
Tabla 8 Potencias de Neutralización de 2.5(E)mg1 y Reactivos de Referencia
Reactivo
Potencia de Neutralización in vitro (CI50, nM)
KG-1a
RBAb ASCc
2.5(E)mg1
0,2 2,4 3,0
mAb anti-IL-18 humana murino (125-2H)
0,2 >300d 3,0
IL-18BP-Fc
0,03 1,0 5,7
mAb Anti-IL-18R (M-840)
1,5 1,7 2,7
b bioanálisis KG-1, valores medios c en este análisis se utilizó (4C/A)-huIL-18 d Análisis de Unión al Receptor Análisis de Sangre Completa Humana con 4-6 donantes individuales. Se proporcionan los valores medios. 125-2H neutraliza la bioactividad de IL-18 a pesar del fracaso para inhibir la unión al receptor
Ejemplo 2.2.J 5: Potencia de Neutralización In Vivo de 2.5(E)mg1
5 Para evaluar la capacidad de 2.5(E)mg1 para neutralizar IFNy inducido por IL-18 humana natural en un entorno inflamatorio in vivo, se utilizó el modelo de ratón inmunodeficiente (SCID) combinado severo, donde se inyectaban PBMC humanas en el ratón y las células se estimularon in vivo para producir IL-18 humana (modelo HuPBMC-SCID). Los resultados (Tabla 9) mostraron que 2.5(E)mg1 inhibía la producción de IFNy dependiente de IL-18
10 humana in vivo con una clara dosis-respuesta mediante cualquier ruta de administración. La DE50 de 2.5(E)mg1 fue de aproximadamente 1 μg o 0,1 μg/por ratón (=0,05 mg/kg o 0,005 mg/kg) mediante administración ip o iv, respectivamente.
Tabla 9A Eficacia in vivo de 2.5(E)mg1 administrado i.p. en un modelo de ratón de HuPBMC-SCID
Grupo
huIFNg (pg/ml) % Inhibición
2.5(E)mg1 0.025 μg/ratón
70 ± 17 61
2.5(E)mg1 0.25 μg/ratón
112 ± 29 36
2.5(E)mg1 2.5 μg/ratón
36 ± 10 80
2.5(E)mg1 25 μg/ratón
10 ± 8 94
2.5(E)mg1 250 μg/ratón
3 ± 2 98
Sin Tratamiento
193 ± 59
HuIgG Control 250 μg/ratón
177 ± 33
Tabla 9B Eficacia in vivo de 2.5(E)mg1 administrado i.v. en un modelo de ratón de HuPBMC-SCID
Grupo
huIFNg (pg/ml) % Inhibición
2.5(E)mg1 0,025 μg/ratón
156 ± 45 36
2.5(E)mg1 0,25 μg/ratón
27 ± 9 89
2.5(E)mg1 2,5 μg/ratón
36 ± 8 85
2.5(E)mg1 25 μg/ratón
11 ± 6 96
2.5(E)mg1 250 μg/ratón
4 ± 2 98
Sin Tratamiento
279 ± 26
HuIgG Control 250 μg/ratón
245 ± 22
Ejemplo 2.2.J 6: Funciones Efectoras
5 La porción Fc de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes p. ej. inducción de citoquinas, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y vida media/velocidad de aclaramiento del anticuerpo y de los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos estas funciones efectoras son deseables para el anticuerpo terapéutico pero en otros casos podría
10 ser innecesario o incuso perjudicial dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos de IgG humana, particularmente IgG1 e IgG3, median la ADCC y la CDC a través de la unión a FcyRs y al complemento C1q, respectivamente. Los receptores de Fc Neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan la vida media en circulación de los anticuerpos
15 Las mutaciones L234A y L235A en 2.5(E)mg1 no tuvieron influencia en la afinidad global o la potencia de neutralización de HuMAb 2.5(E)mg1 en comparación con 2.5(E)wtg1 (Tabla 10). Sin embargo, como se esperaba, estas mutaciones anularon la unión a FcyR y C1q.
Tabla 10: Mutaciones de residuos L234 y L235 a Alanina no afecta a la afinidad o a la potencia de 20 neutralización de 2.5(E)mg1
Parámetros cinéticos de velocidad
Bioanálisis KG-1
Ab
Velocidad de unión (103M-1s -1) Velocidad de desunión (x 10-6 s-1) KD (nM) IC50 (nM)
2.5(E)wtg1
281 47,8 0,170 0,4
2.5(E)mg1
268 52,4 0,196 0,2
Ejemplo 2.2.J 6.1: Unión de FcyRI
25 El FcyR I humano (CD64) tiene una afinidad relativamente alta por los complejos inmunes de IgG1 (KD 1E-8-1E-9 M). Se expresa en monocitos y macrófagos y varias líneas celulares mieloides incluyendo U937. La unión de 2.5(E)wtg1 y 2.5(E)mg1 a células U937 se determinó mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY. Vol (1) 5.3.1, Editado por J. E. Coligan et. al., Publicado por John Wiley & Sons, Inc., 2002). Los datos obtenidos (véase la Tabla 11) demostraron que 2.5(E)wtg1 se une a
30 células U937, pero como se esperaba, 2.5(E)mg1 no. Para confirmar que esta unión estaba mediada por FcyR I, se utilizó un anticuerpo anti-hFcyR I bloqueador de ratón (10.1) para los experimentos de competición. El resultado demostró que el anticuerpo 10.1 bloqueaba la unión de 2.5(E)wtg1 a células U937 de una manera dependiente de la dosis a las concentraciones sometidas a ensayo más abajo, y de ese modo, 2.5(E)wtg1 se une a FcyR I en células U937.

Tabla 11. Demostración del fracaso de 2.5(E)mg1, en contraste con 2.5(E)wtg1, para unirse a FcyR I en células U937 (datos mostrados como IFM+/-DT)
Conc. de Anticuerpo (μM)
1.00E-09 1.00E-08 1.00E-07 1.00E-06 1.00E-05 1.00E-04 1.00E-03 1.00E-02 1.00E-01
2.5(E)wtg1
0,50+0,00 0,50+0,00 0,63+0,12 0,57+0,05 0,60+0,00 1,10+0,00 5,80+0,05 29,60+0,05 38,76+5,19
2.5(E)mg1
0,67+0,09 0,67+0,09 0,60+0,00 0,80+0,14 0,63+0,05 0,67+0,05 0,53+0,05 0,60+0,05 0,63+0,08
5 Ejemplo 2.2.J 6.2: Unión de FcyR II
El FcyR II humano (CD32) tiene una afinidad de unión relativamente baja por los complejos inmunitarios de IgG1 (KD 1E-5-1E~7~M). En condiciones fisiológicas, requiere la formación de complejos inmunitarios multivalentes para su activación. Utilizando anticuerpos marcados con isotiocianato fluoresceína (FITC) específicos para FcyR I, II o III y la 10 detección por medio de citometría de flujo, los autores de la presente invención validaron la expresión de FcyR II en células K562 y se utilizó esta línea celular para el análisis de unión de FcyR II. La unión de 2.5(E)wtg1 monomérico a células K562 fue muy débil. Por lo tanto, se utilizó un anticuerpo anti-cadena kappa para el entrecruzamiento previo de las moléculas de IgG1 para imitar los complejos inmunitarios multivalentes y se sometió a ensayo su unión a FcyR II en células K562. Después del entrecruzamiento, 2.5(E)wtg1 se unió a las células K562, pero incluso
15 después del entrecruzamiento 2.5(E)mg1 solo mostró una unión mínima, si la hubiera (Tabla 12). Un anticuerpo anti-FcyR II, clon IV3, bloqueó la unión de 2.5(E)wtg1, y de ese modo, la unión de 2.5(E)wtg1 a K562 fue mediada por FcyR II.
Tabla 12. Unión de de 2.5(E)wtg1 y 2.5(E)mg1 a FcyR II en células K562 después del entrecruzamiento (datos 20 mostrados como IFM+/-DT)
Conc. de Anticuerpo (μM)
1.00E-08 1.00E-07 1.00E-06 1.00E-05 1.00E-04 1.00E-03 1.00E-02 1.00E-01 1.00E+00
2.5(E)wtg1
0.37+0.05 0.37+0.05 0.40+0.00 0.43+0.05 0.80+0.08 3.43+0.21 19.7+0.70 93.33+4.90 134.37+12.93
2.5(E)mg1
0.30+0.00 0.40+0.00 0.40+0.00 0.37+0.05 0.37+0.05 0.40+0.00 0.50+0.00 1.60+0.08 5.37+0.38
Ejemplo 2.2.J 6.3: Unión de C1q
25 La activación del complemento y la lisis de las células a través de la ruta clásica se activa a través de la unión de C1q a la porción Fc de la molécula de IgG. La unión de C1q a 2.5(E)wtg1 y 2.5(E)mg1 se determinó utilizando mecanismos de ELISA convencionales conocidos en la técnica (Hezareh, M., et. al., (2001) J. Virology, 75 (24):12161-12168). Los HuMAbs 2.5(E)wtg1 y 2.5(E)mg1 a aplicaron como recubrimiento sobre placas de plástico seguido de incubación con C1q humana. A continuación se detectó la unión de las moléculas de C1q por medio de
30 una mezcla de anti-C1q humana de cabra y anti-IgG de cabra de conejo conjugada con fosfatasa alcalina. Los resultados mostraron que 2.5(E)wtg1 se unía a C1q, pero 2.5(E)mg1 no (Tabla 13).
Tabla 13. Demostración de fracaso de 2.5(E)mg1, en contraste con 2.5(E)wtg1, para unirse a C1q por medio de ELISA (datos mostrados como DO405+/-DT)
Cono C1q 0 (μg/ml)
20 40 60 80 100 120
2.5(E)wtg1 0,09+0,00
0,78+0,00 0,98+0,00 1,06+0,07 1,14+0,06 1,32+0,13 1,24+0,06
2.5(E)mg1 0,10+0,01
0,12+0,00 0,16+0,00 0,18+0,00 0,21+0,01 0,21+0,01 0,22+0,00
Ejemplo 2.2.J 6.4: Unión al Receptor de Fc Neonatal (FcRn)
Se ha propuesto que la interacción de IgG con el receptor de Fc neonatal (también denominado receptor Bramble)
40 en células endoteliales es un sistema de control de calidad de IgG y el determinante crítico para la larga vida media de las IgG [Ghetie, V., et al (1997) Nat. Biotechnol. 15:637-640]. Las moléculas de IgG absorbidas mediante pinocitosis y unidas satisfactoriamente a FcRn en vacuolas endocíticas se devuelven a la circulación. Las moléculas de IgG que fracasan en su unión a FcRn se degradan.
45 Los residuos críticos de IgG humana para la unión a FcRn se han cartografiado para determinar el empalme de los dominios CH2-CH3 (Kim J.K., et al (1999) Eur. J. Immunol. 29:2819-2825). De manera importante, estos residuos de unión a FcRn residuos se conservan entre inmunoglobulinas humanas y de ratón y las inmunoglobulina humanas se unen a FcRn de ratón permitiendo estudios de relaciones de estructura-actividad en ratones.
Para someter a ensayo el efecto de las mutaciones L234A y L235A sobre la unión a FcRn, se determinó la unión de
5 2.5(E)wtg1 de tipo salvaje y de 2.5(E)mg1 mutante a FcRn in vitro utilizando una línea de células CHO que expresa FcRn. Se incubaron 2.5(E)wtg1 y 2.5(E)mg1 con las células CHO que expresan FcRn a pH 6,5, seguido de incubación con anti-IgG humana conjugada con FITC (2° Ab). Las células se lavaron y se analizaron mediante FACS.
10 La concentración 500 nM de 2.5(E)mg1 y 2.5(E)wtg1 mostró una unión significativa a FcRn en comparación con la concentración 0,5 nM, que era similar al antecedente con células solas.
Ejemplo 2.2.K: Farmacocinética en Ratones
15 Se evaluó la farmacocinética (PK) de 2.5(E)mg1 en un estudio de escrutinio en ratones para determinar si las mutaciones en Fc (L234A, L235A) introducidas para evitar que la unión de 2.5(E)mg1 a FcyR y C1q afectara adversamente al perfil de PK del suero. El FcRn de ratón se unió igualmente bien a IgG de ratón y humana haciendo del ratón una especie relevante para los estudios de relación estructura-actividad en ratones (Ober, R.J., et al (2001) Int. Immunol. 13:1551-1559). En ratones, se estimó que la vida media terminal de 2.5(E)mg1 era de 12 días. En
20 estudios similares, las vidas medias de otros anticuerpos monoclonales humanos fueron de 10 - 14 días.
Se evaluó la farmacocinética de 2.5(E)mg1 en ratones hembra (Jackson Labs, C57BL/6n) después de una única dosis intravenosa de 0,2 mg (equivalente a una media de 10 mg/kg). Se administraron dosis a un total de 24 ratones y se recogieron 3 muestras de cada ratón. El esquema de muestreo se prolongó durante 7 días. 2.5(E)mg1 mostró
25 una fase de distribución seguida de una fase de eliminación. Las estimaciones de la vida media de la distribución y la eliminación fueron de aproximadamente 1,6 horas y 12 días, basándose en un modelo abierto de dos compartimentos (Tabla 14).
Tabla 14 Resumen de los parámetros farmacocinéticos de 2.5(E)mg1 derivados de una única dosis 30 intravenosa en ratones
t1/2o(hr)
t1/2�(días) Cmax(g/mL) CL (mL/hr) Vss(mL) V1(mL) V2(mL) MRT (días) AUC (hr*μg/mL)
1,58
12,2 63,2 0,0162 6,82 3,15 3,67 17,5 12250
Modelos de Enfermedad
Ejemplo 2.2.L: Efecto de anticuerpos anti-IL-18 en modelos de enfermedad Ejemplo 2.2.L.1: Inhibición de la producción de IFNg inducida por LPS por mAbs anti-muIL-18
La producción de IFNy inducida por LPS es dependiente de la expresión de IL-18 (Ghayur, T., et al, 1997. Nature 386:619-623). Se utilizó un análisis de producción de IFNy inducida por LPS para determinar la eficacia de 93-10C
40 para inhibir la producción de IFNy inducida por LPS dependiente de IL-18 in vivo. Se administró a los ratones una única dosis iv de 93-10C (50 μg). Treinta minutos más tarde los ratones fueron sensibilizados con LPS (20 mg/kg) y desangrados 4 horas más tarde. Se determinaron los títulos de IFNy en suero por medio de ELISA. Como se muestra en la Tabla 15, 93-10C inhibía la producción de IFNy inducida por LPS en ~70%.
45 Tabla 15 93-10C inhibe la producción de IFNg inducida por LPS in vivo
Grupo
muIFNg (pg/ml) % Inhibición
IgG de Rata 250 μg/ratón
7239 ± 365 N/A
MBT 93-10C 250 μg/ratón
2395 ± 711 67
Ejemplo 2.2.L.2: Inhibición de edema de almohadilla inducido por carragenano
La IL-18 está implicada en el reclutamiento de neutrófilos hacia sitios de inflamación. El edema de almohadilla
50 plantar inducido por carragenano es un modelo de inflamación dependiente de monocitos y neutrófilos. El edema en este modelo puede ser inhibido significativamente neutralizando la actividad biológica de IL-18 (Leung, B.P., et al (2001) J. Immunol. 167:2879-2886). Se administraron a los ratones dosis (ip) de 1C5 (400 μg) (Hyashibara Laboratories, Japón) o 93-10C (100 μg) (Medical and Biological Laboratories (MBL) Co. Watertown MA.) o anticuerpos de control y después se inyectó carragenano (sc) en las almohadillas plantares posteriores. El edema inducido por el carragenano fue medido diariamente desde las 24 h a las 96 h. 1C5 y 93-10C suprimieron significativamente el edema inducido por carragenano (inhibición ~50%) desde las 24h a las 96 h post sensibilización (Tabla 16). Además de bloquear la infiltración de neutrófilos, 93-10C también bloquea la expresión de TNF en el lugar de la inflamación en este modelo (Leung, B.P., et al (2001) J. Immunol. 167:2879-2886)).
Tabla 16 Supresión in vivo del edema de la almohadilla inducido por carragenano
Carragenano
Cambio en la Hinchazón de la Almohadilla (mm)
Tiempo (hrs)
24 48 72 96
125-2H @ 400
0,357 0,557 0,543 0,414
1C5 @ 400 ug
0,214 0,300 0,286 0,200
IgG de Rata @ 100 ug
0,300 0,500 0,550 0,450
93-10C @ 100 ug
0,157 0,271 0,243 0,157
P<0,05 vs. IgG de Control
Ejemplo 2.2.L.3: Artritis inducida por colágeno
10 La artritis reumatoide (AR) se caracteriza por inflamación crónica de las articulaciones, y, pérdida de hueso y cartílago articular. Aunque se piensa que la AR es una enfermedad autoinmunitaria, el autoantígeno implicado no ha sido identificado y la etiología precisa de la enfermedad es desconocida. La artritis inducida por colágeno (AIC) es un modelo ampliamente utilizado de AR y tiene características histopatológicas que son similares a las de la
15 enfermedad humana (Bendele, A., et al (1999) Toxicol Pathol. 27:134-142; Trentham, D.E. et al (1977) J. Exp. Med. 146:857-868). En este modelo, se inmunizan ratones o ratas genéticamente susceptibles con colágeno de tipo II
(CII) en coadyuvante completo de Freund. La poliartritis resultante se caracteriza por la destrucción del cartílago, resorción ósea, sinovitis, e inflamación periarticular (Bendele, A., et al (1999) Toxicol Pathol. 27:134-142). Los ratones IL-18 KO sobre un fondo DBA/1 mostraron una disminución de la incidencia y la gravedad de la AIC cuando
20 se compararon con ratones de tipo salvaje (Wei, X.Q., et al (2000) J. Immunol. 166:517-521).
Para abordar el papel de la IL-18 endógena en la patogénesis de la AIC, se trataron ratones con una IgG policlonal de conejo (BA77) que neutraliza la IL-18 de ratón. Cuando se administró la dosis durante 14 días a partir del momento del cebado, BA77 retrasaba el comienzo de la enfermedad y daba como resultado una disminución de la
25 gravedad de la enfermedad. BA77 también inhibía significativamente la producción de anticuerpos anti-colágeno IgG2a. Estos resultados son similares a los referidos para ratones IL-18 KO y confirman un papel para IL-18 como una importante citoquina pro-inflamatoria en la AIC temprana.
Los datos de ratones IL-18 KO y ratones de tipo salvaje tratados con IgG anti-IL-18 indican que IL-18 juega un
30 importante papel por-inflamatorio durante la activación de células T primarias inducida por CII. Para una mejor comprensión del papel de IL-18 durante el comienzo de la AIC, se inmunizaron ratones con CII y el tratamiento con IgG de rata o 93-10C se inició justo antes del comienzo de la enfermedad, que se produce alrededor del día 14. El tratamiento con 93-10C dio como resultado un retraso significativo del comienzo de la enfermedad y de la gravedad cuando se comparó con IgG de rata de control (Tabla 17). Estos datos demuestran que la IL-18 es un factor
35 significativo no solamente en el cebado de las células T sino también en la promoción de respuestas artritogénicas después de la activación de células T específicas de CII.
Tabla 17 El mAb anti-IL-18 93-10C retrasaba el comienzo y disminuía la gravedad de la AIC
40 Tratamiento Puntuación Artrítica media
Día
11 12 13 14 15 16 17 18
IgG de Rata @ 200 Ig
0,00 0,13 0,13 0,13 0,27 0,53 1,20 1,20
93-10C @ 200 Ig
0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,00 0,20 0,47
Dexametasona-21-P @ 1 mpk
0,00 0,00 0,27 0,27 0,13 0,13 0,13 0,47
Período de Tratamiento
P< 0,05 vs. IgG de Rata
Tratamiento Puntuación Artrítica media
Día
19 20 21 22 23 25 26 27
IgG de Rata @ 200 Ig
1,53 1,73 1,93 2,27 2,53 4,20 4,27 4,53
93-10C @ 200 Ig
0,47 0,80 1,00 1,00 1,13 2,20 2,27 2,87
Dexametasona-21-P @ 1 mpk
0,07 0,07 0,07 0,00 0,00 0,00 0,07 0,20
Período de Tratamiento
P< 0,05 vs. IgG de Rata
Ejemplo 2.2.L.4: Artritis Séptica
La IL-18 es un factor importante en la patogénesis de un modelo de ratón de artritis séptica. Generalmente no se
5 piensa que éste sea un modelo AR, pero comparte ciertos componentes inflamatorios y patología relacionada con la AR. En este modelo, la enfermedad es inducida inyectando estreptococos vivos del grupo B (GBS) en las articulaciones de las rodillas. La gravedad de la artritis resultante se corresponde con niveles tanto locales como sistémicos de IL-1� e IL-6, pero no de TNF (Tissi L., et al (1999) Infect. Immunol. 67:4545-50). Se detectaron niveles significativos de IL-18 en las articulaciones tan pronto como a las 12 horas de la inyección con serotipo IV (GBS)
10 seguido de una producción pico de IL-18 después de 5 días (-550 pg/ml en tratados con 1C5 vs -30 pg/ml en control con IgG). Se detectaron niveles elevados de IL-18 en el suero el día 5 después de la inyección (-180 pg/ml en tratados con 1C5 vs ѝ20 pg/ml en control con IgG).
Cuando se inyectó 1C5 1 hora antes de la administración de GBS hubo una inhibición marcada en la frecuencia de
15 lesiones articulares desde el día 2 al día 10 (índice artrítico: 1,0 en tratados con 1C5 vs 2,5 en control con IgG). Además, el tratamiento con 1C5 también dio como resultado una reducción significativa en los niveles de citoquina en las articulaciones incluyendo IL-6 a IL-1�. (Datos no mostrados).
Ejemplo 2.2.L. 5: LEG
20 Los modelos más estudiados de lupus implican cepas de ratones (MRL/lpr y NZB/NZW F1) que desarrollan espontáneamente síndrome de tipo lupus con glomerulonefritis grave, producción de auto-anticuerpos (anti-ADN, anti-RNP etc.), esplenomegalia, linfadenopatía, y en cierta medida artritis y vasculitis. La afectación del riñón se observa normalmente a los 3-5 meses de edad, progresa rápidamente, y a los 6-10 meses es fatal. Ambas cepas de
25 ratón han sido estudiadas exhaustivamente para adquirir conocimiento de esta enfermedad clínica.
Se seleccionó el modelo de ratón NZB/NZW F1 (B/W) (The Jackson Laboratory, Maine, EEUU) como el modelo más relevante para evaluar los efectos de la IL-18 exógena sobre el progreso de la enfermedad de tipo lupus. El comienzo del progreso de la enfermedad en ratones B/W se observa normalmente a los 7-9 meses de edad y a los 30 12-14 meses es fatal como resultado de la insuficiencia renal. Para investigar el papel de la IL-18 en la patogénesis del lupus, se trataron los ratones B/W diariamente con r-muIL-18 o control de vehículo empezando a los 7 meses de edad. Se evaluó la función del riñón determinando el grado de proteinuria. El tratamiento diario de los ratones B/W con 50 μg/kg de IL-18 condujo a un comienzo acelerado de la proteinuria grave en comparación con el grupo tratado con vehículo de PBS. Los ratones B/W tratados con IL-18 también mostraron una muerte acelerada. Estas
35 observaciones fueron coherentes con las descritas más arriba para los ratones MRL/lpr y subrayan un papel proinflamatorio para la IL-18 en una enfermedad autoinmunitaria.
Para investigar el efecto terapéutico del bloqueo por IL-18 en un modelo de ratón de LEG, se estableció un protocolo de tratamiento de inducción-mantenimiento en ratones B/W que recapitula la terapia clínica para la nefritis por lupus.
40 En este estudio, ratones B/W gravemente nefríticos recibieron 5 dosis semanales de Citoxan (fase de inducción) seguido de tratamiento crónico con 1C5 o control con IgG1 de ratón (125-2H) (fase de mantenimiento).
Los resultados demuestran que en los 130 días siguientes de tratamiento de mantenimiento, 1C5 prolongó significativamente la supervivencia de los ratones BW en comparación con la IgG1 125-2H de control. 125-2H es un 45 mAb IgG1 de ratón que no reconoce muIL-18 (P< 0,05,). Además de la prolongación de la supervivencia, el comienzo de la proteinuria grave se retrasó, y hubo una reducción de IgG2a e IgG1 anti-ADNdh en los ratones BW tratados con 1C5. La reducción de anti-ADNdh por el tratamiento con 1C5 fue transitoria y no estadísticamente significativa. Se detectó anticuerpo contra 1C5 (anticuerpo anti-ratón de ratón [MAMA]), y precedió la pérdida de eficacia después del día 130, como evidenció la caída precipitada en la supervivencia y la pérdida de efecto en la
50 reducción del título de anti-ADNdh y la proteinuria. En conclusión, a pesar de la presencia de respuestas de los anticuerpos a 1C5, el bloqueo de IL-18 por 1C5 prolongó la supervivencia, retrasó el comienzo de la proteinuria grave, y redujo los títulos de anti-ADN dh en ratones B/W. Estos datos demuestran un papel para IL-18 en la promoción de las respuestas inflamatorias dando como resultado una pérdida de la función del riñón y por último la muerte.
Ejemplo 2.2.L. 6: Esclerosis Múltiple
Se investigó la contribución de IL-18 a la patogénesis de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE; un modelo murino de EM). Se considera que la EAE remitente-recurrente es un modelo relevante para la enfermedad humana debido al transcurso similar de la enfermedad, los signos clínicos, y la patología del SNC. En estos estudios, se indujo la enfermedad en ratones IL-18 KO y ratones WT C57/B16. Los ratones IL-18 KO mostraron un ligero retraso 5 en el comienzo de los síntomas de la enfermedad en comparación con los ratones WT, y desarrollaron una enfermedad significativamente menos grave en momentos más tardíos (Tabla 18). El tratamiento de los ratones WT con BA77 (IgG anti-IL-18 de ratón (250 mg, 2X / semana), del día 0 al día 14 después de la inmunización retrasó el comienzo de los síntomas de la enfermedad y limitó significativamente la gravedad de la enfermedad en momentos más tardíos (Tabla 18). El efecto protector de la IgG anti-IL-18 podía ser observado en momentos más tardíos
10 incluso después de cesar el tratamiento.
Tabla 18 Ratones tratados con Ab anti-IL-18 y ratones con IL-18 desactivada desarrollan una enfermedad EAE menos grave
Puntuación Clínica Media Día 14 Después de la Inmunización
EAE inducida por PLP en ratones SJL/J
ab anti-IL-18 IgG(BA77) 4 2,7
Puntuación Clínica Media Día 18
EAE Inducida por MOG en Ratones IL-18 KO y WT
WT KO 3,6 2,1
15 Ejemplo 2.2.L.7: Lesión en el Hígado
La inflamación/lesión del hígado inducida por Concanavalina A (Con A) es un modelo animal de enfermedad hepática mediada por células T. La activación de células T intra-hepáticas por Con A conduce a la producción local de mediadores inflamatorios (p. ej. IFNy y ligando de Fas). La interacción Fas-ligando de Fas da como resultado la 20 producción de IL-18 que induce adicionalmente la producción de IFNy, ligando de Fas y TNF. De este modo, se establece un bucle de retroalimentación positivo que da como resultado la lesión del hígado y la producción excesiva de enzimas hepáticas tales como ALT y AST desde las células que están muriendo. Se inyectaron (ip) los mAb 1C5
o 93-10C (ip) 1h antes de la administración iv de 150 μg de Con A. Los ratones se desangraron 24 horas después de la inyección de Con A y se determinaron los títulos en suero de las enzimas hepáticas (ALT y AST). Tanto 1C5 como
25 93-10C bloquearon la elevación de las enzimas hepáticas inducida por LPS, aunque 93-10C fue eficaz a dosis más bajas (Tabla 19).
Tabla 19 Inhibición in vivo de la inflamación del hígado inducida por ConA por 93-10C
Tratamiento
AST stdv ALT stdv
PBS
57 16 30 2
ConA sola
1138 416 1294 481
ConA+93-10C (50 ug)
183 70 153 88
ConA+93-10C (12,5 ug)
635 427 443 256
ConA+ IgG1 de rata (50 ug)
3924 1062 3455 753
30 Ejemplo 2.2.L.8: Sepsis
La IL-18 ha emergido como un importante mediador del choque endotóxico. La IL-18 puede ser un mediador crítico del fallo pulmonar, hepático y multiorgánico inducido por endotoxinas (Neeta, M.G., et al (2000) J. Immunol. 164:2644-2649). Este efecto de la IL-18 puede ser dependiente de su capacidad para regular la producción de
35 mediadores citotóxicos así como su capacidad para activar respuestas inmunitarias innatas y reclutar neutrófilos hacia el sitio de la inflamación local. Además, la sensibilización con LPS induce niveles elevados de IFNy, TNF e IL1 en suero y estas citoquinas pueden contribuir a la letalidad inducida por LPS. Los ratones con IL-18 desactivada sensibilizados con LPS carecían de IFNy inducido por LPS y producían significativamente menos TNF e IL-1 que los ratones WT (Takeda, K., et al. (1998) Immunity 8:383-390).
40 Se realizaron experimentos de letalidad inducida por LPS como sigue. Se pesaron los animales el Día 0 y se determinó la dosis apropiada que se iba a administrar. At T = -1 hora, se inyectaron a los animales anticuerpos antiIL-18 o anticuerpos de control en 500 μl de solución salina al 0,9%, Intraperitoneal (IP). A T = 0, se inyectaron a los animales 20 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) (E. coli serotipo 0111:B4 Sigma Núm. Cat. L-4130 lote núm. 71K4110)
5 en 100 μl de solución salina al 0,9%, Intravenosa (IV). Cuatro horas más tarde se obtuvo sangre de los animales por medio de punción cardíaca. Se determinó el título de muIFNy en suero por medio de ELISA para muIFNy (R&D Systems).
Los ratones WT tratados con mAb anti-muIL-18, 1C5 o 93-10C, se protegieron de la letalidad inducida por LPS
10 (Tabla 20) (125-2H, que tiene el mismo isotipo inactivo que 1C5 pero no se une a muIL-18, sirvió como control). Además, se informó de que los ratones tratados con IgG anti-IL-18 tuvieron una reducción de la lesión del pulmón y el hígado después de la sensibilización con LPS y esto se correspondía con una reducción de la acumulación de neutrófilos (Neeta, M.G., et al (2000) J. Immunol. 164:2644-2649).
15 Tabla 20 Los mAb 1C5 y 93-10C evitan la letalidad por una dosis elevada de LPS
Letalidad
Porcentaje de Supervivencia
Tiempo (hrs)
0 8 24 32 48 56 72 120 144
Solución salina
100 100 100 50 10 10 10 10
125-2H @ 400
100 100 80 70 10 10 10 10 10
1C5 @ 400 μg
100 100 100 90 80 80 80 80 80
Letalidad
Porcentaje de Supervivencia
Tiempo (hrs)
0 8 24 32 48 56 72 120 144
Solución salina
100 100 90 40 10 10 10 10 10
IgG de rata @ 100 μg
100 100 100 100 70 40 40 40 40
93-10C @ 100 μg
100 100 100 100 100 100 100 100 100
Ejemplo 2.2.M: Cristalización de fragmento Fab de 2.5(E)
Para demostrar que los anticuerpos de la invención pueden ser cristalizados de manera que se pueden generar
20 formulaciones y composiciones que comprenden el anticuerpo cristalizado, se acometieron los siguientes experimentos.
Ejemplo 2.2.M.1: Preparación y Purificación del Fragmento Fab del Anticuerpo 2.5(E)
25 Se expresó IgG humana 2.5(E) en células CHO en Medio SR-286. El sobrenadante después de la lisis se filtró a través de un filtro de 0,5 micras y se cargó sobre una columna de Proteína A previamente equilibrada en Tampón A para Proteína A (1XPBS). Después se hizo eluir la IgG con Tampón B para Proteína A (Acetato de Na 0,1 M pH 3,5, NaCl 150 mM). La IgG reunida se concentró a 20 mg/ml, se mezcló con suspensión en gel de papaína al 50%, y se incubó a 37°C durante 24 horas con sacudimiento vigoroso. La mezcla de anticuerpo/suspensión se sometió a
30 diálisis después frente a tampón Tris 50 mM pH 7,0 durante la noche a 4°C para eliminar la cisteína del tampón. Se preparó una columna de afinidad de Proteína A – Sefarosa 4 Fast Flow de 25 mL (Amersham Pharmacia) lavando con 100 mL de Tampón A (Tris 50 mM pH 7,0). El sobrenadante sometido a diálisis se aplicó a la columna de afinidad (velocidad de flujo 2 mL/min). Las fracciones de Fab de 2.5(E) (controladas por medio de absorbancia UV a 280 nm) se recogieron en el descarte. Las fracciones que contenían una concentración de Fab de 2.5(E) mayores de
35 0,3 mg/mL (determinada por medio de la absorbancia UV a 280 nm) se reunieron y se concentraron a -20 mg/mL utilizando un dispositivo de filtro de centrífuga con corte de peso molecular de 10 kDa (MWCO) Ultrafree-15 Biomax (Millipore) y se congelaron a -80°C. Esta muestra concentrada se utilizó en los experimentos cristalográficos descritos más abajo. La pureza de la muestra se evaluó con SDS-PAGE.
40 Ejemplo 2.2.M.2: Cristalización del Fragmento Fab de 2.5(E)
Se descongeló sobre hielo la solución de partida de Fab de 2.5(E) congelada (-20 mg/mL). El Fab (2 μL) se mezcló con 2 μL de una solución reservorio que consistía en polietilenglicol 400 (PEG) al 25-30%, CAPS 100 mM pH 10,5 y se suspendió sobre el reservorio en la cara inferior de un cubreobjetos de vidrio siliconizado a aproximadamente
45 4°C. En un día aparecieron cristales de tipo varilla. Se determinó que los cristales de tipo varilla eran cristales del fragmento Fab de 2.5(E) (Datos no mostrados).
Ejemplo 3: Genes sensibles a IL-18
Ejemplo 3.1: Materiales y Métodos
A lo largo de todo el Ejemplo 4, se utilizan los siguientes materiales y métodos a menos que se establezca de otro modo.
Ejemplo 3.1.A: Tratamiento Celular y Preparación de ARN
Ejemplo 3.1.A.1: Células KG-1
Se utilizaron aproximadamente 3,0 x 107 KG1 células (ATCC núm. CCL-246) para cada condición experimental en los cuatro grupos de tratamiento. En el primero, las células se trataron con 50 ng/mL de IL18 recombinante con o sin una preincubación de 30 min. con 10 mg/mL de cicloheximida. Después de 30 min. o dos horas las células se cosecharon para obtener el ARN. En el segundo, las células se trataron con 0, 0,5, 2,0, 10 o 50 ng/mL de IL18 recombinante con o sin una preincubación de 30 min. con 10 mg/mL de cicloheximida. Después de dos horas las células se cosecharon para obtener el ARN. En el tercero, las células se trataron con 0 o 10 ng/mL de TNF. Después de incubar durante la noche, las células se trataron con 0, 0,5, 2,0, 10 o 50 ng/mL de IL18 recombinante con o sin una preincubación de 30 min. con 10 mg/mL de cicloheximida. Después de dos horas las células se cosecharon para obtener el ARN. En el grupo de tratamiento final, las células se trataron simultáneamente con 0 o 10 ng/mL de TNF y 0 o 2,0 ng/mL de IL18 recombinante con o sin una preincubación de 30 min. con 10 mg/mL de cicloheximida. Después de dos horas las células se cosecharon para obtener el ARN.
Se preparó el ARN total utilizando Reactivo TRIZOL (Life Technologies, Rockville, MD). Se llevó a cabo una fase de separación inicial de acuerdo con el protocolo del fabricante y estuvo seguida de una extracción adicional utilizando medio volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1, Life Technologies, Rockville, MD). La precipitación y el lavado del ARN se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del protocolo TRIZOL del fabricante. Se sometieron a electroforesis aproximadamente 3 microgramos de ARN sobre un gel desnaturalizante de agarosa/formaldehído al 1,0% para evaluar la calidad.
Para los experimentos que requieren la preincubación con TNF, se incubaron las células KG-1 durante 12 horas con 2 ng/ml de TNF antes de la estimulación con 2, 10 o 40 ng/ml de IL18. El ARN se preparó como se ha descrito más arriba.
Ejemplo 3.1.A.2: Análisis de sangre humana completa
Se introdujeron alícuotas de 2,5 mL de sangre humana completa en tubos cónicos de 15mL y se trataron con IL18, IL12, IL18+IL12, IL18+IL12+anti-IL18 o IL18+IL12, IL18+IL12+anticuerpo de control. Las concentraciones finales fueron las siguientes: 500 pg/mL de IL12, 50 ng/mL de IL18(YK27-1), 5 ug/mL de mIgG, 5ug/mL de anti-IL18 1252H, y 2,5-4ug/mL de anti-IL18. Las mezclas se incubaron a 37°C durante cuatro horas con inversión intermitente suave. Después de la incubación, se separaron los glóbulos rojos utilizando cloruro de amonio añadiendo 5mL de 1 X tampón de lisis (PharM Lyse Ammonium Chloride Lysing Reagent diluido 1:10 en Depc). Después de 5 minutos sobre hielo la mezcla se centrifugó a 1200 rpm durante cinco minutos. Este procedimiento se repitió una vez produciendo un sedimento de color blanco de leucocitos sanguíneos. El ARN se aisló con posterioridad utilizando el procedimiento del Trizol descrito más arriba. Para el análisis de micro-matrices, todos los volúmenes de las muestras se incrementaron en un factor de cuatro.
Ejemplo 3.1.B: Preparación de la Sonda e Hibridación con la Diana
Se utilizaron diez microgramos de ARN total y el SuperScript Choice System for cDNA Synthesis (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para sintetizar el ADNc de doble hebra. La síntesis se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo Affymetrix (Santa Clara, CA), que requiere cebadores oligoméricos T7-(dT)24 (GENSET) en lugar del oligo (dT) o cebadores al azar proporcionado con el kit e incubaciones a 42°C durante el ajuste de la temperatura y las etapas de síntesis de la primera hebra. El ADNc resultante se limpió con tubos de 2 ml Phase Lock Gel Light (Eppendorf AG, Hamburg, DE), y el sedimento se suspendió en 12 μL de DEPC-H2O. Se utilizaron 5 μL del ADNc junto con el Kit BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo, Farmingdale, NY) para producir dianas de ARNc marcadas con biotina por medio de transcripción in vitro (IVT) a partir de promotores de ARN polimerasa T7. Los nucleótidos libres se separaron de la reacción IVT con Minicolumnas RNeasy (Qiagen, Hilden, DE). Después se fragmentaron 15 μg de ARNc marcado con biotina de acuerdo con el protocolo Affymetrix. La muestra fragmentada completa se combinó con 5 μL de oligonucleótido B2 de control (Affymetrix), 15 μL de 20X Control de Hibridación Eucariótico (Affymetrix), 3 μL de ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (10 mg/mL, Stratagene, La Jolla, CA), 3 μL de BSA acetilado (50 mg/mL, Gibco BRL), 150 μL de 2X tampón de hibridación MES, y agua a un volumen final de 300 μL. Siguiendo el protocolo Affymetrix, las Matrices Genechip HuGeneFL (Affymetrix) se humedecieron previamente con 1X MES. Los cócteles de hibridación se calentaron después y se centrifugaron, y se cargaron 200 μL sobre los chips. Los chips se centrifugaron en un horno asador durante 16 horas.
Ejemplo 3.1.C: Matrices de Sondas para el Lavado, Tinción, y Barrido
5 El cóctel de hibridación se separó de los chips y se remplazó por tampón de lavado no restrictivo. Los chips se lavaron y se tiñeron utilizando el protocolo EukGE-WS2 en GeneChip Fluidics Station 400, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Affymetrix); un protocolo que coloreaba los chips tanto con solución de coloración de Estreptavidina Ficoeritrina (SAPE) como con solución de anticuerpo. Todos los tampones de lavado y los colorantes
10 necesarios se prepararon de acuerdo con los protocolos de Affymetrix. Se utilizó un Escáner GeneArray (Agilent, Palo Alto, CA) junto con el programa GeneChip (Affymetrix) para el barrido de las matrices coloreadas.
Ejemplo 3.1.D: Análisis de los Datos
15 Los datos de Genechip fueron transferidos desde Affymetrix MAS4 a Microsoft Excel después se cargaron en Spotfire Decisionsite 7.0.
Ejemplo 3.2: Expresión génica regulada por IL-18
20 Ejemplo 3.2.1: IL18 sola regula directamente una cohorte de genes en células KG1.
Para determinar los transcritos regulados directamente por IL18, se realizaron experimentos de titulación de citoquina utilizando células KG1 en presencia y ausencia del inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida. En la Tabla 1 se muestran 62 transcritos representados por 67 grupos de sondas diferentes (debido a las redundancias 25 en el chip) que se encontró que habían sido regulados dos veces o más con un valor de p menor de 0,05 (utilizando el test de la t de Student) al menos en una condición en presencia y en ausencia de cicloheximida. Estos genes comprendían una variedad de categorías funcionales incluyendo factores de transcripción, quinasas, y proteínas secretadas. Debido a que estos genes son regulados sin síntesis de proteínasde novo, estos genes responden directamente a la señalización inducida por IL18. Doce genes codifican proteínas secretadas, y trece codifican
30 moléculas de la superficie (haciendo éstas dianas de anticuerpo viables). El resto de los genes codifican proteínas nucleares y citoplásmicas (véase la Tabla 21).
Tabla 21. Genes inducidos por IL18.
ID Genbank
Localización /función Nombre del Gen Comentario de Unigene 0.5 ng/ml 2 ng/ml 10 ng/ml 50 ng/ml
L29217
quinasa CLK3 quinasa 3 de tipo CDC 9,1 7,4 8,1 15,0
D14497
quinasa MAP3K8 proteína quinasa activada por mitógeno quinasa 8 6,6 2,9 5,8 3,9
L19871
ninguna ATF3 factor de activación de la transcripción 3 1,0 1,1 3,3 2,6
U15460
ninguna BATF factor de Transcripción con cremalleras de leucina de carácter básico, de tipo ATF 1,5 1,7 2,4 2,8
U45878
ninguna BIRC3 que contiene 3 de la repetición IAP de baculovirus 7,0 6,2 10,2 10,0
U37546
BIRC3 que contiene 3 de la repetición IAP de baculovirus 29,4 26,9 76,6 63,6
U72649
ninguna BTG2 familia BTG, miembro 2 3,1 4,7 6,6 5,9
L07765
ninguna CES1 carboxilesterasa 1 1,0 1,3 2,1 2,1
M27691
ninguna CREB1 proteína de unión 1 al elemento sensible a AMPc 0,9 2,4 4,9 3,1
HG3548- HT3749
ninguna CUTL1 cut (proteína de desplazamiento de CCAAT) 2,5 2,1 1,3 0,7
X59131
ninguna D13S106E proteína altamente cargada 2,1 0,5 1,5 2,3
U53445
ninguna DOC1 regulado a la baja en cáncer de ovario 1 2,0 3,3 3,0 3,8
ID Genbank
Localización /función Nombre del Gen Comentario de Unigene 0.5 ng/ml 2 ng/ml 10 ng/ml 50 ng/ml
X68277
ninguna DUSP1 fosfatasa 1 de especificidad dual 2,5 3,1 4,1 3,3
U48807
ninguna DUSP4 fosfatasa 4 de especificidad dual 2,0 2,3 2,9 2,0
X52541
ninguna EGR1 respuesta de crecimiento temprano 1 15,5 12,7 32,4 20,3
X63741
ninguna EGR3 respuesta de crecimiento temprano 3 5,9 7,3 15,1 9,0
L07077
ninguna EHHADH enoil-Coenzima A 3,4 2,3 1,8 2,5
M62831
ninguna ETR101 proteína temprana inmediata 3,4 5,8 6,3 6,8
L19314
ninguna HRY homólogo de hairy (Drosophila) 2,3 2,5 2,3 2,0
S81914
ninguna IER3 respuesta temprana inmediata 3 17,0 18,6 32,9 29,6
X51345
ninguna JUNB proto-oncogen jun B 7,2 6,1 10,7 9,6
U20734
ninguna JUNB proto-oncogen jun B 10,2 21,8 25,0 25,4
U49957
ninguna LPP contiene dominio LIM 2,2 1,1 2,0 1,9
M58603
ninguna NFKB1 factor nuclear kappa B (p105) 1,6 2,0 2,9 2,3
S76638
ninguna NFKB2 factor nuclear kappa B 1,7 2,2 3,5 4,3
M69043
ninguna NFKB1A factor nuclear kappa B 9,6 10,4 15,5 15,8
U91616
ninguna NFKBIE factor nuclear kappa B 11,6 14,8 20,7 21,0
L13740
ninguna NR4A1 subfamilia 4 del receptor nuclear, grupo A, miembro 1 2,0 2,7 2,4 2,5
HG4115- HT4385
ninguna OR1E3P receptor olfatorio 4,5 12,0 4,2 4,1
L20971
ninguna PDE4B fosfodiesterasa 4B, específica de APMc 2,4 2,8 4,2 3,5
U64675
ninguna RANBP2L1 RAN proteína de unión 2 tipo 1 1,1 1,8 2,2 2,2
S57153
ninguna RBBP1 retinoblastoma-proteína de unión 1 2,5 3,4 5,0 4,1
X75042
ninguna REL v-rel 1,6 2,5 3,9 3,7
M83221
ninguna RELB v-rel 2,3 2,8 2,8 2,6
S59049
ninguna RGS1 regulador de la señalización de proteína G 1 10,9 12,7 22,4 17,8
U70426
ninguna RGS16 regulador de la señalización de proteína G 16 3,9 4,7 7,5 6,7
U22377
ninguna RLF secuencia de fusión L-myc reordenada 2,5 2,0 2,5 2,6
M95787
ninguna TAGLN transgelina 6,6 4,7 1,0 1,6
L47345
ninguna TCEB3 factor B de elongación de la transcripción (110kD, elonguina A) 3,6 5,3 2,3 4,2
M59465
ninguna TNFAIP3 proteína 3 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa 9,9 12,4 25,4 20,6
U19261
ninguna TRAF1 factor 1 asociado al receptor de TNF 2,8 2,8 4,9 4,1
U78798
ninguna TRAF6 factor 6 asociado al receptor de TNF 1,2 2,0 2,1 2,2
M37435
secretada CSF1 factor 1 estimulador de colonias 2,9 2,9 2,1 27,0
M57731
secretada GRO2 (macrófago) oncogen GRO2 15,2 20,9 26,3 27,0
ID Genbank
Localización /función Nombre del Gen Comentario de Unigene 0.5 ng/ml 2 ng/ml 10 ng/ml 50 ng/ml
X53800
secretada GRO3 oncogen GRO3 4,1 5,5 14,8 9,9
X04500
secretada IL1B interleuquina 1, 2,2 3,4 5,7 4,7
M28130
secretada IL8 interleuquina beta 8 6,2 10,0 13,4 14,5
Y00787
secretada IL8 interleuquina 8, 5,8 7,4 8,3 8,5
U89922
secretada LTB linfotoxina beta (superfamilia del TNF, miembro 3) 5,0 5,7 11,0 12,8
M31166
secretada PTX3 gen relacionado con la penlaxina, rápidamente inducido por IL-1 beta 3,1 5,2 10,3 6,4
M23178
secretada SCYA3 citoquina A3 inducible pequeña 1,8 2,0 5,0 3,8
M69203
secretada SCYA4 citoquina A4 inducible pequeña 0,9 1,9 7,0 5,6
J04130
secretada SCYA4 citoquina A4 inducible pequeña 1,0 2,6 5,9 4,5
M92357
secretada TNFAIP2 proteína 2, inducida por el factor de necrosis tumoral alfa 4,2 6,4 20,3 19,3
Z32765
superficie CD36 antígeno CD36 (colágeno tipo I/ receptor de TSP) 1,6 2,0 1,4 1,2
Z11697
superficie CD83 antígeno CD83 4,7 8,2 19,6 16,7
M57730
superficie EFNA1 efrina-A1 9,8 6,0 9,5 15,2
A28102
superficie GABRA3 receptor de ácido gammaaminobutírico (GABA) 3,0 2,5 1,6 2,7
M24283
superficie ICAM1 molécula 1 de adherencia celular (CD54) 7,5 11,5 14,5 13,9
M55024
superficie ICAM1 molécula 1 de adherencia celular (CD54) 2,5 3,4 3,2 3,7
J03171
superficie IFNAR1 receptor 1 de interferón (alfa, beta y omega) 3,2 2,5 2,8 2,6
X01057
superficie IL2RA receptor de interleuquina 2, alfa 0,7 0,4 3,9 3,6
L10338
superficie SCN1B polipéptido del canal de sodio 1,8 2,3 1,5 1,5
D79206
superficie SDC4 sindecano 4 (amfiglicano, riudocano) 4,0 4,2 7,2 6,1
HG961-HT961
superficie SOS1 hijo del homólogo 1 de sevenless (Drosophila) 6,3 6,2 9,1 9,9
X83490
superficie TNFRSF6 miembro 6 del receptor del factor de necrosis tumoral 1,1 1,3 3,8 3,3
U19523
ninguna GCH1 ciclohidrolasa 1 de GTP 2,1
U37518
superficie TNFSF10 miembro 10 del factor de necrosis tumoral 1,4 1,4 2,3 1,6

Ejemplo 3.2.2: Efectos históricos de la exposición a citoquinas Respuesta de las células KG-1 a IL-18.
Puesto que típicamente las citoquinas aparecen de manera sucesiva durante una respuesta inmunitaria, se sometió
5 a ensayo el efecto de preincubar células KG-1 con TNF antes del tratamiento con IL18. Este experimento también sometió a ensayo la hipótesis de que la historia de exposición de las células a citoquinas puede tener efecto sobre su respuesta a una posterior exposición a citoquinas. Las células se trataron con 2 ng de TNF 12 horas antes de añadir IL18 y se cosecharon cuatro horas más tarde.
10 La IL18 regulaba la expresión de aproximadamente 125 genes en estas condiciones (Tabla 2). Los criterios de filtración utilizados para obtener este grupo de genes fue un cambio menor del 50% debido al TNF y un cambio mayor de dos veces o mayor debido a IL18 a 10 ng/mL y 40 ng/mL. Estos genes comprendían una variedad de categorías funcionales incluyendo factores de transcripción, quinasas, y proteínas secretadas (Tabla 22). En contraste con otras condiciones sometidas a ensayo aquí, los autores de la presente invención encontraron que el ARNm del interferón gamma y la proteína eran inducidos por IL18 después de la exposición a TNF.
Tabla 22. Genes regulados por IL18 después del tratamiento con TNF.
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene Veces 10 ng Veces 40 ng
J00219
IFNG interferón, gamma 26,3 31,8
U17034
PLA2R1 receptor 1 de fosfolipasa A2, 180kD 29,6 28,7
M57710
LGALS3 lectina, unión a galactosidasa, soluble, 3 (galectina 3) 27,5 25,4
X97748
PTX3 gen relacionado con la pentaxina, inducido por IL-1 15,2 13,6
M27288
OSM oncostatina M 23,1 12,0
X57809
región variable de la cadena ligera lambda 10,9 10,0
Y00081
IL6 interleuquina 6 (interferón, beta 2) 9,2 9,4
D16583
HDC histidina descarboxilasa 8,0 9,4
X07730
KLK3 calicreína 3, (antígeno específico de próstata) 5,6 8,8
HG3111-HT3287
clon HH409 de Homo sapiens desconocido 9,5 7,5
M57732
TCF1 factor nuclear hepático (HNF1) 2,0 7,2
U77735
PIM2 oncogen pim-2 7,1 7,1
U96094
SLN sarcolipina 12,2 6,1
D50640
PDE3B fosfodiesterasa 3B, inhibida por GMPc 4,0 5,4
X14008
LYZ lisozima (amiloidosis renal) 3,0 5,4
M91036
HBG2 hemoglobina, gamma G 3,4 5,4
X72755
MIG monoquina inducida por interferón gamma 5,2 5,2
AC000099
GRM8 receptor de glutamato, metabotrópico 8 2,3 4,3
D11428
PMP22 proteína de mielina periférica 22 5,0 4,0
M83667
CEBPD CCAAT/proteína delta de unión al potenciador (C/EBP) 4,3 4,0
L19267
DMWD distrofia miotónica, motivo repetitivo WD 3,0 3,8
M81181
ATP1B2 ATPasa, transportador de Na+/K+ 3,5 3,8
U79249
secuencia del clon 23839 humano 3,1 3,7
U49973
FLJ10803 proteína hipotética FLJ10803 3,2 3:6
HG870-HT870
GOLGA3 autoantígeno golgi, subfamilia a de la golgina, 3 3,5 3,6
X13589
CYP19 citocromo P450, subfamilia XIX 3,0 3,5
AB000464
clon: RES4-24A 2,9 3,5
M96956
TDGF1 factor de crecimiento 1 derivado de teratocarcinoma 2,6 3,5
U31628
IL15RA receptor de interleuquina 15, alfa 6,4 3,3
D38128
PrGIR receptor (IP) de prostaglandina 12 (prostaciclina) 8,8 3,3
J03507
C7 componente 7 del complemento 2,3 3,1
M32011
NCF2 factor citosólico 2 de neutrófilos 3,5 3,0
X63131
PML leucemia promielocítica 4,7 3,0
D82326
SLC3A1 familia 3 del portador de soluto 4,0 3,0
L10343
PI3 inhibidor de proteasa 3, derivada de piel (SKALP) 2,1 3,0
ID Genbank
Nombre Gen del Comentario de Unigene Veces 10 ng Veces 40 ng
U89995
FOXE1 caja de la cabeza de tenedor E1 (factor 2 de transcripción tiroideo) 2,6 2,9
M62800
SSA1 (52kD, autoantígeno de ribonucleoproteína SS-A/Ro) 3,1 2,9
AB000584
PLAB factor de diferenciación de próstata 2,4 2,8
U37519
ALDH8 aldehído deshidrogenasa 8 2,2 2,7
D21267
SNAP25 proteína asociada al sinaptosoma, 25kD 2,2 2,7
M25667
GAP43 proteína 43 asociada al crecimiento 2,5 2,7
L34357
GATA4 proteína de unión GATA-4 2,3 2,7
U43944
ME1 enzima málica 1, dependiente de NADP(+), citosólica 3,0 2,7
M16937
HOXB7 homeobox B7 2,9 2,6
U27326
FUT3 fucosiltransferasa 3 2,6 2,6
Z23115
BCL2L1 BCL2 de tipo 1 2,2 2,6
HG1877-HT1917
MBP proteína básica de mielina 2,4 2,6
D10995
HTR1B receptor 1B de 5-hidroxitriptamina (serotonina) 2,5 2,6
M91463
SLC2A4 transportador de glucosa de la familia 2 del portador de soluto 3,1 2,5
U19878
TMEFF1 transmembrana con EGF y de tipo folistatina 2,9 2,4
U66468
CGR11 regulador del crecimiento celular con dominio en mano EF 2,2 2,4
U44848
NRF1 factor 1 nuclear respiratorio 3,5 2,4
U73328
DLX4 homeobox distal menos 4 3,2 2,4
HG4593-HT4998
canal de sodio regulado por voltaje (SCN1A) 2,3 2,4
X78710
MTF1 factor metal-regulador 1 de la transcripción 2,7 2,4
X59727
MAPK4 proteína quinasa activada por mitógeno 4 2,3 2,4
J03600
ALOX5 araquidonato 5-lipoxigenasa 2,2 2,3
U87269
E4F1 factor de transcripción E4F-1 3,4 2,3
Y10375
PTPNS1 tirosina fosfatasa, sustrato 1 no receptor 4,5 2,2
D49958
GPM6A glicoproteína M6A 3,3 2,2
U60062
FEZ1 proteína zeta 1 de fasciculación y elongación (zingina I) 3,3 2,2
X14830
CHRNB1 receptor colinérgico, nicotínico, polipéptido 1 beta 2,4 2,1
J04076
EGR2 respuesta de crecimiento temprano 2 (Krox-20 homólogo) 3,0 2,1
HG2981-HT3127
CD44 antígeno CD4 2,2 2,1
U49187
C6ORF32 marco de lectura abierto 32 del cromosoma 6 3,8 2,1
X77744
Homo sapiens para la proteína FLJ00032, parcial 2,3 2,1
X68285
GK glicerol quinasa 2,4 2,0
HG3925-HT4195
SFTPA2 proteína A2 asociada a los pulmones, tensioactiva 3,9 2,0
M26062
IL2RB receptor de interleuquina 2, beta 0,2 0,5
X06182
KIT oncogen homólogo V-kit 0,4 0,5
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene Veces 10 ng Veces 40 ng
U79251
OPCML proteína de unión a opioides/tipo molécula de adherencia celular 0,5 0,5
J03764
SERPINE1 nexina, inhibidor de tipo 1 del activador de plasminógeno 0,5 0,5
X9281A
HREV107 similar a HREV107 de rata 0,3 0,5
L01087
PRKCQ proteína quinasa C, theta 0,2 0,5
D43772
GRB7 proteína 7 de unión al receptor del factor de crecimiento 0,2 0,5
X15880
COL6A1 colágeno, tipo VI, alfa 1 0,5 0,5
HG3115-HT3291
MBP proteína básica de mielina 0,4 0,5
X83301
SMA3 SMA3 0,5 0,5
D87469
CELSR2 cadherina, receptor 2 de tipo G EGF LAG de siete pasos 0,4 0,5
M11313
A2M alfa-2-macroglobulina 0,4 0,4
X64877
HFL3 factor H (complemento) tipo 3 0,4 0,4
Z18859
GNAT2 proteína de unión al nucleótido de guanidina (proteína G) 0,4 0,4
D89077
SLA adaptador de tipo Src 0,4 0,4
L25444
TAF2E factor asociado a la proteína de unión a la caja TATA (TBF) 0,2 0,4
M26665
HTN3 histatina 3 0,4 0,4
S69790
WASF3 familia de proteína WAS, miembro 3 0,4 0,4
U79248
secuencia del clon 23826 humano 0,4 0,4
L15309
ZNF141 proteína con dedos de cinc 141 (clon pHZ-44) 0,3 0,4
L41147
HTR6 receptor 6 de 5-hidroxitriptamina (serotonina) 0,4 0,4
X58431
HOXB6 homeobox B6 0,4 0,4
U50360
CAMK2G quinasa II gamma CaM 0,2 0,4
D88152
ACATN transportador de acetil-Coenzima A 0,4 0,4
U38480
RXRG receptor X retinoide, gamma 0,3 0,4
X16866
CYP2D7AP citocromo P450, subfamilia IID 0,4 0,4
X70991
NAB2 proteína de unión 2 a NGFI-A (ERG1 pb 2) 0,2 0,4
M60830
EVI2B sitio 2B de integración viral ecotrópica 0,4 0,4
M27492
IL1R1 receptor de interleuquina 1, tipo I 0,4 0,4
Z35093
SURF1 surfeit 1 0,4 0,4
D86425
NID2 nidógeno 2 0,3 0,3
U59914
MADH6 MAD ) homólogo 6 0,4 0,3
M18255
PRKCB1 proteína quinasa C, beta 1 0,4 0,3
AF000234
P2RX4 receptor porinérgico P2X 0,3 0,3
S77763
NFE2 factor nuclear (derivado eritroide 2), 45kD 0,4 0,3
U78722
ZNF165 proteína con dedos de cinc 165 0,3 0,3
L05568
SLC6A4 familia 6 del portador de soluto (serotonina), 0,3 0,3
L31529
SNTB1 proteína A1 asociada a sintropina, distrofina, 0,3 0,3
U47054
ART3 ADP-ribosiltransferasa3 0,4 0,3
ID Genbank
Nombre del Gen Comentario de Unigene Veces 10 ng Veces 40 ng
M13955
KRT7 queratina 7 0,4 0,3
D15049
PTPRH proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, H 0,4 0,3
U03486
GJA5 proteína de uniones en hendidura, alfa 5, 40kD (conexina 40) 0,5 0,3
X06256
ITGA5 integrina, alfa 5 0,4 0,3
U22314
REST factor de transcripción silenciador de RE1 0,3 0,3
U51096
CDX2 factor de transcripción de tipo homeobox 2 0,2 0,2
D31762
KLAA0057 proteína de tipo TRAM 0,4 0,2
M23668
FDX1 ferredoxina 1 0,2 0,2
U53476
WNT7A familia del sitio de integración de MMTV de tipo sin alas 0,2 0,2
X57206
ITPKB inositol 1,4,5-trisfosfato 3-quinasa B 0,2 0,2
Z31695
INPP5A inositol polifosfato-5-fosfatasa, 40kD 0,4 0,2
S66793
ARR3 arrestina 3, retinal (X-arrestina) 0,2 0,2
U59877
RAB31 RAB31, miembro de la familia de oncogenes RAS 0,2 0,2
U53786
EVPL envoplaquina 0,2 0,2
S83362
LIFR receptor del factor inhibidor de leucemia 0,3 0,2
D42038
KIAA0087 producto génico KIAA0087 0,3 0,2
HG4333-HT4603
ZNF79 proteína con dedos de cinc 79 (pT7) 0,1 0,1
L01406
GHRHR receptor de la hormona liberadora de la hormona de crecimiento 0,4 0,1

Ejemplo 3.23: Respuesta de Leucocitos Humanos a IL18.
Se sometió a ensayo la respuesta de los leucocitos humanos (leucoféresis aislada) para responder a IL18 sola o 5 combinada con IL12. También se sometió a ensayo la capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-IL18 para inhibir la respuesta transcripcional. Las células se trataron como se describe en el Ejemplo 4.1. El ARN se aisló y se utilizó para sondear Genechips Affymetrix (Hugene, FL). Los resultados se muestran en la Tabla 23, que enumera 49 transcritos inducidos por IL18 + IL12 y revertidos por anticuerpo anti-IL18. Varios genes fueron relevantes para el sistema inmunitario. Muchos de estos genes también fueron inducidos por IL18 en células KG-1. 10
Tabla 23. Otros marcadores potenciales de IL18/IL12 seleccionaron transcritos regulados al alza cuatro veces o más por IL18+IL12 y revertidos por 1252H en una muestra de leucocitos humanos según se determinó utilizando Genechips Affymetrix.
Nombre del Gen
Comentario de Unigene Unigene
KIAA0001
receptor acoplado a proteína G putativo para UDP-glucosa Hs.2465
LIMK2
dominio quinasa 2 LIM Hs.278027
KIAA0196
producto génico KIAA0196 Hs.8294
IFNG
interferón, gamma Hs.856
POLR2C
polipéptido de polimerasa (ARN) II Hs.79402
DAG1
distroglicano 1 Hs.76111
TPSB1
triptasa beta 1 Hs.250700
CDR2
proteína relacionada con la degeneración cerebelar (62kD) Hs.75124
TCF12
factor de transcripción 4 con motivo hélice-asa-hélice Hs.21704
Nombre del Gen
Comentario de Unigene Unigene
TACTILE
activación células T, aumento de la expresión tardía Hs.142023
PIP5K2A
fosfatidilinositol-4-fosfato 5-quinasa Hs.108966
SF3A3
factor de empalme 3a, subunidad 3, 60kD Hs.77897
SEL1L
sel-1 de tipo (supresor de lin-12, C.elegans) Hs.181300
IL15
interleuquina 15 Hs.168132
BAK1
antagonista de BCL2/asesino 1 Hs.93213
SLAM
molécula de activación linfocítica de la señalización Hs.32970
SCYB11
subfamilia B de citoquina inducible pequeña (Cys-X-Cys), miembro 11 Hs.103982
LIMK1
dominio quinasa 1 LIM Hs.36566
CAT56
proteína CAT56 Hs.118354
POLRMT
polimerasa (ARN) mitocondrial (dirigida a ADN) Hs.153880
SCYA4
citoquina A4 inducible pequeña/Mip-1b Hs.75703
MIG
monoquina inducida por interferón gamma Hs.77367
SSX3
sarcoma sinovial, X punto de rotura 3 Hs.178749
TNFRSF6
superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 6 Hs.82359
MAT1A
metionina adenosiltransferasa I, alfa Hs.323715
KIAA0133
producto génico KIAA0133 Hs.57730
FCGBP
fragmento Fc de la proteína de unión a IgG Hs.111732
ARHD
familia genes homólogos ras, miembro Hs.15114
FGFR2
receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos Hs.278581
COL9A1
colágeno, tipo IX, alfa 1 Hs.154850
HPX42B
homeobox progenitor hematopoyético Hs.125231
TAL2
leucemia lifocítica aguda 2 de células T Hs.247978
ESTs
Hs.196244
REN
renina Hs.3210
POU2F2
dominio POU, clase 2, factor de transcripción 2 Hs.1101
ALOX12
araquidonato 12-lipoxigenasa Hs.1200
ACTN2
actinina alfa 2 Hs.83672
KLK2
calicreína 2, prostática Hs.181350
RCV1
recoverina Hs.80539
E2F4
factor de transcripción E2F-4, unión a p107/p130 Hs.108371
SEMA3F
dominio (Ig) de inmunoglobulina, dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3F Hs.32981
BHMT
metiltransferasa de betaína-homocisteína Hs.80756
IEVPL
envoplaquina Hs.25482
BBC3
componente 3 de unión a Bcl-2 Hs.87246
SLN
sarcolipina Hs.15219
RDBP
proteína de unión a ARN RD Hs.106061
MT1H
metalotioneína 1H Hs.2667
RAD54L
RAD54 de tipo (S.cerevisiae) His.66718
Nombre del Gen
Comentario de Unigene Unigene
MLL3
leucemia 3 de linaje mieloide/linfoide o mixto Hs.288971
Ejemplo 3.2.4: Respuesta de sangre humana completa a IL18.
Se sometió a ensayo la respuesta de sangre humana completa a IL18 sola o combinada con IL12. También se sometió a ensayo la capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-IL18 para inhibir la respuesta transcripcional. Se 5 trataron muestras de sangre de donantes normales como se describe en el Ejemplo 4.1. Se aisló el ARN y se utilizó para sondear los Genechips Affymetrix (HugeneFL). Los resultados se muestran en la Tabla 24 que enumera 16 transcritos que fueron regulados significativamente por IL18 + IL12 y revertidos por anticuerpo anti-IL18 en muestras de sangre completa aisladas de dos donantes sanos. Varios genes fueron relevantes para el sistema inmunitario. Los autores de la presente invención continuaron para someter a ensayo la respuesta de tres de estos genes en el
10 panel de 10 donantes normales utilizando la PCR cuantitativa. Los resultados de este estudio de variabilidad humana se muestran en la Tabla 25, para el interferón gamma; en la Tabla 26, para CXCL9 y en la Tabla 27, para CCL8. Los resultados del estudio de variabilidad indicaron que es probable que la regulación de estos transcritos por IL18 en sangre humana sea común entre los seres humanos.
15 Tabla 24. Otros marcadores potenciales de IL18/IL12 seleccionados a partir de transcritos regulados al alza en sangre completa aislados de dos donantes se trataron a continuación con IL18+IL12.
ID del Grupo de Sondas
Título Unigene
202284_s_at
inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1A(p21, Cip1) His.179665
202531_at
factor 1 regulador de interferón Hs.80645
2040578_at
proteína de unión 1 a la secuencia consenso del interferón Hs.14453
205488_at
granzima A (granzima 1, serina esterasa 3 asociada a linfocitos T citotóxicos) Hs.90708
206554_x_at
dominio SET y gen de fusión de la transposasa mariner Hs.265855
206817_x_at
4 que contiene repeticiones de trinucleótidos Hs.26047
207509_s_at
receptor 2 de tipo Ig asociado a leucocitos Hs.43803
209546_s_at
apolipoproteína L, 1 Hs.114309
214438_at
homeobox 1 de tipo H2.0 (Drosophila) Hs.74870
214450_at
catepsina W (linfopaína) Hs.87450
216950_s_at
forma b de FcRI (AA 1-344) [Homo sapiens], secuencia de ARNm Hs.382006
217933_s_at
leucina aminopeptidasa 3 Hs.182579
219386_s_at
activador de linfocitos B expresado por macrófagos Hs.20450
219956_at
UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:polipéptido N- acetilgalactosaminiltransferasa 6 Hs.151678
219971_at
receptor de interleuquina 21 Hs.210546
221223_x_at
proteína que contiene SH2 inducible por citoquina Hs.8257

Tabla 25. Funcionamiento de Interferón y en diez muestras de sangre humana . p<0,.05 para la inhibición por cualquier anticuerpo
IFN
No estimulado Estimulado 2.5 Anti-IL18 125-2H Anti-IL18
donante 3n
0,001 0,187 0,014 0,026
donante 5n
0,003 0,012 0,006 0,006
donante 9n
0,001 1,250 0,037 0,000
donante 10n
0,002 0,361 0,024 0,002
donante 1n
0,002 0,339 0,022 0,070
donante 2n
0,001 0,032 0,003 0,003
donante 4n
0,001 0,082 0,011 0,027
IFN
No estimulado Estimulado 2.5 Anti-IL18 125-2H Anti-IL18
donante 6n
0,002 0,076 0,006 0,010
donante 7n
0,002 0,049 0,009 0,012
donante 8n
0,002 0,049 0,009 0,012

Tabla 26. Funcionamiento de MIG/CXCL9 en diez muestras de sangre humana. p<0.05 para la inhibición por cualquier anticuerpo.
CXCL9
No estimulado Estimulado 2.5 Anti-IL18 125-2H Anti-IL18
donante 1
0,000 0,170 0,082 0,010
donante 10
0,000 0,015 0,000 0,000
donante 2
0,001 0,006 0,001 0,001
donante 3
0,000 0,067 0,010 0,006
donante 4
0,000 0,023 0,012 0,003
donante 5
0,000 0,004 0,000 0,000
donante 6
0,000 0,070 0,001 0,001
donante 7
0,001 0,034 0,001 0,000
donante 8
0,001 0,034 0,001 0,000
donante 9
0,000 0,035 0,000 0,001

Tabla 27. Funcionamiento de MCP2/CCL8 en diez muestras de sangre humana. p<0.05 para la inhibición por cualquier anticuerpo.
CCL8
No estimulado Estimulado 2.5 Anti-IL18 125-2H Anti-IL18
donante 1
0,036 8,941 4,054 1,051
donante 10
0,004 0,987 0,009 0,025
donante 2
0,036 1,225 0,105 0,057
donante 3
0,012 3,923 0,648 0,663
donante 4
0,021 2,227 0,994 0,630
donante 5
0,001 0,005 0,001 0,001
donante 6
0,000 0,023 0,002 0,001
donante 7
0,001 0,009 0,001 0,001
donante 8
0,001 0,009 0,001 0,001
donante 9
0,001 2,438 0,003 0,059
Ejemplo 4: Caracterización de HuMab anti-IL-18 2.13(E)mg1
10 Ejemplo 4.1: Especificidad de Citoquinas Humanas
La especificidad de 2.13(E)mgl para la IL-18 humana se evaluó utilizando el análisis BIACORE siguiendo las instrucciones del fabricante (véase el Ejemplo 2.1.B). Se capturó 2.13(E)mgl sobre un chip biosensor y se determinó su capacidad para unirse a un panel de citoquinas humanas conocidas en solución. Como se muestra en la Tabla
15 28, 2.13(E)mgl se unió a la IL-18 humana madura recombinante. Sin embargo, 2.13(E)mgl no se unió a proIL-18 humana ni se unió a ninguna de las otras 23 citoquinas humanas, incluyendo los miembros de la familia de IL-1 IL1a e IL-1�.

Tabla 28 Análisis Biacore de Unión de Citoquinas a 2.13(E)mg1 y 2.5(E)mg1
Citoquinas humanas rec. soluble, (1μM)
2.13(E)mg1 Capturado (25 mg/mL) 2.5(E)mg1 Capturado (25 mg/mL)
Unión a 2.13(E)mg1
Unión a 2.5(E)MG1g
IFNy
- -
IL-1a
- -
IL-1�
- -
Otras citoquinasa
- -
IL-18b
+ +
Pro-IL-18
- +
c Las citoquinas adicionales sometidas a ensayo para determinar su unión incluyeron IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-21, TNF, LT, LTa1�2, y LTa2�1. 2.13(E)mg1 no se une a ninguna de estas citoquinas. Mutante BV Cisteína > Alanina derivado de IL-18 humana recombinante
Ejemplo 4.2: Competición con otros anticuerpos para unirse a IL-18 humana
5 Se evaluó la capacidad de varios anticuerpos anti-IL-18 para competir con 2.13(E)mg1 por la unión a IL-18 humana utilizando el análisis BIACORE siguiendo las instrucciones del fabricante (véase el Ejemplo 2.1.B). En resumen, se capturaron anticuerpos policlonales anti-humano o anti-ratón sobre un chip biosensor. Después de eso, se introdujeron los anticuerpos anti-IL-18 y fueron capturados por los anticuerpos policlonales anti-humano o anti-ratón
10 (solamente para 125-2H) inmovilizados sobre el chip biosensor descrito más arriba (anticuerpo inmovilizado primario). Luego, se introdujo la IL-18 humana recombinante y fue capturada por el anticuerpo inmovilizado primario. Finalmente, se introdujeron anticuerpos secundarios anti-IL-18 soluble. El análisis midió la capacidad del anticuerpo secundario anti-IL-18 soluble para unirse a la IL-18 recombinante y competir con el anticuerpo primario. 2.13(E)mgl no competía ni con 2.5(E)mgl ni con IL-18BP. El anticuerpo monoclonal anti-huIL-18 murino 125-2H competía con
15 2.13(E)mg1 por la unión a IL-18 humana.
Tabla 29 Análisis BIACORE de Competición del Anticuerpo para unirse a IL-18 humana
2o Ab soluble
1er Ab Inmovilizado
125-2H
2.5(E)mg1 215 444 581 435 2.13(E)mg1 2.3 IL-18BP
125-2H
- + - - + + - - +
2.5(E)mg1
+ - + + - - + + +
215
- + - - + + - - +
444
- + - - + + - - +
581
+ - + + - - + + +
435
+ - + + - - + + +
2.13(E)mg1
- + - - + + - - +
2.3
- + - - + + - - +
IL-18BP
+ + + + + + + + -
+ indica que los anticuerpos primario y secundario se unen simultáneamente - indica que el anticuerpo secundario no se une a la IL-18 capturada
La presente invención incorpora como referencia en su totalidad técnicas bien conocidas en el campo de la biología 20 molecular. Estas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, las técnicas descritas en las siguientes publicaciones:
Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4ª Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-47132938-X). Lu y Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press.
25 Westborough, MA. pág. 298 (ISBN 1-881299-21-X).
Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York página 790. (ISBN 3-540-413545). Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3ª Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2: página 409. (ISBN 0-632-0.1318-4).
5 Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6). Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (traducido por Horst Ibelgaufts). página 634. (ISBN 0-89573-614-4).
10 Referencias
Patentes de los Estados Unidos
5.545.806
5.545.807 5.591.669 5.612.205 5.625.126 5.625.825 5.627.052
5.633.425
5.643.763 5.661.016 5.721.367 5.770.429 5.789.215 5.789.650
5.814.318
5.912.324 5.916.771 5.939.598 5.985.615 5.994.619 5.998.209
6.054.487
6.060.283 6.075.181 6.091.001 6.114.598 6.130.364
15 Publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos 20030186374 Solicitud de los Estados Unidos Núm. de Serie 09/428.082
Documentos de Patentes Extranjeras
EP 712 931
EP 850 952 EP 864 585 EP 0 962 531 EP 0 974 600 JP 111,399194
IL 121554 A0
WO 91/10741 WO 91/17271 WO 92/01047 WO 92/02551 WO 92/09690
WO 92/15679
WO 92/18619 WO 92/20791 WO 93/01288 WO 94/02602 WO 96/33735
WO 96/34096
WO 97/24441 WO 97/29131 WO 98/16654 WO 98/24893 WO 98/41232
WO 98/50433
WO 99/09063 WO 99/22760 WO 99/25044 WO 99/37772 WO 99/37773
WO 99/45031
WO 99/53049 WO 00/37504 WO 00/09560 WO 00/12555 WO 00/37504
WO 00/56772
WO 01/58956 WO 01/83525 WO 02/72636
Otras Referencias
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Aunque se han descrito más arriba numerosas realizaciones y características, los expertos en la técnica comprenderán que se pueden realizar modificaciones y variaciones de las realizaciones y características descritas sin apartarse de la invención definida en las reivindicaciones adjuntas.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Ghayur, Tariq
5 Labkovsky, Boris voss, Jeffrey Green, Larry
Babcook, John Jia, xiao-chi
10 Wieler, James Kang, Paul Hegberg, Brad
<120> Proteínas de Unión a IL-18
<130> BBC-085US 15 <140> no asignada todavía
<141> presentada adjunta simultáneamente
<160> 47
<210> 1
<211> 193 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8 10 <211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
10 <210> 14
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20 10 <211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
10 <210> 22
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
10 <210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
10 <210> 28
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30 10 <211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
10 <210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15 <400> 34
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36 10 <211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial 15 <220>
<223> Secuencia CDR del anticuerpo anti-IL-18 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (1)
<223> Xaa es Ser, Asn, His, Arg, o Tyr
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (2)
<223> Xaa es Tyr, Gly, Arg, Ser, o Cys
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (3)
<223> Xaa es Trp, Gly, Tyr, Asp, Ser, Val, o Ile
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (4)
<223> Xaa es Ile, His, Trp, Tyr, Met, Leu, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (5)
<223> Xaa es Gly, Tyr, Ser, Asn, o His
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (6)
<223> Xaa es Trp, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (7)
<223> Xaa es Thr, Ser, Gly, o no está presente
<400> 42
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia CDR del anticuerpo anti-IL-18
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (1)
<223> Xaa es Phe, Tyr, His, Ser, o val
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (2)
<223> Xaa es Ile, o Phe
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (3)
<223> Xaa es Tyr, Ser, o Trp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (4)
<223> xaa es Pro, Tyr, o Ser
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (5)
<223> xaa es Gly, Ser, Arg, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (6)
<223> xaa es Asp, o Gly
<220>
<221> rasgo_misc <222> (7)
<223> Xaa es Ser, Thr, Gly, o Arg
<220>
<221> rasgo_misc 5 <222> (8)
<223> Xaa es Glu, Thr, Ile, o Asn
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (9)
<223> Xaa es Thr, Tyr, Asn, Ile, Lys, o His
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (10)
<223> Xaa es Arg, Tyr, o Ser 15 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (11)
<223> Xaa es Tyr, Asn, o Ser
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (12)
<223> Xaa es Ser, Pro, Ala, o Val
<220>
<221> rasgo_misc 25 <222> (13)
<223> Xaa es Pro, Ser, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (14)
<223> Xaa es Thr, Leu, o Ser
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (15)
<223> Xaa es Phe, Lys, o Val 35 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (16)
<223> Xaa es Gln, Ser, o Lys
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (17)
<223> Xaa es Gly, o no está presente
<400> 43
45 <210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia CDR del anticuerpo anti-IL-18
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (1)
<223>
Xaa es Val, Asp, Glu, Ser, o Cys 55 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (2)
<223> Xaa es Gly, Arg, Asp, Ser, Lys, Leu, Tyr, o Ala
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (3)
<223> Xaa es Ser, Gly, Tyr, o Arg
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (4)
<223> Xaa es Gly, ser, Tyr, Asn, Thr, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (5)
<223> Xaa es Trp, Ser, Ala, Gly, Tyr, o Thr
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (6)
<223> Xaa es Tyr, Gly, Ser, Phe, Trp, o Asn
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (7)
<223> Xaa es Pro, ser, Phe, Tyr, Val, Gly, Trp, o Val
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (8)
<223> Xaa es Tyr, Phe, Asp, Pro, Met, Ile, o Asn
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (9)
<223> Xaa es Thr, Trp, Asp, Leu, Tyr, Glu, Pro, Phe, o Gly
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (10)
<223> Xaa es Phe, Asp, Tyr, His, Val, Tyr, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (11)
<223> Xaa es Asp, Tyr, Phe, Leu, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (12)
<223> Xaa es Ile, Asp, Tyr, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (13)
<223> Xaa es Tyr, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (14)
<223> Xaa es Tyr, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (15)
<223> Xaa es Gly, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (16)
<223> Xaa es Met, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (17)
<223> Xaa es Asp, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (18)
<223> Xaa es Val, o no está presente
<400> 44
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia CDR del anticuerpo anti-IL-18
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (1)
<223> Xaa es Arg, o Lys
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (2)
<223> Xaa es Ala, Gly, o Eer
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (3)
<223> Xaa es Ser
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (4)
<223> Xaa es Glu, Arg, Gln, o His
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (5)
<223> Xaa es Ser, Ile, Thr, o Asn
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (6)
<223> Xaa es Ile, Val, Leu, o Phe
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (7)
<223> Xaa es Ser, Gly, Leu, Asn, o Arg
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (8)
<223> Xaa es Ser, Gly, Tyr, Arg, Asn, His, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (9)
<223> Xaa es Asn, Gly, Tyr, Arg, o Ser
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (10)
<223> Xaa es Leu, Tyr, Ser, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (11)
<223> Xaa es Ala, Leu, Asn, Val, Gly, o Asp
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (12)
<223> Xaa es Ala, Asn, Glu, Lys, Gly, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (13)
<223> Xaa es Lys, Thr, Asn, o no está presente
<220>
<221> resgo_misc
<222> (14)
<223>
Xaa es Asn, Tyr, Thr, o no está presente 5 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (15)
<223> Xaa es Tyr, Leu, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (16)
<223> Xaa es Leu, Cys, Tyr, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc 15 <222> (17)
<223> Xaa es Ala, Asp, o no está presente
<400> 45
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia CDR del anticuerpo anti-IL-18 25 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (1)
<223> Xaa es Thr, Gly, Ser, Trp, o Glu
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (2)
<223> Xaa es Ala, Val, Thr, Ile, o Leu
<220>
<221> rasgo_misc 35 <222> (3)
<223> Xaa es Ser, o Phe
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (4)
<223> Xaa es Thr, Ile, Asn, Ser, Arg, o Tyr
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (5)
<223> Xaa es Arg, o Leu 45 <220>
<221> rasgo_misc
<222> (6)
<223> Xaa es Ala, Gln, Glu, o Phe
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (7)
<223> Xaa es Thr, o Ser
<400> 46
55 <210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia CDR del anticuerpo anti-IL-18
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (1)
<223> Xaa es Gln, o Met
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (2)
<223> Xaa es Gln, His, o Tyr
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (3)
<223> Xaa es Tyr, Asn, Gly, Ser, o Arg
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (4)
<223> Xaa es Asn, His, Tyr, Asp, Gly, Val, Leu, o Ile
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (5)
<223> Xaa es Asn, Gly, Ile, Tyr, Ser, Gln, Phe, o Glu
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (6)
<223> Xaa es Trp, Ser, Thr, Leu, Ile, o Phe
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (7)
<223> Xaa es Pro, Leu, Thr, Asp, o Ile
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (8)
<223> Xaa es Ser, Leu, Pro, cys, Trp, Ile, o Phe
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (9)
<223> Xaa es Ile, Thr, Ser, o no está presente
<220>
<221> rasgo_misc
<222> (10)
<223> Xaa es Thr, o no está presente
<400> 47

Claims (62)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, capaz de unirse IL-18 humana, donde dicho anticuerpo,
    o porción de unión al antígeno del mismo, comprende una CDR-H1 que tiene los Residuos 31-35 del SEQ ID NO: 6; una CDR-H2 que tiene los Residuos 50-66 del SEQ ID NO: 6; una CDR-H3 que tiene los Residuos 99-110 del SEQ ID NO: 6; una CDR-L1 que tiene los Residuos 24-34 del SEQ ID NO: 7; una CDR-L2 que tiene los Residuos 50-56 del SEQ ID NO: 7; y una CDR-L3 que tiene los Residuos 89-98 del SEQ ID NO: 7.
  2. 2.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, comprende un VH.
  3. 3.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho VH comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6.
  4. 4.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, comprende un VL.
  5. 5.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho VL comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7.
  6. 6.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, comprende un VH y un VL.
  7. 7.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho VL comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7, y dicho VH comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6.
  8. 8.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana; un dominio constante de IgG1 humana; un dominio constante de IgG2 humana; un dominio constante de IgG3 humana; un dominio constante de IgG4 humana; un dominio constante de IgE humana y un dominio constante de IgA humana.
  9. 9.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho dominio de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina es un dominio constante de IgG1 humana.
  10. 10.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho dominio constante de IgG1 humana comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
  11. 11.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un dominio constante de una cadena ligera de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en: un dominio constante kappa de Ig humana y un dominio constante lambda de Ig humana.
  12. 12.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho dominio de la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina es un dominio constante kappa de Ig humana que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4.
  13. 13.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho dominio de la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina es un dominio constante lambda de Ig humana que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5.
  14. 14.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunoglobulina; un scFv; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo humanizado; un fragmento Fab; un fragmento Fab'; un F(ab')2; un Fv; y un Fv conectado por disulfuro.
  15. 15.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano.
  16. 16.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, es capaz de neutralizar IL-18 humana.
  17. 17.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha IL-18 humana se selecciona del grupo que consiste en pro-IL-18 humana; IL-18 madura humana y IL-18 truncada humana.
  18. 18.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, disminuye la capacidad de IL-18 humana para unirse a su receptor.
  19. 19.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, disminuye la capacidad de pro-IL-18 humana, IL-18 madura humana, o IL-18 truncada humana para unirse a su receptor.
  20. 20.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo es capaz de reducir una o más actividades biológicas de IL-18 humana seleccionadas del grupo que consiste en modulación de Th1; modulación de Th2; modulación de Nk; modulación de neutrófilos; modulación del linaje de monocitos-macrófagos; modulación de neutrófilos; modulación de eosinófilos; modulación de células B; modulación de citoquinas; modulación de quimioquinas; modulación de moléculas de adherencia; y modulación del reclutamiento celular.
  21. 21.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, tiene una constante de disociación (KD) seleccionada del grupo que consiste en: a lo sumo 10-7 M; a lo sumo 10-8 M; a lo sumo 10-9 M; a lo sumo 10-10 M; a lo sumo 10-11 M; a lo sumo 10-12 M; y a lo sumo 10-13 M.
  22. 22.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, tiene una velocidad de unión seleccionada del grupo que consiste en: al menos 102M-1s-1, al menos 103M-1s-1, al menos 104M-1s-1, al menos 105M-1s-1 y al menos 106M-1s-1.
  23. 23.
    El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, tiene una velocidad de desunión seleccionada el grupo que consiste en: a lo sumo 10-3s-1; a lo sumo 10-4 s-1; a lo sumo 10-5s-1; y a lo sumo 10-6s-1.
  24. 24.
    Un anticuerpo marcado, o porción de unión al antígeno del mismo, que comprende un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se conjuga con una marca detectable.
  25. 25.
    El anticuerpo marcado, o porción de unión al antígeno del mismo, de la reivindicación 24, donde la marca detectable se selecciona del grupo que consiste en: una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética, y biotina.
  26. 26.
    El anticuerpo marcado, o porción de unión al antígeno del mismo, de la reivindicación 25, donde dicha marca es una radiomarca seleccionada del grupo que consiste en: H3, C14, S35, Y90, Tc99, In111, I125, I131, Lu177, Ho166, o Sm153 .
  27. 27.
    Un anticuerpo conjugado, o porción de unión al antígeno del mismo, que comprende un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, se conjuga con un agente terapéutico o citotóxico.
  28. 28.
    El anticuerpo conjugado, o porción de unión al antígeno del mismo, de la reivindicación 27, donde dicho agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste en: un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina, y un agente apoptótico
  29. 29.
    Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23.
  30. 30.
    Un vector que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 29.
  31. 31.
    El vector de acuerdo con la reivindicación 30, donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste en: pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, y pBJ,
  32. 32.
    Una célula anfitriona que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 30 o 31.
  33. 33.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 32, donde dicha célula anfitriona es una célula procariótica.
  34. 34.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 33, donde dicha célula anfitriona es E.Coli.
  35. 35.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 32, donde dicha célula anfitriona es una célula eucariótica.
  36. 36.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 35, donde dicha célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste en: una célula protista, una célula animal, una célula vegetal y una célula fúngica.
  37. 37.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 36, donde dicha célula eucariótica es una célula animal seleccionada del grupo que consiste en: una célula de mamífero, una célula de ave, y una célula de insecto.
  38. 38.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha célula animal es una célula CHO.
  39. 39.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha célula anfitriona es una célula COS.
  40. 40.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 36, donde dicha célula eucariótica es Saccharomyces cerevisiae.
  41. 41.
    La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 37, donde dicha célula animal es una célula Sf9 de insecto.
  42. 42.
    Un método para la producción de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, que se une a IL-18 humana, comprendiendo el método la etapa de cultivar la célula anfitriona de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32-41 en un medio de cultivo en condiciones suficientes para producir un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, que se une a IL-18 humana.
  43. 43.
    Un anticuerpo cristalizado, o porción de unión al antígeno del mismo, que comprende un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, donde dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, existe en forma de cristal.
  44. 44.
    El anticuerpo cristalizado, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 43, donde dicho cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico sin portador.
  45. 45.
    El anticuerpo cristalizado, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 43, donde dicho anticuerpo cristalizado, o porción de unión al antígeno del mismo, tiene una vida media in vivo mayor que la contraparte soluble de dicho anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo.
  46. 46.
    El anticuerpo cristalizado, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 43, donde dicho anticuerpo cristalino, o porción de unión al antígeno del mismo, conserva su actividad biológica.
  47. 47.
    Una composición para la liberación de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, comprendiendo dicha composición:
    (a)
    una formulación, donde dicha formulación comprende un anticuerpo cristalizado, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 43-46, y un ingrediente; y
    (b)
    al menos un portador polimérico.
  48. 48.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 47, donde dicho portador polimérico es un polímero seleccionado entre uno o más del grupo que consiste en: poli ácido acrílico, poli cianoacrilatos, poli aminoácidos, poli anhídridos, poli depsipéptidos, poli ésteres, poli ácido láctico, poli ácido láctico-co-glicólico o PLGA, poli bhidroxibutirato, poli caprolactona, poli dioxanona; poli metilenglicol, poli hidroxipropilmetacrilamida, poli organofosfazeno, poli ortoésteres, poli alcohol vinílico, poli vinilpirrolidona, copolímeros de anhídrido maleico-éster alquil vinílico, polioles pluronic, albúmina, alginato, celulosa y derivados celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, combinaciones y copolímeros de los mismos.
  49. 49.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 47, donde dicho ingrediente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-�-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol.
  50. 50.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 47, para su uso como medicamento para el tratamiento de un mamífero.
  51. 51.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  52. 52.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 51, para su uso como medicamento.
  53. 53.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 52, que comprende por añadidura un agente adicional.
  54. 54.
    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 53, donde dicho agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: inhibidores de la angiogénesis; inhibidores de quinasas; bloqueadores de la coestimulación molecular; bloqueadores de moléculas de adherencia; anticuerpos anti-citoquina o fragmentos funcionales de los mismos; metotrexato; corticoesteroides; ciclosporina; rapamicina; FK506; y agentes antiinflamatorios no esteroideos.
  55. 55.
    La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 51-54, donde la composición es para su uso en el tratamiento del asma, LEG, osteoartritis, artritis psoriásica o psoriasis.
  56. 56.
    Un método para reducir la actividad de IL-18 humana in vitro, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto IL-18 humana con el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, de manera que se reduzca la actividad de IL-18 humana.
  57. 57.
    El uso de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano que sufra una enfermedad autoinmunitaria, donde el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano.
  58. 58.
    El uso de la reivindicación 57, donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en asma, LEG, osteoartritis, artritis psoriásica y psoriasis.
  59. 59.
    El uso de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente que padezca una enfermedad autoinmunitaria, donde el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano y, donde el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, es para su administración antes, durante,
    o después de la administración de un segundo agente, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, o fragmento del mismo, capaz de unirse a IL-12 humana; metotrexato; un anticuerpo, o fragmento del mismo, capaz de unirse a TNF humano; corticoesteroides, ciclosporina, tapamicina, FK506, y agentes antiinflamatorios no esteroideos.
  60. 60.
    El uso de la reivindicación 59, donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en asma, LEG, osteoartritis, artritis psoriásica y psoriasis.
  61. 61.
    El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 50 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padezca una enfermedad autoinmunitaria, donde el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano.
  62. 62.
    Una composición farmacéutica para el tratamiento de la EPOC que comprende un anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 y uno o más agentes terapéuticos adicionales para la EPOC.
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